▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼

1 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 13:28

いま実験でうまくいかないことスレッド　パート２です。
グチからアドバイスまで幅広く語り合いましょう。

皆様よろしく。

パート１　全部
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/967541407/

パート１　最新100
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/967541407/l100

2 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 14:13

http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/967541407/975

クローニングなんて今日び楽しくないだろ、もともと。
さっさと遺伝子取って、それを使って生物学的な実験をすべし。
スブトラクションとかDDとか未だにやっているラボがあったとは、驚きだ。

3 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 14:16

学部学生に働かせて、よさげなのが出たらワシが実験する。
そんなもんです。

4 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 14:26

楽しくないのは学生にやらせる
これ王道
で、結果が出たら「指導」と称して
自分の思う通りにディスカッションを運ばせる。
論文が出れば
「先生は情熱を持って地道にサイエンスやってるんですね」
と好評、
政治力の糧となる

5 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 14:29

>>3
>>4
まあ、そんなもんです。
はやく職取れよ。

6 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 16:49

>2
うちですが、私今してますが何か？

7 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 17:14

>6
かわいそうに

8 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 18:07

たしかに、マイクロアレーが登場してからdifferential screening
の方法が変わってしまいました。Affymetrixぐらいゲノムをカバー
してるチップがあれば、例えばクロマチンレベルで差異のある部位を
プローブにしてcDNAを釣るのも可能になるでしょう。
実際こんなことしてる人いますか？（当方これでグラント申請予定）

9 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 19:47

まあマイクロアレーもDDもsubtractionも
通の俺から言わせればカスだね。
通はやっぱりmap-based cloningこれだね。
しかも自分でYACコンティグ、BACコンティグ、lamdaコンティグを
しこしこ作る。
これ最高

10 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 19:48

しかしYACがつながらないこともある、両刃の剣。
まあ素人にはお勧めしない。

11 ：6：01/12/26 21:31

>9
マクロアレイって相同性のある配列を釣るシステムですよね？
漏れのは相同性があるっていう配列がまだ未知なんすよ

12 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 21:45

in situ hybridizationをやっているんだけど、核が染まっちゃう。
パラフィンブロックだから内在性のAPは失活してるはずなんだけど。
プローブ以外の原因って、何か考えられるかな。

13 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 22:12

>>11
ハァ？なにいってんの？君
>>12
良くあること．
DIGだろ？

14 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 22:19

>>12
どうやってやってるかくらい書いてね．

15 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 22:21

>>12
核だけですか？でないとすれば・・・
エクソンのプローブを使っているのでしたら、pre-mRNAでは
ないでしょうか。当方も、turnoverの早い遺伝子では見たこと
ありますよ。その場合、核に全般的に染まるのではなくて、
なぜかドット状に染まりました。同じ遺伝子の違う部位に
プローブを設定しても同じで、センスプローブでシグナル
なしならますます可能性高し。

16 ：ともちん：01/12/26 23:54

インバーティッドリピートのクローニングがどうしてもうまくいきません。アドバイスをお願いします。

17 ：うるとらあんそらっくす：01/12/27 02:10

＞１５
ドットはひよっとして２個見えない？ハエの卵の場合だけどうまく
染まると二つの染色体から転写されているゲノム領域が２個ドット
状に見えるよ。該当遺伝子座を欠失したdeletion 染色体とのヘテロ
接合体の細胞ではドットは１個しか見えない。他の生物でもそうい
うことは見られるのかなあ。

18 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/27 02:48

>>16
hostは？SUREとかにしたらよいかも。

19 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/27 05:14

>>17
その通り！
RNA-FISHなみの解像度だと当たり前の話らしいです。
細胞が十分に大きいと、DIGのISHでも見えます。
（小生はマウスの脳の話です）

20 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/27 19:25

>>15
>>17
>>19へ。

>>12
が対面している困難は、
そんな高度な問題ではないと思われる。
DIGでやると、たまーに核がびた～っと染まっちゃう事があるらしい。
たぶん、specificな発現ではない。
おれは一回しかそうなったことがないので、原因は不明。
多分、プローブ入れすぎなだけだとおもう。

21 ：15＝19：01/12/27 19:30

「多分そうかな」と思いながらついカキコしました。
漏れの経験上、DIGのバックは主に最後の免疫組織の
部分によることがおおいので、十分ブロッキングした
方がいいと思いますよ。

22 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/27 19:41

>>16
GibcoのSTBL2でうまくいきました。値段分の仕事してくれるよ。

23 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/27 19:44

モー娘。のお宝画像がいっぱい！！
遊びに来てね♪
http://muvc.net/taron/index.html

24 ：12です：01/12/27 22:04

お返事ありがとうございます
>>15
>>19さんへ
両方ともあります。ぽちっとドットが2つある場合は、
たしかにキレイです。
ドットがたくさん出るものは、そういった理由の割には
出現率が多すぎる気がします。

>>20さんへ
こんな私でも濃度は変えてみたんです。
私のつまらない困難は来年にもちこしでーす。

25 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/28 00:20

１２さん。
あと考えられるのは、核小体。
問題なければ、遺伝子の名前もカキコしてくれ。

26 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/28 02:00

Proteomicsをやろうと思うのですが、核蛋白のみを２Dゲルで
流してるのですが、泳動パターンが安定しません。
どなたか、いいプロトコールもってませんか？

27 ：Voet：01/12/28 14:11

ISHで核が染まる時はプローブ中に反復配列の存在を疑うべし。
BLASTして怪しいところを削ってプローブ作り直す。
後はWashの温度を振ってみるのもよろしい。

28 ：ともちん：01/12/28 16:02

18さん、22さんありがとうございます。いまはホストはXL-1blueです。研究室にsureがあるのでとりあえずそっちで試してみようと思います。GibcoのSTBL2って高いんですか、だめだったらやってみます。
また、インバーティッドリピートのシークエンスは無理なのでしょうか？

29 ：ZONE：01/12/28 17:12

顕微鏡でプランクトンやバクテリア、細胞などをカウントする
時に、デジタルカメラで画面を撮影したいんですけど、専用の
顕微鏡（例えばUSB接続）じゃなきゃできないんですか？
顕微鏡の上に普通のカメラがついているやつがあるんですけど
そのカメラをデジタルカメラに代えてとかできませんかね。
試しもしないでなんなんですけど、やっていらっしゃる方いま
せんか？

30 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/28 18:48

>>29
できます。
ニコンのクールピクス995にアダプタつけてやってます。それ用のリレーレン
ズというのがオプションで売られてます。ときどき写真撮る程度ならそれで十
分だけど、たくさんやるならコンピュータまで含んだシステムの方がいろいろ
便利でいいと思います。

31 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/28 18:50

>>12
パラフィン包埋の段階では内在のAPはけっこう生きてます。

32 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/28 22:17

>29
うちも光学顕微鏡にデジカメ付けて撮影しています
「オリンパス実体顕微鏡」というスレにいろいろ書いてあると思います
リンクはり方知らんのでｽﾏｿ

33 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/28 22:24

>>12
>パラフィンブロックだから内在性のAPは失活してるはずなんだけど。

ｵｲｵｲいったい誰にそんなウソ習ったんだYO？

34 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/28 23:10

>>32
これですね。
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/993705393/l50

35 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/29 14:57

>34
フォローありがとです。
エクスプローラとかでスレッド一覧ですれ選んで
そのアドレスを貼ったらいいのでしょうか。
かちゅだと最後の/150が表示されてなかったもので。

36 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/30 04:39

/150はなくてもいいと思います。

37 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/03 21:36

プロ手ねーすで死ぬんでしょ？
AP

38 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/04 02:47

>>37
死ぬね。少なくとも俺のサンプルでは死んだ。

39 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/06 22:30

40 ：　：02/01/08 19:10

基本的な質問ですけど、ウェスタンのメンブレン何使ってます？
私はニトロセルロース一筋なんですけど、ＰＶＤＦ使ったら見えないバンドが
見えたりするものなのでしょうか？
また、バックグラウンドは高くなりますか？
抗体の抗体価が低くてシグナルが弱いもので、ＰＶＤＦ使ったらどうかと思っているんです。

41 ：zone：02/01/09 00:04

＞30.32.34
情報ありがとうございます。
さっそく試してみます。

42 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/11 08:51

蛋白の発現とmRNAの発現が違う。
mRNAはすべてに発現してるが蛋白は発現しないところがある。

43 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/12 02:09

>>42
何が言いたいんだ？
どっかの質問に対するレス？
それともアナタが質問したいの？

44 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/12 02:53

>>43
NorthernとWesternの結果が一致しないと言いたいのでは？

45 ：43：02/01/12 04:59

ふーん。そういうことなら。
>>42
mRNAは常に一定でもタンパク量が変化するモノはたくさんあるじゃない。
なんかの条件で分解速度が変わってるんじゃないかな。
とりあえずcell cycleをregulateするタンパクについてお勉強するとよろし。

46 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 03:39

今指導してる学生が「統計を教えろ」と来た。
いままでなるべく統計を避けてきたが、年貢の
納め時か？
彼女はReal-time　PCRのデータの有効性を
言いたいらしいが、変化が最高で４倍くらいで
わし自身それにどれだけの意味があるかわからん。
しかし、取り敢えず学位だけは取らしてやらんとな・・・
うちのコンピュータにPrism3なるソフトがはいっとるが、
それが解れば解決するような問題でしょうか？
なるべく横着する術をご教授願いたい！

47 ：IL4：02/01/16 03:42

HIVで一儲け？

48 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 11:42

そもそも統計そのものには意味は無いよーん。
平均値に差があるかどうかを判定できるだけで、4倍の変化が生物学的に
意味を持つかは別の問題。我々が使う統計なんてその程度の物。
差があるかどうかは統計で判定できても、その差に意味があるかどうかは
統計では判らないんだから、＞46の学生の場合、統計以前の問題のような・・・

49 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 12:46

統計自体は、理屈が解らなくても医学生物学用の参考書というか
例題集から同じパターンの探してあてはめれば、大抵の場合
用足りると思う。
「絵苦セルで学ぶ統計」とかそんな名前じゃ中田かな。

問題は48の言うとおり、統計以前のところにあるね。

50 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 13:59

質問版に書き込んだのですが
実験関係はこちらの版の方がよいということなので
書き込ませていただきます。
ALFシークエンサーを使っていて
いつもゲルの状態があまり良くない（プレランしたあとの波形がひどい）
のですがこれを改善するにはどうしたらよいでしょうか？

51 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 16:11

>>46
その「4倍」とやらが別の方法で試験したときにどうなるかを見ればいいんじゃないでしょうか。
あるいは「4倍」がテンプレート量をどのくらい振ったときに現れるかを
調べてみればいいかと。むしろ定量PCRにおいて検量線引かないのは危険過ぎます。

たとえばRT-PCRでサイクルやテンプレート量を振って半定量をしているペーパーがありますけど、
テンプレートを3倍量振れば電気泳動したときに目で見て分かります。
その差は3サイクルくらい余計に回すとだいたい揃います。（乱暴な言い方だけど）

そのくらいの差でも、「違う」ということでペーパーが通っているので
本当に4倍違うなら通常のPCRでも条件が合えばバンド強度の差が出るはずです。

うちはリアルタイムやれるほどカネが回ってこないためセコセコとcompetitorを作って
やってますので、Prismについてはお金持ちな方々に…（わら

52 ：51：02/01/16 16:15

あ、なんか的はずれなｶｷｺだったのかも…

53 ：46：02/01/16 16:47

みなさん、アドバイスありがと。
実はわしもまったく同感。リアルタイムなんてやる必要なし。
思うに彼女は「単にやってみたかった」だけだと思われる。
しかし、あがって来たデータが全く乏しい。唯一使えそう
なのがこの「４倍」ってやつです。彼女の本当の指導教官
（グループリーダー）も、「好きにやっていいよ」と言った
手前、後に引けないのでワシに押しつけてきた。
「絵苦セルで学ぶ統計」はためしてみよう！

54 ：zone：02/01/16 22:25

３Ｈチミヂンをつかって、細胞の増殖を定量する際に、
新しく合成されたDNAの量や細胞数ってどうやって知る
のでしょうか。
エタ沈などで普通にDNAを精製しても、できるのは全DNA
ですよね。その内どれくらいが単位時間当たりに増えた
DNAなんだか。
検量線の書き方とか書くのでしょうか？

55 ：　：02/01/16 23:56

>>46
スタンダードテンプレート作ってreal-timeRTで4倍差があるなら結構差があるのでは？
統計学的にｔ検定でもしたいってことですか？
まー、サンプルが一個ってことじゃないですよね。よくわからん。

56 ：　：02/01/16 23:58

オリゴつかったアンチセンス（培養細胞）がうまくいきません。
オリゴか悪いのか、プロトコールの条件設定が悪いのかもわかんないよー。

57 ：sage：02/01/17 09:17

>54
タイムコース取りなさい。
合成鎖に取り込まれなかった3Hは、
DNAの抽出・精製の際に洗い流されるから。
あまりに初歩的なことなのでsage

58 ：57：02/01/17 09:18

下がってなかった･･･。
ｽﾏｿ･･･。

59 ：zone：02/01/17 10:32

＞＞57.58
タイムコース作る際に、その都度抽出されるDNAの
回収率って同じなんですかね？
もしそうなら良いのですが、バラつくのであれば
無駄じゃないですか？

60 ：57：02/01/17 10:46

>59
それはあなたのレベル次第。学部生ですか？
同じ培養液から径時的に細胞を分注し、それからDNA抽出しても大きなばらつきはなかったよ。
というか、大きくばらつくのなら抽出法をちゃんとマスターしなさい。

61 ：57：02/01/17 10:57

>59
質問板でも質問をみたんで付けたし。
仮に3H取り込み量と細胞増加数のスタンダードがあったとする。
それを参考に得られた3Hから増加した細胞数を算出したとしますね。
その際に、あなたのDNA抽出・精製の精度が悪かったら当てにならないでしょう？
目的は細胞増加数を算出したいの？

62 ：sage：02/01/17 12:07

>56
あまりにも漠然とした質問だぞ。
これで答えてくれというのは無茶だ。

63 ：名前にsageと書いたアホ：02/01/17 12:11

58ではないが下がってなかった・・・
ｽﾏｿ･･･。
何故かE-mail欄が表示されていなかったのじゃ。

64 ：56：02/01/17 18:05

すんません。
オリゴの設計がまずかったみたい。
mRNAの2次構造調べたらちょうどヘアピンのくっつくところにかかってた。
やり直します。

65 ：俺も仲間に入れてくれ：02/01/17 22:17

市販のDNA精製キットの回収率ってどのくらいなん？
俺も似たようなことやってるけど、精度はまあ良し
としよう。
で、もし回収されているDNA量が100パーセントじゃ
なかったら細胞一個当たりのＤＮＡとかもとめるの
無理じゃない？

66 ：ここだけ１０年遅れたポス毒：02/01/17 22:50

CsCl超遠心でやってます。２回まわしてます。キットってなんですか？

67 ：65：02/01/17 23:00

＞＞66
Promega の　Wizard DNA purification kit　使ってます。

68 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/18 01:31

PharmaciaのECLウエスタンバンドがでないよう。
前回生まれて初めてやってうまくいったのにい。
trasferする前のゲルにはバンドあるしポンソーでもバンド見えるのにい。
抗体のincubationってやっぱり一時間もやらないとだめなのですか？
前1/5000でできたから今回1/1000にして30分にしたんだけどだめ？
濃くしたらどんどん時間短くできるって思ったけど、、、

69 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/18 02:23

＞濃くしたらどんどん時間短くできるって思ったけど、、、

そんなことはありません。

以上。

70 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/18 17:36

>>54
よく知らないんだけど、トリチウムチミジン取り込みって細胞をフィルターに引っかけて
液シンでカウントするんじゃないの？
DNAを抽出する理由がわからないです。エタ沈してまで精製する理由が。

細胞数を知りたいならトリプシンEDTA回収してカウントした方が
まだ信頼性があると思いますし。

71 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/18 18:39

トリチウムチミジン取り込み量が液しんから求まって、結局その値が
何を意味してるのかという問題だ。
増殖を定量するのであれば、細胞カウントするだけじゃだめなの？

72 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/19 07:33

>>66
そのレスのみでうちで雇ってあげます。
キット使う奴は嫌いだ。（それでもキアゲンの
カタログはもってまっせ！）

73 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/21 10:45

>>66
うちもキット買えるほど裕福じゃなし。
下手に慣れないキットを使うよりか超遠心した方が安心。

74 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/21 14:02

>>54
頭悪いぞ！
ホットを入れてから新規に合成された核酸量が測れるんだから
それで増殖の検定が出来るだろ。

75 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/22 07:34

>>73
キットはバカでもできるようにしたものです。

76 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/22 09:32

>>75
だからキットを使わなきゃ何も実験できないヴァカが増えてるのだな。
基本的な手法も実験原理もロクに知らない学部生にまでキットを使わせるのはちと問題だと思う今日この頃…。

77 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/22 09:38

>>75
でもそんな技術と科学の本質には全く相関はない。
それはただの精神至上主義です。
効率よくて何かわるいですか？

78 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/22 18:08

RNA取るのにグアニジンとかゴチャゴチャ量って混ぜるのももう嫌だしなぁ。
キットの方が収率いいしサンプル切片が小さければ四の五の逝ってる場合じゃないし。

79 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/22 21:50

ウェスタンやるときのトランスファーって定電圧と定電流どっちが
均一に転写できますか？

80 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/24 03:04

定電流。

81 ：75：02/01/24 07:00

>>77
悪いとは一言もいってないよ。俺も売ってるのはだいたい使っている。
ただ、76が言うことももっともだと思う。特に原理を理解しないで使うって
ところ。キット使っていても、できない・うまくいかないときがある。
その原因究明解決ができるかできないかにつながる。
教えるときに原理もしっかり教えておけばいいんだけど・・・

82 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/24 11:27

>>77
効率があがるのは確かにいい事だと思う。
しかし、>>81が言ってるように、行き詰まったときに
回避できるか否かは原理を知ってた方が有利と思う。

それと、現時点でキットを使う余裕のあるラボなら良いが、
将来的に他所に行く、独立するって時に必ずしも予算が十分にある訳じゃない。
それは予算を引っ張る努力が足らんのだって言われればおしまいだけど。
その時にどうやって手近なもので代用するかってのもその人の能力だろう。
その為にも基本的な原理・手法は知っておいて損は無いだろうと思うけどね。

少しスレ違い・レス違いになったのでさげておきます。

83 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/27 17:10

ドットブロットについてお訊きしたいのですが。
精製した核酸を0.2マイクロのニトロセルロースメンブレンに、ブロッター
を使ってブロットするように習いましたが、核酸って、0.2マイクロメートル
の穴は通過しないんですか？
そんなに核酸って大きいのですか？

84 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/27 17:18

ボスとの関係がうまくいっていません。
どうしたらいいですか？

85 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/27 17:23

>>79
きちんとメンブレンの面積を測ってそれにあわせて定電流でやるのがよい。

86 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/27 22:56

トランスジーンで特定の神経細胞を殺すのには、どんな遺伝子がいいの？

87 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/28 02:25

>84 研究室移動

88 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/28 02:39

特異的プロモータの下になんかつけるとか。>>86

89 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/28 03:47

>>86
全く意味がわからんな。
ジフテリアトキシンとかを聞きたいのかな？

90 ：100：02/01/28 03:53

>>83
直径は2nmだが長さを考えろ。
電気泳動やるアガロースだってスカスカの網だ。

91 ：83：02/01/28 07:56

＞＞90
DNAは長いから、フィルターに絡まるってことですか？

92 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/28 11:41

>>83
どっと部ロットなら、詳しい事はしらないが、
プライマーは抜けちゃうよ。
だから、１００ｂｐ以上は無いとダメ。

93 ：う～ん：02/01/28 12:37

Sf9Cellを使っていますが、トランスフェクションうまくいかないよ～

94 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/28 18:56

>>93
リポフェクションあきらめて今日からカルシウム沈殿でやってます。

95 ：う～ん：02/01/28 22:28

カルシウム沈殿でってなんです？
2ヶ月前にはじめたばかりなもので、、、m(_ _)m

96 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/29 05:45

>>93
手順に問題あり

97 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/29 11:33

遺伝子組換体がえられない…。
ちきしょ～！　青い○○○○なんてきらいだ！

98 ：う～ん：02/01/29 12:17

９６さんへ
テジュンですか？線状DNAとリポフェクチン、私のDNAをボルテックスして、
Seed60に播いておいたSf9Cell上に滴下するだけですが、、、
もちろん、SF9Cellは、10の7乗cell/ml（３日で３倍に増えたやつ）をSeedデッシュ
にまいて１時間、R.T.で清地し、Mideumで洗ってから使っているし。。。
むむむぅ～

99 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/30 00:00

>>98
以下、素朴な疑問です。

1.直接リポフェクチンにDNA混ぜてるのでしょうか？
2.線状DNAってキャリアでしょうか？入れる必要があるとは思わないんだけど？

たいていDNA 量に対して最低限必要なリポフェクション試薬量があるから、
キャリアなんぞ入れてしまうと、まったく入らなくなると思われ。

たとえば、ある試薬で1μgのDNAに対して最低1μｌの試薬が必要とか。

説明書にしたがってやれば、入りそうなもんだけど...読み返してみてはどうでしょう。
何か重要なステップを忘れてませんか？

100 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/30 01:50

>>97
耐えろ。
ひたすら突け、あをいころにーを。

ころにーに関する熱い思いはシャア板でどうぞ。

101 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/30 01:52

ふっシャアネタが100とはな。

102 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/30 04:34

>>98
りぽふぇくちんー＞セルフぇ朽ちん
voltex ->ぴぺてぃんぐ（bac midがきれるから）
medium -> serum /抗生剤 free
以上、プロとコールでもっとも注意されている点。

103 ：96：02/01/30 05:03

>>102
抗生剤もなしにしなければいけなかった？俺は入れていないけど。

>>98
cellも7-10日でコンフルエントになるくらいの数にする。
トランスファーベクターも入れていますよね。当たり前か・・・
コントロールをつける。全てのトランスフェクションができないのなら
完全に手法が悪い。その遺伝子だけなら発現する遺伝子が悪い可能性あり

104 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/30 06:59

>>sf9
どういう方式があるのか良く知らないんだけど、うちではInvitrogen（旧Gibco BRL）のBac-to-Bac Systemでやってます。
・バクミドは調整時も含めてボルテックス厳禁。
・キャリアーは入れていません
そんなもんですかな。激しくｶﾞｲｼｭﾂですが参考までに。

105 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/30 08:09

PCRでDIGプローブ作りやってるんですけど、
バンドになりません。
アニーリングの温度を通常より５～７℃下げるだけでいいんですよね？

106 ：う～ん：02/01/30 11:08

102,103,104さん、
ありがとうございます。
キャリアー（線状DNA)を入れたのがわるいのかもしれません。Invitrogenのプロトコル
（冊子になっているヤツ）を読むと入れろと書いてあったので入れてみました。
おっし、もう一度やってみよう。
P.S.
103さん
Cellは、４日くらいでコンフルエントになるようにまいています。10の７乗cell/ml
をSeedに１時間整地です。
104さん
バクミドってなんですか？

107 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/30 16:19

ある分子の神経細胞での局在を制御するアミノ酸配列を調べる実験を始めました。

初代培養の神経細胞に目的遺伝子にeGFPをつないだキメラ遺伝子を導入し観察することを考えています。導入の効率は低くてもかまいません。
ウイルスを用いる以外に、遺伝子導入のいい方法はありませんか？？

108 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/30 16:38

マイクロインジェクション

109 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/30 16:43

神経細胞は一般的に効率がかなり悪いです。
一部の人たちはリン酸カルシウム法を好んで使っているようです。
またマイクロインジェクションの場合、離婚美男とタンパクを
先に作ってから打ち込む方が良いとされています。

110 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/30 16:52

N本ラボ＠慶應医薬理では、CNS,EMBO論文にやたらマイクロインジェクションの実験が多い

うまくいくんか？

111 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/30 20:03

ニトロセルロースメンブレンの上にブロットした核酸に
抗体をくっつける前の変性処理に、電子レンジを使い
たいのですけど、やっている方いらっしゃいませんか？

112 ：102：02/01/31 08:04

>>106
キャリアーってなんのこと？
淫靡のだったら線状ウイルスDNAと組換えトランスファーベクターを入れなきゃ。
ウイルスDNAの切れているところにトランスファーベクターの外来遺伝子が入って
環状のウイルスDNAになるの。

113 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/31 10:37

>110
N本ラボ＠慶應医薬理の論文はヤヴァいのが多くないか？

114 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/31 17:50

ウェスタンのサンプル調製
sample buffer入れてソニケーション
NP-40 lysis buffer
SDS lysis buffer
の使い分けってあるのでしょうか。

115 ：99：02/02/01 00:58

>>112
あ、そうか。Bac-toBacしか使ったことないんで勘違いしてました。
（まさか、ほんとにSalmon Sperm ぢゃないだろうな...）

とすると、やっぱりDNAとリポフェクション試薬の混合あたりに問題がありそうですね。
あるいは、sf9が継代のしすぎでへばってるとか？
「結構感受性変わりやすい」って注意されたけど。

116 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/01 03:21

>>105
おいらはいつもかなーり凄いスメアになるけど、ちゃんとin situで染めるととてもきれいに染まるよ。
もちろん、同じようにスメアになったコントロールのセンスプローブでは殆ど染色が見られなかった。
アニーリングは大体45℃でやっていたように思う。
あと、テンプレートはPCR産物でやった。
とりあえず染めてみたら？

117 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/03 02:51

前スレで2種類の酵素で切る時それぞれのサイトがどのくらい離れてる必要があ
るかの議論があったと思うんですが結論を覚えてる方いらっしゃいませんか？

118 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/03 05:08

>>117
一番切れない制限酵素スレでいま似たような話題になっているぞ
一言で言えば酵素によって違う
NEBのページにある情報によれば2-3塩基離れていれば大抵切れるみたいだけど

119 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/03 05:22

>>117
がいじゅつですがNEBのカタログに、いくつかの酵素については書いてあるから
参考にされるといいですよ。

120 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/03 06:03

ここだねい。ほれっ。
「**一番切れない制限酵素**」
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1003080216/
103以降のレスを見よ。

121 ：120：02/02/03 06:17

>117
前スレのdatファイルが手許にあるからざっと見てみたけど、やっぱり118,119の言うように、
NEB(New England Biolab)のカタログを見ろ、って結論だね。

しかし、このスレの前スレはむちゃくちゃ役に立つなあ。
今dat落ちしちゃってるけど、すぐ見ることもできるよ↓。
http://www.chikara.biz/multi/http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/967541407/

122 ：はあー：02/02/03 17:56

分子量が5,000－6,000くらいのペプチドってpH5くらいだと溶けないの?
30%酢酸とかだと溶けるのは知ってるけど。。。
酵素と反応させたいんだけどどうしたらいいか
誰か教えてもらえませんか?

123 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/03 18:32

ガイシュツだったらすみませんが、どなたかAffi-gel Hzを使って
抗体をカップリングさせたresin を作成した方いらっしゃいます？
抗体カラムを使って抗原を大量精製するのに使ってみようと思うのですが。
これまでにCNBr-sepharose で同様の物を作って試したのですがアフィニティー
が極端に落ちてしまったみたいなんです。このAffi-gel Hz は抗原認識部位が
カップルされないようになっているらしいですが、
（１）resin だけ買って調製ようの試薬は自作した方がいいのか、
　　　或いはキットで買った方が簡単なのか？
（２）resin 1ml あたり最大でどのくらいの抗体をカップルさせる事が
　　　可能なのか？また、用いる抗体はmonoclonal IgG1 なのですが
　　　カップルすることはできるのか？
どなたか教えて下さい。お願いします。

124 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/04 01:23

ドットブロッター使ってブロットする時、使わない
穴ってどうやってふさいでますか？

125 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/04 03:07

>124
サランラップかパラフィルム。
これ最強

126 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/04 03:44

Sypro rubyを使ってタンパクを染色しようと思っていますが、研究室に
レーザースキャナーがありません。
今は核酸用のトランスイルミネーターとビデオプリンターでロール紙に出力しています。
パターンを簡単に確認するだけならこれでもいいんですけど、そろそろ論文用にデータを
残したいと思っています。
ビデオプリンターで出力したものをスキャナーで取り込んでもいいんですけど、
それだと画像があまりきれいではないのです。
（最初に出力されるビデオプリンターの紙が小さいので。）
CBBや銀染の時は直接スキャナーで取り込んでました。
だれか良いアイディア、Tipsを持っている方いましたらアドバイスをお願いします。

127 ：& ◆h1MElHro ：02/02/04 06:39

>123
（１）キットをそのまま使ったことがあります。問題無かったので予算に余裕があるならキットをつかってみては。
（２）Ｒｅｓｉｎ１ｍｌ当たり１ｍｇぐらいのモノクロ抗体をカップリングに使用しました。
但し最初に抗体サンプルのバッファー交換（カップリングバッファーに）が必要でこの段階でサンプル濃度が薄く
なってしまうことを考慮して濃度が２ｍｇ／ｍｌぐらいの抗体サンプルを使ってました。
あとカップリングは抗体の糖鎖を介しておこなわれるはずなのでどの種類の抗体でも問題無かったように思います。
マニュアルを見て確認してください。

128 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/04 06:58

>>118-121
ありがとうございます。カタログ見てきます。
NEBのカタログすごく役に立ちますね。
これだけ使ったら何か注文しないといけないような。

129 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/04 13:23

>>114
どこまで細胞をぶっ壊すかという話。

130 ：123：02/02/04 13:41

>127
どうもありがとうございます。キットを試してみます。

131 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/06 10:14

オイルフリーのPCRって、時々蒸発している気がする、、、
チューブの締りが悪いのだろうか、、、

132 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/06 13:47

>>131
tubeのメーカーをいろいろ試してみるといいよ
うちの部屋は主に8連を使っているけど
以前使っていたメーカーのだと時々蒸発していたが今使ってるのは大丈夫。
キャップをつけるときの感触からして違う。

133 ：131：02/02/06 15:02

>132
どうもありがとうございます
ちなみにどこのメーカーでしょうか？
8連じゃないやつも教えてください
おねがいします

134 ：132：02/02/06 20:22

>>133
ABgeneのを使ってるよ。8連ではない普通のtubeもそれ。
ソレンソンのもなかなか良かったよ

135 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/06 23:54

>134
どうもありがとうございます
カタログで探しでみます

136 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/07 17:40

ミニプレしてプラスミドを取りました。
エタ沈したら大きなペレットができて、260nmの吸光度もちゃんとあるのに、
制限酵素で切って泳動したら何も見えません。一体何が取れたのでしょうか？

同時に処理した別のサンプルは同じようなペレットが出て、吸光度は同じかよ
り少ないくらいですが予定通りのバンドになって見えます。

137 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/07 17:52

>>136
1.制限酵素で切る前のサンプルを流してみましょう。
2.もう一度吸光度を測りましょう。吸光度260nm/280nmの比は？
3.何に溶かしましたか？溶かした時は他のサンプルより溶けにくかったですか？
4.制限酵素は何ですか？切り過ぎたわけではありませんか？
5.ゲルの染色はどの様に行っていますか？

138 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/07 17:54

ペレットはRNAじゃないかな？
RNAを除くための操作（ペグ沈）などやっていますか？
プラスミドがなくなってしまった原因として考えられるのは、
抗生物質を大腸菌培養中にいれておかなかったため、
プラスミド含有菌が極端に減ってしまったことが考えられますが、
普通に気を使ってやり直すことでちゃんと取れると思います。

139 ：136：02/02/07 18:23

>>137
酵素処理前のサンプルでも何も見えません、と思ったら10kより上にうすーい
バンドが出てるのが見えました。
260nm/280nmの比は1.8くらいで、220nmから320nmまでスキャンしても
普通のカーブが出ます。ちゃんとバンドが出るサンプルと同じです。
溶媒はMilliQ水、酵素はEcoRIとApaIです。染色は泳動後にEtBr溶液に15分
つけました。

>>138
RNAについてはKOAc溶液を加えて遠心したあとでRNaseを加えて37℃で30分
処理しました。培養時には抗生物質（カナマイシン）を加えました。濃度は
50ug/mlです。

一つ気づいたのはベクターの説明書に一本鎖DNAが必要な時はXL1-blueや
JM109をつかえと書いてあって、使ったコンピがXL1-blue MRF'なことです。
これは何か関係あるのでしょうか？

140 ：137：02/02/07 18:59

>>137
＞酵素処理前のサンプルでも何も見えません、と思ったら10kより上にうすーい
＞バンドが出てるのが見えました。

取れたのは大腸菌ゲノム。プラスミドが入っていない＝>138の言うように抗生物質が入って無い。やり直して下さい。

他のサンプルには同じバンドはありませんか？
あったなら、実験手技にも少々改善の余地有りですね。
キットを使ってますか？自作の試薬を使ったアルカリ法ですか？

141 ：137：02/02/07 19:12

間違えた自分宛だ。
>>139が正しい。で、ついで。
大腸菌のゲノムが混入するのは、solution2.のNaOHがへたっているか、
solution2,3をいれたあと激しく撹拌し過ぎている、のどちらかだとおもう。

142 ：136：02/02/07 19:23

>>140
いろいろありがとうございます。
ちゃんと取れた方のサンプルではこのバンドは出ていません。
アンピシリン耐性のプラスミドは取れてカナマイシン耐性の物が取れてないの
ですが、カナマイシンは調製しなおした方がいいでしょうか？
コロニーを拾ったプレートでは選択が効いているように見えるのですが。

ミニプレは自作の試薬でやっています。

143 ：136：02/02/07 19:26

>>141
そういえば今回Sol.3を入れた時の沈殿が多くて混ざりにくかったので転倒撹拌
の回数がふだんより多かったです。NaOHもちょっと古いので作り直します。

144 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/07 22:11

たくさんのｃDNAをRT-PCRでクローニングしてるんですが、どうしても、ミューテーションがたくさん入ってしまいます。
どなたか、良い、proof-readingの熱耐性ポリメラーゼをご存じですか？

145 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/08 00:11

>>136
カナマイシンはあんまりへたってるって話は聞かないけれども、
抗生物質がへたってるって可能性はある。
特にテトラサイクリンなんかは光で分解するから
へたり易い。

もう一度やってみそ。

146 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/08 00:45

>>122
アミノ酸組成、アミノ酸配列によると思うけど
pH変えるとか、DMSO、DMFに溶かすとか

147 ：M2 ◆8fbZZkx. ：02/02/08 02:10

>>136
カナマイシンはオートクレーブしても大丈夫。
ヘタることはそうそうないと思われ。
コンピを自作しているのならばカナマイ耐性の菌がコンタミしていることも考えられます。
プレートもチェックしましたか？
それと、ミリＱに溶かすのって大丈夫なんですか？
私はTE or 滅菌水に溶かしています。

148 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/08 02:14

どっかでBL21(DE3)がkan plateでバリバリ生えたとかみたような。
うーんどこだっけ。

149 ：136：02/02/08 03:40

ストリークしておいたプレートからコロニーを拾って、培養をはじめました。
どうなるのかは明日のお楽しみです。

150 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/08 04:55

RNaseいれても、除く操作をしない限り260nmの吸収は見えてしまうような
気がしている私はDQNでしょうか。
私はLiCl沈してますが。

151 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/08 19:23

>144
サイズは？

152 ：144：02/02/08 21:21

>151
2kbから、3kbの間のもの数個です。

153 ：136：02/02/09 00:30

>>147さんが正解のようです。
コンピの菌株がいつのまにかKan耐性のXL10-Goldに変わってます。
他人の作ったものをよく見ないで使った私がバカでした。
皆さんありがとうございました。

154 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/09 05:26

>123
protein-GかAに結合させて、DMPでカップリングした方がきれいでかつ、
早そう。とうぜんprotein-A or Gたから抗体を阻害しないし。
高価なのがもんだいなのか？

155 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/09 13:46

>>150

よっぽどきれいに精製しない限り、吸光度＝プラスミド収量にはならない。
ミニプレップごときには電気泳動でコントロールDNAと比較した方が正確。

156 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/12 14:21

>>144
長いな。制限酵素で切って変異の入って無いものをつなげるわけにはいかんか？
今、使っている酵素は？TAクローニングはしているの？

157 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/20 14:35

age.

158 ：謝辞：02/02/22 03:05

修士課程における研究を進めるにあたり、貴重なご意見をいただいた２ちゃんねらーのみなさんに厚く御礼申し上げます（藁

159 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/22 03:18

>158　修了おめでとう

は～　発現しない予定の実験で発現しちゃったよ。。　もらったBL21が実はDE3ではなかったという
俺仮説が……　やっぱ配列が悪いのか……　あう～ん

160 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/24 00:44

QIAEXIIのシリカは再利用可能でしょうか？可能とすればどうやって保存すればいいでしょうか

161 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/24 11:03

植物系の方に初歩的な質問です。
オーキシン(IAA)による遺伝子発現の誘導パターンを見たいと思っています。
いくつか論文を見たら1u（マイクロ）Mから50uMで使ってるみたいんなん
ですが、一般的にはどの位の濃度が適当なんでしょうか？

あ、材料はシロイヌナズナの芽生えを使って、
処理はIAAを含むMS培地か水に浸すことでやろうかと考えています。

それから、オーキシンってあまり高濃度だと阻害効果がでてしまいますよね？
その境界の濃度ってどれくらいなんでしょうか？

162 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/25 17:52

ブルースクリプトに１５Ｋｂくらいのインサート入れられるでしょうか？

163 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 00:01

>>159
BL21(DE3)でもものによってはプロモーターのリークあり。

>>150
RNaseAを普通の濃度で使っている限りは、分解産物だってエタ沈される。
よってその点じゃあ、あんたは正しい。が、LiCl沈殿は高分子のRNAは除けても分解産物は除けない。

164 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 00:13

KOD plusで増幅した産物(1.5kb)をクローニングしようとしているのですけど、まったく入りません。

165 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 02:51

>>164
そんなんもっと詳しく書かんと答えられんよ。
人にモノ聞く時はもうちっと考えな。
有力と考えられる理由を２つあげといてやる。
俺はやさしいからな（藁
・KODじゃTAクローニングはできんよ。
・制限酵素サイトの「足場」が足りんのでは？NEBのカタログのAppendixにて確認されたし。

166 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 03:17

>>164
クローニングの方法は？
KOD plusは平滑末端クローニング（KOD DASHはTAクローニングできる）。
ベクター側を脱リン酸化してるなら、PCR産物のリン酸化or5'リン酸基のついたプライマーを使用。

それでも入らないなら、一度、ベクターとインサートをモル比でふってみては？
ベクター：インサート＝1:1,1:2,1:5,1:10とか・・・。
あと、LBをSOCにかえただけで上手くいった時もあるよ。

167 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 03:49

Stratageneだかが出してたBlunt cloning kit試してみるとか。
TAクローニング並に簡単だ。
それとなんだかんだ言っても、pET/BL21(DE3)は、163も言ってるが、もれるよ。

168 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 10:12

１６２です。
出来れば、私の方にもアドバイス下さい。
１５ｋｂはラムダフアージのインサート部分（ノット１切り出し）です。

そもそも１５Ｋｂ位のものを入れた前例などが、あるのかどうか
だけでも知りたいです。

169 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 10:37

>>168
p300が入ったベクターがあるんだから15kくらい入るんじゃないの

170 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 12:24

そうですか、有り難うございます。

171 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 15:57

自分は23k入れたことがあります。知り合いには30k入れた人もいる。

172 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 16:31

>168
NotIだとかえって結構むずかしいよね。
インサート：ベクター比をいろいろ変えて試してみてくだされ。
漏れの使った大腸菌はSTBL2（Gibco)でした。

173 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 17:50

>>171
そういうの聞くと、１５Ｋなんて何でもない様な気がしてきます。
有り難うございます。

>>172
えっ、そんなんですか？
ノットは糊しろの部分が多くて、くっつきやすいような
気がしてたので、、。

とりあえずいろいろやってみます。
有り難うございます。

174 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 22:46

>173
糊しろが長い分だけセルフライゲーションも起きやすいから。

175 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 23:01

>>173-174
糊しろって突出の部分の事？EcoRIとかと同じく4 baseですが…
何か勘違いしておられるのでは？

176 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 02:32

40K入れたこと有るけど。

でもDeletionおきちゃうんだよ、大腸菌飼っているウチに。
バッサリ２０k位飛んだりする。

177 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 02:55

これを見ると200kbぐらいでも入るみたいですね
order.lifetech.com/lti_store/flow.icl?sku=11635018
って、全然BlueScriptじゃないやん・・

178 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 17:15

＞＞１６９
随分遅いつっこみだが、p300は９Ｋもないので、一応。

179 ：Chromosome：02/02/28 03:43

染色体標本つくりで１つ教えてください。
固定するときにカルノア液を使いますが、なぜメタノールだけじゃいけないんでしょうか??
酢酸はどのような作用をしているのでしょう??
教えてください。

180 ：関東以南：02/02/28 22:59

西洋ワサビぺルおきしたーぜによる化学発光基質でお薦めありませんか？
あるふぉすにはCDP-Star使ってるんですが。

181 ：↑：02/03/01 01:51

やっぱりDABじゃないの？それ以外使ったことな～し。

182 ：名無しのどりー：02/03/01 02:07

cosmidの扱い方書いた本ってどなたかご存じないっすか。
phageやplasmidは多いんだけど・・・。

183 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/01 19:07

サザンのコツ教えてください。
アルフォス・ＣＤＰ－Starを使っています。
全然うまくいかないんです。お願いします。

184 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/01 19:12

上手にクリックできないんです
『クリックで救える命がある、、、らしいです。』
http://www.dffmedia.com/index.html

185 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/01 19:53

>>182
ライブラリーを作るのでなければ、通常のプラスミドと変わらない。

186 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/01 20:27

こんにちは。
ミントメールというのをご存知ですか？
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下記の説明通り入力すればいいです。
（*がついている部分のみ正確に入力します。）
- First Name*: 姓 → TANAKA
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（住所は正確に入力して下さい。この住所に小切手を送ります）
- City*: 都市名 → TOUKYOUTO, JAPAN
- State*: そのまま
- Zip*: 郵便番号 → 000-0000
- Country*: 国 → JAPANを選択
- Phone*:電話番号 → 国家番号(日本):81 + 地域番号の前0を除いた電話番号
03-1111-1111 → 81-3-1111-1111,090-1111-1111 → 81-90-1111-1111
- Fax:書かなくてもいいです。
- E-mail*: メールアドレス（全てがメールで処理されるから正確に書いてください）
- Confirm E-mail*: メールアドレスもう一回入力
- Year of birth*: 出生年 → 1970
- Gender*: 性別 → Male(男性), Femaie(女性)
- Password*: 暗証番号 (6文字以上)
- Confirm Password: 暗証番号確認, 上記と同じ
- how do you want to receive commissions that you earn?プレゼント選択
*gift certificates(double$$) プレゼント券（2倍） *cash現金
- do you want to be notified when your referrals sing up?*あなたの会員が登録された場合お知らせしますか?
　yes を選択
- 興味ある分野10個まで選択します。（10個以上だった場合、エラーになるから10個まで）

- Submitをクリックすれば画面に thank youというメッセージと一緒にあなたのID番号と
　暗証番号が出ます。そして5分以内にあなたのメールアドレスに加入完了のメールが届きます。

187 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/02 01:48

>183
どういう風にうまくいかないん？
ちなみに俺それ使ったことあるけど最悪やった。
実験めっちゃ遅れてしまったよ・・・代えれるならRIか
ジゴケシゲニンにしな。

188 ：183：02/03/07 18:51

＞187
メンブランにDNA断片が転写されないんです。
転写後のゲルをエチブロ染色してみると
かなりDNA断片が残ってしまっています。
ちなみにゲル１平方センチメートル当たり
３mAで３時間かけて転写してます。
ちなみに転写の前に酸・アルカリ処理はしてません。
何かアドバイスありましたらお願いします。
ポジティブはシグナルでるので試薬のせいではないと思います。

189 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/07 19:15

>>188
電気じゃなくてキムワイプでやってみるのはどうですか？

190 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/11 07:59

皆さんは細胞への遺伝子導入は何を使われていますか？
とある遺伝子をレトロウィルスで発現させてみると、抗生物質に耐性になって
抗生物質を含んだメディウムで細胞が増えるのですが、ウェスタンで確認すると
全く発現していないんです。
１０クローンくらいつくると、そのうち１つがわずかに発現している程度。
何故なんでしょう？
アデノウィルスがもっと強力だ、って聞いたんですけど、どうなんですか？

191 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/11 08:57

>>188
＞ちなみに転写の前に酸・アルカリ処理はしてません。
なにか理由でもあるの？サイズの大きい断片は当然転写される効率下がるんだけど。
どうしても酸処理したくなければ制限酵素の種類変えるなりしてハイブリするはずの
断片を短くするなどすれば大丈夫でしょ。

192 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/11 10:50

>>190
抗生物質耐性になっていることからプロウイルスDNAのintegration&遺伝子発現自体はOK.
「とある遺伝子」はプロウイルスDNAから欠失していませんか？
transientでは「とある遺伝子」発現はどうでしょうか？

193 ：190：02/03/11 10:57

>>192
resありがとうございます。
「プロウィルスDNAから欠失」とは、パッケージ細胞そのものに
その遺伝子がない、ということでしょうか？
実験でレトロウィルスをよく使うのですが、その原理に関しては
いまいちよくわかっていないので申し訳ありません。

194 ：　：02/03/11 13:06

>>188
普通にキムタオルで転写しろ。
馬鹿。

195 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/11 18:14

>>190
1割も発現してるなら喜ばなくてはいけない場合もあると本で読んだ。
2割発現したらラボ全体で祝賀会するような細胞もあるとか。

196 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/11 18:22

それに、レトロはゲノムに組み込まれるからずっと安定した発現が得られる、というのが
原則なのに、実際は一時的な発現のことも多し。
なぜだろう。人体の神秘やなぁ。

197 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/11 22:33

>196
DNAメチル化です。

198 ：192：02/03/12 03:19

>>193
おバカ。少しはレトロウイルスを勉強してから使ってね。

＞「プロウィルスDNAから欠失」とは、パッケージ細胞そのものに
その遺伝子がない、ということでしょうか？

なんじゃそりゃ？integrateしたgeneに目的遺伝子が確かにあるかPCRで確認
したかってこと。メチル化の場合もあるだろうし、目的遺伝子がtoxicであったり
するとdefective mutationが入ったcloneだけが取れてきている可能性もある。

ベクターウイルスを感染させて１～２日後に遺伝子発現がないようだったら
ベクターコンストラクト自体がちゃんと出来てないって事もありうる。
MOI of 1くらいにしてウエスタンにて試してみれ。

199 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/22 10:35

みんな実験してねぇのか？

200 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/22 18:32

うまく行ってるんだよ。

201 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/22 21:22

最近プラスミドがまともに取れないのですが、
何が原因がわからず苦悶しております。

キアゲンのミニプレップやってるんですが、
プラスミドを泳動するとなんかはるか上の方にバンドが
出るのです（１０ｋｂよりも上）。
そんでなんだこれ？と思って制限酵素（一箇所）
で切って流すとサイズ通りのバンドが一本きちんと
出ます。

これってプラスミドＤＮＡの高次構造がおかしくなってる
ってことなんでしょうか？
試薬のｐＨはおかしくはないのですが、何が原因と
考えられるでしょうか？

202 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/23 00:14

大歩危間違い or circular/linear

203 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/23 00:52

こんかたまー？

204 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/23 02:26

どう見てもゲノムのコンタミだろ。cultureのvolumeが大き過ぎるか、Sol2入れた後で激しく振り混ぜ過ぎ。

205 ：201：02/03/23 10:24

ゲノムのコンタミだったら制限酵素処理した後で
１本のバンドになるとは思えないんですけども。
Ｐ２入れた後はかなりケアして５回くらいinvertさせる
だけです。

ちなみに昨日もう一回培養してプラスミドを取ったら
普通のバンドが出てきました。

原因はいまだに不明。

206 ：670：02/03/23 11:33

3回 invertで充分と思われ

ところでプラス実度がちゃんとトランスフォームされてるの？

207 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/23 12:15

>>205
切った奴もう一度ligationしてみたらどうよ？
工事構造ならまた上の方のバンドが復活するかも。

208 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/23 13:04

>>201
んなこと良くあるよ。高次構造だ。
エクス寅が一本どころか５本くらい出てきて驚くこともある。

209 ：201：02/03/23 13:21

>>208

よくあることなんですか？それは驚き。

ちなみに今朝またプラスミドを取ってみましたが、
比較的まともな感じでした。
でもハイパーコイルっぽいバンドはないです。
制限酵素で今きってる最中ではありますが。
また、midiでも今取っている最中です。

>>207

切った奴をまたライゲーションですか。
試しに１サンプルだけやってみます。

210 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/23 13:32

>>205
ゲノムのコンタミは制限酵素処理で切れてスメアになるが、プラスミド
のバンドに比べて薄いから見えないんでしょ。
ゲノムのコンタミの理由としては、プラスミドが大腸菌にtoxicで、溶菌
してるって可能性も。

211 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/23 14:14

ビタミンＣを用いて、ストレス性胃潰瘍を緩和させる
実験を、マウスを使ってやりたいと思ってる者ですが、
この場合のビタミンＣの有効量がわかる人はいませんか？

212 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/23 21:28

マウスってビタミンＣを自分で作っているって聞いたことがあるような気がする
のですが。

213 ：２１１：02/03/23 22:27

＞２１２
マウスを２４時間絶食させた後に、水につけることで
マウスに人工的に胃潰瘍を作ってビタミンＣの効果をみようと
しています。その際どれだけのビタミンＣの投与で、マウスに上記の
ストレスを与えても、胃潰瘍を発症しないかを知りたくて、文献を調べた
のですが、その有効量がのっているものが見つからなくて困っています。

214 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/24 00:06

夏休みの自由研究レベルの実験だな…

215 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/24 01:17

>>212
その通り。マウスは自分で合成できる。
犬や猫など、他の殆どの動物も合成できる。
できないのは人・猿・モルモット。
ラットはビタミンＣ要求性の品種があるそうだ。
正直、>>211の前途には涙を禁じ得ない。
http://www.clea-japan.co.jp/animals/b4-top.htm
http://group.lin.go.jp/data/zookan/kototen/spacial/s004.htm
http://www.asahi-net.or.jp/~bh2h-ooby/usaginoheya.htm

216 ：sage：02/03/24 02:20

>>212
有効量を明らかにする実験ではないのですね。
なんかアスコルビン酸を飲ませると「スッパスッパ」ってマウスが嫌がるらしい。

217 ：２１１：02/03/24 04:09

いろいろとご意見ありがとうございます。
やっぱりこの実験は無理そうですね。

218 ：215：02/03/24 05:05

>>217
感謝の気持ちがあるなら後学のために聞かせれ。
学年（学部、Ｍ、Ｄ）と学科（生物、薬学、家政、etc）。
あとその実験は自分だけの思いつきか、教官がやれと言ったのか。

219 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/24 10:31

193なんですが、レトロウィルスで遺伝子を発現させると非常に強く発現するのですが、
飼っているうちに次第に発現が弱くなっていき、最後には消えてしまいます。
免疫染色で確認すると、全ての細胞が弱くなってきているのではなく、all or nothing
のようです。もちろん、選択する抗生剤入りのミディウムで飼っていますが。
これってやっぱりメチル化なんでしょうか？

220 ：２１１：02/03/25 03:17

＞２１８
薬学部の二年生です。
クラブ活動で簡単な実験ができるので、
今年はこんなことをやろうかなと思って書きました。

221 ：hh：02/03/25 11:04

>211 まだ見てるか？このすれ。

マウスＶＣ合成→ＶＣ投与意味なし。
なんでこう結論できるのかい？
もっと柔軟に考えるべきよ。

たとえば、必須アミノ酸。
それだけとってりゃあとのアミノ酸は不要という意味か？
確かにそれ以外は合成できるけど、外から摂取したほうが
効率いいし、生体は実際それを利用してる｡

ただ、部活なら、お奨めできる研究発想じゃないな｡
はいて捨てるほどの研究者でそんな計画立てるの３０年前ならともかく意味なし。

まじめに考えるなら
ＶＣとの複合要因（同時摂取の栄養素など）を
加味するなど、変更すればまだまだやられていないこと多いが、
むしろ、
お遊びにならない程度なら
地域性や特殊な状況を計画に加えるといいと思う｡

低インスリンダイエットみたいなものを否定できないところなど、
栄養学は他分野に較べ１０年位は研究が遅れているところを
さらけ出したともいえる｡
付け込む余地はあるともいえるな。

222 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/03 20:31

age

223 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/03 20:48

こんなのはどお？
http://www.media-0.com/www/smile/iriki.html

224 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/20 21:24

みんなうまくいってるみたいで何よりage

225 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/21 00:14

実験で上手く行かないこと：教授とそりがあわない。それに尽きる。

226 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/21 02:18

それほんとつかれまーす

227 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/21 07:03

エレクトロポレーションで培養細胞にプラスミドを入れようとしています。
うちのラボにある機械では電荷の量を設定できないのですが、
電圧とパルスの長さだけ他のプロトコルに合わせてもうまくいきません。
どなたか同じような機械をお使いの方はいらっしゃいますか？

228 ：三木（東京）：02/04/21 07:31

自分の人生もう終わり、と思う方は見ないで下さい！！
いやこれからだ、まだまだと思う方のみ、ご覧下さい！！
あなたの意欲を現実に展開していく方法論をお見せ致します！！

http://www.dream-express-web.com/mog.htm

229 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/21 11:32

なんて機械？書いた方がいいかも。>>227

230 ：227：02/04/21 20:56

>>229
BTXという会社の奴です。
ElectroSquarePorator T820という型番です。
メーカーから取り寄せたプロトコルではいまいちうまく行かないので
他の方の意見が聞けたらと思ってます。

231 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/22 12:38

232 ：ヘボ院生：02/04/27 13:28

RT-PCRについての質問です。
ある培養細胞のある遺伝子（A）ｍRNAのalternative splicing別の、
経時的的変化をRT－PCRで検出しようとやってます。
（Northernでは両者の区別がつかないため）
定量性を持たせるために、HPRTをcontrolとして用いています。

そのPCRにおいて、
①１つの反応サンプルに（A）とHPRTの２組のプライマーをぶち込んでやるときと、
②（A）とHPRTを別々の反応系で（但し同条件で、両者ともプラトーには達していないサイクル数）やったときでは、

EtBr染色での（A）のバンドの強さの経時的変化が、①と②ではけっこう異なるように思えます。
（①では（A）の明らかな発現低下がみられたものの、②では（A）の発現低下があまりみられない＝統計処理でなんとか有意差をひねり出せるかどうか程度？）
自分としては①条件で再現性がとれれば、そのデータで突っ走りたい＝論文fig.に採用したいと考えていますが、
そもそも、一般的に①の目的の遺伝子のプライマーとコントロール遺伝子のプライマーを１つの系に入れて、
その変化を評価するというやり方は、②の別々にやる方より妥当なのでしょうか？

皆さんの意見や経験を伺いたく存じます。

233 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/27 18:42

>>232
うまくいくときは、1でも2でもうまく。
・増幅長が長いと定量性に欠ける。＞300bp以下が目安。
・EtBrでもサイバー（金も緑も）でも、さらに其れがアトゾメでもサキゾメでも
アガロースゲルで泳動をすると定量性に欠ける。＞あくりどアミドゲル

234 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/27 18:43

「いく」ことを忘れた。

235 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/27 22:34

定量性はプロテクションアッセイがいい
alternative splicingの研究なら，定量データはそんなに重要でない。

236 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/27 22:47

投票２３：００で終了。
投票所４７スレ
http://live.2ch.net/test/read.cgi/vote/1019846325/l50
にて
<<生物>>　（<< >>は半角）
コメント
接続方法（CATV ADSL等）
をカキコして、投票をお願いします。

237 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/28 20:40

CDP-Star（ブロッティング用化学発光基質）はニトロセルロースメンブレン
では使えないってか？
膜が疎水性でなきゃダメってのはどういうことだ？
氏ねやTropix!!

238 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/28 20:45

ニトロセルロースはもろいからいやん！

しかしその基質、
ほんとに膜が疎水性でないとだめなの？
ECL ならどちらでも可と思ってたよ。

239 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/28 21:20

＞238
Roche社DIGの説明書の一部を訳すと

「化学発光アッセイには疎水性の表面が求められるため、
一般的なニトロセルロースは使用できません。」

だってさ。感度が極端に落ちるんだと。
　

　

240 ：238：02/04/28 22:34

>>239
レス、ありがとう。
そういうのもあるんだね。

241 ：232：02/04/29 11:34

>>233,235
コメントありがたく参考にさせてもらいます。
Medlineでsemiquantitative RT-PCRをやっているpaper見てみると、
どちらにしても、(A)/control gene(GPDH,actin etc)で評価しているようですが
やはり②が多く、①でやっているのは少数派なようですね。

他の方でも、コメントありましたら、お願いします。

242 ：ひよこ：02/04/29 12:20

知ってる人いたらアドバイス下さい。
バクテリアゲノムをSau3A1で部分分解して、ゲル泳動切り出しにより3-6 kbp
を取ってきてpUC118に組み込み、ライブラリを構築したつもりです。
XL1-Blueに形質転換し、Xgal-IPTGプレートにまくと、青コロニーが7割を占めるのですが、
俺ヘタクソでしょうか？やっぱりインサート、ベクターとも超遠心しないとダメ？

243 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/29 16:37

ひよこさん
やはりベクターの調整ではないでしょうか？
うまく脱リン酸化できていると、ほとんどブルーは出ませんでした。

244 ：ひよこ：02/04/29 19:04

243様
アドバイスありがとうございます。
ベクターは、Bam H1で切断、バッファー交換後、CIAP処理し、失活
(5mM EDTA存在下75度15分)後、ゲル泳動して切り出ししています。
切れているものだけとっているつもりですが。

245 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/29 19:57

インサートの量を増やすのもいいと思うが、２つ入る確率が増えるので後の解析では
気をつけてね。

246 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/29 20:12

聞きたいことがあるのですが、組織培養なのですが、トリプシンを加えた後攪拌後、
上清をのぞき、ＭＥＭ培地を加え、再度攪拌するのですがなぜＭＥＭ培地なのでしょうか？？

247 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/29 21:43

インサートを増やしまくると、驚くほど白くなるな。
９９；１くらいになるときがある。
あれはびっくりする。
でもちゃんと入って成功してるんだよね。これが。
しかし、やっぱり２つ入ってたりする。
まあモル比で
インサート：ベクター＝１０：１くらいにしとけば白いのでまくりで
気分がいい

248 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/30 02:18

>>246
トリプシンの反応止めるだけっしょ？
培地なんて別になんでもいいんじゃない？

249 ：ひよこ：02/04/30 06:16

245、248様
アドバイスありがとうございます。
インサートの量を増やしてみます。インサートがブロードなので良くわからないですが、おそらく
5：1以下ではないかと思いますので。構築後、ポジティブスクリーニングが可能な実験を想定して
いるので、多重に入ることは想定しつつ、とりあえず進めていこうと思います。

250 ：243：02/04/30 06:21

ゲルから切り出すと、トラブッたことがあります。
フェノ抽、エタ沈が堅くてよいとおもいます。
（うまくいけー、うまくいけー）＝催眠治療付！

251 ：ひよこ：02/04/30 15:54

243殿
ありがとうございます。
いくつかのパターンでやってみます。

252 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/30 23:31

トランスフォーメーションがうまくいきません。
ジーンパルサーつかっててプロコトールどおりやってるのですが・・・。
何かコツがあるんでしょうか？

253 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/30 23:32

>>248
１行目は正しい。
２行目はちょい違う。血清中にトリプシンインヒビターがござる。
まあ、培地を加えることで薄まるという効果はあるかもしれんが。

254 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/01 00:18

>>252

もっと細かくお前の条件をおしえろよ

255 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/01 07:55

>>254
そういう人だから上手く行かないんだよ

256 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/01 11:40

>>255に禿同
「プロトコル通りやってるのですが」
「普通にやってるのですが」
と言う奴は研究者不適格。
問題あるからうまくいかんのだろがヴォケと言いたくなる。
要するにこの手の発言の真意は「アタシ悪くないもん！」という自己弁護だ。

257 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/01 12:07

>254-256
まあまあ、その気持ちは判るけど、いぢめるなよ。

>>252
コツは有ります。でも、教えません。それ以前の問題でしょうから。
どのようなサンプルを、どのような対象に入れたいのかぐらい書いて下さい。
ベクターだけで試してみましたか？つうか、始めてやるならそれぐらいやるよな当然。
ついでに、ライゲーションサンプルなら、そっちも疑いましょう。

258 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/01 14:31

この度pETを用いてタンパクを作製します。そこでOrigamiのコンピテントセルを作るのですが、プロトコルが見あたりません。
XL1など他のプロトコル通りにやれば良いんですか？　どなたかご存知の方よろしくお願いいたします。

259 ：>258：02/05/01 15:56

http://natto.2ch.net/test/read.cgi/life/982464137/l50
ここで聴いてごらん。

260 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/01 20:39

＞252
ヒートショックでやりなさい

261 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/02 00:17

白コロニーなのにインサートが入っていません
何故でしょうか？

262 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/02 00:22

＞261
laqzの基質を入れ忘れている。
あるいは、その濃度を間違っている。
あるいは、分解してしまっている。

263 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/02 00:27

>>261
サテライトだったりして。

264 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/02 02:02

は？白なのに入ってないなんてよくあるじゃん
>>262-263
は自分で実験してるか？

265 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/02 02:46

>>264
> は？白なのに入ってないなんてよくあるじゃん
白なのに入ってない奴がよくあるけどあれって何なんだろーね～くらいの気分で聞いているのかも。

266 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/02 03:37

>>265そうでしょ？ふつう

なのに全部白になってしまう状況についてかんがえてる２６２やら
明らかにちがう２６３は何をお考えなんだろうか

で、なんなの？実際

267 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/02 06:24

>>266
262、263は261への返答としては、間違ってはないんじゃない？
すぐ上のエレポねたでは、質問者の情報提供がなってない、
ってことらしいから。

268 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/02 11:29

>>264-266
ここは「▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼ 」スレッドです。

今困っている事について相談するところなんだから、262,263はおかしくないだろ。
実験で上手く行かないなら、インサートチェックを何でやったか言わないと判らないよ。

まあ、実際は菌体やプラスミドに変異が入っていたりするだけだろ。
それか、インサートが入っていないように"見える"だけで、実際は小さいのが入ってるんだろうよ。

269 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/03 00:36

白なのに入ってない奴がよくあるけどあれって何なんだろーね

270 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/03 01:20

つうかジーンパルサーってなんだ？知らないや。

271 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/08 12:16

age
ついでに、>270
エレクトロポレーション用の機械だよ。

272 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/08 14:02

蛋白で、ＲＮＡレベルでちゃんと発現しているのに、蛋白になると
ウェスタンで全く何も見えない事ってありますか？
もちろん、ＲＴ－ＰＣＲしてシークエンスしてもミューテーションはありません。

273 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/08 19:00

>>272
きわめて限られた例ですが、何かの遺伝子のmRNAの相補鎖をコードして
いる領域があるようです。こいつはgene silencingを起こしてその
遺伝子の発現を抑制しているんだとか。こいつは当然タンパクを
コードしているわけではないので、mRNAがあってもタンパクは
ありません。

既存の遺伝子とblast検索してplus/plusでヒットするならこういう
ことはまずないとは思われますが。

274 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/08 20:02

>>232
その前に、mac使いなさい

275 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/10 01:04

>>272なんか導入遺伝子ぽい書き方と思ったのは俺だけ？
だったら翻訳開始効率がどうこうってことない？ないっすか、そうっすか。
>>274わらた。まあしかたがないということで。

276 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/16 13:35

保全age

277 ：227：02/05/19 05:44

>>231
たいへん遅くなりましたがありがとうございます。
電圧低め、時間短かめの方向でいろいろいじってみてます。
効率は上がったのですが細胞が死ぬ数も増えてしまってまだまだです。

278 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/28 00:00

最近実験してないのか？>>all

279 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/28 00:37

エレクトロポレーションのコツ教えてください。

280 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/28 05:06

微小電極にＫＣＬがうまくはいりません。
コツを教えてください

281 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/28 09:02

>>280
処女とやるときのように、そっと入れる。

282 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/28 09:18

あぶって細く引いたイエローチップでﾕｸｰﾘ挿入。
数こなすべし。

283 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/28 10:05

イエローチップってマイクロインジェクション２００μとかで使うのやつですか？

284 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/28 12:59

ふつーの200μのチップでいいYO!

285 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/28 13:12

＞280　イントラ？　3M？　シリンジとガラス管に入れるチューブの間にディスポの0.2umフィルターかましてから入れる。
芯入りピペットを使う。芯入りで空気が入ったら指でたたいて取り除く。
まあ、あまり邪魔にならんが電極抵抗以上の抵抗値を作ったり、ノイズ出る時あり。
微小に限らず、全て基本的にフィルタをかますべし。282のはポリエチレンでも自作可能。製品も多数あり。WPIから。

286 ：２８０：02/06/28 14:04

>>282
とろとろに溶けてしまいます。コツってありますか？
>>284
わかりました。
>>285
ガラス管微小電極に注射器で３MKCｌ入れてるんですよ。
で、空気が取れないんです。
こつこつたたくとすぐ折れるし。
30分たたいても、空気出て行かないし・・・
コツってありますか？

287 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/29 05:37

電極抵抗はどのくらい？　たたくのもこつがいるし。イントラでないのならシャンクを短かめに引くとか。
あと、基本的に注入する時にできるだけガラス壁面にチップの先端をおしつけて、その隙間から空気がもれないようにする。

288 ：同上：02/06/29 05:40

熱でとかして細くする場合、あぶって柔らかくして、
「そこで熱源からおろして」
引っ張る。あぶりながらは無理。要練習。

289 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/29 06:36

>>288
要練習同意。

アルコールランプぐらいの弱めの火であぶって、火から下ろしてから
一気に引く。適当なとこで切って使う。
あとは>>287。

290 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/09 20:22

研究室に配属されたばかりの学部生です。

BigDyeによるシークエンス反応物を生成する際に、
70%EtOHでwashするところを99%でやってしまいました。
このサンプルは作りなおさなければだめでしょうか？

１サンプルだけ流してみれ、と言われればぐーの音も出ないのですが。

291 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/09 20:57

考えればわかるっしょ
エタチンからやったらどーよ
カラムかけてもえーけど

292 ：七氏げのむ：02/07/09 21:10

＞２９０　それは大丈夫だと思う。（９９％でも塩などは　結構とける）

293 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/09 21:11

そのままで大丈夫。

294 ：290：02/07/09 23:45

>>292
>>293

ご助言ありがとうございます！
そのままでいってみます。

295 ：もうすぐＭ１：02/07/13 22:03

９６ｗｅｌｌのプレートで、細胞を蒔いてから、メディウムチェンジをしたいんだけど、
カウントするとどうしても、中央列６・７列に向かって細胞数が多くなってしまいます。
どう考えても、アスピレート（吸引）のときに端は吸っちゃってるみたいなんですけど、
何かいい手技あれば、教えてください。器具でもＯＫです。
細胞数はＷＳＴ－１でカウントしています

296 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/15 22:48

トリチウムちみじんでラベルしたDNA溶液のちみじん濃度を
測ろうとしてRI室へGo。
TEに溶かしたDNA溶液を液シンカクテルに添加したらDNAが
沈殿してきたんですけど。
これはDQNですか？

297 ：290：02/07/15 23:46

問題なく読めました、ありがとうございました。

298 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/17 01:56

TAクローニングでインサートを入れすぎると根が紺よりもコロニーが出なくなることありますか？

299 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/17 03:50

>298
インサートの長さ、量、べクターの長さ、量が分からないと答えようがない。

300 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/17 10:17

>>298
インサートの状態や根が紺の取り方にもよるんじゃない？
インサートにPがついていればそうなるかもしれんし、
インサートがEDTAの多いバッファーに溶けていて、根が紺を水で
volume合わせていたらそうなるかもね。
それと、ベクターとインサートの比率は重要でしょ。
インサート多すぎるとベクターの両端に別のインサート分子が
くっついてしまう確率が増えるので、コロニーは出にくくなるはず。

301 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/17 18:56

>>295
96wellの端は乾燥したりして培養液の状態が悪くなる事が多い。
そのせいで増殖が悪かったりする事はよくある。
気になるなら96wellの端の列は使わない事だ。

302 ：もうすぐＭ１：02/07/17 23:30

>>301
アドバイスありがとうございます。中央の縦６×横１０でまいています。
最外周はまいてないです。
濃度をいろいろ変えて、処理したいときはどうしたらよいものでしょうか？
なるべくバラツキを少なくしたい、というのが本音ですが、ラボによっては
縦６×横４を２つ、中央２列をはずすという手法もあるようなのですが、
いかがでしょうか？

303 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/18 14:32

プラスミドライブラリーのよい増幅方法を教えてください
半固体培地を使っていますか?

304 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/18 18:12

>>295
面倒だけどピペットで吸引したら？

305 ：301：02/07/18 19:30

>>302
むむ・・最外周以外そんなにばらつくとも思えないんだが。
96wellじゃなくて24well x3枚くらいでやったらいかんの？

あと、中央に向かって細胞数が多くなる傾向があるのに
なんで細胞を吸引してると思ったのさ。
それはつまり中央列は細胞を吸引しにくいという仮説
を立てた事になる訳だけど、そんな事あると思う？

306 ：295：02/07/18 22:22

>>305
スクリーニング試験をしているので９６ｗｅｌｌを使っています。

ご指摘の通り、吸引過程に原因があると考えるよりも、最初に細胞を蒔く過程に
問題があると考えた方がいいようですね。

やはりリザーバーと８チャンネルを使って細胞を蒔くのがベストなのでしょうか？？

遠沈管と分注ピペットを使う方法だと、どうしても最初に細胞を蒔いたところが
多くなる傾向があるのです。
細胞をまいた後の薬物処理は、分注ピペットでもＯＫのような気がするのですが、
>>305
さんはどのようにされていますか？

307 ：305：02/07/19 22:13

最初にまく時分注ピペットは使わないなあ。
なんか分注してる間に細胞が沈んでいきそうな気がするんだよね。
自分はリザーバー＆マルチチャネルですな。

それ以降は分注ピペットでも良いと思われ。

308 ：もうすぐＭ１：02/07/19 22:49

>>305
アドバイスありがとうございます。
がんばってみます。

309 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/20 15:10

あのー、primary cultureでLipofectionでは導入効率悪い（１０％以下）ので、
Electroporationしたら、まだましな効率（～２０％）になりました。
（GFPにておおよその確認）
これをLuciferase　assayにも使おうと思うんですが、
ElectroporationでLuc assayしたのってほとんど見かけないんですが、
実際今までされた経験のある人、手ごたえどうですか？
やぱーり、elepoのダメージが大きくて、
lipofectionより導入効率上がったものの、
Luc活性は変わらない・むしろ下がったとかいう、
意味ないじゃん状態ことあるんでしょうか？

310 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/20 15:12

えーっと、５％の導入効率でもいけます。
Lucの発言量（どのpromoter使ってるか知らないけど、俺のは）がむちゃくちゃ多くて、
活性が強いからいけました。
ちなみに、Promoter regionの決定につかったんだけどね。

311 ：309：02/07/20 15:23

>>310
そんなもんなんですか・・・
導入効率、もしかしたら1%程度かもしれないんで・・・＜ウチュ

312 ：奈奈氏：02/07/21 01:31

すみません。まえにもあるかもわかりませんが私もベクターとインサートのライゲーション
がうまくいきません。2つの末端のうち片方のみが平滑末端です。またベクター、インサート
ともに約3kbあります。濃度の比としてはベクター：インサートで1：2の割合でやってい
んですが、みなさんはインサート比をもっと高くしてやるもんなんですか？ちなみに
タカ○のキットを使っています。

313 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 03:16

>>312DNAの純度、制限酵素などの条件がよく分かんないけど単純に
ｲﾝｻｰﾄ増やせば？１０倍くらいに....
あとﾗｲｹﾞｰｼｮﾝさせてる時間を長くするとか....
もっと詳しく書かないとアドバイスしようがないよ。

314 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 04:15

エタチンしてからやってみたら（何となく）

315 ：k：02/07/21 10:43

＞３１３　　もしベクターだけがセルフでつながったのがたくさん
できてしまうなら　もっと注意深くベクターのアームを調整する必要があります。
一番良いのは、ベクターにおいてたとえば　SmaI - HindIIIアームを
つくるというとき、　　（ベクターから切り出される断片中に）両サイト間
にSalIがあり　SalIが　（ライゲーションしようとする）インサート
配列にもない　ユニークなものだとすると、
セルフらいゲーションー＞　SalI　がまだふくまれている
上手くいったライゲーションー＞　SalIを失いインサートがはいる
というようにSalIに関して　有無の差ができるので、
ライゲーションの後、ligase熱失活し、SalIで切ることで
セルフによるバックグラウンドを下げることができます。

316 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 17:35

>315
なるほど！それいいね。使える。
ひょっとしたら有名な技？

317 ：奈奈氏：02/07/21 21:10

>>313
NheⅠ、SwaⅠでカットします。インサートを増やすときというのは、増やせば増やすほど
いいもんなんですかね？今日は1：5の条件で（60分間）ライゲーションしてまいて来ましたが、
残りはまだ16℃でライゲーション反応させてるんでそれをまいてみるのも1つの手ですかね？

318 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 23:12

>317
ちゃんと切れてる？
アガロースで流してみた？
ベクターはPとばしてる？
ネガコンとってる？
形質転換後にコロニーは生えてくる？

俺の経験上blantをligationさせるときは16℃、O/Nのほうが
効率がよくなる場合がある。

319 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/22 01:49

>>317
ベクター切れてないに一票。
ベクター切った後に泳動して切り出すという手もあるよ。
おそらく回収率の問題だろうけど、形質転換効率がかなり下がるので注意。
生えてきたコロニーはほぼ１００％インサート入ってる。

320 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/22 04:17

入りが悪いだけなら、５倍ﾐﾆﾌﾟﾚｯﾌﾟすればｲｲ

321 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/22 14:36

M1なんすけど、完全精製した蛋白を遠心して脱塩濃縮するときに
ミリポア社のUltrafree-MCを使っていて
サンプルのロスが多くて困っています。
濾液と廃液の両方でOD280から算出できる蛋白濃度と液量の積が一致するので
膜を抜けてしまったのではないかとあわてています。
濃縮サンプルはアミノ酸配列の解析に使うので
ここでロスしては具合が悪いのです。
分画分子量10000,サブユニットの分子量約55000,
5000xgまで遠心可能な所を3000xgまで遠心して
膜が破れないように気を遣っていますが
なにかほかにサンプルのロスを防ぐ方法がありませんでしょうか？

322 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/22 15:31

ligationのときにNaClを加えてみてはいかがでしょうか？

323 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/22 15:53

>317はその後うまくいったのだろうか.....

フォローｼﾙ！

324 ：よねんせい：02/07/26 01:52

免疫染色が……うまくいかない…(T-T)
キット使ってやってるのに(-_-;)
凍結切片→電子レンジ処理→後固定→MeOH処理→Blocking→
→１次抗体→２次抗体→ABC→DABとやってます。
バッファーにはTBS-Ca。１次抗体はウサギポリクロで37℃２時間。
Blocking、２次抗体、ABCは室温30分です。
１次抗体、２次抗体、Blocking剤の濃度は振ってみました。
何かアドバイスがあったらお願いします。

325 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/26 03:15

ﾎﾟｼﾞｺﾝとってみたか？
大体相談するのにうまくいかないだけじゃ答えようがないだろう。
どううまくいかないか細かく書けよ。

326 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/26 03:22

レンジでチンしたら切片が白い塊になってしまうんです

327 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/26 03:28

使ってるkitは？

328 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/26 03:44

電子ﾚﾝｼﾞやめれ！

以上、終了。

329 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/26 13:51

>>328に同意。
プロトコルをまるまる信じるのは、どうかと思うよ。
各処理ステップの意味はちゃんと分かっているの？

330 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/26 14:19

MetOH処理も要らん。ホルマリン固定だけで良い。

331 ：324：02/07/27 02:23

レスしてくれた皆さんありがとうございます。
いまのところBGが薄く出てるだけでポジコンも出てません。
一次抗体はもらい物なのですが、先方で確認はしてあるということなのでこちらではしてません。
一次抗体のチェックをした方がよいかもしれませんね。
使ってるキットはVectorのR.T.U. VECTSTAIN UNIVERSAL Elite ABC Kitです。
プロトコルは全てそのまんまやってるわけではありませんし、
一応各手順の意味は理解してるつもりです。。
MeOH処理と電子レンジ処理はプロトコルには入ってません。
最初プロトコル通りにやってみてうまく行かなかったので試してみました。
電子レンジもMeOHも全部やってるわけではなく、毎回１～２枚をやってみてます。
もちろんそれに対する対照は各回とってあります。
前回はMeOH処理と電子レンジ処理両方をやってみてそれでもうまく行かなかったので
ついつい焦ってあんな書き込みをしてしまいました(^_^;)

332 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 01:20

PCRと泳動についてです

サンプルを泳動してもバンドがゼロでした。
親切なことに分子量マーカーも出てませんでした。
泳動はミニゲルセットで水平方向に泳動しました。
　
原因はPCR反応及びそれ以外ではどのようなことが考えられるでしょうか？
特に下記に問題が無かった場合。
作製したゲルは1.4ｇ/Lアガーで厚めでした

1：ゲル及び泳動バッファーのTBE濃度、エチブロ濃度
2：分子量マーカーの作製
3：泳動時間

333 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 01:31

>>324
確実に反応の出る抗体でポジコンとってみな。
それで出なけりゃ抗体じゃなくテクニカルな問題だから。

334 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 01:32

>>332 逆に流した

335 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 01:56

ん？1.4 g/l のagar?
よく知らんのだけどでかいの流す時はそんな感じなんかナ。
/100 ml 程度のagaroseが普通かと。

336 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 03:03

>334
明日確認してみますが、他の人も使っていのでそれは無いと思われます

>335　＆　オール
すみません！！　1.4％アガーのゲルでした！！ごめんなさい

337 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 03:35

ウェルに穴があいていた

338 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 03:50

>>337
最近漏れもそれやりました。
でもアプライしてるときに異変に気付くよ、普通は。

>>332
ミニゲル泳動装置の接触不良は？
3：泳動時間
ふつうBPB等の色で見るでしょ。時間はあくまでも目安にすぎない。

UVランプが切れていたなんてオチは・・・ないよな（藁

339 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 05:03

マーカーすら出んところを見ると
>1：ゲル及び泳動バッファーのTBE濃度、エチブロ濃度
ｴﾁﾌﾞﾛが腐ってた、って思いたくなるんだけれど。

こんなことしてる間にもう一度やったほうが早いと思われ。

340 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 09:57

>>332
キミはきっちりプロトコルを読んで、一字一句確かめながら実験をやりなおす必要がありそうだ。

341 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 11:38

堀越ラボのプロトコール・実験ノートの書き方はすごい！

342 ：332：02/07/30 12:34

>337
入れた後、ウエルの色を見ることで漏れてないことが確認できました
BPBでは流れきってないことが確認できました。

>339
すみません　エチブロって腐るんですか。知りませんでした。ｲｯﾃｷﾏｽ

343 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 12:45

PCRで増やした断片長は何bpくらい？
マーカーが分解してるのかもよ。

もしくはｴﾁﾌﾞﾛが薄すぎるか...

344 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 12:57

>>341
あれはすごいね。。

345 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 14:22

実験ノートスレで教えてあげて>>341,344

346 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 15:47

蛋白をPVDF膜でアクリルアミドゲルから転写したあと
アミドブラック10Bで染色するところを
間違えてCBB R-250で染色してしまった
どうしよう・・・

347 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 15:50

>>346手遅れ。やり直せ！

348 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 16:12

>>346
何に使うつもり？
免染だけなら、多少染色性が落ちるけど大丈夫だよ。
MeOHを使わないで脱色すればいいよ。

349 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 17:36

>348
アミノ酸配列解析なんですけど・・・

350 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 17:44

>>349
やり直しかな。非常に貴重なタンパクならやってみても
良いかもしれないけど。普通はやり直すね。

351 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 17:48

ノーザンでゲルをエチブロで染めたときって、よく洗ってエチブロを抜かないとだめなんですか？
ゲルを染めすぎてピカピカな状態(かろうじてrRNAが確認できる)でやったんですけど。
これって失敗した原因の１つになるんでしょうか？
ちなみにメンブレンもピカピカでバンドも何も見えませんでした。

352 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 17:50

＞351

氏ね。Etbrが濃すぎる。

353 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 18:35

気にするな
問題ない
ハイブリの後に良く洗え。
352はアポ。

354 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 19:40

>347,348,350
レスありがとうございます
やり直してみます

355 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 19:55

>>351
Et-Brは失敗の原因ではないと思うが、ふつうノザンのゲルをEt-Br溶液に
放り込んだりせんでしょ？ゲルにEt-Br少量入れてそのまま泳動→撮影で
しょ。

おもうにRNAが分解して一面ﾋﾟｶﾋﾟｶになったんじゃないのか？

356 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 20:04

あまいな、分析が。
若造。

357 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 20:19

ノーザンのこと、何でノザンっていう奴いるのかな？
それも結構いる。
英語できないの、お前、って感じがするのは俺だけなのか？？

358 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 20:25

>>357
あんただけだよ(ｯﾌﾟ。

359 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 20:37

>>357
どっちだって良いじゃない。向こうに行って言ったら笑われるかも
知らないけど。

360 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 20:38

>355
リボソーム見えてるって言ってるから分解はしてなんじゃない？

361 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 20:39

>>355
そりゃ考えすぎだよ。
でもほんとにそうだったら笑うけど。

362 ：332：02/07/30 21:21

すみません
泳動バッファーを更新したら分子マーカーは今より見えるようになりました
バンドは薄かったですが、前よりかは濃く見えるようになりました
ゲルを今より薄くつくり、PCRを少し検討してみます
ありがとうございました

363 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 22:12

学会の抄録など字数に制限があるときノーザンをノザンとすると一字節約できるよ．
プラスミノーゲン→プラスミノゲンとか．他にもいろいろなパターンがある．
ただそれだけの理由だと思うが，たまにほんとにノザンという言い方が正しく，
ノーザンが誤りだと主張するヒトもいる．（ﾄﾞｷｭｿ？）

まあ，半角ｶﾅの使用が一番イイと個人的には思っているのですけれども．（藁）

364 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 22:18

>>362腑に落ちない話だ。

365 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 22:28

＞363
講演要旨集とかなら分かるけど、発表でノザンって言うなよ。
厨房以下だ。
スペルアウトできないんだろうな。

366 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 23:02

>>362
>>364
それってあり得るんじゃないの。
ようは泳動buffer中の電解質が少なくって、予定通りの電荷がかからず
フォーカシングが甘くなったてことでしょ。

367 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 23:08

>>365
どうだって良いことにこだわるね。
語感の好みってあるでしょ。
それじゃ、あなたはサザンのことをサザーンとか言うの。
馬鹿馬鹿しいからもうやめようよ。

368 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 23:10

英語やり直せ
アポ

369 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 23:13

つーかゲルを水で作らなかったか。

５年に一度くらいやるんだよな、これが。

370 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 23:15

おお

そっか

371 ：332：02/07/30 23:52

>369
久しぶりにしたときはかましてしまいました。
今回はきちんと*10TBEを用いて1.4％ｱｶﾞｰ、エチブロもきちんと入れました
実験技術原理にも造詣の深い人がこのｽﾚは多いですが、皆さんは
秀潤社のプロトコール本等で勉強されていたのでしょうか

372 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/31 00:11

ゲルを水で作るってやったことないけど、
なんかとんでもないことになるの？
おれ実験暦６年だけど。
そういや、たまに後輩がバンドが乱れたとか言ってくるのはそれなの？

373 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/31 04:47

>>355
EtBrのインターカレートにより泳動が正確でなくなるという理由で、ゲルにEtBr入れるのを
嫌う人はいる。そういう人たちは流した後染めてる。
染めすぎなければ、染色後数回水を替えつつ脱色すればOK.一時間も脱色すりゃ見えるはず。
ゲルがピカピカになるのは、よくわからんがやっぱりホルムアルデヒドのせいなんだろう。
ちなみに変性剤入ってるゲルなら、そうそうRNAは分解しないし、簡単には拡散しないよ。
昔遊びで、一晩脱色しながら放置したゲルでノ　ザ　ンしたことがあったが、問題なかった。
もちろん、見る物によるんだろうから、お薦めはしないけど。

>>372
TAEとかを大量に作って共通で使ってる場合、まれに起こるね。
作った人がX50TAE入れ忘れたとか。これは実際にあった。
具体的には、ｴｲﾄﾞｳがわけのわからんことになる（具体的じゃないか）。
マーカーが変なパターンに流れたりとか。私の場合バンドは見えたけど
ものすごい変な位置に出てしまった。TAE作り直したらうまく行ったけど。

長文ｽﾏｿ

374 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/31 05:09

こんな基本的なこと、書きこしてるようじゃー、だめだめね。
373は親切だけどさ。
質問した人、まずは本読んで、原理とかチャンと調べた方がいいよ。
それから、自分で考えることも大事だよ。

375 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/31 06:46

36mlのMALTOSE binding fusion protein　を３ml位に濃縮するにはどうしたらいいでしょう。
今、spin columnを使っていますが時間がかかりすぎて・・。
他にいい方法はないでしょうか。
硫安するしかないでしょうか。

376 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/31 08:22

硫安だな。

377 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/31 12:13

まあその手の塩析かアルコール沈殿、有機溶媒沈殿だね。

378 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/31 12:22

蛋白濃度が1mg/ml以上なら硫安で落とすのが定石
それ以下なら有機溶媒で落とす
-20度に冷やしたアセトンで沈殿させる手も考えられるが・・・

379 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/31 12:39

MBP融合タンパク質ってアミロースカラムに結合させて
0.5Mマルトース溶液5ｍｌぐらいで溶出させてから
50%グリセロールを含む緩衝液で一晩透析すればだいたい3mlぐらいになんぢゃないの？

380 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/31 12:40

>375
限外濾過のスピンカラムでメンブレンが斜めについてるタイプは
結構早いよ

381 ：324：02/07/31 23:11

最近このスレレス進むの速いですね(^_^;)
>>333
確実に反応の出る抗体とは？
抗体は共同研究先から貰ったヤツで、頂いたものを分注して使ってます。
という訳なので、抗体を変えるには新しく貰わなくてはならないことになります。
一度基本に返ってみよう、と思ってプロトコル通りにやってみたのですが、
やはりBGが濃くなっただけでした(-_-;)

テクニカルな原因だとしたらたとえば何があるんでしょうか？
スライドグラスを渇かす、とかベタなことはしてないと思うんですが(^_^;)

382 ：375：02/07/31 23:16

>>377,>>378
すみません、有機溶媒で落すとは何を使ってどうすればいいのでしょうか。
よろしければ詳しく教えていただけないでしょうか。

383 ：377：02/08/01 10:35

>>382
しょうがないなぁ。
アセトン沈殿：４倍量の氷冷アセトンを加えて混合。－20℃で１昼夜
または-80℃で１時間静置。15,000×gでスピンダウン。

384 ：377：02/08/01 10:47

その２）
メタノール／クロロホルム法
200ulのサンプルに対して、MeOHを600ul、クロロホルムを
200ul加え、１分間vortex。600ulのDDWを加えて撹拌。
最高速で１分遠心。界面にタンパクがあるので、それを取
らないように上層（水層）を除去。MeOHを600ul加えてvortex。
最高速で1-2分遠心。上清除去。サンプルの液量が多いとき
は、このチューブを使って、最初から繰り返す。
えっ、36mlもあるのか！！180回繰り返しだね。
うそです。サンプル、MeOH、クロロ、DDWの比を守れば、スケー
ルアップは可能。ただし液量が増えるとロスが多くなる。
やっぱアセトンかな（遠心チューブの材質に注意）。

385 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/01 10:56

>>381
確実に反応の出る抗体とは、あなたの研究室で実際に問題なく
使用できている抗体のことです。
もちろんあなたのサンプルに対してちゃんと反応することが
条件。

もらった抗体が悪いのか、それともあなたの腕の問題なのか。
まずは問題の切り分けをするのが、原因を突き止めるための
一番手っ取り早い方法です。
それか、経験者と一緒に実験するか、だな。

386 ：377：02/08/01 11:02

>>383
最後の「スピンダウン」を「30分遠心」に修正。

387 ：333：02/08/01 11:04

>>385
代わっての回答有難う。
そういうこと＞381

388 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/01 12:19

>>382
フェノール/エーテル法っつー手もあったりする。
今手元にrefないのでまた探しておきますわ。
確かサンプル500ulまでならエッペンですんだはず。
普通のチューブでやっても問題ないはず。

389 ：377：02/08/01 12:52

思い出した！こんな手もあるよ。かなり乱暴。
>>382
透析膜にサンプルを入れて、両端を封じる。
sephadexなどの未膨潤のゲルろ過用レジンを密封のできる容器に入れ、
先のサンプル入り透析膜を埋め込む。4℃に保ち、時々様子を見て常に
乾燥したレジンが透析膜に触れているようにする。
一晩くらいで数倍程度には濃縮できる。
尚、レジンは分画分子量が多きほど吸水率が良い。また、乾燥させれば
繰り返し使える。

390 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/02 05:29

>375　
ATTOの”みずぶとりくん”を使ってみたら？
高分子吸収体みたいなので、液量を減らせる（と知人が言っていた）。
買わなきゃいけないけど。

391 ：楽したいオレ・・・：02/08/03 11:35

ベクター組みかえで、粘着末端を平滑化する際に、T4pol使うとして、
みなさん、いつの段階で使ってますか？
①制限酵素反応→泳動→エタチンisolation→T4反応→精製
②制限酵素反応→T4→泳動→エタチンisolation

教科書的には①のようですが、②の方がステップ数がなくて楽そうです。
しかも制限酵素反応後の液に、直接T4pol,T4buf.,dNTPを追加するだけという、
手抜きならもっと楽そうに思えるンですが、
じっさいのところやったことないので、
経験者の方のコメントお願いします。

392 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/03 12:44

digestionのあと、T4とdNTP入れるだけ。

393 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/03 12:54

>>392と同じ。

394 ：楽したいオレ・・・：02/08/03 15:07

>>392
>>393
なるほど・・・
ということは、digestionを20ulの系でやっていたとすると、
その20ulに、添付されているT4 buf.を入れることなく、
T4pol 1ul & dNTP(25mM) 2ulを入れて、
37℃ incubate　でいいのでしょうか？
digestionのbuf.(L,M,H etc.)によって、
反応速度が変わるとかは余り気にしなくていいのですね。

ついでに、incubate時間はどれだけなもんですか？
本には30minと書いていますが、長いような・・・

395 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/03 15:30

37℃、30min

396 ：375：02/08/05 09:44

>>383,384,388,389ありがとうございます。
またしても質問なんですが、total２５０μlに濃縮したfusion　protein精製後ですが、正確な濃度が必要です。
予想では０．１mgと見ているのですが、このような少量の溶液の濃度測定は皆様はどのような方法でしているのでしょうか

397 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/05 11:41

SDS-PAGE ｼﾙ！

398 ：389：02/08/05 18:22

>>375
マイクロスケールのタンパク定量法は幾つかあるけど、
おじちゃんはfusion protein使ったこと無いから解らない。

399 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/05 18:25

|
|⌒彡
|冫、）
|` ／
| /
|/

400 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/05 18:33

そういえば、正確なタンパク定量はむずかしい。
でも普通は、BSAに換算して～mgぐらいの精度しか要求されないよな～。

とかつぶやいてみるﾃｽﾄ。

401 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/06 07:34

そうか正確な、か。
スケールがでかいならたとえばどんな方法が正確なんだろう？

402 ：389：02/08/06 14:31

>>396
正確な・・・。
全量250uLで、できれば失活したくないんだよね。
「アセトンパウダー作って乾重をはかる」てのは乱暴
すぎるかなぁ。でも一番正確な気がするけど・・・。
どうです皆さん。

403 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/07 00:12

His-Tagを蛍光で染めてみるキット　Mol.Probe社のやつ全然染まらなかった。もうだめぽ・

404 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/07 22:45

なにそれ？抗体いらないの？

405 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/08 14:13

RNA抽出でエタ珍の後の70%ethanolにしばらくペレットをおいておいたら
（3日位）、物凄くRNAが取れたのですが、コレって当たり前なの？

406 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/08 18:08

>>405
しおじゃないの。
でもRNAも捕れてるはず。

407 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/08 20:09

>>405
物凄くRNAが取れた→間違い

ただ目で見えるようになっただけ。(w

408 ：<(_ _)>：02/08/08 23:17

2chの皆さんに質問。マジレス求む。
DH5α使ってtransformationしたんだけど、sequencingしてビックリ。
なんとgenomic DNAがinsertされてました。普通あり得ませんよね～。
しかもBLASTではo-157と出た！
微生物屋さんの方どなたか教えてください。
vectorからinsertionが落ちる・・・ってゆーか、大腸菌のgenomeと組み変わることってあります？
independentな3clone読んで、全てにinsertされていたので、rareな事例ではないように思えるんですけど。
どなたか愛の手を～。

409 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/08 23:22

DH5αってrecA死んでるんじゃないの？
recombinationが起きた訳じゃ無くってインサートのコンタミじゃ
ないの？

410 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/09 00:24

おまえ手をよく洗って実験してるか？

411 ：408：02/08/09 00:35

409さん、レスありがと～。
insertionはあるplasmidから切り出して調製したんですけど、
その際、Gel extraction kitでsize selectionしてますし、
多少のコンタミがあったとしても、plasmid由来のfragmentの方がdominantなわけですから、
その点は大丈夫だと思うんですけど。
やっぱ3pieceのligationは信用できんな～。
Hind-Sal fragment×2をBSのHind digestにinsertしようとしているんですけど。

412 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/09 02:06

教授との確執でまったくうまくいきません。

413 ：ミ,,ﾟДﾟノ,っ━~：02/08/09 02:19

>>412
マジか？悲惨だな。
っで、君はどうしたいんだね？

414 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/09 10:35

>>411
おそらくHind切断大腸菌ゲノムが挿入されたんだろうね。ありえないことではないと思うよ。
サブクローニングに関しては各ステップを厳密にチェックした？
断片の濃度等。
それと、シークエンスする前にコロP＆Sal digestionしてチェックした方がいいんじゃない？

415 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/09 11:11

このスレの16以下をみよ。

416 ：408,411：02/08/09 12:19

414さん
ってことは元plasmidにgenomeがコンタミしてた説ですね。
前にも書きましたが、plasmidから切り出したfragmentの方がdominantに存在しているわけですから、
それもなかなか・・・。ligationに関してはselfのネガコンをとっているだけです。
んでもってcolonyをdirect PCRによりinsert check。insertionも想定されるsizeだったので、これをmini Prep。
んでもって一応、Hindにてdigestionしてvectorおよびinsertionを確認といった感じです。
のちのちkeyとなるplasmidなので、一応sequenceを確認したところ、bacteriaのgenomeが入っていたと。

415さん
んー、sureを使えと？
実は現在hostをsureに変えて再試行してます。
ただ、気になるんですよねー。
なぜgenome・・・みたいな。

何か進展がありましたらご連絡いたします。
皆さん、レスありがとう。

417 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/09 21:31

セミドライ転写装置を使った蛋白のウェスタンブロットがうまくいきません。
ブロッティングバッファーは10 mM CAPS-NaOH(pH 11.0)1種類だけで
水道水を循環させ装置を冷却して
4 mA/（cm2メンブレン）の割合で電流を定電流に設定して転写を試みています
パワーサプライから転写装置には電流は流れるのですが
電圧は０を指したままです。
この状態で１時間転写してCBBで染色しても
メンブレンに蛋白のバンドが出ないでゲルだけに蛋白が残ります。

転写時間が足りないのでしょうか？
それともブロッティングバッファーの組成が間違っているのでしょうか？

418 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/09 21:36

ゲル以外のところを伝わって電流がリークしているのだと思います。
ゲルとかろ紙とかの設置法を図などを参考によくみてやってください。
電圧０はぜったいおかしい・。・

419 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/09 22:15

>>417
もしや、ろ紙をびちょびちょにして乗っけてたりしないか？
もしくは、転写中に重石を乗っけて電極同士が接触してるとか。

関係ないが、4 mA/cm^2 はちとかけすぎのような。

420 ：417：02/08/09 22:30

＞もしや、ろ紙をびちょびちょにして乗っけてたりしないか？
＞もしくは、転写中に重石を乗っけて電極同士が接触してるとか。

はい、バッファー枯渇防止のために濾紙の上からバッファーをかなり垂らして
びちょびちょの状態にして、
生化学事典級の字引を何冊かのせて重しにして通電しています（^^;
ひょっとしてそれが電圧０→転写不全の原因なんでしょうか？

421 ：４１４：02/08/10 00:15

>>416
plasmidから切り出した断片が多かったとしても、３断片のライゲーションだから、
そのモル比等によっては、ベクターと大腸菌ゲノムHind断片の方がつながりやすい状況に
あったと言うこともなきにしもあらずかなと思ったのですが。
ところで、クローニングされてきた大腸菌ゲノムインサートの両端はHindサイトがあるんですよね（データベース上の大腸菌ゲノム配列にも）。
もしそうならば、やはり単なるゲノムのコンタミなのでは？
まさか、もとのplasmid自身が大腸菌ゲノムが入っていたなんてことはないんですよね。
それと、大腸菌ゲノムHind断片が入っていたとすると、その断片中にはsalのサイトは
本来クローニングしたかった目的の断片に含まれる位置にはないはずですよね。
それで、コロPの産物をsalで切ってみてチェックすればいいのでは？とおもったのです
（他の制限酵素認識部位が分かっていればそれでもいいでしょう）。
出てきたコロニーの多くをミニプレしてシークエンスする前に、こうしたチェックを
しておけば、少ないコロニーをひろえばいいので楽になるんじゃない？

422 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/10 01:59

＞４１７
ブロッターの説明書には
「転写効率が悪いときは重いものをのせろ」とあったので（ブロッターによると思われるが）
SIGMAのカタログを上においてる。つまり重しは大丈夫かと。
で、びちょびちょというのが原因ではないかと思う。
バッファーはメンブレン、濾紙が乾かない程度で大丈夫と思う。
あと３種類のバッファーを使う処方もあるので試してみてはどうです？

423 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/10 03:59

おれも大腸菌のゲノムクローニングして読んでたことあるよ。
３kbくらいデリーション取って読んだよ（w
制限酵素地図も理想道理だったし。

424 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/10 04:34

>417
BufferにMeOH入れてますか？
興味があったのでちょと調べてみました。
参考になればと思います↓
ttp://www.bmb.leeds.ac.uk/bmaf/BLOT1.html

425 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/10 06:32

PVDFを使用前にMeOHで湿らせるのを忘れたりしてないですか?
あれ忘れると、全然いきません････でした。
でもそれでも電圧0Vって事はないと思うのだが。
やっぱりリークだろうなぁ。あるいは電圧計が壊れてるとか。

ちなみに、ﾒﾀﾉｰﾙはなくても転写できるYO!
あまりお薦めはしないけど。

426 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/10 07:37

>417
セミドライなのに水を循環させて冷却ってのがよくわかんないんだけど
そういうのってウェットタイプって言うんじゃないの？
具体的な転写装置の名前を書いたらもっと的確なアドバイスみんなから
もらえるんじゃないか？
ぼくもやっぱりびちょびちょなのがまずいと思う。
ろ紙はバッファーにさっと浸してしずくをきったのを重ねてる。
最後に装置を傾けて、余計なバッファーを除くひともウチのラボにはいる。
それでもろ紙が乾くなんてことはないよ。

427 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/10 07:39

Stable Transfectionっていうのは普通にトランスフェクションした後
抗生物質で選択かけるだけでできるものなのでしょうか？
それともゲノムに組み込まれるような特別のベクターが必要ですか？

428 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/10 07:59

>>417
Bufferの組成等、うちのラボでのやり方と全くちがうので言うのは気が引けてましたが。。。
私の場合、電圧は常にほぼ0Vですよ。
むしろ「ここで電圧が上がったら何か失敗してるからすぐ止めてね」と習いました。
電流は2.5mA/cm2で固定。
メンブレンはPVDFで、もちろんウェッティングしてます。

429 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/10 08:35

>>408 plasmidをagarose gelで精製するとかCIAPもするとかしてから使ったら？
うちでもQiagenのキットで精製したplasmidを使ったけど、F’をクローニング
しまくりました。ちなみに、うちでも3断片以上でライゲーションしてるけど、
4%PEG8000存在下で4度overnightにしてから効率あがりました。

430 ：417：02/08/10 15:54

>424,425
bufferにはMeOHは全然入れてません。
ですが濾紙・メンブレン共にMeOHで湿らせた後にblotting bufferにつけて平衡化しています。
>426
ドイツ・Biometra社製のセミドライ式ブロッターです。
蓋の裏面がマイナス電極（炭素板）、本体の表面がプラス電極（炭素板）になって
上から濾紙３枚、ゲル、メンブレン、濾紙３枚の順に重ね
蓋をして通電します。

431 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/10 19:09

＞４３０
メンブレンをMeOHに通すのはメンブレンを
親水性にするとかの理由やったとおもう。（ミリポアの説明書にあったかと。）
ただ濾紙をＭｅＯＨにつけるのは？？？
うちのラボはbufferにＭｅＯＨを入れていて濾紙は親水性もなにもないから
ブロッティング自体にＭｅＯＨが必要と考えれば、bufferにＭｅＯＨを入れるべき。
平衡化作業でＭｅＯＨの濃度は極端に下がるのが原因？？

432 ：408っす：02/08/11 03:31

421さん
sequencingした2つのcloneについて詳しくご報告いたします。
forward,reverseで読んだんですけど、両cloneとも目的とする断片の一つはHindで入っていました。
そのfragmentの他に、一方のcloneはHindに続き、大腸菌のsequence。
そしてもう片方はHindが無く、大腸菌のsequenceといった感じです。
ちなみにこの2つのcloneで見られる大腸菌のsequenceは異なるものでした。
このような結果でしたので、recombinationの可能性を考えたのですが、、、。
もとplasmidに大腸菌の配列が・・・という(恐るべき)可能性ですけど、
先に述べました結果から考えても、その可能性は無いといってもいいのではないでしょうか。
それとSal digestionに関してですが、これは大バカをやらかしてました。
cloningに用いたvectorにもSalが存在し、潰すのを忘れていました。
よってinsertionにSalが無くても、linearになるということになります。
insertionのsizeが大体合っていましたので、本当に軽い気持ちでsequencingしたんですけど、
いや～、やってよかったですよ。これだからmolecularは怖い。

423さん
これって意図的にcloningしたんですよね？(^-^;

429さん
もちろんvectorの方は制限酵素で切った後AP処理してます。
ただしAP活性が低いと言われているSAP使ってますけど。
2h SAP処理しましたが、多少selfは出ているようです。
agaroseによるsize selectionはしてません。
genomeがコンタミしているとすると試してみる価値はありそうですね。
ちなみに429さんはどのようなtrouble shootingで問題が解決しましたか？

遺伝子解析アプリで、ligateするfragmentについてinverted repeatを調べてみましたが、
結構な割合で(高低の基準はわかりませんが・・・)存在していました。
さらにhead to headでfragmentをinsertしようとしているわけですから大腸菌には嫌われるかもしれませんね。
追伸ですがsure使ってやってみましたが、結果は同じでした。colony数はDH5αより明らかに増加しました。
初歩的なことでミスを犯している可能性も捨てきれませんので、fragmentおよびvectorの調製から再トライしてみます。
みなさん、ご意見をありがとうございます。

433 ：４２３：02/08/11 04:01

意図的ではありません。
ある生物の確か genomic lamda cloneを
制限酵素処理してクローニングして
デリーションしてシーケンスしたら、
大腸菌ゲノムがクローニングされてました。
いや、plasmidからサブクローニングしたのかもしれません。
おぼえてませんが。

434 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/11 14:06

>>432
何だ、シーケンスした３つのクローンって全部一緒のシーケンスじゃ無かったのか。

435 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/12 00:40

>>417
単にブロッターが断線ってことはないよね？
試しに定電圧15vで電流が流れるかチェックしたら？
いくら濾紙がべちょべちょでも全く転写しないのはおかしい。

436 ：417：02/08/12 03:21

>435
ブロッターの断線ではないです。
乾電池・豆電球・ブロッターに付属の端子・ブロッターの炭素板を使って
豆球がつくのを確認しましたから。

437 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/12 05:01

上手にビリビリできません(>_<)
どうしたら上手くヤれましゅか？

438 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/12 17:37

エチブロ入りのバッファーを床とかにこぼしてしまった場合、どうやって処理して
ますか？わたしは拭き取るだけなのですが。

439 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/12 23:10

国2検査所→ドクター所得→人事交流でそのまま国1研究所というのはＤＱＮですか？

440 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/13 00:24

>>436
それではチェキになっていない。
435の示唆をもう一度考えるべし。
定電圧15vで電流が青天井なら、電流はメンブレン＆膜以外のところを流れている。
つまりショートでんな。
どっかで電極同士くっついてないか。

441 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/13 02:54

>417
漏電対策に、使い古しのX線フィルムをゲルの形に切り抜いて
ゲルの周りにおいているラボもあったな。

442 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/15 16:02

TACベクターでcDNAライブラリー作るのって、最近では普通ですか？

443 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/15 16:32

＞438
エチブロはハイターで処理してましたよ。
ハイターに一日つけて中和させて捨てます。
だからハイターを薄めたものでふき取ればよいのではないでしょうか？

みなさんどうでしょう？

444 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/17 02:42

>>438
充分です。放置しておけば分解します。

445 ：pentium4：02/08/17 02:45

>>443 それは色を消して発癌物質を作るだけ。

446 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/17 02:48

penだ！起きてたの？

447 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/17 02:49

なめとけ

448 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/17 03:15

>>441
そのアイデアないすです、いただき！

449 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/17 03:16

>>445
その話、いろんなところで聞くのですが、どこかに文献ありますか？
また、じゃあ、廃液処理はどうしたらいいんですか？

450 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/17 03:16

そうか？

451 ：429：02/08/17 03:52

>>432 トラブルシューティーちゅうか、やってみて思ったことを書きます。
3断片以上のときはやっぱりプラスミドもきれいにしといた方がいいでしょう。
インサートの効率が低いので青白選択のとき板が真っ青になりました。
最初は自分で増やしたやつをゲルで流して酵素処理してまたゲルでフラグメントを
除いてたんですが、めんどくさいので最近は買ったやつを酵素処理して流してます（ｗ
(プラスミド、2日ぐらい熟成培養したやつから取ったやつを使ってたりしません？(ω))
APは使うと効率が落ちるので使いません。ゲル後エタ沈して20-50pmolを
5μlスケールで429で書いたような条件でエタ沈したインサートとライゲーションしてます。
インサートの量はあんまり気にしてません。ゲルで流すとエチブロで見える量です。
0.5-1μlをエレクトロポレーションでXL1-blue 20μlに入れてます。

452 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 11:38

>>449
ハイター等でブリーチしてっていうのはDAB。
エチブロは普通活性炭を通して捨てるモノ。

適当な容器に活性炭（紛状）を入れてよく振ったのち、一晩ほど静置して
余剰のエチブロを吸着させる（いきなり濾過しても良いとも聞く）。
ろ紙を乗せた漏斗を通して活性炭を除いて、薬品用の流しに流す。
ろ紙と活性炭は燃えるゴミへ。

453 ：pentium4：02/08/19 11:51

>>446
気付かなかった。変な時間に起きてるよ。

>>449
Molecular Cloningに書いてあるけど・・たしか電気泳動のページ。
（手元にないので確認できません）
あとは>>452のいうとおり。
使うたびに処理するのもめんどくさいので、廃液入れをおいといて
まとめて処理するといいんじゃないかな。

マニアティス（M. C.の著者）のいるところ(ボストン）は
廃液処理に関してうるさいから、まじめにやっているはず。
あれってラボマニュアルを出版したようなもんだからね。
日本で言うと、医科研プロトコルみたいなもの。
医科研プロトコルの初版（当時は制癌プロトコル）は学生の手書きをコピーしたもので、
味があって良かったのになあ…

454 ：452：02/08/19 13:50

>>449
>>453の言うとおり、
Molecular Cloning third ed. vol. 3
Appendix 8.28
0.5ug/mL EtBrのとき、1g/Lで活性炭を加えるとあります。

また、ブリーチすると1000倍くらい毒性が上がると書いて
あります。
みなさん気を付けましょう。

455 ：452：02/08/19 19:02

>>449
EtBr廃液処理用のバッグ（多分活性炭カラム）も売ってるけど、
紛状活性炭か粒状活性炭（このときは自分で細かくすること）
を買った方が安上がりかと思います。
>>453の言う通りに、まとめて（ＰＥＴボトルくらいが適当）
処理する方がいいですよ。あまり大量に保存すると、活性炭
処理やろ過に時間がかかるし、なによりタンクが重くて腰を
痛めるかも。

456 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 22:37

EtBrに催奇性や発癌性があるというデータは一切ありません。むしろ、試してみたが有意差が見られないという論文なら、toxicology系でいくつかあります。Ames testの結果を無批判に外挿した、いわゆるmythってやつです。

457 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 22:38

↑捏造

458 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 22:54

じゃあ、催奇性・発癌性があるって報告挙げてみな。

459 ：449：02/08/19 23:07

>>452さん、pentium4 さん、ありがとうございました。
えちぶろ染色したゲルはどうやって廃棄すればよいのですか？
メスＯュード？

460 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 23:16

PCRﾈﾀです

多型検出をしているのですが、どうも多型が短い断片かもしれないのです
泳動時間が短いと他の断片と泳動距離があまりかわらず、多型かどうかわかりません。
時間をながくすると、他の断片と分離するのですが、像をUV下で見た場合
ぼやけてしまい、比較した際に、比較対照サンプルにも似た大きさの断片があった場合
多型かどうかよくわかりません
よい手段はないでしょうか

461 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 23:23

EtBrに関するMSDS listsは次の通り。

carcinogenicity - NTP: No
carcinogenicity - IARC: No
carcinogenicity - OSHA: No

タバコ１本吸う方がよっぽど問題ありってことで…

462 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 23:25

モノクローナル抗体の作製で、増殖が良くて抗体産生能がいいハイブリドーマを作るには、
どうしたらよいのですか？クローニングは限界希釈法で行っているのですが、
抗体産生しているハイブリドーマは途中で増殖が止まってしまい、増殖がいいハイブリドーマは、
抗体産生しません。

463 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 23:28

>>456

へーそうなの。参考になります。

464 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 23:32

>>462
クローニングに用いるプレートを増やしましょう。
もしくは、モノクロ作製用の培地添加剤を使ってみるとか。

465 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 23:34

456=463

466 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 23:39

>>464
培地添加剤は、入れています。

クローニング前の段階で抗体産生能がないのは、融合がうまくいってないから
なのでしょうか？
モノクローナル抗体作製のいいプロトコールの載っている本とか知りませんか？

467 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 00:03

だれかEtBrの検証してくんないかな。

468 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 00:30

というのは、変異原性の？正式になんと言うかしらんけど。
それが454のx1000という数字なんでは？

469 ：鬱ルシアッセイ：02/08/20 01:42

マウスのp53プロモーターを使ってルシフェラーゼアッセイをやろうとして
います。ヒトのp53ではいろいろとやられているようなのですが、マウスでは
p53のプロモーター領域について参考になる文献がありません。また、
ヒトp53とのシーケンスのホモロジーが低くヒトp53での実験を参考に
できません。そのためマウスp53上流のどの領域を
レポータープラスミドに組み込もうか悩んでいます。
どなたかp53とルシフェラーゼアッセイに詳しい方、いらっしゃいませんか？
どういった領域をどの程度の長さでレポータープラスミドに組み込む
べきなのでしょうか？転写開始点から何b上流がいいとか、
組み込む長さはどれくらいが最適とか、またお勧めの文献などあれば
教えてください。

470 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 01:52

もうすこしはずして書いた方がいいと思われ。
質問には答えられませぬ、あしからず。

471 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 02:25

>>459
ゲルは燃えるゴミでしょ。

>>456,>>458
そうなの？モレキュラークローニングには書いてあったけ
ど・・・。
今手元にないから文献まではわからないけど。

単純に考えて核染色液に発ガン性がないなんて考えられな
い気がするけどなぁ。

472 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 02:29

まあ、無いかもね。あったとしても弱いのはたしか。
発癌性の論拠は、DNAにインターカレートするというだけのことでしょ。
実際の統計データがどの程度あるのかは疑問。

大腸菌で試したらわかる・・・かな？

473 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 02:50

>>472
モレキュラー・・・には何かの菌体で試したようなことを
書いてあったような無かったような・・・。
うろ覚えで申し訳ない。

474 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 03:04

>>473
細菌をつかえば変異原性はわかるかもしれないけれど、
直接発癌性に結びついているとはいえないでしょ？
ということをいいたかったんだけど・・

475 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 08:20

>469
P53の標的遺伝子の調節に関しては、割と（というより今もやってる）
やってる人間です。

この掲示板だとあまり長々と書き込めないので、よろしければ
Yahoo！掲示板、生物板、
◎バイオテクニック質問専用掲示板◎
の方でもう一度質問していただけないでしょうか？

参考文献もいくつか紹介できると思います。

476 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 11:44

>>474
確かにその通りだね。

477 ：鬱ルシアッセイ：02/08/20 11:52

>475さん
ありがとうございます。
Yahoo！掲示板、生物板に行ってみます。
よろしくお願いします。

478 ：476=473=471：02/08/20 12:09

何はともあれ細胞毒性はありそうだから、EtBrをハイターなどで
ブリーチするのは止めましょう。

ところでDAPIはどう処理すればいいのかなぁ。
取り敢えず溜めておいて新聞紙に吸わした後、燃えるゴミに出し
てるけど・・・。

479 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 21:40

うちは少量しかつかわないためか
DAPI、ギムサ普通に流しに捨ててる、、、

480 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 22:51

すいません、質問なんですが、
santa cruzの抗体をWBで使用したいのですが、
目的の抗体がgoatで免疫された抗体なんです。
HRP標識のgoat用の二次抗体ってどこの会社のがいいのですか？
なんか、いろいろと相性があって、悪いと真っ黒になってしまうと
聞いたのですが・・・。
ちなみに、検出はアマシャムのECLを使っています。
残念ながらこのシステム純正のgoat用の二次抗体は無いみたいで、
他の会社のを使うことになると思うのですが、
どこか良い会社のはありますか？

481 ：ミ,,ﾟДﾟノ,っ━~：02/08/21 01:02

ﾒｰｶｰに聞く。これ最強。

482 ：478：02/08/21 14:14

>>479
どもです。私も少量なら見なかったことにしていますが、細胞数を
カウントするときなど比較的多量に出ることがあります。
ネスカフェの瓶に半分ほどたまっていましたが、フタをゆるめてお
いたら液用が半分ほどになっていました。もちょっと濃縮して新聞
に吸わそうと思っていますが・・・。

483 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/21 15:57

http://sasurai.gaiax.com/home/hayato_araki
ﾋﾛﾒﾛ友達のｻｲﾄ

484 ：sage：02/08/21 19:10

植え継いでいる形質転換植物を大量にコンタミ（カビ）させてしまった。
系統数少ないのにピンチです。
カビからレスキューする方法なんて…ないですよね…

485 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/21 19:12

↑すいません、初歩的なミスを…！（鬱氏

486 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/21 19:14

>>484
そんなの無いんじゃない。

487 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/21 21:37

俺は知ってるよ
考えれば分かるよ
単純なことさ
ＯＯＯＯの本を読むんだね

488 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/24 01:21

ラットリンパ節法について詳しいことが知りたいのですが、
ラットリンパ節法をやったことある方いらっしゃいますか？

489 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/25 22:41

>484
殺菌処理→かなり内部の細胞群を慶大
ではだめなの？上手くいってもカルス経由だけど

490 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/27 13:43

>>484
おいらも同じ経験あります。
一時期、インキュベーター内のシャーレのほとんどにカビが生えてきました。
次亜塩素酸ナトリウムで滅菌してみたら、植物体が白化枯死しました。
しかもカビが生えてきていました。
泣く泣くその系統を捨てました。

その中に有望な個体があったかも、と思い今でも後悔してます。

491 ：484：02/08/27 17:40

一度外に出して馴化を試みます。
うまくいけば新芽をin vitroに戻そうかと…
植物はジャガイモです。

492 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/28 20:40

ゲノムサザンした時に、サイズマーカーだけ
検出されて、目的のバンドが出ないんですが......？

どうしたら良いでしょうか？キットはECLです。

一応、必要処理はすべてしているはずですし、
ゲノム量も15～20マイクロは流しているんですが......
鬱死。

493 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/28 20:45

とりあえずRIでやってみれば？

494 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/28 20:54

>>492
泳動はうまくいってるの。
HRP標識抗体（またはストレプトアビジン）の濃度は。
プローブは当たってるの。
マーカーはどんなの使ってるの。

495 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/29 13:25

>>492
もういいのか？

496 ：492：02/08/29 16:26

みんなスマン。
とりあえずもう一回やってみる。

497 ：B4：02/08/29 18:16

固定脳の凍結切片をゴルジ染色(クリスタル紫などで)したいのですが、プロトコルどなたか教えて下さい。
基本的な質問ですみません。

498 ：492：02/08/29 22:36

>>494
泳動後のゲルの写真を見てみると切断されているのは確認できました。
抗体の濃度はわかりませんがラベルするDNAは100ngです。
あとマーカーはタ○ラのWide-Range DNA Ladderです。

すいませんが何でもいいのでアドバイスよろしくお願いします。

499 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/29 22:47

ノーザンやってますが、なかなかRNAの量がそろってくれません。
定量はOD測定で測っているのですが・・・。
なにか、RNAのいい定量法はありませんか？
ちなみにODはだいたい260/280＝0.101/0.043
ぐらいで、260/280比は2よりすこし大きいぐらいです。

500 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/29 22:50

完全に溶けてる？
ＲＮＡ溶けにくいよね。
みんなどうしてるの？
漏れはアルコール沈殿後、あまり乾かさずにｄｗ入れて
６５度で温めて、がんがんボルテックスしてます。
それでも溶け難い時あるし。
むかついて唾入れたろかと思う。しないけど。

501 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/29 22:59

解けてないのですかね。うーん。
乾燥させすぎると解けなくなるといわれたので、
乾かしすぎには気をつけていますが。
なんか、分解したら嫌なので4度で30分くらいボルテックスかけて
放置してますが・・。不十分なのでしょうか？
65度くらいなら暖めても問題ないですか？

502 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/29 23:58

30分もボルテックス？？

503 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/30 00:48

RNAのpptは皆さん何に溶かしてますか？
本によっては0.1%SDSに溶かせ、と書いてありますが、
ノザンの泳動程度なら問題ないのでしょうか？

504 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/30 10:08

>>501
高濃度RNAを熱処理すると、モチ状態になってしまって
二度と溶けなくなるヨ！

505 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/30 10:09

in vitro ligationでadenovirusを作っている方いますか？
I-CeuIとPI-SceIを使って一発でligationできるやつです．
Clontechからキットがでているのは知っているんだけど
ちょっと高くて手が出ないし．．自分でvector作ったり
できるんでしょうか？あるいは誰かからもらえるとか？

506 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/30 10:59

>>498
抗体の希釈率のことだよ。何倍で使ってるの。
泳動自身には問題なさそうだから、抗体濃度かプローブに原因があり
そう。ECLは感度が良いので、二次抗体は１万－数十万倍で使わない
と検出出来ないよ。アマシャムのプロトコルにはもっと低い希釈率
（高い濃度）で使えと書いてあるけどね。
プローブは別の系（in situとか）で使えることが解ってるの？

507 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/30 11:41

>>497
それは甘えすぎではないか。図書館にでも行きなよ。
MPのゴルジトラッカー（？）とかではだめなのか。

508 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/30 11:45

>503
SDSを入れるのはRNaseから守る為にじゃないの？

509 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/30 12:07

>>508
多分正解。でも可溶化効果も期待出来るよね。

510 ：501：02/08/30 13:17

>509
そのままSDS入りでノーザンのサンプル処理して、泳動しても
大丈夫でしょうか？
ホルマリン法なんですが・・。

511 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/30 15:16

酵素反応しなきゃ平気じゃないの？

まあ普通のやつは水に溶かすだろ。
で、ちょっと変な人はそれにRNase inhibitor入れる。
で、おかしな人は0.1%SDSに入れる

512 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/30 16:30

界面活性剤をいれるならザルコシルの方がRNase阻害が強いと聞いた。

513 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/30 18:49

>>492,>>498
どうなった。

514 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/31 00:23

茶ー留守が事故ってマウスが手に入らないんですがどうしたらよかんべ？

515 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/31 00:25

>>514
どう事故ったのですか？

516 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/31 00:54

>>514
注文してあったヌードマウスが感染症で出せないって

517 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/31 04:59

得理苦に聞いてみたら

518 ：圭子：02/08/31 09:31

>499
Nothernやる前に、ODで測定した値が信頼できるかどうか、
ゲルに流してるの？
これで、そろってたら、ほぼOKよ！

519 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/31 14:48

>>518
通りすがりだけど、RNAサンプルは量が足りなくて、
無駄にできないこと多いんだよねー。

520 ：492：02/08/31 18:26

更に質問なんですが
プローブが非特異的にマーカーに大量に張り付いてしまったために、特異的にゲノムに
張り付くはずのプローブ量がなくなるということはありませんか。

521 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/31 18:27

そこまでは考えなくていいでしょう。

522 ：499：02/08/31 20:06

>518
ノーザンの本泳動するまえにためしに泳動して、エチブロで染めたものを
カメラで取り込んで、定量化して、量をあわせて本番をするというのが
一番確実なのですかね。
RNAサンプルはがんばってたくさん集めます。
酵母ですから、たくさん培養すればそれなりに取れますし。

523 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/31 21:23

♪ぞうＸん

ノーザン、ノーザン、バンドがスメアなの
そうね、サーザンもスメアなの。

ノーザン、ノーザン、バンドがみえないの
そうね、タンパクもいないのよ。

ノーザン、ノーザン、ながさが長いのよ
そうね、配列も違うのよ。

524 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/02 22:49

-80℃で一週間ほど保存しておいたサンプル(花弁)をGUSアッセイに用いることは可能ですか。
それとも新鮮な花弁でないといけませんか。
教えてください。

525 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/03 10:28

>>492
マーカーだけ染まった、ってのがなんとなく気になる。
プローブ死んでる時によくそういうことが起こったような気がして。
>>506の言うようにプローブのチェック（他の系で、とか）をお勧めする。
つーか、やり直したほうが早いかも、だが。

526 ：492：02/09/03 11:34

>>525
プローブが死んでるってどういうことですか。
やはりプローブの性能チェックしたほうがいいんですよね。

527 ：506：02/09/03 18:26

>>526
だからおじちゃんが前から言ってるように、in situなどの他の系で
ちゃんと検出出来るか試したのか、或いは、プローブの合成率の検
定をちゃんとやっているのか、と言うことです。

528 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/03 23:34

質問なのですが、N末端ブロックされる（されやすい）蛋白というのは決まっているのでしょうか。
また、それらの情報が載っているサイト等がありましたら教えていただけませんでしょうか。

お願いします。

529 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 20:26

taqでの増幅を確認している遺伝子があるんですが
pfuを使うと増幅が見られません。
伸長時間はtaqで１分のところを１５分も取ってるんですが・・・

530 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 20:37

長すぎ＞15分
PfuはTaqに比べてプルーフリーディング能があるので、伸長反応が遅く見える。
Pfuはfidelityが高く、熱耐性も良好なのでサイクル数を増やすのが吉。

531 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 20:46

>>530 ありがとうございます！
早速やってみます

532 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 23:09

１サイトによるｃｕｔ，ligation後にＰｈ／Ｅｔチンして
余計なｓｅｌｆｌｉｇａｔｉｏｎ空ベクタを
ｃｕｔしてしまいたいんですが、原理的には可能でも量的に大丈夫ですか？
かなりロスりますよね？
ｃｕｔ後はそのままトランスフォームできますか？

533 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 23:13

日本語で話せ＞532

534 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 23:15

＞＞和語ですが、なにか？

535 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 23:18

「意味の通じる」日本語で話せ。
だれも理解できない＞532

536 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 23:20

単一制限酵素認識部位による切断後，つなぎあわせた後にふぇのえたして
余計な自己連結の空運びやを
切断してしまいたいんですが、原理的には可能でも量的に大丈夫ですか？
かなり損しますよね？
切断後はそのまま形質転換できますか？

537 ：535：02/09/04 23:40

1)なんかDNA断片をベクターに挿入する話のだろうか？

２）フェノールクロロフォルム抽出、エタノール沈殿で、インサートのあるベクターと空ベクターを分離できるのだろうか

３）ベクターと切るのとDNA断片を調製するのと、フェノクロ注エタ沈した後で切る制限酵素の種類はなんなのだろうか

４）量的に大丈夫かとは、どういう意味なのか？回収率ならグルコーゲンかエタ沈メイトを使うという話

５）532,536は回線を切ってただちに首をくくるべきだ、というのが結論

538 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 00:00

PCRﾈﾀです

反応に用いるゲノムの最適量があると思います
これより少なくても、多くても反応に影響ない、もしくは悪い、と思うのですが
最適量の何分の1以下のゲノムでPCRをすると、バンドがほとんど（もしくはあまり）
見えなくなるものなのでしょうか？

539 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 00:03

テンプレート１０ｎｇにプライマー２０ｐｍｏｌ

540 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 00:07

>539
ﾚｽｻﾝｸｽです
プライマー20p・molの時に用いる鋳型DNA量を10ng以下にすると
バンドが薄れていくと言うことでしょうか？
恐縮ですが、勉強したいので、もし経験則ではなくソースがあるなら
教えていただけないでしょうか

541 ：５３９：02/09/05 00:29

そうです。至適がこの比です。
バンドが見えりゃいいならＰＣＲのサイクル次第なのだ。
サイクル数上げればかなりかわる。
Ｓｅｑ．の正確性も重要なら、２５サイクルくらいで鋳型を多め
にしといたほうが良い。
Ｔａｑにもよるが。

542 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 00:35

ためしにモル数計算してみたら？
理論的にもモル数で、プライマーﾓﾙ＝鋳型ﾓﾙ×（２のサイクル乗）が境界線
鋳型の分子量もすぐ出るし。

543 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 01:50

539はアホだろ？
テンプレートゲノムの長さが変わればモル数なんか全然変わるだろうに。
したり顔して10ngだってさ。ププ

544 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 10:21

20pmolってのも、total vol.が変われば濃度が違ってくるだろうに、、、、、
でも、初心者ってことで仕方ないんじゃない？＜543

>541
PCR産物のダイレクトシークエンスなら、サイクル数増やしても
殆ど問題ないのでは？　もちろんクローニングする場合は問題になるでしょう。

536の質問は、論外。意味不明。もう少し勉強しましょう。

545 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 12:31

>>492
ところでポジコンは取っているのか？

546 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 20:18

>528
そんなデータ・・・実は俺も欲しい（ｗ

547 ：492：02/09/05 22:09

>>545
あのアト、もう一回やったら上手くいった。
ミンナ、お手数かけてすまなんだ。

上手くいかなかった理由は、、、、、、、
恥ずかしいので聞かないでくれ。面目ない。

548 ：538：02/09/06 13:24

れすありがとうございます
勉強しなおします

549 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/09 23:39

>>492
結局プローブが悪かったの？

550 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/10 09:28

>>549
プローブが合成されてなかったんじゃない。

551 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/11 05:57

>>492
恥ずかしい失敗スレに投稿しる！

552 ：qq：02/09/11 06:00

http://yahooo.s2.x-beat.com/

553 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/11 13:04

0.5mlチューブに10μlぐらい入れて水浴上で長時間反応させると、水分がふたに
凝集して反応溶液がなくなっちゃうのを防ぐいい方法ありませんか？

554 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/11 13:05

シリコンオイルを上層する。

555 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/11 13:19

コンフォーカルで細胞内カルシウム変化の蛍光測定中。
カルシウムプローブ(Fluo-3) がうまくローディングされなかった。
プロベネシッド入れたら、ローディングの方はなんとかなってきたが、
カルシウムチャンネルを活性化させても、蛍光強度に変化なし。
そんなに難しい測定ではないはずなのに。。なぜ ?

556 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/11 21:31

>>553
要するに上の空気層の温度を水浴と同じにすればいいんだろ？
そういう機械売ってるから買え。

もしくは、水浴で反応ってのは、温度を早く目的に達する。
そして温度を安定させるのが目的なわけだから、
温度が安定しているエアインキュベーターが有るなら
最初の５分くらい水浴であっためてその後エアインキュベーターに
入れれば、良いですよ。

557 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/11 21:33

heated lid付のサーマルサイクラー使えばいいんじゃないんですか。

558 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/12 04:33

みなさんありがとうございます
>>544 できればオイルフリーで。みなさん5-10μの反応でもオイル乗せるんですか？
>>556 50℃の制限酵素反応なので他の菌と同居できないのです。もっとも、37℃終夜で
やったらきちんと切れてましたが。昨日、浮かべた上から蓋をかぶせてみたんですが、
やっぱり凝集してましたね。沈めればいいんでしょうけど。
>>557 できれば有り合わせのもので。でも、今度買うやつについてたらそうします。

559 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/12 11:52

UV法でタンパク定量しようとしているんですが、トリプトファン、チロシン、
フェニルアラニンの吸光係数が分からないので、知っている人がいれば、教えてください。
お願いします。

560 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/13 22:29

ＤＮＡのシークエンス解析がうまくいきません。
ＡＬＦ expressを使っていて、シークエンスの反応は
95℃　30ｓ
60℃　30ｓ　を30サイクルです。
72℃　120S
サンプルはゲノムをテンプレートとしてＰＣＲで増幅した約1ｋｂの断片で、
使用したプライマーの長さは２０merでＧＣ含量は５０％です。
サンプルの2次構造などの問題があるのでしょうか？

561 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/13 22:39

>>560
A260/A280比はいくらぐらい？2.0ぐらいでないとうまく行かない
ことがあるらしいよ（最低1.8くらいだったと思う）。
PCRの条件はサーマルサイクラーの種類によるから、これだけで
は解りかねる。
1kbは長いよね。ALFは500-700base位なら安定して読めるのでは
なかったかな。
もう少し条件を書いてみそ。

562 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/13 22:58

>>559
UVによるタンパク定量

http://au.expasy.org/tools/protparam.html

とりあえず、このサイトのハコのなかに君の配列をコピーアンドペーストで
いれてクリックしてみそ!

563 ：561：02/09/17 10:34

>>560
シカトかい。

564 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/17 16:18

ゲノム抽出でHotBorate法は有効なんでしょうか。
自分はCTABで抽出するつもりなのですが、先生がしきりに勧めてきます。
以前、Hot Borate法はRNA抽出のときに用いる方法だと思ってたのですが。

教えてください。

565 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/17 16:35

>>563
まあまあ。うまくいったんだよ、たぶん。

566 ：コギャルとH：02/09/17 16:44

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567 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/18 10:18

パソコンが一日中WinMXのために動いていること

568 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/19 20:45

初めてのノザンです。
キットを使ってRNAをとりました。
で、アガロースゲルに流してたら先輩に簿こられました。
どうしてですか？

569 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 04:17

流すだけなら何に流してもいいんじゃないの？
どうなるかしらんが。

570 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 10:24

>>568
条件が書いてないから分かんないけど、作法にそむいただけでしょ。
569の言う通り、何に流しても出来るときは出来るはず。
まぁ、後はアガロースゲルでは解析出来ないような大きさのモノが
ターゲットだったとか。それなら怒られても仕方ないが、ふつうは
最初にその辺りのことは先輩が説明する、或いは、先輩に聞くもの。

571 ：お忙しいところすみません。：02/09/20 11:18

RIを使って酵素の反応がいったかどうか
検出する実験なのですが・・・。
シリカゲルプレートに反応後の液をスポット
していき、酢エチ：ブタノール＝2：1の
展開溶媒で上げていってます。検出には
FLA3000を使用しています。うまくいけば
分離できて、酵素によって転移されたRIを検出
できるのですが、その時のスポットがぼんや～り
にじんでしまうことがあります。うまく丸くくっきり
となることもあるのですが、一体何によって左右されて
いるのか全く分かりません・・・・・。
なにか展開の時の注意点とかご存知でしたら教えてほしい
です。

572 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 14:55

ＰＣＲが増えない・・・
なんでだ・・・

573 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 15:53

はぁぁぁぁ。またコンタミしたっぽいよ。
また一週間パァだ…。
先生、ごめんね…。

574 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 22:59

>>572
ポジコンとってるか？

575 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 13:29

レトロでも全然発現しない遺伝子ってありません？
私のやっている遺伝子は、ほとんど発現しません。
もちろん、puroでセレクションして、すくすく育っているのに。
何十個というクローン作って、うち発現しているのが１個くらい。
それも滅茶苦茶ちょっとで、数日で消えていきます。

ステイブルになる、もっと良いベクター無いんでしょうか？

576 ：ポスﾄﾞｷｭﾝ ◆yv7nVpfU ：02/09/21 16:20

>>571
濃縮できる層のついたシリカゲルプレートを使うと、バンドみたいになって(ﾟДﾟ)ｳﾏｰかも
しれない。ちょうどSDS-PAGEのスタッキングゲルみたいなもんだと思っていただければ。
テーリングするのは、サンプルが多すぎたり、展開中に溶媒が飛んだり、展開層がちゃんと
飽和してなかったりいろいろ原因は考えられる。また、サンプルが水を含んでいる場合、
スポットした後、きっちり乾かさないと当然TLCは乱れるかと。
あと、フェノール基のある化合物を扱ってる時は酸入れたほうが吉かと思われ。
1%酢酸とかTFAとか試してみるのもよいかも知れぬ。

577 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 16:23

>>568
変性剤入ってなかったに1000ﾎﾙﾏﾘﾝ。

578 ：571：02/09/21 16:52

>>576
ありがとうございます。やってみます！

579 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 17:16

実験というほどのことではないのですが、、、
最近、培地が上手く作れないので困っています。
メディウムチェックすると、カビが発生してしまいます。
フィルターろ過が上手くいってないのかな？
でも、今まで同じやり方で出来ていたはずなんだけど。

580 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 17:44

>>579
部屋、エアコンのフィルタ、プラッツ、クリーンベンチの掃除、
フィルターはディスポだろうけど、その他の器具にちゃんと
オートクレーブが掛かっているか、白衣を半年以上洗濯して
いないのではないか、あたりを思いつきましたが。

あと、ラボの大掃除をした後はしばらく得体の知れないものが
空中をただよっていると思ったほうがいいかもです。

581 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/22 02:53

何度やってもＤＮＡ回収でロスります。回収方法は凍結、遠心・エタ沈・と
フェノール抽出・エタ沈の２つの方法です。何かアドバイスお願いします

582 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/22 15:00

３Ｍの酢酸ナトリウムをエタノール沈殿のときに入れた？
これをやらないと沈殿ができないんだけど・・・
（「バイオ実験イラストレイテッド」の２巻だったろうか。
この記述を入れ忘れたためサンプルをロスしたＤの院生からクレームがついて
急遽正誤表を「細胞工学」誌とWeb上でも入れるはめになったエピソードもある。
当時Ｍ２だった鷲は身につまされたものだった・・・）

583 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/24 20:21

ノーザンしたら、28,18SとtRNAのバンドが出てきた。
何でですか？
助けてください、シャア少佐。

584 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/24 22:16

↑ハイブリ、ウオッシュきつくしれ！

585 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/24 23:40

>>581
ひょっとして、ゲル抽出の事？
それならロスは当たり前です

586 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/25 17:07

28S、18Sってそれぞれ長さではどのくらいになるんでしょうか？

587 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/25 18:25

>>586
哺乳類では
28S：4718
18S：1874bp
となっています。

588 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/25 18:26

>>584
そういう時って、目的バンドは出ないで、28,18Sだけ
出てくるの？

589 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/25 20:35

>>587
さっそくありがとうございます。
哺乳類では、ということは他では違うということなのでしょうか？

590 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/25 21:11

>>589
植物は25Sだから違うのでは？

591 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/25 23:21

>>583

条件いじくるより
Probeの位置を変えた方が絶対上手く行く可能性が高い。
断言する

592 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/25 23:22

GST融合タンパクの状態で発現させているのですが、
トロンビンでカットができなくて困ってます・・・・
全くとれない訳ではないのですが、SDSPAGEしてみたら
グルタチオンセふぁロースにガッツリ残ってます。
なにかいい策はないでしょうか？

593 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/26 09:12

>>591
そゆときって、プローブ長は長いほうがいいの？
それとも短いほうがいいの？
経験則でいいからおしえてけれ。

594 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/26 13:18

>>593
シグナルが出るんなら短いほうがいいな。
短すぎるとシグナル弱くなるけどね

595 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/26 13:28

cDNAの5'か3'-UTR配列をプローブにしる！

596 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/26 23:09

>>592
ﾎﾟｼﾞｺﾝはちゃんと切れていると仮定。スロンビンで切れにくいということは切断ｻｲﾄ
がﾏｽｸされている可能性大。切断時に塩濃度上げる。ｐH変える。ｽﾛﾝﾋﾞﾝを１０倍くらい
いれる。または、融合蛋白とGSTの間にリンｶｰ入れてみる。

597 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/26 23:39

Mupidで泳動させると、たまにバンドがななめってることがあります。
なんでですかね。

598 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 00:05

泳動バッファーのTAEやTBEが蒸発していて、ゲル中のイオン濃度と異なっていた。
あるいは
アガロースを枠に入れて固めるとき、温度が高すぎてゲルの表面近くの水が蒸発してしまい
ゲルの上下でアガロース濃度の勾配ができていた。

599 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 00:55

　斜めっていっても、どの軸に対して斜めであるかによって
答えが異なりますけどねえ。。。

600 ：まじで困ってます。：02/09/27 01:21

Clontechのkit を使ってsubtraction を行い、さらにdifferential
screening を行っているんですが、differential screening の結果が
やる度に違ってきて困っています。ポジティブだったクローンが２回目
にはネガティブになったり、その逆にもなったりします。プローブも同
じバッチ、クローンDNAも全くおなじなのに、困っております。
プローブはRIではなくて、FITC-nucleotide ラベルで、アマシャムの化
学発光でシグナルを検出しております。どなたか同じような経験をされ
た方いらっしゃいますか？

601 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 01:48

>>600
プラスミドとってNorthernで確認するのはどうですか？

602 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 02:46

differential screeningなんていう再現性のないことはやめて
手当りしだいにシーケンスして面白そうな奴だけノザンなりRTやった方がよっぽど良いと思われるな

603 ：まじで困ってます。：02/09/27 02:49

＞６００
ポジともネガとも判別できないクローンが３０個もあるのです。
ノーザンの前にせめて４～５個に絞りたいわけです。

604 ：まじで困ってます。：02/09/27 02:58

＞６０２
differential screening って、やっぱり再現性がないんですか？
普段のサザンやノーザンでは、シグナルの再現性に問題を感じた
事はこれまで一度もなかったです。
多分プローブのcomplexity がものすごく高いのが原因でしょうが、この
ように実験毎にデータが振れてはどれを信用してよいのか、わからなく
なってしまいます。それからmRNAが本当にちょっとしかとれないので、
ノーザンもSMART法でamplify したcDNAを使っています（いわゆる、
Virtual Northern）。それでも４～５回分しか取れませんでした。

605 ：名無遺伝子さん：02/09/27 03:06

>>592　切れたとたんに目的タンパク不溶化というやつでは？とりあえず以下のスレ全部見てみました？
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/982464137/
SDSでカラムに残るってのがよくわからないけど、これはカラム前の反応液やグルタチオンフラクションを
SDS-PAGEにかけると全長のものが見えるってこと？

606 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 03:32

>>604
30クローンだろ？
ファージでやってるとしても一週間もあればシーケンスまで終わるだろうが。

それから、良い事教えてやる。
プラークをつついてPCRでインサートを増幅しろ。
で、スピンカラムで精製して,
PCRに用いたプライマーでシーケンスしろ。
一日で終わる。

俺に感謝しろ

607 ：困ってます。：02/09/27 04:02

＞６０６
アドバイスどうもありがとうございます。
しかし、私が聞きたいことはこのdifferential screening の再現性の事
なんです。クローンを選ぶ基準は遺伝子がおもしろそうとかではなくて発現の差なんです。それからin situでも
確認しようとしています。３０クローンならまあ、１っヶ月仕事で終わ
るでしょう。でも、これから今までの２倍３倍の規模でスクリーニン
グかけるつもりなので、できればメンブレンの上だけでクローンの判断
が確実にできるとありがたいわけです。一番心配なのは、発現がネガ
だったと思っていたクローンに当たりがあるんじゃないか、ってことな
んです。シグナルが出たり消えたりするので。

608 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 08:42

ｼｰｹﾝｽしてRT－PCRで発現のﾁｪｯｸ

609 ：困ってます：02/09/27 09:23

プライマーその都度合成しているお金がないです。

610 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 10:15

>600
今年の春に全く同じことしてました。
違うのはRIでscreeningしてました。再現性とかは
RIのほうがありますが、クローン26とれて全てノーザン、RT,リアルタイム
ではかりましたが、全て差は無くて、半年の苦労は水の泡になりました。
今はずっかり別のテーマやって順調です。

二度とsubtrasctionとかdifferntial displayとかはやりたくありません。
一月なんかでは絶対に終わりません、保証します。週120時間
実験して半年かかります。一人でやったせいだというのもありますが
どうもボスには、うまく行けばしめたもので、失敗しても一人潰れるだけ
みたいに考えられてたようで、自分が捨てたそれは後輩が目を輝かせて
やってますが、後半年後には彼も同じ運命を辿るだろうと思ってます。

つうか、subtractionとかdifferential displayとかknock outの作成って
2ちゃん読む限りみんな、そう言う体験してるようです。

心からのアドバイスですが、こっそりもう一つ別の確実なテーマを
立ち上げて同時進行させることを勧めますね。いつ失敗しても
そっちに移れるように。学位とかかかってるなら絶対そうした方が
いいですよ。

611 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 14:32

折れんところも5年位前にだれかサブトラクションやって、
投げ出して後輩にゆずったけど投げ出したよ（ｗ

で今度はマイクロアレイだって。
こりないね（ｗ

612 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 14:36

>>600
はっきり言ってさいげんせいないよ
面白い配列じゃなくて発現の差でスクリーニングするという君の姿勢もわからないこともないけど、
そんなことじゃ一生natureクラスの論文はかけないよ
いかに面白いことを出すかというのも大事なことだと思うけどね。

君の文章を読んでいると、最近の学生には珍しく論理もしっかりしてて、
実験原理などにも詳しいと思ったよ。
だからそんながちがちに実験進めずに、面白いクローンが取れて、
さらに発現の差があればいいや。くらいの感じで進めていったほうがいいと思うけどなあ。
そして早いうちにテーマを変更したほうがいいと思う。

613 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 17:16

>>600
洩れの知りあいにも differntial displayやって
ポジの1000クローンを調べてたるのが居るけど
結局、たった1クローンしかいいのが見つからなかったそだ。
しかも differntial displayやった条件じゃ、ノーザンやin situや差がでないという罠
こんな例もあるよ！！

neuronに約4000クローン調べて見つけた遺伝子の論文が載ってましたが。

614 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 17:56

Northernやったら逆の結果になったことあるよ。
差が出たからいいんだけど。

615 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 19:56

>>597
バッファが少なめだとか

616 ：６００です：02/09/27 22:21

やはり、subtraction/differential ってそんなに再現性のないものなんです
か？この仕事始める前に知人のデータを見せてもらったけど、たしかに変なも
のばっかりとれたみたいですが、なかには確かにdifferential なものもあった
んです。それでこのスクリーニング法に賭けてみようと思ったわけです。何ご
ともスクリーニングにはガセがつきもので、これをいかに見分けるかが重要な
んですけどね。現在、ポスドク２回目で、もうクローニングみたいな宝探しは
やらないと思ってフィールドを変えたんだけども、このフィールドで一番重要
な問題は実は分子生物学的解析で解決出来る可能性に気付き、この仕事を選ん
だワケです。どんな手法でもいいんです。AとBに遺伝子発現レベルで違いが
あって、それを分子的に同定できればそこから突破口が開けるかもしれないん
です。どなたか良い知恵をお貸し下さい。それからdifferential display も結
構眉唾ものなんですか？

617 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 23:18

>>616
いや、だから発現に差があってもそれがハウスキーピングな遺伝子だったり、
unknown functionだったりしたら面白くも何ともないじゃん。
それよりは面白い遺伝子がとれて、で、発現量に少しでも差があればそっちの方が
話としておもしろいじゃん。
まあ、ねつ造しろとまでは言わないけど。
だからシーケンスして面白い遺伝子だけにしぼって解析した方が良いと思うよ。
せっかく頭よさそうなんだから、勿体ないよ。
DDは眉唾とまでは言わないけど、
endogeniousに発現量が低い遺伝子が取れないっていう傾向にあるな。
で、発現量が低い遺伝子の方が面白い遺伝子という罠

618 ：610：02/09/28 08:37

どうしても発現レベルで違いを見たいなら、まあ方法としては
いっぱい方法としてはあることはあるでしょう。SAGEとかiAFLPとか
最近PNASとかに改良されたSAGEのやり方とか載ってるし,
アメリカの癌研究者とかは異常にSAGEとか好きだし。
もちろんマイクロアレイでも、3回ぐらいやれば統計的に有意なものは
わりとでますし。外注で頼んで解析だけ自分らでやってもそんなに
金かからなくなってきてますよ

あとEMBO reportesにのってた野島先生のとこのstepwise subtractionとか
かなり発現量低いのでもとれるらしいし。本当かどうかわからんけど。
あとは発現量の違いをメチル化に求めてMS-RDAとかDMHとかで取るとか。
自分もやったことあるけど特定の転写因子ならクロマチン免疫沈降を使ったり
と、探せばあることはありますよ。

でもポスドクでこういうのやるのはやめたほうがいいとおもうけどなあ。
結局成功したラボの話とか聞くと修士の学生3代に渡って使って一つクローニング
したけど、発現量の差ばっかりにこだわって変な遺伝子だったしね。
617の言ってるように面白い遺伝子があったら
むしろそこからストーリ－作っていく方が絶対いいと思うけど。
でも結局、後になって成功するなり、失敗するなりしないと
わかんないんだよねえ、これって。
自分もやる前はこれで面白い遺伝子とっていいジャーナルに
のせようと思ってたけど、そういうのは結局大規模なラボで
使い捨ての人間がいっぱいいるとこじゃないとダメなのよ。

619 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 02:05

話の腰を折ってごめんなさい

AFLPのことで教えてください
なんでpreswlective と　selective　の2段階に分けてPCRをしないとだめなのでしょうか
またPCR後、標識してあるDNA断片をアクリルアミドゲルで電気泳動してPCなどで
バンド画像を解析するようですが、PCR後、エチブロ+UV照射でポラロイドや目視で
バンドパターンを解析する、ということはしないのでしょうか

620 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 02:11

最近良い人多いね

>>619
AFLPあんまりくわしくないが、
バンドパターンをエチブロで解析する事はないな。
なぜならメチャンコバンドが出るから。
最初の質問は他の人、だれか教えてあげて

621 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 02:20

>>620
生物板を良板にしようとする志のある人がいますから。

622 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 05:52

ポスドクならDDはやめて、他の動物で標的期間で面白そうなことが、
解っている遺伝子のホモログ取りがお勧め。
今はマウスもHumanもシーケンス情報だけは沢山有るから、
high homologyの場所をみつけてPCRで釣る。

623 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 07:57

ホモログとりってB４とかM１の仕事だろう？

624 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 08:02

ポスドクの方が短気で出る仕事をしないと次がない。
BならMも考えて３年の仕事を考えればいい。
ポスドクは１年で投稿まで行かないと、次がない。

625 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 08:22

へー。大変だね。
そんな面白くない事やんなきゃいけないんだ。
俺の分野だとポス毒3年はできるからね

626 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 16:30

SDS-PAGEで解析するために
SDSを含んだbufferと1:1で混合させた蛋白試料をマイクロチューブに入れて
フタの部分をパラフィルムで密封してマイクロチューブ用のクリップで止めて
チューブをそのままフロートに挿して沸騰水に入れ
100度5分で煮沸処理していますが
どうしても煮沸時にサンプルに水が入ってしまいきちんとした調製が出来ません。
どうすれば水を入れずに処理できるのでしょうか？

627 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 17:19

クリップなしでボイルして、
突沸する前に一度ふたを開けて、ガス抜きをする。＞６２６

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629 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 21:33

>626
水を使わないヒートブロックか何か使ったら？

630 ：６００：02/09/30 22:06

＞６２２
もちろん、それも保険としてやっていました。これまでもいくつか
ホモログ取ったけども全てネガ。これまでの経験から
ホモログ取りしても関係無いところで発現していたりしてだいたい
期待外れなんだよね。しかも他人の論文読んで取ってみようと思いつく
ような遺伝子は他人がもうすでにやっているし。
だからここは何のバイアスもかけないで純粋に発現差だけで遺伝子を
取ってきたいわけです。発現差のある遺伝子さえ同定できれば
例えそれがハウスキーピングであってもストーリーはどうにか作れる
と思うんですけどね。

631 ：＞626：02/09/30 22:21

100度で５分の必要は無い。
65度５分でいいはず。

100度数分の処理で勝手に切断されて泳動度が変化したり、アグリゲーションしてgelに入らないタンパク質がある。

632 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 00:59

アガロース電気泳動分離した
約0.8Kbのバンドをスピンカラムを使って抽出したのですが
それを電気泳動で確認したら0.8Kbのところだけでなく
約1.4Kbのあたりにもはっきりとバンドが出てしまうんです。
シークエンスに使おうと思っているので困っています。

633 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 01:16

泳動時間揃えた？マーカーも一緒に流した？

634 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 01:21

は？

ゲル抽出前にも1.4kbがあったの？
それともいきなりでてきたのか？

635 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 05:52

たまにある。
金に余裕があるならそのままシークエンスしてみれ。
経験上、おそらくそれはダイマーだと思われ。

636 ：632：02/10/01 09:11

レスありがとうございます。
>633
はい、ゲルは1枚でマーカーもしっかり流しました。
>634
抽出前にはなく、いきなり出てきました。
>635
そうしてみます。

書き忘れましたが、0.8Kbのバンドいっしょに
0.4Kbのバンドも抽出したのですが
そちらのほうは問題ありませんでした。

637 ：2チャンネルで超有名：02/10/01 09:21

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638 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 11:36

PCRして電気泳動して、その中の一本のバンド（DNA断片）だけが欲しい場合、
楊枝かチップ先でバンドをつついて、再度PCRと言うのを聞きますが
どれくらいの深さまでつつくものなのでしょうか？アガロースなどはできるだけ
くっついていない方が良いのでしょうか？反応液量は大目の方が無難でしょうか
よろしくおねがいします

639 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 12:13

悩む前に手袋して新しいカミソリで目的のバンドを四角く切り取って
パラフィルムの間に入れて潰して出てきた液をテンプレートにしたらどうだろうか？

640 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 16:32

>>638
コロニーではなくてバンドを？聞いたこと無いけど。

641 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 20:21

>>638
俺の場合は、目的のバンドの所にパスツールを挿して取る。
底まで突き刺す。
で、TE50ulくらいのなかに取ったゲルを入れる。
で95度で5分間煮沸したものをテンプレートにする。
まあ50ulでPCRやるならテンプレートに1ulも使えばいい。

642 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 20:24

それからPCR反応は高温なので、固まる心配はいらない
GTGを使えば夾雑物の心配もイラン。
まあPCR反応液の1/10 vol以下にした方がいいとは思うが。

643 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 22:06

研究費が足らん

644 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 23:21

それは悲惨ですね。
他のラボに盗みにはいらないでね（w

645 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/02 00:35

大量のサンプルを制限酵素で消化して
アガロースゲルに流して切り出してます。
それからＴＥに溶かしてフェノクロからエタ沈、
あるいはカラムを使うキットを使っても回収量が
少ないです。

もしもelutionのコツがあったら教えてください。

646 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/02 01:15

コツっていうか基本はUVに当てる時間を短くする。
余分なゲルは少なくするって事だなあ。

キットなら
eazy trap (Takara)
なら少なくとも半分。多くて90%は回収できる

単にフェノールで回収するんなら多くて2/10くらいじゃん？
減るの当然と言う事を前提にやってください。

647 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/02 13:36

最近ウエスタンブロットを発色現像すると点状の斑点が
いっぱい出てバンドを覆ってしまいます。
抗体を変えるときれいになるけど
ポリクロだとだめです。抗体の希釈倍率うすく
したけど今一です。
何が原因でしょうか？

648 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/02 13:59

>647
抗体を使用前にえんしんして使うと点々は減ると思う。
複数のぽりくろ抗体にでるのであれば、二次抗体もウタガウベシ。

649 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/02 21:25

＞６４７
もしalkakine phosphatase conjugate の二次抗体を使って発色しているなら、
発色buffer 叉はwash buffer をオートクレーブするのがよろし。
この２つのbuffer は古くなると（一週間でも）カビかなにかが生えてきて、
そのカビ由来の alkakine phosphataseでドットがでる。なるたけ毎回、
オートクレーブすべし。

650 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/03 15:28

６４８、６４９さんありがとうございます。
過去のブロットをチェックしてみましたが今のところ
このぽりくろ抗体のときだけ点々がひどいです。
でも半年前はきれいでした。遠心したら沈殿があったので
上清を使って今度はと期待したのですがやっぱしだめでした。。
ちなみにHRP conjugateの二次抗体を使ってます。
モノクロとこのぽりくろを同時に発色したことがあるのですが
ものくろの方は綺麗でした。
肝腎のバンドを粒状の点々がおおってしまいfigureにできません。

651 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/03 15:46

フォトショップで加工しる！

652 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/03 19:01

ＲＮＡiで標的遺伝子がつぶれたかどうかの証明実験てありますか？

653 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/03 19:06

ない

654 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/03 23:15

んじゃ抗体つくりなおせや
カビでもわいたんだろうよ

655 ：６４９：02/10/03 23:51

＞６５０
HRPですか。。。
それならアザイドで一旦そのポリクロ処理してみたら？
内在性由来のperoxidase（カビか何かの？）はアザイドで失活するから。そしてバッファーはこまめにオートクレーブ。

656 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/04 00:21

だからポリ黒だけドットが出るんだからバッファーは関係ないだろ（藁

657 ：６４９：02/10/04 03:04

＞６５６
バッファー中のカビが、メンブレンの表面にこびりついた抗体のコンタミに付着することはないですかねえ？

バッファーは関係ないとはまだ言えない。

658 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/04 03:56

それじゃあ他の抗体でもドットが出るだろ（藁

659 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/04 04:49

>641
>642
ありがとうございます。

660 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/04 05:27

６５０さんの例に即して言えば、そのモノクロには含まれて無くて、ポ
リクロにふくまれているコンタミが、メンブレンにこびりついて、
しかもそいつがバツファーのカビをトラップしている可能性もあると
いいたいわけです。もしそうなら、バッファーを滅菌するだけで効果
は現れるはずだし、すぐにできる仕事でしょう。抗体を遠心しても
効果は無いと言っている以上、次にできる簡単なことは試薬の滅菌です
よ。それから遠心でダメならエッペン中でできるマイクロシリンジ
フィルターというのもあるからそれを使って抗体を滅菌しみてはどうでしょう。

世の中にはカビが生えたら抗体から作り直すようなヒマで金持ちな研究者もいるんだね。

661 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/05 14:49

azideでHRPって失活するんか？
あれって防腐剤でしょ。

662 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/05 15:23

＞azideでHRPって失活するんか？
あれって防腐剤でしょ。

たしかに防腐剤だけど、
同時に活性も落としちゃうのだ。

80年代とかはそれがメインテーマで論文にもなってたぐらい有名な話だよ。
これでも読んでみんさい。

Richardson TC, Chapman DV, Heyderman E.Related Articles, Links
Immunoperoxidase techniques: the deleterious effect of sodium azide on the activity of peroxidase conjugates.
J Clin Pathol. 1983 Apr;36(4):411-4.

663 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/05 15:23

しっかつするよ辞書しらべろ

664 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/05 15:32

しっかつというか阻害

665 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/05 16:46

ヘムタンパク質にアジ化ナトリウム入れたら失活ないし、阻害されるのは基本だろ～が！

666 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/06 16:32

失活or阻害かっていうのは大きいぞ。
阻害が正解だとすると、655のsuggestionはあまり的を射ていないと言うことか。

667 ：６５５ですが、、：02/10/07 06:31

たしかに再生不可能な失活じゃないけど、普通のバッファーに戻したぐらいじゃ活性は戻らないよ。

俺はよくウエスタンでリプローブめんどくさくて、かつ、モノクロの次に
ポリクロ染めるようなときはアザイド入れて一回目の二次抗体失活させて
よくあらって、次の抗体反応していたよ。

668 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/07 19:28

エタ沈後に、迅速にDNAを水に溶かすいい方法ってありますか？

669 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/07 19:37

ぴぺってぃんぐ

670 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/07 19:59

真空乾燥などもってのほかよ。

溶液入れてしばらく放置してから混ぜれば効果倍増。

671 ：668：02/10/07 20:59

真空乾燥をしない場合は、残ったわずかなエタノールなどは
後の反応に影響はしないのでしょうか？

672 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/07 21:31

エタチンしてリンスしたら、スピンダウンして余分なエタノールを除く
これ最高。反応疎外した事など無い。
むしろ、リンスしてスピンダウンせずに乾燥してるだけだと
余計な塩などのこりまくり

673 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/07 22:38

ノーザンの時、バンドが薄いので
露光・現像時間を長くしたら、今度はフィルムが真っ黒
になってしまった。

どうしたらよかですか？
ちなみにキットはECLです。

674 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/07 22:40

流す量増やせよタコ

675 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/07 22:43

つかECLで真っ黒になるって、そうはないぞ。
ノザンにECL使う奴もそうはいないと思うけど

676 ：668：02/10/07 23:20

みなさんありがとうございました
早速実行してみようと思います

677 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/07 23:54

エタチンの汁を残すようなやつはだめだ。

残しても0.3ulまでだ。

678 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/08 01:17

植物の形質転換を始めるんですけど、お勧めの実験書無いです？
タバコで､選抜とか培養とか解析法とかも詳しく書いてあるやつがいいです。

679 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/08 03:29

PCRで出たバンドのシークエンスをしたいと思います
論文とか読んだら
ゲルからの切り出し
ベクターに入れて菌で増やして増えたのを標識して
サンプルのDNAとハイブリダイズする。PCRして長さを確かめる
そしてシークエンス
と言う感じですが、　>638　>641
で再びPCRをして、目的のバンドのみだったら
そのPCRサンプルをシークエンスする、というのは
方法としてはダメなのですか？

680 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/08 03:30

モーマンタイ

681 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/08 06:27

>>679
> ゲルからの切り出し
> ベクターに入れて菌で増やして増えたのを標識して
> サンプルのDNAとハイブリダイズする。PCRして長さを確かめる
> そしてシークエンス

今時そんな事やってる奴いねえよ。
バンドが一本だけなら、PCR後、カラムでプライマーとdNTP除去して、
それをテンプレートにシーケンスするのが一番きれいに読める。
まあバンドが２本以上ならゲル抽PCRでもいいけど、
けっこうゲル抽PCRって、コンタミするからまた余計なバンドがふえる可能性高いよ。
それくらいなら一回目のPCRのあと普通にゲル抽出してから
シーケンスした方が良いかもね

682 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/08 09:58

ウエスタンブロットで低分子（６kDa以下）のバンドが
鳥が飛んでるみたいに歪んでしまいます（真ん中がとがって）。
IPしてTris-NaClのみのbufferでよく洗うといいのですが直接ロードすると歪んだ
バンドになります。細胞を1%TritonX100でlysisしてサンプルバッファーと
混ぜて流してますが何が原因でしょうか？
同じ条件で10kDa以上はまっすぐなシャープな
バンドです。

683 ：2チャンネルで超有名：02/10/08 09:59

http://wqll.jpn.ch
http://my.post-pe.to/tthujk/

女子中高生とHな出会い
　　ロリロリ児童とHな？
　　2チャンネルで超有名

684 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/08 14:02

>681
すんません。
ありがとうございます！助かりました

685 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/09 01:25

DNA抽出って核DNA（gDNA）と葉緑体やミトコンドリアDNAがあると思うのですが
一般的にどこで分けるのでしょうか？
超遠心後に環状か非環状かでわけるのでしょうか

686 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/09 03:25

>>682
gelは何？Tris-Tricineか？何％？
もうちょっと情報下され。
Triton入れると泳動乱れることあったなぁ、低分子は。

687 ：IL-29：02/10/09 06:03

qiafilter maxi-prepって、菌体多いとsupロスるなあ。
ピストンが途中で動かなくなったぞ。むかつく。
やっぱ、250 mlにしとけばよかった。
欲張って500 mlのせた俺がバカだった。

688 ：黒澤：02/10/09 06:39

ついに出た!
各板ごとのｺﾃﾊﾝﾗﾝｷﾝｸﾞ!
ﾘｱﾙﾀｲﾑに変動するｺﾃﾊﾝの順位を見ることが出来る!

【2ちゃんねる人気ｺﾃﾊﾝﾗﾝｷﾝｸﾞ】
http://curoco.com/2chvote/

689 ：682：02/10/09 15:02

>686
GelはTris-Tricineの10-20%gradientです。
IPした場合すなわちTris-NaClで洗って、
あとは同じGel、sample bufferを使用してもバンドはゆがんでないので
Lysis Bufferが怪しいとおもってるのですが。。
detergentが原因だと除くのどうしたらいいですか？？

690 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/09 15:15

http://www.alfheim.jp/~narikiri/narikiri/test/read.cgi?bbs=TheSun&key=1020733230
イタイ厨房ダークセルジュ ◆DUDarkSzlUが見れます（笑）

691 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/09 17:56

＞６８９
アセトン沈殿とかＴＣＡ沈殿で除く

692 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/09 18:08

多糖類が多く含まれる植物からゲノム抽出をしたいのですが，CTAB法では多糖類は残ってしまうのでしょうか．
多糖類をあまり含まないゲノム抽出法があったら教えて下さい．

693 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/09 19:19

Li-acetate処理で糖は墜ちるのでは？

694 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/09 21:28

>>692
CTABが一番いいと思うよ。
一応、原理的には多糖とDNAを分離する仕組みになってる。

まあCTABでやってみてだめならキットでも使えば？
Phytopureとか船越とか。

695 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/09 22:56

>692
果樹？木本？

696 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/09 23:20

>>687
典型的な素人の失敗だね。うちのMDの院生が良くやってるよ。さらに、500mlの
フラスコに2xYTとかTBとかのrichな培地を200ml入れて振ったりしてる。
airationが悪いんで菌の増えが悪くて、結果として菌体が稼げずになんとかなっ
ちゃってるけどね。The more, the betterだと思ってるんだろね。制限酵素なん
かも無駄に沢山使ってるし。

697 ：692：02/10/09 23:34

>>693-695
返事ありがとうございます．
詳しい材料はいえませんが草本植物からゲノムを抽出しています．
自分もCTABで充分多糖が除去できると思うのですが，その後の実験が上手くいかないのでゲノム抽出が原因かと考えてました．

698 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/09 23:52

>>696
おれんとこの奴も５００のフラスコに３００とかいれて振ってる奴居たけど、
お前さんは注意してあげないの？
おれも注意しなかったけど（藁

699 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/10 00:05

>>698
いや、オレより目上の奴だからねえ…

700 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/10 02:56

>>696
同意。ウチはスタッフにもいるけどなんでも多めなヤツらはサイエンスに向いてないと思う。

701 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/10 03:01

2Lフラスコに2xYT 1L入れて発現してますが、なにか？

702 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/10 11:17

硝酸カリウムを10g/1000ml入れれば、別に大丈夫。
大腸菌は呼吸できる

703 ：182kb：02/10/10 14:31

あー、誰かフリーのソフトでABIの波形データを
読めるソフト知りませんか？
Edit ViewはMac用しかないし。
Win用でフリーのものはないのかな？

704 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/10 22:46

ﾏｲｸﾛｻﾃﾗｲﾄマーカーに関して教えてください

ある生物でマイクロサテライトマーカーを見つけるとき
その生物に関するゲノムの情報が無い時は
どのようなステップを踏むのでしょうか

DNAライブラリー作る
適当なﾏｲｸﾛｻﾃﾗｲﾄ配列のプローブ作る
プローブと相同的なDNA断片をライブラリーから見つける
そのDNA断片の配列を調べる
そのDNA断片のﾏｲｸﾛｻﾃﾗｲﾄの長さは違うけど周辺の配列がほとんど同じ物が見つかる
その周辺の配列を元にしてプライマーを作って、PCRでﾏｲｸﾛｻﾃﾗｲﾄ部分が増幅されるのを確認する
SSLPマーカー完成
でしょうか？

それとも何か参考にできるデータベースとかがあるのでしょうか

705 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/11 10:16

>>704
（ゲノム配列情報が少ない生物の場合）手順は大体いいような気がしますが、
マイクロサテライトの多型性が重要な場合は、ある数の個体を用いて
アリル頻度等を調べる必要もあるでしょう。

マイクロサテライトマーカーを用いてgenetic mapを作ったと言うpaperは
沢山あると思うので、それらを参考にすればいいのでは？

706 ：704：02/10/11 17:20

>705
ありがとうございます
ブラストサーチやDDBJも見て見ます

707 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/11 17:37

DNA抽出の費用のことで教えてください
PhytopureのようなキットとそうでないCATB法などでは費用を比べると
比率でどのくらい違うものなのでしょうか

また本などを読むと抽出方法の違いがPCRの増幅結果の違いになることも
あるそうですが、RAPDのような特に再現性が問題になるPCRの場合
その抽出方法の違いがもたらす増幅結果の違いは顕著に出てくるものなのでしょうか？
再現性が優れているバンドはあまり抽出方法が違っても大丈夫なものなのでしょうか
すみません。

708 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/11 18:01

>>703
Chromas
http://www.technelysium.com.au/chromas.html
チャート表示・印刷のみ．古いヴァージョンはフリー．

アラインメントもできるソフトウェアもどこかにあったが，
印刷されたチャートが粗くてねぇ．漏れはもっぱらChromas使って
別のソフトでアラインしているよ．

709 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/11 19:33

>>707
こないだの多糖類の君だね。
費用はなんともいえない。
どのくらいやるかによってもかわるしね。

RAPDくらいなら普通そんなにDNA純度を気にしなくてもいいとおもうが。
それにコントロールをしっかりとれば正誤の区別はつくと思う。
あと、再現性の問題は、DNA抽出法の問題じゃ無くて
腕の問題って言う場合が結構多い。
M4とかがとったゲノムはPCRで増えなかったりすることがかなり多い。
D3の俺は100%同じ量で増える

草本植物の何科かくらい明かしてくれるともっとつっこんでこたえられるんだが。
一応シュンジュウ社の植物のPCR実験プロトコールっていう本に
木本でpolysaccaride richな植物からのDNA抽出法がかいてあったから
一応読んでみて。

710 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/11 19:34

まあつづりはまちがえるけどD3でも

711 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/11 21:28

>709
ありがとうございます
多糖類の片とはまた違う人間です

>一応シュンジュウ社の植物のPCR実験プロトコールっていう本に
木本でpolysaccaride richな植物からのDNA抽出法がかいてあったから
一応読んでみて。

ういっす。これとPCR　TIPSが今の愛読書です

＞あと、再現性の問題は、DNA抽出法の問題じゃ無くて
腕の問題って言う場合が結構多い。

気をつけて抽出します

712 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/11 21:29

書き忘れました。すみません。

>こないだの多糖類の君だね。
費用はなんともいえない。
どのくらいやるかによってもかわるしね。

キットを使わない抽出法がキットに比べて決して安上がりと言うわけではない、
と解釈してよろしいのでしょうか

713 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/11 23:15

リン酸化した基質をIPして、抗リン酸化抗体でウエスタンしようとしてるの
だけど、どうやらIPの過程でPhosphataseが効いてて、De-P化でシグナルを
ロスってることがわかってきた。
皆さんどんな脱リン酸化阻害剤使っとります？
今使ってるのには50mM-NaF,1mM-Na2VO4がはいってまんがな。

714 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/12 00:59

>>709 M4..（泣）実験うまくいかなくてもがんがれ..
陰ながら応援しているとお伝えください

715 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/12 01:29

ALFexpressでのシークエンスがうまくいきません。
鋳型は６００ｂｐのPCR産物でゲルからグラスミルクのキットで抽出しました。
プライマーはPCRで使ったプライマー（２０mer、ＧＣ含量５０％）を
使って両側から読もうとしたのですがダメでした。
プライマーをつくりかえたほうがよいのでしょうか？

716 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/12 01:52

このスレについて一般論ですが
・どのようにうまくいかないのか(詳細な現象＜チャートの様子とか)
・自分のバックグラウンド，経験年数
を書いたほうがいいアドバイスを得られると思いますよ

717 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/12 01:53

もちろん
・実験条件
も忘れずにね

718 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/12 02:09

>>715
バンドが一本ならカラム（Microcon-100)で精製しろ
PCR productの場合はシーケンス反応のtemplateは少なくて良いのだがだいじょうぶか？
BIG DYEなら600bpなら6-12ng/20ulだが

719 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/12 03:44

マルチウエルのディッシュに寒天培地分注するのって、
どういう機械使うの？
メーカーとか、名前とか
詳しく教えてほしいです。
一応1.5mlから1０mlくらいのはんいでやりたいんだけど

720 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/13 12:49

>>719
駒込ピペット

721 ：困った院生：02/10/14 03:26

gel shift assayやってて、
核抽出液なしのRIプローブのみのレーンにも、
free probeの他に、真ん中あたりにバンドがでてしまって、困っています。
competiterとしてcoldのself-probeを過剰に入れても、
そのバンドは消えずに残ってます。。
やっぱりどっかでタンパクのコンタミがあるんでしょうか？
それとも何か、全く別の原因があるんでしょうか？

722 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 03:42

プローブがくっつきあってる香具師じゃねーの？

723 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 05:35

【釜山アジア大会】韓国びいきに不満や怒りの声ぞくぞく
http://news2.2ch.net/test/read.cgi/mnewsplus/1034323758/l50

724 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 06:32

>721
competiter ---> competitor
修行し直すが吉。

725 ：719：02/10/14 11:24

>>720
うそでしょ？
めんどくさいし固まりそう

726 ：703：02/10/15 00:19

>>708
ありがとうございました。

727 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 00:40

植物のtransformationをやっているのですが、まったくうまくいっていない。
コロニーでない。
小さなことでも、なにか情報あれば教えてください。

728 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 01:01

植物のトランスフォーメーションでコロニー？
意味が解らんな。
もう実験やめたら？

729 ：灯台院生 ◆yeOBWilgtY ：02/10/15 01:01

>>727
アグロを代えれ！

730 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 01:07

質問の意味が全く解らんが、アグロに入れられないってことか？
ポレーションで。
重要なアドバイスがあるが、もうすこしちゃんと質問しないと答えてあげない

731 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 01:10

はいっ！

732 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 01:47

アグロにはいらないのです。ベクターに入らないのです。
どおしたらいいのですかぁ　おねがいします

733 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 01:57

>>732
アタマワルソー

もうさっさと実験やめろよ

734 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 01:59

アグロに入れようとしてるって事はベクターには入れてんだろ？
もうこいつの言う事は無視してアドバイス。
エレクトロポレーションでアグロに入れるとき、
パルスかけたら、そっこーでLBなりSOC入れろ。
１０秒以内で。できれば3秒くらいで。
ゆっくりやるとアグロは全くはえてきません。

735 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 02:50

タバコのアグロトランスジェニックの論文かWEB、本をどれか教えていただけないでしょうか
けんさくでみつけられなかったので
あほですみません

736 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 02:53

短いDNA断片を泳動したい時，ポリアクリルアミドゲルを用いますが
どれくらいの長さの断片ならば，どれくらいの濃度のアガースゲルで
代用できるでしょうか？

またアクリルアミドゲルをエチブロ染色はしないのでしょうか
バカな質問ですみません

737 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 12:55

アグロとDNA溶液を混ぜてから液体窒素で凍らせて、その後、37度で３０分いんきゅべーと
してYEBを加えて30度２時間おいてからYEBプレートに撒く方法もある。

とにかくDNAを非常識に多く加えれば入る。

738 ：＞729：02/10/15 13:53

まさか、頭のキレる博識なアナタは狸学部弐号館の万年研究生、F腹K２郎さんですか？

739 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 14:47

ごめんなさい。バカなのです。
というか、パソコンをもってない友達からの質問なのです・・・
アグロにいれるまえの段階で、ベクターにはいらないそうです。

740 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 19:00

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　人"((; 从"))∧
　　　　　　　　　　　 Λ＿Λ　　　＼　＼　|　/　／　　　　　　　）｀ノ;''" "!;;・"､;;")
　　　　　　　　　　　（　´Д｀)　　　Ｚ　ゞ　⌒ヾ∠,_＿＿＿＿＿（从"((; 从;;;从￣｀ヽ,＿＿＿＿_＿__-ニ￣￣ヽ
　　　　　　　 -= -'' ~ ＝￣_￣(二つ`　　　 :　=- 　　　　　　　　（从;．%;"))>>739>;_＿_ '　,,　　゛　、＿　　　　　　）
　　　　　　　　-= 　　　- ― ＝￣""／/_　く￣￣￣￣￣￣￣从；:::（（::・:人人;;）＼￣￣￣￣￣`--=＿＿__ノ
　　　　　　　-=　　　　　イ）　　　／　/ ∨Ｎ　＼　　　　　　　从::　／／-从::;;;))
　　　　　　-=　　_,　　　i　　　,　'　　,'　　　　　　　　、　　　／　／　,-'
　　　　　-=　　 /ヽ　　ヽ,.　　　　　　　　　　　　　　　　　／　／| 　.i
　　　　-=　　／　　-=　　ヽ　　　　　　　　　　　　　　　!､＿／ / 　〉
　　 -=　 ,／　　　　-=　　ﾉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　|_／
　-=､＿ノ　　　　　-=_,＿)

741 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 22:24

>>739
はいらないっていわれてもねー。
大腸菌がまったくでないのか
インサートがはいってないのかくらいはっきりしろよ

742 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/15 23:25

上げに上げてみる

743 ：灯台院生 ◆ipJni/6Rlw ：02/10/15 23:46

>>738
誰それ？しらん。

744 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 02:03

RAPD

論文を読んでいると10-merと12の時がありますが
一般的に再現性や出てくるバンドの数は結構違うものなのでしょうか？
（12－MERはバンド少ないけど、再現性ｳﾏｰ）

また2％ゲルに泳動と言うのが多いですが、短いバンドなら1.5％
よりも観察しやすいものでしょうか

745 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 04:26

まあ２％くらいのほうが1.5よりも格段に低分子は別れるよな。
高分子はヤバいけど。
まあ場合によりケリだろ。
10merも12merもゲル濃度も

746 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 10:18

>745
ありがとうございます

747 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 10:23

RAPDの再現性に関してはPCRの条件によりけり。
サーマルサイクラーが異なると再現性がなくなることもある。

オリゴの長さは、20 merでもやったりする。

ゲルに関しては俺は１％でやってた。
見たい大きさと解像度の問題で適宜変えたらいい。

748 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 11:20

>>739
アグロへのプラスミド導入は､凍結融解法を使ってみてはどうか？
うちではそれで失敗したことないし。

749 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 11:54

プラスミドに入らねぇって言ってるだろ！

750 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 12:11

つうかアグロからプラスミドとるのたいへんだよね。
ちゃんと取れる？
俺めんどくさいからPCRだけで終了してる

751 ：bloom：02/10/16 12:28

http://homepage.mac.com/leverage/

752 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 14:45

Hot Borate法でゲノムって取れるのですか？
教えて下さい。

753 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 15:52

そんな方法しらね。
個人特定される呼び方じゃねーの？

754 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 22:26

こづくりが上手く逝きません。いつも女ができます。。。

755 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 22:33

研究者のみんな～男の子生んじゃってる～？
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1029566156/l50

756 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 23:16

あどうも

757 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 02:53

>747　確かに。

ﾏｲｸﾛｻﾃﾗｲﾄやその周辺と，トランスポゾンって何か関係ありますか？

758 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 12:49

はじめて書き込みさせていただきます。

現在制限酵素処理が上手くいかず困っています。
plasmid 1μg
EcoR1 3μl
Xho1 3μl
10×H buffer(Takara) 5μl
total 50μl

上記系で37℃、O/Nしています。
plasmidの取り直し、制限酵素認識部位を含めて12bp,当該遺伝子配列18bp系30bpのprimerに変えたりもしましたがいっこうに変わりません。
電気泳動で確認しても2000bpより遙か上の方にバンドが出たりなどします。
配列の確認等出来ることはしました。

どなたかお答え下さると大変ありがたいです。
宜しくお願いいたします。

759 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 13:20

↑の二段目の文章がよくわからん。なんでプラスミドの切断にプライマーが出てくるのだ？
あと酵素はそれぞれ0.3μlで十分、時間も37度2時間でいい。

760 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 13:23

これって本当か？

↓　↓　↓
http://www.dream-express-web.com/space-trust.htm

761 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 13:34

759のような厨房は出しゃばって答えるな。
サイト付加したくてプライマーに加えただけだろ。

762 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 14:37

でもたしかに758の書き込みは頭が悪い

763 ：＞760：02/10/17 14:40

>>758の書き方で理解できると思っている香具師は統合失調症の疑いを持った方がいい。
藪でもいいから医者に診て貰え！

764 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 14:44

だいたいXhoIってHで切れたか？
酵素入れすぎだし

765 ：＞758：02/10/17 15:02

primerの長さに「bp」は無いだろ～
意味分かってないよな

766 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 15:11

>>758

プラスミドがきたない、
酵素が失活、

767 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 15:18

PCR産物→制限酵素切断→vectorにライゲーション→形質転換→でてきたコロニーをミニプレップ

上のようにもしスクリーニングのための酵素切断だとしたら、vectorがせるふらいげーしょんしたのを拾ったのかも。

768 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 15:20

　>>767
そんなサルでも分かることを（以下略

769 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 15:38

一番の問題は>>758の書き方だと思う。だれも理解不能

770 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 19:31

たんなるメチレーションじゃないの？
コンピテントセルの種類かえてプラスミドとりやりなおしてみたら？

771 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 19:42

意味不明系に書いたほうがレスがたくさんつくのか？

772 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 19:50

SDS-PAGEに流した精製蛋白をPVDF膜に転写したあとに
CBBで染色して50%メタノールで脱色しバンドを確認した後に
100%メタノールで脱色しているのですが
バンドの部分だけCBBが取れずに困っています

アミノ酸配列を外部に委託して読んでもらうためには
バンドが染色されたままでは解読できないとのことですので
解結方法よろしくおねがいします

773 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 19:58

脱染しなくてもいけるんじゃなかったっけ？

774 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 19:59

暖めたら？＞100%MeOH

775 ：灯台院生 ◆ipJni/6Rlw ：02/10/17 23:26

>>773
私の知ってるところも脱染色しなくてもいけるよ。
772はもう少し業者を洗ってみる必要がありそうね。

776 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/19 12:35

777

777 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/19 12:46

マジで何に金を使っていいのかわからんらしい。
政府に発言権のある経済学者が見てるぞ！

【経済】バイオ研究に２兆円投資－政府
http://news2.2ch.net/test/read.cgi/newsplus/1034554434/

政府はバイオ産業を自動車や情報産業に次ぐ中核産業に育成する「バイオ産業立国」の国家戦略の
概要を固めた。2006年度までに研究投資を現在の５倍の約2兆円に増額、日本が弱いバイオの基盤
技術と人材育成などに重点投資する。新薬審査などの規制緩和も進め国際競争力を持つ企業を育てる。
国内企業主導で2010年に25兆円と試算されるバイオ市場を育成、関連産業を含め新たに100万人の
雇用創出を目指す。引用元　　　　　　　　　　
http://www.nikkei.co.jp/news/main/20021014AT2GI002213102002.html
275 名前：名無しさん＠３周年投稿日：02/10/16 22:28 ID:rXeA5GOc
いまさら遅いと言ってる人に質問。
それでは今、何に金をつぎこむのが良いでしょうか？
278 名前：名無しさん＠３周年投稿日：02/10/16 22:33 ID:Y+SPKaPE
>>275 　　　　　　　　　　　
彼らは批判するしか能の無い口だけ人間なのでまともな答えは返ってきません（ｗ

778 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/19 18:17

ﾏｲｸﾛｻﾃﾗｲﾄやマイクロサテライトマーカーのレビューってありますか？
できれば邦文で。

779 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/19 19:36

ちょうど、今、俺が書いてるから、ちょっとまて。

780 ：灯台院生 ◆ipJni/6Rlw ：02/10/19 22:14

ワラタ

781 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/19 23:44

>779
早めにお願いします
投稿論文でびしばし引用させていただきます

782 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/20 22:56

とりあえず今は
trends in ecology & evolution vol.16 (3) 2001
choloroplast microsatellites : new tools for sudies in plant ecology and evlution
読んでます

783 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/21 02:05

age age 00213589887

784 ：772：02/10/21 15:19

>775
業者というより教授の知り合いの研究室に依頼して
PVDF膜に結合させたアミノ酸配列を解読してもらっているのですが
脱染が中途半端だから解読ができないんだと教授が言い張るので
完全に脱染できないとOKが出ないのです
しかも教授の手を通してでないと試料をその研究室に持っていくことはできないので
実験そのものが完璧に行き詰まっています（涙

785 ：772：02/10/21 16:39

・・・と思ったらその矢先に漸く完全脱染できていました
やっと教授のOKもでて今膜を切り出してマイクロチューブにいれ
窒素で置換して冷蔵庫で保存しました
まもなくアミノ酸シークエンサーにかけるところです

お騒がせしました（m__m）

786 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/21 21:43

NotⅠとHindⅢって相性わるくて、どっちかを活性100％のバッファーにすると
一方は　<20　になってしまうのですが、それでも完全切断きれますか？
コンストラクトの確認してるのですが、予想する長さのDNAは切り出されるのに
不完全切断なのです。このまま先に進んでもいいのでしょうか？

787 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/21 22:14

>>786
制限酵素に機種依存文字使ってるようじゃまだまだだな。

完全にきりたければ
最初にMでHindIII切ってから
つぎにH+Triton+BSAでNotIで切れ
MからHにえたちん無しで変える方法くらいは知ってるか？
まあ知らないだろうけど、めんどくさいから俺は教えない

788 ：786：02/10/22 01:02

>>787

789 ：786：02/10/22 01:03

↑ミス
>>787
ありがとうございます、バッファー変える方法は先輩にきいてみますー♪

790 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/22 03:33

＞７８６
この場合、俺は両方の10X バッファーを半分にして等量混ぜて使っているが、これまで問題は無かったけど。。。

791 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/22 03:49

漏れはカラムかけて脱塩してから

792 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/22 04:02

一回目の反応液量をxとし、
二回目をyとすると、
1/20x＋1/10(y-x)のH bufferを足すんだよ。
L→Mも同様

793 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/22 23:19

>>792
神！

794 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/23 19:46

>>792
GOd!!

795 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/23 21:44

いや、そんなほめられても、、、
どこでもやってんじゃないの？
あくまで簡便法ですから。
まあそもそもLとかMとかHとかってのも目安だけど。
ちゃんとやりたければイオン計算してちゃんとした試薬も作れるだろうけどね。
まあ切れない制限酵素とかいうスレに自作のbufferは切れないとか書いてあったけどな

796 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/23 23:25

最近は便利になって「Double Digestion用推奨Universal Buffer」ってな表があるんで
そっちですませちゃうんだな。昔は塩を足してたけど。

というか、始めに指導教官が教えないのかなあ、切り方。

797 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 00:24

おしえないんじゃない？
俺も自分で考えたし。
double digestion推奨bufferって使った事無いけど
いけてる？

798 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 02:01

誰かRabbit&Rabbitの抗体で蛍光で２重染色する方法教えてくれませんか？
monoclonal Abではどうしても染まらない抗原２つを
どーしても同じ細胞に発現してるかどうか確かめたいんです。
時間もないし、誰か助けて下さい。

799 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 04:07

ﾏﾙﾁはダメだ象

800 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 10:22

>>798
連続切片とって隣接同士を比べる。

801 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 10:59

ホモロジー絶対避けているのに、他の遺伝子も吊ってしまって、
Realtime上手くいきません。
プライマーの特異性を上げるウラ技、試薬お願いしますぅ。
ちなみにGC50以下、長さ２０位、Tm60位で作ってます。

802 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 11:34

＞Double Digestion用推奨Universal Buffer
TaKaraやTOYOBOのカタログには必ず載っていたはず・・・

803 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 12:47

>>798
一時抗体処理 -> 二時抗体処理（MOUSE anti-Rabbit) -> ヨーク洗ってから
過剰量MOUSE Ig処理 -> 別のRabbit Ab処理
せめてどっちかのrabbit抗体が標識抗体ならきれいに染められるが。
そうでなきゃあ、先に一時＆二時抗体反応させておき、生成して使用。
最近良いキットがでてるぞ、調べてみそ。

804 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 16:17

>>802
あ？
だからのってるけど、使ったことないから、実際切れ具合はどうよ？
って聞いてんだよ

805 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 18:29

>>804
別に問題ない。

806 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 21:40

>>804
まあまあいけるよ。確認程度だったら十分。1.5xのTbufferとかおもろいよ。
大事な実験は分けてやるけど。

807 ：798：02/10/24 22:17

>>798
>>803
>一時抗体処理 -> 二時抗体処理（MOUSE anti-Rabbit) -> ヨーク洗ってから
>過剰量MOUSE Ig処理 -> 別のRabbit Ab処理

過剰量mouse Ig処理って何するんですか？wash以外でなに？

>そうでなきゃあ、先に一時＆二時抗体反応させておき、生成して使用。

うーん。Alexaでkitあるみたいですね。「精製して使用」って標識anti Rabbit Ab
さえ無ければ良さそうだけど、混ぜたのぶっかけではやばいですよね。
どの程度のことやられていますか？あー教えて君ですみません。

808 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 23:26

>>801
10% DMSOを反応液にいれるとノンスペ消えることあるよ。
もちろんだろうけど、PCRかけるまえは氷上操作してる？
これでもずいぶんちがう感じがしたんだが。

809 ：804：02/10/24 23:28

>>805-806
ども！

810 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/24 23:30

real timeだと標識してるからtmとか変わるんじゃ無かったっけ？
よくしらないけど。
高めにしたりでぃむそ入れたりしてみたら？

811 ：カスタムDNAアレイ：02/10/25 07:28

以前、度々subtraction/differential screening でお騒がせした者です。

メンブレンでのハイブリスクリーニングが遅々として進まない（２００クロー
ン／週）ために、とうとうボスがDNAマイクロアレイ（DNAチップ）をカスタム
で作らせて、differential screening したらどうか、と切り出してきました。
一枚のスライドで数千のクローンを一度にスクリーニングできるんですよね。
外注するとそうとう値が張ると思いますが、だいたおいくらいなんでしょう
か？
さらに深みにはまりそうで私個人としてはやりたくないんですが、値段を知れ
ばボスもあきらめるかと思いまして。。。よろしくお願いします。
（でも内心、外注で済めば楽だなあと思っている）。

それからトラブッていたdifferential hybridization でのシグナルの振れです
が、ハイブリをハイブリバックからボトルでのハイブリに替え、ハイブリ、洗
いともに真面目に温度計で温度を確かめながら行ったところ、かなり改善され
ました。しかしそれでも擬陽性のクローンはなくなりません。今のところあた
りは無し。もういちどsubtractive hybridizationの条件設定からやり直さない
といけないかもしれない。

812 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/25 14:24

20μLでPCRしています
*10酵素バッファー、dntps、プライマーは2μずついれています
水は13μです
ﾃﾝﾌﾟﾚｰﾄ保存液の濃度を薄めたため、その分より多くのﾃﾝﾌﾟﾚｰﾄ液を入れるようになり
水だけ15μにしました。今までﾃﾝﾌﾟﾚｰﾄはマイクロチップで取っていたのですが
イエローでとるようになりました
そしてらパタンとほとんどﾊﾞﾝﾄﾞが出なくなりました

バッファーやdntps、プライマーの推奨濃度をずらすとPCRにかなり悪影響なのでしょうか
それとも変にゲノム調整濃度をいじったせいでしょうか

813 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/25 15:09

>>812
なぜ200/1WEEKなの？
メンブレンには何をどうくっつけてるの？

814 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/25 15:12

>>812
ハ？
テンプレート増やしたのに
なんで水が13ulから15ulに増えてるの？
意味分かりませんが。
それからマイクロはuにしたほうがいいよ

あと８１３の>>812はとうぜん>>811の間違いね

815 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/25 18:38

>>812
意味不明なんだけどさ、
もしかして反応液の容量20ulより多くしたのに
バッファーの量とか変えてないの？

816 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/25 19:53

>811
ヒトやマウスなら3-4枚で100万ぐらいかな？
カスタムじゃない場合だったと思うけど。

817 ：８１１：02/10/25 21:34

＞８１３
subtractionしたcDNAをベクターにいれてトラホメし、コロニーを一個づつ新しいプレートに並べます。コロニーPCRしてその溶液の一部をメンブレンにスポットしていくわけ
です。Clontechのsubtraction/differential kitの場合、ハイブリには４種類のプローブ
を使わなくてはならないので、全く同じメンブレンを４枚作る必要があります。
結局、２００クローン調べるために、２００X４＝８００個もスポットする必要があり
ます。一人で行うとトラホメ、PCR、メンブレン作成だけで３日、ハイブリ、現像で２
日という勘定になります。
＞８１６
プリメイドのチップですらその値段なら、カスタムメイドならいったいどのくらいに
なるのやら。。。もちろん先に述べたように私の実験の場合、redundantなものを除く
ためにクローン全てをシーケンスする必要はありませんので、その分は安くなるかも
しれない。私の場合、単純に一回でスクリーニングできるクローンの数を増やして、ス
ピードアップをはかるためのDNAチップです。

818 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/25 22:03

８連ぴぺったーとかないの？
あればスポットなんてすぐ終わると思うけど。
たしか96ｻﾝﾌﾟﾙx16枚スポットするのに１時間くらいでおわった記憶があるけど
サザンやってるあいだにスポットしてけばもっとはやくなるし。
ドットブロットならハイブリ４時間で十分すぎだとおもうけど。
ECLなら検出も５分くらいでしょ
ハイブリの時間長すぎるのが擬陽性の要因かもしれないね。
まあその可能性は低いだろうけど。

819 ：８１１：02/10/25 22:37

＞８１８
８連ピペッターは現在考慮中でした。たしかにメンブレンにスポットす
る過程が一番の律速段階なので、そこを効率良くこなせればかなりの
スピードアップは図れると思います。ハイブリは４時間でも十分かも
しれませんが、differential screening の場合、私の経験では高温、
長時間でハイブリさせ、洗いもかなり高めのstringency で行い、弱いシ
グナルを長時間露光して検出しなければ、安定な（実験毎に出たり消え
たりしない）シグナルにならないようです。プローブのcomplexityが高
いためと思われます。

820 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/25 22:52

>>808. 810
もう試したことあるのばかりです。
最近ではどうもプライマーがへっぽこ（指示した配列で合成されていない）
のではないかと思ってます。3'側が一塩基違うとぜんぜん違うから。
化学合成だからやっぱり１００％配列通りのが合成されるわけでは
ないんでしょ？

821 ：灯台院生 ◆ipJni/6Rlw ：02/10/25 22:57

>>820
アニーリング温度はどこまで上げた？

822 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/25 23:37

すげえ、一連（笑）でスポット&PCRとは。
お疲れさん。
８連ぴぺったーくらい近所から借りてくれば良いのに。

823 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/25 23:39

>>820
real timeじゃなきゃちゃんとしたのが増えるのか？
もしそうならプライマーのせいにしないほうがいいんでない？

824 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/25 23:41

疎水性カラムにくっついた蛋白質がDWでもSDSでもエタノールでも
1割ほど取れないんです・・・
これってそのサンプルは疎水性カラムに向かないってことでしょうか？

825 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/25 23:42

やっぱしディファレンシャルスクリーニングむずかしいんじゃない？
俺はサブトラクションのあとに蛍光DDでスクリーニングしてるpaperならみたことある。

826 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/26 17:55

>>824

9割とれてるなら上々では?

827 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/27 12:44

824です
非特異的にくっついちゃっているのが１割いるのに
洗いかたがこれ以上わからなくて（涙
疎水性からむってなんかきまぐれ～（ってか私の腕がわるいのか！！）

828 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/27 16:09

>824
疎水性カラムは30%メタノールでも洗えるし（東ソー社員から直々に聞いた）
いざというときには1M NaOHでもOK（基材にトヨパール樹脂をつかっていれば・・・）
一度それで試してみれば？

829 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/27 16:11

824さん
30%メタノールはやったのですが効果なかったんです（涙
NaOHやってみました～今結果待ちですありがとうございました～

830 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/27 16:29

すみません（涙
上の書き込み824さんではなくて
824です
＞828さん
でした。

831 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/01 14:36

人生

832 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/01 21:36

サザンがうまくいっていません。バンドが検出されません。
ゲノム中に多糖類が多く含まれているとプローブが張り付きにくくなるってことはあるのですか。

833 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/01 21:45

>>832
あまり聞いたことない。
プローブの長さとか詳細書け。

834 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/01 22:21

ウェスタンでバックが高くでるのはウォッシュの時間が足りないからでしょうか？

835 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/01 22:32

>>834
使ってる一次抗体、検出用抗体などの性能が悪いか、濃度が濃すぎ。
ブロッキングしてるものの性能が悪い。
抗体とかの反応、膜の洗浄のときに、膜がかわいているとかも。

対照実験を組みましょう。

836 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/01 22:36

＞＞８３５
ありがとうございます
いままでうまくいってたのに、今やったらバックがガツーンと黒く出ました。
濃度たかすぎですかな？

837 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/01 22:40

>>832
多糖類ってことは植物？
ゲノムサイズがでかいとゲノムも大量にいるけど。
ゲノム100Mbで1ugくらいかな。ECLだと。
普通のサザンはちゃんとできてゲノミックだとできないってことか？

838 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/01 23:26

>>836
それは、使ってる溶液を作り間違えているか、
膜がかわいているかじゃないか？

839 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 01:50

制限酵素で切って入れたインサートが、プラスミド調製後その酵素で切れなく
なりました。こういうことってよくあるんですか？

840 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 01:56

はいってないのではなくて？

まあ俺もきれなくなった事あるけど。
コロニーPCRじゃ増えてくるのにな。
ベクターのサイズも増えてるし。
まあ気にせずやれよ。
はしっこ欠けてるんだろ

841 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 01:57

>>839
頭使ってるか？

842 ：839：02/11/02 02:07

インサートが入っているのは確認済みです
今、シーケンスをしているところです
なんで、端っこがかけるのですか？

843 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 02:13

最近841見たいな意味不明の煽りバカがおおいな

844 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 02:15

>>839
メチル化される配列になっちゃったとか。

845 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 02:15

>>844
それじゃ、ベクター調整もできねえだろ

846 ：839：02/11/02 02:24

タンパクが制限酵素の認識部位に付着しているから
切れないってことあるんですか？

847 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 02:26

プラスミドでしょ？
そんなの聞いた事ないけど。
どっから湧いてキタの？タンパクとか

848 ：839：02/11/02 02:31

指導教官から言われました
何かの本に書いてあったみたいです。

849 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 02:32

例えばXbaIは切れる時と運悪く切れない時があるが、どうしてか。
認識配列に続く配列によってはメチル化される時があるから。

こういう時、指導教官は１から１０まで教えるべきか（時間節約）、
それとも自分で考えさせるべきか。

850 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 02:32

まあとにかくシーケンスの結果を必ず報告する事

851 ：839：02/11/02 02:38

はい、シーケンスの結果を待ってみます

852 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 03:55

843みたいに自分はいけてると勘違いしてるヤシも多いような…

853 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 04:38

↑こういう奴ほんといい加減にウザイ

854 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 04:43

↑こういうﾔｼほんといい加減消えろ

855 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 06:55

そういえばミニプレして制限酵素で切ってインサート確認
なんて長いことやってないなー

端っこ欠けることもあるし
端っこに変なのがはさまることもあるし
XbaIはCTCAGAの次がTCだったらGATCになってdamの標的になるし

コロニーＰＣＲ，これ最強

XbaIの時にどうしても酵素で切る必要がある実験したいのなら
dam-のホストに入れ直しる

856 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 17:45

>>849
ｳｳ｡｡そんな発想出てこねー･･･｡

857 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/05 22:03

PFAなんかでfixした組織からreverse transcriptionに耐えられるような
qualityのmRNAってちゃんととれるの？
ん、fixするとRNaseは失活するのか？？
なぞは深まるばかりだ。
どなたかcome!

858 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/07 10:46

adenoのtiterがうまくあがらないよー．
ちょっと293にtoxicな感じはするけど
それでも同じように増やしたAd-GFPより
2けた低いとかなりがっくり．．．
どなたかよろしく御願いいたします．

859 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/07 10:57

>>858
坊やだからさ、、、と言ってみるテスト。

860 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/12 18:35

糖タンパクを染めるPAS染色をポリアクリルアミドゲルで行ったところ、
水で発色させるためにゲル乾燥中にバックグラウンドが
上がってしまいました。
反応を止める方法をご存じの方、よろしくお願いします。

861 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/12 18:43

http://yahooo.s2.x-beat.com/

862 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/12 22:52

863 ：_：02/11/12 22:52

お勧めです。
http://accessplus.jp/staff/in.cgi?id=3683

864 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/13 15:14

脂肪細胞をOil Redで染めているのですが、
脂肪滴の量が多くなってくるのに比例して、染まる脂肪滴の割合が減っていきます。
どうしてでしょうか？

何かコツがあれば教えてください。

865 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/13 22:46

PCR産物をシークエンスするときは
nestedプライマーつくらなきゃダメなんでしょうか？
いま、PCRの際につかったプライマーで読もうとしてるのですが
うまくいきません。

866 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/13 23:38

>>865
別に作らなくてもよめるけど、
プライマーが残ってたり、ノンスぺやプライマーダイマーが増えてると読めないときがある

nestを作る金があるならそれにこしたことはない

867 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/13 23:45

>>865
それからPCR産物のpurificationは、ゲル抽出よりもカラムをおすすめする
バンド一本のときは

868 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/14 00:37

便乗質問ですが、PCR産物のシークエンスをキャピラリー電気泳動シーケンサーで
行う場合も、プライマーやｄNTPｓは存在していたら×なのですか？

869 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/14 08:50

>868

割と読めるよ。最初の70塩基ぐらいは全く読めないけど。
だから短い産物だとあんま意味ないね。

ただバッファーの塩濃度がキャピラリーの場合はもろに
影響受けて読めなくなることあるのと、キャピラリーの寿命を縮めるのと
ときどき電極のところで火花が飛んだりして危ないので
せめてエタ沈ぐらいはしましょう。

870 ：bloom：02/11/14 08:51

http://homepage.mac.com/bloombloom/

871 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/15 10:47

>869
ありがとうございます

872 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/15 21:47

タバコの形質転換で、カルスになってシュートはでるのですが、
シュートから発根しません。アグロに感染させてないコントロール区域
のリーフディスクは白化しているので、カナマイシンは効いていると
思うのですが…。

873 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/15 21:59

カルスからシュート部分を切り出してMS培地に挿し木すればそのうち根がでてくる。

874 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/15 23:03

>>872
NAAとかIBAを含む培地に移植したらどうでしょう。

875 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/16 10:06

シュートを発根用培地にさすのと，茎頂をさすのでは発根率は断然違うものでしょうか

876 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/17 00:35

トランジエントに発現させようとプラスミドを導入したんだけど、
ぜーん発現しない。。。どうして？？
ｃDNAの３´側ににGFPをつけました。

877 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/17 00:36

そんだけじゃわかんね

878 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/17 06:06

植物野郎って孤独？

879 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/17 17:06

>876
ちなみに、cDNAのストップコドンは取ったよな。フレームあってるよな。
　ウエスタンでは、cDNA側の抗体でブロットしても検出できないんだよな。
そしたら、話をはじめよう

880 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/18 12:24

質問ですが、植物のゲノムを抽出してTEに溶解させて-30℃で長期保存はできるのでしょうか。
教えて下さい。

881 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 01:28

>>880
ゲノムは凍らせちゃいかん。

882 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 01:32

35Sより強いプロモーターって、どうよ？

883 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 01:34

どうよってなにが？
べつに35Sもそんなにどこでも強いわけじゃないだろ？

884 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 02:12

880

乾燥させちゃうのが一番長もち。

885 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 09:20

>842
漏れのも時々欠けるよ。ベクターに入れたのシーケンスすると
３’側が1/10～1/5位の割合で数塩基欠損したり、または変なのが挿入されてる。
⇒で作り直し。なにが原因だろ。

886 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 11:53

朝まで名無しさん：02/11/17 15:18 ID:SZWOdsw8

うちのじいちゃんは、
名字を真ん中から折って左右対象になるのは
在日に多いって言ってた。
後、簡単な漢字つけてるとも云っていますた

887 ：880：02/11/19 12:05

>>884
それはTEに溶かさずに乾燥させるのですか。
それともエタ沈など精製したあとに乾燥させるのですか。
教えて下さい。

888 ：1：02/11/19 14:49

ふと疑問に思ったんですが、
制限酵素量って普通templateのDNA量にあわせますよね。
そのtemplateのrestriction siteの数って関係あるんですかねえ？
たとえば、１カ所のsiteがあるDNAと１００カ所のsiteがあるDNAでは、
何倍くらいの酵素が必要となるんでしょう？？
酵素がDNAを切断する時間によるんでしょうが、
切断するのにかかる時間って全く無視できるようなもの？？　

889 ：888：02/11/19 14:52

↑名前間違え。
もちろん、１ではないです。

890 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 15:11

>>887
エタ沈したまんま保存するのがいいよ。
ゲノム乾燥させると次溶かす時1週間くらいかかるよ。
長期保存ってどんくらいよ？
おれはとりあえずTEにとかしたまま４℃で5年までなら保存したけど
大丈夫だったけど。

891 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 15:13

>>888
もうちょっとユニットについて勉強しろよ。
切る箇所が１００倍になれば、
同時間で切るには
もちろん必要ユニットは１００倍

892 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 15:32

>>891
そんな理屈はわかってると思いますよ。
単純にそう言えますかね？
分子の衝突を考えると、
同じDNA量でsite数が違えば
当然、enzymeがsiteに出会う確率も減りますよね。
あなたの理屈は、反応時間中絶えずenzymeはsiteに結合して、
切断し続けているという前提にたっていませんか？

893 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 15:40

なんなんだこいつは。
＞制限酵素量って普通templateのDNA量にあわせますよね。
＞そのtemplateのrestriction siteの数って関係あるんですかねえ？

この質問文で>>888が>>891の理屈を知らないのが分かるだろ？
一般的な質問に一般論で答えてるのにアホみたいに
知ったかぶりするなよ。バカ。

それからもっと本質的な問題として、
＞同じDNA量でsite数が違えば
＞当然、enzymeがsiteに出会う確率も減りますよね。

だから「同時間」で切るには１００倍って言ってんだけど。

894 ：結論：02/11/19 15:45

891＞892

895 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 15:48

http://www.aiailand.bz/?id=DMGeT4ijLA

896 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 15:57

>この質問文で>>888が>>891の理屈を知らないのが分かるだろ？
888=891なんですが、、

>だから「同時間」で切るには１００倍って言ってんだけど。
うーん、なんでわかんないんだろ。
site以外のDNAは全くfactorとして考えてませんか？

897 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 15:59

↑訂正
factorとして考えてませんよね？

898 ：888：02/11/19 16:03

でも、答えてくれてありがとう。
紙にでも書いてゆっくり考えて、
もし答えがわかったら教えてね。

899 ：891：02/11/19 16:16

意味がわかんねえぞ
俺そもそも888じゃねえし。

900 ：888：02/11/19 16:21

888=892ね

901 ：891：02/11/19 16:28

まあいい。バカは無視。荒れるから。
お前がじっくり考えろ。

902 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 19:47

どなたか知っていたら教えてください。
ウサギの血液から単球の調製をしています。ヒトではうまくいくのですが、
ウサギでは１／１０程度の数しかとれません。
ロスしないためのコツ等伝授していただけるとありがたいです。
かなりマニアックですが。。。

903 ：880：02/11/19 21:55

>>890
たびたびすいません。
エタ沈したまま保存とは、どういうことでしょうか。
70％EtOHでリンスしたあと、完全に乾燥させていないもののことでしょうか。

904 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/19 22:06

>>903
それでよし。
エタノール入りでも良いけど。

905 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 00:22

ベクター型は簡単で、安い。これはあまりに大きな長所だと思うが。

906 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 00:55

何の話だよ

907 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 01:03

ゲノムは、ＴＥに溶かせばかなり保存できるし、
エタノールの中でも安定だよ。
溶かす場合は、ゲノムの濃度が重要になってくる実験だと、
やっぱり溶解させてから一週間くらい経った方が安定した結果でるね。
ただ、完全に乾燥させちゃうと多少は切れるから、
その次に使う実験によってはお薦めできない。

>>901
切れるといえば、なんでこいつ一人で切れてんの？
小学生じゃあるまいし、無視するんなら黙ってしろよ。
昼間から研究室で誰にも相手にされなくて寂しいの？？

908 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 01:05

888必死だな（藁

909 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 01:24

>>905 >>906
RNAiってどうよ
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1010537291/l50
では？

910 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 04:14

mRNA in situ用のサンプルは-80 ℃でどれくらい保存可能でしょうか？
今年の６月にperfusion で固定回収したアダルトマウス脳なのですが、
何も出ません。アドバイスお願いします。

911 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 04:30

私はperfusion、ビブラトームしたセクションをそのままメタノールにつ
けて-20 ℃で保存、使う時にrehydrate します。今年の２月頃に回収し
たサンプルは今のところin situうまくいっております。ビブラトーム直
後のスライスを用いたin situ サンプルと比較しても遜色はありませ
ん。

912 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 07:19

私も似たような質問。
4% PFAでo/n固定したmouse Embryoなのですが、
OCTに包埋してー８０度に保存すれば半年以上は
もつとラボ内ではいわれていたのですが、
３ヶ月もしないうちに、
シグナルがメチャメチャ落ちてるみたいです。
切片にしたものは１ヶ月でもう差が有ります。
凍結組織、凍結切片後の組織は
どれくらいもつのでしょうか？

うちのフリーザーがやばいのかなあ？

913 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/23 18:55

PCRでcDNAから遺伝子をベクターにサブクローンしましたが、
ミニプレップを３クローンシークエンスしたら３クローンとも別々の部位に
point mutationが見事にはいってました。このようなケースでもっと
シークエンスするクローン数を増やして全長（3 kb) のmutationがないのがみつかるでしょうか
あるいはmutagenesisでmutationをおきかえた方がいいでしょうか？
ちなみに酵素はPfuを使ってますが、以前は3kbくらいのはmutationが入ってなか
たのですが。。

914 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/23 19:04

90kbpほどのベクターに断片をbluntしてサブクローニングしたいんですが、
断片が入ってくれません。Kitは何がお勧めですか？

915 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/25 00:04

大腸菌の成長曲線を描いている学部４年生です。
吸光光度計でＯＤ600で計測しているのですが、
培養開始３時間くらい、吸光度にして
ＯＤ600＝0.001～0.01くらいの間で、ひどく
誤差が出るんです。この手の実験に慣れている
方で、どなたか誤差の出ないような秘訣を
教えて頂けませんでしょうか。

916 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/25 00:35

>>915
誤差出ちゃうって、そりゃそうだろう。
ODで0.001なんてところを厳密に測るのは大変な話だが…。

そんなにきちっと測らなきゃいかんのか？

917 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/25 00:43

>915 分光器の仕様です。誤差が嫌なら薄めずに測るなり、濃縮-再懸濁
して測るなりして0.05～0.5 ODの間になるように調節しましょう。
つうか、3時間で0.01って育ちが悪くない？つうか、先輩に聞けば？

918 ：915：02/11/25 01:08

>>917
うちはゲノム系の研究室で、先輩に
詳しい方がいないので。
分光器の仕様でしたか。知らなかった。
ご教授有難うございます。

そうそう。育ちが悪いのは、増殖抑制に
関係した遺伝子を導入している為です。

919 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/26 22:03

>>913
cDNAにuniqueな制限酵素siteを探して、mutationの入っていないfragmentを
つなげるっていうのはどうでしょう？
私はKODを愛用していますが、3kくらいでしたらmutation無しでいけてます。
参考までに。

920 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/27 08:15

>>914
90kbpってコスミドとかYACでしょうか？
普通のプラスミドしか組んだことのない厨ですが、10k以上で入りづらいやつは、
・切り出すバンドにUVをあてない（1レーン余計に流して切って後染め）
・反応はスケールアップ（普段20ulを100ulに）、精製産物はエタ沈で濃縮
・コンピテントセルのヒートショック後、でかいチューブに移して数時間振騰培養
等でしのいでいます。
ライゲーションはNEBのT4 DNA ligaseを使っていますが、タカラのVer.2 kitで
うまく行っているとも聞きました。10xバッファーのATPがだめになりそうなので
分注しています。タカラのは酵素ごと凍っていたと思います。

921 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/27 09:32

>>917
はまさに厨房の答えだな

まず、90kbってのはベクターのながさだ。
そしてヒートショックではいるわけがない。
エレクトロポレーションに決まってる。ホストが大腸菌か酵母なら。

>>914がもう少し詳しくどうやってるか書かないと答えられない。

922 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/27 10:19

>915
とりあえずキュベットを洗剤につけおき洗いする。
キュベットホルダーの位置がまがってないか確認する。
光源が不安定の場合は交換する。

923 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/02 12:48

NADPHの減少速度で反応を追っているんですが、ストックソルーションを
on iceに置いておいても340nmの吸光度がどんどん下がっていってしまいます。
酸素か何かで酸化されてるんだと思うんですが、これを防ぐいい方法ありませんか？
使っているストックソルーション
250mM K2HPO4 pH6.6　1mM NADPH　2mM DTT
40μM Ac-CoA　200μM malonyl-CoA

924 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/02 13:39

>923
40μM Ac-CoA　200μM malonyl-CoA
ってsubstrateとして加えている？
それなら、これらをストックソルーションから除いておかないと
だめでしょう
250mM K2HPO4 pH6.6　1mM NADPH　2mM DTTがストックソルーションで
あとから40μM Ac-CoA　200μM malonyl-CoAを加える
25度じゃなくても反応は進むと思う

925 ：923：02/12/03 00:44

>924　ということはコントロールとるときでも吸光度の減少（0.15/ｈぐらい）は
避けようがないし、Ac-CoAとか脂肪酸合成の基質を入れてから測定にかける
時間も統一しないとだめって事なんですね。
お答えどうもありがとうございました。

926 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/03 02:23

こうすればライゲーションがズバズバ上手く逝くぜっていうコツは無いものですか。
どうにも自分のやり方に自信が持てない。

927 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/03 03:37

2チャンネルを止めることだな
他のうまくいかない大概の実験にも当てはまることだが
ここは実験のうまくいかないやつらの集まる板
ＤＱＮは感染する。

928 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/04 03:47

CATB法に関して教えてください

2*CTAB，クロロホルム/イソアミルアルコール入れた後，遠心の上澄み（A）に
クロロ/イソのかわりに1*CATBを入れたのですが，その後にクロロ／イソ入れたら
この後は通常のプロトコル通りでOKなのでしょうか？

（A）にクロロ／イソを入れた後、2800でなく8000rpmぐらいでまわしています
白いペレットや二層の境界面に白いもやもやがあるのですが
これはDNAでしょうか

929 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/04 07:47

↑転載
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1026312578/24

930 ：923,925：02/12/05 02:18

さて、やり直すか、と思って試薬調整し直したら
NADPHがすでにお亡くなりになっておられた模様。。
みなさん保存どうされてます？瓶の中に乾燥剤と一緒にいれて冷凍庫？

>>926 とりあえず、ライゲーションしまくる。
失敗したらやり直す。
50反応もやればコツが見えてくるんじゃない？
コツというよりか失敗したときに原因の見当がつくとか。
#この前全然うまくいかなかったけどATP入れ忘れたらしい。。

>>928 通常のプロトコルが何を意味しているのかわかりませんが、
http://www.shizuoka-c.ed.jp/nokyoken/noukyouken/1999/ken11-2.htm
を見るかぎりでは、isopropanol入れるとDNAが沈殿する、とありますが、
イソって、イソアミルアルコール？
あと、それってうまくいってないんですか？うまくいっていない点を書いていただけると
助かります。なにが助かるのかは聞かないで。。

931 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/05 09:49

イソアミルアルコールも知らないやつがいたのか！？

932 ：930：02/12/05 10:30

>931 いや、イソアミルアルコールもCTABも構造式は書けるんですが、
CTAB法はよく知らないもので。出過ぎたレスごめん>>928
CHCl3:IPA=2:1だと水が有機層に取られて水溶液から何か出てきてるの
かな？と思ったんです。

Molecular Cloningには高塩濃度CTABでDNAは溶けていて、これに
IPAかEtOHを加えると沈殿するとあったので、高塩濃度CTABで生じる
もやもやは別のものでは？

933 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/05 22:18

つうか普通にクロロホルム抽出とかフェノクロにはIAA入れるのが本来の方法でしょ？
わけわっからんな。君。
>>932のレスは無視だな。こりゃ。見当違いにもほどがある

で、中間層の白いのはタンパクとか脂質ですよ。
ちなみにゲノムがこれらに絡んでいるので、
水層をピペットとかで吸うと、引っ張られてあがってくるから注意ね

934 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/05 22:20

DNAではないので間違っても吸わないように汁！

935 ：植物系：02/12/05 23:58

>929
転載ありがとうございます

>929-934
ありがとうございます
>930
説明不足で申し訳ありません
CATBとクロロ/イソアミルを混ぜて遠心した後の澄んでる上澄みに
クロロ／イソアミルでなくCATBを入れてしまうと、濁ってしまうので
これがその後に悪影響を及ぼすのではないか？回避するとしたら
どのような方法があるのか？と思い質問させて頂きました

＞で、中間層の白いのはタンパクとか脂質ですよ。
ちなみにゲノムがこれらに絡んでいるので、
水層をピペットとかで吸うと、引っ張られてあがってくるから注意ね

上澄みの上のほうを擦ってもｺﾞｺﾞｺﾞと上がってくるのでいつも若干入ってしまいます

話は変わりますが、CATB/クロロイソアミルの上澄みは澄んだ茶色なのですが
これが濃いほどDNAがｲﾊﾟｰｲとかってあるのでしょうか？
（水浸状の培養植物だと茶色どころか薄い黄緑です）

936 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/06 00:08

> 上澄みの上のほうを擦ってもｺﾞｺﾞｺﾞと上がってくるのでいつも若干入ってしまいます

なるべく吸わないように太めの使い捨てスポイトで吸ってる人も居ますよ
まあ少々ならすっても平気でしょうけど
>
> 話は変わりますが、CATB/クロロイソアミルの上澄みは澄んだ茶色なのですが
> これが濃いほどDNAがｲﾊﾟｰｲとかってあるのでしょうか？
> （水浸状の培養植物だと茶色どころか薄い黄緑です）

濃いほど葉緑素が多いって事です。
だから薄い方がキレイだよ
まあ色が濃いってのは最初のサンプル量が多いから濃くなるんだろうから
濃いほどDNAがイパーイってのはあながち間違いではないけども、
あんまり良い事じゃないよ

937 ：植物系：02/12/07 00:46

>636 ありがとうございます

938 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/08 17:56

site-derected mutagenesis はじめました
ヒット率があまりに低いので困っています
5％ぐらいしかとれてきません
あとは元のままの配列です
どこが悪いのでしょうか

939 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 01:22

>938 ヒットしたものを取って終わりではないのでしょうか。
次回のヒット率を上げたいということでしょうか？

940 ：＞938：02/12/09 02:04

お互い逆向きになるよう設計して変異を入れたプライマー２つでプラスミドを一周するPCRをしろ
ついでにプライマー内部にサイレントミューテーションになるように上手く制限酵素サイトを
入れて制限酵素切断してからライゲーションすればOK

PCRのあとDpnI処理するのも忘れるな。

941 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 02:37

>>938
http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/olul/upld59/technical/kodplus59tr01.pdf
増えなかった…
KODplusを買えと言うことか？

942 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 11:48

943 ：wildtype：02/12/09 21:34

すみません、突然ですが、教えて欲しいことがあります
SDS-PAGEでバッファにグリシンが入ってるのは何故ですか？
さらにBlotするときのバッファにメタノールが入っているのは
何故なんでしょう？

というかこういう疑問はどこで
解決すればいいんでしょうか・・・

944 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 22:29

＞９４３
君は４年生？
まずは人に聞く前に調べるってことを覚えなさい。
こんなことが本に載ってないなんて言わせないよ。
ちなみにSDS-PAGEのバッファーってTris-Glyだよね？
今時リン酸系なんてないかな・・。
まずTrisとSDSだけ溶かしてpHをはかってごらん。そんでGlyいれてから
またpHはかってごらん。それで答えがわかるよ。
もう一つはメタノール入れないでぶろっとしてみればわかると思うよ。
ちなみにPVDFって何の略だい？
単に言葉だけ覚えても意味無いからね。
最近そういう輩がおおいよ。Ph Dでも痛いのがいるからな。
君はそうならないように精進しなさい。

945 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 22:30

http://science.2ch.net/test/read.cgi/future/1022864257/l50

瞬間移動ついに実現か。　MIT教授ら
M.Minsky（原子核物理）、N.Simon（金属物性）
両教授は６日、パラジウム金属の超微細な粒子に重水素ガスを取り込ませてレーザー光線を当てる新方式で、
物質の空間転移を確認した、と発表した。
空間転移に必須とされる超高圧の状態以外でも実現できたことで、大規模装置の必要のない空間転移などの可能性があるという。
　空間転移反応を起こすには、重水素などの原子と原子を接触させることが条件。
両教授によると、パラジウムとジルコニウムの合金を焼き、直径５・メートル（ナノは１０億分の１）の範囲に
パラジウム原子約８０００個が格子状に集まった超微細粒子を作った。
この超微細粒子に重水素ガスを吸わせると、パラジウム原子１個に対し、通常は１個未満しか取り込まれない
重水素が約３個取り込まれ、凝集。
さらに溶接に使うレーザー光を当てると空間転移が起こり、仕切りで区切った別の箱に原子数百個が転移した、という。

　山下慶太・名誉教授（原子核物理学）の話　この手法は優れており、世界でも例がない。
空間転移反応は、常識をくつがえすもので、今後の関連の研究に期待したい。　

946 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 22:32

＞９３８
もとのままのが多いってことはおそらくはDpn Iが効いてないんだろうな。
でもあたりがとれてるんなら別にいいじゃないかと思うが。
１００％にしたい？

947 ：wildtype：02/12/09 23:18

＞９４４
すみません、ご意見ありがとうございます。
僕の言い方が悪かったのですが、
メタノールやグリシンじゃないと駄目なのか、
他の物質じゃ代えが効かないのか、ということを聞きたかったんです。
まぁ基本的に調査不足ですね。精進します。

948 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 00:02

超遠心でgDNAを精製しました
溶媒はTE-塩化セシウムです

DNAを取り、いろいろ処理をして、下層の溶液+2倍量TE+さらにその2.5倍の100％エタノール
で-80℃30分以上しました

その後にすぐに遠心（80分）しました
そしてペレットを70％エタノールでリンスして遠心して（15分）白いペレットを得ました

遠心の温度は4度でした

白いペレットを見てふと思ったのですが
-80度から4℃遠心の間に溶液を溶かして、塩化セシウムが析出するのを確認して
それを溶かしてから遠心する、という処理が必要だったのではないか？
このペレットには塩化セシウムがかなりあって、それで白いのでは？

皆様のご意見を聞かせて頂けないでしょうか

949 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 01:01

そうですね
そうおもいますよ

950 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 06:37

禿同
だからセシウム振ったあとは，一般的には透析でＤＮＡをとります
透析しないでエタ沈したら，重たいセシウムのジャリジャリの上に
へなへな～っとＤＮＡが乗っているので，吸い取って捨ててしまいやすい
セシウムジャリジャリになったら７エタではセシウムを除去しきれません
いったん適当な量の水に再溶解してエタ沈をやり直すとよい
ただしとれてくるＤＮＡはセシウム塩と思われ
酵素反応大丈夫か？

951 ：938：02/12/10 06:50

>>940
ありがとうございました
逆向きプライマーでPCRですね
やってみます
ただしターゲットはコーディング領域でないので制限酵素サイトの導入は難しい
とにかく4^3-1=63とおりのミュータントがほしいんで，ヒット率を上げないと大変です（-1というのは野生型です）
>>940,946
DpnI処理についてもう少し聞いてもいいですか？
DpnIてGATCをブラントで切る制限酵素のこと？
だとするとプラスミドがぶちぶちに切れませんか？

952 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 08:14

Dpn1 はメチル化されたDNAを切るのでPCR産物は切らない

953 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 08:35

>943=947=wildtype
>メタノールやグリシンじゃないと駄目なのか、
>他の物質じゃ代えが効かないのか、ということを聞きたかったんです。

まだ読んでるか？　確かに943の質問の仕方では、「まず自分で調べろｺﾞﾙｧ」と
言われても仕方ない。だが、盲目的にプロトコルに従う実験馬鹿が多い中、代替品
の可能性を考察する態度が個人的に気に入った。本で調べる上でのヒントをあげよう。

まず、ブロッティングバッファにメタノールを入れる理由は割と簡単だ。
適当なプロトコル本を手当たり次第に読め。
それに対して、グリシンを入れる理由は、ちょっとてこずるかもしれんぞ。
普通のプロトコル本や生化学の教科書には載ってないと思う。
図書館に行って、電気泳動に関する専門書をひもとくべし。

俺もあくまで又聞きなので間違っているかもしれないが、俺が知るところでは、
本来グリシンはその効果が予想されていたものではなかった。つまり、「理由は
分からないけど、入れてみたらSDS-PAGEがうまくいっちゃった！」ということ。
その辺のエピソードはどうも眉つばなんだけどね、グリシンは入れると良いことが
おきる、というのが経験的にまず知られていて、理論的根拠は後付けらしいんだよ。

ところでついでに>>944、お前さん、SDS-PAGE bufferにグリシンを入れる「本当の」
理由、もしかして勘違いしてないか？
>まずTrisとSDSだけ溶かしてpHをはかってごらん。そんでGlyいれてから
>またpHはかってごらん。それで答えがわかるよ。
ここだけ読むと、まるでグリシンはTrisをバッファライズするためだけに入れてると
思っているように読めるんだが・・・大丈夫か？

954 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 08:39

キミこそ大丈夫か?

955 ：953：02/12/10 08:46

954は944なのか？気に障ったならあやまるが。
しかし、グリシンの電気泳動時に果たす役割を考えると、単に
pHを計るだけでその存在意義が判るとは思えないんだがね。

956 ：948：02/12/10 10:27

ありがとうございました
もっかいTEと100％エタノール入れて-80℃に入れてみます

957 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 12:44

メタノール入れ忘れたままブロットしたが、特に変なことは起こらなかった。なんのために入れるのか漏れもわからん。

958 ：wildtype：02/12/10 15:04

＞９５３、９５７
レスありがとうございます。
やっぱり経験則って部分が大きいんですかね・・
調査してみます。

959 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 15:23

経験則の部分をいかにして根拠があるように見せるかが査読論文をうまく書くコツかも。