▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼
932 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/16 04:42
>>929
まずラベルしないで普通に使ってみた？
抗体、市販品で無い場合は乾燥状態にする過程で
力価がさがってることがある。
それから抗体の認識部位に活性基のＣ等がある場合、
力価の低下が予想される。
まずラベルしないで普通に使ってみた？
抗体、市販品で無い場合は乾燥状態にする過程で
力価がさがってることがある。
それから抗体の認識部位に活性基のＣ等がある場合、
力価の低下が予想される。
933 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/16 09:38
>>925 立体障害？ cccとocで切れ方が違うのは、酵素によってhelicityの好き嫌いがあるからだが。
934 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/16 19:20
>>920
移動度は
閉環状(cc(c))＞開環状(oc)＞線状(linear)
の順。
cccが切れないのは酵素が立体障害でアクセス不能なため。
したがって酵素処理前にある程度ほどく操作が必要。
ほどくためには
移動度は
閉環状(cc(c))＞開環状(oc)＞線状(linear)
の順。
cccが切れないのは酵素が立体障害でアクセス不能なため。
したがって酵素処理前にある程度ほどく操作が必要。
ほどくためには
935 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/16 22:30
日 韓 断 交 ！
平成13年3月31日に、『２０１５年までに 日韓断交を実現する会』を結成いたしますた。
【宣言文】韓国が嫌いな日本人の皆さん
日本が嫌いな韓国人の皆さん 我々と協力し是非
２０１５年までに日韓断交を実現しませんか?
お互い望むところです。
【入会方法】
入会手続きは簡単。
トリップを付けて、「入会します」と書き込むだけ。
是非、これを機会に御入会を！
【名簿や資料、リンク集など】
『２０１５年までに日韓断交を実現する会』NAVER JAPAN支部電子渉外局 ＮＪ観測室
http://f15.aaacafe.ne.jp/~book/
http://www.geocities.co.jp/WallStreet-Stock/4433/
韓国 旅行要注意ーレイプーhttp://antiko.fc2web.com/
かえれ！竹島http://ime.st/www.perverts.nl/files/headfuck.mpeg
平成13年3月31日に、『２０１５年までに 日韓断交を実現する会』を結成いたしますた。
【宣言文】韓国が嫌いな日本人の皆さん
日本が嫌いな韓国人の皆さん 我々と協力し是非
２０１５年までに日韓断交を実現しませんか?
お互い望むところです。
【入会方法】
入会手続きは簡単。
トリップを付けて、「入会します」と書き込むだけ。
是非、これを機会に御入会を！
【名簿や資料、リンク集など】
『２０１５年までに日韓断交を実現する会』NAVER JAPAN支部電子渉外局 ＮＪ観測室
http://f15.aaacafe.ne.jp/~book/
http://www.geocities.co.jp/WallStreet-Stock/4433/
韓国 旅行要注意ーレイプーhttp://antiko.fc2web.com/
かえれ！竹島http://ime.st/www.perverts.nl/files/headfuck.mpeg
936 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/17 00:44
ほどくためには日韓断交か。
937 ：919：04/01/17 10:20
>>934
ありがとうございます。
酵素で切れない件ですが、試した三種の酵素はそれぞれ
プラスミド（挿入含み）中でまったく別の物理的部位（結果的に
最も好ましくはマップ上で相互に１２０度離れています）に一箇所だけ
制限部位を持つものです。
そういうものを意図的に選びました。
cccDNAをほどくにはどうすればよいでしょうか。
ありがとうございます。
酵素で切れない件ですが、試した三種の酵素はそれぞれ
プラスミド（挿入含み）中でまったく別の物理的部位（結果的に
最も好ましくはマップ上で相互に１２０度離れています）に一箇所だけ
制限部位を持つものです。
そういうものを意図的に選びました。
cccDNAをほどくにはどうすればよいでしょうか。
938 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/17 21:30
cccDNAって電気泳動でどこに出てるの？
939 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/18 12:07
>>934 立体障害って、一体DNAをカチカチの棒か何かと勘違いしてないか？cccが切れにくかったり、逆にocが切れにくかったりするのは、螺旋のピッチの差に敏感な酵素があるからだよ。
940 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/18 16:22
ものすごく基本的なことで申し訳ないのですが、
ＦＢＳに含まれるエストロゲンってどの程度なんでしょうか。
例えば、basal mediumがフェノールレッドの入っていないものの場合、
１０％ＦＢＳに含まれるＥ２は、10^-8M程度のエストロゲンと比べて
何倍、もしくは何分の一程度であると推測されるのでしょうか。
もちろん、ロットなどによって全く異なると思いますが、
目安として、ということです。
ＦＢＳに含まれるエストロゲンってどの程度なんでしょうか。
例えば、basal mediumがフェノールレッドの入っていないものの場合、
１０％ＦＢＳに含まれるＥ２は、10^-8M程度のエストロゲンと比べて
何倍、もしくは何分の一程度であると推測されるのでしょうか。
もちろん、ロットなどによって全く異なると思いますが、
目安として、ということです。
941 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/19 00:22
>>940
E2依存的に発現する遺伝子のプロモーター領域にluciferase
を繋いだコンストラクトを細胞にtransfectionし、
既知の濃度のE2を加えた時と、FBSを加えた時とで活性を比較する。
とかやってみたらいかが？
FBSはいろいろ入ってるからダメか？
E2依存的に発現する遺伝子のプロモーター領域にluciferase
を繋いだコンストラクトを細胞にtransfectionし、
既知の濃度のE2を加えた時と、FBSを加えた時とで活性を比較する。
とかやってみたらいかが？
FBSはいろいろ入ってるからダメか？
942 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/19 14:17
TAクローニングが上手くいかない…
コロニー生えたと思っても、コロピーすると目的遺伝子が入ってない。
やっぱヒートブロックないのがいけないのかなあ？
それともベクターやコンピの扱いがいかんのか…？
はやくシークエンスしたいよ…
愚痴なのでsage
コロニー生えたと思っても、コロピーすると目的遺伝子が入ってない。
やっぱヒートブロックないのがいけないのかなあ？
それともベクターやコンピの扱いがいかんのか…？
はやくシークエンスしたいよ…
愚痴なのでsage
943 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/19 17:02
ファージをー20度で保存しちゃったけど、
プレートに撒いても生きてる？
プレートに撒いても生きてる？
944 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/19 21:31
945 ：940：04/01/19 23:40
946 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/19 23:41
何のファージでどういう組成のバッファーに溶けてましたか？
947 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 01:05
λ、SM
948 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 01:32
数パーセントくらいに下がってると思う。増やしたクローンなら問題なし。ライブラリーならお気の毒。
949 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 09:34
944 ：名無しゲノムのクローンさん ：04/01/19 21:31
>>942
そんな物posicon置けよ。一発で分かるじゃん。
統べてコントロールとっても分からない事があった気がする、、、、。
TAクローニングじゃなく、ただのうつしかえで、、、、、。なんでだろうね？
>>942
そんな物posicon置けよ。一発で分かるじゃん。
統べてコントロールとっても分からない事があった気がする、、、、。
TAクローニングじゃなく、ただのうつしかえで、、、、、。なんでだろうね？
950 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 10:33
TAべくたーを凍結融解するとてきめんにセルフらいげーしょんがでる
951 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 19:24
TAに限らずワンカットのベクターは
購入（調製）したらすぐに小分けして
当座の分以外は-80℃
購入（調製）したらすぐに小分けして
当座の分以外は-80℃
952 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 20:08
そんなに分解されます？短期間で。
953 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 20:34
よくよめ。そういういみではない。
954 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 22:18
セルフが起きるって事？？
955 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 22:55
956 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 23:06
TAは知らんけど、EcoRIもHindIIIもBamHIも５年前に調製したものをｰ20℃で保存して使ってるけど、気になるほどの劣化は認められません。>>951さんは何か勘違いをなさっているのではないでしょうか。
957 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/21 10:12
>>951
確かに、解凍を繰返すのはよくないですよね。どのレベルの実験環境（材料）を維持して
やっていくかの違いだけだと思いますが。おきそうなトラブルを減らしていく
事は、大事ですからね。
>>855,956
上記に海田阿戸でなんですが、私もお二方と同じで取り分け問題を感じた事はないです。
確かに、解凍を繰返すのはよくないですよね。どのレベルの実験環境（材料）を維持して
やっていくかの違いだけだと思いますが。おきそうなトラブルを減らしていく
事は、大事ですからね。
>>855,956
上記に海田阿戸でなんですが、私もお二方と同じで取り分け問題を感じた事はないです。
958 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 02:22
959 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 03:38
HPLCのカラムがおかしい。だれがやらかした。
960 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 12:08
>>955や>>956はスルーってことですか？正面から反論してるんだから、
何か一言コメントがあって然るべきかと思うんですけど。
んっ？何か気に触っていたら済みません。
＞私もお二方と同じで取り分け問題を感じた事はないです。
と書きましたが、この書き込みで何か気に触りましたでしょうか？
何か一言コメントがあって然るべきかと思うんですけど。
んっ？何か気に触っていたら済みません。
＞私もお二方と同じで取り分け問題を感じた事はないです。
と書きましたが、この書き込みで何か気に触りましたでしょうか？
961 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 17:08
1.vec. only（ゲル精製了。以下これを使っている）
2.EcoRI処理vec.→ライゲーションせず
3.EcoRI処理vec.→ライゲーション
4.EcoRI処理vec.+導入断片（EcoRI処理済み1.5kbp）→ライゲーション
コロニーが出るのは1と3のみ。4は1：1,4,10,20と導入断片比を変えている
本EcoRIを使った他の組み替えは、問題なく可能。
すべて断片は、single cutのvec.でさえ、ゲルで精製。
組み替えができない原因は何ですか？
2.EcoRI処理vec.→ライゲーションせず
3.EcoRI処理vec.→ライゲーション
4.EcoRI処理vec.+導入断片（EcoRI処理済み1.5kbp）→ライゲーション
コロニーが出るのは1と3のみ。4は1：1,4,10,20と導入断片比を変えている
本EcoRIを使った他の組み替えは、問題なく可能。
すべて断片は、single cutのvec.でさえ、ゲルで精製。
組み替えができない原因は何ですか？
962 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 18:34
カットしたベクターをゲル精製する必要は無い。
963 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 21:03
>>961
dephosphorylationはしてないの？
ま、それは関係ないとして、
理論的に考えてインサートが悪さしてると結論づけられるね。
>>962
まあ必要ないけどバックグランドは下がるよ。
dephosphorylationはしてないの？
ま、それは関係ないとして、
理論的に考えてインサートが悪さしてると結論づけられるね。
>>962
まあ必要ないけどバックグランドは下がるよ。
964 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 21:23
>>962.963
レスどうもです。
＞カットしたベクターをゲル精製する必要は無い
100も1000も承知ですが、うまくいかなかったので、仕方がなくcut後
精製したまでです。通常はしません。
インサートは、TAcloning後別のfusionベクターに組み換えたものを更に別なベクタへ
移し替えをしようとした時にうまく入れ替えできませんでした。
要するに、うまくいかないベクターとの相性と言う事なのですか？
＞dephosphorylationはしてないの？
勿論dephosphorylationしたものもしています。結果は同じですけど。
レスどうもです。
＞カットしたベクターをゲル精製する必要は無い
100も1000も承知ですが、うまくいかなかったので、仕方がなくcut後
精製したまでです。通常はしません。
インサートは、TAcloning後別のfusionベクターに組み換えたものを更に別なベクタへ
移し替えをしようとした時にうまく入れ替えできませんでした。
要するに、うまくいかないベクターとの相性と言う事なのですか？
＞dephosphorylationはしてないの？
勿論dephosphorylationしたものもしています。結果は同じですけど。
965 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/23 01:53
結果は同じですか。
966 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/23 09:17
>>965
＞勿論dephosphorylationしたものもしています。結果は同じですけど。
のことについてのレスだと思いますが、言葉が足りませんね。
通常、vec. single cutはフェノクロ-エタチン後にdephosphorylation。
その後に、insertionとligationで大腸菌へ。
うまくコロニーがでなかったので961のようにしました。
勿論、コロニーがでない事には変わりはありません。
＞理論的に考えてインサートが悪さしてると結論づけられるね。
たまに聞く話ですが、実際インサートが悪さして組み替えできなかった例って
皆さんもあるのですか？ほぼ似たベクターには入るのに入らないとか？
絶大なる経験者の方、誰か良きアドバイスをください！
＞勿論dephosphorylationしたものもしています。結果は同じですけど。
のことについてのレスだと思いますが、言葉が足りませんね。
通常、vec. single cutはフェノクロ-エタチン後にdephosphorylation。
その後に、insertionとligationで大腸菌へ。
うまくコロニーがでなかったので961のようにしました。
勿論、コロニーがでない事には変わりはありません。
＞理論的に考えてインサートが悪さしてると結論づけられるね。
たまに聞く話ですが、実際インサートが悪さして組み替えできなかった例って
皆さんもあるのですか？ほぼ似たベクターには入るのに入らないとか？
絶大なる経験者の方、誰か良きアドバイスをください！
967 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/23 13:16
伝説の短波長UVイルミネータを使ってるとか。
968 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/23 13:41
969 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 04:17
EcoRIサイト（か周辺）に重要な遺伝子とか無いですよね、まさか。
970 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 04:30
ゲル精製した後エタ沈してるとか
971 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 13:13
>>969
＞EcoRIサイト（か周辺）に重要な遺伝子とか無いですよね、まさか。
すみません。どう言う事だかイマイチ正確に把握できませんので推測でレス
します。EcoRIで切る事で、転写、もしくはプラスミドの複製に影響を与え
る領域が欠損叉はその領域にinssrtionが導入されると言った事は無いです
>>970
＞ゲル精製した後エタ沈してるとか
これもよく分からなかったのですが、ゲル精製後はそのまま使っています。
エタチンするとよく無い事が起きるのでしょうか？個人的に、ゲル精製した
後に、その溶液をエタチンして再度滅菌水で溶解して使っても問題が無い気
がしますが
＞EcoRIサイト（か周辺）に重要な遺伝子とか無いですよね、まさか。
すみません。どう言う事だかイマイチ正確に把握できませんので推測でレス
します。EcoRIで切る事で、転写、もしくはプラスミドの複製に影響を与え
る領域が欠損叉はその領域にinssrtionが導入されると言った事は無いです
>>970
＞ゲル精製した後エタ沈してるとか
これもよく分からなかったのですが、ゲル精製後はそのまま使っています。
エタチンするとよく無い事が起きるのでしょうか？個人的に、ゲル精製した
後に、その溶液をエタチンして再度滅菌水で溶解して使っても問題が無い気
がしますが
972 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 13:27
ligationがいっていないのか、ligationがいったのちに
できたベクターがtoxicになっているのか、そもそも
遺伝子の耐性とかをまちがえているのか。
できたベクターがtoxicになっているのか、そもそも
遺伝子の耐性とかをまちがえているのか。
973 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 14:40
>>972
今一度添付します
1.vec. only（ゲル精製了。以下これを使っている）
2.EcoRI処理vec.→ライゲーションせず
3.EcoRI処理vec.→ライゲーション
4.EcoRI処理vec.+導入断片（EcoRI処理済み1.5kbp）→ライゲーション
コロニーが出るのは1と3のみ。4は1：1,4,10,20と導入断片比を変えている
本EcoRIを使った他の組み替えは、問題なく可能。
添付してありますように、これを見ていただだければ、
＞そもそも遺伝子の耐性とかをまちがえているのか。
と言う事は、無いと思います。
また、ligaseも問題ないと思います。
問題は
＞ligationがいったのちにできたベクターがtoxicになっているのか、
と言う点ですが、たのベクターではサブクローニングできています。
たまたま、今回使おうと考えているベクターに入れる事で、毒性が発揮される
そんな事があるのでしょうか？ちなみに、極標準的な、論文でも多用されている
ベクターへの組み替えです。
今一度添付します
1.vec. only（ゲル精製了。以下これを使っている）
2.EcoRI処理vec.→ライゲーションせず
3.EcoRI処理vec.→ライゲーション
4.EcoRI処理vec.+導入断片（EcoRI処理済み1.5kbp）→ライゲーション
コロニーが出るのは1と3のみ。4は1：1,4,10,20と導入断片比を変えている
本EcoRIを使った他の組み替えは、問題なく可能。
添付してありますように、これを見ていただだければ、
＞そもそも遺伝子の耐性とかをまちがえているのか。
と言う事は、無いと思います。
また、ligaseも問題ないと思います。
問題は
＞ligationがいったのちにできたベクターがtoxicになっているのか、
と言う点ですが、たのベクターではサブクローニングできています。
たまたま、今回使おうと考えているベクターに入れる事で、毒性が発揮される
そんな事があるのでしょうか？ちなみに、極標準的な、論文でも多用されている
ベクターへの組み替えです。
974 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 15:37
insertのなかの遺伝子がプロモータ付きでたまたま
発現してしまい、そうなったplasmidをもつコロニーが
生えてこない（または生育が異常に遅くコロニーが
でていないようにみえる）ということは稀にあります。
対処法としてトラホメ後のプレートをLB1%Glcにするとか
逆に最小培地プレートにして25度でプレートをとるとか
というおまじないがあります
おまじないなので、常に効くとは限りませんが。
発現してしまい、そうなったplasmidをもつコロニーが
生えてこない（または生育が異常に遅くコロニーが
でていないようにみえる）ということは稀にあります。
対処法としてトラホメ後のプレートをLB1%Glcにするとか
逆に最小培地プレートにして25度でプレートをとるとか
というおまじないがあります
おまじないなので、常に効くとは限りませんが。
975 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 15:59
>>974
レスありがとうございます！
＞insertのなかの遺伝子がプロモータ付きでたまたま発現してしまい
たまたまと言うのがみそなんでしょうか？他の類似のベクターでは発現しない
けど、この組み合わせがよく無いってことなんでしょうね？
promoter regionが入っていたのかな〜、、、、、。cDNAがpromoterとして
働くって言うものがたまにありますが、どうなんでしょうか？
結構これだと、色々都合が易い事があるんですよね。このmRNAを転写する
promoter regionには、いわゆる普通の転写因子結合領域が無くて未だに
転写寄稿が不明なのです、、、、。色々考えてみる価値はあるかな？
>LB1%Glcにする
そうですね。これはやっていないので、試してみようと思っていました。
やってみます。supressionかかればいいけど。と言うか、基本的にmRNAチェック
してませんから、いい加減な事言わない方がいいですね（w
レスありがとうございます！
＞insertのなかの遺伝子がプロモータ付きでたまたま発現してしまい
たまたまと言うのがみそなんでしょうか？他の類似のベクターでは発現しない
けど、この組み合わせがよく無いってことなんでしょうね？
promoter regionが入っていたのかな〜、、、、、。cDNAがpromoterとして
働くって言うものがたまにありますが、どうなんでしょうか？
結構これだと、色々都合が易い事があるんですよね。このmRNAを転写する
promoter regionには、いわゆる普通の転写因子結合領域が無くて未だに
転写寄稿が不明なのです、、、、。色々考えてみる価値はあるかな？
>LB1%Glcにする
そうですね。これはやっていないので、試してみようと思っていました。
やってみます。supressionかかればいいけど。と言うか、基本的にmRNAチェック
してませんから、いい加減な事言わない方がいいですね（w
976 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 16:00
訂正
誤：cDNAがpromoterとして
正：mRNA自身がpromoterとして
誤：cDNAがpromoterとして
正：mRNA自身がpromoterとして
977 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 18:35
>> 973
とりあえず、insert が ligation しているかどうかを調べれば、
何かわかるのでないでしょうか？
insert 量がそこそそあれば電気泳導して insert が ligation したか
どうかはどうかは確認することができまするぞ。
とりあえず、insert が ligation しているかどうかを調べれば、
何かわかるのでないでしょうか？
insert 量がそこそそあれば電気泳導して insert が ligation したか
どうかはどうかは確認することができまするぞ。
978 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 18:48
>>977
おっしゃられる通りです。
実際、実行しています。ですが、本来導入すべくinsertどうしでしていません。
insertと別のfragmentどうしです。ligationされていました。
fragment同志でしたので、ligationは10度でo/nでしていますけど、、、。
やはり、本来のinsert同志でやってみた方が良いのでしょうか？
おっしゃられる通りです。
実際、実行しています。ですが、本来導入すべくinsertどうしでしていません。
insertと別のfragmentどうしです。ligationされていました。
fragment同志でしたので、ligationは10度でo/nでしていますけど、、、。
やはり、本来のinsert同志でやってみた方が良いのでしょうか？
979 ：977：04/01/24 22:47
>>978
やってみた方がよろしいかと思います。
私も他の vector だったら簡単に ligate するのに
何故か 自分が使用したい vector とはligation しないということがかってありました。vector の相性が悪いと全然 ligation しないようです。
私は、極力ゲル精製をしない、そしてゲル精製する際には、クリスタルバイオレットを使用して UV をあてないということで解決しました。
ちなみに、ligase は TOYOBO の ligation high が他の会社のものよりくっつきやすいみたいです。←別に TOYOBO のまわしものではないです。私が実際にやった際には他の会社ではくっつかなかったけどくっついたというだけのことです。
やってみた方がよろしいかと思います。
私も他の vector だったら簡単に ligate するのに
何故か 自分が使用したい vector とはligation しないということがかってありました。vector の相性が悪いと全然 ligation しないようです。
私は、極力ゲル精製をしない、そしてゲル精製する際には、クリスタルバイオレットを使用して UV をあてないということで解決しました。
ちなみに、ligase は TOYOBO の ligation high が他の会社のものよりくっつきやすいみたいです。←別に TOYOBO のまわしものではないです。私が実際にやった際には他の会社ではくっつかなかったけどくっついたというだけのことです。
980 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/25 10:32
ベクターを代えるとサブクローニングできないことは良くあります。それほど
でなくても、one cutのベクターにサブクローニングしてもインサートが片方
向のものしか取れない（あるいは反対方向はきわめて増殖が悪い）ということ
は経験されたことがあるのではないかと思います。今のベクターを使いたいの
であれば、考えられる解決策は、上にあったようにGlc入りの培地を使う、形
質転換後の培養を30℃で行う、StratageneのABLE competent cellを使うなど
が考えられます。後者２つはいずれもプラスミドのコピー数を落とそうという
工夫です。
でなくても、one cutのベクターにサブクローニングしてもインサートが片方
向のものしか取れない（あるいは反対方向はきわめて増殖が悪い）ということ
は経験されたことがあるのではないかと思います。今のベクターを使いたいの
であれば、考えられる解決策は、上にあったようにGlc入りの培地を使う、形
質転換後の培養を30℃で行う、StratageneのABLE competent cellを使うなど
が考えられます。後者２つはいずれもプラスミドのコピー数を落とそうという
工夫です。
981 ：名無しゲノムのクローンさん：
>>977
＞私も他の vector だったら簡単に ligate するのに
＞何故か 自分が使用したい vector とはligation しない
皆さんも苦労しているのですね、、、。クローニングって、
もはやルーチンワークで”誰でもできる”見たいな風潮
があるので、他の組み換えは問題なくできるのに、one cut
の組み換えでつまずくと結構凹みますね、、、、、
＞ligase は TOYOBO の ligation high が他の会社のもの
＞よりくっつきやすいみたいです
以前はtakaraのligation hightを使っていましたが、今は
TOYOBO の ligation highを使っています。安いからと言
う、理由なんですけど（苦笑）
>>980
＞one cutのベクターにサブクローニングしてもインサートが片方
＞向のものしか取れない（あるいは反対方向はきわめて増殖が悪い）ということ
＞は経験されたことがあるのではないかと思います。
これは確かにありますね。確率では、正逆等比で出てきてもおかしくないのに
実際は偏りがある事が多いです。
＞上にあったようにGlc入りの培地を使う、形 質転換後の培養を30℃
＞で行う、StratageneのABLE competent cellを使う
取りあえず前者2つはすぐにでも実行に移せれるので、やってみます。
本当に多くの方に御指示頂き、ありがとうございます！
＞私も他の vector だったら簡単に ligate するのに
＞何故か 自分が使用したい vector とはligation しない
皆さんも苦労しているのですね、、、。クローニングって、
もはやルーチンワークで”誰でもできる”見たいな風潮
があるので、他の組み換えは問題なくできるのに、one cut
の組み換えでつまずくと結構凹みますね、、、、、
＞ligase は TOYOBO の ligation high が他の会社のもの
＞よりくっつきやすいみたいです
以前はtakaraのligation hightを使っていましたが、今は
TOYOBO の ligation highを使っています。安いからと言
う、理由なんですけど（苦笑）
>>980
＞one cutのベクターにサブクローニングしてもインサートが片方
＞向のものしか取れない（あるいは反対方向はきわめて増殖が悪い）ということ
＞は経験されたことがあるのではないかと思います。
これは確かにありますね。確率では、正逆等比で出てきてもおかしくないのに
実際は偏りがある事が多いです。
＞上にあったようにGlc入りの培地を使う、形 質転換後の培養を30℃
＞で行う、StratageneのABLE competent cellを使う
取りあえず前者2つはすぐにでも実行に移せれるので、やってみます。
本当に多くの方に御指示頂き、ありがとうございます！