いま実験でうまくいかないことｽﾚｯﾄﾞ
883 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/04 18:57
>>880
タグくっつけてプルダウンにしとけって。
そっちの方がずっと楽だよ。
2次スクリーニング、まともにIPなんぞでやってたら大変じゃ。
検出をWB以外でやるならまだマシだけどさ。
あとね、ハイブリドーマの大量培養の方がたくさん取れるよ。
時間かかるけどね（免疫から始めて４−６ヶ月）。
タグくっつけてプルダウンにしとけって。
そっちの方がずっと楽だよ。
2次スクリーニング、まともにIPなんぞでやってたら大変じゃ。
検出をWB以外でやるならまだマシだけどさ。
あとね、ハイブリドーマの大量培養の方がたくさん取れるよ。
時間かかるけどね（免疫から始めて４−６ヶ月）。
884 ：ゾネ：01/12/05 21:33
Macで NIHImageを使って、DNAドットブロッティングの発光量をデジタル化
（定量化）したいんですけど。
いろんなメーカーからCCDカメラと解析ソフトのセットが数百万で出てます
けど、スキャナーとNIHImageで十分ですよね？
やっている方いらっしゃいませんか？
（定量化）したいんですけど。
いろんなメーカーからCCDカメラと解析ソフトのセットが数百万で出てます
けど、スキャナーとNIHImageで十分ですよね？
やっている方いらっしゃいませんか？
885 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/05 21:47
886 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/05 22:00
887 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/06 22:30
880です。881,883さん、どうも。
複数のエピトープで作製、ってことは、
部分リコンビナントを抗原にしてモノクロ作ればいいってことかな。
full lengthを3つに切って、それぞれのモノクロ作ろうとおもってるけど
どうでしょ？
full lengthを認識しなかったら悲しいが、、、。
タグつけてプルダウン、できたらいいなと思ってたんだけど、
うーん、できるのかな。
これ（落としてくるもの）ってほとんどの細胞に発現してる。
そこにadditiveにタグ付きのを強制発現させると、
タグ付きとタグ無しが共存することになるんだよね。
タグ付きのものにうまく取りたい奴がくっついてきてくれるといいんだけど。
いけるかな？そんなのやってみないと分からないか。やる価値はあるかも。
スクリーニングをIPでやってたら確かに死にそうだ。
WBでスクリーニングして
その中にIP出来る奴が混じってたらいいなと思ってたんだけど。
ハイブリドーマの大量培養ってのはあの
回転培養器をCO2インキュベーターにつっこむタイプのやつ？
高くて、うちにはないから敬遠してたんだけど、、、。
たくさんとれるって1匹分の腹水に比べてどのくらい？
複数のエピトープで作製、ってことは、
部分リコンビナントを抗原にしてモノクロ作ればいいってことかな。
full lengthを3つに切って、それぞれのモノクロ作ろうとおもってるけど
どうでしょ？
full lengthを認識しなかったら悲しいが、、、。
タグつけてプルダウン、できたらいいなと思ってたんだけど、
うーん、できるのかな。
これ（落としてくるもの）ってほとんどの細胞に発現してる。
そこにadditiveにタグ付きのを強制発現させると、
タグ付きとタグ無しが共存することになるんだよね。
タグ付きのものにうまく取りたい奴がくっついてきてくれるといいんだけど。
いけるかな？そんなのやってみないと分からないか。やる価値はあるかも。
スクリーニングをIPでやってたら確かに死にそうだ。
WBでスクリーニングして
その中にIP出来る奴が混じってたらいいなと思ってたんだけど。
ハイブリドーマの大量培養ってのはあの
回転培養器をCO2インキュベーターにつっこむタイプのやつ？
高くて、うちにはないから敬遠してたんだけど、、、。
たくさんとれるって1匹分の腹水に比べてどのくらい？
888 ：亀レス：01/12/14 15:25
889 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/14 15:37
>>887
量的には腹水の方が圧倒的に採れると思うけどな、オレは。
普通培養上清中の抗体濃度は10-20μｇ程度、腹水中には10mg程度は含まれる。
一匹から5-10mlは採れるし、精製も簡単。コスト安いし。
大体マウスにプリスタン射ってから1ヶ月で細胞を打てる。
細胞射ってから1-2週間で腹水を採れる。参考まで。
量的には腹水の方が圧倒的に採れると思うけどな、オレは。
普通培養上清中の抗体濃度は10-20μｇ程度、腹水中には10mg程度は含まれる。
一匹から5-10mlは採れるし、精製も簡単。コスト安いし。
大体マウスにプリスタン射ってから1ヶ月で細胞を打てる。
細胞射ってから1-2週間で腹水を採れる。参考まで。
890 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/14 15:46
891 ：881：01/12/14 19:48
>>887
おおお、亀レスｽﾏｿ。
抗体の量は、>>889の言うとおり、腹水から取った方が、一般にたくさん取れる。
培養上清は、同じ量取ろうと思ったら、大量に培養しなきゃならんので、面倒だしコストもかかる。
業者に腹水化を注文するのが、一番楽で低コストです。
エピト−プに関しては、色々考え方があるが、タンパク切って、と言うのも確かに一つの手だ。
どっちかというと、リコンビナントで取った方が楽だとは思うが。
後のスクリーニングとか考えるとね。
おおお、亀レスｽﾏｿ。
抗体の量は、>>889の言うとおり、腹水から取った方が、一般にたくさん取れる。
培養上清は、同じ量取ろうと思ったら、大量に培養しなきゃならんので、面倒だしコストもかかる。
業者に腹水化を注文するのが、一番楽で低コストです。
エピト−プに関しては、色々考え方があるが、タンパク切って、と言うのも確かに一つの手だ。
どっちかというと、リコンビナントで取った方が楽だとは思うが。
後のスクリーニングとか考えるとね。
892 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/14 23:15
>>884
888も書いてるとおり厳密でなくていいなら使えるんだけど。
スキャナは直線性がよくない。さらに見映えを良くするために濃度補正とか
輪郭強調処理とか勝手にかましてくれる。設定でそういうの全部オフにして、
さらに検量線を書いて、それから使わないとウソの数字が出てしまうよ。
888も書いてるとおり厳密でなくていいなら使えるんだけど。
スキャナは直線性がよくない。さらに見映えを良くするために濃度補正とか
輪郭強調処理とか勝手にかましてくれる。設定でそういうの全部オフにして、
さらに検量線を書いて、それから使わないとウソの数字が出てしまうよ。
893 ：883：01/12/15 11:36
>>889
そう？
私がやっている限り、２Ｌの培養で数十mgはかたいよ。
腹水って汚いから精製が面倒臭そうで毛嫌いしてる。
精製簡単なら今度は腹水にしよっかな。
大量培養の方が確かに費用はかかるけどさ。
簡単にきれいなモノ取れるから好きなの。
そう？
私がやっている限り、２Ｌの培養で数十mgはかたいよ。
腹水って汚いから精製が面倒臭そうで毛嫌いしてる。
精製簡単なら今度は腹水にしよっかな。
大量培養の方が確かに費用はかかるけどさ。
簡単にきれいなモノ取れるから好きなの。
894 ：884：01/12/17 22:50
デンシトメーターなら確実かな？
895 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/19 13:39
誰かBACクローン（というかlow copyででかいプラスミド）を高い収量で回収できる方法をご存じの方、教えてください。
大腸菌のstrainは何がいいとか、プラスミドの精製はどのキットがいいとか、何でも。
大腸菌のstrainは何がいいとか、プラスミドの精製はどのキットがいいとか、何でも。
896 ：AmpliTaq Gold：01/12/19 14:20
PCRがうまくいかないんですが、誰かヒントをください。
897 ：Clontech株式会社：01/12/19 14:23
ずっとPCRやってなさい>896
898 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/19 15:44
899 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/19 17:13
>>896
チェック項目
１）ｄＮＴＰ（結構へたりやすい）
２）バッファー（析出はないですか？）
３）プライマー（ＰＡＧＥ流してみる。ものによってつぶれやすいものあり）
４）発表されている配列に基づいている場合、もとの配列とのミスマッチの
可能性。（種差など）
以上、よくある話ですが、意外と本には書いてないので、老婆心ながら
チェック項目
１）ｄＮＴＰ（結構へたりやすい）
２）バッファー（析出はないですか？）
３）プライマー（ＰＡＧＥ流してみる。ものによってつぶれやすいものあり）
４）発表されている配列に基づいている場合、もとの配列とのミスマッチの
可能性。（種差など）
以上、よくある話ですが、意外と本には書いてないので、老婆心ながら
>>895
漏れが使ったのは、危亞幻のBAC用キット
500mlの培養から取るやつで、
終了はDNase処理すると10-20ng/400μl
処理しなければ、約10倍取れる
ただし、BacのゲノムがたくさんコンタミしてるがPCR(5Kbp)はできるよ！！
まあしかし何だな
大量に取るのは難しいと思われ。
1このバクテリアに1コピーしか入ってないし
管理が悪いとすぐに脱落するし
要は、ニックが気になんなきゃ
10-50L位大量培養して、アルカリ/SDS方で取れば
セシウムで回してもBacのゲノムと取り分けるのは無髄と思われ
漏れが使ったのは、危亞幻のBAC用キット
500mlの培養から取るやつで、
終了はDNase処理すると10-20ng/400μl
処理しなければ、約10倍取れる
ただし、BacのゲノムがたくさんコンタミしてるがPCR(5Kbp)はできるよ！！
まあしかし何だな
大量に取るのは難しいと思われ。
1このバクテリアに1コピーしか入ってないし
管理が悪いとすぐに脱落するし
要は、ニックが気になんなきゃ
10-50L位大量培養して、アルカリ/SDS方で取れば
セシウムで回してもBacのゲノムと取り分けるのは無髄と思われ
901 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/19 19:30
すみません、初心者です。教えてください。
制限酵素処理したゲノムDNA断片をゲルから抽出して、
プロメガのTA-cloningキットを使って、形質転換し、コロニー・ハイブリダイゼーション
して、目的DNA断片を見つけ出す。 この方法は、うまく行きますか。教えて下さい。お願いします。
うまくいきますか。
制限酵素処理したゲノムDNA断片をゲルから抽出して、
プロメガのTA-cloningキットを使って、形質転換し、コロニー・ハイブリダイゼーション
して、目的DNA断片を見つけ出す。 この方法は、うまく行きますか。教えて下さい。お願いします。
うまくいきますか。
902 ：いーこり。：01/12/19 20:17
初めまして。
分かる人がいれば教えてください。
エレクトロポレーションの時に火花が散ります。
DH10Bのcompetent cell（自家製：10%glycerolで洗いを数回繰り返す）で0.1cmのキュベットを使い、2.5ｋV・200Ω・25μFDで行っています。
塩濃度以外に何か原因は考えられますか？
分かる人がいれば教えてください。
エレクトロポレーションの時に火花が散ります。
DH10Bのcompetent cell（自家製：10%glycerolで洗いを数回繰り返す）で0.1cmのキュベットを使い、2.5ｋV・200Ω・25μFDで行っています。
塩濃度以外に何か原因は考えられますか？
903 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/19 20:37
>>902
わははははあああああ！！火花散らしてる奴ハケーン！！
っていうか、気を付けないと死ぬよ！
原因はね、たぶん、キュウベットがぬれてるからだよ。
電圧かける前に氷にさしとくじゃん。
よくキムワイプかなんかで拭いてからやれば多分大丈夫だよ！
わははははあああああ！！火花散らしてる奴ハケーン！！
っていうか、気を付けないと死ぬよ！
原因はね、たぶん、キュウベットがぬれてるからだよ。
電圧かける前に氷にさしとくじゃん。
よくキムワイプかなんかで拭いてからやれば多分大丈夫だよ！
904 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/19 20:40
>>901
プロメガのTA-cloningキットがいかなるものか知らないが、
TA-cloningという名前である以上は、
制限酵素処理したDNA断片をクローニングするのには
かなーり不適切であると思うんだけどね。
ていうか、そんなことくらいで質問しに来る君だったら、
うまくいきません。
断言します。
うまくいきません。
プロメガのTA-cloningキットがいかなるものか知らないが、
TA-cloningという名前である以上は、
制限酵素処理したDNA断片をクローニングするのには
かなーり不適切であると思うんだけどね。
ていうか、そんなことくらいで質問しに来る君だったら、
うまくいきません。
断言します。
うまくいきません。
905 ：ぷう：01/12/19 20:49
’ミニカン’ってなにぃ？？
906 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/19 22:43
ところで、このスレは後継スレどうするよ？
そろそろ考えないと。
そろそろ考えないと。
907 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/19 23:22
stratageneの'XL-10 GOLD Ultracompetent cell'を
使っている人いますか？
カタログには20−30倍のtransformationの効率と書いてありますが
本当ですか？
使っている人いますか？
カタログには20−30倍のtransformationの効率と書いてありますが
本当ですか？
908 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/19 23:33
909 ： ：01/12/19 23:42
910 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/19 23:43
901さんへ。
もう一度教科書読みましょう。
もう一度教科書読みましょう。
911 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 04:57
>>907
XL-10 GOLD Ultracompetentもつかいましたが、個人的にはGibco STBL2を
最後の切り札的に使ってます。１０の９乗は出るので、ケミカルでもかなり
よいです。リピート構造のあるコンストラクトもらくらく。
XL-10 GOLD Ultracompetentもつかいましたが、個人的にはGibco STBL2を
最後の切り札的に使ってます。１０の９乗は出るので、ケミカルでもかなり
よいです。リピート構造のあるコンストラクトもらくらく。
912 ：名無しゲノムのクローンさん ：01/12/20 09:07
海泥由来の菌の単離がうまくいかない……。
コロニーから単離して電顕で見たら
３種類くらいコンタミしてるのもある……。
もう一度コロニーにして単離しないと……。
平板にわさわさ生えてる菌を
どうやってコロニー状態にしよう。
コロニーから単離して電顕で見たら
３種類くらいコンタミしてるのもある……。
もう一度コロニーにして単離しないと……。
平板にわさわさ生えてる菌を
どうやってコロニー状態にしよう。
913 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 10:29
>912
適当に掻きとって、ひたすら希釈して、
プレートにワンコロニーしか生えてこない状態にすれば。
適当に掻きとって、ひたすら希釈して、
プレートにワンコロニーしか生えてこない状態にすれば。
914 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 15:58
>>904 >>910
平滑末端の制限酵素を使って、ゲノムDNAを処理し、ゲルから精製してから、Aテール
附加させ、ライゲーションすれば、クローニングができる。
おめえら知らないくせに、うるさくいうんじゃなぇー
平滑末端の制限酵素を使って、ゲノムDNAを処理し、ゲルから精製してから、Aテール
附加させ、ライゲーションすれば、クローニングができる。
おめえら知らないくせに、うるさくいうんじゃなぇー
915 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 16:59
916 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 17:32
>>901
実験の目的が今ひとつ把握できていませんが、既存のゲノム断片を
クローニングされたいのでしょうか？
その場合、配列がわかっているのならＰＣＲも一考されたらどうでしょう。
また、繰り返しクローニングする予定のあるものであれば、いっそうのこと
ライブラリーを作っては。ファージにしておけばスクリーニングは幾分
楽になります。（コロニーハイブリ比）
９１５さんの方法を使われるのであれば、InVitrogen Zero-bluntが
サブクローニング効率を上げるのに役に立つかもしれません。
実験の目的が今ひとつ把握できていませんが、既存のゲノム断片を
クローニングされたいのでしょうか？
その場合、配列がわかっているのならＰＣＲも一考されたらどうでしょう。
また、繰り返しクローニングする予定のあるものであれば、いっそうのこと
ライブラリーを作っては。ファージにしておけばスクリーニングは幾分
楽になります。（コロニーハイブリ比）
９１５さんの方法を使われるのであれば、InVitrogen Zero-bluntが
サブクローニング効率を上げるのに役に立つかもしれません。
917 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 17:59
>>916
有難うございます。
サザンハイブリダゼーションして、得られたシグナルから、
制限酵素処理したゲノムDNA電気泳動ゲルに相同するところを
切り出してクローニングしよう思ってます。塩基配列はまったくわかりません。
初心者なので、よく使われている方法を教えて下さい。お願いします。
有難うございます。
サザンハイブリダゼーションして、得られたシグナルから、
制限酵素処理したゲノムDNA電気泳動ゲルに相同するところを
切り出してクローニングしよう思ってます。塩基配列はまったくわかりません。
初心者なので、よく使われている方法を教えて下さい。お願いします。
918 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 18:04
>>917
サザンで使った制限酵素と同じサイトのベクターにゲルから
切り出したDNAをつないでライブラリーとすればいいんだよ。
後はコロニーハイブリでスクリーニング。
効率が悪いようならファージライブラリーの方がいいかもしれんが、
最近の高効率コンピテンとセルを使えばプラスミドでも大丈夫かもしれない。
サザンで使った制限酵素と同じサイトのベクターにゲルから
切り出したDNAをつないでライブラリーとすればいいんだよ。
後はコロニーハイブリでスクリーニング。
効率が悪いようならファージライブラリーの方がいいかもしれんが、
最近の高効率コンピテンとセルを使えばプラスミドでも大丈夫かもしれない。
919 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 18:06
誰か教えて下さい。
‐20℃で1ヶ月保存したトランスフォーメーション液は
また使えますか。 お願いします。
‐20℃で1ヶ月保存したトランスフォーメーション液は
また使えますか。 お願いします。
920 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 18:20
921 ：912：01/12/20 19:45
922 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 20:15
923 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 20:17
924 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 20:18
925 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 20:29
926 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 20:30
>>908
死ぬのは人間です。
大腸菌は、1/100位は生き延びるでしょう。
>>909
俺もBioRadだけど、火花散るよ。
散らしたときはそりゃーショックさ。しばらく放心状態。
もちろん、コロニーも生えない。
氷に付けて火花散る人は、
たぶん、氷に水はってるんだよ。
その方がすぐよく冷えるでしょ？
でも、拭かないと、たまに火花。
死ぬのは人間です。
大腸菌は、1/100位は生き延びるでしょう。
>>909
俺もBioRadだけど、火花散るよ。
散らしたときはそりゃーショックさ。しばらく放心状態。
もちろん、コロニーも生えない。
氷に付けて火花散る人は、
たぶん、氷に水はってるんだよ。
その方がすぐよく冷えるでしょ？
でも、拭かないと、たまに火花。
927 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 20:31
928 ：922：01/12/20 20:33
929 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 21:50
930 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/20 22:11
>>929
でも、あの方法じゃあ、時間を節約できないよ。
でも、あの方法じゃあ、時間を節約できないよ。
931 ：927：01/12/21 09:17
932 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/21 09:22
>926
溶液に塩が混じってるんじゃないの？
塩が混じっていたら、１００％火花散るよ。
溶液に塩が混じってるんじゃないの？
塩が混じっていたら、１００％火花散るよ。
933 ：卒研生：01/12/21 17:39
>>926
俺はキュベットを氷の上で冷やすときに、サランラップしいてる。
少し冷えが悪いけど、トランスフォーメーションの効率はそんなに変わらん。
なにより火花が散らんくなっただけでも精神的に大分良い。
あと、キュベットの上部のほうに菌液がついてると火花が散りやすい。
なんでかよう分からんけど。経験上はそうなってる。
俺はキュベットを氷の上で冷やすときに、サランラップしいてる。
少し冷えが悪いけど、トランスフォーメーションの効率はそんなに変わらん。
なにより火花が散らんくなっただけでも精神的に大分良い。
あと、キュベットの上部のほうに菌液がついてると火花が散りやすい。
なんでかよう分からんけど。経験上はそうなってる。
934 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/21 18:26
896さんではないですがPCRがうまくいきません。
血液（血球細胞）からゲノムを抽出してPCRでスクリーニングをかけているのですが、
電気泳動するとスメアしています。
Mg濃度、酵素濃度、テンプレートの濃度、
アニール温度に伸長時間、サイクル数もいじってみたけど全部ダメ。
それならとプライマー買い替えたんですがそれでも・・・。
899さんの項目もチェックしたのですが、
何も増えないならまだしもスメアになる理由がわからないんです。
使っているのはABIのPCR9700、ポリメラーゼはAmpliTaqGoldです。
血液（血球細胞）からゲノムを抽出してPCRでスクリーニングをかけているのですが、
電気泳動するとスメアしています。
Mg濃度、酵素濃度、テンプレートの濃度、
アニール温度に伸長時間、サイクル数もいじってみたけど全部ダメ。
それならとプライマー買い替えたんですがそれでも・・・。
899さんの項目もチェックしたのですが、
何も増えないならまだしもスメアになる理由がわからないんです。
使っているのはABIのPCR9700、ポリメラーゼはAmpliTaqGoldです。
935 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/21 18:36
>>934
nestedでかけてみた？
nestedでかけてみた？
>>934
スメアーになる・・・非特異的に何か増えてる
touch down かnested PCRをすれば特異性は上がる
プライマーを変える・・・Tｍ60-64度GC45-55%30mer前後、上げたいとこの配列をよく確認しないと知らぬ間にリピート配列、etcを踏んでいることがある
細かいことだが、俺の経験からいえば、
Mg濃度はさほど変化をあたえんが、
テンプレートの濃度とTEの持ち込みは重要
多くてもテンプレートは100ng以下でTEは1μl以下/50μlの系
TEが多いとうまくいかなくなる。
4Kbp以上ならCool（4度）
4Kbp以下なら Hot（90度）
で1-2分間加熱、冷却中にサンプルを乗せる
denatuer を94℃1分から98度15-20秒に変更
TaKaRaのLA-Taqがいいぞ増えは良くないが
PCR条件は緩くてもちゃんと上がる。
スメアーになる・・・非特異的に何か増えてる
touch down かnested PCRをすれば特異性は上がる
プライマーを変える・・・Tｍ60-64度GC45-55%30mer前後、上げたいとこの配列をよく確認しないと知らぬ間にリピート配列、etcを踏んでいることがある
細かいことだが、俺の経験からいえば、
Mg濃度はさほど変化をあたえんが、
テンプレートの濃度とTEの持ち込みは重要
多くてもテンプレートは100ng以下でTEは1μl以下/50μlの系
TEが多いとうまくいかなくなる。
4Kbp以上ならCool（4度）
4Kbp以下なら Hot（90度）
で1-2分間加熱、冷却中にサンプルを乗せる
denatuer を94℃1分から98度15-20秒に変更
TaKaRaのLA-Taqがいいぞ増えは良くないが
PCR条件は緩くてもちゃんと上がる。
937 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/21 19:07
938 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/21 19:31
939 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/21 19:59
折角のよいスレなので、950踏んだ人、新スレ作成ｷﾎﾞﾝ。
940 ：934：01/12/21 22:33
みなさん素早いレスありがとうございます。
>>935さん
nestedはかけましたが、スメアーの状態はさらに悪化します。
nested前のテンプレートになにか調整するなどの工夫は必要でしょうか？
>>936さん
貴重なご意見ありがとうございます。
さっそくいろいろ試してみることにします。
確かにMg濃度はスメアーの濃さしか変りませんでした。
プライマーのデザインも考え直してみます。
>>937さん
ご指摘ありがとうございます。
1Kbp程の目的遺伝子内にプライマーを4つ作って、
500bp→300bp（nested）と増やしてスクリーニングしています。
スメアーの中に目的断片が見えたときもあるのですが、
もう一度同条件でやったらスメアーだけと、再現性がとれません。
スメアーは全体になっているときもありましたが、
最近は低分子側（1kbp以下）に見られます。
>>938さん
う〜ん、さすがにしっかりとはめてはいるんですが。
ちなみに基本敵なPCR条件は以下のように行っています。
95℃、10min→（94℃、1min→55℃、1min→72℃、2min）×60サイクル
→72℃、7min→4℃
>>935さん
nestedはかけましたが、スメアーの状態はさらに悪化します。
nested前のテンプレートになにか調整するなどの工夫は必要でしょうか？
>>936さん
貴重なご意見ありがとうございます。
さっそくいろいろ試してみることにします。
確かにMg濃度はスメアーの濃さしか変りませんでした。
プライマーのデザインも考え直してみます。
>>937さん
ご指摘ありがとうございます。
1Kbp程の目的遺伝子内にプライマーを4つ作って、
500bp→300bp（nested）と増やしてスクリーニングしています。
スメアーの中に目的断片が見えたときもあるのですが、
もう一度同条件でやったらスメアーだけと、再現性がとれません。
スメアーは全体になっているときもありましたが、
最近は低分子側（1kbp以下）に見られます。
>>938さん
う〜ん、さすがにしっかりとはめてはいるんですが。
ちなみに基本敵なPCR条件は以下のように行っています。
95℃、10min→（94℃、1min→55℃、1min→72℃、2min）×60サイクル
→72℃、7min→4℃
941 ：素人：01/12/21 23:14
今晩は。みなさんのご意見をお聞きしたいです。
培養細胞に遺伝子導入して選択培地でコロニーを
形成させた後、プレートにサブクローニングする
と上手く細胞が立ち上がって来ません。
コロニーピックアップをペニシリンカップ法ではなく
ピペットで掻き取って行っています。
その物理的な剥離がいけないのでしょうか？？
レスポンスお願いします。
培養細胞に遺伝子導入して選択培地でコロニーを
形成させた後、プレートにサブクローニングする
と上手く細胞が立ち上がって来ません。
コロニーピックアップをペニシリンカップ法ではなく
ピペットで掻き取って行っています。
その物理的な剥離がいけないのでしょうか？？
レスポンスお願いします。
942 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/22 00:16
>>940
60サイクルは多すぎでしょう。
60サイクルは多すぎでしょう。
943 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/22 00:18
944 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/22 01:51
945 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/22 03:29
>>941
サブクローン時に、細胞が定着するまで薬剤を抜いてみてはいかが？
細胞が明記されていないので一概に言えませんが、サブクローン時に
薬剤耐性遺伝子が一時的にオフになっていることが考えられます。
ただし、定着次第薬剤を戻さないと、発現プロモーターがメチル化を
受けて、目的遺伝子の発現も低下する可能性があり要注意。
サブクローン時に、細胞が定着するまで薬剤を抜いてみてはいかが？
細胞が明記されていないので一概に言えませんが、サブクローン時に
薬剤耐性遺伝子が一時的にオフになっていることが考えられます。
ただし、定着次第薬剤を戻さないと、発現プロモーターがメチル化を
受けて、目的遺伝子の発現も低下する可能性があり要注意。
946 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/22 18:30
大きいインサート(４〜６Ｋ）を組み込んだプラスミドをトランスフォーメーション
させた場合って、小さいサイズ(1.3Ｋ）のインサートを組み込んだ場合より大腸菌の
生育は悪くなるんでしょうか？
培地はLBを使っています。
させた場合って、小さいサイズ(1.3Ｋ）のインサートを組み込んだ場合より大腸菌の
生育は悪くなるんでしょうか？
培地はLBを使っています。
947 ：名無しゲノムのクローンさん ：01/12/22 21:36
946さんへ
大きいやつは少し効率が悪いです。
あとゲルから切り出すときにあまり紫外線をあてるのもよくないといううわさですが。
お金に余裕があれば、いい市販のコンピテントセルを使われては如何ですか？
大きいやつは少し効率が悪いです。
あとゲルから切り出すときにあまり紫外線をあてるのもよくないといううわさですが。
お金に余裕があれば、いい市販のコンピテントセルを使われては如何ですか？
948 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/22 21:44
949 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/23 01:28
すいません教えてください。
香辛料、特にコショウやシナモンからDNAを抽出しているのですが、
260/280できれいなDNAが取れません。またPCRをしても阻害のせいか、
増幅しません。どうしたらいいのでしょう？
適切な方法かkitがないでそうか？
香辛料、特にコショウやシナモンからDNAを抽出しているのですが、
260/280できれいなDNAが取れません。またPCRをしても阻害のせいか、
増幅しません。どうしたらいいのでしょう？
適切な方法かkitがないでそうか？
950 ：素人：01/12/23 16:06
＞945
ご意見ありがとうございます。
現時点でたくさんのコロニーが立ち上がってきていない
ので次の打ち込みをするときにそうしてみます。
ご意見ありがとうございます。
現時点でたくさんのコロニーが立ち上がってきていない
ので次の打ち込みをするときにそうしてみます。
951 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/23 17:31
少量（数百ぐらい）の細胞からゲノムDNAを抽出してPCRしようとしていますが、効率よくDNAを抽出出来る方法を誰か知りませんか？
952 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/23 19:34
>>951
どうしても抽出の必要がありますか？
直接PK/SDSバッファーからPCRできるはずです。
Single-cellのPCRなんかではそうしてるはずです。
（PK/SDSそれぞれの濃度を低めに調整するんだと思います）
今ちょうどいいお手本が見つからないので、また追記します。
どうしても抽出の必要がありますか？
直接PK/SDSバッファーからPCRできるはずです。
Single-cellのPCRなんかではそうしてるはずです。
（PK/SDSそれぞれの濃度を低めに調整するんだと思います）
今ちょうどいいお手本が見つからないので、また追記します。
953 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/23 19:36
Single-cellなんてできるの？すげー
954 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/24 06:06
>>940
俺の基本
94℃、2min→（94℃、30sec→52℃、30sec→72℃、2min）×30サイクル
→72℃、10min→4℃
変性の時間が長すぎる。taqがどんどん失火津する
兄ーるは45℃くらいでもやってみては？
俺の基本
94℃、2min→（94℃、30sec→52℃、30sec→72℃、2min）×30サイクル
→72℃、10min→4℃
変性の時間が長すぎる。taqがどんどん失火津する
兄ーるは45℃くらいでもやってみては？
955 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/24 20:19
>>940さん
当方、マウス組織からゲノム抽出を行っているＢ４です。
少し前まであなたと全く同じような状況でした。
ある日を境にして、目的のバンドが得られなくなりました。
いろんな条件を変えても、いつもスメアになってしまって…
同じ条件でも再現性がなく、２か月間悩みました。
そこで、同じデザインのprimerを新しく注文したところ、うまくいくようになりました。
精神的に大変でしょうけど、がんばってください。
当方、マウス組織からゲノム抽出を行っているＢ４です。
少し前まであなたと全く同じような状況でした。
ある日を境にして、目的のバンドが得られなくなりました。
いろんな条件を変えても、いつもスメアになってしまって…
同じ条件でも再現性がなく、２か月間悩みました。
そこで、同じデザインのprimerを新しく注文したところ、うまくいくようになりました。
精神的に大変でしょうけど、がんばってください。
956 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/25 02:29
GST-fusionで結合させるタンパクを5アミノ酸削ったら、途端に発現ゼロ・・・
さらに５アミノ酸削ってやると、今度はバンバン発現した。
でも最初の方の５アミノ酸が結構データの肝だったりするのに（鬱）
さらに５アミノ酸削ってやると、今度はバンバン発現した。
でも最初の方の５アミノ酸が結構データの肝だったりするのに（鬱）
957 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/25 05:06
958 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/25 05:09
>>940
60サイクルはいくらなんでも多すぎ。
extensionも長すぎ。
それから、amplitaqゴールド使ってるンだっけ？
あれってPCRサイクルの前に９４℃くらいで１０分くらい暖めないといけないけど、
やってる？
アニーリングはちゃんとTm計算して＋2℃くらいでやってみな。
ちなみにおいらは、２４穴ではスメアになったけど、
９６穴では大丈夫だったことあり。
60サイクルはいくらなんでも多すぎ。
extensionも長すぎ。
それから、amplitaqゴールド使ってるンだっけ？
あれってPCRサイクルの前に９４℃くらいで１０分くらい暖めないといけないけど、
やってる？
アニーリングはちゃんとTm計算して＋2℃くらいでやってみな。
ちなみにおいらは、２４穴ではスメアになったけど、
９６穴では大丈夫だったことあり。
959 ：zone：01/12/25 12:46
酵素反応の37度はプラスマイナス何度まで許されますか？
失活すると怖いんですけど。
高温槽がダイヤル式なんですよ。
失活すると怖いんですけど。
高温槽がダイヤル式なんですよ。
960 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/25 13:46
>>959
恒温槽に温度計を突っ込むか、サーマルサイクラーorブロックインキュベータ。
どちらも無ければ培養用のインキュベータに水をいれたビーカでも入れて暖めよ。
失活は酵素によりけり、それより、スター活性のほうが恐い。
>>940
60サイクルかければとっくにdNTPは枯渇して伸びなくなるのでは？
それだけかけたら、変異もかなり入るので、サイクルは少な目が良い。
アニール温度は9700ならグラジェントにかけられたと思う。説明書を読め。
>>946
インサートが大きいと増えにくい傾向はあるが、
どちらかというと、内部の配列による。
10kbでも生えてくることはあるし、1kb以下でも生えない時がある。
恒温槽に温度計を突っ込むか、サーマルサイクラーorブロックインキュベータ。
どちらも無ければ培養用のインキュベータに水をいれたビーカでも入れて暖めよ。
失活は酵素によりけり、それより、スター活性のほうが恐い。
>>940
60サイクルかければとっくにdNTPは枯渇して伸びなくなるのでは？
それだけかけたら、変異もかなり入るので、サイクルは少な目が良い。
アニール温度は9700ならグラジェントにかけられたと思う。説明書を読め。
>>946
インサートが大きいと増えにくい傾向はあるが、
どちらかというと、内部の配列による。
10kbでも生えてくることはあるし、1kb以下でも生えない時がある。
961 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/25 15:25
今、clontechのSMARTというキットでsubtractionをしています。
mRNAを増幅し、制限酵素のRsa Iで切断するところまでいっているのですが
うまく切れません。
どなたか、このキットを使われたことのあるかたこのようなことが
ありましたでしょうか？
mRNAを増幅し、制限酵素のRsa Iで切断するところまでいっているのですが
うまく切れません。
どなたか、このキットを使われたことのあるかたこのようなことが
ありましたでしょうか？
962 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/25 15:44
963 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/25 15:46
964 ：940：01/12/25 18:10
ただいま、PCR条件の見直しとプライマーの作り直しの真っ最中です。
PCR条件は先輩がずっとうまくやっていた条件だったのですが、
これから自分のベストの条件を見つけていこうとPCR中です。
みなさんたくさんのアドバイスありがとうございます。
論文の謝辞にみなさんのこと書きたくなるくらい感動しました。
>>955さん
同じ境遇だったのですね。
でも抜け出されたということで、はげみになります。
>>958さん
Taqの活性化ですよね。
95℃10分でやってます。
うちにも24穴あるんですけどやはり機械によって結果かわりますか。
>>960さん
グラジェントできるのは知りませんでした。
マニュアル読んだら載ってました。
ありがとうございます、試してみます。
PCR条件は先輩がずっとうまくやっていた条件だったのですが、
これから自分のベストの条件を見つけていこうとPCR中です。
みなさんたくさんのアドバイスありがとうございます。
論文の謝辞にみなさんのこと書きたくなるくらい感動しました。
>>955さん
同じ境遇だったのですね。
でも抜け出されたということで、はげみになります。
>>958さん
Taqの活性化ですよね。
95℃10分でやってます。
うちにも24穴あるんですけどやはり機械によって結果かわりますか。
>>960さん
グラジェントできるのは知りませんでした。
マニュアル読んだら載ってました。
ありがとうございます、試してみます。
965 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/25 18:12
>>961
サブトラクションキットを使ったことはありませんが、RNAの増幅は
毎日やってます。そこまでは問題ないと思います。
実は年始から同キットを利用しようと考えてるので、気になってます。
RsaIでサイズダウンさせる前に、カラムかなにかで一度精製のステップ
はなかったでしょうか？それはうまくいってますか？
また単に制限酵素が死んでるってことはないですか？
サブトラクションキットを使ったことはありませんが、RNAの増幅は
毎日やってます。そこまでは問題ないと思います。
実は年始から同キットを利用しようと考えてるので、気になってます。
RsaIでサイズダウンさせる前に、カラムかなにかで一度精製のステップ
はなかったでしょうか？それはうまくいってますか？
また単に制限酵素が死んでるってことはないですか？
966 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/25 18:38
Ordered DD法だっけ？あれはいかにもうまくいかなさそうだが。
967 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/25 22:33
DDとかsubtractionやってるやつって、
少なくとも数百人に笑われてることを知って置いた方がいいよ。
少なくとも数百人に笑われてることを知って置いた方がいいよ。
968 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 00:04
それでもいいよ。いいの取れたから。君たちは揶揄しながら眺めてなさい。
969 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 02:36
まあとったもんがちだな。
でも、そもそも片手間実験でやるもんちゃうの？
でも、そもそも片手間実験でやるもんちゃうの？
970 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 02:46
971 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 02:56
>968
で、のーざんやって、変化なしってか（藁
で、のーざんやって、変化なしってか（藁
972 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 03:06
PCR subtruction したサンプルをマイクロアレーでとると、
楽でイイよ。あなたも１週間で新遺伝子クローニング。
取れた数十個のクローンは即全部シーケンス屋さんに頼んで６００ー８００だけ読んでもらう。手をつけるのは未知か面白そうなものだけ。
アレーだと番号言ってリクエストするだけだし、ほんと人任せクローニング。
助手の皆さん。こんな楽なクローニングないよ。
イイ時代になった。（こんなん研究と言えるのか？）
楽でイイよ。あなたも１週間で新遺伝子クローニング。
取れた数十個のクローンは即全部シーケンス屋さんに頼んで６００ー８００だけ読んでもらう。手をつけるのは未知か面白そうなものだけ。
アレーだと番号言ってリクエストするだけだし、ほんと人任せクローニング。
助手の皆さん。こんな楽なクローニングないよ。
イイ時代になった。（こんなん研究と言えるのか？）
973 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 03:17
>>959
うちでは37度の酵素反応は全部エアインキュベーターでやってる。
大腸菌のプレートとか培養する奴ね。
紙のエッペン立てに立てて置いとくだけ or 96 wellプレートにビニールテープで蓋しておいとくだけ。
水を張ったービーカーになんか入れない。ただ置いとくだけ。
これで駄目だったという話は聞いたことがない。やってみそ。
うちでは37度の酵素反応は全部エアインキュベーターでやってる。
大腸菌のプレートとか培養する奴ね。
紙のエッペン立てに立てて置いとくだけ or 96 wellプレートにビニールテープで蓋しておいとくだけ。
水を張ったービーカーになんか入れない。ただ置いとくだけ。
これで駄目だったという話は聞いたことがない。やってみそ。
974 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 03:26
975 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 09:36
>972
やってて愉しい？
やってて愉しい？
976 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 10:32
しかしクローニングの作業自体を楽しいと思うか？
977 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 10:45
ASAPクローニング作業は終えて機能解析をする。
クローニング自体は研究とは胃炎。
マイクロアレイはいいね。
とりあえず、未知遺伝子のリストが手に入って夢がふくらむ。
（すぐしぼむ？）
クローニング自体は研究とは胃炎。
マイクロアレイはいいね。
とりあえず、未知遺伝子のリストが手に入って夢がふくらむ。
（すぐしぼむ？）
978 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 13:30
979 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/26 14:10
980 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/27 03:12
>>978御苦労さまです。
ここと、裏技擦れ タンパク精製すれはいいね。
ここと、裏技擦れ タンパク精製すれはいいね。
ウェスタンブロットを勉強し始めました。
サンプルを作る時、グリセロールを入れると書いてあるのですが、
どうしてですか？ 授業では７％と習ったんですが、本によってまちまちです。
ゲルに入れるのもあるようなんですが、何のためなのでしょうか。
サンプルを作る時、グリセロールを入れると書いてあるのですが、
どうしてですか？ 授業では７％と習ったんですが、本によってまちまちです。
ゲルに入れるのもあるようなんですが、何のためなのでしょうか。
982 ：名無しゲノムのクローンさん：
サンプル溶液が軽いと、バッファに浮いちゃって泳動できないからだよ。