「実験の裏技ありますか？？」２　　　

パート１はこちら
http://cheese.2ch.net/life/kako/972/972458683.html

32P の汚染は、リン酸バッファーで見事に落ちる。どんな洗剤よりも強力に。
放医研に国内留学していた時に教えて貰った。

出尽くした？

ＡＢ○のシーケンスキット、反応スケール１/４、さらにTaq用バッ
ファーで１/４に希釈して反応してる。推奨プロトコルの１/１６量
で４００ｂｐぐらいなら問題なく読める。

>>2 競合するんっすか。

まじで汚染が取れるんだから。だれか興味ある人はメカニズムを考えてみてちょ。

age

age

リアルタイムPCR SYBR Green、2/3スケールで問題なし。

>>9
うちでは１/２だよ。業者がそのほうがいいって。

９６００なら１/８でできるって。

>>10
25microLのスケール？
>>11
6 microL？

>>12
そう。テンプレートもプライマも水もマスターミックスも半分。
温度を設定する画面で５０μを２５μに変更するの。

９６００の話は業者が言ってたので未確認だけど、
６μスケールじゃかえって面倒そうだよね。
だから、Taq用のバッファーを使って、２０μスケールくらいにするのでは？

元スレ立てた人の名前、14-3-3って…
都立大磯辺研か？
皆さん、おげんきですか〜。

ピペットチップもエッペンドルフチューブも
オートクレーブしない。
エッペンドルフチューブはオートクレーブしないと
キャップがゆるいのがあるから要注意だ。

電気泳動の裏技ないですか？

age

Big-Dye Ver3の使用したいますか？
使った感想をきぼんぬ

全部プロトコールの1/100にすりゃー、研究費1/100で済むよ。
100万で1億の実験ができるんだ。
PCRなんて50μじゃなくて0.5μでやるべきだよ。

研究費デノミ政策

>19
絶対無理。

9600シリーズなら0.5μも可能だが、特殊なピペットと特殊な
チップが必要。

結局、計測技術の進歩で研究費のコストは大幅に減らせる。
そう考えれば、ピペットの技術がバイオの未来を左右する。

>>19
50は無理だが、10ならいける。
…1/5じゃだめ？

研究費1/5になるのもかなりデカイな

実験の基本は面積の少ない９６穴

うち基本的に1.5mlのチューブ使ってるんだけど、よく考えりゃ制限酵素
切断もライゲーションも100microL以下の容量。これなら操作は0.2mlチューブで
できる。ならば遠心機他の規格を0.2mlに合わせて酵素反応のたぐいは全
てサーマルサイクラーで、なんて考えてみたんだが、どうでしょ。

>>27
すでにそうしているよ。
0.2のチューブも1.5のチューブに入れたら遠心できる。
サーマルサイクラーを４度にしとけば氷もいらない。

96穴のプレート洗ってつかってます？

>>27
1.5ml tubeより0.2ml tubeの方が単価が高いのでは？

電気泳動裏技(DNA)？
Mupid等の場合、急ぎのときは蒸留水をいれると
泳動が早くなります。が、抵抗が上がるので
熱も出るしMupidだとヒューズ飛ぶかも。

チューブの単価
1.5ml>0.5ml>>>>>0.2ml

マジで、高いの？

0.2mLチューブの方が高いよ
1.5mLチューブを使う方が経済的

あげ

>>31
蒸留水入れたら泳動遅くならない？
うちじゃ全く逆だ。蒸留水入れてバッファー希釈
した方が熱も出ないし･･･なんでだろ？

暗室で縦四方固め

>>36
オームの法則だと、抵抗を上げると電圧一定なら電流量も減ります。
だから泳動が遅くなるはず、なんですが(電気系は小学校レベルの
知識しかないのでよくわかりません)、mupidもしくはgelmateでは、
反対に流れるのが早くなる、と聞きました。というか、薄まってるの
とは違うかも。もしくはゲルは抵抗が少ないから電流が逃げる？

実際に使用していた状態の実況。
mupid等で、1×TAEで普通に泳動→数枚泳動後もしくは数日後、
泳動しようとしたら干上がっている→ゲルを入れ、沈むくらいまで
洗瓶から蒸留水足す→ついでにウェルも洗う(一石二鳥)→繰り返し。
とやっている間に、泳動が早くなったというワケ。

>>38
うちも大体同じで最初は1×TAEだけど蒸発した分だけ蒸留水を
足していってる。で、段々と発熱も減るし、泳動も遅くなる。

ただ完全に蒸発させたことがないからその辺が問題なのカモ。

>>39
ムムー。
物理出身者が「速くなる説」を唱えてたので、何か根拠があるかとも
思ってたんですが、無さそう。でも確かに速くなってたというのは、
bufferの組成かなにかが微妙に違うのカモ。
つーか、すっごい熱くわなりましたデスよ。根拠無いので、この辺で。
裏取れた裏技でなくてスンマセン。

>>40
なんか不思議だね。
解決は出来なかったけど研究室によって全く逆のことも
起こり得るということを知っただけでも楽しかったよ。

ふつうは蒸留水入れたら泳動遅くなるだろうが。
TAE成分の電解質が多いほど抵抗は低くなるから、電流は多くなる。
蒸留水入れたら泳動層断面の面積あたりの電解質が減って、抵抗値が上がる。
よって泳動はおそくなる。

age

電気泳動は電流より電位差でしょ？
バッファ濃いと電圧が低くなるんじゃないの？

>>44
mupidのスイッチになんて書いてある？

私はbuffer量が多いときは遅いような気がしてるんだけれど。
何となくだけれど。

>>45
なんて書いてあるの？
バッファが多いと遅いのと（電流が多く流れることで）電圧が
低下すると遅いのはconsistentだと思うけど？

>>46
45が言いたいのは、「mupidは定電圧電気泳動装置」ということでは？
たしか50Vと100V。

ところで、通常より薄いバッファーに、通常濃度のバッファーを含むゲル
を入れたら、はじめのうちはゲルの中を優先的に電流が流れるようになる？

平行に流れないだろうから、像はきたなくなると思うけど。

裏技と呼べるようなものではないが。

SDS-PAGEで使う2xサンプルバッファーを4xサンプルバッファーに
してアプライ量をかせぐ。サンプルが薄いときに有効。

微量超遠心でのバランス合わせは、電子天秤でチューブの重量を量り、
ピペットマンでバッファーを足す。
0.1 g増やしたかったら、100 uL足すという具合に。
面倒なのでバッファーの比重は１。一応、上皿天秤に乗せて最終確認はする。

＞微量超遠心
セシクロのシールチューブの超遠心って、重量きっちり量ってます？
DNA/RNAを溶かして、0.01g単位できっちり量ったセシクロを入れて
終わり。
あとはチューブの首の辺りまで入れてシールだけど、目測です。
また、タンパクの短時間超遠心(S100等を取る時)も、リシスバッファーでリシスして、
バランス用にリシスバッファーを等量加えるだけ。cellのvolume位大した事はないけど。
それで100000rpmで20時間回したりするんだけど、インバランス出た事ないな。

>>49
20時間が短時間ですか・・・

>>49
確かに、セシクロのシールチューブは>>48 のような方法では
やっていません。バランスの合わせようがないので。
上皿天秤に乗せて確認はしていますが。

そういえば、最近はDNAのペレットを直接 50 w/w% CsCl TE溶液
に溶かしています。横着するようになったなぁ。

＞私はbuffer量が多いときは遅いような気がしてるんだけれど。
何となくだけれど。

サブマリン泳動層でしょ。
ゲルの置いてある部分の断面を考えればわかるでしょ。
液が増えれば、ゲル内への通電量が相対的に減るからだよ。

>>47
そういうことです。

>>52
????
私はMupid使ってます。電圧は常に一定なのでbuffer量がふえると
相対的に電流下がる、って解釈してるんだけど･･･。
そういうことなの？
ﾁｭﾎﾞﾝﾇにも解るように解説ｷﾎﾞﾝ｡
ｽﾏｿ｡

わたしゃbufferの濃度の影響だけかと思っていた
液量でそれだけ違うのなら、8レーンのゲルと17レーンのゲルでは
かなりの速度差が出ると思うぞ

>54

なんで？？？
サブマリンでゲルの上にバッファーがギリギリひたひたの場合と、
たっぷりと層から溢れるほどある場合では、泳動速度が違うだろ。

ギリギリの方が泳動速度は早いけど、発熱がすごかったり、
きれいに流れなかったりする。
たっぷりだと、きれいに流れるけど、遅い。
バッファーが循環することで、ゲルの冷却機能も果たしているからね。

素人だけど考えるに、
E=IRにより、バッファー量が多ければ抵抗値が下がるので（管が太くなる）、
定電圧なら総電流量は増えますね。
しかし上層のバッファーへの通電（逃げ？）が増えますから、ゲル内通過する電量も減るでしょうね。
上がる総電流量とで相殺されそうに思いますが、実際には
多すぎるバッファーは泳動がおそくなりますね。

バッファー濃度は濃い方が抵抗値さがるから電流は増えるでしょ。
水を入れればおそくなり、つけ汁で濃くなれば早くなるのは、
そういうことですよね。

ナルホド。
濃度の問題じゃなくて、量の問題でありましたか。
了解しました。たしかにヒタヒタのギリギリだったですよ。
発熱するワケだ。あと、ゲルは流したレーンだけカミソリで切って、
残りは漬けっぱなしの事も多かったから、常に10レーン余りが
泳動槽に入っている状態でした。
乾燥して厚さが元の半分くらいになったゲルにも平気で流してました。
上のを書いてから、自分なりにTAEのAが飛んだら流れ易くなんのかな？
ていうことで、マードーデモイーヤと思ってました。
だって、イオン強度の問題だけなら、上から塩を加えれば早くなるの？って思ったし。
案外ホントに塩をひとつまみで早くなったりして？

それから、トランスフェクション用のDNAですが、ずっとCsClx2回廻してましたが、
最近は1回しか廻しません。リン酸カルシウムで、バラつきはありますが効率はほぼ同じくらいでした。
CsClを入れる前段階に雑味をなるべく加えないようにしたあと、
CsClを入れる直前のペレットにちびっとだけRNaseを加えます。
CsCl超遠心後は、イソアミル→フェノクロ→エタ沈→溶かしてエタ沈。
エタ沈の時、NaOAcよりNaCl(5Mx1/10vol+EtOHだから、25mMくらい)の方が
いいらしいっていう人がいますが、意味有りますか？

RNaseは機雷だ！
1,2,3のステップの後に最終濃度２Mリチウム酢酸を加えて１０分氷上で放置、２倍量のエタノールを加えて遠心、
そのあとCsCl遠心に回すも、７０％エタで２回洗って制限酵素で切るのも、各人の自由。
500bpより大きなDNAを見るにはこれで十分。

↑、氷上放置後、遠心、上清を新しいチューブに移してエタノールを加えるんだった。

トランスフェクション用でもDNAもCsCl回してません。
丁寧にプレップすればほとんどクローズドです。

＞＞13さん
漏れはやったことないからわかんないけど、ミューピッドで
buffer薄めるとDNA早く流れるってのが本当だとすると不思議だよね。

これが定電圧でなくて定電流だったら、buffer由来のイオンが減ったせいで
DNA以外のイオンが流れてくれないので、
定電流を保つためにDNAがどんどん流れるって理屈ならわかるけどね。

＞＞36さん
ジュール熱の式　Q=IVt
からすると、抵抗増えて電流値落ちれば熱は出なくなるんだよね。
（Vは一定だから）こっちの方がreasonable。

>>61
そんなこといってるから生物系は頭悪いっていわれちゃうんだよ。
バッファが濃いと、単にDNAにかかる分電圧が低くなるだけ。
薄すぎても、電流が流れなくなるから駄目だけど。

>>62
そうかな？
電圧は「電場」だから
buffer由来のイオン（Trisなど）にもDNAにも
同じの力が加わる筈だよ。

↑もちろんchargeが同じだとしてね。

QE=6πηru
（Qがcharge、Eが電場、ηは溶媒の粘性定数、rはイオンの仮想半径で、
uが電気泳動易動度）
この両辺がイオンやDNAにかかる力。

むかし島尾先生の講義で聞いた。

回路図かいて見りゃすぐに分かるよ。

(+) -- チャンバのバッファ(R0) -- [DNA(R1) + ゲル中とゲル上のバッファ(R2) ] -- (-)

(-)側のバッファは(+)といっしょにして考えることが出来るから略。
これを使って式を立てる。
また、R2はR0とは距離と断面積を係数とする比例関係にあるから、
それをつかって式を簡略化する。
最終的に、定電圧ならR0とR1の比でDNAの分電圧が決まることになる。
R2の値にはR0と断面積が影響するので、バッファの濃度と量が
DNA分電圧の変動要因になるというわけ。

この程度の内容は中学校で習うんだから、簡単に導いてよ。

なるほどね。
ミューピッドって(+)も(-)もみんなつながっているから
回路図って発想は湧きにくいよね。

bufferを薄めることで、R0とR2は上がるわけだ。
電圧は一定だから相対的に抵抗の少ない分
抵抗R1のDNAは電流値を増やす。
だからDNAは早く流れる。

それでいいのかな？

DNAもトリス-グリシン バッファーで流す。

>>66
ま、そう言うことです。
式立てて、微分してみればどの辺が最大か分かるはずなんだけど
あまり大差ないだろうから面独裁や。

FACSのことなんですけど、
染色時間や細胞数を結構いい加減に設定してもちゃんとデータが
でてしまうことはわかったのですが、ゴミ（死細胞）がときどき
混ざってしまいます。どうしたら減らすことができるでしょうか？

FS-SSでゲートをかけて、いいやつを拾ってきなさい。。。

7-アミノアクチノマイシンDを使えば、生細胞と死細胞を染め分ける事が出来る。
ちなみに死細胞が染まる。

実験の基本は面積の少ない９６穴

大腸菌のコロニーからラージプレップするとき、まず３ｍｌ程度のチューブで
培養してから大きなフラスコに移すのが一般的ですが、どうしていきなり
コロニーからフラスコに菌を入れたらいけないのでしょうか？
うちのラボの連中によると、一旦菌が増えているか確認できるからだとか、
大腸菌が苦しんでリアレンジメントが起こりやすいとか言っていますが
誰も本当のところを知りませんでした。

大きなフラスコにコロニーから無菌的に植菌するのが難しいから。
漏れは直接やっちゃうけどね。

それだけの理由なの？知らなかった

E-coliって増殖にdensityの問題ないの？

>>73〜>>75
bacteriologyのなごりで。purecultureからOD測っておけば
stational phaze手前までの時間があらかじめ予測できる。

>>76
培養するだけなら問題なしかと。もちろん高密度はまずい。

>>77
げ、タイプミス。もちろんpreculture

1.5ml tubeより0.2ml tubeの方が単価が高いのでは？

>>79もれもそうおもう。

げ

長時間同じ培地で培養してると抗生物質がヘタるから。

>>26,27
最近は制限酵素処理（ミニプレとかね）は
やすっちい96プレートでやります。
ふたはセロハンテープでね。
ラベルとかしなくていいし、便利だよ。
最近はミニプレ用の培養液も、
チューブに移す手間が面倒なので、
1.5mlチューブに適当に培地入れて、
菌植えて、ローテーターで37度で一晩放置。
そこからプラスミド取ってます。
たまに増殖悪い菌がいるけど、楽で良いよ。

>>83
96プレートは私も使っています。蓋付きのもの。テープなんてしない。
しっかりしたプレートなので洗って使い回し。

1.5mlチューブは普通なのでは？ミニプレップにしか使っていないけど。
6時間培養なので1日で結果が出せます。

>>83
どうやってローテーターを37度に保つの？
ローテーターごとインキュベターに入れるのか？
それができない場合何かいい方法はない？

LB培地に硝酸カリウムを10g/liter入れて、３７度に静置すればよい。

>>73
もう話は終わったのかもしれないけど，一応コメント．
培地の酸性化，とか，抗生物質が分解される，とかそういう理由のはず．
培地が酸性化するから，というのは昔よく聞いた．
でも50-100ml程度だったら，私はグリセロールストックから直接培養します．
さらに横着するときはトランスフォーメーションしたプレートに直接LB蒔いて溶かして，培養したりすることもあり．

プラスミドをとる程度なら，培地の酸性化なんてあんまし気にする必要もないと思いますが，どうでしょ？

>>87
Cmなんかだとへたりはほとんど問題にならないと思う。
やはり培養時間が予測しやすいことが肝だと思う。

>>電気泳動の件

ミューピッドの電源装置がちゃちなのはみなさんご存じの通り。
ということは、電源の内部抵抗が非常に高い。この内部抵抗の影響で、
流す電流値が高いほど、電圧降下を引き起こす。従って、できるだけ
バッファー中を電流が流れない方が泳動電圧が上がる＝泳動が速くなる
ということが起きる。そういうことは電源屋では常識だが？

良い電源と安物の違いは、ひとえに電流供給能力の違い＝内部抵抗の違い、
といっても過言ではない。

だが、せっかくのバッファー（緩衝）能力が発揮されないと思うから、
実験に再現性が無くなったり、高次構造に騙されたり、足下を掬われる
ことになりかねんから、基本には忠実に。

ミューピッドの電源はダイオードブリッジ＋抵抗分圧による
簡易電源、すなわちヒューズ付きのほとんどＡＣ直結、構成じゃなかったっけ？
この場合の内部抵抗とは？？？

１００Ｖで仮に０．２Ａ流れたとすると、５００オーム。
内部抵抗なんてその数％以下だろうと思われるから、
電圧降下も１０％もない程度じゃないだろうか。
その程度では問題になるとも思えんが・・・

>>86
なんで硝酸カリウム入れるの？

>>88
抗生物質が分解される，ってのは，大腸菌に分解されると言う意味です．
耐性遺伝子をもってたら，抗生物質分解するんじゃなかったっけ？

>>92

Cm耐性は非分泌性なので大丈夫！

age

ミューピッドの電源、ワンチップICの定電圧電源がブ
リッジ無しで入ってるんじゃないか?
秋葉原のパーツ屋で200円くらいのチップだ。
だもんで、電圧は一定なもんでバッファーがへたって来ると
過電流が流れやすくて、そうするとチップが壊れる。
それを防ぐために、すぐ切れるヒューズがはいっているんだと
思うけど。それにしてもあのヒューズはよく切れる。

酸素の変わりにNO3-が電子受容体になって、末端酸化酵素を介して呼吸鎖を動かす。
硝酸入りの静置培地で生育した大腸菌を集菌するとずいぶん赤みのかった色になっている。

>>95
三端子レギュレータのことを言ってる？
もしそうだとしたら、100V入力じゃ発熱が大変だと思われ。放熱板
つけなきゃならなくなる。
実際は単なるダイオードブリッジ。100Vは全波整流、50Vは半波整流、
コンデンサによる平滑化すら無しの超簡易回路だよ。

>>97
了解した。
確かに100V入力のできるレギュレータなんて、
あのサイズではないな。

SDSのゲルを脱色液に漬けた後、ビニール手袋してゲルを指で連打。
すぐにバンドが見えてくる。

制限酵素処理後、制限酵素を除いた後にBAPしたいとき、キアゲンのgel extract kitで処理する。んで、最後にカラムから溶出する時はelition bufferじゃなくて、BAP bufferで溶出する。

もれは制限酵素処理した溶液に直接CIAPをつっこむ。
plasmid 1 ugを50 ulの系で切ったらCIAP 1 ulとか。
その後gel extract。

>>100
なんで脱リン酸化した後gel extractするの？
>>99
gel extract kitですか、PCR purification kitの方が・・・

>100 漏れは制限酵素と一緒にCIAP入れちゃう。量は>100と同じくらい。

CIAPよりBAP

>>101
PCR purification kitでした。

>>100
制限酵素を除去してライゲーションする為と違いますかね？

私はSAP派

>>104そうです。

>>104、>>105
そうなんだ。vectorはゲルから回収すると決まってコロニーがでてこないから
絶対にしないことにしている。

ちなみに熱失活させておけば問題ない。失活させなくても（忘れても）上手くいったヨ
でもPCR purification kitを使っていれば制限酵素も除去されている。

>100
え？切れ残りのvectorがあるとまずいからgel extractすんじゃないの？
>107
> vectorはゲルから回収すると決まってコロニーがでてこないから
ん？俺は大抵できているけど？

E.Coli用アガロース培地を作る時は専らレンジでチン。
ラージプレップ用LBでもレンジでチン。

泳動用アガロースゲルは、レンジで融かしてBioradのSDS-PAGE用
ガラス板の上に注ぎ込んで、串さして終わり。
デカい方だと25mlまでは表面張力で溢れ出ないよ。
流す時はミューピッドサイズの泳動槽でも150Vで流す。

で、余った時間で2chに行き有意義なディスカッションをする。
( ﾟ∀ﾟ)　＜Umahhh

> E.Coli用アガロース培地を作る時は専らレンジでチン。
> ラージプレップ用LBでもレンジでチン。
よーするに電子レンジだけで滅菌できるってことでしょーか？

泳動用アガロースゲルはたくさん作っておいて1XTAE中で室温保存。
ただし、ウェルを上に向けておくと析出してきた塩がウェルの中にたまってきてしまうので
必ずウェルは下にする。さらに、保存しておいたゲルを使うときは、サンプルをロードする前に
バッファでピペッティングしてウェルの掃除をしておくことも忘れない。

最近の鞭毛の有無が電顕を使わずに判別できる
方法をどなたか教えてください。
学生実験で教わった鞭毛染色、全く使えません。
ちくしょぉー、このクソ忙しいときに
電顕壊れやがって！！ヽ(`Д´)ﾉ ｳﾜｧｧﾝ

暗視野顕微鏡で見たら？

>>111
私はタッパーの底に水で湿らせたティッシュを置いて
その上にゲルを置いて室温保存している。

113が良いことを言った！　しかし１１２の「最近の」は「細菌の」じゃないのか!?
暗視野でいいのか？

光学顕微鏡で「細菌」の鞭毛が見えるのか？！

最近→細菌です。
ｽﾏｿ……逝ってきます

光学顕微鏡で見えますか？
何かで染色してから見るんですか？

>>115
暗視野で大腸菌の鞭毛長さ測ってたねーちゃんが生物物理学会にいた。
>>117
染色はしない。横から光を当てて反射・回折した光だけを観察する。
専用のコンデンサーが必要。
俺も詳しくないから、後は顕微鏡の参考書や生物学辞典でも見てくれ。

>>110
そそ。フラスコの口をラップでクルクル巻いて筒作って、
レンジで沸騰させる。急いでる時はすぐ水につけて冷やす。
でもこの時ちゃんとしたフラスコ使わんとパリンといくよ。

長期保存にはお薦めしないけど、トランスフォームして次の日の朝
つつくなら十分使える。朝10時頃つつけば夜7時には生えてるから、
ミニプレして夜10時には結果が見える。で、次の日ラージプレップに
持っていける。　( ﾟ∀ﾟ)　＜Umahhh

>>114
そのまま冷蔵庫で永久保存

>>87 グリセロールストックから直にラージに移る派です。
けど、low copyのプラスミドとか、鎖長が長いプラスミドを取るときに、
３〜４時間後に抗生剤を追加して、cultureしてるんやけど、上手く取れるときと取れないときの差が
激しくって困っています。何か上手い方法知っている方みえたら教えてください！！！

>>121
菌を回収する前に氷冷するとプラスミドのコピー数が増えると
きいたことあるけど。
でも、専門家じゃないから実際コントロールとってやったことはないけど。

>>121
抗生剤って、camだよね。
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/l50
こっちで聞いた方がよいかな。

すてーしょなりふぇーずまで大腸菌を培養した後、
クロラムフェニコールを加えて一晩振って、プラスミドコピー数を増やす操作って
どの系統のプラスミドだと効果がありますか？
菌株やインサート長も影響しますか？

>>122 今度試してみます。E.coliが早く増えすぎるときはいつもダメみたいなので、cultureするときの温度も関係しているのかも知れません。
>>123 ampのときです。スレ違いすんません。
>>124 pBR322などに効果があるようなことを聞きました。oriが関係しているらしいです。
　　　キアゲンの説明書にはcolE1（合ってる？）系とあともうひとつの系に有効と書いてありました。
　　　ためしに今うまくとれてないプラスミドでクロラムフェニコール加えてみたところ、とたんに増殖が抑制されました。
　　　それは偶然にもプラスミドがよくとれたんですが、どうなんでしょう？？

ampでしたか。いや124の操作がうまくいかないのかと思ったので。

pBRくらいなら5ml以上の菌液使えばいいじゃん。

>>124　クロラムフェニコ−ル法はプロスミドによって
増幅のオーダーすら変わるからちゃんと濃度ふって
最適値をもとめたほうがいいよ
pBR系でもほとんど増えないやつもいる（経験済）
J.Bacteriologyの古い論文にいろいろのってる

QiagenのQiaprepSpinを再生して使ってる人いますか？
://www.biowire.com/bw_jsp/single_product_review_top.jsp?fr=10&rid=15444&tid=5&ru=9206
こんなん見かけたのでやってみたんですけど、自家製のアルカリリシスじゃうまくいかないっす・・
soln３の塩濃度が濃すぎるのかな・・

ヲレはいつも1リットルの2xYTで生やした大腸菌をアルカリーSDS法→CsCl超遠心x2回だ。プラスミドは１０mgは盗れる。

文句有るか？

>>130
そんなにとってどうする。
CsClはたかいんだじょ。

物取りしてるんで、そのDNAを使ってセミコンフルエントHEK293cell約２００プレートにリン酸ーカルシウム法トランスフェクションします。

>>129
QIAGENのminiprepだったら使いまわしまくってるよ。
３〜５ｍｌ培養してＰ１、Ｐ２、Ｎ３加えて遠心。
カラム通してさっとプラスミド。３０分程度。
使ったカラムはミリＱで３回ウォッシュ。

そんな感じ。

>>133 とれたりとれなかったり再現性がなさそうに見えたので今捨てちゃいました(w
それはそうとＰ１、Ｐ２、Ｎ３足りなくなりません？
それで、Molecular Cloningにのってるでやってみたんですけどだめだった、と。
まぁ、Ｐ１、Ｐ２はsolution12とほとんど一緒だし、Ｐ３は割と多めに入っているので
２回分ぐらいはありそうですけど。solution3の濃度を半分にすればいいのか、
それともＰ１に入っていないグルコースがなんかやらかしてるのか・・

>>134
あれはイオン交換カラムだから使いまわしはできますよ。
miniはやったことないけどmaxiは
研究費がないころ使いまわしていました。
１回でもカラムを乾かしてしまうとダメだと思いますよ。

129です。なんか、ハッキングモードに入ってちょっといろいろやってみました。
solution1 100μ　solution2 200μ　solution3 150μ　＋　新カラム→　Ｘ
solution1 100μ　solution2 200μ　solution3 150μ　＋　H2O　400μ→　Ｘ
solution1 250μ　solution2 250μ　N3 350μ　→　○
ただし、solution1にRNaseが入ってないせいか、ゲルで流すと1000bp以下のところに
どどーんと出ます。これってRNAでいいんですかね？
それで、ちょっとpHを測ってみました。solution3　5.3　　N3　4.2
どうりでS3とN3の匂いが違うと思った。solution3でうまく行かない理由はこれですかね？
ところで、どなたかPBとPEもどきのレシピご存じないですか？

>>134 でかいやつは多分乾かすとひび割れちゃうからだめなのかも。。miniは乾かしても
大丈夫っぽいです。gel extraction kitはひび割れちゃいましたが。

そういえばlargeの樹脂はQBTで平衡化しますよね。
という事は出荷時は塩基型になってるのかな？miniもS3で洗って酸性型にしてから使えば
DNA引っ掛かってくれるかな。。

たいした技ではないが、ウェスタンでセミドライブロッターを使って転写するとき、人によるけど、辞書やSigmaのカタログなんかを”重石”としてブロッターの上に乗せる人いるよね？乗せない人もいるみたいですけど。
で、その時、Bio Craftなんかの重めの電源を使う場合、こいつ自体を重石代わりに使ってるんですが、これは、どうですか？
ブロッター複数枚使用時も、全部積み上げて最上段に電源。
机上スペースが電源分だけ多少空いて、少し得した気分です。

>>138
うちは１リットルくらい水の入ったビンを置いています。
電源装置はちと重すぎるような・・
薄いPAGだと押しつぶされちゃったり、濃いPAGだとひび割れたりしませんか？？

138は漏れだった・・・ｳﾂﾀﾞｼﾉｳ｡｡｡

しがない学部三年のものです。
形質転換でエレクトロポレーション後に菌を培養しますよね？
Ampであれば前培養は入らないというお話がありましたがなぜですか？
あと先日、サイズの大きいプラスミド（アグロ用）を培養後（LB2ml）、
プラスミド抽出をしました。
しかし異様にとれが悪いのですがなぜだかわかりません。
どういった理由が考えられるでしょうか？
ぜひ理由を教えていただきたく、お願いいたします。

>>134

再現性ない？
実験の方になんかまずい点があるのでは？
Ｐ１は大量に作っておいたやつをずっと使ってます。
Ｐ１、Ｐ２、Ｎ３は単体で売ってませんでしたっけ？
キアゲンのインストラクションに組成書いてあるから
作れるけど、めんどいよね。

ちなみにmidiは使いまわししてません。
miniはもう何回使ってるかわかんないくらいだけど
普通にプラスミドとれてくるけどな。

まぁラボが貧乏ってわけじゃぁないんですけど
使いまわせるなら使いまわそうと。

>>140
スレ違い。それともネタか？
アンピシリンとカナマイシンの作用機構の違い、プラスミドのコピー数について勉強しなさい。

>140
実験の質問はこっち↓でな。
「▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼」
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/l50

Ampに関してはここ↓に出ているよ。
「★★実験の手抜き・節約・時間短縮method★★」
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1010893696/
ただし、明らかにここと重複スレだからあげちゃダメ。
つーか該当部分を選んで全部こぴぺしとくわ。34はかなーりお役立ち情報だ。

6 ：名無しゲノムのクローンさん ：02/01/13 13:07
大腸菌のトランスフォーメーションの時、
アンピシリンで選択する場合は、
前培養（LBで一時間くらいあっためるやつ）は省略する

20 ：名無しゲノムのクローンさん ：02/01/13 13:35
前培養って、アンピシリン以外の抗生物質でも、
いらないやつある？
カナマイとかハイグロとかは？

24 ：名無しゲノムのクローンさん ：02/01/13 14:01
>20 転写／翻訳を阻害する抗生物質は前培養しないとだめ。
アンピシリンは細胞壁合成を阻害するので省略可。

34 ：名無しゲノムのクローンさん ：02/01/13 14:17
>>20
昔、そのテの手抜きに興味があって、いくつかの抗生物質（と、もちろん対応
する耐性遺伝子を載せたなるべくidenticalなplasmid）でタイムコースを
とって確認したことがある。

結論は、６の言うとおり、アンピシリンは、形質転換直後にまいても
一時間液培後にまいても、効率は全く変わらなかった。
一方、カナマイをはじめクロラムフェニコール、テトラサイクリン等は、転換直後
にまいた菌はほぼ全滅。
なにしろ10年近く昔、教官に隠れて趣味でやった実験なんでよく覚えてないのだが、
確かカナマイの場合、転換後15分ぐらいからコロニーがあらわれはじめ、1時間後
にはほぼ安定する。2時間以上液培すると再びコロニーの漸増がみられる。
おそらく液体培地の中で細胞分裂をはじめている影響と思われる。

妙だったのはテトラサイクリンで、どれだけ前培養しても、決して出現コロニー数が
安定することはなかった。だらだらと増えていくのみ。テットの薬剤耐性はかなり
特殊なんで（確か細胞膜のポンプ活性）、耐性が出るまでに時間がかかるのかな、と
思ったことを覚えている。
こんなんで役に立つかね。

39 ：1 ：02/01/13 14:37
ただし，これを読んでも，初心者にはいきなり教えない方がいい．
昔，後輩に，前培養の意義を教えてから，
アンピシリンのときはしなくて良いよ．
っていって，やらせてたら，
一年後に，そいつかカナマイでやったときにも前培養せず，
しかも前培養の存在すら覚えてなかったりした．
あるていど，基本的なことを覚えさせてから，
おしえましょう．

78 ：名無しゲノムのクローンさん ：02/01/17 01:03
なんでtransformationのときに抗生物質がアンピシリンだと前培養がいらなくて
カナマイシンだといるのかがわかりません。アンピシリンは細胞壁合成を妨げ、
カナマイシンが転写翻訳を妨げると聞いても？？？？
ヒントだけでもプリーズ！

80 ：名無しゲノムのクローンさん ：02/01/17 03:23
耐性遺伝子が発現する前に効いたらどうするよ。

81 ：Ｎ ：02/01/17 10:08
>78
静止期と細胞分裂がヒント。どの時点で耐性遺伝子産物が必要か、
考えてみたら分かる。
静止期にも翻訳は必要だろ。それがジャマされたらどーなるよ？
アンピシリン耐性なら、増殖期に入る直前までに獲得されていたら
OK。

>>142-144
エレクトトロポレーションの場合は必要だと聞いたが。
とにかく早くSOCを入れるのが効率に関わるって習った。
いまじゃ装置が無いから確かめられんが・・・
普通のプラスミドには関係のない方法だね

>145
ということは、普通のトラフォメの時と、エレポの時では、前培養の意義が違うってこと？
普通のトラフォメの時は、要するに抗生物質に対する耐性を獲得するために必要な時間。
ではエレポの時は？

>>141　再現性はあったようです。プラスミドが入ってないコロニーばっかりつついて
いたことがわかって、またそれを調べるために新品使って入ってないことを証明したり
してしばし落ち込み。カナマイシンにボコボコ生えてんじゃねー＞ＢＬ２１（笑

P3はlargeのカタログに載ってましたけど（アルカリ法のsolution3と同じ）
N3は載ってませんでした。確かに買えますけど、それでは裏技魂が（ｗ
っていうか、PEとかPBはどうされてるんですか？largeのQCとは多分違いますよね……
pH下げた70%エタノールでもいいのかな？pH4.2のS3も作って月曜日にでもトライしてみます。

ちなみに、うちの研究室は金はありませんので、使えるものは使い回すのが大好きです。
で、使い回しが自前でできるとミニプレップ48本とか気兼ねなく出来るのでいいなぁ、と……

>>129 qiagen miniprep kitはイオン交換と違ってシリカ系だよ(midiとかはイオン交換)。
P3にいっぱいchaotropic saltはいってんのがN3ちゃうの？

>143,144
ありがとうございます。更正部室はわかりました。
私はアグロのプラスミドはただ単に、
コピー数というよりもoriの違いかと考えていました。
オリの違い＝コピー数の違いですか？
完全なるスレ違いでごめんなさい

>146
普通のトラフォメの前培養は耐性獲得＆塩等の希釈。
だから、別に効率無視して生えればよいなら、滅菌水で希釈して播いても可。
で、エレポの前培養は菌体がパルスで穴開けられたダメージの回復では？
流石にそままだと死ぬだろ。

>150
>で、エレポの前培養は菌体がパルスで穴開けられたダメージの回復では？

プレートでは回復しないが、液体培地では回復するということか？？？
じゃあ極端な話、抗生物質の入ってないプレートにまいても死ぬのだろうか。

>>151
私がやった時はまだ学生の時でした。しかも普通の形質転換（化学法でいいんだよね？）
でもプレカルチャーはやるのが当然と思っていました。エレクトロの場合は装置の持ち主
のところに行って借りていたんですが、その人の説明が＞150さんと同じでした。
今、普通の形質転換でAmpの場合プレカルチャーをしなくなって＞151さんと同じ疑問は
あります。
で、持ち主はいろいろ試していたみたいで、パルス後、どれだけ早くＳＯＣを入れるかで
効率がよくなるかが変わってくると言っていました。

>>151
酵母ではプレーティングの時にガシガシ塗ると、明らかにダメージを受けるようです。
（コロニー数が少なくなる）
エレポ直後のヤワヤワ菌体の状態ではプレーティングのあの摩擦でもダメージになるのでは。
全く生えないとは思わないけど。
パルス後にＳＯＣを入れる早さで効率が変わるというのは私も経験あり。
プレーティングよりもＳＯＣを入れるほうが時間がかからないし、
パルス後に直接プレーティングしても効率悪そうです。
それではエレポの意味がない。

だれか電子レンジで大腸菌はやすプレート作ってませんか？
過去ログ見たような気もしましたがちょっと見つけられなかったので、、、
いちいちオートクレーブするのは面倒だよう。

>154
このスレの>>109と>>119を見よ。

>>109
>E.Coli用アガロース培地を作る時は専らレンジでチン。
>ラージプレップ用LBでもレンジでチン。
>>119
>フラスコの口をラップでクルクル巻いて筒作って、
>レンジで沸騰させる。急いでる時はすぐ水につけて冷やす。
>でもこの時ちゃんとしたフラスコ使わんとパリンといくよ。
>長期保存にはお薦めしないけど、トランスフォームして次の日の朝
>つつくなら十分使える。

でも、おいらなら、一度に1リットルくらいオートクレーブして普通に作って冷蔵庫に
保存しとくけどね。作りたては水っぽくって使いにくいし。

age

ついにネタ切れか、、、

まだ出てくるだろう？？？

part1からここまで、誰かまとめて...
え？言い出しっぺというのがパターンですか？
そういわずに。

前にもどっかに書いたけど、プラスミド回収の話。

アルカリSDS/イソプロ沈後のプラスミドをファイナル1.5mMになるようにスペルミジンを加えて10分遠心。50%イソプロ　w/　300mM
NaCl、10mM MgCl2でウォッシュ。シーケンスグレードのプラスミドの出来上がり。実際に読めたよ。

PCRプロダクトの精製には1mMスペルミン。'99　Vol. 17　p. 822　Natureバイテクより。

age

シーケンス用のサンプルをいちいちRNaseA→PEG沈する必要なし。
Alkali法のSolI、�U、�V→エタ沈したら、ペレットを100μg/ml RNaseA
入りTEに溶解して、そのままシーケンス。
シーケンスを邪魔してたのは、中途半端な長さに分解されたRNAだった…

>>162
同志よ。周りではなかなか信用してもらえないけどほんとにこれでうまくいく
から楽になったもんだ。サイクルシーケンスで伸長温度が上がったこともある。

うちはRNaseが薄いけど2時間37℃でたっぷり処理してた。濃くすればいいのか。

7年ぐらい前その方法でdye primerはやってたけどdye terminatorもうまくいくの？
最近はやり直すのは絶対イヤなのでキット使ってるなあ。

それよりそのグレードのプラスミドでトランスフェクションうまくいくかな？
QIAGENのプラスミド取りキットって説明書どうりの収量がコンスタントにだせなくて
困ってます。とっても高価なのに、、、

いろいろやってみた結果、MSDSにも書いてある（最初から見とけばよかった……）グアニジンHClを
10%ぐらい入れたpH4.2の溶液をN3の代わりに使うことでカラムに引っ掛かるようになりました。
MSDSには25ｰ50%って書いてあるんですが、20％も入れると再結晶しちゃうんですけど。。　ま、いっか
あと、KOAcの濃度も低めにしないと沈殿します（多分KCl）　だからN3もアルカリ法Soln3に比べてpH低めのものを
多めに入れているのではないかと思いました。
ちなみに、Qiagenに質問したところ良くある質問らしくて（ならFAQに書いといてくれ（ｗ）濃度は明らかに
できないがグアニジンSCNが入ってるそうです。確かにそっちの方がカオトロピックっぽいけど、ほんとですか〜？
で、PBの代わりに代用N3で、PEの代わりに70%エタノールで洗って溶出してます。

あと、これはオカルトかもしれないんですが、P1、P2、N3をマニュアル通りじゃなくてアルカリ法分量
（100、200、150μL）で入れたほうが沈殿がかっちりします。low copyのやつを6ml 2xYTカルチャーから
とろうとするとよくゲル状になってたんですが、これできっちり遠心できるようになりました。

ところで、アルカリ法Soln1のグルコースってなんで入ってるんですか？

Molecular Cloningの新しい版だとグルコース入ってないよ。

BACクローンをセシウムを使わないで、簡単に大腸菌から回収する方法ってありますか？
個体へのインジェクションに使えるグレードで。

あげちゃう

http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/olul/upld39/rakuchin/pcr.html

PCR単一バンドの出し方。
これって目には見えてないけど、ゲルが
２回目の反応チューブに入って反応阻害の
恐れないのですか？

>>169
逆にPCRアーティファクトが増えそうな気がする。
nestedならいいかもしれんが、、、。

>>169
値段の高いアガロースなら大丈夫だろう。
泳動前にバッファーを新しいものに変えておく事を忘れずに。

>>166 もう4版が出たの？はやいなぁ・・　ちなみに、3版はA1.16
グルコースの謎に関しては質問すれに行ってきます。
P1、P2、変性N3全部なくなったので現在作成中　
まぁ、RNaseAも買ったのでQiagenも許してくれるでしょう。
ちなみに、4度で保存したときに沈殿が出なかった変性N3でやったら
うまく行きませんでした。（ｗ　グアニジンHClは15%以上必要なようです。

グルコースはリゾチーム処理のために入れていた名残りじゃないの？

Sol 2を入れたときにpHが極端に高くならないようにバッファーとして
グルコースが入ってるそうな。Current Protocol in Molecular Biology
参照のこと。

>174
グルコースに緩衝能ってあったっけ？
浸透圧調整とばっかり思ってましたが。

確かにメーリングリストか何かのログにも同じことが書かれていました。
知らなかった。そういえばSol2は本来は用時調整だし、pHは重要なのか。

だからアルカリ法っていう名前がついたんじゃないの？

ミニプレップのカルチャーをふたをせずにやるのは常識？

基本。

>>169
そんなの基本

>>169
http://natto.2ch.net/test/read.cgi/life/1010893696/l50
こっちの７４
↑
こっちの方がレベル高いな

GILSON　ピペットマンの補正の仕方教えてくり

修理に出す。

シリンダーにシリコングリスでもぬっとけ。

補正じゃなくて較正

>>Gilson
講習を受けていない人にはチップコーンやOリング等、
売ってはいけない事になっているそうな、と言ってみるテスト。

みんなどれだけキットの試薬量ケチってる？
あびーのビッグ大、スケール半量、なんて普通？
１／４までオーケーって聞いたことあるけんど。

さあ、みんなのケチ具合を披露してくれ！

銀染色のキットは1/10までスケールダウン
（増感液・銀染色液・現像液。洗浄液と停止液は自作）
ゲルはサンプルローディングした分だけ切り取ることが前提
で、タッパーは１００均で売ってる中で一番小さいサイズ

HalfBDという薄め液があるけどどうよ?
>187

>189
おおおっ、なんだそりゃ。
初耳。
詳細キボン

Half BDでBDを1/8に薄めて使っていたけど、KOD bufferでもBD1/8希釈できることが
判明してからもっぱらKOD bufferで薄めている
以前は多少汚くても400bp程度は読めていたが、調製をうまくやらないと200bp程度しか読めなくなってしまった
最近ではアマシャムからDynamic ETとかいうDyeも売られていて、薄め液もあるらしい
あとは出入りの業者さんに聞いてみて

Half BDなんて、おそらくMgの入った緩衝液だろ。
自分でMg濃度計算して試してみろ、でるから。

ビッグ大でも、尼社務のでも、一回のシークエンスに1マイクロしか
使わない。それでもいい時は、600-700bp読める。

ちなみに薄め液は使わないことが多い。

>>193
それって、スケールは20ulのままでPremixを1ulしか使わない、ってことですか？

質問なんですけど、ウェスタン・ブロット法(エライザ法ともいう)の時間を
短縮したいんですけど、みなさんはどのようにやっているのか参考までに
教えてくれませんか？お願いします。

BigDye Ver.3
10ulの反応スケールで、
premix 0.5 ul
5xSeq B. 1.75 ul
primer 0.8 pmol
template 50 - 125 ng
MilliQ + n
これ以上はけちったことないです。
ふつうに読めます。

>>196
ttp://www.millipore.com/publications.nsf/docs/PC031
試してみる価値はあるかも。

>>195
スケールは5ulに落としています。
テンプレート量は、それが何か（PCR productか、通常のプラスミドか、BACか等）によって変えます。

>>196
どうでもいいけど、ウェスタンブロッティングとＥＬＩＳＡは
似て非なるものでは？
確かに抗原抗体反応を利用するし、ＨＲＰやらＡＰやら
用いることもあるだろうが、ウェスタンは電気泳動してからのものですよね。
当方厨房により詳しい解説キボンヌ。

>199
レスどうも。
5ulまで落としてるんですか。。。
なんかスケール落とすとエタ沈の時失敗しそうで、ちょっと躊躇してしまいます。

>>200
あ、突っ込んじゃいましたね････。
ちなみに私が貼ったのはウエスタンの方です、念のため。

裏技じゃないけど、教えて！ウエスタンの時、最後ECL発光で見てるんだけど、
その後のX線フィルムってなんでもいいの？前のラボではブルーバックの
透明なやつだったんだけど、こっちではXomat-ARっつうちょっとマットな
感じの磨りガラス様な感じのフィルムなの。

単に質感の問題だけ？それとも感度にも何かあり？
（コダックのHPにいってみたけどわからんかった。）

アマシャムでKodakの５倍くらいの感度のX-rayフィルムを売っている。
値段は３倍。
感光前（笑）のKodakXrayフィルムは汚い緑というかんじで現像後も青い色が残るが
アマシャムXrayフィルムは明るい黄色というかんじで、現像後はバックグラウンドの色はほぼ透明

AR>ブルーのフィルム（感度）
です。多分。
あまシャムのはしらん。

オートクレーブにチップとサツマイモをいれて120度20minで
かけると滅菌と昼ご飯の準備がいっぺんにできるよ。

つうかチップをボックスに詰めるのが面倒なんだけどいい方法
あります？

>>206

箱入り買うか、カセット式の買うか、バイトを雇うか、後輩にやらせるくらいしか思いつかんなあ・・・・・・
金のあるラボなら前二つでいいんだろうけど。

>>201
エタ珍時にはグリコーゲンを加えたりしています。
沈澱見えるのでなくなったことはない。

>208
あれ、グリコーゲン入れちゃっても大丈夫だったのか。。。
何となく、キャピラリーに害がありそうで嫌だったので、今まで躊躇してました。

ひょっとしたらそちらのシーケンサーははゲル板式ですか？

>>209
いえ、キャピラリー式です。
全く問題なしです。

>210
そうですか！じゃあ今度から試してみまっす。有益な情報さんくす。

>206さんを含めて質問なのですが（おそらく散々既出？）、
そんなにチップをオートクレーブする必要ってあります？
極端な話、袋にピペットマンを突っ込んで装着したって大腸菌や酵母の
トラフォメ程度ならコンタミしないですよね。
オートクレーブしたチップなんてRNA扱う時くらいにしか絶対的な必要を感じない.....
もちろん人によって事情はちがうのでしょうが。.

うちのラボだと制限酵素処理したDNAをゲルにアプライするときにさえ
オートクレーブしたの使ってるんですよ。
まあやってる本人がいいって言うのならいいんですが。

こんなことするのにオートクレーブ不要だってのありません？

>>212
> そんなにチップをオートクレーブする必要ってあります？

ないと思う。私は最近ほとんどやってません。
そもそも袋を開けた直後はきれいなわけだし、
ましてやnuclease freeが保証されてたら無菌も同然なのではないか？
無菌ではないnuclease free、という状況は、正直、想像できん。
昔、PNEだったか細胞工学だったかに「手抜き実験の勧め」みたいな連載があって、
その中でチップやチューブはオートクレーブしなくて良い、という話が出てました。
何が書いてあったかは忘れてしまったが。

> 極端な話、袋にピペットマンを突っ込んで装着したって大腸菌や酵母の
> トラフォメ程度ならコンタミしないですよね。

袋にピペットマンをつっこむのは良くないのではないかと。
ピペットマン自体はきれいではないわけだし。
その程度の仕事なら良いけど。

> オートクレーブしたチップなんてRNA扱う時くらいにしか絶対的な必要を感じない.....

RNaseはオートクレーブしても失活しないんで、あんまり関係ないと思う。
予算があれば、RNA用にはnuclease freeが保証されてる箱入りの奴を使うのがベストなのだが。

> うちのラボだと制限酵素処理したDNAをゲルにアプライするときにさえ
> オートクレーブしたの使ってるんですよ。

使い分けるのが面倒、というのも大きいのでは？

>>207
俺が一番下っ端ですｗ

>>212
まさにRNA扱っているんで.あとクリーンベンチ内で使うチップはオート
クレーブかけたものを使う約束になっているんで.でも>>213によると
RNase失活しないのかあ･･･ためになるっす。

何連もチューブ並べてその都度チップ交換するときチップがボックスに
入っていないとまどろっこしくて.そういった意味でもチップ詰めが必要
です。

>>214
以前はRNAを扱うチップは滅菌してましたが、最近は滅菌してません。
DNase、RNase-freeのチップでもないです。
ノーザンやin situをする限りでは影響は出てないです。
213にもありましたがオートクレーブではRNaseは失活しませんし。

オートクレーブ、意味無いと分かってるんだけど、
ついやっちゃうなあ。
やんないと気持ち悪い。
まあ、おまじないみたいなもんかな。

>216
儀式、みたいなもんですかね(w
そういえば、「ちゃんとした」プロトコルは「儀式」ばっかりだったりするよね。

そうそう。儀式が大事

なあ、ところでdouble digestionでつくったベクターも脱リン酸化しないといけないのか？

>>219
２カ所のうち１カ所が切れ損なった分子があるだろ。

チップをラックに詰めるときって素手でやっていますか？
オートクレーブかける/かけないどちらでもいいんですが。

>>220
そんな微量な分子は無視してよろし
それにそこまで言ったら1カ所しか切れなかった分子がちゃんと
脱リン酸化しているとは限らない

>>221
じゃあしなくていいのか？

>>221
素手では絶対にさわらない。オートクレーブにはかけない。
慣れればチップ立てに立てないで、チップの入った袋からピペットマンの先で
チップを拾って使うこともできるらしい。

>そんな微量な分子は無視してよろし
近接していると（つか往々にして近接しているが）切れにくい事ってあるじゃん。

>>222
CIAP処理くらい、するもしないもヘッタクレもないだろ。
あんなもん、制限酵素処理の時に一緒に入れてやれば十分。
手間は変わらん。いいから入れとけ。

BAPのほうが好き

うちのラボにはCIAPしかない。BAPってそんなに良いのか？

BAPの方が丈夫だという話はあるけど、データとったことはないなあ。
SAPはどうなの？

ゲル精製するならよほどのことがない限りdouble digestionで脱リン酸化の
必要はないと思うけど、ゲル精製したくないときとかライゲーション後に出る
コロニーがあまりに少ないときとか、インサートの入ってる率が少ないときには
有効だとは思う。

昨日KpnI/BamHIで切ったものをSAP有り／無しでライゲーション／
トランスフォームして播いたところ、SAP無しではインサートの有無で
コロニーの差がほとんど見られなかったよ。SAP有りではインサート無しでは
コロニーはほとんど出ず。
結構酵素を入れて３hr切ったんだけど、Double Digestionで普段のバッファー
（KpnI:Low BamHI:K）ではないもので切ったから、酵素の回転が鈍ったかな？
だから、もし自分で十分にきれてる自信がなかったらSAP(BAP/CIAP)処理
する事をすすめます。
ちなみにSAPはフェノクロで除く必要がないから超楽です。

おれはベクターの方を３ヶ所で切る。これ最強

あんまり隣同士だと切れない場合がある。

どっかのBAPってEDTAで失活するのがあったけどどこだっけ。

>>227
そのやり方ではStar活性で変なところで切れてしまうかも
と言ってみるテスト。
NEBのカタログはかなり制限酵素について詳しいです。

Takaraのdouble digestionの所を参照にしてみたが。。。。

確かにNEBのカタログだとsequencial推奨になってる。
一方、俺もよく参考にしているTakaraのカタログに出てるDouble Digestion用の表だと
0.5x K Bufferを使うように書いてあるんだけどね。
もっとも、BamHIの項を見ると低イオン強度下で認識配列がゆがむと書いてあるけど。

KpnIはTritonを混ぜると劇的に切れるようになる。

というか、入れないと結構残るときがある。

フリテンＢＡＰ。

>>227
最低でもスピンカラムくらいはかけたんだろうな。
短いkpnI-BamHI断片が組み込まれたからAPなしでインサート無しコロニーが
増えたんじゃないのか？

漏れは酵素量が多くて長時間の反応はちょっと不安だな。

前にこの板で抗体反応の時にパップペンの代わりに何かを使うってのを見た気がするんですが。
なんでしたっけ？普通の油性マジックとかでいいんですかね。
とりあえず油性マジックでもいけるかな、て感じではありましたけど。
免疫組織化学やることになったんで誰か教えてくださいな。
あ、免疫組織化学に関する他の裏技もあったらよろしくです。

パップペンかえよ

ちなみに俺が覚えてるのは、エタノールなど揮発性気体をしみこませた
キムワイぷを近付けると液体がどっかいく。とか、
封入はマニキュアで。とか。
はいぶりのカバーはパラフィルムとか。

エッペンチューブの中身をまぜるには、
ちびたんのふたを開けて回転させながら指ではじく。
酵素入りのときは優しく弾く。こうすればスピンダウンと撹拌がはやくおわる。

微小電極の作り方のコツを誰か教えてください。

ガラス管にKCｌをつめるやつですけど。

コスミドぐらいのサイズのDNAってQIAGENのカラムでELUTE
の効率悪くなることありますよね。
eluteを効率よくさせる裏技もってるひとキボンヌ

80Cぐらいに熱したbufferを入れて出すのでは？＞サイズの大きなプラスミド

>>241
BACやcosmidの場合、65℃のQFでelute。
QFは、途中で冷えないように、暖かいのを少しずつ加える。

>242, 243
情報あるがとう！８０度というのは
プロトコルの６０度よりかなり高いけど
大丈夫なんでしょか？
温度が高いほどエルートしやすくなるのかなあ。
途中で冷えないようにというとこ
までは気を配ってなかったから参考になります。
でははじめは６０度で少しずつ加えて１回Eluteし、
２回目で８０度くらいのをくわえてみるっす。

>>240
引く力を弱めにすること。
段の間の冷却をしっかりすること。

初心者っす。
PCRからのdirectにsubcloningするときの、ベクターのお奨めありますか？
今は、TOPO使ってますが・・

http://bestranking.misty.ne.jp/gamble/enter.cgi?id=hhitosi

魚類・エビ類を簡単に突然変異させる方法はありますか？
マウスはエチルニトロソウレアを使っているのですが。
家に持ち帰ることができないように完全管理されています。（当然ですが）
紫外線灯だといまいち反応がありません。
何か一般家庭・ホームセンターで入手できる物を知りませんか？

やっぱUVだろ。水やガラスはUVの吸収が良いから、UVかけるときは浅い
プラスチック容器に入れてやんないとダメよ。成体にかけてもいまいち
だから卵にね。

おまえらピペットマン両手に持って同時に分注できますか？

EMSもってかえればいいじゃん！

>250
チンコだったらどちらの手でもオナれますが、何か？

>252
マンコだったら洗わなくても舐めれますが、何か？

>253
すごい特技を持っているな。
おれには真似できん。

細胞の培地は暖めなくて即ぶっかけ。これ最強。

CIAP処理しても出てくる空のベクターは何で出るの？
沸けわからん！！かなり強い酵素らしいけどさぁ
惨めな卒論製にあいのてを〜

制限酵素の処理が不十分か、CIAPの処理が不十分。
というか、完全に無くすのは無理でしょ。。。。

つか、そんなことも自分で解決できない卒論性は
惨めな卒論発表会を迎えてもらいましょ

age!

そもそも切れとんか？
処理したての（ligationやらんの）トラホしてみれ。

>>256
少しは自分で考えて。
それと、いろんなコントロールはとっているんだろ？

アガロースゲル（低融点でないもの）からの核酸の抽出法に関する
ウラ技があれば教えて下さい．よろしくお願いします．

切り出したゲルをパラフィルム中でｸﾞｼｬってつぶして出てきた
駅を回収するだけでよい、と言っている人もいる。

>258
問題点を解決するのはいいと思うけど、本当に興味を持たない限り、
CIAP処理が完全に行かないくらいどうでもいい気がするな。

>256
酵素反応の基礎すら解ってない君には留年がよく似合う。

>262
GENE CLEANつかえ
いまどき低融点アガロースなんて使ってる時代じゃない

>>263
シグマのカラム通すだけでOKな奴も同じ原理か。
（て言うか原理もヘッタクレもないわな）
一応途中で活性炭を通してエチブロ除けるように工夫してあるが。

質問です！　エチブロをなるべく無害に捨てる方法はありますか？
できれば簡単でお金も余りかからない方法で。

あまり効果がないとも言われているが、
漏れは次亜塩素酸で処理して捨てろと教わったな。

それは色が消えるだけで、発癌性を高める処置といわれてるよ。
たしかMCに書かれてる方法は、活性炭に吸着させてろ過して捨てる方法
だったと思う。ろ液は排水へ、ろ紙と残留物は燃えるゴミへ。

その具体的な商品とかはないですか？

フツーに活性炭買えば？和光から買えるぞ。
ただし、そんなに安いものではなかった気がする。

>270
一行目のソースキボン！
ＭＣ？

ＭＣだったと思うよ、だい２版には書いてある。３版はしらん。

要するに発ガン性物質の多くはDNAアダクトを作ったりするのが多いけど、
そのままでは反応性は低く、体内で代謝活性化されてDNAとの反応性が高くなる。
絵津風呂もじあえん処理で反応性が高くなるってことなのかなあ？？

と勝手に解釈してみる。

>268
活性炭を使うのが一番最高！
小はPD-10カラムから大はBIO-RAD社のエコノカラムまでどんな大きさでもイイから
カラム内に粉末状の活性炭（ペレット状のはすり鉢で粉砕しておく）を詰め込んで
上からエチブロ廃液を通すとエチブロを含まない濾液がでてくるのでこれを流しにすてればよい

筆者はこの活性炭カラムでSDS-PAGEに使うCBB脱色液を完全脱色して再利用している
（言うまでもないがエチブロ処理用とCBB脱色用の活性炭カラムは別に分けて使うこと）
CBB脱色液をキムワイプで脱色する方法よりはずっと効果的に脱色できるよ！
ただ活性炭を混ぜて抛っておくのではダメで必ずカラムを作っておくこと。
ついでにアミドブラック10B脱色用の7%酢酸もこれで脱色可能


できればミリポア社純水作製装置の活性炭カラムが交換時期にきたときにこれを引き取って
エチブロなりCBB処理に使うと良いが
たいていどこの実験室でも活性炭が紙の箱に入ってころがっているはずだから
探してみてもよいだろう

参考文献：細胞工学Vol.18 Nq.11 1999 1696-1697

あっそうそう言い忘れていたけど
活性炭カラムを作製するときには
カラムの底に脱脂綿でもグラスウールでもいいから
透水性のある緩衝材を詰めてから活性炭を入れておくべし
そうしないと濾液に活性炭の粉塵が混ざって出てきて
訳の分からないことになってしまうから（笑）

??
えちぶろなんて流しに流して終了でしょ？

>>277
市ね。

え？まじでだめなの？
あたりまえに流しに捨ててるけど、
なんかもんだいでもあるのか？

>277
　　　　　　　　　　　　　　　　 ヽ ｌ /／
　　　　　　　　　　　　∧＿∧(⌒) ―― ★ (ｱﾚｰ）―――
　　　　　　　　　　　 （　　　　） /|ｌ　　／/ | ヽ 　　逝ってよし
　　　　　　　　　　　（/　 　　 ノｌ|ｌｌ ／　/　|　 ヽ
　　　　　　　　　　　 （Ｏ　　ノ 彡''　 　/　 .|
　　　　　　　　　　　　/　 ./ 〉
　　　　　　　　　　　　＼__）_）

E.Coliごとtransfectionこれサイキョー

我が家で一通りの実験ができる、これ最強。

絵恥部炉も菌もガンガン流してるけど、アメリカだから気にしない

>283
ぞぉ〜

おれも菌もエチブロもホルマリンもがんがん流してるけど常識
灯台だし。

>285
朝日に通報すますた！！！

名○屋じゃRIもながしてたなあ。

俺は夜になるとギター担いで各研究部流してましたが、何か？

>>246
TOPOはどうなの？

生物分子応答研究センター裏の池が夜中にぼぉ〜と
チェレンコフ光みたいに発光しているのはヲマエのせいかっ！＞287

>288
面白い。是非狂大にきなはれ（ｗ
ここで流せるのはヲマエのギターだけだよマジで
それ以外のものを流すと助手にボコスカにやられるもんね

>>270
Trends Biochem Sci 1994 Jun;19(6): 257-258
確かに発ガン性は高くなるらしいが、現実には
「自然に返そう」「キャッチ・アンド・リリース」（←うそ）
をしているラボが多いようですね。
　粉末状の活性炭は飛散性が高くて扱いづらいのですが、
このくらいは仕方のないことでしょうか。

>>291
残念ながらライバル灯台所属です。

野依に逆らえる奴は誰一人いないのか、、、、、＞287

>>294
医学部が、、、。

貝渕センセが、、、？

うらびでおならたくっさんもっています

ぺーぺーよ　　　逝かぬか

∧||∧
（　 ⌒/
　∪ /　/　ヽ
　　　　/>>297ﾉ
　　　 ∪∪
　　　　　　　　 ∧ ∧,〜
　　　　　　　　( （⌒￣ `ヽ　　　　＿
　　　　　　　　　 ＼　 ＼　`ー'"´, -'⌒ヽ
　　　　　　　　　/∠＿,ノ　　　 _/_
　　　　　　　　 /（　ノ　ヽ､＿/´ 　＼
　　　　　　　､（ 'ﾉ（　　　　　く　　　　 `ヽ､
　　　　　　／`　 　＼＿＿＿_>＼＿＿_ノ
　　　　 ／　　　　　　 /＿_〉　　　　 `､＿_>

>>298
ありがとう。友達にならへん？

300げと

誰か作るとは思ったが、虐殺シューティングゲームとかではなく、
ほのぼのアドベンチャーゲームで来るとは意外だった。。。
エンディングのタマちゃんとの別れは泣けた。。。

「タマちゃんの海までの脱出ゲーム作ってみたよ　part４」
http://pc3.2ch.net/test/read.cgi/jisaku/1032099641/l50

人人人　　人人
　　　　　　　　　＿＿＿
　　　　　　 ／　　　　　　ヽ　　　人人人　　
　　　　　／　　　　　　　 　ヽ　
人人　 /　　 　 　 ●　　　● 、　　　　　　　
　　　／　 　　 　 　 　 　 　 v　l　人人人
　 ／　　 　 　 　 　 　 , 、_ _人_ノヾ　
人人　　　　　　　　　　　　　ノ　人人
　　　　　　　　　　　　 川川
　　　 人人人　人人　

効率良く実験するワザありますか？

みんなの工夫をおしえれ！

大腸菌をゆっくりはやしたい場合、
例えば日曜の朝だけ学校にきてトランスフォームしたり液体培養したいとき
30度で培養するといいとおもうんだけど、どお？

やっぱりコロニーPCRしてそれをシーケンスするのに慣れると
いちいちミニプレする気がなくなりました。

ｲｲ！

ミニプレなんて機械がやってくれるじゃん

実験の空き時間に実験を入れるぐらいか？
そうすればいくつか同時にできるでしょ。
俺の後輩はできんが・・・。
みんな、いろんな実験をどのくらい同時にできる？
例えば、ノーザンやりながら、ウエスタン、IP、キナーゼ活性測定、
あんど、FACS解析＋顕微鏡による細胞観察とか。

漏れはその時間をペーパー読む時間にあててるからなあ・・・

>>307
年とって来ると、精神的にできなくなってきますよ

>307
万一失敗とかして、上手くいくはずの実験がだめになったらかなり泣けてきます
漏れは普通は2.欲張って3.3は転ぶことが多いです

>262
チップか楊枝でバンドをつついてPCRとかではなく？

がいしゅつかもしれませんが
制限酵素切断部位付加したinsertをPCRでとってベクターと
制限酵素で切って、ベクターをCIAP処理した後
どっちも少量泳動してみたらワンバンドだけだった場合
ゲルから抜かずに直接gene cleanのようなカラムで
purifyしてligationしていいのでしょうか？

>312
後でsequenceするなら何でもOK

手間とかUVの問題をかんがえれば直接purifyの方が
いいようですが、ligationの効率はどうでしょうか。
あとワンバンドにみえても別のサイズの断片がコンタミ
してる可能性はあるからミニプレップの数を増やした方が
いいでしょうか？

>315
ミニプレを増やすのが一番簡単なのに何故それを惜しむ？

>>315
何故それを惜しむ？

電気泳動撮影装置ありますよね。
高解像度のCCDカメラでゲルの写真を取るやつ。
赤貧ラボなうちは、そんなものはもちろん、ポラロイドの使用もママならないのですが
市販の100万画素ほどのデジカメを使って、上記の撮影装置のような
役割を果たさせることができるのでしょうか？

さー？
っていうか、写真なんて実はほとんどとらなくても良いような気がするな。
上から覗いてスケッチしとけよ

>318
友人も同じ理由でいらんと言います
ただ私の実験はたくさんサンプル流して、バンドたくさん出て
それらを比較していくのでスケッチより写真のほうがいいんです

100万画素もあれば十分だと思うけど、必ず接写ができるやつを選んでください
最近はどこでもスキャナが余ってるので、どこかから拾ってきてそれで取り込む
という手もありますよ

>>320
できるの？
サザンとかと勘違いしてない？

放射線を直接デジカメで撮影する話だったの？
アイヤ〜　勘違いアルヨ　すまん　つうか、勝手に混乱

エチブロ染色+UV照射です

デジカメでとれるかどうかは実際にやってみれば？
癌にならないように気をつけてね

とれるよ、普通に。
だけどね、あのフードみたいのがないと使い辛いンよ。
いちいち部屋を暗くせんといかん。

オレンジのフィルターがあった方がいいのか、
なくても感度変わらないか、検討中。

ほー。良い事聞いた。
フードつかうときはファインダーとかを取り除くの？

誰かRabbit&Rabbitの抗体で蛍光で２重染色する方法教えてくれませんか？
monoclonal Abではどうしても染まらない抗原２つを
どーしても同じ細胞に発現してるかどうか確かめたいんです。
時間もないし、誰か助けて下さい。

この前、画像ファイルを貯めといたハードディスクが跳びマスタ
ポラがあるんならオレンジフィルターもあるんでしょ。ないとバックグラウンドの蛍光灯があやしい
雰囲気を演出してくれます。
フードはレンズが入ってて接写機能を補ってくれるんだけど、うちのデジカメではシャッターボタンが
押せなくなるので使ってません。ぶれやすいので何かしら台は必要。今はキアゲンの空き箱。
トレーからゲルを出したほうがきれいに撮れることに最近やっと気がつきますた。。

>328

トレーによってはUVシャットダウンで
全然バンドが見えないってやつ無かった出したっけ

>>327
免疫組織染色？　FACS？
1次抗体の片っ方をDNPやFITC標識する時間もない？

免疫組織染色です。

>>331
一番手っ取り早いのは，ミラー切片（完全に隣り合った連続切片）を作製し，
それぞれの1次抗体で単染色する，かな．．．　データとしては写真を並べてみせれば問題なしかと．

次に手っ取り早いのが，
まず抗原AをFITC標識2次抗体で検出して乾燥させないように手早く写真撮影する．
その後で，低pHのグリシンbuffer処理か熱処理して抗体をはがす．その後で2回目の染色により
抗原BをRPEで検出，一回目と同一の部位を撮影する．そんでフォトショップ上で合成する，と．
これは最低限片方の抗原性が，low pHか熱処理されても維持されることが前提だけれど．

まだ他に方法が無いわけではないけど，とりあえずこんなんでどう？

お付き合い下さいましてありがとうございます。
できればコンフォー刈るで油侵レンズでとりたいので同時に撮影したいと思って
ますので、ちょっと・・・なんですが。
抗原A rabbit 1st Ab→標識2nd Ab→何とかrabbit IgGsを不活性化する
→抗原B rabbit 1st Ab→標識2nd Ab
でなんか良いのないですか？

>>333
共焦点でしたか，，，，，経験ないです．

>→何とかrabbit IgGsを不活性化する
実はそこらへんについて考えたことがあるのですが，，

切片上では，抗体Aの（二次抗体に対して）抗原性を持つ領域は一回目の二次抗体によってほぼカバーされてしまうと思います．
ですから抗体Bの反応の後の2回目の二次抗体（少なくとも1回目のものと同じ動物種だったら）は抗体Aには結合しえない，
もしくは結合しても無視できるレベルでは？と．
そう考えると，一種類づつ反応すれば事実上問題はないことになっちゃうんだけどね．

その場合むしろ問題なのは，一回目の二次抗体の残った片腕が2回目の1次抗体Bを捕まえちゃって（3次元的に可能か？ｗ），
二回目の二次抗体が抗原性剥き出しのままの一回目1次抗体に結合してしまうことなのでは，と妄想しています．

ここで抗体Aかウサギ正常血清でもかましてあげるってのは？1次抗体の片方でもmAbならこれで理論上も問題は解決なんだけどね．
私はマウスmAb/マウスmAbで手早く目星をつけたいときはとりあえずそうしてます．光学レベルだけど．

余談ですが，FCMレベルの感度でも、この方法で経験上問題はないよ．
といってもこの感度レベルだったらブロッキング自体しなくたって，
2回目の2次抗体の交差反応は感度の上では問題ないかもしれないけど（汗）．共焦点では？　

え〜，意味不明なこと長々と書いてスマソ．
やっぱ結局のところ，抗体をFITC標識する時間ぐらいないっすか？っということです．
私ではお役に立てそうにないですね，スマソ．いい方法見つけたらここでオセーテくださひ．

＞317，325
ソニーのフロッピーカメラ買ったとき
オシロ用フードってオプションがリストされてた
ポラについてるフードってもともとオシロ用なので
逝けそうな気がする
あとはフィルターだな
ただしjpeg記録だから実はデータをわからないように抜いてる

ここを見てるカメラ小僧いる？
レンズ径／規格とオシロフードの関係について解説ｷﾎﾞｰﾝ

セントリプレップで濃縮した液を、無駄なく回収する裏技知りたい？

おしえなさい

1．厚めのシリコンチューブを5ミリぐらいの長さに切ったのを用意する。
　　（太くて小さい輪ゴムのようなものなら何でもいい）
　　で、それをきれいに洗っとく。

2．濃縮液と炉液を回収したあとのセントリプレップの底に1を入れ、
　　再びフィルターを装着．
　　（つまり、カップの底とフィルターの間にはさむ）

3．1分ぐらい回す。

4．ふたをあけて、出てきた液を回収。
　　フィルターに染み込んでたのとか、管壁についていた液も、
　　しっかり回収できる。
　　（50~100ulぐらいは増える）

おためしあれ。

>>338
わかりにくい。
2の部分をもう少し詳しく書いてYO！

>>339
セントリコンで濃縮液を回収するときは、
フィルターをひっくり返して遠心すればええやん。
でもセントリプレップはそれができなくて、
管壁やフィルターについて残った液を回収するのって大変だよね。
ここまではいい？

セントリプレップを普通に使うと、中の液が少ないときは、
フィルターが底にくっついた状態になるやん。
で、くっつかないように外側の容器の底に、
何でもいいから5mmくらいのスペーサーになるものをいれて、
内側の容器を装着する。
5mmぐらいまでの厚さのものなら、はいってても蓋を閉めることができる。

その状態で遠心すれば、
残りの液が全部底に溜まるということになる。
まだわかりにくいか？

MaxiprepをLi法やPEG法でやると吸光度に比べて
AEPでのバンドのEtBr発色から求めたプラスミド
濃度が５〜10倍くらい低くなるんです
（後者はNEBラダーの発色程度と比較してます）。
特にLi法で著しく、またPEG法だと収量（ここでは
ペレットの見た目の大きさ）がずっと少ないです。

やり方でどっかまずいところがあるんでしょうか？
なお、RNase Aは0.1 mg/mlの濃度で使用しています。

上読んだらMiniprepキット、使い回せるらしいですね。
できるのならMaxiprepのキット、使い回そうかな？

AEPってアガロース電気泳動の略か？

RNAが残ってるに１票。Li沈澱だけでは絶対に除けない。
PEG沈ではほぼ除けると思うんだけどなあ。

>>342
> RNAが残ってるに１票。Li沈澱だけでは絶対に除けない。
やっぱりそうですよね。
> PEG沈ではほぼ除けると思うんだけどなあ。
うーん、あたりをRNaseで汚染させないようにイソプロ沈
してからRNase Aで１時間処理してるんですが。。。
もう少し処理をきつくしてみようかな。
でもPEG沈でOKの筈なんですよね。
腕が悪いのかなー。頑張ってみます。
ありがとうございました。

>>340
さんきゅ
わかったYO！

ん？フェノクロしとらんの？
>>343

植物からのDNA・RNA抽出について教えてください

CATBやキットによる核酸の抽出
この時に、材料が普通の植物体でなく培養植物（特に水浸状化植物）の場合
試薬の量は増やす、減らす、という経験則・一般束はあるのでしょうか？

使用したアガロースゲルはレンジでチンして再利用、というアドバイスがありましたが
この時、もしくはその後、TBEやエチブロ、アガロースを加える、ということは行うのでしょうか

実験の裏技ではないかもしれないけど…
クリーンベンチの中に時計が欲しいとｵﾓﾀ。
だれかやってる？orオススメの時計は？

フナ□シあたりがソーラー駆動のオークレ可の吸盤付き時計出してくれたら
うれすぃのにｗ

>348
時計にアルコールかけて入れたらいいんでは？

>>349
いあ、そーいわれると元も子もないんだけどｻｧｗ
内部がコンタミの源になったりとかしないかなと大げさな心配してみた。
でも中にあったほうが視線移動少なくてすむしなぁ、と。

あと置時計はスペースが勿体無いし、かといって掛け時計つってもフックなんて
つけらんない上に小さいのがあんまりないのでどうすっぺ？　というのも。

>>346
QIAGENのキットを使ってカルスからゲノム抽出したことありますが、プロトコールどおりでも抽出できました。
量はかなり少なかったですけど。

>351
ありがとうございます
ということは、培養植物の場合、充分な量が欲しかったら
プロトコールより大目のサンプルを投入しる、ということですね

>350
うちのは中から外に風が出るタイプですが
かなり適当にしててもコンタミって全然しません
むしろ、梅雨時期がひどい。気をつけててもバンバンコンタミ離ます

>>353
ああいうガラスついてない方がコンタミしにくいの？
イメージ的には逆なんだけど、、、、
他のラボの人もオープンのほうが大丈夫とかいってたなあ。

>354
ついてる部屋の人がこっちのやり方見て唖然としてた
特に俺は適当だから。
ベンチ使う数十分前から殺菌灯使ってたりするのを見ると大変そうと思う

ctab

もう最近のガキはやらないだろうけど、
ファージDNAを取るときは、大腸菌がほとんど溶けちゃうくらい大量に
ファージを播くと収量がｲｲ
で、stratageneのキットで精製すると完全に切れる

最近のガキがやらないこと

deletion反応
sequence gel自作
plate lysate
mineral oil PCR
RI labelling
超遠心

ガキです。
下の三つはたまにやりますが･･･。

まあmineral oilつかってPCRしたからっていばることじゃないような気がするな（w

そういや裏技
480を使ってPCRするときはブロックにmineral oilをたらして
チューブとの密着をよくする（w
こんなもん誰の役にも立たんな。今さら

＞358
今でもウレア計ってますけど何か？

miniprepのときsol.3に加えてから最終濃度２M酢酸リチウムを加えて、氷上３０分置く。
その後、普通に遠心。上清をEtOH沈。

RNaseA処理しなくても、＞0.5kbpのDNA断片はRNAにかぶらない。

RNaseくらい気にせず使おう！垂れ流そう！

植物系です
DNA抽出について教えてください
培養植物の場合，抽出過程に培地が混ざるのはダメと聞くのですが
混ざった場合の悪影響はどの段階で出るのでしょうか？
PCRでの反応の悪さでしょうか？それとも低い収率のような，もっと前から出るのでしょうか
（EX．得たチンしてももやもやがあんま出ないとか）

>>327
経験ありませんが、一次抗体をそれぞれ直接ラベリングとか
できませんか？
ラベリングキットとかって売ってますよね

>>365
制限酵素で切れないとか、DNAが分解されやすくなるとか。
まあPCRくらいなら平気じゃない？少しくらい混ざっても

>367
ありがとうございます

実験に明け暮れてカサカサになった手
どんなクリームよりも
鼻の頭のあぶら
よくのびてしっとりします
やっぱ天然物はえーわー

グリセリンと尿素を水に溶かしたものが、ハンドクリーム代わりになるそうだが

グリセリンカリ液（＝ベルツ水）が
化粧水として薬局で今でも市販されているぞい

クロンテックのPCR-Select cDNA Subtraction Kitなんですが，
mRNAはタカラのOligotex dT30 mRNA Purification Kit
をマニュアル通りに使ってサンプルにしてやっています。
しかしアダプターのライゲーションが添付の骨格筋mRNAだと
そこそこ行くんですが，自分のサンプルではうまくいきません。
サンプル自体に不純物があってもライゲーションの行程までに
2nd cDNA合成とRsa I 処理後の精製があるので除かれてると
思うし，Rsa Iでスメアなバンドはちゃんと低分子側に移っているし
どこが悪いのかわかりません。
　マニュアル通りに行かなかったのは，Rsa I，90分処理では切れず
オーバーナイトにしたことくらいです。あと，テンプレートと
アダプターのモル比（当然スメアなので概算ですが）も1：1〜
1：30まで変化させてみましたが，自分のサンプルにはライゲーション
の形跡無しです。
　高いキットなんで教授の視線が怖いです（サブトラクトで得られる
cDNAの種類がかなり多くなると思うのでクロンテックに
やってもらいたくはないし上の人の人たちも同じ考えのようです）。

なんか裏技があるようにしか思えないんですが，うまくできた方，
こうしたらいいというとこ教えてもらえませんか？
お願いします。

2ｃhで聞くなヴォケ

そのキットしらないけどさ、アダプターが変性してるんじゃないか？
ヒートブロックで70度で五分くらいあっためて、で、
ヒートブロックごと四度の冷蔵庫にいれて、一時間くらい掛けてゆっくり
4度までもってくと、アダプターがきちんとアニールし直すよ。
で、ライゲーションしてみなさい。
当然アダプターのモル数は多めの方が良いね。

まあそれ以前にいまさらサブトラクションかってきもするけど

アレーってか

>>374
ありがとうございます。
言われたとおりやってみます。
ただポジコンのキット添付のサンプルでは
ある程度ライゲーション、行ってるんですよね。
そこが簡単に説明つかないというか、よくわからないトコで・・・

アレーですか？
うーん、金のことは俺にはよくわからんです。
それに安くて遺伝子を網羅して再現性がよいってのは
まだ無いと聞いてましたが、実はそこらへん勉強不足です。
ちょっと調べてみて話してみようかな？

>>372
アダプターライゲーションがうまくいかない理由とは関係ないかもしれないが
私の経験をひとつ

最初のmRNAのPurity、すなわちmRNAの絶対量も重要
可能ならOligotex dTは2回かけるべき
泳動してKit添付mRNA並に、28S&18Sが見えなくなって、mRNAがぼ〜っと
見えるくらいまで精製する
Candidate Cloneがとれた後にノザンかRT-PCRでスクリーニングすることに
なると思うがその時の陽性率が上がる。その時陽性率5％とかだと、結構つらいよ。

>361
Glycerolの方が安いよ

>>377
> 泳動してKit添付mRNA並に、28S&18Sが見えなくなって、mRNAがぼ〜っと
> 見えるくらいまで精製する
2nd cDNAを泳動したとき確かに私のサンプルは28S&18Sが見えてたけど
添付サンプルのものは殆ど見えてなかったです。

> Candidate Cloneがとれた後にノザンかRT-PCRでスクリーニングすることに
> なると思うがその時の陽性率が上がる。その時陽性率5％とかだと、結構つらいよ。
わかりました。それはつらそうです。

> 最初のmRNAのPurity、すなわちmRNAの絶対量も重要
> 可能ならOligotex dTは2回かけるべき
考えはしたんですが、total RNAからmRNAを取る１回目はよいとして、
絶対量がtotal RNAの数％に下がるｍＲNAを再度Oligotex dTにかけたら
モノが無くなってしまうんじゃと思って踏み切れませんでした。
小さい組織からのprimaryな細胞なもんで。
でもやってみます。ところで２回目のOligotex dT、量をもし減らしたんなら
どれくらいまで減らしたのか教えて下さい。お願いします。

精製したmRNAは何に溶かしてる？

>>380
Oligotex-dT添付のDEPC処理水で溶出しています。
2nd cDNAを作るまではそのまま一気に作業を
進めているのでRNA標本の段階で一晩保存
ということもしてませんが。。。

全然関係ないんですけど、
レトロウイルスラベリングって
どういう技術で何に使われるんですか？

>>379
書き込み遅れて申し訳ないです。

>絶対量がtotal RNAの数％に下がるｍＲNAを再度Oligotex dTにかけたら
>モノが無くなってしまうんじゃと思って踏み切れませんでした。
>小さい組織からのprimaryな細胞なもんで。

気持ちは分かります。どれだけ重要な&手間のかかるサンプルかとの兼ね合いですね。
僕は幸い量には苦労しない臓器でした。

>ところで２回目のOligotex dT、量をもし減らしたんなら
>どれくらいまで減らしたのか教えて下さい。お願いします。

これは、2回目だからという理由では減らせないのでは？
結合させたいmRNA量は変わらないわけだし。
ただ、僕は1回目から600 ug total RNA/Oligotex 200 ugまで
ケチってましたが、問題ありませんでしたよ。
メーカー推奨量の1/3くらいだっけ？

二回oligotexやると一回目の1/5〜1/10位にしかへらないよね

>Oligotex 200 ugまで
Oligotex 200 ulの間違いでした。申し訳ないです。

すいません初歩的なことですがアガロースゲル電気泳動で
バンドをシャープに美しく出す方法ってありますか？
写真にとるとなんかぼやけるので。

>>386

それは元々バンドがぼやけてるのか
それとも写真に撮る段階でぼやけてるのかを
はっきりしてもらわんと答えようがないぞ

ピントが合ってないんだろうな。
もしくはバッファー濃度がゲルとちがうとか
ゲルがかたまってないとか

http://www3.to/12345678

PCRをして複数バンドのうちに一本の配列を見たいと思ったとき
みなさんはどのような方法を取られますか？ラボによってまちまちだと思いますが

> 書き込み遅れて申し訳ないです。
いえ、とんでもないです。どうもありがとうございます。
　
> 気持ちは分かります。どれだけ重要な&手間のかかるサンプルかとの兼ね合いですね。
目的を考えれば優先順位は決まってますから
がんばってとってみます。

> これは、2回目だからという理由では減らせないのでは？
> 結合させたいmRNA量は変わらないわけだし。
なるほど、訊いてよかったです。
ゲル濾過とかと同じ様な気でいました。あぶなかった。。。

> ただ、僕は1回目から600 ug total RNA/Oligotex 200 ulまで
> ケチってましたが、問題ありませんでしたよ。
> メーカー推奨量の1/3くらいだっけ？
私はOligotex-dT30 mRNA purification kitというのを使ってます。
今、自宅で、プロトコールが手元に無いんですが、total RNA 300 ugでOligotexを
20-30 ul加える位だったと記憶してます。このキット２-３種類
あったのでお互い別のやつなんでしょうね？
細胞、思い切り増やして、Oligotex、ちょっとけちって今度こそは、と思ってます。

>>384
>二回oligotexやると一回目の1/5〜1/10位にしかへらないよね
ううー、これって一回目にとれたpoly(A)量の1/5〜1/10位しか
回収できないって意味ですよね。というかそれ以外に意味とれないけど。
やはりそんなもんですか〜。がんばって細胞、取ろ。

細胞とれるんならとれや。
年に一回しか花が咲かない植物やってるやつとかは、
必死でサンプリングしてるぜ。
１００本の植物から０.３gくらいしかサンプル取れないし、
ジャストのステージが欲しいから、日が限られるし、その日は必死よ。
いくらでも取ろうと思うなら取りなさい。

>390
ゲルから切り出して nested pcr じゃない？

>391
>今、自宅で、プロトコールが手元に無いんですが、total RNA 300 ugでOligotexを
>20-30 ul加える位だったと記憶してます。このキット２-３種類
>あったのでお互い別のやつなんでしょうね？

僕の使ってたのは、Oligotex-dT30<Super> (TaKaRa W9021A)です。
カタログ見ると、379さんのはこれにスピンカラムを組み合わせたものですね。
カタログ見る限りでは、カラム付きKitの方がOligotexの推奨使用量が少ない
ように見えます。とすると、カラム付きKitの場合、ケチるのはあまりよくない
かもしれません。推奨使用量　定価1500円/total RNA 250 ugだから
ケチらなくてもいいのでは？Subtraction Kitの恐ろしいバカ高さを考えると。

>393
ありがとうございます
ただ、nested primerがない、内側の配列がわからない、というときに
使える技はありますでしょうか？

数塩基ずつずらすだけでもnested primers
になることは多いよ。

nestやるならゲル中いらねえだろ

つうかもう散々既出だよその話題は。
ゲルのバンドの所チップでつつくなりパスツール刺すなんなりして回収して
100ul位のTEに入れて煮沸して溶かして
それを1ulくらいテンプレートにして同じプライマーでPCRやりなおせや。
詳しい話はどっかに出てるから探せ

>>394
> カタログ見ると、379さんのはこれにスピンカラムを組み合わせたものですね。
そうです。こちらの方がきれいにとれるとカタログに書いて
あったんでこちらにしましたが、手間を惜しんじゃいけないようです。
> ケチらなくてもいいのでは？Subtraction Kitの恐ろしいバカ高さを考えると。
あはは・・・値段のことは考えないようにしています。考えちまうけど。
先生の顔、ひきつるの見るのやですから。
こんどこそ・・・。しかしまた何かあったらその時はまたよろしくです。

>>392
>細胞とれるんならとれや。
自分より厳しいサンプルのヒトの話はよく聞きますからね。
とりますです。

>>397
待ってくれ。田舎者の漏れにも教えてくれ。
"ゲル中" ってのは方言じゃなくて、ふつーに使われる言葉なのか？

398の方法では余計なバンドが増えたり、taqのエラーでmutationが入る
可能性も高くなるからおすすめできない。
ゲル中シル。そんなにめんどくさくないだろ。

切り出してDNAを抽出するんだから

ゲル「抽」ぢゃないのか？

>>401
余計なバンドが増えるのはお前がへぼいだけだし
direct sequenceすりゃmutation入っても関係ない。
ゲル中なんてめんどくさくてやってられない。

>>402
ﾊｧ？死ねよバカ

ゲル中毒

>>403
余計なバンドが増えないような単純な実験しかしたことのない厨か？
解決策が考えられないんだったら答える必要無し。
俺は素人には確実なゲル中をすすめるよ。

>>405
プヒャ
自分がヘボイのを棚に上げて（藁

お前ら仲良くしろ

>>406
お前の方法ならどんなPCR産物もゲル中なしで楽にシークエンスできるんかい？
本当にそう思っているなら神聖アホですな。

おいおまいら、ＰＣＲでもやってれ

レスありがとうございます
ゲル抽＝ゲルの切り出しを行い、精製したものをテンプレートにする
ゲル中＝ゲルをスポイトなどで吸い取り、TE等で希釈し、それをテンプレートにする
という理解でよろしいでしょうか

ぺるちぇのサーマルサイクラーで最後のhold tempを4℃にして長く置くと機械が
いたむので10℃以上にする。

>>410
ダメです
ゲル抽=意味が通じるのに変換の違いにいちゃもんつけるバカ
ゲル中=めんどくさいから変換をきちんとしない合理主義者

ゲル中＝略語使ってるとじきに原意を忘れるトリ頭

あげ

↑　あがってないよ　さげてるよ

ゲル抽出の裏技ありますか？
なんかこう、スピンカラムを使いまわせるとか、グラスミルクを
再生するとか、じつはコンストラクションにもBactoAgarでよい
とか、そういう貧乏くさいの希望。

グラスミルクって
要するに楽焼きの上薬のことだろ

珪藻土のこと？

最近のシークエンシングキットは、適当に取ったプラスミドでもかなりきれいに波形が出るように思うのですが、
ポリメラーゼの性能でしょうか？

Thermosequenase使うようになったからじゃねえ？

（＾＾）

ヽ（｀д′）ノ

（＾＾）

極Ｘprotocolスレに流れを取られてしまったな

http://www6.ocn.ne.jp/~endou/index2.html
　　　　　★YAHOOOプロフィール★

>>424
このスレとあのスレでは目指すものが違うので共存可能

日本エイドー社製のポリアクリルアミドゲル電気泳動に使うガラス板の
耳の部分が取れたものをくっつけて使うつもりで
ガラスを接着できる接着剤をいくつか買って試してみましたが
ぜんぜん直りません。あきらめて新品のガラス板を購入したほうがいいのでしょうか？

タイマーの代わりにメトロノーム

>427さん
ウチではミミつきだけ買い足してますよ。
ところでヨソでもあれを"ミミ"って表現するんですね。

壊れたといえば、アガロースゲル作る時の25レーンのコーム買ったんだけど、
あれのクシを一本折っちゃったときは泣けたなー、高かったのに。

ゲル作ってから毎回くっつければいいんでないの？

漏電するよ

RI実験で、ゲルドライ後オートラしようとしたら、ゲルが
ボロボロにひび割れしていました。ひび割れ対策などあれば
ご教授お願いします。

完全に乾燥しる

５％グリセロール溶液にひたしてからゲルを乾燥させると
ひび割れ防止になるそうです。

アルコールも足しとけ。10〜40%ぐらい。
縮んでるやつを乾燥させるほうがひび割れにくい。

http://jsweb.muvc.net/index.html
　★お気に入りに追加してしまったアドレス★

>>429さん
レスサンクスでつ。
やっぱりそうするしかないんですか・・・（泣

「ミミ」といえば
秀潤社の「バイオ実験イラストレイテッド５タンパクなんてこわくない」でも「ミミ」だったけど
ここではスペーサーのついている方がミミ付きですた・・・
逆に羊土社の「タンパク質実験ノート」では「ミミ」という表現にはでくわしませんですた。

スペーサーにミミが付いている方が
折れにくいという罠。

>>427
ガラスはどうやってもくっつかないんだよねー
取り急ぎ、アロンアルファでくっつけといて、表面にアクリル棒でサポートいれるのではダメ？

>>438
ところが我々のラボでつかっている日本エイドーのは全く逆で
ミミのついてるところにスペーサーがない・・・
メーカーによってもこの点には違いがあるみたいね。

ミミ無し、スペーサー付き
間にゲル
ミミ有り、スペーサー付き
間にゲル
ミミ有り、スペーサー無し

この組み合わせだと、一度に２枚のゲルを流せる罠。

>441
アプライしづらくないですか？
泳動そうにはクリップで留めていますか？

仮説を立てる
　　↓
その仮説を証明するために必要な実験系を考える
　　↓
その実験が理想的にいったらどういうデータが得られるか考える
　　↓
そのデータをフォトショップ等で作成する。
　　↓
それを元に論文を書く

>>441 むしろ

耳付スペーサーあり
ゲル
耳なしスペーサーなし
ゲル
耳付スペーサーあり

の方が合理的っぽ・・

　　 　 ∧＿∧∩　／￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
　　　 （　´∀｀）/＜先生！流行ってます。http://homepage3.nifty.com/digikei/ten.html
　＿ / /　　 /　　　＼＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＼⊂ノ￣￣￣￣＼
　||＼　　　　　　　　＼
　||＼||￣￣￣￣￣||
　||　 ||￣￣￣￣￣||

>>443
先生!!
最後の二つは、逆にしたほうが効率がいいと思います。

ageちゃったりして....

ゲル板のガラスで、ゲルを剥がし易くするために何か塗っている人がいたのですが、何だったか思い出せません。
分かる人います？

>>448
ゲルスリックのことか？

>>449
それでは裏技とまでは言えない
オートバックスへ逝け
レイン-Ｘ
アメンボウ
その他フロントガラス撥水材を買え

>>450
マジ？

ハイブリダイゼーション溶液は自分のザーメン使ってます。
それだとsalmon sperm DNAは必要ないし、粘度もちょうどいいしで
金いらずデス。Dextranの変わりに多糖類はふんだんに入ってるし。
ぜひお試しあれ。

ネタでなければ（たとえネタでも）Methodsに英文で何て書くか晒して

>>450
ｽﾚﾀｲちゃんと読んでなかった、ｽﾏｿ。
前いたラボではガラコつかってたな、そういえば。
逝ってきます。

>450
塗り方は普通に説明書通りにするんですか？

ふつーです
ついでに，ガラス磨きにはジョンソン・クルー最強

>>456
マジ？

ここで聞くべきかどうか分からんが教えてくれ。

最近はsubcloningでトランスフォーメーションの後にsingle colony isolation
はやらないのか？

俺は最初にやるように教わってるから律儀にやってるがなにげに時間が
かかるのが嫌だ。できるならやりたくないのだが？

やりまへん
1日無駄

>４５８
聞いた事ないです。
具体的には何するの？

>>460
トランスフォーメイションの後にめぼしいコロニーを滅菌した楊子で突っついて
新しいプレートにちょんと付ける。それを白金じでさらさらと伸ばして培養します。

なぜそういうことをするかと言うと、ampでは大腸菌死なないので、そのコロニー
にはplasmidを含まない大腸菌も含まれてるし、そのコロニーが単一の菌由来
かどうかは見た目では分からないからです。single colony isolationで
それを単離できるので安心です。

俺は今でもやってるけどなー。細菌学では常識だけど。

どんな実験でも目的がなんなのかはっきり汁
ほしいプラスミドを取るのが目的
きれいなクローンを単離するのは目的でない

候補を複数拾って当たったやつからプラスミドを取る
コロＰをやれば確認作業も短縮できる

だからシングルコロニーの分離なんて普段は無意味

だが
事情によっては必要になってくるのでおぼえておいて損はない

プレートのまま何日もほっといたコロニーから液体培養するとか
古ーいストックから起こすとか

こういうときにはよくプラスミドが脱落してる
全然とれなかったり収量が極端に悪かったり

プラスミドを入れなおすという手もあるが
コロＰだけしかやってないクローンだとそれはできない

で
漏れは細菌学の実験をちゃんと習ったことがなくてストリークが下手なので
菌をＬＢで適当に薄めて塗ってる

プレートをグシャっとも逝かずに目にもとまらぬ速さでしゃかしゃか
って神業としか思えん

>>458
なるほどね。
確かに、覚えておいて損はないね。
当たりコロニーを引き直して、
コロニー拾い直す方が安心だね。
けど、毎回やると大変すぎる。。。

ハイブリバック買ってる奴は馬鹿。
ちょっと厚手のビニール袋で十分代用できる。

（＾＾）

test

ｼﾞｯﾌﾟﾛｯｸ最強

>>461
なるほど。transient expression用のベクターとる時にはいいかも。

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>467
もれないの？

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―━―━―━―━―━―━―━―━[阪急大山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━

ハイブリにビニール袋はうまくないねぇ
泡抜きができん

実験ノートにポラ写真とか
酵素やキットのデータシートとかを貼り付けるときには
口紅糊よりもポイント糊が便利
口紅糊は３年ぐらいする黄ばんではがれてくるし
普通の水糊はノートがべとべとになってたわむし
セロテープもいずれ変色してはがれてくる

水糊は少なくとも１０年ぐらいは安定しているので
細い糸状に出てくるポイントタイプならべとべとにならないしノートもたわまない
http://bungu.plus.co.jp/sta/search/result_d.asp?Ns=2&gc=1A154&name=のり、接着剤&num=30&genre=&keyword=&types=g&GREEN=&GPN=&EMARK=&OTHER=

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ﾋﾟｭ.ｰ　(　　＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣〕
　　＝ ◎――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉

age

hage

“ヘ(￣-￣ )カモォーン♪
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　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
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　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
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hoshu

ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

　　　 　∧＿∧　 ∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　（　 ・３・） (　　＾＾ ） ＜これからも僕たちを応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣￣∪￣￣〕
　　＝ ◎――――――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉&ぼるじょあ

　　　 (⌒V⌒)
　　　│ ＾ ＾ │＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　⊂|　　　　|つ
　　　（＿）（＿）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎パン

ageてみるﾃｽﾄ

すみませんが教えてください。
mupidの泳動槽使っていますが、100Ｖで時間がかかるため
ミニゲルがきっちり入って、外部電源が使える泳動槽を探しています。
業者に探してもらったり、自分でもあんまりわかりませんでした。
以前にどっかのラボでみたのですが、、、。

>486

おれんとコつかってるなぁ
電源；BioRad
槽　；マリソルorBIOCRAFT

だよ

ミニゲルに1XTAEで100V以上かけたら、泳動後にはbufferが沸くだろ…

チェックするだけならちょこっと流せばええやん

ボスが金があるからといっていろんなもの買ってラボが手狭になって困る。
せっかく４部屋をブチ抜きにしてひとつの部屋にしたのに。
ラボから出ることなく何でもできるのはありがたいが・・・

買うならどっかに土地でも買って新しいラボ作ってほしい

そのどこが裏技なのかと小一時間（ｒｙ

部屋をブチ抜くときドラえもんに頼んだから、実験に支障なく、わずか数分で完了。
これが裏技ｗ

上上下下左右AB
テニスを電源入れたまま引き抜き・・・

ネツゾー

資金源が裏技ですが？

>488

150Vで流してますがなにか？

300Vぐらいかかってるような気が・・
ちなみに、ミニゲル2枚同時で70mAです〜

ageとくか.....

あぼーん

皆、組み替えどのくらい手を抜いてます？

断片移し替えの時とか、2種のプラスミドを同じ酵素で切って、
何も精製せず、フェノクロ/エタチンした後に、2つをまぜてライゲーション。

こんなのは、当たり前ですか？

>>499
そこまで手を抜くと余計手間かからないか？
一つ一つの作業を確実にやることが結局早かったりするんだよね。

>>500
それが、驚く事にそうでもないんです。
極めて最近しった、超手抜きなんですけど。

皆やっぱり、ちゃんとゲル精製してライゲーションですか？
single cutとかの場合は別ですよ、もちろん

ウォーターバスの中に10円玉を入れとく

>>502
カビ防止？
どのくらい効果あるの？

アザイドを一滴入れたりはするが・・・。

皆さんにお聞きします
ミニプレのとき
sol-2入れたら氷冷5分
sol-3入れても氷冷5分
てマニュアルに書いてありますが
ひょっとしてすぐに次へ進んでも大丈夫？

組み換えのフラグメント精製する際に、ゲル精製って、皆ちゃんとやってるの？

>>504
ぶっちゃけ大丈夫。
sol1入れて、しっかり大腸菌をばらしたら、
そのままsol2入れて、そのまま転倒混和（一応菌が溶けていることを確認）
直ぐにsol3入れて、数回転倒混和したら直ぐに遠心してＯＫ。
俺はいつもそんなもんだよ。

ただ、しっかりステップを踏んだ方が、純度は高いと聞いたことがあるが、
どこまで効果あるかは知らないなぁ。

>>504
俺はやってる
そんなケチるもんでもないと思うし・・・（時間も金も）。
面倒くさいって程、手間でもないでしょ。

制限酵素で切ったベクターをゲルから切り出し精製するのは変だと思う。

Li塩を入れてRNAを落とすときは氷上３０分しっかりやる。

>>508
なんで？
確かにライゲーションの効率が下がるかもしれないが、
別にやっても構わないと思うのだが。

>>510

ヒマなんだな。

↑どんな場合でも精製しないんですか？

暇人と罵られるほど時間はかからないと思うのだが？
泳動中は別のことやってればいいだけだし・・・。

↑精製はなに使っていますか？gene pure見たいな奴？遠心フィルター？

好きなのはGene　Crean　Kit2です。
でも、カラムも使うよ。
３社ぐらいを適当に使っている。

いまだにWizard使ってるやつはアホ。

コストがかからず楽で早く確実な方法を模索するのも結構だが、
自分が上手くいくと信じている方法でやるのに文句をつける必要はなかろう。
実際それで目的のベクターが常識の範囲内の時間とコストで出来るのなら、
他人がとやかく言う必要は無い。
些細なプロトコールやキットの種類について考察するよりも、
もっと考察すべきことがたくさんあるだろうに。
それとも、将来は実験のキットを作る企業にでも就職したいのか？

効率が悪い系やライブラリー作成ならベクターも精製したほうがよいアルよ。
うちは効率が悪いライブラリー作成なので精製しないと板が真っ青になった後、
即サテライトだらけ、なんてことになる。

ちなみに、ゲルからの精製はGel Extraction Kit、PCRの精製も、
制限酵素除きとかもこれ。しかも使い回し。
この前QC追加注文しましたよ。

504さん、
sol�V(酢酸カリウム)より酢酸ナトリウム（3M、pH5.3だったと思う）使うと次の遠心で、しっかりした沈殿ができます。
で、デカントで新しいチューブにうつせます。
そのままフェノクロするならどうでもいいですが。

いい事聞いたｗ
504じゃないが、今度やってみよう。
サンキュー

だめだめ！sol�Vでタンパク質＆ゲノムDNAを除けるのは、SDSの(正確にはDS ）の塩でpotassium塩の方がsodium塩より溶解度が遥かに低い事を利用してタンパク質とgenome DNAを沈殿させることによるんだから。

騙されるところだったんでつか？
あぶないあぶない・・・。

もしかして酢酸ナトリウム（3M、pH5.3）ってエタ沈用？

>>522
>>521
は常識なんだけどな。。。。

519はどこからそのネタを持ってきたんだ？
実際にやったことあるのか？

Sol4として酢酸リチウムを最終濃度２モラー入れて氷上30分、RNAが除けます。

ネタかどうかはともかく，デカントはやめれ．
sol3→遠心のあと，沈殿しないで浮いてる白いカスが
混ざったらあとが大変．見た目おんなじでも純度全然違うから．
無理に精製しようとすると収量がた落ちになるし．

sol3後クロロホルム50μl入れて軽くシェイク→遠心

すると全てのカスがまとまって浮遊物０。既出ｽﾏｿ

>504,520-524,526
助教授から教わって、実際にずっとやってました。
ミニプレップではsol�V使ったことはほとんどないです。

サンプルはその後制限酵素でチェックして、PEG沈して、シークエンス(300bp)してました。
この程度の実験なら酢ナトでもいいということでしょうか。

またこのときは、エタ沈には使ってませんでした。

いずれにしても、邪道ですか。。。
皆様、お騒がせいたしました。

jm109ってDCMあるよね？

てことは、ホストに使うとStu1切れなくなるよね？？？

Dam negativeに入れ替えれば切れます

間違えた。Dcm negativeです

もちろん切れるStuI siteも切れないStuI siteもある

↑完全にメチレーションされない、その逆の完全な脱メチル化されないってことですか？

分かってないね。メチレーションは完全でもメチル化されないStuI siteだってあるでしょ。ひょっとして釣りにマジレスしてまつ？

■ この事件の裏側の衝撃的な真相
■ ヤフー４６０万人データ流出事件の犯人は、
■ 池○大作Ｓ価学会の闇の謀略部隊だった
--------------------------------------------------------------------------
大新聞は流さないがこれは疑惑の宗教法人Ｓ価学会の腐敗した恥部を再び示した

偉そうに清潔なフリをしてこの国の政治のキャスチングボートを握って
いるように振る舞っている公○党の支持母体の暗部が突然明るみに出た一部始終
--------------------------------------------------------------------------
日刊ゲンダイが１面で特集 （ヤ○ーＢＢとＳ価の関係）
１面（カラー） http://ahiru.zive.net/joyful/img/901.jpg
２面 http://ahiru.zive.net/joyful/img/902.jpg

創○学会元幹部： 竹○誠○(55)
現在、聖○新聞広告部長。

また、共犯のＹ浅輝昭(61)も○価学会信者
との報道（１面記事参照）

布教活動や選挙活動に使用できるのでＹＢＢの名簿に目をつけた（記事より）

今大腸菌まいたんですけどプレートが乾燥しないのでひっくり返せません。
具合わるいので早く帰りたいんですけどなにか良い方法ないですか？
クリーンベンチ内だと乾燥が速いと聞いたことがあるような…

クリーンベンチ内で風あててかわかしなさいな。

クリーンベンチでふたを開けて紫外線を照射しておくと
速く乾くという噂があります。

↑
そういうのはある種「裏技」だが
ここに１つ教訓を貼っておこう
http://food3.2ch.net/test/read.cgi/food/1058171145/l50

幻の大技、とかないですかね？

●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●
●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●
●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●
●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●
●●●●●●●●●●●●●●●●不合格●●●●●●●●●●●●●●●●●
●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●
●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●
●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●
●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●
●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●

そんなに大量の液まくから悪いんだよ。
頭悪い

5'側の開始ATG付近のプライマーにはkozak配列を入れておく、

とか。

それ何？

いやぁ、申し訳ない>542
まいたのは５０マイクなんですけど
プレートが作りたてなせいではなっからびちゃびちゃだったんですよ。
クリーンベンチで速攻かわいて今日コロニーひろってミニプレできました。

蒔く前にクリーンベンチなりで乾かしておくべきだったな>545
にしても朝コロニーひろって即カルチャーして夜ミニプレップしたってことかい？
一日浮いたってことである意味裏技だな。

調子悪いならここに来ないで寝てな。

>>543
プライマーって、cDNAのPCRをかけて発現ベクターに入れるということかな？
kozak配列を入れておくなんて当たり前の事だと思ってましたが・・・。

さらに、kozak配列を少しずつ変える事によって、
発現量を調節することも出来る。

うちの先生は「コザックって何？ダンスでもするの？」とか言うのですが、、、

>>528
別に邪道じゃない。Kじゃないとダメって言ってる椰子が知ったかぶってるだけ。
気にする必要なし。

世の中にどれだけNaのプロトコルが出回ってるか知りたければぐぐって見るとよろし。

>>549は、酢酸ナトリウムを使ってどうやって最終標品へのSDSの持込みを防げるのかを説明してみなよ。

>>550
酢酸ナトリウム使うプロトコルはちゃんとあるって（呆
藻前が知らないだけ。
実際に動いてるプロトコルに対して、その理論ではうまくいかないはずだと
喚いてもしょうがないと思うんだが・・・
無知って怖いなぁ。

ちなみにSol2のSDSは1%、SolIとNaAcで希釈されて約0.3-4%になる。
プロトコルにより若干違うけど。
この程度のSDSがEtOHpptで落ちると思ってるの？馬鹿じゃない？

「プロトコルはちゃんとある」ねぇ… 低いレベルで満足することはいつだって可能だろうよ。そもそもNaOAcを使う積極的な理由がなんかあんのか。それから、もちろん0.3%のSDSだって当然エタノール沈殿されるさね。

実験ってなんでもそうだよな。
これでもうまくいくって言って、いい加減なことして。。。
その時はうまくいってさ。本人はいいだろうけど。
そらその程度の実験なんならいいだろうよ、
でももっとシビアな実験で、トラブルにあって相談のる身になって見ろよ。
え？どこでそんなこと憶えたの？ってびっくりすることしばし。
しかもそんなこと思わないからトラブルシューティンングも時間かかるし。

まあ、誰だか知らないけど、NaAc使う積極的理由を説明すべきだな。

遅くなったが>>551同意。

>>552
>もちろん0.3%のSDSだって当然エタノール沈殿されるさね。

ミニプレ論争などどうでもいいが、頼むからそういう嘘は止めてくれ。

>>550
>>552
物を知らんってのは怖いね。
Nucleic Acids Res. 1979 Nov 24;7(6):1513-23.
でも読んでみたら？
最も普通のエタノール沈殿でSDSが落ちるような物理法則の世界には
そんな論文ないのかも知れないがね。

>>553
良いとこ付いてるが、文脈の考え方が正反対だね。
俺が言ってるのはKでもNaでもどっちのプロトコルもあるし、優劣も実質ない。
だから528が落ち込む必要はないってだけ。誰にもNaの方がいいなんて言った覚えはない。
要するに俺がNa使う積極的理由を示す必要は全くない。
別にKな人はK使ってれば良いんじゃないの？
一応DNAがNa塩で回収されるかK塩で回収されるかって違いはあるが、実質
どっちでも良いわな。
むしろさ、あんたの言うように、Naではダメだって主張してる椰子が
Naのダメさを説明する必要があるんじゃないのかい？（うざいからしなくて良いけど）
それがあんたの言うロジックでしょ。

結局酢酸ナトリウムではミニプレップできないって言うのはガセだったんですね…

できるけど
ゲノムのコンタミが多いよ

>>557
それは嘘。

やっぱ酢酸アンモニウムでしょう。
いざとなったら飛ばせるしね。
だから、電顕のバッファーとかに使われるんだよ。

ヲレは酢酸リチウムをsol.4として使う。これが一番

オメーら馬鹿野郎様はご立派な方法でどんな素晴らしい
プラスミドを構築してるんでしょうねえ。
豆腐の角に頭ぶつけて詩ね。

５６１が率先して自殺しなさい。早よ死ねアホ。

無知は氏ね。>>561
本当の馬鹿？

>>555 うわ、えらい古いの出してきたな。しかし、この論文はalkali法の最初の論文で、カリウムを使う改良法が２年後に出てるんだから、両方同じように使えるという例としては不適切だがな。
Ish-Horowicz D, Burke JF.
Nucleic Acids Res. 1981 Jul 10;9(13):2989-98.
そもそも、現在出回っている「ほとんどの」プロトコール集でも「ほとんどの」キットでもカリウムを使っているということに、何らかの理由があるはずだと考えるのが自然だと思うが如何。

その理由がメーカーの生産コストだったりなんとなく前から使っているだけだったり
することもあるからねぃ

＞564
アメリカの歴史のある分子生物学の研究室ではナトリウム塩のところは
結構多い。元論文があって、その方法でやってうまくいってるから
変える必要性がないんだよ。
カリウム塩を使う方法の明確なアドバンテージはかなりのSDSを沈殿除去できる点で、
これはアルコール沈殿を使わないキットでは重要だ。どんな初心者が使うかも
知れないからね。尤もSDSが残る場合は塩も残るんで、大差は無いのだが。

俺だって今からDNAワークはじめる人にはカリウム塩の方法で教える。
流通している方法だし、あえてカリウム塩で教えない理由はない。
だけど、ナトリウム塩を使ってる人にカリウムに変えた方がいいと言うような
アドバンテージもまたないんだよ。

要するにね、ナトリウムを使うとゲノムがコンタミするだの蛋白が残るだの、
SDSが除けないだのというようなデマを流すのは勘弁して欲しいって事。
俺を含めナトリウム塩のプロトコルがちゃんとあるって言ってる人は、
誰一人ナトリウム＞＞＞カリウムとは言ってないでしょ。（実質＝なんだけど）
特にSDSがエタ沈されるとか堂々と言ってた類の馬鹿は反省して欲しいって事。

それからその論文、別に改良じゃない。変法って言う方が正しい。

分子生物学実験プロトコール厨 1st Edition

たかがＤＮＡ精製に、、、、暇ねえ。
木を見て森を見ずとは言い得て妙。
そんな３０年前に終わってるレベルで
まだもがいてる人がいるなんて信じられん。

馬鹿に付ける薬は無いか・・・
NIHにでも行ってもがいてますね君たちって言って来なよ、止めないから。
そして冷笑されてこい。

>>568

あほ。

>特にSDSがエタ沈されるとか堂々と言ってた類の馬鹿は反省して欲しい

禿同。

>>566 SDSを効率よく除去するって理由があるのに改良じゃなくって変法だって
議論も良くわからないが、それはともかくとして、エタノール沈殿後のサンプル
にもタンパク質の持込があるのはフェノール抽出すれば中間層が見えることから
明らかだから、とうぜんSDSの持ち込みもあるだろ。
>>519 沈殿がしっかりするのはSDSが残っているから。エタノール沈殿で大部分
が除けるとしても目的によってはトラブルを起こすことあり。

>>568
ＮＩＨだろうが何だろうが、雑魚は雑魚。
あんたアメリカ忠ですか？失礼Ｗ

まあ匿名掲示板の情報なんて受け手次第だし、馬鹿に物を教えても
得るものはないからなぁ。

>>571書き込みから見て君がナトリウム塩のプロトコルで仕事したことあると
思えないんだけど、どうして知らないことを知っているように喋りたいのか？
ナトリウム塩でうまく行ってる人は、どうしても「低レベル」ってことにしたいの？
そんな「低レベル」扱いなら別に腹も立たないけどな。一応質問に答えておくと、
アルコール沈殿でSDSは除けるし、カリウム塩使ったって全てのSDSを沈殿除去
できる訳じゃないんだよ。エタノール沈殿を最終精製に用いる限りにおいて、
practicalな差は無いと言っておるわけだよ。それでもSDSを持ち込むことにしたい
んなら、もう相手はしきれない。そうしておいてくれ。君が何を言おうが
現実は変化しないからね。

素性を明らかにしておくとアメリカ某研究所でかなり長く働いている人間だが、
俺が、じゃなくラボがずっとこのプロトコルでやってきて何の問題も無いんだよ。
俺自身はカリウム塩で習ってこちらではラボプロトコルでやってるが、正直差を
感じたことはない。ラボはばりばりのモレキュラーバイオロジー。うちで出来ない
テクニックってほぼ無いと思う。付け加えて言うと、このプロトコルでやってるのは
うちだけではもちろんない。

>>572それは無理てもんだ。悪いがミニプレップ程度で雑魚呼ばわり
するなんて頭のどっかが壊れてるとしか思えないが。お前さんの実験はミニプレップが
目的なのか？
間違った知識を振り回すお前さんは十分雑魚だけどﾅｧ・・・。

まあ信じたく無い人は信じなくてよろしい。
これ以上は議論無用。もう相手はしない。馬鹿の壁は越えられないよ。

ちょっと補足っつうか。
カリウム使おうが蛋白は当然残る。そこには(S or P)DSは複合体として
存在しないのか・・・？そんなはずはない。

分析化学やってる人はちゃんと考えてみるといいと思う。

実験生物学やってる人は・・・気にしないんじゃないの？
その後の反応がうまくいく限りにおいて。

そういうこと言ってるんだけど、まあ分からないんなら結構。

NIHのトップ＞日本のトップ＞＞＞＞＞＞日本の底辺ラボ＞NIHの底辺ラボ＝>>573
は常識だがなあ。
アメリカのトップ研究所ならキット使うだろ普通Ｗ
嘘ばっかりついてると、うっかり捏造しかねないから気をつけた方がいいよ。

もっと言えば、モレキュラーなんてテクにゃんの仕事。
それを使って何を明らかにするかが重要であるわけで、
＞うちで出来ないテクニックってほぼ無いと思う。
とか自慢してる時点でｱｲﾀﾀﾀ。
君のいるとこって、専門学校なのかな？？？

なぁんだ、煽り合いしたかっただけか・・・。
別に嘘だとおもっておけばいいんじゃない？>ミニプレップが実験の目的の575さん。

まあ書き込みが全てを物語ってくれますよ。575が体現してくれているように。

何か上がってると思ったら、専門学校スレとテクスレに粘着してた
粘着キチガイが今度はここに来てるのかよ（萎

>>573 確かに理屈だけじゃ世の中動きません。で、実験。solution 3として
NaOAcを使ってmini-prepをやってみました。EtOH沈殿の後、70% EtOH洗浄、風
乾した沈殿を50ulのTEに溶解しました。確かに問題なさそうに見えます。ここ
に試しにKOAcのsolution 3を10ul入れて攪拌後、遠心してみました。すると小
さな白い沈殿が、これは一体何でしょうか？？？これでもSDSの持込みが無い
と強弁なさるのでしょうか。
SDSの持込みのあるDNA溶液だって、0.1ug程度を数unitの制限酵素で切る分に
は問題なく切れますよ、そりゃ。だからって、他の用途に問題ないとか、Naと
Kで差が無いとか。ちょっと違うんじゃありませんか？

>578
↑
このﾋﾄ今まで見た中で最強のｱﾌｫですね。
笑いすぎで腹が痛いです。

↑引用は>>で

晒されてるのは>>579なわけだがね

僕もそう思います。しかも既に一番上に上がってるスレにさらにageってもねぇ。

>580->582
なんでそんなに必死なの？(ｯﾌﾟ

↑引用は>>で

>>573=>>576=>>579=583
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 (⌒Y⌒Y⌒)
　　　　＿＿＿＿　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＼＿＿／＼
　　 ／∵∴∵∴＼　　　　　　　　　　　　 　 　 　 　 ／　　　　＼　ヽ
　 / ∵∴∵∴∵∴＼　　　　＿＿∫＿＿　　 　 ／ ⌒　　　⌒ ＼ ヽ
　|∵∴ノ ／,,　　　 ,,　l　　 ／　　　　　　　 ＼　　|　 《;.･;》　《;･;.》　　 ⌒）
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　 /ヽ |　　 ー　　 ー　|　 l　 へ , ､ ノヾ　　 |||||||　ヽ_／⌒_⌒＼._ﾉ|　　 ）
　| 6`l　　 ､＿_ つ＿_/　　| 《;.･;》　《;･;.》　　|||||||　 |　| |＿|＿|　|　|
　ヽ_ヽ　　　ヽJJJJJJ　　 |　 ⊂⌒◯------9)'　 ヽ |　,-v-､　,| /
　 　 ＼　　|,-v-､　 |　　　 |　 /iuUuuiヽ　　　|　 　 　 ヽヽﾆﾆノ ノ
　　　　 ＼_ヽニﾆノ/　　 　 |　 | ,-v-､ |　　　|
　　　　　　　　　　　　　　　 ヽ' ヽﾆﾆノ丶　丿
　　　　　　　　　　　　　　　　　 ー - ―

　　　　　　や　　ば　　い　　よ　　こ　　の　　厨　　房　　！　　！

>584
専用ブラウザつかえや

578 名前： 名無しゲノムのクローンさん 投稿日： 04/03/22 22:36
>>573 確かに理屈だけじゃ世の中動きません。で、実験。solution 3として
NaOAcを使ってmini-prepをやってみました。EtOH沈殿の後、70% EtOH洗浄、風
乾した沈殿を50ulのTEに溶解しました。確かに問題なさそうに見えます。ここ
に試しにKOAcのsolution 3を10ul入れて攪拌後、遠心してみました。すると小
さな白い沈殿が、これは一体何でしょうか？？？これでもSDSの持込みが無い
と強弁なさるのでしょうか。
SDSの持込みのあるDNA溶液だって、0.1ug程度を数unitの制限酵素で切る分に
は問題なく切れますよ、そりゃ。だからって、他の用途に問題ないとか、Naと
Kで差が無いとか。ちょっと違うんじゃありませんか？


potassium acetate入れたらSDSが沈殿するんですか.....すごい発見ですね。
化学の常識が覆されてるワケなのですがNatureに投稿したらどうですか?

回る回る四時台は回る

SDSの持ち込みが増えれば、タンパクと膜とゲノムの持ち込みも増える、
ってことにならないのが不思議。
結構選択的に落ちるもんなんだなあ。

このスレにいる人たちの中には、エタ沈の原理も理解出来てない
人がいるようですね。

だから578さんは信じなくても良いし使わなくても良いとあれほど。
引くに引けなくなってどうしてもK>>>Naにしたい気持ちはわからなく
もないけれど、その実験を書き込むのはちょっと墓穴って言うか・・・。

これまで知らなかったのならここは素直に引いたら良いと思うんだけど。
ミニプレップの原理は全く持ってsol.3にカリウムを使うことには依存して
いないんだから。それは原著にあたれば実験して無いひとでも理解できるし、
経験のある人ならナトリウムのプロトコルが結構流通っていうか使われて
いることを知っているんだけどな。それを無知だと思うのは、ちょっと
他人を甘く見杉だと思いますよ、まじで。

だからね、信じたくないひとは信じない。これでFA。
頭の片隅にそういうこといってた馬鹿がどっかに居たとでも認識しておいて貰えれば、
将来ラボを移ったときに面食らうことも無くなるでしょう。それでいいんじゃね？

>>587 分かってないのはあんただよ。ナトリウム塩に対してカリウム塩は溶解度が遥かに低いのだ。常識なのだ。これでいいのだ。

グアニジウムやカリウムはラウリル硫酸と不溶性の塩を形成することは
学部のときに習う常識のはずだが、、、

さて、そろそろ次の議題に移りましょうか。

カリウムがラウリル硫酸と不溶性の塩を形成することはわし知らんかった

これが裏だ。
キ支⇔支キ

　　生物学のひとは高校化学すら理解していないのですね。

full length cDNAって販売されてますが、本当にfull length入ってるんでしょうか？どうやって取っているのでしょうか？

full length cDNAって販売されてますが、本当にfull length入ってるんでしょうか？どうやって取っているのでしょうか？

>>599
それのどこが裏技なんだ？

裏技っていうか、ある程度テキトーにやること

と、この世界に足を踏み入れて約１年の俺はそれを学んだ。

テキトーでいいとこときっちりやらなきゃいかんとこを区別できるようになるのが次の段階です。

caco2でstable transformant作りたいのですが、transfection後、細胞が増えません。
このままでは、cloningできないのですが、皆さんこのような経験あります？
あったらどうやって、打開されましたか？

また、transfectionやcloningの浦技ってありますか？

PCRでMgSO4入れない

すいません｡
実験の質問ってどこにすればいいのでしょうか?

ボスの指示がなんであれ、自分のやり方を貫く。

これがヲレが学んだこと。

「アレどうなった？」と聞かれたら、適当にやり過ごす。

>>605
次スレたってないな

▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼
http://science2.2ch.net/test/read.cgi/life/1026312578/l50

↑誰かお願いします

久しぶりに上げ

BioTechniqueに出てたな

solution 3で盛り上がってますが、
私のおすすめは7.5M 酢酸アンモニウム。
これ使ったらNaやKには戻れないよ。
出典は忘れました^^;

なにがどういいの？

アンモニウムイオンはT4リガーゼを阻害する。

>>611
昔から全然普通に使うし・・・
なんで魔法のソリューションのように言うのか理解できない。
だいいち、核酸をその後何に使うかによって使い分けだろ。
残存成分の阻害はまちまち。

>>612
一番気に入っている点は、
沈殿がコンパクトになることかな。
他のみたいに沈殿が遠心後に
ぷよぷよ浮いてたりしない。

>>613
アンモニウムは蒸発する。
エタ沈後にSpeedVacで引くでしょ。

>>614
だから残存しないんだってば。
昔から普通に使ってたらしいけど、
意味もわからずに使ってたんだね。
なんというか、こういう人って、
どうなんでしょうねぇ、みなさん:-)

ちなみに酢酸アンモニウムは、
電顕用の試料を作る時のバッファーにも使われるぞ。
下手なバッファー使うと電顕に写っちゃうからね。

>>615
＞エタ沈後にSpeedVacで引くでしょ。

引かないよ。めんどくさい。時間かかる。
そんな装置ないとこもあるし。

てかfinalどれくらいいれるのさ？

>>615
遠心する前にクロロホルムを１滴入れても沈殿しっかりするよ。

>>615
塩として沈殿するんだから残存しない訳ないだろが。哀しくなるね、こういう一知半解のコメント読むと。

>>615
エタ沈後にSpeedVacで引いて乾固することは百害あって一利なしとMolecular Cloningにも書いてあるがね。いや、もちろん必ずしもMolecular Cloningに従う必要はないのだが。

SpeedVacはこの３年使っていない。

618のいうとりなんだろうが、
７０％Ethanol washで気にならないくらい除けるから、
何でも問題ないし、
Sol3はsol3をそのまま使って取れるんだから、
買ってすむ溶液をわざわざ作る気がしない。

作るっつうかこの場合既にラボにある、
エタチン用の塩のどれを選択するか、
だけどな。

うむ。それだけだな。
上の方にSDSとカリウムが不溶性の塩を云々というレスがあったが
確かに溶解度は低いのだが全然溶けないわけじゃないしな。
誰かが言ってるように、エタノールリンスの後で残留するかもしれない
ような微量を問題にするのなら、その程度はカリウム塩でも溶けるだろう。

とにかく藻前ら、ミニプレップごときで侃々諤々やってて楽しいですね
ってこったな。

>>622
俺最近自分が好きなのは研究じゃなく実験なんだと気づいたよ。
ポスドクじゃなくテクになりたい。

expression vectorのMCSにtagを入れたいのだけど、どうすれば簡単にできるでしょうか。
myc-tagを5'側に漬けようと思っています。

>>624
タグ入りのベクターに目的遺伝子を入れる
↓
プルーフリーディングの酵素でタグごとPCR。
発現ベクターに入れやすいように制限酵素サイトもつける。
↓
酵素で切って発現ベクターに組み込む

かな？

>>615
ｳﾞｧｰｶ
残存するんだよ。
お前残存しないと思って使ってたの？
ﾔｳﾞｧｲﾔﾊﾞｲ

しかしこのｱﾌｫｳは誤った知識になんで自信満々なんだろう？

615は「酢酸→揮発性」「アンモニア→揮発性」だから、持込があっても揮発しちゃうと思ってる厨学生です。
615は洗いのときもきっと酢安入れています。もっとも、615の理屈で言えば残存しないから、洗いのときも
酢安入れたほうが回収率アップでいいことづくめですネ！

> ポスドクじゃなくテクになりたい。

アメリカきたらいいよ。
日本人は器用で何でも実験できるから、
テクとしては出世できる。
いいボスを捕まえたら一生楽しい暮らしができる。

給料なんかポスドクの２倍以上だ。

>>622
俺最近自分が好きなのは実験操作じゃなく研究なんだと気づいたよ。
テクじゃなく研究者になりたい。
ドロップアウトの３９歳ですが。

>>627
いや、風乾時に飛ぶけどね。
何ケチつけてんだか分からんが。

うん。酢酸アンモニウムは揮発性の塩だが。
何を文句言ってるんだか分からんな…

尤もアンモニウムイオンを使えば、当然DNAはアンモニウム塩として
回収されるわけだが、よほど特殊な事でもせんかぎりは無問題だ罠。

そんなに飛ぶかなあ。凍結乾燥したあとはいつも結構残ってるんだけど。
2回ぐらい凍結乾燥繰り返すとやっと全部飛ぶ。

>>630-632まだ酢酸ｱﾝﾓﾆｳﾑの話なんかやってんのか、ﾚﾍﾞﾙ低そうだな。そんなﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞ取りに必死かよ。それより>>629について徹底討論しようぜ。

うーむ。むしろ必死な626、627、633と淡々とレスする630-632に見えるんだが（ｗ

>>630-632
何度もレスして必死だなｗ
>>634
他人の振り乙

>>635
即レスか、びっくりした。凄いな。
まあ信じないだろうけど（信じたくないだろうけど）他人だけどな（ｗ

>>636
ああ。
俺はお前らほど忙しくないんでな。

>>632
「凍結」乾燥するからだろ。
ＤＮＡは常温処理だからな。
今はタンパク精製のケースじゃないんだよ。このネタ分かる人が
どれだけいるか分からんが。

>>618
塩として沈殿する分を残存とは言わないわなぁ。

酢酸アンモニウム処理は大腸菌由来の残存するDNase活性を
除去する効果がある、と聞いたことがある。

プラスミド獲りなんかテクにキット使わせてやらせてるから気にしたことない。
ボスも俺も実験アイデア考案や論文書きで忙しく考えたことないな。

はいはいＷ

>>642
何か気に入らないことでもあったのぉ？

いやいや、君の演技がつぼに入っただけだよ

君の演技って・・・
前には書いてないんだが

そうか、まあそうだよな。気にスンナ

お前が気にしないのはいいが、何かあったのか？

あったかといえば、あったな。
食おうと思ってた餃子の賞味期限が切れてたな。

ギョーザの賞味期限なんか無いに等しい
チョンの輸入材料の大根は（ｒｙ

>>641
そんなに忙しい人が２チャン見てるとはね
楽しい人ですね:-P

遅ﾚｽ臭っ！

遅レスすまん。今日は休みなもんで^^;

うっせーデブ

だまれ短小

お前の母ちゃんデベソのクセに

>>655
はい、反則、
本人以外のものの悪口はいけません。

では再開！

>塩として沈殿する分を残存とは言わないわなぁ。

エタチンでは共沈剤だから残存ではないけど、
その後の70%エタノールwashは塩をのぞくためだから、
その後も残った分は残存とよんで差し支えないと思う。

それにしても２回目だが、エタノールwashしても、
その後の反応を阻害する様な多量の塩残存は、
俺自身は経験がない。

お前たち皆、washしないのか？？？？？？？？？？？？？？？
洗わないでそのまま次のステップにいくんか？

ん？DNAと塩を構成しているアンモニウム塩ってそんな簡単に除けるか？
70%ethanolくらいで、、、

何かこういう事書くとヒステリックに反応する子がこのスレにはいるから
ちょっと嫌だけど、DNAがアンモニウム塩として回収されてても、別に
T4-ligaseを阻害したりはしない。経験上ね。

ミニプレップの時ならなおさら無問題。どうせ大して塩感受性な操作なんて
しないし、本当にそういった操作が必要ならセシクロ回すだろ。
あとセシクロ回したら、明示的に置換しない限りはDNAはセシウム塩だが、
そんなこと気にする奴はいない。

要するにugオーダーのDNAが何の塩であろうが、practicalにはほとんど関係
無いのだが。

>>656
なんで本人以外の悪口が反則なの？その理由が説明されていない。

反則かどうかはともかく、非紳士的行為により退場だな。

なんで本人以外の悪口が非紳士的行為なの？その理由が説明されていない。

>>657
その理屈で言うと、
NaClを70% EtOHで洗うと、
塩素が発生しちゃうわけですね。
混ぜるな危険！
みなさん気をつけましょう。
さすがは２チャン。すごいなぁ。

酢酸アンモニウムのオリジナルの試薬ビンからも
いつのまにか酢酸とアンモニアが揮発してどんどん量が減ってるしな。

>>663
baka?

>>664
残存しないと言う奴は、それが是だと言ってると思う。

>>665
相手するな危険！

酢安が揮発するなら
酢安でエタ沈したあとは
洗う必要ないね

SDS

> 酢安が揮発するなら

あのう・・・揮発しないなんていうのは釣りですよね？
こんな常識しらないなんてあり得ないですよね？

揮発するに決まってるだろ。
実際、元の試薬瓶からだって酢酸アンモニウムがみるみる減っていってるしな。

そんなの見たことねー

それはお前の観察力が欠如しているからに他ならない。
酢酸アンモニウムは揮発するんだから間違いない。

じゃＳＤＳ使ってない核酸調製なら酢安エタ沈のあとの洗いは不要だね

ああ。無駄な手間だな。

揮発するったって、ピューって感じに飛んでいくわけじゃない。
揮発するのを気長に待つより、洗った方が次の実験に早く進められるんじゃないかな?

>>628は本当ですか？だったら今日からポチになるよ。
>>624は無視ですか？>>625でオッケー？

>>674
全部の試薬が純度百パーセント奈良ね。そんなのあり得ないだろ？

663のいている事がどうしても理解できん。
７０％のエタノールに溶くと、
DNAは溶出しないがNaClは３０％分存在する水に
よく解けて、大部分が除けるのだが、
その間にCl2は放出しない。

なにをいっているのか、よくわからん。
煮たら若干出せると思うが。

水分中の塩素が抜けるだけだが。

塩化アンモニウムなんかなら、煮てればアンモニアが抜けて
pHが下がっていくけどね…

化学を勉強したことのない、かわいそうな子が何人かいますね

66666666665677666677667766676767766667767676766767667676667767m676666766666666666666666677777667666666666666666 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000

>>682
全くだ。例えば681が何を言ってるか分かる人が何人いるか。

DNAのナトリウム塩(カリウムでもアンモニウムでもいいけど)というのは、
DNAと酢酸ナトリウムの混合物なんです。
だから70% EtOHで洗うと酢酸ナトリウムだけが除けるのです。
さすがは2チャン!
ノーベル賞あげてっ!

>>685
もう痛々しいからやめな。自分で誤解して自分で煽ってりゃ世話無い。

化学も知らない奴らが、日本のサイエンスはダメだとか、おれたち
若手に予算をよこせだとかいう書き込みをしていたのか！！

いいのいいの。便所の落書きだから。
2ちゃんはウソばっかりということを、
少しでも多くの人に認識してもらえればね。

顔見えないからねぇ（苦笑
昨日配属されたようなぺーぺーが実験とはなんぞやと語ったり、
論文のでない万年ポスドクがオーサーシップについて蘊蓄たれたり
してるんだろうな。

特にこのスレはスレタイからして厨度高そうだ。

｡･ﾟ･(ﾉД`)･ﾟ･｡
( ´Д`)y──┛~
ｹﾞﾄｽﾞｻｰ
￣￣Ｖ￣￣￣￣￣
　　∧ ∧
⊂(ﾟДﾟ⊂⌒^つ≡３
　 ､､､､
　ﾐ･д･ﾐ＜ほっしゅ
　 """"
(-＿-)
(∩∩)

すいません！間違っちゃいました…
ごめんなさい｡･ﾟ･(ﾉД`)･ﾟ･｡
とりあえず去ります…。

で、結局誰が正しいことを言ってるの？？？

俺ひとり

だから2チャンに頼っちゃダメなんだってば!

共沈とか溶媒活性とか、知らないでエタチンとかしているみたいねえ。
別にDNAは沈澱時に別の塩化化合物になる訳じゃあないんだよ。
溶媒の溶質を解けさせる力を落としてやって溶質を沈澱させているのであって、
塩と化学反応させて化合物にして落としている訳ではないのよ。

だから溶質が高濃度なら塩が無くてもある程度は沈澱を作れるんだよ。

657だけど663の勘違いした意味が今やっと解った。

657＞70%エタノールwashは塩をのぞくためだから、

ただ「のぞく」としか書かなかったから、70%エタ注入後に、
NaCLが突如揮発して溶液からなくなると思ったのね？
だから、（揮発ってのは別の議論からのイメージ混乱でしょうね）

663＞NaClを70% EtOHで洗うと、塩素が発生しちゃうわけですね。

という理解になった訳ね。
いやあ、柔軟つうか新鮮つうか、なかなかすごい発想やな。
正解は＞679だが、
だけど、除ける分が大部分かというと、どうなんだ？
そりゃあ回数を繰り返すか、
要するに最終的に大容量でぺレットを洗えば
過半数以上の塩は除けると思うが、
完全に除去は無理だろな。

そりゃあ１分子くらいはＮａＣｌだって揮発してるかも試練。。。。。

>>695
よほど特殊なことをしない限りは沈殿状態で電荷は持たない。
リン酸基は必ずなんかの塩になってるってこと。あるいはリン酸そのものな。
沈殿に用いる塩の種類によって、DNA-NaになったりDNA-Kになったり
DNA-NH4になったりするわけだな。特殊な場合、DNA（酸）としても
回収は出来るが。

これは単なるイオンの対合の問題で、化学反応とは別物だがね。

ええい、こうなったら実験で証明しようって強者はいないのか？
放射性同位元素で標識された塩を使ってさ、、、

>>699
何の話？
こんなの常識レベルの問題で、分かってない奴がいるのが驚きなんだが。

>>700
ネタを楽しめない余裕のない馬鹿はっけーん

多くの人は大学卒業しているんだよね？
高校生じゃないよね？

面白くも何ともない冗談を言おうとする奴に限って
素の反応を返されると、相手を攻撃したがるんだよな・・・

生物学は理系じゃないから。
生物進む奴って、大学によっては入試で物理/化学両必須じゃないところもあるらしいね。
高校の基礎/古典物理や基礎/古典化学くらいは修めておいてもらわないと。

>>701
ネタとは思えない真剣さが伝わってくる書き込みがあるぞ・・・

>>703
冗談を理解できない白雉君、必死だな、オイ。
お前の仕事もさぞつまんないんだろうなｗ
自分だけは面白いと思っている系確定だなｗ

>>705

>>703とか超必死だものなぁ

こんな馬鹿が集まってるところにさらに馬鹿なこと言っても
馬鹿が増えたと見なされるだけ。ネタふりならTPOを弁えろ。
笑いを取れなかったお前が悪い。＞701

>>708
死ねよ

>>708
早く死ね　

自作自演Uzeeeeeeeeeeeeeeee!

IP抜いたらこのスレかなり自作自演が多いな。
暇なアホ学生、こんなしょうもないことして何が楽しいの？
3人くらい。どうみても結婚できない醜男って判るけどね。
もちろん放置。

おもりろさをわからないのを
たにんのせいにする
つよがるがしょうしんもの
ひるまからねるな
こどくはじごうじとく

＞IP抜いたら

ｸｽｸｽ

>>708
そう思ってるのはおまえ(とお前の自作自演レス)だけだ。

おまえからは口臭しか感じない。

>>715
そんなの当たり前だろ、ウンコ喰ってるんだからさ。

もう一度言う。自作自演Uzeeeeeeeeeeeeee!

　　 λ＿λ　　　　／￣ こんなネタスレムキになって存続させたがるような
　　（　｀∀´）　＜　　童貞粘着くんだから、いつまでたっても
　　 /　　　ﾉつ　　＼＿ 一人身なんだよカスｗ
　　（人＿つ_つ

エタ沈の原理でさえコンセンサスが得られないとは・・・。

こりゃまた痛い>>708のいるスレだな

理系じゃない奴らの争いには理性も理屈もないな。
もちろん理想もない。

底辺私立をクンjokeがわからないことをいばるなよ
結局、その辺しか受からない程度のアタマなんだろ
どうでもいいよ
しかも東大の植民地になってるのを喜んでるし

あ、俺はマジで帝大なので

699だが自演はしてない。

てか、いい加減意味のない煽り合いはやめたら？
そういう思いで>>699も書き込んだんだけど。
では明日も早いのでこれで失礼する。

急に伸びてるから何かと思えば、下らん。
特に必死に自演してるアホは池沼か？

おいおい！！一寸見てなかったらなんでこんなにクソカキコが入ってるんだよ！

>>719
塩分子がターゲット周りの水分子を奪うことによってターゲットを凝集させる

か否かで争ってるわけではないと思うが？

頭のいい722さん。
ここら辺でエタ沈の原理をバシッと説明してください。

>>自作自演氏へ
誰の事言ってんだ君は？
君がDQNなのは分かったけど誰の事を巻き込もうとしているんだ？
馬鹿は君一人。
勝手にやってて下さいなｗｗｗ

>>一寸見てなかったら

ﾌﾟｯ
必死で画面見つめてたくせに

後一言だけ。

ethanol precipitation（俺はエタチンって言葉は好きではないので使わない）
の原理云々より、なぜ核酸が水溶液に溶けるかをまずは理解する方が先決
だと思うがね。ではこれで失礼。

何か自演していないらしい（どうだか）699はネタじゃないらしいが、じゃあ
そのネタじゃないネタを笑えと言って必死に粘着してる馬鹿はどっから沸いて来た
んだ？

おーい。ネタじゃないらしいぞ？

>>726
カリウムを使うかナトリウムを使うかという争いから始まり今に至るまで
煽り合いが収まらないのはエタ沈の原理を理解してない奴がいるせいだと思わないか？

>>730
「エタノール沈殿」でいいじゃん。
日本語訳があるのに。

>>732
馬鹿が一匹？混じってるから。

>>730
おれはそれも含めてエタ沈の原理と言ってるつもり

>>732
問題は酢酸アンモニウム入りバッファをオートクレーヴしたとき
揮発して有意なだけうすくなるかならないか心配だということだろ？

>>736
水溶液ってものをそもそも理解してないなら、そういう心配をするわなぁ

>>737
だよなあ。
水溶液というものを理解していたら、エタノールの水溶液である７０％エタノールをオートクレーブしても心配しないわなぁ

>>738
それは水のエタノール溶液かもな。

酢酸アンモニウム水溶液をオートクレーブしても
70%エタノールをオートクレーブしても平気だよ！
だって同じ水溶液だから

さてみなさん「塩析コロイド」の原理について誰か概説できる人はいないのかな？
あとはエタノールの水親和性についてもお願いしようか

737だけど、どうやら736さんを怒らしてしまったようで申し訳ない。
水溶液にしたら揮発しないなんて言ったつもりはないんだが。

じゃ酢安をｵｰﾄｸﾚｰｳﾞしたらまずいな、非常にまずい。

もういい。俺は降りる。あとは好きに罵りあってくれ。

逃げた！

>>741
お前が説明するんだよ

>>743
ああ、藻前はあいつか（ｗ
さくあんって言う人見覚えがある。
つか藻前がいなくなれば正常化する気がするんだがね。

むしろｵﾏｴだよ

酢酸アンモニウムが揮発すると知らなかった酢安クンが、またもや粘着してる
わけね・・・

酢酸アンモニウムは揮発性だからうちではオートクレかけてません。

>>749
ああ
お前がいる限り俺もいる

うちではオートクレーブしますが、濃度は気にしてません。
どうせ少々飛んでも関係ないし。

うちではｴﾀﾉｰﾙもｵｰﾄｸﾚｰｳﾞしますが、濃度は気にしてません。
どうせ少々飛んでも関係ないし。

>>751
ここで下らん意地で粘着してないで、頼むから化学事典かなんかを
あたって調べてくれ。君がスレを伸ばしたって、化合物の化学的性質
は変化しないんだからさ。

お前がいる限り俺もいる

あの、質問ですが、うんこするとうんこ臭いのもうんこが揮発してるからですか？

参ったな。辺り構わず俺にも粘着宣言か。意地になっちゃったな。
放置するしかないかね。。。

うちではうんこもオートクレーブしますが、濃度は気にしてません。
どうせ少々飛んでも関係ないし。

>>757
気になるなら出て逝けや

頭悪いのにプライド高いと、粘着になって大変だね

そんなに悔しかったの？

めちゃ悔しい。

ばかだなあ、おまえら。
オートクレーブするときにふたをきっちり閉めればエタノールや
酢酸アンモニウムがとぶわけないだろ？
そんなことも知らなかったのか？

面白すぎるぞ。
どっかーん、　　か？

>>764
本気にしてやっちまう奴を見てみたいんだから、そんな早く
突っ込んじゃｲﾔﾝ

>>764
爆発するという迷信があるみたいだけど、おれはふたをきっちり閉めて
やってるよ。今まで爆発したことないし。

>>766
私も蓋締めてやってるよ。大体何で爆発するのか、764や765はわかってるのかね？まあ、学部生の厨房だろうけど。

>>764
真厨かよ？
それともバカを晒すのが趣味なのか。
破裂なんかしない。

>>765ってもしかして今までフタ開けてオートクレーブやってたのか？

RNA専用70-75%EtOH → 滅菌ミリQ水で作ってフィルタ滅菌
RNA専用100%EtOH → フィルタ滅菌
酢酸アンモニウム入り緩衝液 → ミリQ水で作ってふたを締めてオートクレーブ

してます（EtOHの滅菌は経験上あまり意味ないですが・・）

>>765
ｵｰﾄｸﾚｰｳﾞ用に蓋を締め付ける、ｵｰﾄｸﾚｰｳﾞ可のﾌﾟﾗｽﾃｨｯｸとｽﾌﾟﾘﾝｸﾞから成る道具が実際あるんだけどね、、、

またオートクレーブで厨談義ですかＷ

厨のオートクレーブは蓋を閉めると容器が爆発するらしいですぜダンナ

爆発ってのは内圧＞＞＞＞外圧の状態で起こるものですがな
厨のオートクレーブは何で加温するんでしょうなＷ

まさか。。。。。。。空焚き？

油じゃないの？ｗ
厨は厨学で何のために水蒸気圧とかを習ったんだ？（まだその単元に行ってない？）

>>774、775
質問スレ並に丁寧な解凍っすね＾＾

120℃まで上がりますな、
４０分程加圧しますな、
終わったら圧を抜きますな、
安いボトルですと
ぱりんと瓶の底が抜けます。

スコットボトルなら大丈夫でしょうけど、
加圧が十分には上がりませんでしょうな。

また圧を抜かないでじーっとさめるまで待っても
大丈夫でしょうけど、
何のために加圧するのか、わかりませんな。

　　　　　　　　　　　　　　　./　 ヽ　　　　　 /　 ヽ
　　　　　　　　　　　　　　 /　　　ヽ＿＿＿/　　　ヽ　 ｷﾎﾞﾝﾇ〜ｷﾎﾞﾝﾇ〜
　　　　　　　　　　　　／　　　　　　　l＿＿＿l　　　＼
　　　　　　　　　　　　|　　　　　 ● 　|　　　 |　　●　 |　　／￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
　　　　　　　へ　　　 |　　 へ　　　　　ヽ　 ./　　　　　|　＜　実験の裏技　まぁ〜だぁ〜〜〜？
　　　　　　　 ＼＼　　＼　 ＼＼　　　　ヽ/　　　　 ／ 　　＼＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ﾁﾝ　　　　　　　 ＼＼　　.＞　＼＼　　　　　　　　　　ヽ
　　　ﾁﾝ　　　　　　＼＼/　　　　＼＼　　＿　　　　　　 |
　　　　　　＼￣￣￣￣￣￣￣／　 /￣　　 ヽ　　　　/　　 ＿
　　　　　　　 ＼回回回回回／￣￣ヽ　　　　　　　　/￣￣ ／|
　　　　　　　　　＼＿＿＿／　　　　　 ヽ＿＿＿＿／　　／　 |
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ／　　　|
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　 ／　　　　 |

＞また圧を抜かないでじーっとさめるまで待っても
＞大丈夫でしょうけど、
＞何のために加圧するのか、わかりませんな。

ほんとにオートクレーブ知らない人がいるんだ・・・

>ほんとにオートクレーブ知らない人がいるんだ・・・
ｵﾏｴﾓﾅ

>>780
馬鹿を晒されて悔しがってんのかｗ

777=780か。
あほもほどほどにしとけよ。
あぼーん。

>>777=780はその阿呆の度合いからして酢安君だろう。1日経っても怒り醒めやらずか。

>>777
なんのために加圧しているのか教えてほしい。マジで。

熱と圧力でタンパク変成させて、
失活なり、殺菌なりするんです。

熱だけでも殺菌は可能で、
電子レンジでもある程度殺菌はできます。
でも胞子は残るらしいですね。

ごめん熱でタンパク変成、圧力で菌対破壊、かな。

また間違えた、菌体な。

熱だけで良ければコッホ釜というのもある。

>>777はそんなところを突っ込まれてんじゃないだろう？
「時間が来て圧を下げたら、いったん圧をかけた意味がない」と言ったところをあほだと言われてるんだが。

瓶のふたを閉めているのなら、そもそも加圧しても意味がない、
温度だけを上げればいい、という意味です。

>瓶のふたを閉めているのなら、そもそも加圧しても意味がない

これまたひどい（ｗ

１２０℃のインキュベーターに入れればいいのであって、
２気圧まであがるオートクレーブである意味がないでしょう。

２気圧の圧力は菌体ではなくてむしろ胞子、胞芽の破壊のため
でしょうな。

蓋を閉めても中身の液体によっては、
温度が上がれば内部圧力は上がるでしょう。
もしかしたら２気圧以上に上がるかもしれない。
危険だけど。

少なくとも空気の膨張分は上がる。

丈夫な瓶さえ有ればオートクレーブはいらんということか？

それは裏技だ。

あかんわ。
これ以上790につきあわんとこ＞ALL

フタはするけどきつく閉めないで少し緩めるってことでしょ、
アルミのカバーをして。

キャップを少し緩めないと蒸圧滅菌にならない。
かといってキャップを完全に外したら
滅菌後即コンタミする。

毎朝見るたびに、厨ぶりが微笑ましいのと同時に、このような
池沼のモノが研究に携わっている現実に驚いております。

ボク、圧力鍋って知ってるかい？それから、どうしてH2Oが１００℃以上に
なるのか考えたことあるかな？

マジで高校、いや厨学からやり直した方がいい。こんなアホと組んだ日には
気が狂ってしまうやも試練

ちょっと見なかったら今度はオートクレーブかよ・・・（呆
ミニプレップにオートクレーブ、なんつうか・・・覚え立ての学部生？

水（溶液）が120度になると言うことの意味をもう一度考えてみた方が
いいよ。圧力で胞子破壊とか言ってる奴はさ。

富士山頂では米がうまく炊けない。何でだろうね？

あとな、10mも潜れば2気圧だぜ。海面下10mは死の世界か？

＞あとな、10mも潜れば2気圧だぜ。海面下10mは死の世界か？

hahaha。
研究室でこんなことも知らないＤＱＮ、実際にいるのか？

>>800
785とか792とか、見てると悲しくなるな。

へえ、120度に上げるためだけに釜なのか。
だったら丈夫な瓶が有れば釜いらんじゃんか。
ほほー、やっぱ乾熱や油熱滅菌器の方が上じゃん。

圧力で胞子破壊は無いけど、高温水蒸気で胞子破壊はあるんだよ。
乾熱が120度20分では駄目な理由がそれ。
乾燥状態の胞子はやたらとしぶといけど、水でふやかしたら
それほどでもない。

こりゃ知らんかった。勉強になった。
カタログでこんな風に説明しているが、

＞高圧蒸気滅菌法は、適当な温度および圧力の飽和水蒸気中で加熱することによって微生物を殺減する方法です。

圧力はどうでも良かったんだな。
ただ水蒸気を媒体に温度を１２０℃にするために高圧にしてたのか。
へーへーへーへーへー　５へえ

溶液の加熱滅菌の話をしているのに乾燥状態かよ

水深１０mは１気圧分。

＞803

んじゃ丈夫な瓶に水を入れて１２１℃の間熱滅菌器に
４０分入れたら、内部の胞子は殺せますか？

オートクレーブを遠くまで借りにいかなきゃならないのですが、
LBくらいならラボに有る乾熱で滅菌できそうですね。
ただいくら丈夫なボトルでも40分はちょっと危険ですよね。
もたないかな。

毎朝このスレッドを見るのが楽しみな今日この頃。

>>802
おまえは液体を乾熱滅菌するのか？

>>804
だから>>803嫁。チューブとか試験管とかオートクレーブするだろ？
器具類の滅菌には蒸気じゃなきゃ駄目なんだよ。

>>807
中がちゃんと121度になっててしかるべき時間圧力に耐えられたら
オケー。

こんなとこでくだまいてないで、吉本でも行けよ。
出世するぜ。

803がいうまで誰も飽和水蒸気の役割を知らんかったのね。

>>813
そんなの常識だから誰も話題にしてなかっただけだろ？
それを802に803が教えてあげたんだろ？

あぼーん

具体的に書かないと、ただの電波だぞ

>>808
LB寒天培地で、大腸菌で、コンストラクションとかなら滅菌の必要なし。
電子レンジでさっさと溶かして、適度に冷まして抗生物質入れて十分。
冷蔵庫で１週間くらいどうって事ないぞ。

45 ：なまもの ：04/07/07 12:53 HOST:cacheflow5.sys.hokudai.ac.jp<8080><3128><8000><1080>
対象区分：［個人・三種］優先削除あり
削除対象アドレス：
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1044032848/754
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/996490423/815
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1084866161/627
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1089169519/2
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1044032848/754
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1045306977/839-842

削除理由・詳細・その他：
特定可能な個人の誹謗中傷です。
事実であるかどうかわかりませんが、
見ていて非常に気分の悪い悪意に満ちた書込みです。

上智に理系なんかあったんだ。

>>817
電波が細胞壁を壊すから滅菌にもなるよ。

せめて電磁波といってほすぃ

このスレを読んでると、電波が正常な思考を壊しそうで怖いんだが。

このスレを読んでると、電波が正常な思考を壊しそうで怖いんだが。

あれぇ〜、もう終わり？なんだ。

>>785とか>>792さんとか聡明な方のお出ましはまだぁ〜？
あーいうのが面白かったのに。。。残念だ。
で、次のお題は？

807ですこのスレ役に立ちましたー。
感熱でLB滅菌できました。
ありがとうございました。

>>792のどこが聡明なんだよ。
別のスレでいじめられてたＤＱＮじゃねーの？

思いっきり皮肉だろ。

>>827
何を言ってるんですか？皮肉とは失礼な！
私は本気で彼らの降臨を待っているんですよ。


さぁさぁおいでなすってください。
待ってますよぉ〜

SOC培地培養中って何だよｗ
「培地」培養中

お前が意味不明だよ。馬鹿市ね

裏技はどうなったのか

滅菌だけならオートクレーブでいいと思うけど、
これだとウイルスは死なないよ
（ウイルスを生物というかは疑問だからこの表現はおかしいけど）

園芸農家はウイルスを殺すために
植木鉢を再利用するときは600℃で3時間感熱するらしい（うろ覚えでスマソ）。

まだ乾熱と水蒸気滅菌の違いが分からない雑魚がいるのか

以前、微生物の培養してたときにコンタミしました。
全部滅菌して手も除菌できる石鹸使用して７０％エタノールで消毒したのにです。
何がいけなかったんでしょう？

全部滅菌できていなかったからです。

無菌操作がヘタクソだからです

>>835-836さん
やっぱりそうでしたか・・。
微生物扱う研究室辞めて良かった。

ラボを移ったんだが、培地は手作りだしチップは自分達で詰めてからオートクレイブだわ、
とにかく貧乏くさい。遠心も前は３人で２つだったのによー。
雑用やる専門の人もいないし、前のラボに戻りたい・・・

シークエンスかけるにも一台しかないから予約で３日待ちとかそんなん。
ふざけすぎ。

>>838
研究室に入ったらそういう状態だったからそれが普通なんだと思ってた
よっぽど金あったんだね

植菌は滅菌した爪楊枝ですが。

それは普通じゃないか？

実験のウラ技じゃないけど、学部４年の時に外研に出て
そこの先生と関係もって卒論８割やってもらった。
おかげで大絶賛だったよー。

>>843
関係って何関係？
まさか○体関係？

まぁそんなとこ。
でも別れる時はあっちがダダこねて大変だった・・・。
やっぱツケが回ってくるんだね。

>>845
おまいは最低や！

え、なんで？
身体張って卒論仕上げたんだよ？問題ないじゃん。
うちの大学、他にもいるよ。

学部の卒論程度で体張ってるようじゃきついねえ。

うちの学校だろ
まぁまわりで結構噂になってるよ。

>>843
女ですよね?

等価交換なんだから当事者の勝手だね

教授の方が得してると思う。等価じゃない。

843が等価だと思ったんならそうなんでしょ

843の体は卒論大絶賛程度の価値しかないってことだね。

>>854
それってほとんど無料サービスだな。

すみませんが質問があります。
栄養塩用のサンプル保管用にディスポの
プラスチック遠沈管を使おうと思っているのですが、
新品の場合は酸洗浄とかしなくてもいいでしょうか？
離型用のグリースとか残ってないですかねぇ？

どれぐらい精密でなきゃならんかわからんので答えにくいが
気になるなら洗ったらどうですか

うちでは酵素反応やなんかに使うミリＱ入れるには洗ったりしてません

以前DNA技術を習ったラボではアシストのシリコナイズチューブを使ってたが
水を入れたら油みたいのが必ず浮いてきてたよ
それでも気にせず使ってた

できるやり方が正しいやり方

>>848　東大らしいよ。その女。

>>849　どこの大学？
もしかして山のてっぺんにある大学？

ECLを節約したいんですが、
ある程度希釈できるんでしょうか？
希釈してもそれほど感度は落ちないのでしょうか？
希釈には何を使えば良いのでしょうか？

ＥＣＬは自作しれ
www.st-andrews.ac.uk/~rthlab/methods/ecl_homemade.html

http://www.abrf.org/Other/ABRFMeetings/ABRF2004/2004PosterAbstracts.pdf
のＰ９−Ｔ

詳細不明じゃねえかよ！

ディープフリーザーが使えなかったんで、培養細胞の保存のとき発泡スチロールのコンテナに
LN2入れてそこにバイセル直接漬けて１時間くらい放置→LN2タンクに保存、ってやったけど
こないだ細胞起こしてみたら割と普通に起きてきた。

細胞によると思われ

コンピ作りたいんですけど、5mlのチューブで集菌する時に使う遠心のローターが
スイングしかなくて上手く作れません。3000rpmで15分遠心すると菌がチューブの底で
ぺレットになりTBバッファーに溶けません。回転数を下げるか時間を減らすかで解決しそうな気も
するのですが、どなたかスイングローターでコンピを作っている人いますか？
新しいローターを買ってもらえるほど裕福なラボではないです。

TB入れたらピペットマンp-1000をつかって
ペレットにゆっくりTBを吹き付けながら分散させる



















ちょっとは工夫しろよぉ

>>867
結構しっかりしたぺレットになってしまうのですが、
その時点で底の菌が死んでしまっているようなことってありませんか？

大き目のチューブで浅めに菌液入れれば、もっと早く沈殿するよん。
ブルーチップより、１ｍｌ（５ｍｌでも可）ディスポピペットの方が
菌を傷つけないのでベター。
当然コールドルームでやること。

5mlではなく50mlのチューブでした。失礼しました。

>>869
ディスポピペットですか。優しくピペッティングするのが難しそうですが、
どうやっていますか？口ですか？口はちょっとまずいですよね。

ピペットエイド知らないなんて、釣りなのか？

ちなみにコンピのタイターは増やし方でも変わるよ。
１８℃で増やすと最高。

>>871
結構古いピペットエイドなんですけど、使ったことないんで
強弱が調節できるかわかりません。調べてみます。

>>872
今度試してみます。

ありがとうございます。

>>873
うちではちょっと大き目のシリコンの駒込ピペット用駒を
つかってやってるよ　そのほうが微調整が利くし簡単だし。
一個20円くらいだよ。

遠心すれば、ペレットになるって当然の事じゃないのかな。
50mlのファルコンなら、まずバッファー10mlくらい入れて
シャカシャカ振れば溶けますよ。
一度にいっぱい入れると何故か溶けにくいです。
うまく作れないってことは、形質転換効率が低いって事だと思いますが、
cellの濃縮がうまいこといってないだけだったりして。

気泡を含むように攪拌すると、タイターが落ちる。
やさしくピペッティングが一番。

懸濁適当にやっても大丈夫だったけどなぁ（18度で５x８乗くらい）
軽くvortexしてたし。

初心者には王道を教えるべき。

うちにはコールドルームがないので
とにかく手早く

培地をデカントで捨てたあとキムワイプの上でひっくり返して５分間放置
とかいうけど
コールドルームがないうちではダメだね

デカントしたチューブのリムに残ってるしずくを
ブルーチップでじゅるるーっと吸い取ってる

>>979 TBで２回洗ってるんだから、デカントで除けるだけで十分。ペレットの状態で５分も放置する方が問題だと思うが。

最近作ったコンピの効率が悪い
ＴＢを作り替えてからかな

どなたかアグロバクテリウムからのプラスミド抽出の仕方教えて。
大腸菌のボイルプレップでやったら、なんにもなかった。
なんか方法ある？

アグロはむしろ酵母に近い細胞壁の固さをもっているから
酵母用のDNA抽出キットを使うとよくとれるんだよ

ボイルしたらペレットも出てきたから細胞壁は壊れてるとは思うんだけど、
全くでなかったのはどうして？

ウエスタンで抗体を節約するのにどうしてる？
パラフィルムでメンブレンを挟むと節約できるけど、どうしてもムラができる。

>>882
Rapid procedure for detection and isolation of
large and small plasmids.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=7009583
これじゃだめなの？
タイトルしか読んでないから、よく分からんが。

>>885
ブロッキング試薬を入れずに１次抗体を当てる。もち希釈度上げる。
モノによっては１００倍以上感度が上がるぞ。

>>885 アザイドを入れて使いまわす。

>>885
ハイブリバック、もしくは厚手のビニール袋を小さく切った奴に入れて
ヒートシーラーでふたする。
今まででこれが一番節約できる。
もちろん回収して使い回す。100cm^2でだいたい２ml位かな。必要量は。

>>889 さらにそれを２枚のガラス板などにきつく挟んでビニール袋の
たわみなどに由来するムラを防ぐとmuch betterrrrrr

>>890
なるほど！次からそうする。

>>886
何でこの方法は生き残らなかったのかな
エタ沈しないでも泳動にかけられるのに

GC−richの解消法ってあるんですか？助けてくだしゃい！卒論が・・・・・

１．高温で游動
２．フォルム網戸仕様
３．酸化剤納入（水素結合阻害）

データ以前にその文章力では、相当苦労すると思うぞ>>893

へけけっ！
そんなの余計なお世話ぶぁい！

>>1
データの採れない場合は想像力で補え！！！

>>893
PCRのこと言ってるの？
それともRTかな？どちらもGC-richだとposingするけど。
とりあえずDMSO入れてみるのがデフォルトでしょうね。

ガス栓が使えない上プロパンのボンベをおくスペースもない部屋でどうしてもブンゼンバーナー
使いたいんですが、ブンゼンバーナーと携帯用コンロのボンベをつなぐ方法とかありますか？

>>899
アルコールランプとかは駄目なの？

寿司屋で穴子ネタに焦げ目付けてるハンディ型のバーナー

アウトドア用の縦型携帯コンロは如何？

色々と回答ありがとうございます。

火力がほしいので>901のハンディバーナーで行こうかと思います。>902も考えましたが
値段が高いのであきらめました。

いろいろアドバイス有り難う御座います！参考にして頑張りましゅ。
因みに、８９６は僕ではありません！へけけ

裏技裏技

ともだちんこ

裏技というか小技だけど、いちいちビーカーや三角フラスコ一本だけオートクレーブする
のがめんどくさいとき、70%のエタノールスプレー→ライターで点火、ってやってる。

あと、DNA断片のLMG精製のとき電子レンジ使うのって普通ですよね？

ミニプレップする直前の、十分増やした大腸菌液を数ulを
サーマルサイクラーでボイルしたのちに電気泳動したらきれいにプラスミド相当と思われる位置で
かつサンプル間で違う位置にシングルバンドが出たんですけど
これでインサートの有無を見込んでミニプレするのって危険ですか？

サイズマーカーを短いバンド用を使ってしまったので
具体的にどのくらいの長さかチェックしそこなったのが残念です。長文すみません。

なかなか良さげだがある程度希釈しないと塩濃度高すぎて
位置ぶれそう。シングルバンドってのはすごいな。

908は誰かほかにもやってそうだが真偽の程はいかに？
おれはしらんかったがこれはもしかしてすごいんじゃないのか？

プラスミド：インサートの比によるんじゃないの？
5:1ぐらいならいいんでないかな。

コロニーでPCRかけて当たった奴だけ増やすもんじゃないか普通？

コロPもうまくいくときゃあうまくいくけどけっこう偽陽性やら偽陰性が多いが
908の方法なら909の指摘にきをつければいいんでないかい？

誰か今ちょうど増えた菌液もってる香具師
追試したれ。漏れはもちあわせがないんだスマソ(ry

ボイルは試してないが、コロニーかき取りアルカリＳＤＳを含むろーでんぐだいと混ぜてそのまま泳動はしょっちゅうやってる。ころＰより楽。
ただスーパーコイルなので普通のマーカーは使えないし、インサート入ったものが必ずしも上に出るとは限らないので注意が必要。

あらかじめセルフライゲーションのときの移動度を
普通のマーカーのときで把握しておけば、それと違う長さのをピックアウトしてきゃあいいって感じなのかな。
試してみようっと。
ボイルしてぶちぶちにしたら、制限酵素でシングルカットして直鎖状にしたときと
同じ移動度になってそうだから普通のマーカーで測ってもよさそうな気もするが＞915さん

そのうち痛い目にあって元さや

>>917
あははは、うまいこというね。
こういうのに熱心こるのは大概暇な修士なんだな。

>>916
ミニプレップの教えにあるとおり、煮ようが、アルカリに漬けようがそうそうぶちぶち切れないし、中性室温にすれば元に戻るのがプラスミドの良いところ。というわけで直鎖状の普通のマーカーはダメ。
どこかのメーカーがスーパーコイルの分子量マーカーを売っているのを見たことあるがどうせまともな数字は出ないので馬鹿っぽい。
実戦では空ベクターを同じように処理して流すべし。検討を祈る。

ミニプレなんて機械にやらせりゃ良いんだから、そんなところで妙なトリックを追求する必要ないだろ。

コロニーピック＞培養＞ミニプレ＞制限酵素処理ａｎｄ／ｏｒシーケンス＞画像解析＞当たり判定
までやってくれる機械があればベストだ（中に人が入っていても良い）。
・・・・
つまり何でも金で解決というのが最高の裏技だが、それを言ったらこの板いらんだろ。

みなさんありがとうございます。
>>915さん
あなたのその方法で成績的にはどうですか？
１００％ではないかもしれないですけど好成績っぽいですが

>>921
偉さを比較して何か意味があるのか？

908の方法やってみたけど
インサートあるのとセフレライゲーションだとかなり長さ違うな。
けっこうあてになるほうほーかも。
ただ塩濃度のせいでぶれるのかわからんが、同じセフレでも微妙に
バンドの位置が上下してたのが気になる。

みんな切ってしか流さないのかな。
もらったクローンがダイマーだったなんてよくあるしなぁ。

915みたいな直接泳動は
コロニーが大きくないとできないのでは？

アガロース電気泳動で　最後にすこし逆方向に流してみる
スマイリングが若干改善する気がする

なわけねえだろ

やってみて

電気泳動は拡散を除けば可逆的な過程だからね

アガロースゲルのとき　コームの断面を長方形ではなく　台形状に削るときれいなバンドになる

と思ったら既に市販されているのねえー

>>922
実用的に問題ないのでルーチンに使っています。まずはお試しあれ。
ただネガコン（空ベクター）と比べる実験は必ず入れた方が良い。
セルフの方が多いと決めつけて実験を行ったところ、実際はインサートありのクローンのほうが多くて、わざわざセルフをつついたこともあるので。
>>926
確かに最低でも直径１ｍｍ弱はほしい。
とにかく急いでいて数時間でも早くプラスミドがほしいときは、908のように液体培地で増やしている途中でチェックする。

>>927
うちのラボなんか・・・人間関係が殺伐とし過ぎて・・・「スマイリング」なんぞゼロに等しい！

そうきたか

>924
遅レスで申し訳ないけど"セフレ"ライゲーションて入力ミス？それともそんな用語があるの？

>同じセフレでも微妙に
>バンドの位置が上下してたのが気になる。

で妙な妄想を....

おちゃらけで書いたんだろうよ
ただそんなこと書いてるせいでラボで思わず口走ってしまったりしたら笑えるけど

ボクもセフレに上下してほしいです。

みなさん、ありがとうございました。試してくれた方も915さんも。
はい、所詮わたしはM2です。
その後もけっこううまくいって、目的のものがゲットできました！
セフレじゃないけど彼にはうまく入った分おねだりしています。
ここには発現プラスミドつくってる人多いみたいなのでお互いがんばりましょうね。

Ｍな２年生、萌えぇ〜！！

やっぱ送入上手なんでつか？

おまえらセルフ○○○ーションばっかりなくせに・・・寂しい奴らだな（ｗ

この前、隣のラボに所属している彼女に
ふざけて「今夜、君とライゲーション！」と言ったら、
「キット使う？」と真顔で聞かれた。

結局、その夜は二人とも忙しくて、
ライゲーション出来なかったけど・・・・
未だにどうゆう意味だったのか聞けずにいる。

をいをい・・・実験なんかいつでもできるだろ。
なんでもっと口説かなかったんだ？明らかに誘ってるじゃん、その女。

いや、誘っちゃないだろ。どうしてそこまで楽天的になれるか。

そんな近くで付き合うなよ　周りがめんどくさい

>>942の「キット使う？」の解釈

１：今夜私もあなたとライゲーションすなわち性交渉したいのですが、
道具を使って性交しますか？

２：奇遇でね。今夜私もプラスミドのライゲーションをするのですが、
私のラボには良いライゲーションのキットが余っています。
一緒にこのキットを使ってライゲーションしましょうか？

３：あんたみたいなキモオタが私とやろうなんて一万年早いわよ。チクワでも相手に一人でやってろ。

４：キット（だっちわい・）使ってね。

５：「君とっ！？買う？」（援交）の聞き間違えor脳内変換

キットつかおうか、と答えてみればよかったのに

おまえら分子屋はキットが無いとｾｸｰｽもできんのか！

ばらで買いそろえる方が高くつくでしょ。

どんなインサートでも射れるから漏れにもおねだりしとくれー！

良すれの予感age

藻前らの周りで発現プラスミドつくってるMな2年女はいねぇかぁ〜！！
何をおねだりしてんだぁ〜！
ナニかぁ？
洩れにもおねだりを〜！

BamHIのPartial Digestionをして、目的のバンドを切り出して、サブクローニングしたいけど、どうしたらいいですか？
酵素の量を減らす？反応時間を減らす？温度を低くする？
経験ある人いますか？

partial ってなんですか？　切れ方が不完全でもいいって事？

BamHIの経験はないが
酵素量を減らして、反応時間を５分とかでおＫ
サンプルに余裕があるなら酵素希釈系列つくる
温度低下の効果はいまいち
＞957
確率的に切れたところと切れていないところが混ざった状態

>958
どうもありがとうございます。
明日試してみます。５分というのが、すごい。
>957
NcoI/BamHI断片の450bpを切り出したいけど、その中にBamサイトが一カ所あるから、
その箇所を切れないようにしたいのです。

まず二本鎖DNAを１本鎖にする
切りたいところに相補的なプライマーを入れる
酵素で切って　また熱変性で１本鎖にする
ゆっくりアニール

その前にPCRではだめなの？
5'側プライマーはNcoIサイトをつけて
3'側はBglII（BamHIのコンパチブル）なら　切れ口は同じじゃない？

>956、BamHI
partial digestion（サンプルがたくさんある場合）
1)まずNcoIで切ってリニアにする
2)精製（フェノクロエタ沈等）
3)サンプルを4〜8本に小分けする
4)BamHIで切れにくいbuffer(TakaraのMなど)を入れる
5)BamHIを2-fold dilutionしてサンプルに加える
6)37℃で15分
7)dyeを加えて反応を止め泳動、該当部分を切り出し

>>956
960のようにPCRをオススメするがダメなの？
まるでBamHIで切ったようにBamHI末端をつくる方法があるぞ。
例えば、BbsIサイトをprimerの5'側に付けておき、（CGGAAGACCGGATCC..の様に）
増幅産物をBbsIで切断すればBamHIと同じところで
同じ末端として切れるよ。
GGATCCはBamHIサイトで、GAAGACはBbsIサイト。
こんな感じの酵素はBsaIとか他にもあるから、増幅産物内に存在しない
酵素を使えばいい。
BglII（BamHIのコンパチブル）だとAGATCTだからちょっとだけBamHIで切った時と
違ってしまうのだが、この方法なら全く同じ末端になるよ。

どうしてもpartial digestionするなら、予備実験をしっかりやった方がいいと思います（時間か酵素量をしっかり振って）。

そろそろ千取り合戦か？

話がそれるが、おれの所属してるラボは細胞生物系で、人員１０名、年間予算２０００万くらいなんだけど、
発表論文は年間３〜６報（IF>10が０〜１、IF>5が１〜２報、それ以下２〜３報）ってな感じ。
これって優秀な方なんだろうか？

tegatai

>>964 修士の学生も含めて平均１報/２年てことだから、なかなか大したもんなんじゃないか？

>>964
ひとりあたま消耗品費200万円、ポスドクはなしの助手・院生
主力だったら、かなりたいしたもんなんじゃないか？
きっとそのうち２〜３年に一度はCNSや姉妹誌がコンスタントに
でるようになって、20人以上規模のラボになるだろう
ボスが野心的ならば。

>>964
大阪の研究所の方ですか？

俺のラボ　博士1人　修士1人
年間予算50万

論文は2年で3報くらい（IF=1〜2）
こんなもんでしょ？

年間５０マソでなぜ成果がでるの？
奇跡だ！！

何の分野?
動物植物は無理だよね
バクテリアかシミュレーション？

栄養学

969です
1人50万ね　2人で100万/年
分野は主に分子生物学
タンパク発現（大腸菌、酵母、哺乳類）　マウスでの実験なんかもやってます
ベクター、菌なんかは全部分与、　　マウスは自家繁殖
実験サンプルはフィールドから持ってくる
金かかるのはやっぱりTaq、制限酵素、Bigdye、FBSかな？

でもIF3以上の雑誌には難しいよ
まじめなサラリーマンって感じ
貧乏学極めるか・・・

抗体はmQで希釈。

ところで、エタ沈とイソプロ沈があるけど
エタ沈のほうが良い事ってあるのですか？
イソプロ沈のほうが少ない量で沈殿できるし、沈殿量にも差があるとは思えない。
どうして未だにエタ沈をする人がいるの？

イソプロ沈しても最終的には70%エタでリンスするだろ。
その後の処理を考えるとエタ沈の方がいいこともあるらしい。
それと、沈澱の仕方が全く同じではないと思う。
NTPの落ち方とかに差があったような。

エタ沈はエタチン税を取られるからイヤ

>>976
そうなの？
採ったＤＮＡに不純物が多くなるのか？＞イソプロ

磯プロ臭いから嫌い

磯プロの臭いが好き

エタノールは飲んだら酔っ払うが、イソプロは？

>981
たぶんものすごい体臭がするんじゃない？