▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼

932 ：930：02/12/05 10:30

>931 いや、イソアミルアルコールもCTABも構造式は書けるんですが、
CTAB法はよく知らないもので。出過ぎたレスごめん>>928
CHCl3:IPA=2:1だと水が有機層に取られて水溶液から何か出てきてるの
かな？と思ったんです。

Molecular Cloningには高塩濃度CTABでDNAは溶けていて、これに
IPAかEtOHを加えると沈殿するとあったので、高塩濃度CTABで生じる
もやもやは別のものでは？

933 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/05 22:18

つうか普通にクロロホルム抽出とかフェノクロにはIAA入れるのが本来の方法でしょ？
わけわっからんな。君。
>>932のレスは無視だな。こりゃ。見当違いにもほどがある

で、中間層の白いのはタンパクとか脂質ですよ。
ちなみにゲノムがこれらに絡んでいるので、
水層をピペットとかで吸うと、引っ張られてあがってくるから注意ね

934 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/05 22:20

DNAではないので間違っても吸わないように汁！

935 ：植物系：02/12/05 23:58

>929
転載ありがとうございます

>929-934
ありがとうございます
>930
説明不足で申し訳ありません
CATBとクロロ/イソアミルを混ぜて遠心した後の澄んでる上澄みに
クロロ／イソアミルでなくCATBを入れてしまうと、濁ってしまうので
これがその後に悪影響を及ぼすのではないか？回避するとしたら
どのような方法があるのか？と思い質問させて頂きました

＞で、中間層の白いのはタンパクとか脂質ですよ。
ちなみにゲノムがこれらに絡んでいるので、
水層をピペットとかで吸うと、引っ張られてあがってくるから注意ね

上澄みの上のほうを擦ってもｺﾞｺﾞｺﾞと上がってくるのでいつも若干入ってしまいます

話は変わりますが、CATB/クロロイソアミルの上澄みは澄んだ茶色なのですが
これが濃いほどDNAがｲﾊﾟｰｲとかってあるのでしょうか？
（水浸状の培養植物だと茶色どころか薄い黄緑です）

936 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/06 00:08

> 上澄みの上のほうを擦ってもｺﾞｺﾞｺﾞと上がってくるのでいつも若干入ってしまいます

なるべく吸わないように太めの使い捨てスポイトで吸ってる人も居ますよ
まあ少々ならすっても平気でしょうけど
>
> 話は変わりますが、CATB/クロロイソアミルの上澄みは澄んだ茶色なのですが
> これが濃いほどDNAがｲﾊﾟｰｲとかってあるのでしょうか？
> （水浸状の培養植物だと茶色どころか薄い黄緑です）

濃いほど葉緑素が多いって事です。
だから薄い方がキレイだよ
まあ色が濃いってのは最初のサンプル量が多いから濃くなるんだろうから
濃いほどDNAがイパーイってのはあながち間違いではないけども、
あんまり良い事じゃないよ

937 ：植物系：02/12/07 00:46

>636 ありがとうございます

938 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/08 17:56

site-derected mutagenesis はじめました
ヒット率があまりに低いので困っています
5％ぐらいしかとれてきません
あとは元のままの配列です
どこが悪いのでしょうか

939 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 01:22

>938 ヒットしたものを取って終わりではないのでしょうか。
次回のヒット率を上げたいということでしょうか？

940 ：＞938：02/12/09 02:04

お互い逆向きになるよう設計して変異を入れたプライマー２つでプラスミドを一周するPCRをしろ
ついでにプライマー内部にサイレントミューテーションになるように上手く制限酵素サイトを
入れて制限酵素切断してからライゲーションすればOK

PCRのあとDpnI処理するのも忘れるな。

941 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 02:37

>>938
http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/olul/upld59/technical/kodplus59tr01.pdf
増えなかった…
KODplusを買えと言うことか？

942 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 11:48

943 ：wildtype：02/12/09 21:34

すみません、突然ですが、教えて欲しいことがあります
SDS-PAGEでバッファにグリシンが入ってるのは何故ですか？
さらにBlotするときのバッファにメタノールが入っているのは
何故なんでしょう？

というかこういう疑問はどこで
解決すればいいんでしょうか・・・

944 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 22:29

＞９４３
君は４年生？
まずは人に聞く前に調べるってことを覚えなさい。
こんなことが本に載ってないなんて言わせないよ。
ちなみにSDS-PAGEのバッファーってTris-Glyだよね？
今時リン酸系なんてないかな・・。
まずTrisとSDSだけ溶かしてpHをはかってごらん。そんでGlyいれてから
またpHはかってごらん。それで答えがわかるよ。
もう一つはメタノール入れないでぶろっとしてみればわかると思うよ。
ちなみにPVDFって何の略だい？
単に言葉だけ覚えても意味無いからね。
最近そういう輩がおおいよ。Ph Dでも痛いのがいるからな。
君はそうならないように精進しなさい。

945 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 22:30

http://science.2ch.net/test/read.cgi/future/1022864257/l50

瞬間移動ついに実現か。　MIT教授ら
M.Minsky（原子核物理）、N.Simon（金属物性）
両教授は６日、パラジウム金属の超微細な粒子に重水素ガスを取り込ませてレーザー光線を当てる新方式で、
物質の空間転移を確認した、と発表した。
空間転移に必須とされる超高圧の状態以外でも実現できたことで、大規模装置の必要のない空間転移などの可能性があるという。
　空間転移反応を起こすには、重水素などの原子と原子を接触させることが条件。
両教授によると、パラジウムとジルコニウムの合金を焼き、直径５・メートル（ナノは１０億分の１）の範囲に
パラジウム原子約８０００個が格子状に集まった超微細粒子を作った。
この超微細粒子に重水素ガスを吸わせると、パラジウム原子１個に対し、通常は１個未満しか取り込まれない
重水素が約３個取り込まれ、凝集。
さらに溶接に使うレーザー光を当てると空間転移が起こり、仕切りで区切った別の箱に原子数百個が転移した、という。

　山下慶太・名誉教授（原子核物理学）の話　この手法は優れており、世界でも例がない。
空間転移反応は、常識をくつがえすもので、今後の関連の研究に期待したい。　

946 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 22:32

＞９３８
もとのままのが多いってことはおそらくはDpn Iが効いてないんだろうな。
でもあたりがとれてるんなら別にいいじゃないかと思うが。
１００％にしたい？

947 ：wildtype：02/12/09 23:18

＞９４４
すみません、ご意見ありがとうございます。
僕の言い方が悪かったのですが、
メタノールやグリシンじゃないと駄目なのか、
他の物質じゃ代えが効かないのか、ということを聞きたかったんです。
まぁ基本的に調査不足ですね。精進します。

948 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 00:02

超遠心でgDNAを精製しました
溶媒はTE-塩化セシウムです

DNAを取り、いろいろ処理をして、下層の溶液+2倍量TE+さらにその2.5倍の100％エタノール
で-80℃30分以上しました

その後にすぐに遠心（80分）しました
そしてペレットを70％エタノールでリンスして遠心して（15分）白いペレットを得ました

遠心の温度は4度でした

白いペレットを見てふと思ったのですが
-80度から4℃遠心の間に溶液を溶かして、塩化セシウムが析出するのを確認して
それを溶かしてから遠心する、という処理が必要だったのではないか？
このペレットには塩化セシウムがかなりあって、それで白いのでは？

皆様のご意見を聞かせて頂けないでしょうか

949 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 01:01

そうですね
そうおもいますよ

950 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 06:37

禿同
だからセシウム振ったあとは，一般的には透析でＤＮＡをとります
透析しないでエタ沈したら，重たいセシウムのジャリジャリの上に
へなへな～っとＤＮＡが乗っているので，吸い取って捨ててしまいやすい
セシウムジャリジャリになったら７エタではセシウムを除去しきれません
いったん適当な量の水に再溶解してエタ沈をやり直すとよい
ただしとれてくるＤＮＡはセシウム塩と思われ
酵素反応大丈夫か？

951 ：938：02/12/10 06:50

>>940
ありがとうございました
逆向きプライマーでPCRですね
やってみます
ただしターゲットはコーディング領域でないので制限酵素サイトの導入は難しい
とにかく4^3-1=63とおりのミュータントがほしいんで，ヒット率を上げないと大変です（-1というのは野生型です）
>>940,946
DpnI処理についてもう少し聞いてもいいですか？
DpnIてGATCをブラントで切る制限酵素のこと？
だとするとプラスミドがぶちぶちに切れませんか？

952 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 08:14

Dpn1 はメチル化されたDNAを切るのでPCR産物は切らない

953 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 08:35

>943=947=wildtype
>メタノールやグリシンじゃないと駄目なのか、
>他の物質じゃ代えが効かないのか、ということを聞きたかったんです。

まだ読んでるか？　確かに943の質問の仕方では、「まず自分で調べろｺﾞﾙｧ」と
言われても仕方ない。だが、盲目的にプロトコルに従う実験馬鹿が多い中、代替品
の可能性を考察する態度が個人的に気に入った。本で調べる上でのヒントをあげよう。

まず、ブロッティングバッファにメタノールを入れる理由は割と簡単だ。
適当なプロトコル本を手当たり次第に読め。
それに対して、グリシンを入れる理由は、ちょっとてこずるかもしれんぞ。
普通のプロトコル本や生化学の教科書には載ってないと思う。
図書館に行って、電気泳動に関する専門書をひもとくべし。

俺もあくまで又聞きなので間違っているかもしれないが、俺が知るところでは、
本来グリシンはその効果が予想されていたものではなかった。つまり、「理由は
分からないけど、入れてみたらSDS-PAGEがうまくいっちゃった！」ということ。
その辺のエピソードはどうも眉つばなんだけどね、グリシンは入れると良いことが
おきる、というのが経験的にまず知られていて、理論的根拠は後付けらしいんだよ。

ところでついでに>>944、お前さん、SDS-PAGE bufferにグリシンを入れる「本当の」
理由、もしかして勘違いしてないか？
>まずTrisとSDSだけ溶かしてpHをはかってごらん。そんでGlyいれてから
>またpHはかってごらん。それで答えがわかるよ。
ここだけ読むと、まるでグリシンはTrisをバッファライズするためだけに入れてると
思っているように読めるんだが・・・大丈夫か？

954 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 08:39

キミこそ大丈夫か?

955 ：953：02/12/10 08:46

954は944なのか？気に障ったならあやまるが。
しかし、グリシンの電気泳動時に果たす役割を考えると、単に
pHを計るだけでその存在意義が判るとは思えないんだがね。

956 ：948：02/12/10 10:27

ありがとうございました
もっかいTEと100％エタノール入れて-80℃に入れてみます

957 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 12:44

メタノール入れ忘れたままブロットしたが、特に変なことは起こらなかった。なんのために入れるのか漏れもわからん。

958 ：wildtype：02/12/10 15:04

＞９５３、９５７
レスありがとうございます。
やっぱり経験則って部分が大きいんですかね・・
調査してみます。

959 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 15:23

経験則の部分をいかにして根拠があるように見せるかが査読論文をうまく書くコツかも。