実験の裏技ありますか？

実験の裏技情報希望・・
例えばHelaの培養で、こんな培地でやってみたけど大丈夫だったとか。

大腸菌へのトランスフォームでSOCじゃなくてDWで薄めてまいてる。とかですか？
こんなのは基本か。

大腸菌のトランスフォーメーションはコンピにDNA入れてon ice5分で
それをそのままプレートにストリーク。
めんどいからわざわざ薄めない。

ネコをぬぐうには｢ネコの泉｣に行くとよい。

シークエンスするときにミニプレするのも面倒だからコロニーから
直接シークエンスするとか？

コロニーPCRからのシークエンスならありだね。

免疫染色、ハイブリでブロッキング省略。
無駄なことはしない主義でね・・

ブロッキングもハイブリも0.4Mリン酸バッファーと7％SDSだけ。

デンハルトも鮭精子DNAも使わない

>8
どういうハイブリの時の条件ですか？

普通のノーザン
10-30マイクログラムRNA／レーンで流して、ハイボンドN+にブロットして
上記の液で６５度でブロッキング、同じ温度でハイブリして後は他と同じくx２とX0.2SSCで洗う

とっておき、でもないが。

免疫組織染色やin situ hybridiationでスライドグラスにマウントした
反応液を取り除きたい、という時。

キムワイプなんかを丸めて100%EtOHを吸わせたやつを数mmまで接近させる、
すると反応液が半球状に凝縮してきれいに吸い取ることができます。パップ
ペンを切らしたときにでもどうぞ。

パップペンて何？

マジックみたいなやつ。これで切片をの周りを囲むようにしてスライド
グラスに輪を書いておく。すると疎水性のインクに阻まれて反応液が輪
の外に漏れ出さない。井内盛栄堂のカタログなんかで載ってる。

滅菌したガラス器具が手元にないときで
オートクレーブする時間がないとき。
ぬらさない状態で電子レンジ、最高出力３分。
コンタミ菌がもしいても、これで確実に死滅。

>8
church法ですね。
ゲノミックサザンにも使える？
ノザンで微量なmRNAも検出できる？

Hybond N+ への核酸の固定について
UV， bake, アルカリどれを使用？
どれだけで十分？

アルカリトランスファーしてから
UVでおしまい。
posiメンブレンでbakeするのは
ドキュソ。UVも、やらんでもいいと思う。

即席滅菌法って役立ちそうだ。

ノザンやサザンのサーモン、cot1は入れなくても
大して変わりはないね。確かに。
でも、
免疫染色のブロッキングはしないと駄目だろ。

みなさんHybond N+ですか？やっぱり。

＞18
ネタに決まってるだろ

泳動用dye＆グリセロールを一緒に入れてPCR→直でアプライ。
大量にコロニーPCRするとき便利。(裏技じゃないけど周りではマイナーなので)

>21
takaraにキットがある。

↑見てみた。キットだと25μl×48回で15000円 (RR020A)。rTaqで150U分か。
1g 900円のdyeでいいし遙かに安いよ。

おっと、dye入り(M13固定)は16000円だった。訂正。

ほんとの裏技。Taq発現ベクター入り大腸菌。

＞25
それは口にしてはいけないsage

昔から思ってるんだけれど電子レンジで殺菌はできるん？

>>17
なぜbakeはドキュソ？

ド、ド、ドキュ、、、、ドングロ？！...ﾊｱﾊｱ;

age

age

>>27
出来る。
ある程度の確率でコンタミするが･･･
カルチャーディッシュを再利用したことがある。

他人の培養してる細胞の中に指つっこんじゃうってのは、
裏技に入りますか？

>>35
バレルと恨まれるので恨技です。

>>35
　酵母Nハイブリッド or ES cloneの培養に偽陽性クローンを入れるのは裏技ですか？

他人のやってるウェスタンブロッティングのメンブランに
お相撲さんみたいに手の跡をつけちゃうのは裏技ですか？

嫌がらせスレになるのか？

32P dCTPを程良く寝かせて比活性調節。(ちょっと33P風)

ひそかに+極と-極を入れ替えておいてサンプルをとばさせるのは裏技ですか？
blunt endを作るときに、制限酵素と同時にKlenow+dNTPをいれておくのは
常識ですか？

そろそろage

Dr.YK氏シリーズはどの程度常識ですか？
　http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/cobr/rakuchn.html

冷却し忘れた大型遠心のローターをLN2冷却。

余談：
一度何を思ったのか液窒を注いだ後にローターの蓋をしめてしまった。まずい！
と思ったが既に遅く、ネジに内圧がかかってはずれない。爆弾と化したローター
をおいて俺は逃げたね(冷

>>44
で、どうなりました？
停電してる低温室を液ちで冷やそうとして窒息死した人がいたね。

半日ばかり放置して、こわごわ見に行ったら窒素は抜けてま
した。今思い出してもちょっと怖い。
スレ主旨とずれるのでsage

夏の暑い日は、打ち水代わりにLN2。

風流なもんでげす。

さっきTweenに超音波かけてみたらすぐ溶けた。常識か。
BSAはどうしてますか？

対抗上げ

冷ましすぎた寒天培地を電子レンジで・・・常識か？！
一度使ったDEAE Toyopearlを塩酸で洗浄して再生したことにする。とか。

SDS-page のゲルの染色に電子レンジって普通？

>>53
普通みたいだよ。
染色時に軽く暖めると、
脱色が行き易いってラボの奴が言ってる。
自分はしないけどね。

>>54
脱色ってことは、クマシーのことですね？

>>55
そうです。
コントラストがはっきりするんだって。

＞53
電子レンジの技、実験医学かなんかで読んだなあ。

クマシイ脱色の時、キムワイプ浮かべてます？

メタノール・酢酸・水は流しに捨てるのは本当はいけないので
ガロン瓶に活性炭を入れて脱色液を入れておきました。
適当に振ってから静置して、上澄みを脱色液として再利用していました。（昔

>>58
浮かべてません。修士の時にいたラボではみんな入れてました。
電子レンジってどのくらいかけるんですか？

20秒でいける＞60

沸騰してから３０秒で染色完了。
沸騰してから１分、脱色液代えてもっかい沸騰させてから１分レンジでチンするとほぼ完了します。
私は、ゲル板からゲルはがしてそっこー耐熱性のタッパーに入れて染色。
泳動装置洗い終わった頃、染色完了して、脱色。
装置を片づけている間に脱色も完了かな？
保存するゲルは、あと一晩サラの脱色液にさらすけど、見るだけならトータル１０分もあればいける。

沸騰してから３０秒で染色完了。
沸騰してから１分、脱色液代えてもっかい沸騰させてから１分レンジでチンするとほぼ完了します。
私は、ゲル板からゲルはがしてそっこー耐熱性のタッパーに入れて染色。
泳動装置洗い終わった頃、染色完了して、脱色。
装置を片づけている間に脱色も完了かな？
保存するゲルは、あと一晩サラの脱色液にさらすけど、見るだけならトータル１０分もあればいける。

電子レンジねたでもう一つ、組織切片を氷冷した固定液に入れて電子レンジで処理
すると数十秒で固定が完了するというのを聞きますが。経験者います？

>>64
microwave 固定の変法で話しにはよく聞くが
やったことはない。組織切片の免疫染色で、
反応が弱い時には切片に熱をかけると反応が
強くなることがあるので、そういう目的でなら
電子レンジを使ったことがある。

>>65
このへんの話は電子レンジにかけることではなく加熱することが重要なんでしょうか？

>>66
そうです。切片を沸騰したPBSに1分いれるだけで
反応（免疫染色）が増強されることがある。
ただし、蛋白質によっては反応が消失することもあるので、
いろいろやらないと反応が出ないこともある。

>>66

　均一な加熱手段として電子レンジが一番適している。
　私は以前、PAGE のゲル作るとき乾燥機つかっていたけど、最近は、TEMED の量を多くしているなぁ〜。
　標準プロトコールの３倍くらい入れると２分くらいで固まってくれます。
　でも注ぎ方が下手だと泳動が乱れるので、ご注意を。

＞68

誰も真似しないから心配するな（W

と言うか、68は少しスレの流れが読めていないような気がします。

＞７０
同意

68じゃないけど、実験の裏技だから、許容範囲内では？
ぜんぜん裏技じゃないけど。

>>69-71
少なくとも最初の1行は流れに乗っていると思う。
情報量ゼロの1行レスよりまし。

68のつまらん反撃か

sageこちょこちょ書くのってせこくない？>>74

マウスの尻尾を切って遺伝型のチェックをしています。
プロテネースで蛋白とかして、DNAを精製してPCRに
持っていくまでに2-3時間かかります。
試薬を使わずに尻尾をボイルしてgenomic DNAをとる
方法が、本に書いてあったので試したのですが成功しません
でした。成功した方はいますか？

あげ

>>76
マウスの尻尾ではやったことないですけど，
(微生物屋さんなので)，
ゲノムDNA回収したいときは，
試薬使うより、ボイルはかなり使えます。
夾雑物増えるけど，収量も増えるので。
もし，煮沸でうまくいかないのだとしたら，
マウスの場合において，煮沸で組織から回収できる成分に
PCR阻害になるようなものが入っているのか，
尻尾そのまま煮沸しただけじゃ，組織が壊れてなくて
DNAが全然溶出してきてないかってことですかね？

血液から採るのがあった、と思ったらこれもProK 1hrしてるな....。
http://lena.jax.org:80/resources/documents/imr/protocols/blood_DNA_PCR.html
行ったことないけど手元のPCR本(蛋核酵)の方法転載。
1.組織を液体窒素中で破砕→イオン交換水を加える(1ml/100mg)。
2.沸騰水中あるいはヒーティングブロックで15分間沸騰。この抽出液をDNA試料として用いる。

CTAB沈殿すれば、かなり綺麗にならない？

最近よくやる方法だけど複数のインサートを同時にライゲーション。
3つぐらいまで大丈夫。

マジ？やろうとしたら絶対駄目ってセンパイに怒られちゃった。。>>81

>82
最初はそういう手抜きをしたら駄目とかなんとか言われてたけど敢えて無視して自己流でやってます。
誰も真似しようとしないけど時間が随分短縮されるし、ベクター側のMCS中のサイトの順番をあんまり考慮する必要がないのである程度慣れている人にはお薦め。新人には勧めないけどね。
トランスフォーメーションもコンピにDNA混ぜてon ice5minだけしかしないけどちゃんと成功するし。
その代わりサイトはちゃんと考えないと駄目
例えば
EcoRI――HindIII　　HindIII――NdeI　　NdeI――BamHI
これをEco/Bamに入れるんだったら理屈上絶対に入るよね。
同じ切り口の酵素はできるだけ使わないほうがいいけど
やむをえない時にはベクターとくっつける切り口だけ。これでも1/2は当たりだしね。

一度SfoI――HindIII　HindIII――PmaCIというのを
ベクターのSmaIサイトに入れるのをやったけどこっちの方が辛かった。
とはいっても12コロニーつついて2つ当たりがあったからそれはそれでいいかと・・・
ただ、注意することは、インサートとベクターを混ぜてから反応液を入れるのではなくて
インサートのmixtureどうしを室温で１〜３分反応させてからベクターを入れ、16℃に移す事。
どのインサートもベクター1に対して5ぐらい入れておけば大丈夫。
インサートとベクターを一緒に混ぜてから反応させると効率がグンと落ちて
下手をするとコロニーが全く出ない事もあるから気をつけて。

　

age

対抗age

荒らし封印age

荒らし封印age

あげ荒らしに好まれてるスレだな。

　

他にないの？

>>91
上に書いてる人はもう逃げ出したよ。

>>3
42℃インキュベートも省略できるんですか？

>>93
ヒートショックしなくていいという話はよくきく。

＞94
ありがとうございます。早速やってみます。

酵母のコンピテントセルを保存する方法知ってる人いますか？

あと、大腸菌（JM109）のコンピテントセルを溶かした後、
凍らせてもう一度使うというのは裏技ですか？

>96
それは表技。一回毎にチューブに分注しておくとチューブがもったいない上に、
コンピテントセルを分注するのもめんどくさい。

シークエンスサンプルの反応後のDNAをdry upするのは熱をかけて蒸発させる
ってのは？

>>95
結果出ましたか？

大部分の酵素反応、ベクター作成時の大腸菌形質転換などに有効です。効果は１６
時間程度ですので、オーバーナイト以上の実験系になるとあまり効果がありません。

８３＞うちでもやってます。トランスフォーメーションも一緒です！

コンピの作り方で、本当は１８℃で培養してＯＤを測定していってとめるのが普通らしいのですが、うちではいきなり３７℃で培養してＯＤ600=0.3〜0.4でとめて
菌体をTSSに溶かして終わりという方法でやっております。

>100
で、そのコンピ効率どのぐらいでるの？
気になる・・・。おしえて

１０の８乗以上は逝きますよ。
うちは「最低限の努力で結果を出す！」みたいなのが根底にあるらしいです。

学部4年の頃、ラボ全体で使うコンピつくってて、
めんどくさいので37℃で振って適当に止めたけどどこからも苦情は出ませんでした。
そんなもんらしいです。