★★実験の手抜き・節約・時間短縮method★★
73 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 23:11
74 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 23:20
ゲル入りPCR
ゲル抽出の後，即PCRをかける方法．
電気泳動後（GTGクラスのアガロースが望ましいが，ふつうのでもいい，
ただし，余計なバンドのコンタミが増えるかも），
目的のバンドをパスツールでつついて取り出す．
100ulのTEに入れて，９５℃で５分温める．
それをテンプレートにする．
PCR反応液の1/20以下にしたほうがいい．
かなり応用範囲の広い方法だよ．
ゲル抽出の後，即PCRをかける方法．
電気泳動後（GTGクラスのアガロースが望ましいが，ふつうのでもいい，
ただし，余計なバンドのコンタミが増えるかも），
目的のバンドをパスツールでつついて取り出す．
100ulのTEに入れて，９５℃で５分温める．
それをテンプレートにする．
PCR反応液の1/20以下にしたほうがいい．
かなり応用範囲の広い方法だよ．
75 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 23:29
自分の精液ゲル・・・
76 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 23:39
>68
カバーガラスは使いにくい。黎明期は皆使ってたけど、
今はパラフィルムが主流だと思う。
適当な大きさに切ったパラフィルムをおいて、
上にハイブリ液をのせて、
スライドグラスを上からちかづけて、
液の張力でフィルムをはりつけせてから、
ひっくり返してハイブリする。
カバーガラスは使いにくい。黎明期は皆使ってたけど、
今はパラフィルムが主流だと思う。
適当な大きさに切ったパラフィルムをおいて、
上にハイブリ液をのせて、
スライドグラスを上からちかづけて、
液の張力でフィルムをはりつけせてから、
ひっくり返してハイブリする。
77 ： ：02/01/16 23:51
>76
私もパラフィルムですね。
でもスライドグラスにハイブリ液のっけて、そっとパラフィルム乗せるだけ。
ぜんぜん普通か･･。
私もパラフィルムですね。
でもスライドグラスにハイブリ液のっけて、そっとパラフィルム乗せるだけ。
ぜんぜん普通か･･。
78 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 01:03
なんでtransformationのときに抗生物質がアンピシリンだと前培養がいらなくて
カナマイシンだといるのかがわかりません。アンピシリンは細胞壁合成を妨げ、
カナマイシンが転写翻訳を妨げると聞いても？？？？
ヒントだけでもプリーズ！
カナマイシンだといるのかがわかりません。アンピシリンは細胞壁合成を妨げ、
カナマイシンが転写翻訳を妨げると聞いても？？？？
ヒントだけでもプリーズ！
sage
80 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 03:23
耐性遺伝子が発現する前に効いたらどうするよ。
81 ：Ｎ：02/01/17 10:08
>78
静止期と細胞分裂がヒント。どの時点で耐性遺伝子産物が必要か、
考えてみたら分かる。
静止期にも翻訳は必要だろ。それがジャマされたらどーなるよ？
アンピシリン耐性なら、増殖期に入る直前までに獲得されていたら
OK。
静止期と細胞分裂がヒント。どの時点で耐性遺伝子産物が必要か、
考えてみたら分かる。
静止期にも翻訳は必要だろ。それがジャマされたらどーなるよ？
アンピシリン耐性なら、増殖期に入る直前までに獲得されていたら
OK。
82 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 10:38
>73
コンタミとかが起きないようにすごく気をつかってて
マイクロピペットもオートークレーブ可能なタイプ、
P2（大腸菌）エリア、泳動エリアなど区画がきっちりわかれ
そのエリア専用の器具（ピペット、遠心機）もあるよ。
ピペットを実験台に直でおくのも厳禁、バッファーなども
出来るだけ作製済みのものを購入、水もお高い水を
購入して使ってます。
コンタミとかが起きないようにすごく気をつかってて
マイクロピペットもオートークレーブ可能なタイプ、
P2（大腸菌）エリア、泳動エリアなど区画がきっちりわかれ
そのエリア専用の器具（ピペット、遠心機）もあるよ。
ピペットを実験台に直でおくのも厳禁、バッファーなども
出来るだけ作製済みのものを購入、水もお高い水を
購入して使ってます。
83 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 12:44
84 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 12:45
パらフィルムか。。。
やられた。
俺のラボは原始時代だったのか？
やられた。
俺のラボは原始時代だったのか？
85 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 15:50
パラフィルムでやると、ハイブリ後にはがすのが大変なんて事は
ないですか？
カバーガラスなら、傾けただけで滑って行くんですが
ないですか？
カバーガラスなら、傾けただけで滑って行くんですが
86 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 17:32
ご心配なく。
強引にはがしても、切片が傷む事はまずありません。
これはガラスでもいっしょですが、ハイブリの時の
湿度とふたの密着性には気をつけて。
湿箱を用いる場合は、水にしないで、ハイプリ液と
同じホルムアミド濃度溶液にすると、ハイブリの
ムラがなくなります。
もっとも、お金があれば、ハイブリをスライドメーラー
内でやってしまうのが一番です。
強引にはがしても、切片が傷む事はまずありません。
これはガラスでもいっしょですが、ハイブリの時の
湿度とふたの密着性には気をつけて。
湿箱を用いる場合は、水にしないで、ハイプリ液と
同じホルムアミド濃度溶液にすると、ハイブリの
ムラがなくなります。
もっとも、お金があれば、ハイブリをスライドメーラー
内でやってしまうのが一番です。
ハイブリの後、ホルムアミドの入った溶液中につけてパラフィルムが
浮いてくるのを待てば完璧だよ。
浮いてくるのを待てば完璧だよ。
88 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/18 02:58
＞８5、８６
そう、わざわざパラフィルムを剥がしたりしない。
ハイブリ後のスライドをラックに載せて、
洗浄液にいきなりつける。パラフィルムは軽いので、
溶液に浮いてきます。それをピンセットで回収して捨てます。
手軽な上に、コストもはるかに安いです。
（日本はパラフィルム高いんだっけ？僕は現在海外。）
そう、わざわざパラフィルムを剥がしたりしない。
ハイブリ後のスライドをラックに載せて、
洗浄液にいきなりつける。パラフィルムは軽いので、
溶液に浮いてきます。それをピンセットで回収して捨てます。
手軽な上に、コストもはるかに安いです。
（日本はパラフィルム高いんだっけ？僕は現在海外。）
89 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/21 00:18
このスレ結構好きだからあげ。
90 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/21 04:07
91 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/21 11:05
今時でなんですがPCRの時にミネラルオイルを重層しています
どうやったら効果的にミネラルオイルを取り除けますか？
どうやったら効果的にミネラルオイルを取り除けますか？
92 ：30：02/02/21 12:30
91>
パラフィルムに乗っけてつつーっと流す
パラフィンが疎水性なのでオイルがくっつき反応液をはじく
パラフィルムに乗っけてつつーっと流す
パラフィンが疎水性なのでオイルがくっつき反応液をはじく
93 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 00:22
>>91
まだそんなラボあるんだねぇ。
まだそんなラボあるんだねぇ。
94 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 01:35
＞９３
それがさあ、他の人が使っているもんだから、
しょうがなくて片隅にあった古いPCR使ったンよ。
オイルの要るやつ。
そしたらそっちの方が全然バンドが濃いんだよ。驚いたよ。
むろん全く同じ条件。
古いPCR使ってる皆さん、嘆くなかれ。あれ、結構いいのかもよ。
それがさあ、他の人が使っているもんだから、
しょうがなくて片隅にあった古いPCR使ったンよ。
オイルの要るやつ。
そしたらそっちの方が全然バンドが濃いんだよ。驚いたよ。
むろん全く同じ条件。
古いPCR使ってる皆さん、嘆くなかれ。あれ、結構いいのかもよ。
95 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 01:47
96 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 02:22
昔ラボの権力者にいぢめられて、泣きながらミネラル・オイルのいる
ＰＣＲ使ったらいきなりクローニング（５’ＲＡＣＥ）がかかった事が
あります。
悪くないと思った。
ＰＣＲ使ったらいきなりクローニング（５’ＲＡＣＥ）がかかった事が
あります。
悪くないと思った。
97 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 02:33
同じＰＣＲ機使っても、オイル使用した方が結果が安定していて
いいですよ。ここ一番ではわざと使ったりしてます。
いいですよ。ここ一番ではわざと使ったりしてます。
98 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 03:02
＞必要とするサーマルサイクラーはないよ。
オイルフリーのPCRでも、オイルを入れてまわして御覧。
オイル無しでかけるよりもイイよ。まじで。
かかりの悪いプライマーでつかうと結構うれしい。
オイルフリーのPCRでも、オイルを入れてまわして御覧。
オイル無しでかけるよりもイイよ。まじで。
かかりの悪いプライマーでつかうと結構うれしい。
99 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 03:08
オイルフリーのサーマルサイクラーにオイル入れていいの？
オイル漏洩による電気系統への影響が心配だ。
まぁ熱伝導率とかを考えるとオイル入れた方がいいに決まっとるが。
オイル漏洩による電気系統への影響が心配だ。
まぁ熱伝導率とかを考えるとオイル入れた方がいいに決まっとるが。
100 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 03:17
>98
それ試してみたけど、結果は変わらなかったな。
それ試してみたけど、結果は変わらなかったな。
>>99
明らかに話を誤解しとるな。
チューブの外のオイルじゃなくて、チューブの中に
蒸発防止の為に入れるoilのこと話してんのよ。みんなは。
いや確かに昔は、オイルを入れないと使えんサーマルサイクラーも、
あったんだが（COYとか、、、遠い眼。。。）
明らかに話を誤解しとるな。
チューブの外のオイルじゃなくて、チューブの中に
蒸発防止の為に入れるoilのこと話してんのよ。みんなは。
いや確かに昔は、オイルを入れないと使えんサーマルサイクラーも、
あったんだが（COYとか、、、遠い眼。。。）
102 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 04:04
＞９８、９９、１００
プライマーによるよ。
プライマーによるよ。
103 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 05:00
測定データを直線回帰し、そのスロープさえ求まれば問題ないので、
測定点2点しか取ってない。
おれの実験は信用できん！自分で言ってしまったりする。
測定点2点しか取ってない。
おれの実験は信用できん！自分で言ってしまったりする。
104 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 09:35
>>99
一般にオイルは絶縁体。
一般にオイルは絶縁体。
105 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 14:29
>>102
GCがrichな時に効くの？
GCがrichな時に効くの？
106 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 16:26
>105
漏れの成功例は確かにGCリッチ（ゲノム）でした。
漏れの成功例は確かにGCリッチ（ゲノム）でした。
107 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 00:49
O/N の大腸菌カルチャーを遠心し、ペレットダウンする。
Solution I , II , III をベンチに用意する。
ダルイと思って、大腸菌をマイナス８０℃で保存。
夜は飲みに行って、次の日プラスミド回収。これ最強。
Solution I , II , III をベンチに用意する。
ダルイと思って、大腸菌をマイナス８０℃で保存。
夜は飲みに行って、次の日プラスミド回収。これ最強。
108 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 01:00
>>107
-20℃でいいよ。最強じゃないし。
GST fusionタンパクとかMBP でも、ドライペレットで凍らせるのは常識。
セシクロ用（時間節約組には縁が無いか）とかGST用とかの、たまたま
失敗しそうなものは、スペアを作っておく。これ常識ね。時間の節約にもなる。
-20℃でいいよ。最強じゃないし。
GST fusionタンパクとかMBP でも、ドライペレットで凍らせるのは常識。
セシクロ用（時間節約組には縁が無いか）とかGST用とかの、たまたま
失敗しそうなものは、スペアを作っておく。これ常識ね。時間の節約にもなる。
109 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 02:29
おれもそれはあまりにも当たり前で、書こうとはおもいもよらなんだ。
110 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 09:47
金曜の夜にカルチャー始めて、翌朝に他人に4℃に移してもらって、
土日は彼女とデート。これ最強。
土日は彼女とデート。これ最強。
111 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 13:32
>>110
金曜にプレートを渡し、「（土曜にプレカルチャーして、）日曜の夜くらいに培養しといて」
という方が最強。プラスミドを渡してトランスフォーメーションからやって貰うのが
もっと最強。以前、そういうの普通にやってたよ。
金曜にプレートを渡し、「（土曜にプレカルチャーして、）日曜の夜くらいに培養しといて」
という方が最強。プラスミドを渡してトランスフォーメーションからやって貰うのが
もっと最強。以前、そういうの普通にやってたよ。
112 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 19:21
そっか。チューブに入れる方かぁ。
ホットボンネットによる影響が出にくいのかなぁ。。。
オジサン勘違いしていたよ。ご指摘どうもありがとう。>>101
>>104
ウチにある古いサーマルサイクラーには
「オイル漏洩は致命的な電気系トラブル発生の原因になる恐れがあります」
って書いてあるーよ。
ホットボンネットによる影響が出にくいのかなぁ。。。
オジサン勘違いしていたよ。ご指摘どうもありがとう。>>101
>>104
ウチにある古いサーマルサイクラーには
「オイル漏洩は致命的な電気系トラブル発生の原因になる恐れがあります」
って書いてあるーよ。
114 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/28 20:32
CG培地のサンプルをどっかからもらって、
金曜の夜植菌＞月曜朝回収。
意外といける。
金曜の夜植菌＞月曜朝回収。
意外といける。
115 ：104：02/02/28 23:02
>>113
考えてみた。たしかに原因にはなりうる。
スイッチや可変抵抗の接点についたら接触不良起こすかもしれない。
しかし水だと回路のどこについてもショートするから、それよりは
はるかに安全。まあそんなところだ。
考えてみた。たしかに原因にはなりうる。
スイッチや可変抵抗の接点についたら接触不良起こすかもしれない。
しかし水だと回路のどこについてもショートするから、それよりは
はるかに安全。まあそんなところだ。
116 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/01 02:12
>>112
ネタ？
ネタ？
117 ：112：02/03/01 09:06
>>116
マジ
マジ
118 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/17 11:17
実験しないに限る
119 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/17 13:58
＞１１８
いいこと言った。
いいこと言った。
120 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/17 19:00
実験嫌い。
バイオ員ふぉに移ろうかしら。
バイオ員ふぉに移ろうかしら。
121 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/16 01:32
x-galを大量に入れると早く判別ついていいね〜
122 ：名無しゲノムのクローンさん：
taqを大量に入れると余計なバンドがふえてこまるね〜