タンパク質の精製２

1 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 21:43

タンパク質の精製についての情報交換をするスレ

前スレ
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/982464137/l50

2 ：：02/12/10 22:04

あぼーん

前スレ
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/982464137/

前スレより

30 ：生化学師団蛋白精製大隊最先任軍曹：2001/02/20(火) 06:34
＞２９

あらゆるプロトコルがキット化され、女子中学生がPCRでもサザンでも
シークエンスでもできるようになってしまった現代の分子生物学。
俺たちが青春を捧げた研究も、いずれコギャルがケータイ片手に
ブラウズできるようになってしまうのか？

だが心配はいらない。唯一マニュアル化できない漢（おとこ）の戦場が、
蛋白質精製という無法地帯に残されている。敵（蛋白質）が変われば
武器（精製法）も変わる、過去の知識などあてにはならない、やってみなけりゃ
わからない、先にタマ取ったもん勝ち、情け無用のキリングフィールドにようこそ。

それでは新米兵士の君に、生き残るための教練書を哨戒、違った、紹介しよう。
「Protein Analysis and Purification」　Ian M. Rosenberg, Birkhauser
「Guide to Protein Purification」 Murray P. Deutscher, Academic Press
「Protein Purification Methods」 E.L.V. Harris and S. Angel, IRL Press
「蛋白質・酵素の基礎実験法」　堀尾武一、南江堂　＜ちょっと時代遅れだけど。
あと、Amersham Pharmaciaが出しているクロマト関係の小冊子には全て
目を通しておけ。

5 ：教練書入手先：02/12/11 00:35

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/081763665X/
Protein Analysis and Purification: Benchtop Techniques
Ian M. Rosenberg (著) ペーパーバック版
U.S. 定価： $76.95
価格：￥10,359
出版社: Springer Verlag ; ISBN: 081763665X ; (1996/11/01)

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0817637176/
同ハードカバー版
U.K. 定価：￡120.00
価格：￥24,989
出版社: Springer Verlag ; ISBN: 0817637176 ;

6 ：教練書入手先：02/12/11 00:36

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0122135857/
Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology
(Methods in Enzymology Series, Vol 182)
Murray P. Deutscher (著)
価格：￥10,173　現在、在庫切れです。
出版社: Academic Pr ; ISBN: 0122135857 ; 182 巻 (1990/03/01)

http://www.amazon.com/exec/obidos/ASIN/019963002X/
Protein Purification Methods by E. Lynn Harris, S. Angal
Availability: Out of Print--Limited Availability
Publisher: Irl Pr; ASIN: 019963002X; (December 1996)

7 ：教練書入手先：02/12/11 00:41

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/4524401237/
蛋白質・酵素の基礎実験法
堀尾武一 (編集)
価格：￥8,544
出版社: 南江堂 ; ISBN: 4524401237 ; 改訂第2版版 (1994/11)

Amersham Pharmacia Technical Literature Database
http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/literature_intro

8 ：教練書入手先：02/12/11 00:47

34 ：ＨＤＤ理論：2001/02/20(火) 13:03
あとね。
英語の本ですけどAcademic Press社、N.C. Price編集
Protein LAB-FAX ISBN 0-12-564710-7
はコンパクトだけどいろんなことが書いてあってお薦めだよ。
＞３０
漢と書いておとこと読む、その心意気に乾杯

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0125647107/
Proteins Labfax (Labfax Series)
N. C. Price (著)
U.K. 定価：￡56.95
価格：￥12,293
出版社: Academic Pr ; ISBN: 0125647107 ; (1995/12/21)

9 ：その他紹介された本：02/12/11 01:24

349 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/17(金) 18:56
どうも、横レスです.
僕はタンパク質工学に興味がある学生です.
大学院からタンパク質を学びたいと思っています.
今の講座はバイオしかやらないので、essensialとcellなどの教科書は読んでいますが、
タンパク質工学に関する本は読んでません.
タンパク質工学に関する入門テキストのようなものがありましたら
教えてください。厨房でした

350 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/21(火) 16:03
古典的名著
タンパク質工学の物理・化学的基礎　江口至洋　共立出版

あと
蛋白質機能の分子論　濱口浩三　学会出版センター

10 ：その他紹介された本：02/12/11 01:25

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/432005377X/
タンパク質工学の物理・化学的基礎
江口至洋 (著)
この本は現在お取り扱いできません。
出版社: 共立出版 ; ISBN: 432005377X ; (1991/05)

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/4762236179/
蛋白質機能の分子論
浜口浩三 (著)
価格：￥3,400
出版社: 学会出版センター ; ISBN: 4762236179 ; 改訂版版 (1990/02)

11 ：その他紹介された本：02/12/11 01:31

425 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 16:02
横レスすいませんが、タンパク質工学を学ぶ上で参考になる本があったら、
ぜひお願いします。独学で学ぶ予定です。

426 ：泥沼歩兵部隊：01/10/15 18:56
古典的名著　江口至洋　「タンパク質工学の物理化学的基礎」
共立出版

これはいい本なのですが絶版になってどこでも手に入りません
もってる先輩で使ってないヒトから言い値で買う価値のある本
です。古本屋でみかけたら即ゲット

蛋白質機能の分子論　濱口浩三　学会出版センター
これも古い本ですが入門にはよいと思います。

蛋白質のフォールディング　原理・機構・応用
RHペイン　シュプリンガーフェアラーク東京
最近ではタンパク質工学そのものへの興味よりも
フォールディング機構に切り口のある本によい本が
あると思います。お勧めです。もう何冊か、最近出て
いるフォールディング関係の日本語の本もいちどご覧ください。

最後に今年の8月の蛋白質核酸酵素の増刊
「新世紀における蛋白質科学の進展」ですが、玉石混交と
いってしまうには玉のほうが多い、日本の蛋白質科学も
レベルが高くなったなあと思わせる本だと思います。特に
若い人たちの書いているところがどれも粒ぞろいに面白
いです。入門には向きませんし、構造生物学が大分はいっ
てますが一応お薦めしておきます。

12 ：その他紹介された本：02/12/11 01:39

http://www.springer-tokyo.co.jp/content/isbn4-431-70953-3.html
タンパク質のフォールディング　第2版
R.H. Pain　著
崎山文夫　監訳　河田康志／桑島邦博　訳
B5　並製　410頁　本体 6,000円＋税　
ISBN 4-431-70953-3
CコードC3045　　発売日　2002年10月11日

http://kyoritsu-pub.topica.ne.jp/pne/pne01z.html#shinten
新世紀における蛋白質科学の進展
中村春木・森川耿右・鈴木紘一・三浦謹一郎　編
392ページ／定価7,035円（本体6,700円）
ISBN 4-320-05588-8
『蛋白質核酸酵素』増刊号を書籍に改装

13 ：その他紹介された本：02/12/11 01:53

818 ：泥沼歩兵部隊・後方戦闘支援室：02/09/28 21:10
タンパク質物とり戦線、前線にて戦闘中の皆さま、いかがお過ごしですか？秋の学会シーズンを
控え、日々の戦闘もますます激化していることと思います。
さて、泥沼歩兵部隊後方戦闘支援室から、下記の書籍をご紹介させていただきます。
Protein Protocols Handbook
John M. Walker (Editor) (Paperback, 1147 pages - February 2002)
Humana Press; ISBN: 0896039412; 2nd edition (February 2002) 日本円で約15000円
タンパク質の取り扱いに関する良い教科書がないとお嘆きの皆さま、是非ご検討ください。
後方より諸兄らの武運を祈る・・・・オーヴァー

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0896039412/

14 ：話題になったURL：02/12/11 02:00

http://www.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp/biophys/profile/hiroakih.files/refolding2002.pdf
蛋白質の（試験管内）巻き戻し法における最近の話題

http://www.virus.kyoto-u.ac.jp/Lab/MolGen/opinion_frame.html
上村さんの雄叫び＠京都大学ウイルス研究所・上村研究室

15 ：大腸菌リコンビナントしか取ったことない分子生物気取り：02/12/11 02:14

生物板史上に残る名スレと謳われた前スレは凋落傾向のまま容量overに近づき、
このスレもやる気のない2ｹﾞﾄ、よくわからない3ｹﾞﾄをされてしまいました。
書籍などを拾ってくることしかできませんでしたが、前スレを全部保存すると
ともに折角紹介された本もどれか買ってみて勉強することにします。

16 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/11 02:21

>>15
まとめてくれてありがとう

17 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/11 05:24

>>1-15 ごくろうさまです。

大腸菌での大量発現は以下のスレも参考にしてくださいね♥

大腸菌の発現についておしえて。
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1016116176/l50
大腸菌について極めるスレ
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1020772225/l50
▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1026312578/l50

18 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/11 09:08

>15 3だけ部分精製してもらえました。力及ばずごめんなさい。

私も大腸菌大量発現しかやったことなかったのですが、つい最近
好酸菌酵素の精製を始めました。マニュアル(文献)ありですが。(ｱｾ
しかし、全然きれいにならない・活性どんどん無くなっていく．．
硫安沈殿にもいろいろコツがあってどれも一筋縄じゃいかないですね。
前スレとかもう一度読み直してがんばります！

19 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/11 14:22

前スレは、低レベル化の進む生物板において、数少ないお役立ちスレだと思います。
一冊参考書を紹介させてください。
Protein Purification: Principles and Practice
Robert K. Scopes
ISBN: 0387940723
Thomas Pollardが薦めていた本で、わかりやすく書かれています。
お値段はちょっと張りますけど。。。

20 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/11 15:36

他のお役立ちスレ

Ｘ線のタンパク結晶化ってどうよ？
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1030796416/
BIACORE～生体物質間相互作用の解析スレッド～
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1033258256/

21 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/11 18:31

>>19
http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0387940723/
Protein Purification: Principles and Practice (Springer Advanced Texts in Chemistry)
Robert K. Scopes (著)
U.S. 定価： $76.95
価格：￥9,606
出版社: Springer Verlag ; ISBN: 0387940723 ; 3rd 版 (1994/01/01)

上に挙げてあるものよりむしろ安いですね。
こちらにするか…

22 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/12 09:20

構築に関するスレッドがないので、ここでよろしいでしょうか？
pVL1393のプロモータ直下のATGは潰してATTになっていますが、
これとフレームを合わせるなと説明書には書いてありますが、
いったいどういうことでしょうか？

23 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/12 18:48

3個目の認識は甘いから念のため外しておくということでは？

24 ：22：02/12/12 20:48

がび～ん。
ATT→メチオニン（開始）なんてことあるのですか！
ありがとうございます。

25 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/12 21:04

いや、そんなことはないと思う。

26 ：22：02/12/12 21:06

＞25
じゃ、どうしてわざわざフレームあわすなって書いてるの？

27 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/12 21:07

バクテリアでは「TTG」が開始コドンになることがある。

28 ：22：02/12/12 21:12

>27
pVLは昆虫なんですが･･･。
それに、ATTの直後はCCと続いてて、いぢくれません。

29 ：ちょっと貼ってみる：02/12/13 11:52

http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/tds/mol_bio/live/web_enabled/21201P_554745.pdf

DESCRIPTION
The pVL1392 and pVL1393 baculovirus transfer vectors contain
the complete polyhedrin gene locus of the Autographa
californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) cloned into the
pUC8 vector, but lacks part of the polyhedrin gene coding
region. A multiple cloning site (MCS) region has been inserted
37 nucleotides downstream of the ATG polyhedrin start
codon, which has been changed into an ATT.
The insert of choice must provide its own ATG start
signal at the 5' end of the gene. The distance between the
cloning site and the ATG start of the gene should not exceed 100
nucleotides, otherwise the protein expression will be poor.

30 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/13 15:12

>>22
29 のどこにフレームずらせと書いてあるんだ？
フレームなんて関係ないじゃん

31 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/13 21:20

His trapで精製しているのですが、溶出後のサンプルをTrisで透析すると
凝集しちゃうのですが、原因がわかりません。可溶性になってると思うのですが、
どなたか教えて下さい・

32 ：みかん：02/12/13 21:49

ATTからたまに翻訳されることもあるって。
DNAクローニングに載ってるよ

33 ：22：02/12/13 23:29

>30
紙の説明書には書いてあります。
月曜日に書き込みます。

34 ：しろうと2号：02/12/14 05:14

>>31 思うぐらいで可溶性になってたらみんな苦労してません（笑
とりあえず、前スレと今実験でうまくいかないこと２を全部読み返してみそ
いくつかヒントが書いてあったよ　

一番考えられる原因はあなたが書いている通り透析（か温度）だよね？
HiTrapからの溶出だと0.5M NaCl 100mM Im 50mＭリン酸緩衝液
pH7.4？（ちょうど昨日作ったところ）

関係ないけど8ｘリン酸緩衝液、レシピ通りに作ると最初pH5ぐらいの
やつができるけど、なんであんなにpH低くなるんでしょう？
モレクロに載っているpH7.4のレシピ（75:25ぐらい）でも6.4ぐらいにしか
なってなかったし、その辺になにか可溶化しているヒントがあるのかな？

さて、今日は私も透析だ！

35 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/15 00:05

タンパクの可溶化とリフォールディングについて質問させて下さい。
「タンパクをSDSで可溶化した後にNP40を加えて中和」
という表現を聞いたのですが、私にはその意味がさっぱりわかりません。
どなたかその原理が書いてある本などご存じ無いでしょうか？

36 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/15 00:10

SDSでぼろぼろにしたものにグアニジン入れて、
だんだんその濃度減らしてリフォールドってのはあったような・・・

37 ：親切な人：02/12/15 00:16

ヤフーオークションで、凄い人気商品、発見！！！

プランテック製の「 RX-2000Ⅲ 」を改造済み
にした、アイティーエス製の「 RX-2000Ⅲ 」↓
http://user.auctions.yahoo.co.jp/jp/user/neo_uuronntya

ヤフーオークション内では、現在、このオークション
の話題で、持ちきりです。

ヤフー ID の無い方は、下記のホームページから、
購入出来る様です↓
http://www.h5.dion.ne.jp/~gekitoku/#.2ch.net/

38 ：テスト：02/12/16 06:06

WEBブラウザよりテストカキコ。

39 ：22：02/12/16 09:58

>30
ね、書いてあるでしょ。ATTのフレームにあわせないように勧めるって。
それ以降の理由がよくわからないんだよね。

A multiple cloning site (MCS) has been inserted 37 nucleotides
downstream of the polyhedrin ATG start codon, which also has been
changed to ATT. It is advisable that the ATG start codon of the cloned
gene not be in-frame with the vector ATT due to translation initiation
that has been reported using these vectors in some recombinant viruses.

40 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/16 23:32

精製以前のお話で恐縮です。
ある種の酵素の大量発現が難しいのは毒性だと思うのですが、
ある種の膜タンパクの発現が難しいのはどうしてでしょうか。
大量発現によって、イオンバランスとか崩れる？これも毒性が原因ですか？

41 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/17 00:18

>31
>34
前スレに、透析時にTwennなどの界面活性剤を入れて透析すると
よいと書いてあったぞ。
まあ、リフォールディングの話ではあったが、アグり防止にはいいのでは？

42 ：35：02/12/17 02:21

書き方が悪かったので訂正っす。
「NP40でSDSを中和する」というのがどういうことなのか分からないのです。
Tritonを入れるとフォールディングを助けてくれるってのは聞いたことあるんですが。。

>36
レスどうもです。
SDS入れた後にグアニジンですか。。
聞いたこと無いなぁ。
ちょっと調べてみます。

43 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/17 10:31

昆虫細胞でo/eさせた組換えタンパク質を調製するための
昆虫細胞の粗抽出液抽出法を教えてください
よろしければ、ソースも一緒にお教え頂けると幸いです

44 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/17 11:14

invitrogenのbac-to-bacのマニュアルに載ってないかな？

45 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/17 11:19

>>39 due to translation initiation that has been reported
using these vectors in some recombinant viruses.

と書いてあるわけだが・・
ATTから開始しちゃうvirusじゃ無いんなら好きにすればいいのでは？
参考文献も載っていると思うんですが

46 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/17 11:50

>44
すみません
そのマニュアルには細胞の増幅までしか書いてありませんでした
他にソースはないでしょうか？

47 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/17 17:27

>>45
このベクターを使った組み替えウィルスでATTから翻訳される例がいくつか報告されてるから
ずらしておく方がいい、じゃないかな？

48 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/17 22:45

>>46
http://www.invitrogen.com/content/Focus/181010.pdf
とか、
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C1157
とか。
金積んでよそに頼むとか
https://www.katakura.co.jp/S_WORM1/explain/service/naiyo.htm

49 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/18 00:25

bac-to-bacとbac-n-blueはどっちがおすすめですか？

50 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/18 00:27

つーかさ、タンパクを調製する「一般的方法」なんてないだろ。
タンパクによって性質全然違うんだから。

51 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/18 13:01

>42
構造屋じゃないけど、非イオン性界面活性剤によって
遊離した過剰なSDSをミセル形成して不活化するみたいなことは
聞いたことあるよ。

52 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/22 18:15

みなさんは、界面活性剤を完全に取り除きたいときどうしてますか？
どうも透析だけじゃダメらしいのです。
時間もかかるし。

53 ：35：02/12/22 18:43

>>51
レスありがとうございます。
遊離した過剰なSDSを不活性化ってことは完全に取り除けるわけではないのですね。

>>52
CA(cycloamylose)やCD(cyclodextrin)を用いた方法があるようです。
前者はTAKARAからキットが出ています。

↓ここにちょこっと書いてある(ファイルサイズ1.3M)
http://www.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp/biophys/profile/hiroakih.files/refolding2002.pdf

54 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/28 01:55

一つのフラクションにどうしても二つのタンパクがある時、
この二つをどう区別したらいいですか？活性測っても
どっちが働いてるのか分かりません（涙）

55 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/28 15:22

二つあるってわかってるんならもう区別できてるやん（w
分離したいってことか？タンパクが二つあるってどうやってわかった？

56 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/28 16:12

SDS-PAGEでみるとかなり近いところに二つあって
いろんなクロマトやっても挙動が同じなんてす。
ペプチドシーケンスを読めばいいのかもしれませんが
時間も設備もないのです（涙）。

57 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/28 16:15

修飾によるバンドシフト？

58 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/28 16:59

いろんなクロマトって具体的には？
ゲルろ過はやってみた？SDS-PAGEで出る分子量はnativeのものと同じという確証はある？
要するにnativeでは二量体なんじゃ？

59 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/28 19:56

まあ確かに難問だとは思うけど、
結局そのバンドが何であるかを同定しないと
研究が進まないでしょ。
だったら、MSでもやるしかないんじゃ・・・・・・・・・・
それできなかったら、それ以上仕事進まないんでないの。

60 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/28 22:50

>>59
烈しく同意

61 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/28 23:03

>58さん
ゲルろ過しても同じところにでてきてしまいます。
SDS-PAGEで出る分子量はゲルからの活性回収の結果から
考えるとnativeのものと同じ可能性は高いと思います。
ほかに疎水性クロマト試したのですが強く吸着しすぎて
しまい回収が悪く精製ステップからはずしました

62 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/29 02:00

>54
それだけの情報じゃどうにも答えようがない。
こんな質問によく答える気になるな。。。>>57,58他

63 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/29 02:05

>>62
どんな情報が必要ですか？

64 ：しろうと2号：02/12/29 02:29

疎水性って、C18？もっとCが短いのはだめなん？

65 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/29 02:59

困ってる礼儀正しい人に優しいのが生物板住人

66 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/29 04:38

>>63 とりあえず、前スレdat落ちする前に読んでみたら？
タンパク質の精製
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/982464137/

67 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/29 08:01

>しろうと２号さん
使ったのあC４のブチルカラムです。

現在は陰イオン交換、陽イオン交換カラムの２ステップで
部分精製に留まってます。その結果７０ｋDa付近に２本の
メインバンドが出てます。
現在はその部分精製で最適温度とpH、熱安定性、阻害剤、
基質特異性をだしたところです。
・・・・説明不十分かもしれませんがどうぞ良い案ご享受
くださいっっ

68 ：しろうと2号：02/12/29 09:28

HSP70とかいうやつでは？と、とりあえず脊髄反射で書いてみる。
前スレにそんなのが載ってました。

69 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/29 10:35

違うやろ

70 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/29 10:46

わてもそー思う

71 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/29 12:45

とりあえずnative PAGEで分子量を計れ。
もしかしたら2量体で働いてるかもしれんし。

72 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/29 17:05

ゲルろ過やったんならもう分子量わかってるんじゃないの？

73 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/30 06:02

もちろん分かってます。

74 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/30 19:12

やっぱりMSが必要なんでねーの？

75 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/30 23:05

>>74
本人が無理って言ってるじゃんw

76 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/30 23:11

カラム何本も通してるなら分解産物かもしれん。
だから、できたら N 末アミノ酸配列を見たいとこだが。
外注もできんの？

蛋白量があるなら、SDS-PAGE 後切り出して、
マウスかラットでポリクロ作って反応を見てみるとか？？

77 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 02:44

その時間があればMSのほうが早い

78 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 06:59

nativeでどのくらいの分子量なの？
それによって解釈が。。。
61読むと70ｋってこと？

79 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 08:49

>78
そうです～約７０ｋDaです。

80 ：79なのですが・・：02/12/31 08:59

これから一ヶ月ほどでどのくらい実験データそろうのかしら？（涙）
精製始めたばかりのころにゲルから蛋白回収して抗体作って
アふぃにてぃカラムつくったらどうですか？と先生に言ったら
「邪道」と言い放たれましたわ・・・（ひどいよぉ）
精製ってのが目的で早く精製して何かしたいって人じゃないのかしら？？
うちの教授ｻﾝは・・・

81 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 11:15

つうか、シークエンス決めろ。
いろいろやって時間と金をムダにしてるくらいなら、その方が安上がりだ。

82 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 13:15

アフォな教授ですな。
逝ってよし！

83 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 15:35

その享受おわってます・・・

84 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 18:20

抗体カラムでの溶出条件をちゃんとわかってる？ほとんど変性させて溶出させるでしょうが。
シーケンスだけ知りたいならそれでもいいけど。
というか自分の研究の目的もわかってないのかと小一時間

85 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 19:07

おいおい、直後に pH 調整とかすれば、活性が残存するケースも多いぞ。
それにシーケンスがわかれば、無駄な時間がへらせるかもしれんし。

井の中の蛙ってのは、どういうもんだか小一時間 (略

86 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 23:43

>84さん
酸性条件（酢酸を使いました）に晒した後、Trisで中和して
活性が残っていることを確認しました。
最初あふぃにてカラムを使いたかったので一応試してから
提案してみたのですが・・・やっぱり小一時間。。。ですか？

87 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/01 02:57

一ヵ月じゃ厳しいな

88 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/01 04:02

がんがれよ！としか言えない漏れ…欝

89 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/01 05:28

プロテアーゼでしょ。活性なくてもいいから逆相ＨＰＬＣで２つを分けてからＮ末シークエンスを読む。
活性を残すなら，もう一度イオン交換，ゲル濾過で精製できるでしょ。三が日でやってください。

90 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/01 14:49

>88さん
ありがとうございます～
がんがります！！

>89さん
明日からがんばってみますう

みなさんありがとうございました（ぺこり）
一人でうにゃうにゃ考えるよりもみなさんに
相談した方が良いですね～

91 ：しろうと2号：03/01/01 17:01

前スレ、dat落ちしたのでhtml化してもらいました
タンパク質の精製
http://page.freett.com/tondat2ch/030101-982464137.html
▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
http://page.freett.com/tondat2ch/030101-1009340905.html

広告が出るけど我慢してやってください。

92 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 00:16

グッジョ！

93 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 00:47

>91　自分のパソコンに保存する知恵をつけろとか言われていた方でしょうか。
煽りに耐えてよく頑張った、感動した！

94 ：　：03/01/02 04:49

>89
分解産物なら同じイオン交換は
期待薄なのでは？（可能性無いとは言わんが）。
ゲルろ過でも無理そうなくらい分子量接近してるみたいだし。
（HPLC使えば分かれるかな？）
疎水カラムで取れなくなるんだから、
逆相でも同じことがある可能性が高いんじゃない？
もちろん何もしないで悩むより
手動かしたほうがいいと思うが。。。

95 ：94：03/01/02 04:52

Nativeで単一なら
SDS/PAGE前のSample処理の仕方が
まずいのかもね。

96 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 05:01

陽と陰の両方のイオン交換で等電点沈澱とかは平気なもんなのかな
それが原因で目的蛋白のうちわずかなもんが変性してたりしてな

97 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 06:54

両方のカラムにくっつくみたいだしね。
疎水性も高そうだし。。。
でも、活性あるのが取れてるんだから
いいんじゃない？
精製目的が何なのか知らんけど。

98 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 16:35

TCAで低分子落としてみてシークエンスの方向で・・・

99 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/03 00:48

やっぱりそうだよな

100 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/03 02:16

100

101 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/03 17:44

もっちゃんモエ～

102 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/03 21:02

誰だよもっちゃんって

103 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 02:06

>>102
おまい、さてはもぐりだなw

104 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 06:43

間違いねぇ、モグリだべ

105 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 07:10

ﾁｮﾄ遅くなってしまったけど>90さんへ
島津に外注でMS頼めば？２sampleくらいだったらそんなに高くないよ。

多分１sample３～４ﾏｿだったと思う。

漏れの予想では多分分解産物じゃないかとｵﾓｲﾏｽ.....

106 ：厨：03/01/04 12:33

ゲルろ過で素通りしているように見えるときって、何が問題なんでしょうか？
塩？

107 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 12:34

>>106
根本からやり直したまへ

108 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 13:55

>106
Ｖ0をもう一度確認することをお勧めします
もしかしたらゲルが目的タンパクとサイズ的にあっていないかも
しれませんよ～
塩が関係していたら（塩を入れてなかったら）素通りうんぬんではなく
ゲルに非特異的に吸着しちゃいます。

109 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 22:43

>106
目的タンパクが大きいんでしょうね。

>108
ゲルろ過で吸着することなんてあるんですか？
私は経験したことないし、初耳です。

110 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/05 00:31

>109
試しにバッファーから塩をぬいてゲルろ過やってみるとわかるよ。

111 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/05 01:21

>109さん
経験談ですが5～10 mM程度の緩衝液を使ってゲル濾過すると
ゲルに非特異的に吸着しました。（糖タンパクは吸着しやすいと
扱っているヒトが言ってましたが・・・一概に言えるのでしょうか？）
その後で500mM NaCl流したら出てきてくれましたが・・・
故にゲル濾過って大抵濃いめの緩衝液か塩入りなんですねぇと
納得しちゃいました。先人の知恵ってすごい！！

112 ：109：03/01/05 02:18

ありがとうございます。
勉強になりました。
今までの目的タンパクが吸着しなかったのは
運がよかったんですね。

でも、ゲルろ過使った
脱塩カラムってありますよね？
あれどうなってるんでしょう？
無知ですいません。

113 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/05 11:32

＞112さん
普通のゲル濾過カラムは10～100ｋDaを分離しますが脱塩カラムはせいぜい
分子量数100とタンパク質をわけますよね？
だから精製に用いるゲル濾過カラムとはポアサイズがちがうからだと
思います。
ちょっとわかりにくい説明ですみません

114 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/05 15:12

ゲルろ過で非特異的に吸着するっていうけど、相互作用は何だろ？

115 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/05 17:22

あの～Lysyl Endopeptidase でpeptide が切れないんですが
酵素消化やってる人でLys-c使ってたら方法教えて。
ちなみに俺っちは・・
　凍結乾燥タンパク質に4M Urea 0.1M 炭酸水素アンモニウム 10μl
加える
　　↓
　Lys-c溶液（Wako, 1vialを1ml 蒸留水で懸濁）を1μl加えて30℃で
　インキュベート
ちなみに精製タンパク質の量は1.5μg/μl

116 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/05 20:19

＞115さん
ｐＨはいくつですか？
以前Lysyl Endopeptidase使っていて切れなかった経験ありです（涙）
基質（目的蛋白）はペプチドですか？それともタンパク質ですか？
Lysはどれくらいあるかわかってますか？
（質問ばかりでごめんなさい～）

117 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/06 00:10

実験室の整頓２

118 ：112：03/01/06 09:30

>113さん
ありがとうございました。
なんか引っかかる気がしますが
なんとなく分かったような気がします。

>115さん
私も似たような条件で切れなかったことあります。
私は0.1% SDSを追加したらブチブチ切れました。

119 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/06 10:33

>116さん
　炭酸水素アンモニウムのpHは7.8でした。pH調製はおこなってません。
　基質はペプチドで65aaです。
　炭酸水素アンモニウムんの方がMS(MALDI-TOF-MS)とりやすいですが、
かわりに1M Tris(pH9)で消化するのは無しでしょうか？
>118さん
　0.1%SDSを追加ですか？！反応液にどれくらい加えられましたか？
　ためしてみます。

120 ：118：03/01/06 11:15

>119さん
SDSは終濃度で0.1%でやりました。
Lyc-CはこのくらいまでのSDS濃度だったら
絶えられるそうです。

あと、バッファーは0.001～0.1M Tris (pH8-9.5)
が私のところのプロトコルには書いてありました。

121 ：ちゃいな：03/01/06 13:53

ちょっと質問なんですけど。
異物をある生物に投与することによって、発現の上昇がRT-PCRで
確認されているものがあるんですが、実際に発現している臓器が分かっているならば、
タンパクレベルで発現の上昇を確認することって可能だと思います？

122 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/06 19:13

不可能ではなさそうだけど簡単ではない。

123 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/06 21:45

>>115
Lys-Cは確かアンモニウムイオンで阻害されるんじゃあ？いかにもLysのアミノ基と競合しそうじゃん。

124 ：スレ違いですが…：03/01/06 23:47

ＤＮＡ精製についてのスレってどこかにありませんか～？

125 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/07 00:03

あるよ

126 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/07 11:10

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーで塩基性タンパクの溶出にMgとかCaを使うと低濃度で溶出できるらしいですが、この二つにはどんな違いがあるんでしょうか。
違いがあるようなんですがよくわかりません。経験談ｷﾎﾞﾝﾇ

127 ：タンパク質初心者：03/01/09 01:37

クーマシーブリリアントブルーにはR250とG250というのがあるみたいですあが、
両者はどう違うのでしょうか？

128 ：厨：03/01/09 01:55

すっかり出遅れた…… 回答どうもありがとうございます。

>>107　その根本がわからなかったりします。(^^;)
>>109　目的のものは250kDらしいんですが30kDぐらいのものも
一緒に素通りしちゃいます。樹脂はSephacryl S400です。

>>124　このあたりどうですか？
大きなプラスミドの精製ってどうやるの？
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1031832809/l50
プラスミドミニプレップキットどれが良い？
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1026651564/l50

>>127 色と水溶性が違います。

129 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/09 14:55

>128さん
一度Native-PAGEすることをオススメします
もしかしたらサブユニットとかかも？

130 ：タンパク質初心者：03/01/09 23:28

>>128 色と水溶性が違います。
早速のご回答どうもありがとうございます。
ちょっとタンパクのＳＤＳ－ＰＡＧＥをやる場合には、どちらでも問題は
ないのでしょうね？

131 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/09 23:35

>>130
いや R の方が G より 5～10 倍感度が高くなるはず。
目的の蛋白量が多いならどちらでもいいけどさ。

132 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/09 23:37

ＲはよくトリシンSDS-PAGEなどペプチドをみたり銀染色する程ではな
いけれど量少ない・・・って時に用います
Ｇのが濃い青～紺でＲは水色です

133 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/09 23:57

Rって、コロイド染めするときに使うんじゃなかったっけ？

134 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/10 23:33

age-PAGE-hage

135 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/11 03:44

精製話からズレてる

136 ：タンパク質初心者：03/01/11 22:12

>>131,132,133
どうも、ありがとうございました。とりあえずＧでやってみます。

137 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/12 11:29

トリシンPAGE名前は知ってるが何のために使うのか分からない

138 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/12 12:07

10kDa以下の低分子をきれいに分けられると聞いた

139 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/12 18:57

あれ、泳動時間がえれーかかるから、
普通ので十分ならやる必要もなかろ。

140 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/13 12:33

>137さん
ペプチドとかのバンドを確認するのに使ってますよ
うちのラボでは
確かにすんごく時間かかります６～７時間とか・・・

141 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/14 01:30

>>140
乙カレー

142 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/16 01:25

学生がやる仕事じゃねーよ。精製はよぉ。

143 ：160：03/01/16 01:38

>>142
指導教官がやったこともないのにやらされてますが？
うまくいかなくて怒られてますが？
学部生ですが？

144 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/16 01:39

３０代になるとタンパク質を一から精製しようなどという蛮勇はでてきません。

145 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/16 01:41

デオキシコール酸はミセルサイズが小さいのでSDS-PAGEと同じレシピで
SDSをデオキシコール酸ナトリウムに置き換えたもので電気泳動すると
低分子量タンパク質やリポ多糖も高い分解能で分けられるそうだ。

146 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/16 02:11

でも、デオキシコール酸じゃタンパクほどけないような気が・・・

147 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/17 02:13

>145さん
それって前もってするサンプル処理にもデオキシコール酸使うのですか？
それともサンプル処理はSDS-PAGEと同じ要領でしょうか？
ちょっとやってみたいです・・・

148 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/17 07:48

疎水性領域を含む組換えタンパク質を精製したいと思うのですが、何かいい
方法はあるでしょうか？というのも、いろんな人がトライしてもうまく可溶
画分に来ないそうなんです
変性させずに精製をしたいのですが、、、
ちなみにヒスタグで昆虫細胞で発現させます

149 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/17 13:29

>>148
あきらめるのが一番いいと思うが。

界面活性剤の種類、イオン強度、pHについて、
注意深くサーチするしかないんじゃないかと。

その疎水領域は外しちゃいかんのか？

150 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/17 14:57

変性させて精製した後re-foldingではいかんのか？
溶けないやつはどうやっても溶けないぞ。

あるいはE.coliにホストをかえて、GroES-EL発現株を使ってみるとか。
シャペロンがあとあとじゃまだが、結構可溶化はする。

151 ：147：03/01/18 07:13

>>148さん、149さん
ご指摘ありがとうございます。
いろいろトライして、また報告したいと思います。

152 ：山崎渉：03/01/18 12:57

（＾＾）

153 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/19 18:59

144の気持ちがよく分かる

154 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/19 19:30

知り合いのポス毒は４年間ずっとある酵素の活性を追って精製に励みましたが、なかなか同定できず
結局、あきらめてゲノム情報から標的をゲットしIF=2の雑誌に論文を出しますた。

その間、ずっと1st無しなんで気の毒でした。

155 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/20 22:49

>>154
今は逆遺伝学の時代？

156 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/22 13:16

精製というとおこがましいんですが、煮詰まってます。
蛋白をアイソトープで標識してdistributionを見たいのですが、私の持って
いる蛋白は大量のアルブミンが入っているので除去したいのです。
HPLCでsize exclusion のカラムを使ってを使ったところ目的蛋白の３０数
kdの部分に小さなピークが出るのでこれを回収してSDS-PAGEしたのです
が、目的の蛋白よりずっと多くのアルブミンが出てきてしまいます。繰り返
すと蛋白がなくなってしまいます。蛋白濃縮用のフィルターで遠心してみて
も、漏れてきたアルブミンばかりになってしまいます。純粋な蛋白は市販さ
れているのですが、非常に高価なので、今まで非常に安価なアルブミン入り
を使っていたのです。なんとか安く精製する方法はないでしょうか？

157 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/22 14:34

pcDNAベクターにFlagかHAかc-MycかT7かHisx6タグ付けてcDNAを培養細胞で発現させて、精製しろ
バキュロもいいぞ

158 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/22 17:34

>>156
イオン交換とか、疎水相互作用とか、逆相とか、ハイドロキシアパタイトとかのクロマト。

159 ：156：03/01/22 23:07

157, 158
アドバイスありがとうございます。
いろいろやってみたいところですけど、新しいカラムを買えるかどうかが問題
かもしれません。

160 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/22 23:51

貧乏なら硫安沈殿とか・・・

161 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/24 02:30

分子量が２倍も違うなら，ゲル濾過で分けられる出衣装

162 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/26 00:55

ブルーデキストランって、アルブミン吸着するんでなかったっけ。

163 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/26 01:55

>>162
一応そういうことになってるけど、実はそんなに効果的でないかも？
アルブミンの含有量身のよるけど、血清のようなサンプルから抜こうとしても
そんなにぬけなかた。

164 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/02 18:03

ageついでに質問です。
今度大腸菌でタンパクを発現させようと思うんだけど、
refoldingしたタンパクはやはりfunctionがあるか
チェックしないと意味がないのかな？
よく大腸菌は糖が付加されないから活性がないことが多い
と聞くんですが。。。

165 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/03 00:58

>>164
一般的にはそうだけど。
何の実験に使いたいかによると思うが・・・。

166 ：お願いします。：03/02/06 01:01

大腸菌にタンパクを発言させて回収したいんですが、ソニケーションってどれくらいやるもんでしょうか。。
本によっては（３Lの培地から回収してきた大腸菌は）１時間くらいやれと書いてある者もあるのですが。。。。
そんなにやって大丈夫でしょうか／。

167 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/06 01:04

気持ち程度で十分

168 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/06 17:08

>>166
どのくらいの時間培養したかによっても違うし、
（対数増殖期の大腸菌の細胞壁は柔らかいと思う)
リゾチーム作らせてるやつなんかは細胞壁へなへなになってるんですぐに壊れる。

ソニケータのチップの大きさ、容器の材質などにも大きく影響する。

要するにやってみるしかない。

169 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/06 17:45

freeze thawing だけでもけっこう壊れると思う

170 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/06 22:27

>>168
それでは十分壊れたかの指標はどうするの？
スモールスケールで条件検討してもらーじすけーるにはあてはまらないっしょ？

171 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/06 23:41

顕微鏡で見るとか

172 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/07 01:37

>>170
タンパクが可溶性のものだったら、遠心してほとんどが上清にきたら、
菌が壊れたっていえるやん。

そんな感じで試行錯誤するしかないと思うよ。

173 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/07 11:49

ちょっと理由がありまして、プロテアーゼが使えないのですが、
同じように特定の配列を認識して、化学物質で融合タンパクを切断する
ことなんてできます？

174 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/07 15:19

そういえば、大腸菌をソニケーションで壊して硫安沈澱で分けた後、
１日くらい透析を繰り返してると白い者が沈澱してくる。
絵恥部路で光るし、260nm辺りに最大九週波長を持つからあれはDNAだよなあ。。。
きっと染色体がバラバラになったやつなんだろうけど、それってソニケーションのやり過ぎだから
でちゃったのかなああ。。みんな経験ありませんか？

175 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/07 20:59

>>174
白いのがDNAってのは多分誤り。
白いのの中にDNAが多く含まれているってのが正しいと思う。
普通に大腸菌壊したら、必ずDNAは出てくる。

176 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/08 03:30

>>173
ブロモシアン処理
ヒドラジン処理
あたりを検討されたし

177 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/08 03:38

>>174
昔、精製の進んだタンパクでそれ出たことがある。
たぶんアグリゲート。

178 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/08 10:50

んじゃあ、あぐらないためにはどうすればいいのだろうか。

179 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/08 10:57

>>175
いやほとんどはDNAだと思う。
市外吸収曲線も、きれいなピークを描いてたし（キアゲン精製みたいに）、
Bradford法の試薬をかけても色が全く青色にならない。

180 ：世直し一揆：03/02/08 11:26

＜血液型A型の一般的な特徴＞（見せかけの優しさ・もっともらしさ（偽善）に騙され
るな！）
●とにかく気が小さい(神経質、臆病、二言目には「世間」、了見が狭い）
●他人に異常に干渉し、しかも好戦的・ファイト満々（キモイ、自己中心）
●自尊心が異常に強く、自分が馬鹿にされると怒るくせに平気で他人を馬鹿にしようと
する（ただし、相手を表面的・形式的にしか判断できず(早合点・誤解の名人)、実際に
はたいてい、内面的・実質的に負けている）
●本音は、ものすごく幼稚で倫理意識が異常に低い（人にばれさえしなければＯＫ）
●「常識、常識」と口うるさいが、実はA型の常識はピントがズレまくっている（日本
の常識は世界の非常識）
●権力、強者（警察、暴走族…ｅｔｃ）に弱く、弱者には威張り散らす（強い者にはへつらい、弱い者に対してはいじめる）
●あら探しだけは名人級（例え10の長所があってもほめることをせず、たった１つの短所を見つけてはけなす）
●基本的に悲観主義でマイナス思考に支配されているため性格がうっとうしい（根暗）
●一人では何もできない（群れでしか行動できないヘタレ）
●少数派の異質、異文化を排斥する(差別主義者、狭量）
●集団によるいじめのパイオニア＆天才(陰湿＆陰険）
●悪口、陰口が大好き（Ａ型が３人寄れば他人の悪口、裏表が激しい）
●他人からどう見られているか、人の目を異常に気にする（「～みたい」とよく言う、
世間体命）
●自分の感情をうまく表現できず、コミュニケーション能力に乏しい（同じことを何度
も言ってキモイ）　
●表面上意気投合しているようでも、腹は各自バラバラで融通が利かず、頑固(本当は
個性・アク強い）
●人を信じられず、疑い深い（自分自身裏表が激しいため、他人に対してもそう思う）
●自ら好んでストイックな生活をし、ストレスを溜めておきながら、他人に猛烈に嫉妬
する（不合理な馬鹿）
●執念深く、粘着でしつこい（「一生恨みます」タイプ）
●自分に甘く他人に厳しい（自分のことは棚に上げてまず他人を責める。しかも冷酷）
●男は、女々しいあるいは女の腐ったみたいな考えのやつが多い(例：「俺のほうが男
前やのに、なんでや！（あの野郎の足を引っ張ってやる！！）」）

181 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/08 17:04

タンパク質の精製スレだよ。ここは。

182 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 00:06

まずPEI沈殿かストレプトマイシン処理かスペルミジン処理で
でDNAだけ沈殿させるのがよいと思われ。

PMID: 11735448

183 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 01:15

なんにしてもだ。
DNAちゃんと除けてないようなモンは、硫安分画なんかせんほうがええぞ。

184 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/16 03:41

保守

185 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/21 09:44

良スレ　age

186 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/21 17:01

[ISI Journal Citation Reports]

2001 JCR Science Edition

NATURE
Journal ImpactImmediacy Cited Citing Source
Mark Title ISSN Total Cites Factor Index ArticlesHalf-Life Half-Life Data
[Checkbox] NATURE 0028-0836 315640 27.955 7.734 939 6.9 4.5 Data
----------------------------------------------------------------------------
Impact Factor
Cites in 2001 to articles Number of articles
published in: 2000 = 26108 published in: 2000 = 1013
1999 = 26028 1999 = 852

0 + 99 = 52136 0 + 99 = 1865

Calculation:Cites to recent 52136
articles ----- = 27.955
Number of recent 1865
articles

ということなので
ＩＦは論文が出た次とその次の年の被引用回数期待値
論文が出た年の被引用回数期待値はImmediacy Index

187 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/21 17:51

精製したペプチドなりタンパクを「Ｖ８protease」で酵素消化してる人いないかな？
精製ペプチドがLys-c でもThermolysin でもV8 でも切れない。
だれかプロトコルｷﾎﾞﾝﾇ

188 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/22 19:16

疎水クロマトではpH7.5より7.0の方が分離はよくなりますか？
あと20mMリン酸バッファー1M硫安のpHってpHメーターで測れているんでしょうか？

189 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/25 03:28

スレ汚しすまん！

190 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/03 00:32

何で遺伝子の数よりもタンパクの数のほうが多いの？
遺伝子・・・3万
タンパク・・・20万
ぐらいですよね。
セントラルドグマでは遺伝子の種類の数とタンパクの種類の数って同じのような気がするんですが、教えてください。

191 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/03 01:17

それを知ってなんになる?

192 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/03 01:19

＞１９０　あふぉ？

193 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/03 01:42

とりあえずスレ違いだな。

194 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/03 11:08

外注ないの？

195 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/04 18:59

シグナルペプチドつけて、分泌型にして精製しようと思うのだけれど、
どの配列つけたらよく分泌されますか。
経験ある方教えてくださいな。

196 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/04 22:18

>>148
遅レスだがアルコール使うのも一つの手だよ。エタノールかメタノールね。

197 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/05 03:35

>>196
イソプロとか、エチレングリコールなんかも使うって話もあるな。
溶けるよりも先にタンパク壊れそうなもんだが。

198 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/06 16:08

教えて君でスマソ。
ある蛋白質を大腸菌で発現させ精製したが、分子量約60kDaの蛋白質が混じってきた。
おそらく分子シャペロンGroELとの複合体ができていると考えている。複合体からシャ
ペロンを遊離させたいのでATPを添加した実験を試みているが、うまくいっていない。
こんな経験のある人、ヒントあるいは参考文献を教えてもらえませんか？

199 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/06 22:59

>>198
ついてきちゃうよな、GroEL。
いい方法あったら、俺も知りたい

200 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/07 01:05

>>198
SDS-PAGEで展開後切り出す。

・・・ｽﾏﾝ

201 ：山崎渉：03/03/13 13:45

（＾＾）

202 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/21 14:30

>>196
どういうふうに使うんでしょうか？

203 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/21 22:35

>>202
溶出液に混ぜる。

204 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/23 00:41

>>198
MgCl2とATPを最終5mMになるよう加える文献みたことある。Tris50mM pH8.0で25度、活性をはかりながらインキュベート。

205 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/27 19:01

脂肪組織からタンパクを抽出したいのですが、脂肪をなるべく
除きたいです。なるべく活性を保ちたいので、有機溶剤などは
使いたくないのですが、いい脱脂方法などないでしょうか？

206 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/28 00:15

アセトンでも使うべし

207 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/28 01:24

>>205
有機溶剤使っといて、後で巻き戻すってのはどうよ。
近頃はこんなものがあるらしいぞ。

「タンパク質リフォールディング技術」
http://www.affrc.go.jp/ja/db/seika/data_nfri/h13/04.html

誰かこのあたり詳しい人、コメントlちょうだい。

208 ：TR4：03/03/30 04:33

今度リン酸化タンパク質の活性の比較をしたいと思っています。とりあえず
大腸菌で発現、カラムで精製させるわけですが、リン酸化されていない状態
のタンパク質をとってきたいのですが、バッファーは何がお勧めでしょうか
？リン酸バッファーじゃまずいと思うし、でも、今までリン酸バッファーし
か使ったこと無くて他のタンパク精製に向いたバッファーについてはあんま
り知らないしで・・・誰かバッファーの選び方についてコメントください。

209 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/30 20:05

>>206,207

コメントありがとうございます。「タンパク質リフォールディング技術」って
はじめて聞く手法ですが、勉強してみようと思います。

210 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/31 01:19

>>208
とりあえずはGood buffer

211 ：ＴＲ４：03/03/31 15:03

>>210
Ｇｏｏｄって人の名前のＧｏｏｄですか?手持ちの本に載っていないんですけど、
組成とかｐＨとか教えてもらえませんでしょうか?

212 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/31 15:33

>>211
手持ちの本調べるのもいいけど、もっと楽すること覚えたほうがいいかもな。
googleで簡単にこんなのが見つかったよ。
http://www.toyama-mpu.ac.jp/hp/clla/seikahp/mametisiki.html

213 ：TR4：03/03/31 21:28

>>212
ありがとうございました。この中から適当なｐＨのものを選んで使ってみます。
たまには２ｃｈ以外にもインターネット使えってことも分かりました。

214 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/04 16:20

コラーゲンの一次構造の機能部位（ex.細胞接着・RGD）を調べる場合

精製過程でゼラチンにしてしまうのだが、これってOKなのですか？

立体構造状態と機能はかわってくるんでないの？

215 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/04 16:37

立体構造状態と機能はかわってくるんでないの？
　　　　　　　　　　　　↓
立体構造状態で機能はかわってくるんでないの？

216 ：↓ここに逝けぇ!!：03/04/04 16:49

http://www.raus.de/crashme

217 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/07 17:47

タンパク質精製初心者なのですけども，教えて下さい．
私の所属する研究室でタンパク（主に酵素なのですが）の単離精製をはじめようということに
なり，FPLC も購入したのですが，差し当たってカラムはどの辺りをそろえればよろしいでしょうか？
イオン交換系やゲルろ過にしてもたくさんあり過ぎてとてもではないけども全部は買えません．
試料は動物臓器です．具体的にどの会社のこれがいいとアドウ゛ァイス頂ければ幸いです．
予算はできれば５０万円，最高でも１００万円くらいでお願いします．

218 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/08 10:40

別に好きなの買えば？

まあどれを買えばいいと言うより、無いとやってけないものとしては、
monoQ、monoS、ゲル濾過最低一本、くらい。
これくらいないと何にもできんでしょう。
ファルマシアのmonoQHRとmonoSHR、superose6くらいは揃えとけ。
今はmonoQ 5/50 GLとかになってんのか？よく覚えてないが。
あとQ-sepharoseFFとS-sepharoseFFくらいはあって困ることはない。
つか無いとしばしば困る。あとは自分の目的酵素にあわせて何かアフィニティ
かっときゃいいんでないの？

値段はmonoQ、monoS、superoseで50万くらいかね。
ゲル濾過は目的蛋白の大きさに合わせて適当なのを選ぶべし。

あ、大事なことだが、２ちゃんの情報なんか信用してカラム買ったりするなよｗ

219 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/08 13:05

>217

アマシャムのカタログ見るといいよ。いろいろ載ってて
勉強になるよん。
ゲルろ過とかは分析スケールを勝負?スケールとでは
違うので注意ね。
後者の場合は自分で担体詰めるのがつめるの廉かったりする。
セルロファインとか。

　FPLC買ってからのアドバイスで申し訳ないんだけど、
オープンカラムがてっとりばやくて良かったりして（笑

220 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/08 13:43

100kxg上清画分を硫安塩析して、透析、DEAE-dextranでバッチで結合、カラムにアプライして
塩濃度ステップワイズで粗精製、その後、半透膜で濃縮、バッファー置換して25マイクロメートルのフィルターで
濾過してからFPLCにかけろ＞218

221 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/08 14:01

>220は217より素人だと思われ。。。。
まあネタだろうけどｗ

222 ：あぼーん：03/04/08 14:19

　　 ,.´ / Vヽヽ
　　　 ! i iﾉﾉﾘ）) 〉
　　　 i l l.´ヮ｀ﾉﾘ　＜先生！こんなのがありました！
　　　 l く/_只ヽ　　　
　　|￣￣￣￣￣|
http://saitama.gasuki.com/koufuku/

223 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/08 15:52

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224 ：217：03/04/09 08:32

>218, 219, 220, 221
丁寧なお返事有り難うございます．
ご意見を参考にしながらカタログ見ていくつか買って見ようかと思います．
これからもご意見お願いします．

225 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/09 08:49

http://japan.pinkserver.com/peepingroom/index.html

226 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/09 20:21

最近オンラインカジノでよく遊んでるよ！
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227 ：山崎渉：03/04/20 04:33

　　 ∧＿∧
　　（　　＾＾）＜ぬるぽ（＾＾）

228 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/22 11:22

DNA結合タンパクの精製をします。まず細胞抽出液をポリミンPまたは
ストレプトマイシン処理により核酸を除いてから、カラム操作をおこないます。
でも、DNA結合タンパクは、除核酸処理の時にDNAとともに除かれてしまうと
いうことはないのだろうか。そもそもどうして除核酸しなければならないのか
教えてください。

229 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/22 12:42

>>228
別に問題にならないんだったら、やんなくてもいいよ。

230 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/22 22:18

>>228
除核酸処理が裏目に出てDNA結合タンパクが一緒に沈殿してしまう、
なんていうのはよくあるケースです。
というか、ポリエチレンイミンを核酸結合蛋白質の精製に使用した
かなり初期の論文では
（１）一度ポリエチレンイミンで核酸結合蛋白質をDNAを沈殿させ
（２）沈殿を0.3Mくらいの塩で洗うと
（３）ほぼワンステップでタンパクが精製できた・・・
なんていうのもあったような気がしまする。SSBの精製だったっけな？
ストレプトマイシンのほうがそういうケースが少ないと思うけど。

でも、核酸はのぞけるなら早めにのぞいておいたほうがいいよ。
最悪の場合にはcellつぶすときにリゾチームと一緒にDNASE Iをいれるのさあ

231 ：_：03/04/22 22:25

（　´Д｀）/＜先生！！こんなのを見つけました。
http://muryou.gasuki.com/hankaku/hankaku05.html
http://www.muryou.gasuki.com/hankaku/hankaku06.html
http://muryou.gasuki.com/hankaku/hankaku10.html
http://www.muryou.gasuki.com/hankaku/hankaku09.html
http://muryou.gasuki.com/hankaku/hankaku07.html
http://www.muryou.gasuki.com/hankaku/hankaku08.html
http://muryou.gasuki.com/hankaku/hankaku01.html
http://www.muryou.gasuki.com/hankaku/hankaku02.html
http://muryou.gasuki.com/hankaku/hankaku03.html
http://www.muryou.gasuki.com/hankaku/hankaku04.html

232 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/06 06:29

3000プロジェクトはうまく逝ってるのか？

233 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/06 12:12

他のミレニアムプロジェクトやCRESTなんかよりははるかにうまくいっているよ

234 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/06 12:24

真面目なんですが、
ちんこを大きくしたい。どうしたらいいっすか？
彼女いわく「入ってる気がしない」らしいのです。
お願いします。２ｃHパワーでどうにか・・・・
有効なマッサージとか、食品とかありませんか？
ちなみに年は２０歳です。どうか科学的に・・・

235 ：bloom：03/05/06 12:26

http://homepage.mac.com/ayaya16/

236 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/10 13:09

>232
うちはうまくいってません

237 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/16 01:40

どこ？関東かな？

238 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/16 02:04

たぶん灯台じゃないか？

239 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/16 13:43

メンバーを見ればどこがうまくいきそうかそうでなさそうか分るよな。
ていうか2chネラーですらわかるようなことが、文科省役人にはわからないのかな?

240 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/17 01:53

彼らは文系だからな。

241 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/17 12:03

文バカじゃしょうがねえな。

242 ：236：03/05/19 21:01

関西しょぼしょぼ大学です

243 ：ももえ：03/05/19 21:05

寄ってらっしゃい
http://www.k-514.com/

244 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/19 21:37

いいスレが見つけられなかったのでここで質問させていただきます。

蛋白質、RNA、DNAについて勉強したいのですが
いい参考書はありますか？
ちなみにRNAって何？っていうくらいのバカです。

245 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/20 00:14

んー、
高くてもいい、もしくは大学の図書館が利用できるなら、
細胞の分子生物学、ローン生化学とか。

安いのがいいなら、適当なブルーバックスを読むか、
ネットで検索しる。

246 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/20 01:37

TAブラウンの「ゲノム」第二版出たよ。第一版から、早くも
改定したけど、あれはひょっとしたらいい本かもよ！

247 ：クローン人間：03/05/20 03:13

これとゲノムの関係が分かる人は入室許可します。
http://homepage2.nifty.com/deadoc/

248 ：山崎渉：03/05/21 21:39

━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

249 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/22 00:16

かなり基本的な質問ですが、変性剤の定義って何か改めて聞いたことないのですが、
以下のようなタンパクの構造保持に関わる相互作用を壊すものということでよいのでしょうか？
塩橋を切る→GdnCL,Urea
疎水相互作用を壊す→detergent（detergentって変性剤に入りますよね？）
水素結合を壊す→なんだろう？？

誰か分かる方、教えていただけますでしょうか？

250 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/22 00:43

大体あってるとおもいますがGdnCl / Ureaは水素結合もこわすと
おもいます。
あと、「カオトロピックイオン」を変性剤としてカウントする
こともあります。
GdnSCN, KSCN, KClO4などです。
１「変性失活させるものは全て変性剤」という広義の使い方と、
２「立体構造を失わせて可溶化させるための変性剤」という意味と
どちらもありですが。でも酸変性・アルカリ変性・有機溶媒変性や
核酸抽出のときに用いられるフェノール処理のフェノールなどは２の意味での変性剤としてはもちいられないですね。

251 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/22 00:47

分子間架橋は何で切ればいいでしょうか？

252 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/22 01:05

SSならDTTとかで還元すれば・・・。
どういう架橋かわからないとなんとも・・・。

253 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/22 08:29

すんませんアルドール架橋です

254 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/22 13:26

天然蛋白質でアルドール架橋なんてありましたっけ？
GFPのクロモフォアは、ちがったかな分子間じゃないよね

255 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/22 20:05

コラーゲンにあったような

256 ：597：03/05/22 20:14

まんこ汁に含まれるタンパク質を精製したい。

257 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/22 20:17

”週間ボイス”っていいよ
ニュースの英字記事内容と訳文を月８０円で毎週日曜日に
購読できて、そのニュース音声も聞くことができる。
まぐまぐから配信されるから安心だよ。
申込は以下のアドレスからできるよ。
HPにはサンプルがあるよ。

ＨＰから↓
http://flexy.infoseek.ne.jp

まぐまぐから↓
http://premium.mag2.com/
週間ボイスで探してみてね

258 ：249：03/05/26 22:46

250 さん、ご返答ありがとうございました。一つかしこくなりました。

259 ：山崎渉：03/05/28 14:16

　　　　∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　(　　＾＾）＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣〕
　　＝ ◎――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉

260 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/11 21:56

ちょっと質問
pET系のベクターで可溶可させるのにNusAとかDbsとかあるけど、
使ったことある人います？
詳細きぼんぬ。

あとorigami competent cellとかもどう？

261 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/11 23:43

スレ違いかもしれませんが、
分子量がとても大きいタンパク(Brca2, DNAPK 380 kDa)を
電気泳動により分離して、検出したいと考えております。
できればウエスタンもしたいのですが、どなたか教えて
いただけないでしょうか。

262 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/12 01:26

>>261
何を教えて欲しいんだ？

263 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/12 11:29

>262
分子量の大きなタンパクの分離を良くするには、ゲルの濃度(%)を
下げればいいのですが、分子量が380kDaあるような場合には単にseparating
gelを3-5%ぐらいにすれば、分離できるのでしょうか。また分離できたとしても
泳動後にウエスタン用の膜に転写可能でしょうか?

264 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/12 15:32

げるろか

265 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/12 18:06

>261、263
論文とか業者を調べたほうがいいんじゃ…。
めんどうなら単純にウェブで検索してみては？
ぱっと見た感じ、普通に5-9%のゲルで流してウェスたんやってるみたい…。

266 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/12 18:23

>>261
検出方法があるタンパクなの？
精製度合いは？ただの抽出液？
場合によっては、一回ゲルろ過クロマトしたほうが
良い時もあるよ。

267 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/13 00:56

>>263
薄い濃度のゲル作るときは、Bisの濃度を高めにするといいそうだ。
クロスリンクした奴のSDS‐PAGEだと、500kDaぐらいまでバンド見えるから、
400そこそこなら、やれんことはないと思う。

268 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/13 13:48

GST融合タンパクの精製をしてます。
これまで数種類のタンパクをGSTタグで精製したことがありますが、
いずれの場合もGlutathione Sepharoseへの吸着が悪かったです。
大腸菌でinduceしたタンパクの数パーセントしかついてないです。
今回のBufferは次のような組成です。
50mMTris/pH7.5,50mMNaCl,1mMEDTA,10mM2ME,10%Glycerol
ちなみにsonicationはしていません。

どこかに気を付けたら吸着率が改善するのでしょうか？
それとも試した融合タンパク自身がGlutathioneにくっつきにく
い性質のものだったと考えたほうがいいのでしょうか？

269 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/13 20:35

ここだけの話ですが樹脂のほうを使用前にguanidine HClであらってみて
くらさい

270 ：_：03/06/13 20:51

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/hankaku03.html

271 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/13 23:40

>>269それって、どの質問に対するレス？

272 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/13 23:41

あなたが探してるのってこれだよね？この中にあったよ♪
エッチな動画がただで見れるよ！
http://www2.free-city.net/home/angelers/page001.html

273 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/13 23:53

269　>>268
出荷状態直後のGSH SepharoseFF　吸着能ひくいっす
4bではそんなことなかったんで、密度上げすぎてスペ
ックおちてるかも

274 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/16 10:22

>230,265,266,267
遅レスですが、ありがとうございました。

275 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/16 10:27

>267
500kDaのタンパクを流したときの、アクリルアミドとビスの濃度を
教えていただけませんか。

276 ：aiii：03/06/17 10:46

glycophorin A の精製法を教えていただけませんか。
古い方法なら書いてあるんですけど。

277 ：_：03/06/17 10:48

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

278 ：268：03/06/17 13:04

>>269,273
レスありがとうございます。
単体側に問題があるとは…。
さっそく今週試してみて結果を報告させていただきます。

279 ：_：03/06/17 13:06

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

280 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/18 15:30

がん細胞が永遠に生きることを利用して、たんぱく質を作ることについて説明したページってどっかにないですかね？

281 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/20 00:40

自戒をこめて。

技術的エクセレンスがないくせに、難しいサンプルに徒に手をだして
試薬と時間を無駄にしてはいけない。

結果がでないことを、難しいサンプルのせいにしてはいけない。

それは単に研究を始める前の時点で、すでに誤っていたということに
しか過ぎない。それを続けるのに、他人を巻き込んではならない。
自滅するなら独りで。

282 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/20 21:31

なんで酵素できれねーんだ？ペプチドはよ～～～

283 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/20 21:38

>282
切れないような酵素or条件を使っているのが悪い。
もっと勉強しなさい。

284 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/20 21:46

了解http://yahooo.s2.x-beat.com/linkvp2/linkvp2.html

285 ：_：03/06/20 21:48

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

286 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/20 22:34

>>280
寿命が無限大だとしても、分裂のたびに突然変異が起こるから、
有用なタンパク質を作り続けるとは限らない。
そもそも、ミューテーションの除去、校正能力が欠損しているのが
がん細胞なのだから、突然変異の可能性は正常細胞と比べ
格段に高いと考えられる。
しかも、大腸菌などのバクテリアは無限増殖するので
あえてがん細胞を利用する利点はない（増殖スピードからも）。
バクテリアは単離、保存がが容易で、かつ培養も簡単なので
タンパク質を量産する目的でがん細胞を有効利用するなんて
研究するだけでばかげていると思うが。

287 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/20 23:05

>>286
ハイブリドーマって一種の癌細胞だよね。
モノクロを大量生産するときに、ハイブリドーマをマウスやラビット
の腹腔にうちこむと、そこに定着して固形がんを形成した後
ものすごい大量な抗体をそのマウスないしラビットの腹水に
産生するよね。
こんな方法はかれこれ十五年前からあるけど、286ってひょっとして
物知らず?

288 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/21 08:45

>287
286は当然そんなことは知っていると思うがな。
一般的には286論が当てはまるがこういう例もあるよ、と言った方が大人だわな。
おまえさんまわりに嫌われてないかい？

289 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/21 12:20

俺の周りでは嫌われてないよ、オトナの社会にいるから。
でもまあコドモには嫌われてもまったくかまわないよ。

「研究するだけでばかげていると思うが。」

って書き込みをしてるコドモにちょっときついこといっただけさ。
しつけとして当然。どうせ生物業界なんて人があまってるんだから
才能のないこの業界に向いてないコドモは、みんなで叩いてはやめに
おひきとりねがったほうが、もしかして本人のためかも？
ところで286ってひょっとして288？素直にゴメンなさいっていえない？

290 ：288：03/06/21 16:30

いや僕は286さんじゃないよ。
287さんも280さんに対しての回答をちゃんとされてるんだから、もう少し言い方をかえたら
読んだ人間もイヤな気分にならないですむのになあと思っただけ。
でも一番悪いのはこの程度をスルーできなかった僕ですね、その点ではゴメン。

291 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/22 18:31

>>287
大腸菌でモノクロ作れますか?

292 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/05 18:57

あるプロトコルのタンパク精製法で見たのですが、

大量発現
↓
sonication
↓
1M ショ糖
↓
4% Triton
↓
inclusion body　(90%の精製度)

と、あるのですが、この時の1Mショ糖溶液の役割を教えてください。

293 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/05 19:53

>291
287ではありませんが、
single chainのFvを発現するシステムがあります。
アマシャムでファージを使ってscFvを発現させるのが
あるんですが、大腸菌でもできるんじゃないでしょうか。
詳しくはホームページでも調べてみてください。

294 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/05 23:01

私が作りました♪
http://nuts.free-city.net/index.html

295 ：_：03/07/05 23:09

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

296 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/08 01:22

>>292
おそらく密度調製とおもわれ。
inclusion bodyを溶かさないようにしながら
細胞膜破片などは上済みにうかせて、沈殿だけを
とるんじゃないかな？

297 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/08 03:18

>293
scFvじゃなくて、「親IgGが作れるか？」の意ではないかと。

298 ：_：03/07/08 03:53

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

299 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/08 13:33

＞297
scFvでもふつうの抗体みたいに使えるとおもいますが
（Fusion proteinにしたりとか）。

300 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/09 05:03

>299
使える使えないではなくて、
150kDaのタンパク質が作れるかどうかを問題にしていたのだと思いますが。

301 ：山崎渉：03/07/12 12:18

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

302 ：山崎渉：03/07/15 13:01

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

303 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/21 16:36

神戸である「若手ペプチド夏の勉強会」参加する人います？

304 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/21 17:05

そんなのがあることすら知らなかったYO

305 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/22 17:04

結構マイナーじゃん。それ

306 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/23 05:15

TAGZYMEってどうよ？

307 ：_：03/07/23 05:16

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

308 ：なまえをいれてください：03/07/24 15:38

ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

309 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/25 19:42

ハッキリ言って近所の吉野家ではねぎだくの方がつゆだくよりもずっと立場は上だよ。
一家４人で吉野家、よーしパパ特盛り頼んじゃうぞー、とか言ってる親子連れは店員のストレス解消のいい的。
吉野家は、殺伐とした雰囲気を出してるし、親子連れはかなり彼らに見下されている。
(吉野家通は店員には頭があがらないためＵの字テーブルの向かいに座った奴相手に刺すか刺されるか。
また、隣の奴は本当につゆだくを食いたいのかと小１時間問い詰めたい。
「１５０円でどうだ？(その席空けろ）」と持ちかける吉野家通も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ牛鮭定食しか頼めない素人は滑稽。

310 ：ぼるじょあ ◆yBEncckFOU ：03/08/02 03:09

　　　　∧＿∧　 ∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　（　・３・） (　　＾＾）＜これからも僕たちを応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣￣∪￣￣〕
　　＝ ◎――――――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉&ぼるじょあ

311 ：山崎渉：03/08/15 18:55

　　　 (⌒V⌒)
　　　│ ＾＾ │＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　⊂|　　　　|つ
　　　（＿）（＿）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎パン

312 ：名無しゲノムのクローンさん：03/09/06 06:40

GST融合タンパク発現したー！

313 ：名無しゲノムのクローンさん：03/09/07 15:03

prteins labfaxいい本ですね。
protease inhibitorの作用濃度や半減期ものっていた。

314 ：名無しゲノムのクローンさん：03/09/16 03:00

protein protocolもかなりいい本だよ

315 ：名無しゲノムのクローンさん：03/09/22 00:34

あのー。膜貫通領域をもったたんぱく質を精製できた例って
少ないんでしょうか。。？

316 ：名無しゲノムのクローンさん：03/09/22 11:19

くさるほどある

317 ：315ではないですが：03/09/23 00:45

>>316
やっぱり界面活性剤とかつかって可溶化ですか?

318 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/04 19:19

Native(SDSで変性させていない)PAGEにタンパクを流したあとのゲル片から
タンパクを抽出する方法をご存じでしたらどなたか教えてください。

319 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/04 21:37

バッファにゲル片放り込んで拡散させる

320 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/05 00:48

大腸菌由来タンパクを精製し、業者に依頼してポリクロ抗体を
作ってもらいました。
が、目的のバンドと丁度同じ位置にバックが出てしまい困ってます。

この状態から精製は可能でしょうか？
一番簡単な方法を教えてください。

321 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/05 01:25

抗体を精製するのはあきらめる（バックグラウンドの正体がわかってない限り）

抗原をもっときれいにして抗体を作り直すべし
うちは学生時代タンパク質専門だったから大概のものならウルトラ・ピュアにできる

322 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/05 19:42

>>318
ありがとうございます。
bufferはどんなものでもいいんですか？
あと拡散させたあとは遠心してゲルを除去すればいいんですか？

323 ：322：03/10/05 19:43

× >>318
○ >>319

324 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/05 19:51

ゲル作ったのと同じような組成でいいと思う
なら、数十パーセントは回収できるでしょう
ゲルは遠心除去
サンプルは濃縮

あと電気泳動的に目的物を引っ張り出すような方法もある

325 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/05 19:52

ちなみに、アクリルアミドのゲルから核酸を抽出するキットはタンパク質にも同様に使える

326 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/06 01:53

＞ゲル作ったのと同じような組成
Tris-buffer(glycine含まない)でもいいですか？

327 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/06 05:32

うちはTris系で回収してる
液量を増やせば結果回収量は増やせるけど
希釈されてモノによっては不安定になったり
濃縮が大変だったりするから
安定で疎水ゲルなんかで簡単に濃縮できるものなら
液量は多少増やしてもいいかも

328 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 00:32

分子量500kDaの蛋白質の精製をしようと、細胞にmycタグをつけて抗体カラムを行おうとしていますが、通常の免疫沈降に比べてほとんど精製できません。
ホモジナイズする時に細胞重量の５倍のバッファーを加えているのですが、加える寮が少なすぎるのでしょうか？
通常の免疫沈降法では細胞20μgあたり1mlのバッファーで溶解すると思います。
他に考えられる原因として、
①溶出に用いるmycペプチド濃度が適切でない
②myc-アガロース量が適切でない
③濃縮（セントリコン)時にロスっている
が考えられると思います。
経験者もしくは研究室で蛋白精製を行っている人がいましたら、どうか教えてください。
お願いします。

329 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 17:18

精製したときに，カラムレジンの一部をSDS-PAGE,Immuno blotting
してタンパク吸着を調べてみたら如何？
ビンゴだったら溶出条件の検討でコトがすみますよね．

330 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 17:53

>>328
負荷後洗浄液は調べてみた？
そこに出てこなかったら溶出せずにくっついたままでは？

331 ：328：03/10/10 20:52

>329
カラムレジンにくっついているのですが、それ程多い量とは思えません。
myc蛋白質のレジンへの結合があまりよくないみたいです。
>330
負荷後の洗浄液に蛋白は残っていました。
どうしたらいいのでしょう？

332 ：329：03/10/10 20:58

>>330
ｽﾏｿ．君の言ったチェックが正しい．
精製するとき，洩れは全ての画分のタンパク濃度を測り，
SDS-PAGEをしてるから，つい…

>>328
そういうわけで洩れの言葉足らず．
鬱出死脳

333 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 21:13

目的物の本体がデカいし立体構造も不明だから
抗体の結合力を考えると、立体障害（＝物理的にアクセスできない）の可能性が大きい。
別のタグを試すか、間を長く取るか、
それがダメなら精製法の変更まで考える。

334 ：328：03/10/10 21:20

>333
普通の免疫沈降レベルではかなりくっついてくるんです。
スケールを大きくしただけなのに、なぜうまくいかないのかよく分かりません。
違う点は上に上げた点と、バッファーが異なること位です。

335 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 21:28

ああごめん
免沈のとこ読んでなかった。

でも、洗ったときに落ちてくるんだから
なんで上のきみの原因推測１－３に至るのか理解できん。

336 ：328：03/10/10 21:30

>335
普通洗ったときにも落ちてこないものなんですか？

337 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 21:35

>328
一週間くらい前に別スレで質問してたときもそうだったけど
自分の状況を最初から出来るだけ書くようにしなよ。
前回と同じ書き込みをそのままコピペするのはこのスレの方々に失礼だと思う。

338 ：328：03/10/10 21:37

>337
ごめんなさい。
まだ書き込み慣れていなくて…。

339 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 21:37

負荷や洗浄の条件はただでさえ高い抗原抗体結合の結合定数が高くなるように設定されているから
抗体数が不足していない限り、抗原が通常の検出下限を上回るほど検出されるのはおかしいと思う。

ところで、それにもかかわらずなんで１－３の推測が出たのか？
その理由を聞きたい。

340 ：正誤：03/10/10 21:41

抗原が通常の・・・ -> 抗原とキメラになった目的物が通常の・・・

341 ：328：03/10/10 21:41

>339
負荷や洗浄の良い条件が分からなくて、上の１－３の推測が出たのです。
だから抗原が通常の検出下限を上回るほど検出される可能性も捨てきれないという次第で…。

342 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 21:48

ちょっとキミの言ってることわからんよ。

「検出される可能性」って？実際検出されてるんでしょ？
可能性じゃなくて原因では？
それに、検出されてるんだったら、抗体カラムにくっついていないことが分かってんだから
１－３のように推測するのはおかしいのでは？ということ。

343 ：328：03/10/10 21:56

>341
書き損じです。
すみません。

推測についてですが
レジンにもくっついているんですがこれが溶出、濃縮という操作を経た結果、検出されないという結果から推測１，３
負荷の条件が分からないから推測２を書きました。

344 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 22:06

免沈のときの条件は？

345 ：328：03/10/10 22:16

>344
免沈の時は10cm dishから細胞を剥がして20mM HEPES, 142.5mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM EGTA, 1% NP-40 計1ccで溶かし、myc-Agarose 10μlを加えて四時間振っています。
溶出はmyc-peptide 50 μg/mlで行っています。

346 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 22:18

同じバッファ条件でカラムにかけられないの？
特段問題が思い浮かばないんだけど

347 ：328：03/10/10 22:23

>346
今までは先にゲルろ過をかけて(燐酸バッファー）いたので、バッファーがどうしても異なっていました。
うまくいかないので、先に抗体を負荷させようと思っています。
次回は同じバッファ条件で実験するつもりです。
抗体負荷の前にプレクリア（proteinG)を行ったほうがいいでしょうか？

348 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 22:31

>>347
つーか逆にそのリン酸バッファーでimmuno precipitationしてみれば良いじゃん。
そのバッファーに問題があると思うなら。
１ー２日で結果出せる実験だからね。

349 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 22:32

ライセートそのままかけるんだったら前処理やるべし

350 ：328：03/10/10 22:35

>348
そうですね、やってみます。

351 ：328：03/10/10 22:37

>349
一応ライセートを10000g 10分遠心行うつもりです。

352 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 22:40

否、抗体に非特異的結合するタンパク質がライセートに含まれてるだろうから
それ除いとかないと
(その前にゴミを除くのは当たり前ってことで)

353 ：328：03/10/10 22:42

>352
分かりました。
プレクリア行います。
いろいろ有難うございます。

354 ：328：03/10/10 22:52

答えてくださった方々、貴重な時間を割いていただき有難うございました。
またいろいろやってみますが、うまくいかなくなったら質問させてください。
本当に有難うございました。

355 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/10 23:05

今から１０年前までウチの部屋はタンパク専門で
タンパク精製の長ったらしいスキーム考えては実験というのが楽しかったんだが
今はそんなのに手間ヒマお金も掛けてられないからなあ
そういうウチのラボも部屋内やベンチ上見ると１０年前とはまるっきり違ってるし

356 ：ＴＢ＄：03/10/22 21:19

５ＫＤａ～２０ＫＤａのタンパク質にタグをつけて精製したいです。
ＧＳＴはでかいからつけたくないんですけど，なんかお勧めのタグありませんか?
Hisは当りはずれがあるっていうし・・・

あとPROTEIOSのｋｉｔ使ったことある人いませんか?
どうでした，うまくいきましたか?

357 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 21:49

毎日使っています。

358 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 21:55

PROTEIOS使うんだったらものすごい量発現できるんだから、地道に精製すべし。

359 ：ＴＢ＄：03/10/22 22:00

精製はHisでオッケーですかね?なんだか結果がいまいちなんですよ。

360 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 22:09

これからPROTEIOS使うならもうタグなんかつけずに、精製用HPLC、pIやnaiveの電気泳動などで精製すべき。
PROTEIOSは、mRNA無作為選択発現試行で発現率は95%くらいあるし、従来のコムギ胚抽出物系の1,000倍量くらい取れる。
タグなんかつけて悩むより、タグなんか不要。

361 ：ＴＢ＄：03/10/22 22:13

コメントありがとうございます。ちょっと，そっちの方で考えてみます。

362 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 22:28

>>360
「mRNA無作為選択発現試行で発現率は95%くらい」ってホント？本当なら早速試してみたいので、どこかに参照できるデータある？

363 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 22:35

残念ながら、私の仕事で進行中なので公開できるデータにはありません。
信じてもらうか、眉唾物と聞き流してもらうかの選択しかありません。

364 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 22:37

高価なキットなので、ご自身でよく考えてください。

365 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 22:37

うーむ、その道のプロの方でしたか…
例えばどのくらいのサイズのタンパク質まで発現しますでしょうか？

366 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 22:47

うちが確認した中では120kDaのものも発現しました。
計算推定分子量がそれより大きいものは後回しにしてあるので
200kDaなどというものはまだ試していません。
もっとも、一般的に言えることで、低分子量のほうが一般的によく発現します。
たぶんそれはキットの説明書の中にも書いてあったと思いますが、
80kDaくらいまでならそんな大きな差異は感じていません。

367 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 22:50

凄すぎ！　ここで言ってる「発現した」ってのは、CBBで見えるくらいと考えて良いのでしょうか。例えば120kDの場合とかでも。それともWesternレベル？

368 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 22:51

すみません。慌ててしまいました。実はtoxicなタンパク質の発現に苦労しています。

369 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 22:53

三菱化学生命科学研究所がこの系を使ってやった一部例（泳動像）を公開しているので
それなどは参考になりますか？

370 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 22:54

何に対してtoxicなんですか？

371 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 22:56

> CBBで見えるくらいと

モノによってですが見えます。これはペーパも出てます。
(昔A社のmet抜きのキットでやってたころから考えたら夢のよう)

372 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 23:00

チャネル・ブロッキング系なら大丈夫だと思いますが
リボゾーム・アタッキングなんかだと難しいと思いますが。

373 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/22 23:16

昔から売ってるたとえばA社のキットはmet(leu)抜きで
これは35S、3H、14Cなんかで抜いた全量を補完するわけだが、
PROTEIOSだったら20種全部入った混合液使って
オートラならラベル用のRIなんかは1/100量くらいで拮抗させても十分。
それくらいすごい。

374 ：心配性：03/10/23 15:41

同じ濃縮遠心器に（チューブは別々で）
最終精製酵素標品（銀染色で単一バンドを確認,bufferはTris）と他のサンプル（植物組織,bufferは水）を入れても
コンタミは起こらないのでしょうか？

375 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/23 18:11

内容が飛び散らない限り大丈夫だが
心配なら水と一緒に回しては？

376 ：心配性：03/10/23 19:11

>>375
ありがとうございます
早速廻してみます

377 ：359：03/10/23 20:02

やっぱり、精製しなきゃいけないサンプルの数が多いこと、活性が欲しいことを考えて、
タグを付けたいんですよ。精製が楽で、良い結果が得られて、できるだけ小さいタグって
何がありますでしょうか？オススメのタグは？

378 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/23 20:16

目的タンパク質のＮ末かＣ末がドメインの外にあるか内にあるかわかる？
一般的に入手できるようなありとあらゆるタグとインターバルの長さを検証した論文があったんだけど
今ラボじゃないから見つけたらまた教えるよ

379 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/23 20:19

俺個人の意見としては切り離しできるタグじゃなきゃ嫌だけど

380 ：359：03/10/23 20:25

目的のタンパクを適当に断片化させて発現させているんですよ。
ですから、立体的な構造とかはサッパリです。

381 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/23 20:36

pQE9,10,11のN末へのHisx6タグが最強>>359
XL1-Blueでコンストラクトを造って、そのままIPTGぶちこんで発現できる。

pET21a,b,c,dとかはXL1-Blueでこさえても、その後、BL21DE3に入れ直さないといけない。

382 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/23 23:31

>>381
個人的にはpET系の方が好きだな。
産物の毒性が高すぎてプラスミド自体が構築できないってこともないし。
Kmの方がAmよりきれいに選択できるし。ものぐさ者にも意外と便利。
ちなみにうちは28abcセットです。

>>359
とりあえずH6でやってみなはれ。。　だめだったらまた考える。

383 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/24 10:12

アフィニティーで流すのはいいが
バインディングしたものを洗い流すときに構造が変ってしまうのでは？
その有無をどうやって調べれがいいですか？

384 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/24 20:45

E. coliでタンパク質作ったら問題が多いなー嫌だなー
なんでこれにこだわる奴がいるんだろ

385 ：ＴＢ＄：03/10/27 06:33

PROTEIOSでタンパクの発現量が上がらない・・・
CBBでちょっとしか出てこない・・・
俺が実験下手なだけなんだろうか・・・?
もういやだ・・・だれか・・・助けてください・・・
誰かコツを！(泣)

386 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/27 09:30

CBBで見えるなら御の字だろ。収量はタンパクによる。

387 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/27 19:32

>>385
翻訳量はタンパク質の種類にもよるんだけど・・・
セットについてる小さな冊子のプロトコルに完全にしたがってやってる？
セットについてるポジコンと比べてどう？
あのポジコンはかなり翻訳効率が高いから選んであるんで
同等まで出なくてもしかたないけど。
重層法のときに境界が拡散すると、効率がかなり落ちるよ。
うちではあのポジコンより強く出るやつ（もちろんmRNA濃度はそろえて）が結構あるんだけど

388 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/27 19:43

今から4年前まではコムギの系使ってCBB染色で出るなんて考えられなかったなー
歩留まりが500-1000倍にアップするなんて…
ウチでは今度からPROTEIOSでスケールアップして作ったターゲットを生かしたまま精製・単離に入ります

389 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 19:03

プロテイオスって三菱がらみのラボ以外では売れていないって噂
本当ですか？

390 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 19:08

なんで三菱？
関係ないんだけど

391 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 19:16

>>390
販売は東洋紡
生産ラインは三菱の工場

392 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 19:22

三菱の工場ってどこよ？
自動車のライン？

393 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 19:24

そこまではシラン
でも化学じゃないのかな？

394 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 19:26

> 売れていないって噂

脳内のｳﾜｻかよ！

395 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 19:27

脳内の工場でな

396 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 20:35

>>395
プロテイオスの説明書に三菱化学が事業パートナーって書いてあった。

397 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 20:38

>>389=391=393はそれ見て言っただけ。

398 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 20:41

>>397
へぇ～
すご～い！

399 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 20:43

大腸菌でも酵母でも某単細胞緑藻の系でも発現がうまくいかなかったうちラボのタンパクなんだが
同じ生物学教室内の別のラボが買ったProteiosほんのちょっともらって試した(抽出物自体は5μl!)ら
なんとﾊﾞﾝﾊﾞﾝ翻訳してるじゃん！
ボスにねだったら「値段は？」
値段言ったら却下されたよ。ケチ親父

400 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 20:43

えらいね
事業パートナって意味わかったんだね

401 ：起原切れ助手：03/10/30 20:47

>>399
（プロテイオスの価格）／（タンパク合成量）
で計算したら、割高ではないです、と主張してみたら？
実際発明者の遠藤センセーもどっかのシンポでそう言ってたし。

402 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 20:51

うちラボのボスは大腸菌キチガイなんだよ。
おれが封入体にも入ってないことも確認したら
「その原因を探らないか？」
やりたくねーーーーーーーー

403 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 20:54

一般的な発現系としてはE. coliには見切りつけるべき。
時間と手間だけじゃなくてお金も消えてくよ。

404 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 20:56

おれが部屋ボスならとっくにやってるってば。
ホールバクテリアのブロッティングで陰なのに
封入体までやらされる、ええそんな部屋ですが何か？

405 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 21:04

ちゃうよ、製造は。
ライセンスを付与されたのがインビトロテック、という形式で
そこから供与されるという形で東洋紡が製造してる。
製造側から見た事業パートナというのは普通、営業のこと。

406 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 22:04

プロテイオスがそんなに万能なわけねえじゃねえか
プロテイオスでできるタンパクはたいていは大腸菌
でもできるよ。できないのは腕が悪いだけ。

407 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 23:43

腕が悪いだって　ﾌﾟｯ
ｻｲｴﾝﾃｨﾌｨｸじゃないやつ。

408 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 23:47

コムギ以外のはどう？

409 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/31 00:07

ものとりなんて職人芸よ　サイエンスがはじまるのは
そっから先の話。

410 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/31 07:35

腕がよくても
菌がどうしても作らないモノはとれん
園児でもわかるように書いてみました

411 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/01 09:22

「菌がどうしても作らないもの」なんてないよ。
それは遺伝子が間違っているときだけ。
・作ってから沈殿する
・作ってから菌が死ぬので量が増えない
・作ってるけど分解される
いずれもとる方法があるよ。
ボクちゃんにはむずかしいだろうね。

412 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/01 18:11

>>411
糖タンパク質とかも作ってもらえますか?

413 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/05 00:07

>>412
作ってもらえるかもしれないけど、糖以外の部分だけなんじゃないの？

414 ：にゃー：03/11/14 21:00

His-tag精製の際にureaを使う理由って、なんじゃらほ？

415 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/14 21:17

腕がよくても
菌がどうしても作らないモノはとれん
園児でもわかるように書いてみました

416 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/14 21:24

無理に大腸菌で何とかしようなんて、貧乏くせぇから嫌だ。

417 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/14 22:44

>>416
それなんだが、うちでは脳のある極微量タンパクをE. coliしかもキメラで作ろうとしてたんだが
ボスが切り離せないならキメラはまかりならんと言う上に、ボスに無断で菌に作らせてみたら
全然取れなかった。
そんなことは露知らずボスがこっちに無断でw) ProteiOS注文したんで使ってみた。
70kdくらいのタンパクなんだがCBBで区別できるほど取れた。
今はnative/pageとIPで分離してる。
ある条件で生体内で発現することはわかってたんだが
その条件下のマウスをギロチンで100匹潰してもモノにはお目にかかれなかったんで感動してる。

418 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/14 22:51

菌にしても翻訳後修飾は無理だから、修飾必須なら今回のProteiOSのでも同じはずだが、
今の段階の部分精製で生体アッセイでポジティブ出てるから
とりあえずツナギ目的で速報が書けそう。
ありがたい。

419 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/14 22:55

従来のコムギ系なら自作できるんだが
これは原著とパテント文書読む限り
特にパテントからすると材料にすごくシビアな選別が掛かってるからうちの施設では無理そう。
買ったほうが安い。ボスが変なこと言い出さなければよいが。

420 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/14 23:11

パテント文書ってどこで読めるんでしょうか。

421 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/14 23:13

cbbで見えるっつうことはmgｵｰﾀﾞｰで獲れそう？
精製系を確立してお金はかかるけど系を拡大したら結晶化→3D解析いけるんじゃない？
なんか夢が拡がるね
ああ俺のﾎﾞｽも「こんなの買ってみた」ってある日突然持ってこないかなあ。。
夢じゃなくて妄想が拡がる毎日だわ。
結局要らない苦労なんてしないほうがいいんだよね。
それだけ遅れるし小金も無駄になる。

422 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/14 23:13

>>414
使わんでもいいがや

423 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/14 23:16

>>420
東京特許許可局じゃなくて実在する特許庁

424 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/14 23:29

ウェブ経由で？

425 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/15 00:33

Yep.

426 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/15 08:45

>>421
コムギ胚生来のものを上回ってCBBで見えるくらいだから
合成系を拡大すれば当然mg単位で取れそうだ。
当然資金的なものが第一問題で従来のコムギ系なら数年前に実際作ったことあるんだが
材料選別に風選はともかく色彩判定まで使ってる上
これが翻訳効率で結構クリティカルなものでもあるらしいから
機材をラボに導入しても償却できない。
10月から残りの1000万のなかから使えるから教授がせこいこと言わない限り可能な方向。

427 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 00:13

やめときなはれ　スケールアップしたとたんにはまりまっせ

428 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 01:07

ダメージもスケールアップ

429 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 06:07

貧乏ラボの悪魔の声に惑わされるな。自分でよく考えて決めろ。

430 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 06:20

数百リットルの培養スケールで細胞を増やしてタンバク質精製していたが、規模が大きくなると不安定な酵素の取り扱いは格段に困難になる

431 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 07:34

今のPROTEIOS数十μlを数mlに増やしたところで問題はない

432 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 11:30

ゲノムしかできない上司は、タンパク質のことちーっとも解ってないのに
タンパクなんて簡単だろ。とか抜かす。

433 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 17:37

今から十二年ほど前はcDNAライブラリこさえて、釣って、丸一年かけて一本シーケンシングするのが流行ってた？からね。
そういう奴はタンパクをやってるところをバカにしてる風潮があった。
俺からしたらクローニングやシーケンシングなんて全然生物学やってる気がしなかったけど。
今でもタンパクの高純度精製系を一つ確立したら達成感あるよ。
今は無粋な精製方法があるけど。

434 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 17:45

あの当時はシーケンス・キチガイじみた時代で
雑誌でもシーケンスがデカデカと一ページをとって
それより何より、それがタンパク質になるのに
そういうのが頭から抜けてる奴がいた
そんなので研究者になって今助手あたりやってるのがいるから
からかってみると突っ込みどころ多数

435 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 18:05

そうだね、ローカス決めてORF推定して組織での発現パターンを出して、
いっちょあがり。

ヲレが「そのタンパク質を発現させて活性とか計ったり抗体造ってみないんですか？」とか
聞くと
「なんでそんなことしなきゃいけないの？相同性から何のタンパク質なのか自明でしょ（藁」

こんな感じだった。

436 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 19:45

>>433
＞十二年ほど前
異常に細かいな…
Ｃ＆Ｓが生物学じゃないのは同意するが、タンパク質の精製系の確立が生物学か？
>>435
「活性とか測ったり抗体造ってみる」ってのも、何も言ってないに等しい気がするのは歳のせいだろうか。

437 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 19:54

＞タンパク質の精製系の確立が生物学か？

そうとは言っていない。
相対した場合、生物実験としての面白みがあった。

438 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 20:12

>>436

ヲレは癌遺伝子の発見の重要性は、それまで生理的な変化とか訳の分からない染色体の転座欠失塩基置換だと思われていた脱制御された細胞増殖現象が

チロシンリン酸化とかGTP結合タンパク質とか転写因子とかいった具体的な生化学的特性と示す機能分子が引き起こしていることが判明した、

という風に解釈してんだけど、それでも「活性や抗体を造る、ってことは何も云っていない」の？

439 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 20:46

そうじゃなくて、活性「とか」測っ「たり」抗体「造ってみる」っていうんじゃなんだかなあ、って思っただけです。

440 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/17 21:48

>>438 「癌遺伝子の発見の重要性」ってセリフが主張をしっかり裏切って
ますが。揚げ足取りはともかくとして、癌遺伝子の産物がGTP結合タンパ
ク質や転写因子だったってのは、相同性で示唆されてそれがそのまんま確
認されたわけだから、あんまり良い例じゃないね。チロシンリン酸化はオ
ドロキ！だったみたいだけどね。

441 ：426：03/11/20 21:57

相当量アプライしても銀染で一本になるような精製系を確立。
思ったよりステップがかなーり少なくすんだ。
ステップが多いとスケールアップしたときに手間もお金も大変だから。
で、とうとうProteiOSを大人買いした。
とは言っても、まだ3D解析の共同研究は申し込んでいないから
とりあえず100倍スケールでモノを獲って生化学的分析に当てることになった。

442 ：356：03/11/22 03:47

その精製系、大まかでいいんで，どんな方法か教えてくれませんか?

443 ：426：03/11/22 10:37

あくまで、分画をアッセイできる方法があることが前提だが。
・硫安沈殿(ゴミ除去目的)
・疎水相互作用クロマト(濃縮/精製目的)
・イオン交換クロマト
・サイズ排除クロマト[ゲルろ過]
・遠心ろ過膜(濃縮/カットオフ目的)
・IEF
・Native/PAGE
精製系検証クロマトはすべて、分析クラスHPLC。
これで一本バンドに。
もっとも、二つの電気泳動はなくてもかなりキレイだから
純化標品の使途によっては必要ないようだ。

目的タンパク質の性状によってかなり後ろの段階まで多くゴミが付いてまわるケースも多いから
モノによって段階の増減は必至。

先週中に準備が完了したから、週明けから管に小分けして合成に入る。

444 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/22 20:05

>>433
無粋な精製方法・・・とは！？

445 ：His-tag厨：03/11/23 08:02

>>444
呼んだ？

446 ：His-tag厨：03/11/23 11:10

His-tag万能！最高！
キメラでも気にしない！

447 ：＞His-tag厨：03/11/23 12:08

くっつかないこともあるわ、洗いで落ちることもあるわ、大してきれいにならないこともあるわ、
とても万能と言えないと思うが。

こんなのが万能だと思ってるのは、10年ほど前の化石的なジェノミクス、もとい、シーケンス至上主義者だけと思われ。

448 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/23 15:44

His-tagは確かにきれいにならない場合もあるし、きれいに
するにはFPLCが必須かも。だけど、洩れの場合は培養条件
変えただけで、かなり精製度が上がった

449 ：His-tag厨：03/11/24 04:12

>>447
くっつかなければhisの数を増やすのみ。
最低でも前と後ろに6個ずつ入れろ。
His-tag厨はモノの機能や折畳みなど気にしてはならない。
ただ純粋にポリペプチドを精製するのみ。

450 ：450：03/11/24 06:42

はじめて450をゲット！
やったよ、忠男さん！

451 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/24 06:54

学生はしかたないとしても、助手なんかで
シークエンシング・キチガイ時代をすごして
タンパクの精製１つやってこなかったのは痛いな。
言ってることが明らかにおかしいのがいるし。
プライドが知ったかしか許さないから。

452 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/24 07:31

>>451
年代的には30代半ばから後半くらいの助手が多いね。
知らないくせにタンパク質の精製に口出してくる。
言うことがすべて的外れ。
やつら、タンパク質が簡単なことだと思ってるから。
マニュアルシーケンスなんて、同じことの繰り返しにしかも時間がかかっただけで
苦労でもなんでもないのにね。
あんなのを「若いころは苦労したな」とか言っちゃってる。

453 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/24 10:06

Tandem Affinity Purificationというのはどういう精製法でしょうか。
何か新しい点があるのですか。

454 ：起原切れ助手：03/11/24 12:33

>453
アフィニティタグが複数ついていて連続して精製ができる。
その結果、精製度がかなり上がる、という方法。
Nature Biotech.に原著論文があったはず。
調べましょう。

455 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/24 15:16

>454
Thank you!
でもなんだか高そう。まだ手軽に出来る方法じゃなさそうですね。

456 ：起原切れ助手：03/11/24 15:50

>455
どうだろう？
オリジナルの論文では目的のタンパクとカルモジュリン結合ペプチド(CBP)ともうひとつ、これは抗体で精製できるタグだったかを連結していたと思う。

簡単な例ではGSTとHistagを目的のタンパクに融合させておいて、２種類の樹脂を使って精製して最後にGSTと目的のタンパクの間をトロンビンで切断するとか、すればTAP法と同じことなんじゃないかな？

457 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/24 23:42

ベクターは作ろうと思えば作れるけどなあ
カラムをタンデムに並べてラクチン粗精製ってのがウリなのかな

精製度を追求する必要のある実験なら
後で別のカラムにかけなきゃな

458 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/25 09:32

>>452 あんたあちこちの板に同じこと書き散らしてるね。よっぽど悔しかったんだろうね。

459 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/25 09:39

TAPいいですよ。うちは手抜きでtransientでやったんですけど、至適化も何もなしでいきなり銀染でワンバンド！でした。複合体を精製したかったのでワンバンドじゃ困るんですけどね。今はstable line取って再挑戦中。

460 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/25 13:33

N末にGST、C末にHisx6でやってる。問題ない。

461 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/25 17:35

>>458
悔しいって何が？それに先の内容はここにしか書いた覚えないが。
むしろお前が悔しがってんじゃないの？
ラボでも周囲から無能呼ばわりされてて
ここでも図星だったから怒ったの？

462 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/25 18:11

ﾀｸﾞ厨とかｼｰｹﾝｽ至上主義者とか無能助手とか
自覚しているか自分が周りから陰口されてない限り
>>458のように反応することはありえないと思われ

463 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/25 22:52

無能助手は他スレでも演説ぶって荒らすから困り者。

464 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/25 23:07

たんぱく質並びに核酸の代謝と役割って何？

465 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/25 23:08

タンパク質の精製スレにつき、スレ違い>464

466 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/25 23:15

originalのＴＡＰはCaM-binding peptide-TEV protease site-protein
Aという配列で、protein AをIgG beadsで吸着→TEV proteaseで消化
→CaM beadsで吸着→EDTAでeluteです。ﾀｸﾞ厨ではありますが、収率と
精製度の両者をソコソコ満足させてくれます。予備実験無しでとりあえ
ずできるのが魅力です。ﾀｸﾞ無しにこだわってる方は、じっくりやって
ください、邪魔しませんから。その間にボクらはこれで論文書きます。
助手以上のジョブ取んなくちゃいけませんので。

467 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/28 00:17

情報THXです
まあまあ喧嘩腰にならなくとも。Tagや変性がほとんど禁忌に近い実験法もあるわけだし

CaM-Sepharoseかぁ。使ったことないけどやたら強そうだなCaM。

468 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/28 22:36

タグ厨　vs　カラムおた　vs 無細胞教信者
の三つ巴の戦いはほのぼのしていていいなあ　またーりまたーり

469 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/29 13:47

ヒト由来の遺伝子なのでうちのボスがウサギ網状赤血球や昆虫系にこだわってたんですが、
なかなかうまく発現できず（全メチオニン、全ロイシンをホットで置き換え）、
PROTEIOSで拍子抜けするほどうまくいきました。コールドアミノ酸は20種混合で、
ホットメチオニンはコールドの100分の1量しか入れてません。
ただ、翻訳後修飾があるかもしれないタンパク質なので、活性があるかはまだ確認してません。

470 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/29 15:26

469
どっかのベンチャーの方ですか？
プロテイオス最近売れてないらしいデスが、そんなによろしいですか？

471 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/29 20:13

生物学科の別の部屋で植物の微量酵素をやってるところがあるんですが、
そこが以前から小麦胚芽の従来系を使ってて、大量翻訳の記事見かけてから
部屋で同じもの作ること検討したんですが、結局難しく断念して購入。
それで大量発現に成功して、また別の部屋でマウスのタンパク質やってる部屋が
それを知って購入。このときうちのボスは「動物のタンパク質を小麦でかよ！」
とあきれていたんですが、その部屋でも大量翻訳に成功してからどうやら考えが変わったようですね。
今では「小麦、いいねぇ」とか言ってますが、ごらんの変節漢なので、
またいつ態度が豹変するか不明です。

472 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/29 22:27

なんでベンチャだと思ったんですか？
471で書いたとおり大学ですが。
470では憶測も載せてますが、何か意図があるんですか？

473 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/29 22:47

>>472
仮に同様に無細胞合成キットを（別処方・別特許で）最近販売し出したところがあるとしよう。
また実際は、PROTEIOSが売れていてその競合品のほうが売れてないとしよう。
さらに仮にまた、その会社にとってはそれが主力商品にしたいもののひとつなら、PROTEIOSは目の上のコブどころか抹殺したいくらいだろう。
またさらに、この場はだれがただの一研究者の振りをしてもだれもその正体はわからない。
もっとも、「PROTEIOSが売れていないとは憶測ではなく出入りの業者から聞いた」とか何とでも言えるだろう。

474 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/29 23:38

>472
実際Proteiosは東洋紡が自社の工場内で生産してるのに
他社ﾗｲﾝに委託してるとｳｿ書いてた奴がいるから
信用しないほうがいいよ
売れてちゃﾏｽﾞい人間がいるんじゃないかな

475 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/30 01:24

俺のところはそのへんの植物がターゲット材料だから
目的タンパク質自体は大量に取れなくもないし実際に取ってるが、
生合成の研究しているために、前駆体が必要。
大腸菌はそれなりに作ってはいるんだろうが、
分解が早い・速いのかそのあとの実験に耐えられるだけの質と量が取れなかった。
そこで PROTEIOS 使ってる。
ラベリングなしでもある程度の量が手に入るから重宝しているよ。

476 ：起原切れ助手：03/12/01 10:03

なんと言うか、＞469の書き込みが話の流れからして不自然で、
何か宣伝をしたいんじゃないかって思えるよね。
それに対する>470も変だけど。

プロテイオスは確かに今までの無細胞系に比べれば全然発現多い。
透析しながらやるとさらに合成量アップ。
あとは、フォールディング、SS結合、修飾など、
その辺のところの情報はどうなのでしょうか？

477 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/01 17:36

>>476
変じゃないだろ？以前にも出てるし、話の流れって･･･
お前がその時点で心に描いてるひとつの流れじゃないと駄目なのか？

478 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/01 19:00

ここは「タンパク質の精製スレ」だから別に新規にネタ振ってもよいわけで。
期限付きの自称助手に言われて反論するのも大人気ない。

479 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/01 21:32

>プロテイオスは確かに今までの無細胞系に比べれば全然発現多い

1,000倍とかだから比べる余地もないと思うけどね。
しかしあれだ。糖鎖修飾って生物種特異性・タンパク種特異性が高すぎて
無細胞系でも原核細菌系でも真核細菌系でもうまくいかん。
これだけはオリジナル種以外では無理かもわからんね。

480 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/01 21:34

うまく行かんと言うのはたとえくっついても違うのがくっつくし。

481 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/03 02:37

大腸菌から離れてバキュロウィルスを使うことになったんだけどどうなの？
利点とか欠点とか教えて。

482 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/03 08:29

利点：
大腸菌で無理な蛋白質でもおおむね活性型がとれる
糖などの翻訳後修飾OK
糖は短いものしか付加されない

欠点：
ウイルスベクターの作成は、大腸菌、酵母よりもさらに面倒
ウイルスのタイター、感染時のタイミングなどにより発現量
大きく変動、コントロールにはかなりの習熟が必要
培地は高価
血清の取り扱いに注意

がんがれ

483 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/03 09:36

バキュロは哺乳類培養細胞なんかにもバリバリ入るから取扱には気をつけてね。もちろん哺乳類細胞内では複製はしないだろうけど、入れた遺伝子はtransientには発現するだろ。

484 ：学生さんはお金がない：03/12/04 23:10

大学のレポートでタンパク質のホールディング反応について説明せよ、というのが
出たのですが、ホールディング反応とはなんなんでしょうか？
授業では触れてないので全くわかりません。
よろしかったら参考になりそうなサイトのURLなども教えてください。

485 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/04 23:19

フォールディング（折りたたみ）ではなくホールディング（抱き込み）なのか？
何のホールディング？金属イオン？

486 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/04 23:19

どっちにしろ、なぜこのスレに書くんだよ。

487 ：学生さんはお金がない：03/12/04 23:20

え。。。フォールディングなんですか？
先生が口頭で言っただけなんで聞き取り間違えかもしれないです(；´д⊂)

488 ：学生さんはお金がない：03/12/04 23:21

>>486
え・・・タンパク質のスレだからフォールディングして精製するのかなぁ、と・・・
もしかしてスレ違い系ですかね・・

489 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/04 23:24

検索サイトで「タンパク質フォールディング」もしくは英語なら
"proteins folding"でいっぱい引っ掛かるぞな

490 ：学生さんはお金がない：03/12/04 23:27

>>489
ありがとうございます！
早速レポートに取り掛かりますｗ

491 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/04 23:29

上のは論理積検索な
フレーズ検索なら「タンパク質フォールディング」または「タンパク質のフォールディング」
英語のフレーズ検索なら"protein folding"

492 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/04 23:38

>>490
もしかして灯台？

493 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/04 23:40

東大なら化学生命学科へ行きたい

494 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/04 23:41

東京大学生がこんなところであんな質問するわけないと思いたい。

495 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/04 23:42

>>490のレポートって
ttp://www.phys.s.u-tokyo.ac.jp/stud/download/16seibutubuturirepo.pdf
の気がする

496 ：学生さんはお金がない：03/12/04 23:45

中堅私大の薬学部ですよ・・・

497 ：481：03/12/05 01:42

結局、バキュロウィルス自体は使うのをやめて、昆虫細胞に直で発現させることに。
InsectSelect BSD Kitを買うことになったよ。

498 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/05 01:43

sage

499 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/05 05:36

age

500 ：500：03/12/05 05:36

折
り
返
し
地
点

501 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/06 21:07

>>495
おまいこそ灯台だろ

502 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/09 22:52

ピチア酵母って、どうよ？

503 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/10 10:13

>483
哺乳類の培養細胞にバキュロのDNAが入るとは知らなかった!
どのような実験により、入ることが確認されたのでしょうか
教えてください。

504 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/16 02:45

ヘタに煮るとあぶくが出てきて大変だぞ
そりゃあもう、石鹸入れたみたいに
ブクブクと。
そんなときにはな､ちょこっとだけ
酒を入れるんだ。
どうだ？わかったか？

505 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/19 17:25

バッチ法でアフィニティー精製（GST, His...）をやってるのですが、
透析をO/Nでやるとものによっては大量にアグってしまいます。
手持ちのプロトコールでは1時間1時間O/Nでbufferを2回変える様になっています。
O/Nの部分を減らしたらアグる量が減るような気がしますが、
最短でどれぐらい必要でしょうか？ご存知の方がいらっしゃったら教えてください。
自分で調べた限りではO/Nとしか記載されていないのです。

506 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/19 17:55

透析液の塩強度を下げる、上げる、pHを高めにする、グリセロールか
エチレングリコールを入れる、界面活性剤NP40などを0.1％入れておく、

そのへんでどうよ？

507 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/19 18:05

透析後の酵素消化のあとのタグ除去でアフィニティーを使わない
(ゲルろ過とかイオン交換とかで済ます)のなら、
消化のためのバッファ交換だけが目的になって GSHやらNi を完璧に除去する必要がないので
1h + 3hぐらいで試してみるけどなあ。

だめなら薄めて透析するとか(ただし、お値段のする酵素の量が増える)

てゆかサンプルのせいじゃなくてタグのせいで起こるアグりもあるからな
(pPROEX-HTは比較的アグりやすいと言われるし実際そうだから自分は避けてる)

508 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/19 18:23

前レス見てなかった。
pHと塩濃度と消化時間を振って酵素消化条件を小スケールで確かめてから
透析外液決めるのはよくやりますわ。

509 ：505：03/12/19 22:19

レスありがとうございます。
Tagは切り離さないので、単なるbuffer交換です（グルタチオンやらNiやらを除く）。

レス見てなかったので、
透析をPBS1hr、PBS+DTT1hr、PBS+DTT5hrでとりあえずやってみました。
心なしかアグる量が減ったような気がします。

> 透析液の塩強度を下げる、上げる、pHを高めにする、グリセロールか
> エチレングリコールを入れる、界面活性剤NP40などを0.1％入れておく、

このあたりのって教科書類に載ってますか？勉強したいので、出典があったら
よろしくお願いします。

> (pPROEX-HTは比較的アグりやすいと言われるし実際そうだから自分は避けてる)

今回はまさにこれでした…。

510 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/19 22:32

>>509
透析はだいたい低分子量なら1-2時間で平衡に達するよ。
だからO/Nなんか意味ないよ。
それよりも1-2時間でbuffer交換をして、それで２－３回やった方がいい。内液と外液は
100倍あれば十分。まあ２回の透析で十分だね。全部で３－４時間か。

それとアグる条件はそのタンパクによって異なるから、塩濃度が高い方がいいのか低い方が
いいのか、pHは高い方がいいのか低い方がいいのか、ものによって異なるから、
いろいろ試してみてください。

DTTは還元剤で入れてるのでしょ？それなら常時入れてる方がいいと思うけど。
どうして最初のPBSでDTT抜きなのか理解できない。それと上記の理由で最後の５時間って
意味ないと思いますよ。

511 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/19 22:39

ラミニンなど凝集しやすいものはタンパク質濃度を高くしすぎると沈澱するので
0.1mg/ml以下になるよう容積に注意するとか。

512 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/20 00:42

DTTがdetergent的に働いてアグり解消に効く場合もあると
誰かに聞いて透析の途中に入れてみたってとこでしょうか。

>このあたりのって教科書類に載ってますか？
メーカーのトラブルシューティング用ハンドブックあたりに
少し記載があったっけ？GST handbookとか。いま手元にないので。

pH、塩濃度、タンパク濃度etc.は次の実験手順と相談しながら
一度にガッと並べて条件を決める。場所をとるのが難点だけど。
pHは等電点が関係してくるので頭の片隅に。

513 ：あぼーん：あぼーん

あぼーん

514 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/07 23:53

タンパク精製うまくいかない・・発現量が少なくて・・なんでやろ？？
GSTもHis6もFLAGもだめぽ。。少しずつコンストラクト変えてるのに。。
動いてる系も動かなくなってしまった。
やっぱタンパクによって条件とか全然違うんだね。
細胞が専門だけど、生化学の系でもみてみたくてやってるんだけど、
悪戦苦闘中。。
IPTGの濃度とか、インダクションの条件変えようかなぁ？
インクルージョンだったらちょっと面倒でつ（；；）

515 ：514：04/01/16 23:26

プライマー変えてコンストラクト作り直したら上手く可溶性に上がってきました。
良かった（＾＾）v

516 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/17 00:00

>>515
どこをどんな風に変えたの？
それが後人の役に立つ。質問に答えてくれた人へのお礼にもなるよ。

517 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/17 00:01

>>516
あ、ごめん、質問に答えた人はいなかったね。

518 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/17 10:24

2chはそういうとろこじゃないから、これで終了ってことで。

519 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/17 22:18

話は変わって、どなたかAKTAシステムの中で一番お値段お手ごろなPrimeというシステムを使ったことのあるかたいませんか？評判はどうなんでしょう？

520 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/17 22:25

http://jbbs.shitaraba.com/travel/1723/

521 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/17 23:37

>>519
なんに使おうと思っているかを書かないと、答えにくいかもな。
いや、俺は使ったことは無いが。

522 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/18 00:50

使ってます。
使い勝手はまあまあですね。バイオラドの同等
品よりいいんじゃないかな？

デフォルトの設定では、フロウレストリクタが糞なので、
バックプレッシャが高くなりすぎるので、うちでは
はずして使ってます。
あと、付属のレコーダも使いにくいので、日本製の別の
レコーダにしたほうがよいです。
ゲルろ過、ステップ溶出、グラジエントどれも快適に
使えますが、UV検出の感度を変えるのは、メニュー
を深くおりていかなければならないので、めんどくさ
いです。

523 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/18 01:40

>518
それを聞いとけば、おまえの人生変わったかもしれんぞ。
研究とはそういうもんだろ。

524 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/19 02:09

未だにアマシャムをアプライドバイオシステムのままだと思ってしまふ
いや、略語もABで一緒やし。

525 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 13:52

かなりアバウトな事してます。
あるフュージョン蛋白精製するのに、sdpageでバンドきりだし、水加えて
振り上澄み回収してます。これで取れますか？

526 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 14:09

>>525

electroelutionしる。

527 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 15:37

>>526
本当に申し訳ないです。何か参考になるものありませんか？
どうすればよいのかすら見当がつきません、、、、、

528 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 23:17

大腸菌の発現ベクターにクローニングして、精製するのが簡単。時に数mgとれるよ。
Fusionなら例えばGSTなら可溶性になる可能性が高いし、アフィニティーで楽に
とれるよ。ビーズからの溶出は還元型グルタチオンで。
オリゴ作ってやった方がいいよ。
今後にもかかわるしね。
でも研究室のやり方にもよるから、なんとも言えないけど。
うちのラボは大腸菌主流だな。
ってたいてい精製はそうだろうけど。

529 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/20 23:34

pETとかpQEでHisタグも悪く無いね。

530 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/21 10:16

>>528,529
レスありがとうございます！

>Fusionなら例えばGSTなら可溶性になる可能性が高いし、アフィニティーで楽に
とれるよ。ビーズからの溶出は還元型グルタチオンで。

これでしたいのですけど、プロフの方針で使えません。最終的に数十ミリg
取らないといけないのですが、途方に暮れそうです。研究費が無いのです。
4月から数十万しか使ってないと言えば、どのくらいの環境か分かると思いますが、、、。
はずかしい、、、。

531 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/21 11:10

pGEXをもつ大腸菌BL21を1リットルTB培地でIPTG誘導すれば100mgはGSTがとれるぞ。融合タンパク質でも数分の一はでる

532 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/21 11:50

>>531
やっぱり、例のカラムを使ってですよね？
ゲルカットアウトで、sH2O入れてでフルって言うのって、本当に蛋白溶出して
くるんだろうか？ほとんど取れません。600ml培地分の菌量でも。

しょうも無い悩みなのは分かっているのだけど、、、、。
誰かこの手法でとったヒトいませんか？

533 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/21 15:00

切り取ったゲルを透析チューブに入れて、125mM Tris-Cl pH6.8, 2% SDSを入れる。ミューピッドにSDS-PAGE泳動バッファーを入れて透析チューブを横たえて100V、2時間、ときどきチューブの向きを変える。

これで出てくる。

534 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/21 15:46

カラムでなくてバッチ処理しろ。

535 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/21 15:59

>>533
ありがとうございました。
で、質問なのですが、SDSは入れないとダメですか？
それか、SDSおおせのように入れ、あとでエタノールで蛋白落とせば良いですか？

536 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/21 16:43

電気溶出後、透析チューブからゲルをつまみ出して、再び封じて
一晩、１xTBSに透析してからアセトン沈澱すれば？

537 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 01:59

>>530
ともかくそんなほうほうでは数十ｍｇなんか絶対にタン
パクはとれないぞ！！
それくらいだったら、金のかからないタンパク精製法を
ともかくためせ！
（１）硫安沈殿
（２）等電点沈殿
（３）カルシウムホスフェートゲルによる沈殿と再溶解
（４）バルクのイオン交換樹脂
（５）ゲルろ過樹脂は生化学工業のセルロファインが安いぞ
（６）アガロースでの分取用等電点電気泳動を自分で組む

538 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 02:06

>>530
間違ってもsmartシステムなんて使うなよ！

539 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 10:28

多くの方に色々教えていただき本当にありがとうございます。

何の為に使う物なのかを書きます。
ある蛋白に特異的に反応する抗体を作る為です。その為に、
GST-fusion vec.を作成しfusion-proteinを取ると言うのが目的です。
プロフは以前それでとっていたと言っています。その為に、一番最適
な、安く調製する方法は何になるのでしょうか？当方、蛋白精製は素
人以下です。何回も聞いて、しかもゼロから何でも聞こうとする姿勢
は失礼だとは思いますが、途方に暮れての書き込みですので、、、、

540 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 12:07

グルタチオンビーズをまず買え

541 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 12:14

>>540
レスありがとうございます！御指摘の点ですが、プロフの方針で
不可能です。何を馬鹿げた事を！と思われるかも知れませんが、、、、

542 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 13:11

近所のラボから200-300ulぐらいグルタチオンビーズを貰え。

何回でも再生して使える。

543 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/22 22:08

>>539
抗体作成に数十グラムも必要なのか？
2ミリグラム程度でいいと思うが。

1. GST-fusionタンパクをSDS-PAGEで流して、
バンドを切り出し、>>533の方法でeluteする。
2. 溶出液をアセトン沈殿。ある程度のSDSはアセトン沈殿で取り除ける。
3. 再びSDS-PAGEで精製度のチェック。(場合によっては1へ)

この繰り返しでウサギに注射して抗体を作ったことがある。
回収率は高いが、多量のタンパクが必要ならば数をこなす必要がある。

ちなみにこれで作った抗体は結構ノンスペのバンドあり。
抗体も精製して使えるようにしました。

544 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/23 03:53

ＳＤＳ変性することにより免沈可能な抗体生成は激減。精製したとしても。
ウェスタンのみの目的ならいいが、お勧めできない。

545 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/23 09:27

>>543
的確なレス、感謝します！
10ミリグラムを目標としています。
教えていただいた手順がよさそうですので、それを実行してみます。

543さんと同じようにウサギに作らせるつもりですが、その後の精製は
考えていません。と言うか、つかえ無さそうなら、精製するしか無いと言うのが
本当の所ですが、、、。
本当にありがとうございました！！

>>544
おっしゃられている事は、そうかも知れませんね。
利用目的は、ウエスタンもしくはIF。免沈は今の所考えていませんが、
私が今後進めて行く過程で考えている実験では免沈も視野に入れています。
免沈やめてpull downでもいいかも知れませんが、、、、。
ありがとうございました！

何かお気付きのことがあれば、また教えて下さい。

546 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/23 10:42

グルタチオンビーズは使えない、用途は抗体作成だったら
Hisタグの方がいいんじゃないか？
pETとBL21の組み合わせなら、全タンパク合成の50%ぐらいは
作ってくれるぞ。
もし封入体に入ったらかえってラッキーだ。
大体、グルタチオンビーズも買えないのに酵素はどうするんだ？

547 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/23 12:03

>>546
＞グルタチオンビーズも買えないのに酵素はどうするんだ？
切る酵素は買いません。そのまま（fusionさせたまま）ウサギに接種
しますので、問題はありません。確かに、他の物でも言い訳ですが、、。

ちなみに、GST以外でも作成進行中です。血清のチェックの為です。

548 ：543：04/01/23 21:45

>>545

本当にこのやり方でやるの？あまり勧めないよ。
2グラム回収するのに結構な数の泳動やったし。

もし可能であれば、SDS-PAGEの前に硫安沈殿とか入れたら？
かなり簡単にバックグラウンドを減らせるし。
ただ、GST抗体でチェックした方が(・∀・)ｲｲけどね。

ゲルから切り出した状態でウサギに直接免疫した人もいたが、
その時は別に問題なかった。

でもよ、他のラボから少しくらいビーズは貰えないの？
絶対それが一番(・∀・)ｲｲんだけど。

549 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 01:17

良スレアゲ

550 ：528：04/01/24 01:42

＞530
GSTの王道っていうか、アフィニティーは一番いいんだけどなぁ。
簡単だし。
俺今日もそれでdeletion mutantのタンパクとったよ。WTはもちろんだけど。
おおむね、15時間で透析までもっていける。外液はTNCバッファーで。

明日、cleavage site決めます。もちろんsequenceは必須だけど。
プレリミナリーなら使えるかな。
4Bはびっくりするほど高くないよ。
可溶性にあがる確率が高いならホント今後いろいろ使えるよ。
交渉してみ。
一般論としてあるし、論文もあるよ。
ペーパーみせてみて納得させるのはどうかな？

551 ：528：04/01/24 01:51

っていうかこんな時間にレスすいません。
読めないよねぇ。
悩みはみんなあると思うんですけど。
機会がったらみてくれると嬉しいです。
でもこういうスレはいいなって思います。

552 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 02:01

ＧＳＴフュージョンで免疫後、ＭＢＰやＨｉｓ等違うタグのフュージョン
カラムで精製し、大容量ＧＳＴカラムに通す。他の組み合わせも可。
これ最強最速。

553 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 13:26

>>548
＞本当にこのやり方でやるの？あまり勧めないよ。
2グラム回収するのに結構な数の泳動やったし。
今後２週間はこればかりです。プロフは時間より安価が重要の様です。

＞SDS-PAGEの前に硫安沈殿とか入れたら？
＞かなり簡単にバックグラウンドを減らせるし。
培養条件的検討して、ほぼメインでバンドが見えますので、そのままでいこ
うと思っています。ちょっと位、純度が落ちてもいいかな、、、、、、、

＞ゲルから切り出した状態でウサギに直接免疫した人もいたが、
＞その時は別に問題なかった。
そうみたいですね。ただし、きちんと抗体ができてくれればいいんですけど。
免疫抗原としては、イマイチ弱いんですよね。賭けです。

＞でもよ、他のラボから少しくらいビーズは貰えないの？
＞絶対それが一番(・∀・)ｲｲんだけど。
確かに、おしゃられている通りです。当学部で、持ち合わせている可能性は
なく、他学部に行かないと苦しいです。

554 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 13:26

>>530
＞俺今日もそれでdeletion mutantのタンパクとったよ。WTはもちろんだ
＞けど。おおむね、15時間で透析までもっていける。外液はTNCバッファ＞ーで。
私も頑張ります。結構にたような事されてる方がいるんですね。驚きます。

＞一般論としてあるし、論文もあるよ。
＞ペーパーみせてみて納得させるのはどうかな？
そういう処方がるのは、知っています。ぺーぱーがあることも100も承知で
す。その上での指事ですから、今更って感じですし、期限が悪くなりますの
で（w

>>552
＞ＧＳＴフュージョンで・・・・・・これ最強最速。
コメント難しいです、、、、。

555 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 13:31

だったら、GST融合タンパクがハイドロキシアパタイトに
わりとつよく結合することを利用して、もっとも安価なグレードの
ハイドロキシアパタイトか、場合によっては試薬屋に眠っている
試供品を利用してわけるのはどうか？

556 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 14:59

>>555
＞GST融合タンパクがハイドロキシアパタイトに
わりとつよく結合する
そうなんですか！？勉強になりました。

＞試供品を利用
これがいいですね～、、、。あるかな～

557 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/27 02:44

封入体からの巻き戻しでシクロデキストリンとかアルギニンとかはどうですか？

558 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/27 11:32

GTP結合タンパク質の場合、封入体を６Mグアニジン塩酸で可溶化したのち、1uM GDP, 5mM MgCl2, 1xTBS, 50%グリセリンで一晩透析する。

変性したのち、基質存在下で透析すると巻き戻り効率が良いらしい。

559 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/27 18:13

50%グリセリンって粘性高そう。

560 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/28 03:20

pGEX4TにGST結合タンパクをぶりぶり作らせることは出来たんだけど封入体になった。
とりあえずGSTrap FFにかけるために可溶化させたいんだけど、組み換えタンパク精製ハンドブックに
のっていた「３ＭぐらいまでのUrea又はグアニジン塩酸」じゃ可溶化しなかったんだよね。
とりあえずどうしたら可溶化して精製出来るんでしょうか？
目的は抗体を作るためで最終目標は数㎎。
IPTGの誘導をしなかったり、誘導濃度を下げてみたり、培養温度を下げてみたけどやっぱり封入体。

561 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/28 04:58

>>560
君も一緒に巻き戻しの泥沼にはまろう。

562 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/28 17:21

>>560
昔、GST融合が封入体になった時に、8MUreaに溶かした後、
Ureaを含まないバッファーで希釈して、一気に終濃度を2Mまで
落としたら、析出してこなかったので、カラム精製できた。
ただ、結合力が落ちるのでロスる覚悟で行うべし。

563 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/28 18:30

>>560
モルクロにはサルコシルで可溶化しろと書いてあるけど、
やってみたら結合力ゼロになったよ。

564 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/28 22:05

>>563
Triton入れた？

565 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/28 23:29

SDSによりタンパク質の変性が起きても、SDSの重量の６倍以上のTritonX100を溶液に添加するとSDSがTritonミセルに取り込まれて、変性作用が消失する。

566 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/29 12:20

生物の細胞内でエネルギー源となるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を、
タンパク質でできた細胞内の微細な「分子モーター」を人工的に回転
させて合成することに、浜松ホトニクス筑波研究所の伊藤博康研究
員らが成功、２９日付の英科学誌ネイチャーに発表した。
　
ＡＴＰが分子モーターの回転によって合成されることは間接的な証拠
から分かっていたが、人工的にモーターを回して確認したのは初めて。
生命の基本的なエネルギー源の合成を、人間の力で再現したことになる。
　
今後、ナノサイズの分子機械づくりなどで、エネルギー供給システムの
開発につながる成果だ。

http://headlines.yahoo.co.jp/hl?a=20040129-00000015-kyodo-soci

567 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/29 12:25

>566
日本語がおかしいよ。

568 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/29 12:29

タンパク質でできた細胞内の微細な「分子モーター」を人工的に回転
させることで、生物の細胞内でエネルギー源となるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を合成することに、浜松ホトニクス筑波研究所の伊藤博康研究員らが成功、２９日付の英科学誌ネイチャーに発表した。

の方がわかりやすい。

569 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/01 20:58

良スレage

570 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/02 15:36

βAPPを精製しまつ。

571 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/03 12:19

以前IgGアガロースでproteinA　tagの精製
を教えていただいたものです。その節はありがとうございました。
今回教えていただきたいのは、プロテインAとIgG結合が高pH(9ぐらい）
でもうまくいくかなということです。高pHのサンプル流したら
回収率ががくっと落ちゃって

572 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/04 10:41

> 571
あ　た　り　ま　え　じ　ゃ　ん

573 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/04 21:28

>>571
やっぱりそうなんですか・・
　精製後に気づきまして・・
　ｐHと結合力の関係が分かりそうな
　論文などありましたらお教え願えませんか？
　教えて君ですいません

574 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/06 20:54

酵素精製に使うカラムは何回まで洗浄→再生できますか？
生体材料をTrisで潰して硫安沈殿したものに硫安を加えて
疎水性カラム＜Butyl-Toyopearl＞に吸着させた後に硫安濃度を落として溶出しているのですが
同じカラムを繰り返しEtOH/１回蒸留水/NaOH/１回蒸留水で洗浄再生しながら使うと
粗酵素液と硫安沈殿液の活性は変わらないのに
カラムを通したあとの活性だけがどんどん落ちてくるのです・・・

６回まで使用したカラムを廃棄するようにしているラボもあると聞いて驚きました
そんなものなのでしょうか？

575 ：Toyopearl王ラボ：04/02/06 21:44

水酸化ナトリウムで洗うから長持ちしないんだよ

576 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 16:15

DEAE-Toyopearlのようなイオン交換カラムだと
NaOH/H20x2/NaCl/H2Ox2で洗浄するわけだが・・・
Butylだとそうもいかないのだろうか

577 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 16:55

いや、セファロースとかが強アルカリに弱いのかもしらん。
あとPhenyl セファロースに脂質がこびり着くのかも。
SDSで洗えばどうよ？

ヲレはDEAE-Toyopearl 650MをNaOHやMethanolで何回洗っても大丈夫だった。

578 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 16:58

タンパク質精製のとき、バッファーでメルカプトエタノールを使ったりしますが、
これってS-S結合は切れたりしないんですか？

579 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 16:59

回収量が落ちてるのか？
それとも比活性が落ちてるのか？
NaOHの残りでタンパクが失活してることはないか？

580 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 16:59

s-s切るためにつかんじゃないのか？

581 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 17:11

S-S切ったら失活するでしょ？
ある本では酸化されるのを防ぎ、失活するのを防ぐとか書いてあるけど

582 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 17:12

βメルカプトエタノールの還元力はそれほど強くないので
過熱しないとSーS結合は完全にはきれないのぢゃないか？

緩衝液中のβメルカプトエタノールは還元型-SH基を空気酸化させないために入れておく。常温や４度で積極的にS-S結合を切りたいのなら
DTTが吉。

583 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 17:20

>581, >582
濃度にも寄ると思うのですが、
s-sが切れるβ-メルカプトとDTTのそれぞれの濃度を
教えていただければ幸いです。
β-メルカプトの方が高いとは思いますが。

584 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 18:09

値段はDTTの方が高いが1mMぐらいで効く。
βメルカプトエタノールは0.1～2.0％ぐらい入れることもある。

585 ：578：04/02/07 20:25

大腸菌からタンパク質を発現させて、精製するとき、
バッファーにβメルカプトエタノールを使ってるんだけど
本には変性させないために加えると書いてあるが、
メルカプトエタノールはS-S結合を切るから変性するんじゃないのかな？
このへんがよくわからんのだよ

586 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 21:16

細胞内は通常還元状態なんで-SH基は還元状態なので切れている。

細胞外分泌タンパク質は-S-S-結合を持つ者があるが、
大腸菌内で発現されたタンパク質では-S-S-結合は生成しない。

587 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 21:27

>>585
濃度にも依るんですよ。
濃いともちろんS-S結合は切るけど、程よい濃度だと
意味の無いシステイン同士のS-S結合を防げる。
全てのシステインがS-S結合してるわけじゃないですよ。
そい言う意味で、buffeにメルカプとエタノールをくわえる意味がある。
ちなみにメルカプとの方が安い。
それとDTT1mMってのはs-s結合切るには弱すぎる。10mMでも弱いんじゃないか？
それから、メルカプとエタノールは原液は約14Mだからモルで濃度を表示して欲しいね。

588 ：578：04/02/07 21:29

そうなのか。
知らなかった。
ありがとう

589 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/08 15:50

俺は全てのS-S切りたくて、βメルカプトの場合は14mM, DTTの場合は1mMで使っていた。
これじゃあ、S-Sを全て切るのには足りないでしょうか？
詳しい方、教えて下さい。

590 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/08 15:54

１０倍にしる！＞589

591 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/08 15:57

>>579
蛋白量はほぼ変わらず比活性が激しく落ちる
NaOH→蒸留水で洗浄再生後のカラム内pH6前後

・・・という状況です。

592 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/08 20:00

NaOHで洗うからだよ。
サイエンスにおけるものに限らず、あらゆる行動の一つひとつのステップについて、その意味を考えておこなうか否か決定すべき。

593 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/09 20:30

タンパク質の複合体をureaを混ぜて分離させてるのですが、
これは一体どういうメカニズムで分離されるんですか？

594 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/09 20:49

インテグリンの大まかな精製法おしえてください

595 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/09 23:09

>>593
http://www.chemistryquestion.jp/situmon/shitumon_senmon_kagaku21_protein_urea.html

596 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/10 00:32

>>595
なるほど。
サンクス

597 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/11 18:48

ヲレ的にはほとんどの組み換え体タンパク質はGST融合でこさえている。
しかも切り離さず使う。

598 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/11 19:10

融合タンパク質の構造や機能など信用できない。たとえHisタグでも。根拠がある。

599 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/11 19:17

根拠を示してください。おねがいします。

600 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/11 19:29

>599
おれは598ではないが、融合タンパク質が
うまく機能をもつ場合ともたない場合があることは事実。
His-tagあるとアグリ易くなる例もある。
これはうちのラボの別の人の結果です。

601 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/11 20:01

融合蛋白質の性質がタグで変わることは、無視できないほど多いのは事実。
でもカイネースがフォスファテースになったりはしない(w
要は使い道だわな。
Kmやら何やらを問題にする真っ当な生化学やさんは使わないし、
本質的な機能さえ分かればいい細胞生物やさんには便利な道具。

Yeastみたいにタグ付きの蛋白がfunctionalかどうかをin vivoで検証
できる系があれば、細胞生物の世界では何も怖くはない。その場合でも
kinetic parameterが少し変化してる可能性は結構あるけどね。

602 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/11 20:18

イーストの人だと、タグ付けると表現型が出たり、
コンプリメントしなくなったりするっていう
経験をしてる人は多いよね。
特にGSTみたいなでかいタグでは多い。
動物細胞系の人は、その辺ちょっと無頓着過ぎると
感じることはあるな。

603 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/11 23:09

GSTはdimer GFPはdimerかtetramerになるから、kinetic parameterは
当然大幅に変化するので要注意なり

604 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/12 01:19

>>598
私はX線結晶構造解析野郎ですが、Hisタグがついていても、結晶構造に関しては信用できると思います。
（ペプチドと言えるほどの小さな奴なら話は別ですが）
以前はHisタグがついてたら結晶化も難しいもんだと勝手に思ってたけど、今ではそんなこと全然気にしません。
（Hisタグ付で結晶化できなかった場合にはHisタグを取って試みるようにしている）
実際、Hisタグがついたまま結晶化して構造解析したものを、複数種PDBに登録してます。
Hisタグがつくことのデメリット→mobileな部分が増えるので結晶化に不利になる場合がある
メリット→精製が速くなるのでフレッシュな状態で結晶化に持って行ける

...もちろん、機能に関しては、場合によっては注意が必要ですな。
詳しくは>>600-603の方々が書いて下さってますが。
その他、pIとか、金属イオンが機能に与える影響も、かなり変化する場合があるでしょう。

605 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/12 03:51

重原子入れるときに苦労するけどな

606 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/13 01:38

そういえば全てSe-MADかMRでしたわ。レスthanx。

607 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/14 20:01

旦那に２ちゃんには、チョコレートの画像うｐを待ち望んでるリアルではチョコをもらえない
毒男の人がいるんだよ・・と話を振ったら「飲み屋に行けばいいのに。絶対もらえるのに。」だって。
・・・そんな業務用チョコでモテを確認してうれしいのか？

私からは、枕元にハート型のチョコを置いといてあげた。クリスマス翌朝の子供みたいに
よろこんでた。「今日、会社に持っていってみせびらかそうかなあ。」って言ってた。
恥ずかしいからやめてぇ（大照）

608 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/20 18:19

アミノ酸配列からS-S結合が何個入ってるか予測できるプログラム、どこかに落ちてないですか？

609 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/20 18:22

アミノ酸配列から立体構造を予測できないのに、
S-Sの箇所なんか予測できるの回？
そんなプログラムあったとしても、
どの程度の信頼性あるンかな？

610 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/21 20:38

イムノグロブリン様な繰り返し配列なら分子内S-Sは予測できそうだな。

611 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/21 21:00

タンパク質に敬称
ﾜﾛﾀ

612 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/21 23:51

610様は、「よう」と読んで欲しかったんだと、俺様は思うんだが。

613 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/21 23:56

しかしタンパク質様様だな(様々だが)

614 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/22 15:52

>>611,612

今、分かったよ（w

615 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/22 23:37

611は馬鹿だなぁ　何言ってるか全然分からなかった。
ほんっとに馬鹿だね
611様の馬鹿にはなりたくないなぁ

616 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 11:36

GST融合を酵素処理してGST以外を回収したいのですが、
その時全部4Bに結合したままで全く回収できません。
良い回収方法がありましたらお教え下さい。

617 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 12:04

???
切れてるかどうか確認した？

618 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 12:33

>616
まず、君の操作と結果を詳細に記載せよ。
助言はそれからだ。

619 ：616：04/02/25 13:52

申し訳ございません。

大腸菌でpGEX6Pに組み込んだ遺伝子を発現させています。
発現はWBでも確認できていますので存在しています。
（結合量が少ないのも辛いところですが）グルタチオンSepharose 4Bに
結合は出来ています。
そのビーズを用いてプロテアーゼ処理後、SDS-PAGEで確認しますと
溶液側には目的タンパク質は存在せず、
ほとんど全てがグルタチオンSepharose側に来てしまいます。
切断もサイズダウンが起こっていますので出来ています。
疎水性が高い訳でもなく沈殿しているとも思えません。
反応条件をふったのですが（NaCl 0～1M、detergent0～1%、pH 6.4～9.0）
いずれも同じ結果でした。
かなり大量にサンプルが欲しいので
良い回収方法がありましたらお教え下さい。
お願いします。（ＴＴ）

620 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 14:24

参考になるか知らんが、俺の場合、
pGEX4T-1でfusionタンパクを合成し、
樹脂に結合させた後、
樹脂20μｌにたいし、TBST buffer
(50 mM Tris-HCl(7.4), 150mM NaCl, 0.2% Tween20)
を加え懸濁し、そこにトロンビンを１ユニットから２ユニットを
混ぜる。
んで、25度で１時間放置。
そのあとにボルテックスしてチビタンで遠心し、
上清を回収。
それでクーマシーでどぴゃっと染まるんだけどな。
fusionするタンパク次第で大違いなのか？

621 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 14:29

そうそう、fusionしたタンパクの分子量はどのくらい？
それからfusionした全長タンパク質自体の樹脂への結合は
確認しましたか？

俺の経験では、fusionするタンパクとGSTの分子量が
同程度の時はくせ者だぞ。

と、いうのは、目的タンパクが不安定な場合、
そのタンパク部分が大腸菌内で分解されてGSTのみが
回収される。
それは当然、樹脂に結合し、トロンビンで
切断しても樹脂に結合したまま。
樹脂ごと煮たあとでSDS-PAGEすると、
あたかもプロテアーゼで分解された目的タンパク質に
相当する分子量の位置にバンドが見える
ってことがあった。

622 ：うんこちゃん：04/02/25 15:06

pGEX4T-1ってなに？

623 ：うんこちゃん：04/02/25 15:07

pGEX4T-1ってなに？

624 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 15:07

>>616
ほんとに融合したタンパクがGSH Sepharoseにくっついてるの？
→GSHで溶出してサイズ確認。
ほんとに融合タンパクがプロテアーゼで切られているの？
→GSHで溶出したものを切る & GSH Sepharose上で切ったのを溶出。
目的のタンパクはGSHとくっつかないの？

関係あるかどうかわからないけど、
PreScission Proteaseはシステインプロテアーゼなんで、
Buffer中にきちんと還元剤入れとかないと
切れが悪くなります。

625 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 15:14

>>622,623
プラスミドベクターの名前ですが何か？

うんこちゃんってなに？

626 ：616：04/02/25 18:20

皆様、レスありがとうございます。

目的タンパク質のサイズは10～77kDaで
同じタンパク質のドメイン～全長expressionをしています。
GSHで溶出するので結合はしているものと考えます。
サイズも合っています。
溶出後透析し、PreScissionで切って（プロトコール通り）
GSH Sepharoseにかけると溶液から消えてしまいます。
透析で無くなってしまっていることもありません。
ですので、モノがGSHかSepharoseに結合していると思います。

何とか目的タンパク質だけ溶出出来ないものでしょうか。
知恵を拝借したく存じます。

627 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 18:41

>>616
10-20% glycerol 存在下20mM GSH,over night, 4C,でバッチで
攪拌でもだめでつか？

628 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 19:15

>>616
カラム上じゃなく、GSH溶出してから切ってるのですね。
切った後GSH Sepharoseにアプライしたら、
素通りに目的のタンパクも出てこないと。

1.プロテアーゼで切ったサンプル
2.それをGSH Sepharoseにアプライした素通り画分
3.その後GSHで溶出した画分
でいうと、1.ある　2.なし　3.ある　なんですか？
3.のとこに、目的のブツ、GSTタグ、PreScissionが出てきます？

まずは、もしまだ試してないのなら、カラムに結合させたまま
プロテアーゼで切ってみるのはどうでしょう？

にわかには信じがたいのですが、
もしブツが本当にGSH Sepharoseにつくのなら、
タグなんかなしでGSH Sepharoseで精製できるんじゃないですか？

629 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 19:59

うん、俺もビーズに結合させたままの
消化を勧める。

630 ：＞616：04/02/25 20:56

それと同様の経験有り。GSTと目的蛋白がS-S結合で架橋されていると
考えられる。立体構造に不安があって漏れはそのコンストラクトを
使わなかったが、どうしても試したいのであれば、10 mM DTTくらい
を加えておくと、あるいは外れるかもな。

GSTは個人的に嫌いだ。いろんな事が起こるぞ、あれ。

631 ：616：04/02/25 20:59

GSH Sepharose 4Bに結合させて切ってもほとんど離れなかった
（銀染色でうっすらバンド。90％以上吸着したまま；CBBで激しく染色）ので
GSHで溶出後酵素処理しました。
ほんの少しでも取れるなら、この方法（溶出後消化）でうまく行くかと思ったのですが
ダメでした。

最悪この目的タンパク質にはアフィニティ精製はダメかなと思っています。

632 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 21:02

>>615
なに怒ってんだボウズ

633 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 21:18

>>632
お前だろ…（呆
何遅レスで怒ってるんだ？

634 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 21:21

>630
他にどんなこと経験したのか、教えてくれ。
今、使ってるんだから。俺。

635 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 21:44

GST融合のままで取り扱ったらだめか？

pull-down assayとか抗GST抗体で検出とか、便利やん。

636 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/25 21:46

GSTはfusionの相手次第では沈殿しやすいよ
どれくらい沈殿するか予測するソフトがあるらしい？

637 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/26 03:36

ぶっちゃけ、生物は素人なんだが
比較的安全・安価で蛋白変性作用のある物質（薬剤）はありませんか？

変性といっても、酵素等の活性を無くす事が目的だから
構造が変化したまま戻らない事が肝要

638 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/26 10:18

>637
君には教えたくないですね！

639 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/26 11:04

>>637
一番安いのがボイルすればいいのでは？
薬剤なら尿素。
他にもあると思うが思いつかん。

640 ：630：04/02/26 11:18

>>634
しばしば loss of function mutant になる。（←これが一番嫌）
proteaseで切り離せない。（切れるがGSTと挙動を共にする。S-S架橋か？）
不自然に溶解度が高いことがある。
dimerを作るのは仕方がないが、時にmultimerを作ってアグる。
カラムに付かない。またはごくわずかしか付かない。

などかな。俺はもう二度と使わないと心に決めたよ。今はFLAG信者だ。

>>637
formaldehydeではだめか？

641 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/26 11:53

リンカーが短いんぢゃないか？＞GST融合で困っている香具師。

ヲレはpGEX4T-1よりリンカーが10aaぐらい長いのでやってる。
大概、問題ない。

642 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/26 11:58

>>637

ブリーチ、過酸化水素だろ。
mupidに過酸化水素を入れてRNaseを失活させるし。

643 ：630：04/02/26 12:28

>>641
そう言う問題ではない。大体リンカーは君のより長いと思うよ。
Gatewayだし。
in vivo又はそれに近いfunctional assayの系は持ってるかい？

644 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/26 12:34

昔からGST融合タンパク質を動物や酵母で発現させてアッセイしていたが
幸い、どれもチャントpull-downできてるし、活性も見えますし、
phenotypeの異常もなかったけどねぇ。

645 ：644：04/02/26 12:38

HAタグ、Mycタグ、FLAGタグ、T7タグ、HIsx6タグのどれも動物細胞で使用経験あるし、それぞれそれなりに良いのは知っている。

可逆的にdimerizationするならFKBP12x3タグもいいかも,
FK1012を使うけど。

646 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/26 13:33

今更dimerになる馬鹿でかいタグをあえて使うこともないでしょう。
トラブル多いのは周知の事実だし。
他に良いのがいっぱいあるし。

抗体でも作るんなら別だけど。

647 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/26 13:36

ちゃうちゃう。
in vivoで二量体化させて活性化をみるやつに使う＞ASK1とかRafとか。

648 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/26 13:37

>>647
GSTのこと言ってるんだけど・・・
分かりにくかったらｽﾏｿ

649 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/26 13:45

二量体化の問題点は分かる。

でもpull-downのとき、抗体＋プロテインAビーズより
グルタチオンビーズだけで済むから、手間と金が節約できるので
GSTを愛用してる。

650 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/03 02:04

ＧＳＴフージョンでタンパク精製行いたいんですが
可溶化しまへん・・・orz
ＧＳＴ単発と比較して同程度の量のフージョンタンパク質が
発現しているのですが、これって発現しすぎなんでしょうか？

ＩＰＴＧは0.1ｍＭでＯＤ0.7から誘導してます。
誘導後は培養温度を１７度にしてるのですが・・・

ちなみに使用ベクターはpGEX6Pです。
誰か助けてクリ；；

651 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/03 02:36

培地にグルコース添加してみたら変わるかもよ

652 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/03 06:13

>>650
651に加えて、
IPTGをさらに減らしてみる。
誘導前の培養温度も下げる。
ウェスタンでぎりぎり見えるくらいの発現にしたら可溶性に来ましたよ。
GFPもくっついてますが酵素活性出てます。

ところで皆さん菌体からタンパクの回収はどうなさってますか？
超音波でやると完全に壊れてないような気がするのですが。

653 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/03 09:48

>>652
漏れは何時でもlysozyme->sonicationだなぁ。考えるの面倒だし。

654 ：650：04/03/03 10:08

650でございます。
いくつかレスいただきありがとうございます
今日から早速色々ためしまー

また報告いたします

655 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/03 18:11

>>653
Lysozymeの濃度はどのくらいですか？

656 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/04 02:27

超音波で不安ならば位相差の顕微鏡で見てみれ。
桿菌のままで残ってるヤツがどれだけいるか目で見て分かる。

657 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/04 11:00

>>655
1mg/ml。粉量って適当に放り込む。
↓
服を脱ぐ
↓
畳む
↓
1%Tritonを加えて待つこと15分。
↓
でろでろになる。
↓
適当にsonication。
↓
(ﾟДﾟ)ｳﾏｰ

酵素使うのが嫌って人多いけど、楽だよ。
今のところ、精製した蛋白の活性は全て問題なし。

658 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/05 16:29

>>652
おれはボリュームが多い時はフレンチプレスだな。
封入体に行くのか可溶性画分に行くのかを小スケールでテストする時はソニック使うこともあるけど。

659 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/05 18:03

細胞膜分画の調製のために初めてpercollを使った密度勾配遠心法を行っているのですが、アマシャムのdensity marker beadsを見たところ全てのビーズが下に沈んだ状態で密度勾配が形成されているようには見えませんでした。

論文のプロトコールを参考に、250mM スクロース 30mlに対し、parcoll 4mlを加え、均一に撹拌してから25000gで15分または1時間遠心しました。

アドバイスなどあればよろしくお願いします。

660 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/05 20:10

25000g......gかけすぎ。protocol嫁！

661 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/06 01:28

percollでそんなに遠心力かけちゃ意味ない。
スクロースじゃあるまいし。
沈降係数って知ってる？

662 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/06 16:04

>659を晒してみるか....

663 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/06 18:11

はやくシーケンスとらせれ！！貧乏除供寿

664 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/07 01:28

>>659みたいなのは何か実験をするとき、「なぜコレを使うのだろう？」とか
「どうしてこんなことをするのだろう？」とか考えないのだろうか。
なぜショ糖（単独）ではなくパーコールを入れると思う？
考えをめぐらしたことがあるか？
もし考えたことがあるなら、ショ糖のときみたく遠心力を掛けようとは思わない。

665 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/07 01:32

たとえば１００mlクラス以上の大型ロータで密度勾配作りたいときどうする？
普通にある遠心機ではそのクラスでは遠心力を出せない。
したがってショ糖では密度勾配遠心できない。
ならどうするべ？
パーコールの意味をよく考えてみるべ>>659

666 ：659：04/03/07 14:35

アドバイスありがとうございました。

percollは沈降係数が大きく、低速遠心で密度勾配を作るのに向いていて、超遠心では沈降しすぎてしまう。
large scaleでの密度勾配遠心によく使われるということでしょうか。

プロトコールはどうひっくり返して読んでみても、25000gと書いてあるのですが
ともかく勉強不足のようなので、勉強し直して出直します。

667 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/08 00:00

>666
君がプロトコールと呼んでいるのは何かの論文かな?
出版物、Netは調べたかな?

percollでグラジエントかける時はたいてい250g位なもんじゃねーのか?
まぁ、うまくいくようにがんばってな。

668 ：652：04/03/08 21:34

全培養は３７℃で普通に行い、本培養で誘導までを
２７℃、６０ｒｐｍくらいにしたら、誘導かける前に
可溶化していました。誘導かけると、やはり沈殿のほうに
行ってしまっていました。

さあ、これから精製だ。

669 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/16 00:23

保守あげ

670 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/20 13:02

900kDaのコラーゲンタンパク（TAGはついてない）を
アフィニティで釣っているのですが、うっすらは取れるのですが
ほとんど廃液に残ってしまいます。
ゲルはプロテインＧをつかっていますが、高いですね。
プロテインＧと抗体の割合とかみなさんどうしてますか？
プロテインＧカラムとか売ってるのかな・・

671 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/20 13:40

>670
売ってるが...
affinity purificationは抗体のtiter次第で回収率が大きく変わるぞ。
titer測ってるのか?

672 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/24 03:42

うちはHAタグをつかってます。分子量ちいさいんで便利。

673 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/26 22:50

初心者なので質問させてください。スレ違いかもしれませんが。

現在あるペプチドに対する抗血清から特異的抗体を精製しようとしています。
抗原カラム(S-S結合を利用してsepharoseに結合させています）は
別の人が作って持っているのですが、どのようなプロトコールで精製すればいいのか
自信がありません。タンパクあんま扱ってないラボなもので．．．

中性のバッファーで結合させて0.2Mグリシン(pH2.8)とかのバッファーで溶出すればよいのでしょうか？
おすすめのプロトコールがあったら教えていただけると助かります。

そんなん自分で調べろよって声が聞こえてきそうですが、実際やっている
方々の意見を聞きたいと思っています。

よろしくお願いします。

674 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/27 05:53

>>673
知ってるがお前の態度が気に入らない。

675 ：673：04/03/27 12:17

>>674 さん

態度が悪いと感じたのなら申し訳ありません。
よい方法を知っていらっしゃるのでしたら教えていただけないでしょうか。
よろしくお願いいたします。

676 ：どなたかお教えください：04/03/27 14:54

タンパク質を結晶化して、構造解析を行う予定のものですが、
うちのラボには、解析装置がなく、他の施設のを借りようと思っています。

成書などで、記載されていなかったのですが、
ハンギングドロップ法で、
結晶化させた後は、どのように保存したらよいのでしょうか？

移動にかなり時間がかかってしまうため、
結晶化したサンプルを安定的に保存する方法
とか教えていただけないでしょうか？

677 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/27 17:43

using anti-body嫁！

678 ：結晶屋：04/03/28 21:49

６７６さん
測定日にあわせて結晶を仕込むことが多いですね。
また、測定の際には１００Ｋ程度まで冷却するケースが多いので、
結晶を抗凍結剤に浸したあと、測定用ループにマウントした状態で液体窒素内で保存するか、
ガラスや石英のキャピラリーに入れて密封します。
キャピラリーでの保存は結晶によってはだめになることもあります。

679 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/29 02:58

>>676さん
先日横浜であったシンポジウムでは
アメリカの結晶屋さんが、ある結晶条件の同じバッチを
一日一度写真をとって紙芝居みたいに発表していました
結晶化後２－３日で結晶が現れてだんだんおおきくなって
ある日にちを過ぎたら今度は急速に消えていきました
同じ条件で結晶化した別の結晶についてしらべても
分解能も結晶化後数日がいちばんよくて、あとはどんどん
悪くなるみたいです。
どこか室温系でデフラクションだけとらせてもらえるところで
結晶化後何日目が一番分解能よいかしらべて、
それにあわせて放射光を確保して、クライオではやめにはかるのが
よいのではないでしょうか？

680 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/29 19:53

>>676
bluebio2001 マルチポスト？

681 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/30 01:47

だったら何？

682 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/30 02:08

>>633
ｺｲﾂ、遅ﾚｽで何を怒ってるんだろう、、、

683 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/31 13:08

STRATAGENEのpRSETを使ったことありませんか？
海外からもらったクローンのベクターが
それだったんですけど、
BL21*(DE3)中では
インダクションかけなくても
ジャジャ漏れ状態みたい…
確かにlacOはない様ですけど、そんなもんですか…？

684 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/04 03:07

>683
pGEXでも良くある。気にするな。

685 ：676：04/04/11 09:42

結晶屋さん、名無しゲノムのクローンさん

出先にweb環境がなく、遅れレスしてしまいました。
申し訳ありません。
Labに戻り次第、室温系で条件をふってみることにします。
ありがとうございます。

686 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/14 23:56

蛋白精製を最近始めたばっかの厨です。
アフィニィティクロマトで目的蛋白質を溶出するelution bufferって
どういう基準で決めたらよいのでしょうか？
目的蛋白質はthrombinです。。

687 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/18 19:55

論文探して読めや
トロンビンなんか古い論文にいっぱいでてるやろ
その頃はアフィニティなんか使ってないかもしれんが。
アフィニティはどういうカラムにつけるのか（スルーでもいいが）、
何を精製するのかで溶出が全然違うから一概に言うのは難しい。
俺が酸性プロテアーゼでアフィニティ使ったときは、ペプスタチンカラムに付けてpH変えて出した。

688 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/24 23:24

あげてみよう

689 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/25 09:10

age

690 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/28 16:42

>>686
そんな基本的なこときいてんなタコ

691 ：sage：04/04/28 17:26

2.次のクラミドモナスのアミノ酸配列をもとにプローブを作製しなさい。
MGELKRVHAEEVCMLKE
この問題教えてください。

692 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/28 22:38

Metとか、コドンに縮重が少ないペプチド部分を選んで、あとは自動合成やれ。

693 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/29 00:04

こうですか？
ggggagctaaagagggtacac

694 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/29 00:06

TAP法を使って、市販されている公募（たっぷたぐに目的タンパクがついている）
の目的タンパクを精製した方はいらっしゃいますか？

695 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/29 01:28

>693
いや、う～ん、まあ、というか、というかですね～、
プライマーつくるときは、可能性ある配列をすべてつくれるわけです。
というのは、ポリヌクレオチドの自動合成というのは、順番に塩基を
つないでいくわけです。順番につないでいくときに、縮重の可能性のある塩基
を全部いれてしまう、というふうにやれば可能性のある配列すべてが
楽にできちゃう、という寸法です。
つまりですね～、一通りの配列をつくっても、その配列がぴったり合う確率
は小さいので、たぶんうまくいかないからダメなのですよ。

696 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/29 10:34

くら未どもなすのこどんはGCにかたよっている

697 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/07 18:43

SDSでタンパク質精製していますが、単一バンドにする事が難しいです。
pGEXのベクターでやっています。

ゲルだけでやるのははっきり言って困難だと思いますが、如何なものでしょうか？
抗体調製用の蛋白です。

時間だけが無駄に過ぎて行き、依託で作ってもらう方が、今の時点では安くすんでいます。
ばかばかしいですが、まだやらなければならないので、よい方法教えて下さい

698 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/07 21:17

他所でGlutathione Sepharose beadsを0.5mlぐらい恵んでもらえ。
バッチ精製でビーズは何回でもくり返して使える。

699 ：ぺー：04/05/07 22:18

シークエンシャルＩＰってどうですか？何リットルという単位で細胞を培養
しないといけないんですか？

700 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/08 02:12

>697
　....かわいそうな奴だな。ビーズ送ってやるから住所晒してくれ。

701 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/09 10:47

いや、おれにまかせろ

702 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/09 23:53

細胞から変性蛋白質だけ抽出する方法してるひといます？
膜蛋白質はいらないんだけど。。。
NP40つかってるペーパーあったけど、
NP40だと完全には膜タンパクを可溶化できないみたいなんだよね。
なんかいい方法あったら教えて。

703 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/10 00:36

>>697
SDSじゃ、単一にならないことも良くあるじゃん。
つーか、違った配列のサブユニット持ったタンパク質なら
単一まで精製出来ていたとしても、複数バンド出るし。
とりあえずNative-PAGEしとけ。

704 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/10 01:21

>>細胞から変性蛋白質だけ抽出する方法
質問の意味が分からん。

705 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/15 11:28

あげ

706 ：初心者：04/05/20 00:45

ウエスタンのお勧めのメンブレンってどこの会社のどんな銘柄ですか？

707 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 01:10

ミリポア

これが間違い無い。

708 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 01:50

イモビロンPがスタンダードだと思うよ

709 ：初心者：04/05/20 02:03

芋びろんＰ使ってるんですけど、変なムラが出るんですよ。
どうしてなのだろう。
たまたまロットが悪かったのか・・・？

710 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/25 23:05

タンパク質ってボルテックスしてもいいんですか？
単純に考えるとDNAと同様、分解してしまうのではないかと思ってしまうのですが。
誰か教えていただけますか

711 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/25 23:14

>>710
物と用途による。酸化に弱いものなら普通はしない。
でもそんなことわからないことが多いので、普通はさける。
BSAぐらいなら（用途によっては）ボルテックスすることもあるけど
タンパク質扱っててボルテックスが必要になるってことはあんまりないな。
なんのためにボルテックスしたいのかこっちが聞きたい。

ちなみにDNAでも長さによってはボルテックスしても切断されない。
例えばプラスミドとか、ファージとかくらいなら。

712 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/26 00:21

>>711
藻前、酵素反応したことないな。
酵素と基質混合するのに普通に使うぞ。
もちろんしない方がいい場合もあるがな。
何でgenomicDNAがボルテックス不可で、プラスミドはＯＫなのか、
タンパクの大きさがどれくらいなのか考えてみろや。

713 ：710：04/05/26 00:26

生成時に沈殿して、ピペッティングじゃ解けないんでつ。

714 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/26 00:31

>>712
だから用途によると書いたんだよ。
酵素反応といってもいろいろあって
酵素のカイネティクス調べるだけなら大概は短時間の反応ですむから
ボルテックスしてもかまわないと思うけど。

あと、

＞何でgenomicDNAがボルテックス不可で、プラスミドはＯＫなのか、
タンパクの大きさがどれくらいなのか考えてみろや。

タンパク質は大概コンパクトにfoldingしてるからね。
genomic DNAはそうじゃないでしょ。
まあ、この件に関しては一般的なことを言っただけで、俺自身経験があってのことじゃないんで。
genomic DNAでも問題ないって思うなら否定はしないよ。やめといた方がいいとは思うけど。

715 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/26 00:32

>>713
生成時って？
なんのことかわからない？ボルテックスでそうなるならボルテックスが厳禁だけど。
別の問題な気がする。

pHか、塩濃度か、タンパク質自身の濃度か。。
その辺いじるしかないんでは？

716 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/26 01:21

>>713
ボルテックスはダメやね。生成中ならなおさら。
タンパクの種類は？精製のどの過程？何の操作の後？

そこら辺の情報があると、解けない理由もわかるかもしれないな。

717 ：710：04/05/26 02:17

すまん。精製でちた。

718 ：710：04/05/26 02:18

組織からのタンパク抽出でつ。

719 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/26 11:13

>>710
可溶性画分にくるタンパクを精製してるの？
だったら、ボルテックスどうのこうのよりも
沈殿している時点で活性がヤバイんじゃないの？

ちなみにオラは平気でボルテックスする派。

720 ：710：04/05/26 12:39

いそぷろぱのーるで沈殿させていまつ。

721 ：名無しさん@Vim%Chalice：04/05/26 22:25

溶媒分画しても大丈夫なタンパク質ならたいていは
ボルテックスしても大丈夫だろ。

722 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/26 23:12

ボルテックスと一口に言っても、スピードやチューブの形状などによって、
起こりうることは様々だと思う。

723 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/27 08:35

>>710
イソプロでタンパク沈殿？
これって、活性のあるタンパク精製のステップなの？
電気泳動してしまうサンプルなら分かるけど…

詳しい方、そんなのアリなのですか？

724 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/27 12:00

ふつう、有機溶媒でタンパク質分画するときはアセトン沈澱しないか？

725 ：710：04/05/27 17:06

isogenというキットを使っているんでつが、
大丈夫でしょうか。
不安になってきまちた。

726 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/27 20:58

isogenだと全タンパク画分か。
電気泳動してN末シーケンスなら、ボルテックスしても
タンパク質はバラバラにはならんから気にするな。
活性とかならイソプロに耐えるタンパク質なんだろうから
ボルテックスしても大丈夫だろ。気になるならやめとけばいいし。
ついでに言っとくと全タンパク画分だから、水に溶かそうとしても
全部は溶けないぞ。SDSとボイルするか、溶媒入れとくか、かね。

727 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/27 21:24

漏れ、イソプロじゃないけどブタノール－硫安という精製ステップやったことあるよ。
血中の脂質代謝系の酵素なんだけど、
水に対して透析した血漿にブタノールと硫安放り込んでかき混ぜると、
水層とブタノールの界面に酵素が集まる。
もちろんちゃんと活性がある酵素が取れる。

728 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/27 21:49

>>725
なんだ。それならそうと早く言ってくれれば良かったのに。
RNAとタンパク質を同一サンプルから取ろうとしてるんでしょ。
それならほぼ失活してるはずなので、ボルテックスはしてもかまわないよ。
しかし、酸化を受けて凝集する可能性も考えられるね。

てか、それって沈殿したタンパク質って非常に溶けにくいでしょ。
俺も前にやったけど、全然駄目であきらめたよ。

729 ：710：04/05/28 00:05

みなさまありがとうございまつ。

730 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/28 00:09

もれもisogen使ってる。
要はisogenだと変性させるからタンパクの活性はなくなるけど、
2DEとかウエスタンに使う分には問題ないってことだよね？
この解釈であってる？

731 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/28 00:17

マルチポストしたこっちは放置か
http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=870476

732 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/28 00:29

合ってるんじゃない？塩酸グアニジン溶液で溶かしてから遠心してフィルター
通してゲルろ過して目的画分を透析すればものによっては活性も戻ってくるよ
ゲルろ過で流すバッファーも塩酸グアニジン入れるんだぞつまるからな

733 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/28 00:37

＞＞732
それってなんで活性戻るんだ？
透析するだけで活性戻るの？

734 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/28 00:45

いろいろなタンパクが高濃度で混ざってると、凝集しやすいものに
引っ張られて強いタンパクも沈殿するのよ。だからちょっときれいにしてやってから
変性剤取り除けば、自分で巻き戻るようなタンパク質なら戻るの。
本当はゲルろ過しながら巻き戻すほうがいいんだけど、この条件だと確実に
ゲルがつまるからねぇ。

735 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/28 00:50

戻ることもあるらしいよ。俺のは戻らなかったけど。

736 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/28 00:53

実験の特性による。

一定の割合で活性が戻ればいいタイプの実験なら変性巻き戻しでもいいが
構造解析なんかの場合はあんまりというか、かなり好ましくない

自分の研究手法が世間のスタンダードだと強く思い込んでいる人がいると
共同研究のときお互いに困るのだ。以上経験談

737 ：734：04/05/28 00:58

ああ、そらそうだな。変性巻き戻しで構造解析できるもんもないわけじゃないが
そういうのはたいがい解析済みだったりするしな。

738 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/28 01:27

＞736

構造解析の場合は変性剤を用いないで精製するの？
てか、普通は大腸菌で強制発現させるか。

739 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/28 01:43

お蔵入りしたサンプルは数知れず。

740 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/14 21:16

抗体作製のためにpET-19b使ってBL21に入れて発現させたんですが
精製してSDS-PAGEしたら収量が少ないうえにsmall scaleで確認したときとバンドの位置が全く違ってて
しかもマルチバンドになっててどうしようもなくなりますた。。。
どうしよう

741 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/27 04:58

もう一度、各ステップで確認して下さい。

742 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/28 04:22

どれぐらいのスケールアップをしたのだろうか。
１０倍程度のスケールアップが問題ならば、スケールアップせずに１０回培養すればいいんだけどね。
１００倍以上じゃツラいな。

でも、スケールアップが問題じゃなさそう。

743 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/29 01:16

StratageneのSolubility Enhancement Tags（SETs）試した方はいらっしゃいますか？
ちょっとでも可溶性にくる分が増えてくれるといいんだけどなー。

744 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/29 01:24

H e n - E g g - W h i t e - L y s o z y m e

745 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/29 01:46

ヘリカル四十数残基か
効くのかねぇ

746 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/30 01:15

あ

747 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/30 01:15

ｈｈｈｈ

748 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/01 19:52

質問です。

S-S結合を切断するのに十分なDTT濃度ってどの程度でしょうか？
精製は４度で行なっています。
タンパク質の内部にあるばあいや比較的表目に露出している場合で異なるとは思いますが、
それぞれの場合について、知っている方がいましたら御教示下さいませ。

また、S-S結合以外に、高濃度のDTT（例えば10mMとか）が、タンパク質の活性に影響を
与えるようなことってあるでしょうか？

よろしくお願い致します。

749 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/01 20:14

1 mM もあれば十分ですよ。

750 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/01 20:31

>>748
freeのS基を保護するためなら1 mMでも大丈夫かもしれないが、既に結合してしまってる
S-S結合を切断するのには10-100 mMくらい必要。
その辺はタンパク質か条件によって違うと思う。

751 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/01 21:02

別に聞くの教えるのは勝手だからいいんだけど、
何で論文引いて調べようとしないのかがようワカラン。

752 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/03 06:44

勝手だからいいじゃん

753 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/06 02:16

便乗質問
抗体(IgG)の失活ってどのくらいのDTT濃度で起きますか？
βメルならどこまで耐えますか？

754 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/06 20:26

タンパク質間相互作用の研究を行なっています。
S-S結合を持たないタンパク質同士の親和性が、
DTT濃度に依存して変化するのです。
濃い方が親和性が弱くなります。
これってどのような理由なのでしょうか？
あるいは、この辺りを調べろ、とかの助言でも嬉しいです。
よろしくお願いします！！

755 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/06 22:42

疎水相互作用と思われ。
グリセロール濃度なんかではかわらないの？

756 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/07 03:04

>>754
コンタミにシステイン持ってるやつがいる、という可能性は？

757 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/07 03:32

artifact

758 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/07 11:16

>>754
その相互作用はどうやって計っているんですか？
相互作用自体がDTT濃度に依存しているのではなくて、その計測系がDTT濃度に依存しているのではないですか？

759 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/07 19:30

「化学と工業」で紹介されたことのあるような、分子間相互作用検出用の、滴定型カロリメトリーかな？
それとも・・・？

760 ：754：04/07/07 19:39

みなさん、レスどうもです。
アッセイ系に関してはとても特殊なので身元がわかってしまいそう。
なので勘弁して下さい。
いろいろ状況を考えると、コンタミか疎水性度の問題かのどちらかと思われます。
コンタミに関しては可能性はありますが、検出限界以下ですので
とりあえず、DMSOあたりの濃度をふって親和性がどう変化するか調べようと思います。

761 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/09 18:52

質問です。
NHS activated beads FFでつくったアフィニティーカラムを再生するときって urea で洗っても大丈夫ですか？
蛋白が変性するのはかまいません。
よろしくお願いします。

762 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/10 02:45

不溶性画分の巻き戻しについて教えてほしいのですが、
塩酸グアニジンを加えてから透析する程度しか知らないので
詳しい手順を教えてください

763 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/10 04:10

>>762
周りに経験者がいないなら可溶性画分に来る条件を模索する方がいいと思うよ。

764 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/10 13:37

巻き戻しってそんな難しいものなんですか？

765 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/10 13:45

巻き戻らない奴の方が圧倒的に多いんだが。

766 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/11 00:30

正確には「こいつは巻き戻らんと匙を投げられる奴の方が圧倒的に多い」だと思う。
汎用性のある巻き戻し法を開発したら大金持ちになれるよ。

767 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/11 03:03

いったん変性→巻き戻し路線ではじめたら、
これは上手くいかないと判断して路線変更するまでの手続きが大変。

わりと可溶性画分に出やすい発現系や
配列的に可溶化しそうな発現領域の候補をいくつか考えて
可溶化路線で進めるというのが手っ取り早い気がする

実験の特性にも依存するがな(これは前にも書いた)

768 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/12 11:12

溶けた＝巻戻ったとは限らんからね。。。
まーそのあと何に使うかにもよるけど。

769 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/12 16:20

>>768
封入体の場合溶けた＝（封入体から別の形に）変性したじゃないの？

770 ：761：04/07/13 14:46

解決しました。
お騒がせしてすみませんでした。

771 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/16 22:27

これってどうですか？

【化学】タンパク質の溶解度を増やし、安定性も向上させる簡単な方法

1 ：pureφ ★ ：04/07/16 12:51 ID:???
　タンパク質の濃度を凝集させたり、沈殿させることなく必要なレベルに引き上げることは、
挑戦的だが重要な課題だ。構造生物学の分野においては、主に溶解度の低さのため、膜
タンパク以外のタンパク質のうち、20%ほどのものしか構造解析に適していないと言われている。
　今回、この問題を解決するために、2種類の電荷を持つアミノ酸、L-アルギニンとL-グルタ
ミン酸各50mMを同時に緩衝液中に加えると、タンパク質の溶解度がものによっては8.7倍まで
増加することを発見した。これらのアミノ酸はタンパク質の凝集や沈殿を防ぎ、長時間の測定を
可能にするのみでなく、タンパク質が分解してしまうことからも保護する作用がある。一方、
タンパク質－タンパク質、タンパク質－RNA質相互作用はこれらのアミノ酸共存下でも
阻害されなかった。
　これらのアミノ酸添加は、高いタンパク質濃度と長期間の安定性が要求されるような場面、
特に、同位体標識されたタンパク質のNMRによる溶液構造解析などで力を発揮しそうだ。

A Simple Method for Improving Protein Solubility and Long-Term Stability
Alexander P. Golovanov, Guillaume M. Hautbergue, Stuart A. Wilson, and Lu-Yun Lian
J. Am. Chem. Soc., ASAP Article 10.1021/ja049297h S0002-7863(04)09297-2
Web Release Date: July 1, 2004
http://pubs.acs.org/cgi-bin/abstract.cgi/jacsat/asap/abs/ja049297h.html
（大学の図書館とか以外からは多分見れません）

772 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/16 22:51

>>771
よし、お前試してみろ。
報告もよろしく。

773 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/16 22:53

>>771
アルギニンは試したけどだめだったよ。Gluは入れなかった。
アルギニンについては
Umetsu, M., K. Tsumoto, et al. (2003). "How Additives Influence the
Refolding of Immunoglobulin-folded Proteins in a Stepwise Dialysis
System. SPECTROSCOPIC EVIDENCE FOR HIGHLY EFFICIENT
REFOLDING OF A SINGLE-CHAIN FV FRAGMENT." J. Biol. Chem.
278(11): 8979-8987.
と蛋白質核酸酵素の48(16)に記事がある。

今は>>743のタグつけたコンストラクトのシークエンス待ち。

774 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/16 23:13

精製がおわってせいせいした。
これからは正々堂々と研究にうちこめるぜいぜい。

775 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/23 15:02

抗原として使いたいのですが、electroelutionで回収したサンプルからCBBを取り除く方法を教えて下さい。
MeOHで洗ってアセトンで沈澱させればいいんでしょうか？
CBB染色→バンド切り出し→MeOHで完全脱色→electroelutionという方法も考えたのですが、
MeOHで完全脱色の際に切断面からタンパクが流出しそうな気もします（まだ試してませんが）。

776 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/24 18:50

みなさんGSTセファ４Bて何回くらい再生して使ってます？
また、50％スラリー1mlでどれくらい吸着しますか？

777 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/24 20:50

まともな質問スレが見つからなかったので、この場を借ります。
先日踵の皮膚を大きく、すりむいてしまい、微量の出血をともないつつ
皮膚一枚下の組織が露出する状況になりました。
数日後、カサブタができてきたのですが、さきほどぶつけてしまい
カサブタがとれて、エライ出血してしまいました。
ただもう一回直るのを待つのももったいないし、
取れたカサブタを患部に血のりと一緒に貼り付けてみたのですが
植物の様にこの皮膚を使って傷口がふさがるということはありますか？

淡白やら皮膚に強そうな皆様のご意見をお願いします。

778 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/24 20:54

ありません。
かさぶたは頻繁にはがし、都度十分消毒してください。
そのほうが直りが早いです。ただし痛みを伴う。

779 ：泥沼歩兵部隊：04/07/25 03:15

>>776
2-3回は調子いい。
4-5回過ぎるとかなりあやしくなる。
汚いものを乗せて強く洗うのを繰り返すと
なんとなくへたるのが早いような気もする。
5mgは吸着できるが、それは5mg inputにして
それを100%吸着する、という意味とは違う。

780 ：776＠らぼ：04/07/25 23:45

＞泥沼歩兵部隊殿
レスありがとうございます。
自分は現在M２なのですが、昨年やってたHis-tag系がうまくいかず、５月頃からGST系に切り替えたのであります。
ウチの教授は「再生すれば何回でも使える」とのたまっているのですが、
自分の経験上ではやはり３、４回過ぎると調子悪くなるので聞いてみた次第です。
自分の系ではうまく行った時で（ビーズ出して１回目はうまく行かない事が多い。
再生１回目or2回目）ビーズ2mlに対して25mgほど乗せて、15mg程溶出してくれます。
ビーズ使い過ぎですかね？
また、なぜかグルタチオンで溶出してくれないのでPH8.8のTrisで溶出させてます。
（なんとなくSDS－PAGE用のを使ってみたら溶出したw）
そしてビーズ中でのthrombin切断がうまくいかないのであります…
7月中に免疫まで行かないとクビとか言われても無理だよ！

781 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/26 11:53

泥沼歩兵部隊殿は、久々の2chですか？

>>780 = 776
それはGSTビーズやHis-tagレジンの問題ぢゃなくて、
取り扱っているタンパク質の問題か、
Fusionタンパク中のThronbin切断部位の位置が問題ではなかろうか。

782 ：735：04/08/05 01:58

質問です。藻前らどのタグが好きですか？
いまいちどういう場面でどのタグを使うのがいいと　っていうことが
わかんないんだけど。俺はHis-tagに一票かな。理由Hが続いていてなんかかっこいいから。

【好きなタグ】His-tag
【理由】Hが続いていてなんかかっこいいから。

さあ、君も投票してみようじゃないか！

783 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/05 02:15

【好きなタグ】His-tag
【理由】選択性、特異性

784 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/06 21:51

何の話しているかさっぱりわからない

785 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/07 00:23

むずかしい

786 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/07 00:48

先生から２次元ＨＰＬＣを導入すると何が良いのか調査しろと。

ぐぐっても出てこないし、誰か教えてください！

787 ：あるケミストさん：04/08/07 06:52

【好きなタグ】His
【理由】やっぱAffinity高いべ

788 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/07 09:03

【好きなタグ】His-tag
【理由】手始めにやるにはピッタリ

789 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/07 21:54

His-tag好きばっかりだな。

790 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/08 01:35

嫌いなのも教えて

791 ：HisTag厨：04/08/08 02:09

勝ったな。圧倒的に勝った。

792 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/08 17:48

>>786
一度システムをセットアップしたら、2次元電気泳動より楽そう。
確実に言えるのは、その後タンパク質を同定するとき、
ゲルから切り出す作業を省けるので、簡単になる。

業者は、電気泳動よりも再現性がいいなどと口にしますが、
どうかわからないし、値段が高過ぎる気がする。

793 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/08 21:32

業者さんはただたんに売れればいいとしか考えていないようですので
怪しいと思ったら有力な論文を持って来させましょう。

794 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/11 00:23

しかしまあ、タンパク質発現、精製をやったことの無いヒトは、簡単に思ってるよなあ。
は～あ。

795 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/12 17:33

大腸菌スレから来ました。
指導者なしでゼロから初めて１年の、組換えタンパク生産初心者です。
発現させたタンパクが発現条件を変えてみても沈殿画分に入ってしまうので、
尿素やグアニジンで溶かして透析などをやってみましたが、
どうしてもバッファーに溶けるものがとれないのです。
これまでに試したベクターはpGEX, pQE, pMAL です。
ちなみに目的タンパクはS-S結合が４個あります。

あれこれ調べて今後の対策を考えたのですが、
（ホスト）Origami
（ベクター）チオレドキシン融合、NusA融合、ペリペラズムへ輸送
（シャペロン）共発現系
　　　　　　　人工シャペロン；TAPS, NDSB, CA, CD
といったところが今後検討すべきところでしょうか。
ピントずれてないでしょうか？
この他にも検討すべきことはあるでしょうか？
チオレドキシン融合＋Origami で、とりあえずやってみようとは思ってますが。

796 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/12 19:06

>>795
酵母とか培養細胞とかはどうかな？

797 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/13 02:06

羊土社のプロトコル本には、尿素やグアニジンで溶かしての
リフォールディングまでしか書いてなかったので、
実はすぐにでも酵母を検討しようと思ってました。
ところが最近795に書いた手法を見つけて、
まだまだ大腸菌で検討すべきことがあるのかな、と。
ただ、情報源は、NovagenやTaKaRaのカタログ、
文献も開発者だったりメーカーだったり、
あまり、客観的じゃないのでちょっと不安でした。
さっさと酵母とかに移ったほうが正解の場合もありますよね。
う～む。

798 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/13 17:37

どれも汎用性のある手法ではないから、
可能なら並行して他の発現系始めといた方がいいよ。

799 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/13 17:39

用度者ってまだ生きてるんだ(w

800 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/14 12:51

>>795
>どうしてもバッファーに溶けるものがとれないのです。

なんでそこまで頑固に不溶性なんでしょうか。
detergentはどうですか？

inclusion bodyでしたら、
refoldingの検討にチャレンジしてもいいのでは…。

801 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/16 03:28

>>800
>>762-769で同じような話が出てるんだけど、今修士2年くらいで博士も同じ
ラボに残ることが決まってて、他に確実に結果が出そうなプロジェクトが同時
進行中くらい余裕があるならrefolding目指してもいいけど、他に聴ける人もい
ない状況では深みにはまるだけだと思う。

802 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/17 03:34

795 です。アドバイスありがとうございます。
実は、発現領域をかなり狭めたときに可溶性のものが発現したのですが、
目的の機能がありませんでした。
refolding条件の詳しい検討はどうみても泥沼なので、代表的な条件だけ検討
しましたが、ダメでした。
みなさん（特に798さん）のアドバイスを参考にして、795の手法をとりあえずは
検討しつつ、酵母か培養細胞での発現も準備を始めることにします。大腸菌のな
かでの条件検討よりも、ホストを変えたほうが大きく条件が変わりますしね。

803 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/19 02:54

His-tag関連でちょっとお聞きしたいんですが、
CNBrを使ったtag切断をした事のある方いらっしゃいますか？
うまく切れなくてちょっとまいってます。
うまくいったプロトコールを教えてください。

804 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/19 06:05

refoldingをtryするなら、とりいそぎHampton
のFold It kit と　TAKARAのシクロアミロース
キットの二つを試す。
SS2組がもっとも問題ということだったら、
それを逆手にとって可溶化してまき戻す
試薬[TAPS-sulfonate](岡大・山田先生の方法)が
効くかもしれない。

だがともかくfoldingは泥沼になりがちだから
出口がなさそうだったらすぐあきらめるのがよいと思う
さっぱり行かないようだったらとっとと足を洗ったほう
がよいと思う。

あと、キットを買うだけで簡単にためせるもうひとつの
選択肢は小麦胚芽のセルフリーだと思う。
3日で試せて結果がでるんだったらこんなによいことはない

805 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/19 18:52

アドバイスありがとうございます。

>>HamptonのFold It kit
これは、便利ですね。検討しなかった要因が入っているので、
確認のため、あとでやってようかと思います。

シクロアミロースやTAPSなども使う側からの情報があると、
ちょっと安心します。

セルフリーは、795には書きませんでしたが、実はちょうど試したところです。
ですが、発現が確認できませんでした。
もう少し試してみますが。
評判は良いようですが、私の検討しているタンパクには
向いていないかもしれません。

試薬業者のお盆休みが終わったので、チオレドキシン融合用の
ベクターを注文しました。まず、ここから始めます。

806 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/08 14:57

牛乳アレルギーの原因である「βーラクトグロブリン」の除去・分解の研究を
やっている方いませぬか？

807 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/08 15:36

いたとしても守秘義務あるからPubMedで得られる以上の情報はないと思うが

808 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/08 16:42

そうかな？
漏れの同期なんか飲みでプロジェクト暴露大会やってるぞ。
罰ゲームでネタばらしとかもあったし。
守秘義務が機能してるなんて思ってるのはよほどのお人よしか馬鹿。
忠誠心なんて今時ありませんよ！

809 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/08 21:25

痛い会社だな

810 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/09 10:35

同期との飲み会なら多少はなすかもしれんが、
こんな誰が見てるかもわからない所で自分の研究内容話すか？
普通飲み会だろうが肝心なところは話さないと思うがな

811 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/11 13:12:24

まあ、会社のレベルによるだろうな。
どうせ大した成果に結びつかないだろう、と考えてる連中が多いとことか。
まあ、大学からしてみればどうでもよいことで、困るのは企業なんだけどね。
808は、ばーーーーーーーーーか。だと思う。

812 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/11 14:33:26

いい年して、飲み会で罰ゲームかよ。

813 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/28 00:06:04

等電点6.2のタンパクがpH6.0リン酸バッファー　陽イオン交換カラムに吸着するんです
しかも　しっかりと　0.4Mくらいの塩で落ちてきます
こんなことってあるんですか？

814 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/28 01:16:41

よくある。

815 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/28 20:42:54

>>813
その等電点の値は、アミノ酸配列からの計算値ですか？
もしそうなら、変成状態とnativeのタンパクの等電点は異なることが多いですよ。
計算値の等電点が6.2でも、nativeタンパクでは表面のアミノ酸によって等電点が決まますよね。
等電点付近でイオン交換に結合しても、不思議ではないですよね。

816 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/28 23:14:01

＞815　どうもです
トリプシンでよく切れる部位は塩基性の部位でした

こういうデータから信頼できる構造が分かるデータベースとかないですか？

817 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/02 15:03:14

>>813-816
そもそもタンパク質はそのpIより低いpHのバッファー中では
プラスに傾くと思うのですが…。
pI=6.2のタンパク質がpH6.0のバッファーで
陽イオン交換カラムにくっついても不思議はない。
だいたいそんなpIのタンパク質って、
DNAかRNAにくっつく奴でしょ。

818 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/03 01:16:23

>>813
なんでわざわざそんなことやってんの?
そのたんぱく質なら普通, まずは pH 8 あたりで陰イオン交換じゃないのかなぁ。

819 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/08 13:26:48

polyethyleneimine沈殿について教えてください。
硫安沈殿と何が違うのでしょうか？

820 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/08 14:03:34

>>819
polyethyleneimine沈殿は使ってたことあるけど何が知りたいの？
硫安沈殿でうまくいくなら、硫安の方が楽だよ。

821 ：819：04/10/10 10:23:13

>>820
おぉ、レスありがとうございます。
PEI沈殿の原理がいまいち分かりません。
PEIはポリマーですが、塩析と考えてよろしいのですか？
硫安と比べて、カオトロピック性はどうなのでしょうか？

＞硫安沈殿でうまくいくなら、硫安の方が楽だよ。
どういう点で、楽なのでしょうか？

822 ：820：04/10/10 15:18:29

>>821
Methods in EnzymologyのRNAタンパク関連のやつ（vol272～274あたり？）
に詳しい説明があった気がするのだが、前のlabに置いてきてしまったので
読み返せないんだよね・・・。昔読んだ記憶では原理はあいまいな記述だった
気がするんだけど自信がない。
PEI沈殿はもともと核酸結合蛋白質の精製に用いられていたはずで、主たる用途は
核酸と蛋白質の分離だったと思う。PEI沈殿が使いにくい理由を知っている限り
羅列すると・・・
・PEI溶液の粘度が非常に高く、パーセンテージの調節が難しい。
・沈殿に関するファクターがPEI濃度と溶液の塩濃度の２つに依存するため
　条件検索が難しい
・そのくせ、すっぱり分画できるわけでもなく、けっこうだらだら沈殿する
・PEI沈殿で得られた蛋白質からPEIを完全に取り除くためには、カチオンカラム
　か、硫安沈殿を行う必要があると考えられている
くらいかなあ。核酸と蛋白質を分けるだけだったら、結構すっぱり分けれる。
タンパク精製という観点からすると、粗精製なら使えるけれど、あまり微妙な
精製は難しいと思う。

823 ：819：04/10/11 10:49:13

>>822
まさにかゆい所をかいてくださるかのようなレス。
820さん、ありがとうございます。

824 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/12 22:25:24

タンパクを変性させずにプロテアーゼで切ると露出している部分だけがきれますか？
それだけ精製すれば露出部分が分かる気がするのですが

825 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/12 22:57:35

>>824

プロテアーゼの濃度を振って(切れるか切れないかギリギリの
ところから）、プロテアーゼ処理すれば、露出というか、立体構造上で
フレキシブルな領域が切断される可能性があるよ。
ドメインとドメイン間のリンカー部分とか。
ドメインマッピングとかでEntrezで検索してみ。

826 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 10:01:38

タンパク質の精製自身のネタではないのですが、Fcとの融合タンパク質を作って精製したいと考えています。
commercial availableなFc融合タンパク発現ベクターってうってますか？
バキュロ用ならあるみたいなのですが。。。

827 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 11:00:50

Fcは知らないけどZZ融合　proteinA融合ベクターなら無料で分与してもらえるよ
http://www.shigen.nig.ac.jp/cvector/cvector.html
確か、ここのデータベースにあったはず

Fcは哺乳類　酵母　大腸菌　全部でやられているから分与を申し込んでみてもいいかも
自分で作るなら　アミノ酸を少し変えるとproteinA結合量が増すので　やってみたらいいですよ

828 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 11:43:45

>817

>pI=6.2のタンパク質がpH6.0のバッファーで
>陽イオン交換カラムにくっついても不思議はない。
>だいたいそんなpIのタンパク質って、
>DNAかRNAにくっつく奴でしょ。

マイナスにチャージしたタンパク質がDNAかRNAにくっつくんですか？

829 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 13:07:01

酵素と基質の結合に関わる相互作用

電気的相互作用、イオン結合
疎水性相互作用
水素結合
ファンデルワールス力
金属イオンに対する配位子となることによる結合
etc

だから、酸性タンパク質が核酸と結合しても不思議でもない。

830 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 13:51:45

>だいたいそんなpIのタンパク質って、
>DNAかRNAにくっつく奴でしょ。

まあこれは明らかに間違いだ罠。
塩基性の蛋白ならそういうことも言えるが。

全体の電荷だけでは判断できないのも事実だが、
ならばなおさら酸性の蛋白質をDNAかRNAに
くっつく奴だろと言ってしまうのはおかしい。

多分塩基性と酸性とちょっと混乱したんだろう。
誰にだって間違いはある。

831 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 15:40:55

遺伝子配列から見ると思いっきり膜貫通領域みたいな配列があるんです
しかし　これは分泌タンパク　いったいどんな役割があるんでしょうか？
予想では一部が膜に結合し　残りを細胞内に導入していると考えているんですけど

832 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 16:56:16

おいおい、それを調べるのがあんたのテーマなんじゃ？

833 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 18:55:46

タンパク精製の先輩方、今から分泌タンパクを精製するとして、タグはFcでやるかHisでやるかどっちが皆さん好きですか？
もちろん物によって違うのは判ってますが、purityやprotocolの単純さ、値段から判断していただけませんか？

834 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 19:09:56

まあ　簡便さから言ったらHisだけど　EDTA混在では使えなかったりするし
一番いいのはFcの端っこにHisをつける

835 ：起原切れ助手：04/10/13 19:53:33

nativeのHis-tagはあんま好きじゃないな。
両方やって比較するのは嫌なの？

836 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 19:59:39

ありがとうございます。だれかが作ったマップも無い、インサート情報以外難の情報（サイトとか）も全くない、変なFcベクター
しかなく、しかもこの実験はちょっと教授や他のスタッフにはこっそり始めたい実験なんです。
だからおおっぴらに供与していただく事も出来ないんですよ。んで自分で「わけのわからないFcベクター」
からFcを引っこ抜いてきてたのsecretory vectorに埋め込まなきゃ行けないんですよね。
ちょっと面倒だったんです。
ほかの先輩方はどうですか？

837 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 20:05:24

エピトープタグならFlagかHAの方を勧めるけどなぁ。

838 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 21:28:50

私もFcやってますが酵母ではよく分泌されますよ　培地を硫安沈殿　透析
イオン交換という古典的な方法で精製してます

ちなみにあまり免疫とかミサイル療法には使えません（製薬屋に聞こう）
ただの発現安定化タグくらいというなら問題ないと思います

839 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/14 01:22:10

ところでFc使うのは何のため？　ただのタグ？
それともAPCに提示しようと思っているの？

しこたま論文あるから見ておいたほうがいいぞ

840 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/14 22:14:29

ZZとかDDのほうがよくね

841 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/15 02:44:57

えーと膜貫通型のレセプターは分かってるのですが、ligandは分かっていません。
同ファミリーのリガンドは別の膜タンパクなので、目的のレセプターのリガンドも
膜タンパクだと思っています。
そこで上記のようなタグ付き分泌たんぱくをとってきて、まずリガンドが組織の
どの部分に発現しているかみたいんです。

＞840
なぜですか？

842 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/15 04:09:37

TAP purificationってchaperoneがcontamiしてくるってきいたけど
ほんと？

843 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/15 08:15:19

うそではない
ATP入りのbufferでよくwashすると抜ける
そのあたりのやりかたはアマシャムのpGEXの
マニュアルに詳しく書いてあるので、やりかたを
まねるとよい

844 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/15 09:22:55

コンタミなのか、シャペロンの結合がなんらかの意味があるのか、
どうやって判断するの？

845 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/15 09:29:36

>841 目的が分からなかったものでね

それだったらFc融合でなくてもいいからGSTとか可溶化する発現系にして
FITCなんかでラベリングして　その後組織にふりかけて　蛍光を観察したら？

あとTwo-hybridとか
いろんなやり方があるから全部は説明できませんけど

846 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/17 13:40:41

ありがとうございます。
two-hyのようなライブラリー作成をするためには、発生のどのステージで、どの臓器で
発現するのかチェックしなければいけないので、そのための実験なんです。

タグ付き生成の方法としてはＧＳＴはイマイチ信用してません。結構でかくて他の酵素をし精製したとき
活性が全くなくなってしまったことがあったので。付加する側の末端がある程度フリーならいいのですが、
そういう情報もないので。。

皆さんありがとうございました。いろいろやってみます。

847 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/17 18:55:50

Hisタグ融合タンパク質をトロンビンで切断した後の分離精製を簡便に行いたいのですが、Hisタグ付きトロンビンてどこかにありますか？

848 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/17 19:36:29

うちにバクミドのコンストラクトがある。
欲しいか？

849 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/17 19:36:57

Novagenなら　トロンビン回収カラムとセットで売ってるよ

850 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/17 23:41:44

>>844
シャペロンの結合に何らかの意味なんかあるわけないだろう。
そもそも「シャペロン」という概念自体、一部の研究者の
妄想ないし宗教観がはいりすぎ。
あれは、フォールディングのゆるいたんぱく質にはもれなく
自動的にくっついてくる。

851 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 01:42:01

>850
> そもそも「シャペロン」という概念自体、一部の研究者の
> 妄想ないし宗教観がはいりすぎ。

詳しく。

852 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 09:38:41

>>850 フォールディングのゆるいタンパク質にもれなく自動的にくっついていることがシャペロンに対する反論になってるのか？

853 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 11:14:49

foldingに時間がかかるタンパクには
シャペロンが多く結合して、時間が余りかからない
タンパクにはシャペロンはあまり結合しないという
ことでいいの？

854 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 22:46:34

アルギニンとかいいのか？
グリシルグリシンっていいのかあ？

855 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 00:12:05

>>854
巻き戻しは周りに経験者いないなら止めとけと何度も言われてるよ。

856 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 02:02:26

>>852
なってるだろ？シャペロンは蛋白質を「巻き戻したり」「正しい立体構造を
とるのを助ける」ものだと思われていたし、いまだにそう思っている香具師は
多い。正確には（わざわざATP使ってまで）「出来損ないにくっつ」いたり
「出来損ないを安定化する」のが関の山だというのにな。
natively unfolded proteinという概念が提出・認知されたため、いままでのシャ
ペロン研究の1/3－1/2は嘘・誇大解釈・でたらめ・妄想だったことが、業界では
再認識されつつあるなあ。

857 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 02:15:42

native unfolded proteinについてもうちょっと詳しく解説願いたい>856

858 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 10:14:16

>>856 そりゃ言いすぎだろ。Cdc37とかFKBPなんとかとか、特定のタンパク質のフォルディングに必要なことが遺伝学的にも確認されている系もいくつもあるだろ。

859 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 13:09:30

>>857
８５６ではないけど。
native unfolded protein じゃなくて natively unfolded protein
もしくは intrinsically unstructured protein
どちらかの単語での古い論文（といっても１９９９年か）を読めばいいと思います。
（オレは上っ面しか知らないから、読んでみて。日本でも精力的にやっているグループがあると思うし。856のところとか。）

>>858
>遺伝学的にも確認されている系
むしろこっちを聞きたい。
ここはタンパク質スレなんだから「遺伝的に確認」と書かれても、、、

860 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 13:40:18

訂正
「遺伝学的に確認」と書かれても
　　　↑

861 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 14:25:36

>856
「巻き戻したり」するまで言ったらたしかに嘘くさいだけど、
「正しい立体構造をとるのを助ける」ならそのとおりだろ。

第一、「出来損ないにくっつ」く*fだけ*じゃフォールディングを助けられない。
(くっつくだけならATPのエネルギーはそもそも要らない)
ATPを使ってまでの安定化させるための機構の存在を、
「巻き戻し」と呼ぶ人が居てもおかしくないと思うがどうよ。

862 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 22:10:34

最新のNature Reviews/ Molecular Cell Biologyにこんな総説が載ってるよ。
Pathways of chaperone-mediated protein folding in the cytosol
Jason C. Young, Vishwas R. Agashe, Katja Siegers and F. Ulrich Hartl

863 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 09:16:59

確かに、最近妙に疲れると思ったら、
俺のタンパク質のmisfoldingが多くて、
シャペロンが勝手にATPをじゃんじゃかじゃんじゃか使うから、
いくら食べても追いつかないよ(w

864 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 09:34:37

それ究極のダイエット法として、どや？　尿素やグアニジンを食べる。

865 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 10:57:28

ウコン飲んだら肝障害起こして死ぬみたいね（爺さんばかりだけど）
代謝とか見たら面白いかもね

液クロで溶出するとき　NaCl濃度を上げるのと
バッファー濃度（1M リン酸バッファー）をあげるのどっちがいいの？
どっちでもいいとか・・　pHあげる人もいるけど

866 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 12:06:06

だいたい馬鹿で浅はかな発現はユダ

867 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 23:18:34

タンパクのisoformがあって分子量の差が30くらいしかない
どうやって2つの存在や発現量を示したらいいのでしょうか

868 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 23:38:22

>>867
ウェスタンで重なるの？元のタンパク質の分子量は？
まあ、SDS-PAGEの濃度で工夫するか大きいゲルを使うかだけど。

869 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 23:45:12

２次元展開してみな

870 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 23:59:36

等電点は予想ですが　9.21 9.23
分子量は19,250 19,280
遺伝子からみたら2つあるんですけど
発現しているか分かりません

871 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/22 00:02:24

違いを見込むようにプライマー設計して
RT-PCRやってみな

872 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/22 00:22:16

1塩基しか違わない　それが1アミノ酸変異につながる
こういうのが全部で3ヶ所くらいあります
末端1塩基だけ変えただけではプライマーはスルーしてしまうんですよね

873 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/22 00:39:19

それは本当にアイソフォームなのかな？

874 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/22 00:45:59

>>873
確かに。アミノ酸は一個平均110だから30ってのは小さすぎるよな。

875 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/22 01:04:51

それは単なる配列決定のミスかPCRのミスじゃないかな？
ゲノム上で別な遺伝子座にコードされているのならば（笑）
転写開始点を見極めるてみな

876 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/22 01:06:30

あ～日本語変だな　ミスタイプスマソ（笑）

877 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/22 01:34:38

見極めるぽ？

878 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/22 09:49:11

アミノ酸変異だからGluからAspへの変異だったら
分子量は147-133=14くらいだよね
合計したら差が打ち消しあって30くらいに落ち着くのでは

879 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/22 12:38:02

マスでもこいとけ

880 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/22 16:17:09

MSやったけどピークが重なりすぎて何とも言えない
mRNAレベルで２つは明確に区別できるんだがなあ（制限酵素で切れる、切れない）

881 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 11:57:14

分子量いくつ？
２万や３万の分子量ならば30も違っていれば
別ピークとして見えると思うが。。。
もしダメならば、guanidine存在下、還元アルキル化、
トリプシン消化して、変異が入ったフラグメントのMSピーク強度を
比較する。

882 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 11:58:56

>>870に書いてあったね。スマソ

883 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 12:03:24

>>880
>>MSやったけどピークが重なりすぎて何とも言えない

サンプル中にその２つのタンパクしかないならば、２つのピークとして
完全に分離すると思うが、夾雑タンパクがあるとそうはいかないかもね

884 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/31 03:46:48

横着しないで光ピンセットで１分子づづ分離しろよ。

885 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/31 04:45:15

そんな方法で1分子づつ分離できるならノーベル賞ものだな。

886 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/31 09:43:02

ばいおらっどのCHTカラムって使ったことある？
elutionがめんどくさそうだけどいろんな分離に使えそうな気が

887 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/31 14:23:25

光ピンセットで大腸菌を一匹ずつ捕まえて迷路遊びする研究室もある。

このラボは金も在るし、指導力もある良い先生なのでやる気の在る熱心な院生
ならhappyなんだな。

888 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/31 14:45:25

881の方法がいいと思います。
MSのピークエリアで正確に存在比を出すことはできませんが、
２種類存在するかどうかには答えがでるでしょう。
アミノ酸配列が推定できるのであれば、
変異部位を含むペプチドを得るために適した
ペプチターゼも選択できると思います。

889 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/01 07:50:04

>>886
使ったことあるけど、何か聞きたい？

890 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/03 23:54:43

駄目って聞いたけど本当？

891 ：889：04/11/04 12:24:01

>>890
駄目ってことはないよ。不便に感じるのは、ゲルに対する親和性についての目安がないので
（例えばイオン交換に対するタンパクの等電点）、吸着するかどうかは一度カラムに乗っけて
みるまでわからない。ゴミタンパクと目的タンパクの分離も、乗っけてみるまでわからない。
吸着量も少ない。
メリットは、イオン交換やゲル濾過で分離できないタンパクが、もしかすると分離できるかも
しれないと言う点と。たまにハイドロキシアパタイトにやたら高い親和性を持つタンパク
もあるので、その場合は一発で精製できるかもしれないというくらいかな。
基本的にはどうしても単離できない時の最終手段じゃないかなあ。

892 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/06 13:02:12

当電点がわからないタンパクだとイオン交換どっちつかったら
わからないけど、CHTなら薄いリン酸bufferからグラジエントやれば
とりあえずつくのでそこは便利。
リン酸bufer系でやると両性イオン交換のようにほぼ使える。
Caがやや金属アフニティーをもつのでヘムタンパクなどは溶出が
遅れ気味になる。
逆に言えば塩ナトとリン酸bufferでは全く違った分離モードになる。
酵素なんかはイオン交換でできなかったものがCHTでできたとよく聞く。
来年アパタイトの教科書大御所に書いてもらうからちょっとまてYO

893 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/08 01:16:00

>>892
たとえばアプライバッファーにリン酸をいれておいて、eluteは塩濃度
で行うっていうのもありかもな

894 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/08 11:56:48

>893
NaClとリン酸のダブルグラジエントでエンドトキシンの除去
が効率よくできるとかいてあった希ガス

895 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 11:04:43

質問。
家庭でグラムスケールの精製をしようとしたら、やっぱりカラクロでいいのかなぁ？

896 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 20:52:23

4畳半に　ファーメンターをおいて
隣にアマシャムのマシンをおけば？

897 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 06:47:38

CNBrを使ってafinity columでbindng タンパクの精製をやっているんですが、
溶出の条件で、0.01%の三フッ化酢酸を使えと文献に書いてあるんですが、
これって、三クロロ酢酸(TCA)もかまわないんでしょうか？

898 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 10:28:21

>>895
洗濯機の脱水機能をつかって硫安沈殿で遠心分離

899 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 10:30:07

>>897
TFAにしておくべきだとおもうぞ。
そういう精製をしたあとは普通は逆そうHPLCとか
マスとかにかけるだろ？
TCAは揮発性じゃないがTFAは凍結乾燥でかなりのところ
除去できるし、逆そうや、TOF-MASS条件にも向いている。

900 ：897：04/11/13 11:44:28

>>899

早速のご丁寧なレス、大変ありがとうございます。
実は、溶出した後、すぐに10-20%TCAで溶出タンパクを沈殿させて、
これをPageに流して、Mass-specにかけるつもりなのです。
こういうケースでは揮発させる必要がないので
TCAでもかまわないんでしょうか？

901 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 11:58:58

>>897
SDS-PAGEにかけるためだけの変性状態での
蛋白質濃縮だったら、俺はふつうは
TCA沈殿よりもクロロホルムメタノール沈殿を使う。
TCAの塩が残っているとTOF-MASS飛びにくいからから・・
もちろん、逆そう樹脂入りマイクロチップみたいなも
のをつかえばいいのだけど、コストかかるし。

ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=6731838

902 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 12:08:02

クロロホルムメタノール沈殿のやりかたについて
元文献古すぎてネットで読めないだろうから書いておきます。
元文献が入手できたら、ぜひご参考にしてください。

１．塩やdetergent入りタンパク溶液100 uL
２．クロロホルムを100uL入れてボルテックス20秒
３．そこにメタノール400uL入れてボルテックス20秒
４．そこに水を300uL入れてボルテックス一分
　　４．で白濁する。
５．それを遠心する。室温のほうがいい。チビタンで5分くらい
二層にわかれて目的蛋白質は、クロ層と水層の界面に浮く
上清だけをとって捨てる。界面の上、水層は50くらいのこしてよい
６．そこにメタノール300ulを加える　一層になる
７．それを遠心する　こんどはクロメタ層をすべて注射針などで
　　とって捨てる
８．電気泳動にかける前に沈殿を風乾する　～10分？
　　かわかしすぎないこと。沈殿が硬くなりすぎる。
　　メタが乾ききっていないと、SDSサンプルバッファで
　　アプライしたときに電気泳動で浮いてきてしまうので注意。

検討を祈る　オーヴァー

903 ：897：04/11/13 14:23:56

詳細なプロトコールまでいただき、大変ありがとうございます。
早速試してみます。
２ｃｈが、こんなに役立ったことはありません。
実験がうまくいき、ペーパーになった暁には
Aknowledgementに、Dr. 901=902として
謝辞を述べさせていただきます。

904 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 14:28:35

901と902の所属はどうするの？

905 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 18:50:15

>>904 901と902の所属はどうするの？

2ch

906 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 21:17:12

We acknowledge the men inside 901 and 902.

907 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 23:34:16

>908
君、paper書いた事あるのか？

908 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 23:35:55

あるよ。一番好きな雑誌は"Protein Expression and Purification"だよ.

909 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 23:51:46

なかの人なんかいない

910 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 00:52:22

>>908

あの汚いGelの写真が載ってる雑誌ですか。。。
yield tableと。。
IFどのくらいなの？

911 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 01:08:07

実は俺もProtein Expression and Purificationに出しました
IFは1.4くらいです　マニアックですよ
でも審査はしっかりしてます

個人的にはBiotechniquesが好き

912 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 11:19:21

>>あの汚いGelの写真が載ってる雑誌
わかってないなあ
　＃＃　精製の雑誌だから、精製前が汚ければ汚いほど
　＃＃　ものが見えなければ見えないほど、ポイントが高いのさ
　＃＃　もとからきれいなものの精製なんて誰でもできるじゃんか
レビュワーが丁寧なのも特長だよね
一度投稿するとものすごく勉強になるよ

913 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 18:48:53

>>912

そうなのか？ゲルの写真の解像度、大きさともに冴えない
感じなんだけどな。
内容以前に作りこまれて無いという印象。

なんか、構造屋が結晶でなくて、取り敢えずこの雑誌に
という感じなのだが。

914 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/15 00:55:20

So what?って論文が大半じゃないの？
精製するのは結構だが、何のためにやってんだオイオイっていう。

精製屋の自己満足ならチラシの裏にでも書いてろ(AAry
とまでは言いすぎだが、それに近い印象だなー。

915 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/15 01:00:23

精製後にちゃんと意味がある結果がでたんなら、
普通にJBCとか載せるだろ。

916 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/15 21:16:01

Spo11の発現精製が載ってた。。。
これはすごいかも。ySpo11だけど。

917 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/15 23:27:37

精製に苦労した場合には、せめてもう一方書きたいという欲求が精製屋から巻き起こっても、それはそんなに不思議ではないとおもうよ

918 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/16 00:27:19

>>917

大変なことを何も無かったことのように数行の文章で完結するのが
トップジャーナルの載せる美学だと思ってるんだけど、だめかな？

919 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/16 01:34:46

ケースバイケースじゃないかな？　他のグループが追試できなかった
場合、下手すると捏造ギワクを科せられるだろ～。書くべきことは
ちゃんと書くべきだし、スペースが足りなければ二報に分けるのもよいかと。

920 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/20 12:41:14

実際にはProteins > Protein Science > Protein Eng. Des. Sel > Protein Exp. Pur.
の順なのですが。

921 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/20 13:34:01

>>920
うーん、頑張ってJBCの方がいいね。

922 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/20 13:37:11

ここは蛋白精製のスレです。

923 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/20 13:40:32

>>910-921　空気嫁

924 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/21 00:48:26

まあ、関係あるといえば関係あるんじゃないか。

925 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/21 23:07:37

con Aカラムの原理を教えて下さい。
なんかマンノースとかの糖に吸着するらしいけど、何でですか？
よろしくお願いします。

926 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/21 23:33:38

レクチンだからだろ～？
レクチンちゅう、一群の糖にくっついちゃう蛋白のグループ
があってさあ　コンカナバリンAちゅうのがその代表格なんだろう？

927 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/22 07:12:06

レクチンと相互作用があるというのは分かります。
分からないのは、なぜそのレクチンとマンノースが相互作用するのかって所です。
どういった作用でくっつくのか、もし、お知りでしたらもう一度教えて下さい。
よろしくお願いします。

928 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 02:26:32

蛋白質が糖を認識するのの一般的なルールは
水素結合と疎水的相互作用だとおもうよ

Con Aとマンノースは、複合体の立体構造が出てたと思うんで、
それを見れば一目瞭然なり

929 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 09:56:46

ありがとうございます。
立体構造で認識しているのですか。
当方、何か特異的な官能基だけ（例えば、水酸基を認識しているとか）を認識していると思っていました。
立体構造の複合体を作るということは、
酵素と基質みたいに「鍵と鍵穴」の関係にあるということになりますよね。
ということは、ＣｏｎＡは、分子の形で認識しているのですね。
なんとなく、分かったような気がします。
本当に、ありがとうございました。

930 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 11:50:17

>>929

うーん,>928ではないが、蛋白質が化合物を認識する場合、
微視的にはチャージであったり、疎水性パッチを認識している
と考えるのが一般的だね。(ただ、認識するという言葉は
蛋白質の擬人化を少なくとも含んでいるので、この用語を
使うには注意が必要。特に分子生物学をやってるかた。)

特異性というのも、確率論で議論するべき事例もすくなくとも
あるからね。

931 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 13:16:53

>>930
「認識する」以外のあたりさわりのない言い方ｷﾎﾞﾝ
英語のままでdistinguishとかrecognizeとか言うべき？

「折りたたむ」と「折れたたむ」の話を思い出したよ

932 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 15:09:44

>>931
認めるから意思が出てくる。
識別で良いんじゃない。

933 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 18:05:46

とりあえず
ttp://www.seikagaku-hit.com/bio/02tech/a04_hone/lec.html
いろいろ

934 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 17:00:28

現在、Trcプロモーター下流に目的遺伝子をN末にHis-tagと連結後、XL-1Blueで発現
誘導。２５℃で誘導し、およそ半量が可溶性に行くことを確認（発現量は低め）。
Niカラム一発では銀染で単一バンドにならない為、Niカラムの前にイオン交換（１ml
お試し版）に通したのだが、付くには付くのだがどうにも回収率が悪すぎ。
Niカラム→透析→イオン交換とするのがいいのかな？。
一応、平行してpET+BL21DE3も作成中。

めちゃめちゃビギナーで申し訳ないんですが、先輩方、サジェスチョンをお願いします。

935 ：名無しタンパク質のリコンビナントさん：04/12/04 17:16:09

Niカラム→透析→イオン交換

が普通だろ。Niカラムだけで単一バンドまで持って行けない。
バッファー交換は透析以外の方法でもいいんだが。

936 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 17:30:55

Niカラム使用時の洗いがゆるいんぢゃないか？

1M NaClとかでがんがん洗うとか、5-10mM イミダゾールをそれに
加えておいて、Hisリッチな関係ないタンパク質など非特異的な吸着したものを洗い出しておくとか。

937 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 20:44:45

5mMイミダゾール入れただけで目的の6xHis-taggedタンパク質の結合が1/3に！何で？？？

938 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 21:33:03

へたくそ、うまくいくまで繰り返せ

939 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 21:38:26

>937
サンプルに10mMイミダゾール入れとくんだよ。それからカラムの平衡化はちゃんとやってるの？
Ni-NTA→イオン交換が定石だが....誰か経験者に見てもらわんと失敗するだろうなぁ。

940 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 21:43:50

いやさ、そのくらいは分かってるつもりなんだけどな。
イミダゾール抜きの条件でNi-NTAにロードしたらノンスペのバンドが
出たもんだから、おまじないだと思って入れたのよ。そしたら急に
目的のバンドも結合が下がった。6xHisってその程度の濃度のイミダ
ゾールで競合されちゃうの？それとも末端削れてHis-tagが短いとか？

941 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 21:47:39

経験上5mMイミダゾールでHis6が落ちたことないなぁ。
N末端のフォールディング次第だろうけどNi-NTA→イオン交換でやったほうが早いんじゃネーノ?

942 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/06 20:21:40

943 ：& ◆HsAdOdHy/I ：04/12/08 23:29:07

基本的な質問なんだけど、
SDS－PAGEで分離した後、WesternBlotして、
その後、ゲルをクマシーなんかで分離することはできるの？

944 ：いえい！：04/12/08 23:31:18

タンパク質化学式教えて（　´,_ゝ｀）

945 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 00:44:01

Hisx6タグ付タンパク質が旨く精製されない場合、立体障害でNiカラムに
付かない可能性がある。その場合、六M尿素もしくは６Mグアニジン塩酸で変性した条件でカラムにかけるとよく吸着する場合がある。

946 ：943：04/12/09 02:48:50

>>944
長いべ。
NH2-CH(R)-CO-NH-CH(R)-.....-CH(R)-COOH

943の質問も宜しく！

947 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 03:07:28

>>943
質問の意味がわからんべ。
ブロット後のゲルをクマシーでどうしたいんだ？

948 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 05:03:37

＞＞９４６　申し訳ない書き間違えました。クマしーで
染色することはできるのという質問でした。

勘違いが会ったら教えて欲しいんだけど、
くましって全部のタンパクに染色するんだよね。
一方ウエスタンは固定化した抗体にだけくっつくので、
ウエスタンで見えないバンドはクマシーで見るのだと思った。

SDS−パゲで分離　ウエスタンで膜にトランスファーしてみる
SDS−パげで分離　ゲルを染色してバンドをみる
の２通りがあるんだよね。

949 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 05:45:37

>>943
何が言いたいのか良くわかんないけど、
メンブレン上でも染色できるよ。バックが消え辛いけどね。

950 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 11:09:10

>>943
ウェスたんでみえないバンドはどんなのがあるのかしりたいと。

1.同じサンプルを普通にPAGEして普通に銀戦
2.ブロットされたモノで抗体によって染まらないのを見たいとすると
　蛋白量がシングルバンドで100ngを下回るときは銀戦上回ればクマシー

でどうでしょう。

951 ：943：04/12/09 14:09:27

>>949,950
ありがとうございます。
よく考えたらウエスタンしたときに
タンパク質は膜に移動して、アクリルアミドゲル
にはもはや残っていないんだね。
よく知らないのでわかりづらくなって悪かったべ。

952 ：名無しタンアパク質のリコンビナントさん：04/12/09 14:58:51

トランスファーがどれぐらいの効率で行ってるか気になって、トランスファー後のゲルを染めることもあるな。

953 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 15:08:53

ここも自演スレかｗ

954 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 15:32:49

どこが自演なのか皆目検討つかんが。
一匹、二匹、ちょっと抜けたヤツがいて、みんなでわいわいやっているだけでしょう。

955 ：M1：04/12/10 00:24:54

明日Hi-Five買うから勉強しといてって教授に言われたんですが経験が少なくて...メーカーのプロトコールに載っていなくて初心者が失敗しやすい点があったら教えていただけないでしょうか？教授が気性が荒いので失敗は許されないんです。

956 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/10 18:44:16

ひぇ～。
XL-1Blueで発現させたらWBで1本しかバンドでないのに、
BL21に入れたら2本になった。

957 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/11 22:42:41

ミリポア社のMatrex Red Aについて教えて下さい。
現在、調べたところこの樹脂は、アフィニティーに分類され、樹脂の構造まで分かりました。
が、何の要因で吸着するのか？（何を特異的に吸着しているのか？）が全く分かりません。
どんな情報でもいいので、知っている方がおられましたら、書き込みをよろしくお願いします。

958 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/12 01:48:55

>>957クマしー吸着

959 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/12 17:54:56

クマしー吸着って何ですか？
今日、図書館行っても分かりませんでした。
ネットでもゼロ件でしたし。

960 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 09:20:46

現在、GST融合タンパク質の精製を行なっています。
Thtombinで切断後、BenzamidineによりThrombin除去を行ないましたが目的タンパク質もBenzamidineに結合してしまいました。
切断後にSDS-PAGEにより目的タンパク質は確認しているので、Thrombin除去に問題があると考えております。
そこで、Benzamidine以外でのThrombin除去の方法をお教えいただけないでしょうか？

961 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 13:52:04

だれにも聞けないのでどなたかお答え下さいm(_ _)m

lysyl endopeptidaseであるペプチドを切断するのですが

そのペプチドの試料とlysyl endopeptidaseのモル比が１：１００
になるように加えたあと。。。

と書いてあります。モル比ということはどういうことでしょうか？
またその求め方をどなたかおしえてください。

962 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 14:20:37

モル計算知らないわけじゃないよね?

参考
　モル数＝試薬の重さ／分子量
　モル比＝試薬１の重さ／試薬１の分子量　：　試薬２の重さ／試薬2の分子量

ところで試料とモル比１：１００じゃなくて１００：１じゃないの？

963 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 15:39:56

モル計算知らないんだろうよ。

>>961
乱暴に考えて、酵素だから１個有れば１００個切れると考えれば、答えはわかるだろう。
わからなかったらやめちまえ。

964 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 15:41:51

GST-fusionのことはくわしくないけど、ゲル濾過やイオン交換ではだめなんかい？

965 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 16:24:10

>>964 は >>960 へのレス

966 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 10:03:43

>>964
目的タンパク質の分子量がThrombinとほぼ同じであるため、ゲルろ過は無理なんですよ。。。
何かいい方法はないのでしょうか。。。

967 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 19:38:41

>>960
タグ無しで発現-->Benzamidineで精製

968 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 20:11:34

>967
それでいいと思う。
ただし、カラム内でアグっているのをBenzamidineにくっついてると勘違いしていたら
あとは言うまい。

969 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 21:57:55

俺ならイオン交換一発
酵素の微量な残りも気にならないし。

970 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 11:52:35

967
タグ無しだと、目的タンパク質が活性を持たないのでだめなんですよ。
だから、GST fusionでやっているんですよね。。

968
8M Ureaで溶出を行なったら、目的タンパク質とThrombinがようしゅつされましたので、アグっている訳ではないとおもいますよ

971 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 19:05:11

>>970
とりあえずbenzamidineカラムに通すバッファーにNaClを大量にいれとけ
詳しくはマニュアル嫁

972 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 19:54:53

>>960 = >>970
968さんのため息が・・・

タグ無しで活性ないなんて…アグってるんでしょ、その段階で。
GSTつけて活性出るの…ナニユエそれを切り捨てちゃう？

ureaで溶出…変性すればアグってても溶け出てきますよ。
aminobenzamidineとかでやってください・・・

973 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 21:05:44

単純にbenzamidineカラム担体がプラス荷電をもっているので陰イオン交換カラムと同じ働きをしているのでは？

>>971が1M　NaClを入れろ、というのは正解

974 ：961：04/12/18 22:21:03

>>962さん>>963さん

私はB2のアホ学生です。
お返事ありがとうございます。
ラボの何人かに聞きましたが、「Lys-Cの分子量がわからないから」
ということで現在必死にしらべております。

wakoのカタログには２AUと力価しか書いておりませんでした
どなたかLys-Cの分子量を教えてくださいm(_ _)m

975 ：968：04/12/18 22:43:42

>972
フォローありがと。

960は何をしたいのかわからんのだが・・・
活性云々抜きでタグ切りたいってことは構造解析か？
GSTならpGEX6Pのほうにのっけて、Prescissionプロテアーゼがベストだと思うが。
それならプロテアーゼがGST融合だからカラム一本だべさ。

976 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 22:47:11

wako のプロダクトインフォにかいてあるぢゃん

977 ：961：04/12/19 02:22:20

>>976
どこでしょうか・・みつかりません・・

978 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/21 10:00:08

>960
この間のフナコシニュースにビオチン化トロンビンというのが載っていたけど・・・
アビジンビーズでトロンビンが除けるとかいうやつ。

979 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 03:41:51

すれ違いかもしれんが・・
エリスロポエチンとGCSFの等電点っていくらだったっけ？？

980 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/26 11:38:51

すごく基本的なんですが…

硫安沈殿で沈殿した奴は透析で100%溶けますか？
液量少なくしたいから、できるだけ透析はしたくナインだけど、酸でもアルカリでも
溶けないんだ…

981 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/26 13:12:20

硫安で沈殿したタンパク質って水とか塩無しのバッファを少し入れれば溶けるでしょ。
硫安沈殿の原理から考えれば。

982 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/26 22:37:59

沈殿・・・100%は溶けないな・・・(;´_ゝ｀)
透析しても、溶けない奴はあるね。

983 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/27 01:42:54

変性モードだから・・・
アセトン沈殿がよくね？

984 ：980：04/12/27 09:37:50

>透析しても、溶けない奴はあるね
やっぱり…
ありがとうございます。またいろいろ試してみます。

985 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/27 09:53:33

六ﾓﾙ尿素で溶かして透析しる

986 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/27 11:48:26

変性させてどうするんだ。
変性させないところが硫安沈殿のいいところだと思っていたのだが。

溶けない部分って本当に必要なものなのか？
硫安を抜いて再溶解して来た部分だけを使う、溶けない部分は使わないでは行けないのか？

全然溶けないっていうんなら、話は別だけど。

987 ：980：04/12/28 09:27:02

>>986
結局それでＯＫでした。