大腸菌の発現についておしえて。
79 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/22 14:02
関係ないでしょうが、大腸菌用の1%グルコースの培地というのはどうやって・何の目的で
作るんでしょうか？
作るんでしょうか？
80 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/22 14:05
145 ：名無しさん＠お腹いっぱい。 ：02/09/13 16:20
とある番組のドッキリ企画で、ユンソナの楽屋を隠しカメラで撮影していたところ、
ユンソナが突然オナニーしはじめて、その企画がボツになったのは結構有名な話。
とある番組のドッキリ企画で、ユンソナの楽屋を隠しカメラで撮影していたところ、
ユンソナが突然オナニーしはじめて、その企画がボツになったのは結構有名な話。
（＾＾）
（＾＾）
83 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/17 03:54
84 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/18 20:44
ストックオプションもらいました!
（＾＾）
（＾＾）
87 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/18 22:31
よかったね！
88 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/19 03:56
OriCプラスミドってゲノムと行動をともにするの？
細胞内には1コピーしか存在しないの？
知っている人がいたら教えて下さい。
細胞内には1コピーしか存在しないの？
知っている人がいたら教えて下さい。
∧＿∧
（ ＾＾ ）＜ ぬるぽ（＾＾）
（ ＾＾ ）＜ ぬるぽ（＾＾）
90 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/10 03:42
sacB遺伝子をTAクローニングしたら大腸菌が生えてこなかったひといますか？
91 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/12 09:55
漏れまくリィィィィィィー！
つうか1%グルコース入れた培地でオーバーナイトしたプレカルチャーが
一番目的タンパク溜め込んでた。Cmが死んでるのか？
つうか1%グルコース入れた培地でオーバーナイトしたプレカルチャーが
一番目的タンパク溜め込んでた。Cmが死んでるのか？
92 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/18 23:05
Cmはそう簡単に死なないぞ
気になるなら濃度あげてみたら？
気になるなら濃度あげてみたら？
93 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/19 00:17
ド素人でつ 質問がありまして書き込みます タンパク発現するとき､大腸菌に対して､発現した産物が毒性を持つのはどんな時なんでしょうか？それを予測できたりしますか？発現今後したいんですが､そいつがどんな方法しても発現できないって言われてるらしくて･･･
94 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/19 03:16
>>93
理由は色々あると思うけど
発現させたタンパク質が
内在性の生存に必須な因子を阻害する可能性
なんかが考えられる。
他の生物種のもの発現させるんだから
普通は起こらないけど、時に起こる。
過剰発現系ならなおさら
あとはフォールディングしないタンパク質発現したら
それだけでtoxic
理由は色々あると思うけど
発現させたタンパク質が
内在性の生存に必須な因子を阻害する可能性
なんかが考えられる。
他の生物種のもの発現させるんだから
普通は起こらないけど、時に起こる。
過剰発現系ならなおさら
あとはフォールディングしないタンパク質発現したら
それだけでtoxic
95 ：sage：03/05/19 03:54
1クリック10円で仕事あがりに2ちゃんねるにリンクを貼り付けるだけで・・・
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96 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/19 21:26
植物による発現の方法が開発されたそうですが、詳細をご存知の方おられますか？
昨日の日経に載っていたそうです
昨日の日経に載っていたそうです
97 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/21 00:16
>>94
インクルージョンボディーがtoxicってことですか？？
インクルージョンボディーがtoxicってことですか？？
98 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/21 01:28
んなこたあない
inclusion bodyにいくお陰でガンガン発現する蛋白質はなんぼでもありまっせ
inclusion bodyにいくお陰でガンガン発現する蛋白質はなんぼでもありまっせ
99 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/21 07:43
lacIqってクマシー染色で見えますか？
ベクターによっても量が違うんでしょうか。
IPTG添加後になくなるバンドがあるのですが……
ベクターによっても量が違うんでしょうか。
IPTG添加後になくなるバンドがあるのですが……
━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―
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102 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/07 21:41
EGFP-tagの大腸菌用発現ベクターを、まずプラスミドを増やす目的で振ったらペレットが緑色だった。
漏れ過ぎ。
漏れ過ぎ。
103 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/08 20:57
ヘルプです。大腸菌（BL21)で発現させて、ちゃんと目的蛋白だけを認識する抗体で
うえすたんしたら、ちゃんとした分子量プラスアルファ上下に同じように反応するバンドが
現れとります。単に抗体のばっく？でもこれって・・。分解で分子量が減るならまだしも、増えるって
しかも、多量体状態までじゃなくって、ほんのちょこっと増えるってなんなんだ？
くうううううううう。
うえすたんしたら、ちゃんとした分子量プラスアルファ上下に同じように反応するバンドが
現れとります。単に抗体のばっく？でもこれって・・。分解で分子量が減るならまだしも、増えるって
しかも、多量体状態までじゃなくって、ほんのちょこっと増えるってなんなんだ？
くうううううううう。
104 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/08 21:06
106 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/08 21:19
107 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/08 21:36
GFP＝緑色蛍光蛋白
緑色蛋白にあらず、、というところか？
緑色蛋白にあらず、、というところか？
108 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/08 21:41
リークィー？？？なに？そんなことあるんだ！
チェックしてわかるもんなんだろうか？
チェックしてわかるもんなんだろうか？
109 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/08 22:27
__∧＿∧_
|（ ＾＾ ）| ＜寝るぽ（＾＾）
|＼⌒⌒⌒＼
＼ |⌒⌒⌒~| 山崎渉
~￣￣￣￣
111 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/13 02:05
バクテリアの遺伝子破壊についていい文献があったら教えてください。
112 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/13 02:34
>>106
手元の観察結果は、102、109の報告が正しいことを示しているぞ。
pEGFPにサブクローンして形質転換した時、セルフライゲーション
したプラスミドが入ったコロニーはよく観察すると、うすい緑色
であることに気づくが、目的のインサートが入ったコロニーは白色
のままなので、スクリーニングのコロニー選択に利用できるぞ。
手元の観察結果は、102、109の報告が正しいことを示しているぞ。
pEGFPにサブクローンして形質転換した時、セルフライゲーション
したプラスミドが入ったコロニーはよく観察すると、うすい緑色
であることに気づくが、目的のインサートが入ったコロニーは白色
のままなので、スクリーニングのコロニー選択に利用できるぞ。
113 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/13 02:44
>>111
グラム陰性菌かグラム陽性菌か、それとも抗酸菌か？
詳細きぼ〜ん。
ってゆ〜か、PuB-Medで検索してみなはれ。
・Molecular Microbiology誌
・Journal of Bacteriology誌
・Infection and Immunity誌
あたりに、参考文献ありまへんか？
グラム陰性菌かグラム陽性菌か、それとも抗酸菌か？
詳細きぼ〜ん。
ってゆ〜か、PuB-Medで検索してみなはれ。
・Molecular Microbiology誌
・Journal of Bacteriology誌
・Infection and Immunity誌
あたりに、参考文献ありまへんか？
114 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/13 11:15
>>113
グラム陰性ですが、なにかベクターを使ったほうがいいのか裸のDNAでいいのか比較した実験でもありますか？
グラム陰性ですが、なにかベクターを使ったほうがいいのか裸のDNAでいいのか比較した実験でもありますか？
115 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/13 14:02
>>113
方法を比較したような文献は、今まで見たことがありません。
どのような方法で、どのような欠損株を作製しようとしているのでしょうか？
それと裸のDNAというのは、目的遺伝子断片そのもののことでしょうか？
ちなみに通常の相同組換えの場合、
野生型の目的遺伝子を含む断片を、親株では複製できないようなベクターに
クローニングして、内部に挿入か欠失の変異を入れた変異型アリールを作製し、
それを親株に形質転換させます。
形質転換されたDNAと染色体の間での相同組換えが、変異の５’側と３’側で
一回づつ起こると野生型アリールと変異型アリールが置き換わるので、
そのような株をスクリーニングして分離します。
用いたtargeting vectorですが
（１）環状のまま形質転換した場合、２ステップのスクリーニング
をすることになります。
（２）線状にして形質転換した場合、１ステップのスクリーニング
で済みますが、変異株がとれる確率は（１）よりかなり低くなります。
方法を比較したような文献は、今まで見たことがありません。
どのような方法で、どのような欠損株を作製しようとしているのでしょうか？
それと裸のDNAというのは、目的遺伝子断片そのもののことでしょうか？
ちなみに通常の相同組換えの場合、
野生型の目的遺伝子を含む断片を、親株では複製できないようなベクターに
クローニングして、内部に挿入か欠失の変異を入れた変異型アリールを作製し、
それを親株に形質転換させます。
形質転換されたDNAと染色体の間での相同組換えが、変異の５’側と３’側で
一回づつ起こると野生型アリールと変異型アリールが置き換わるので、
そのような株をスクリーニングして分離します。
用いたtargeting vectorですが
（１）環状のまま形質転換した場合、２ステップのスクリーニング
をすることになります。
（２）線状にして形質転換した場合、１ステップのスクリーニング
で済みますが、変異株がとれる確率は（１）よりかなり低くなります。
116 ：115：03/07/13 14:04
>>114ですた。スマソ。
117 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/13 17:09
有難うございました。単に機能欠損株をとりたかっただけなので、PCRで増幅した断片をエレクトロポレートするだけでいけるかなあと思ったのです。環状で導入した際２ステップのスクリーニングが必要とは具体的にはどういうことでしょうか？
118 ：115：03/07/14 02:06
>>117
野生型のアリールを増幅して、そのまま形質転換する、ってことですか？
その方法で変異を導入できる理屈がわからないのですが・・・？？
相同組換えによる変異導入では、変異部位の両サイドでそれぞれ１回、
計２箇所で相同組換えが起こらないと入れ替わりません。
しかし、線状のまま導入すれば、１ステップで、これら２箇所で同時に
相同組換えが起こったクローンがとれますが、相当低い頻度になります。
そこで、環状のままで２回のスクリーニングを行う方がより確実で、常用
されています。
野生型のアリールを増幅して、そのまま形質転換する、ってことですか？
その方法で変異を導入できる理屈がわからないのですが・・・？？
相同組換えによる変異導入では、変異部位の両サイドでそれぞれ１回、
計２箇所で相同組換えが起こらないと入れ替わりません。
しかし、線状のまま導入すれば、１ステップで、これら２箇所で同時に
相同組換えが起こったクローンがとれますが、相当低い頻度になります。
そこで、環状のままで２回のスクリーニングを行う方がより確実で、常用
されています。
119 ：115：03/07/14 02:06
>>117 （続き）
＝＝＝目的変異遺伝子を環状プラスミドで形質転換した場合＝＝＝
＜１ステップ目＞
変異を導入した部位の５’あるいは３’領域で、染色体との相同組換えが
起こると、プラスミドの全領域が一旦、染色体上に組込まれます。
プラスミドの有する薬剤耐性を指標にして、ポジティブセレクションします。
プラスミドの複製起点は、この宿主細胞内で機能できない（注１）ので、
この時点でプラスミドが染色体に組込まれたクローンのみが選択できます。
従って、このクローンの染色体上では、元々存在する野生型のアリールと、
プラスミド由来で持ち込まれた変異型のアリールがタンデムに連なった状態
で存在することになります。
＜２ステップ目＞
次にこのクローンを選択薬剤のない培地で培養します。すると、ある頻度で
変異部位の５’か３’のどちらかで相同組換えが起こり（注２）、プラスミド
の領域が染色体上からドロップアウトします。
この目的のクローンは薬剤耐性を失っていますから、薬剤の入ったプレート
と入っていないプレートに整列ライブラリーをつくり、薬剤感受性になって
いるクローンをネガティブセレクションします。
（注１）このようなベクターを自殺ベクターsucide vectorといいます。
（注２）最初の相同組換えと同じ側で起こると変異型アリールがドロップし
元の株に戻り、反対側で起こると野生型アリールがドロップし、
変異が導入される。
＝＝＝目的変異遺伝子を環状プラスミドで形質転換した場合＝＝＝
＜１ステップ目＞
変異を導入した部位の５’あるいは３’領域で、染色体との相同組換えが
起こると、プラスミドの全領域が一旦、染色体上に組込まれます。
プラスミドの有する薬剤耐性を指標にして、ポジティブセレクションします。
プラスミドの複製起点は、この宿主細胞内で機能できない（注１）ので、
この時点でプラスミドが染色体に組込まれたクローンのみが選択できます。
従って、このクローンの染色体上では、元々存在する野生型のアリールと、
プラスミド由来で持ち込まれた変異型のアリールがタンデムに連なった状態
で存在することになります。
＜２ステップ目＞
次にこのクローンを選択薬剤のない培地で培養します。すると、ある頻度で
変異部位の５’か３’のどちらかで相同組換えが起こり（注２）、プラスミド
の領域が染色体上からドロップアウトします。
この目的のクローンは薬剤耐性を失っていますから、薬剤の入ったプレート
と入っていないプレートに整列ライブラリーをつくり、薬剤感受性になって
いるクローンをネガティブセレクションします。
（注１）このようなベクターを自殺ベクターsucide vectorといいます。
（注２）最初の相同組換えと同じ側で起こると変異型アリールがドロップし
元の株に戻り、反対側で起こると野生型アリールがドロップし、
変異が導入される。
120 ：115：03/07/14 02:23
>>117
機能欠損株を作製するのが目的でしたら、１ステップで手軽にできる
方法もあります。
（１）目的遺伝子CDSの真ん中約0.5〜1 kb程度をPCRで増幅する
（２）sucide vectorにクローニングする
（３）形質転換する（環状のまま）
（４）PCRで増幅された相同領域のどこかで相同組換えが起こり
プラスミド全領域が染色体に組込まれる
（５）ベクターの薬剤耐性でスクリーニングする
この方法だと、119で記述した＜１ステップ＞後と同様、プラスミド
全領域が染色体上に組込まれたままです。しかし野生型アリールは、
プラスミド領域が挿入された形で破壊されます。
１ステップで簡単ですが、
・相同領域が短いために、組換えの頻度が小さい
・遺伝子の完全な欠損ではなく、N末端側からPCRで増幅したところまでは
正常で、そこからC末端側のない欠損タンパクが発現している
といった欠点もあるので、解析の目的に応じて使い分ける必要があります。
機能欠損株を作製するのが目的でしたら、１ステップで手軽にできる
方法もあります。
（１）目的遺伝子CDSの真ん中約0.5〜1 kb程度をPCRで増幅する
（２）sucide vectorにクローニングする
（３）形質転換する（環状のまま）
（４）PCRで増幅された相同領域のどこかで相同組換えが起こり
プラスミド全領域が染色体に組込まれる
（５）ベクターの薬剤耐性でスクリーニングする
この方法だと、119で記述した＜１ステップ＞後と同様、プラスミド
全領域が染色体上に組込まれたままです。しかし野生型アリールは、
プラスミド領域が挿入された形で破壊されます。
１ステップで簡単ですが、
・相同領域が短いために、組換えの頻度が小さい
・遺伝子の完全な欠損ではなく、N末端側からPCRで増幅したところまでは
正常で、そこからC末端側のない欠損タンパクが発現している
といった欠点もあるので、解析の目的に応じて使い分ける必要があります。
121 ：One-step gene disruption：03/07/14 15:39
E. coliではより簡便な方法が開発されている。
K.A.Datsenko, and B.L.Wanner PNAS 97:6640-6645 (2000)
One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12
using PCR products
本方法では Lamuda PhageのRed recombination系を利用して直鎖DNAでかつ
相同領域の短い（40nt)での組替え反応が効率よく働くように工夫されている。
１．薬剤耐性遺伝子を含む挿入DNAをPCRで調整する。
２．このとき、挿入したい目的のDNA配列をプライマーに付加する(40nt)
３．Red recombinationの遺伝子をもつプラスミドを入れた菌株に対して
electroporation法でPCR産物を形質転換させる。
４．薬剤耐性コロニーを選択する。
５．目的領域の組み込みをPCRで確認する。
この方法の利点は、PCRによって簡単に挿入するDNA領域を調製でき、
しかも希望する位置に正確に、非常に高い効率で組替えが可能であるという。
また、2キロほどのPCR産物で10kbを越す領域を組替えで置き換えることができる。
知る限りでは15kbでの成功例がある。また、組み込んだ薬剤耐性遺伝子はその両側に
FRT配列をもっているため、あとでFLP recombinaseで欠失することができるなど、
よく考えられたシステムである。
この方法を利用して、大腸菌の破壊株コレクション（KO collection)の作成が
進められ1140遺伝子破壊株がすでに作成されている（慶応大学先端生命科学研究所
微生物工学）。
この方法はプラスミドに対しても機能するため、BACの改変などにも利用できる。
今後のDNA改変の技術として非常に役立つと思われる。
K.A.Datsenko, and B.L.Wanner PNAS 97:6640-6645 (2000)
One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12
using PCR products
本方法では Lamuda PhageのRed recombination系を利用して直鎖DNAでかつ
相同領域の短い（40nt)での組替え反応が効率よく働くように工夫されている。
１．薬剤耐性遺伝子を含む挿入DNAをPCRで調整する。
２．このとき、挿入したい目的のDNA配列をプライマーに付加する(40nt)
３．Red recombinationの遺伝子をもつプラスミドを入れた菌株に対して
electroporation法でPCR産物を形質転換させる。
４．薬剤耐性コロニーを選択する。
５．目的領域の組み込みをPCRで確認する。
この方法の利点は、PCRによって簡単に挿入するDNA領域を調製でき、
しかも希望する位置に正確に、非常に高い効率で組替えが可能であるという。
また、2キロほどのPCR産物で10kbを越す領域を組替えで置き換えることができる。
知る限りでは15kbでの成功例がある。また、組み込んだ薬剤耐性遺伝子はその両側に
FRT配列をもっているため、あとでFLP recombinaseで欠失することができるなど、
よく考えられたシステムである。
この方法を利用して、大腸菌の破壊株コレクション（KO collection)の作成が
進められ1140遺伝子破壊株がすでに作成されている（慶応大学先端生命科学研究所
微生物工学）。
この方法はプラスミドに対しても機能するため、BACの改変などにも利用できる。
今後のDNA改変の技術として非常に役立つと思われる。
122 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/14 16:50
123 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/14 19:35
ご丁寧に教えていただき有難うございました。対象は大腸菌ではないのですがトライしてみたいとおもいます。
__∧＿∧_
|（ ＾＾ ）| ＜寝るぽ（＾＾）
|＼⌒⌒⌒＼
＼ |⌒⌒⌒~| 山崎渉
~￣￣￣￣
126 ：なまえをいれてください：03/07/24 17:46
ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。
127 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/11 15:26
ある人の酵素なのか
ヒトのある酵素なのか
まあどっちにしてもこんなやつ学術論文書くのは無理
ヒトのある酵素なのか
まあどっちにしてもこんなやつ学術論文書くのは無理
128 ：めぐみ：