大腸菌について極めるスレ
938 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 00:11:38
174 名前： 名無しゲノムのクローンさん 投稿日： 02/03/21 22:34
Sol 2を入れたときにpHが極端に高くならないようにバッファーとして
グルコースが入ってるそうな。Current Protocol in Molecular Biology
参照のこと。
Sol 2を入れたときにpHが極端に高くならないようにバッファーとして
グルコースが入ってるそうな。Current Protocol in Molecular Biology
参照のこと。
939 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 09:22:26
940 ：919：2005/10/13(木) 12:53:18
941 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 13:35:19
>>939
Current Protocol in Molecular Biology, 1.7.3より
Glucose serves as a buffer in step 6 when the pH of the solution is
greatly increased by addition of NaOH. Glucose provides buffering in
the range of pH 12 and, by preventing the pH from rising too drastically
in step 6, increases the efficiency of precipitation in step 7 (when
the pH is lowered by addition of potassium acetate).
Current Protocol in Molecular Biology, 1.7.3より
Glucose serves as a buffer in step 6 when the pH of the solution is
greatly increased by addition of NaOH. Glucose provides buffering in
the range of pH 12 and, by preventing the pH from rising too drastically
in step 6, increases the efficiency of precipitation in step 7 (when
the pH is lowered by addition of potassium acetate).
942 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 13:44:28
>939
強アルカリではあるよ。OHが電離する。
強アルカリではあるよ。OHが電離する。
943 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 13:50:14
強アルカリ条件だと、グルコースの水酸基から水素イオンが放出されるらしいな。
944 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 20:43:44
>>939 ボコボコにされてますな。ここは怖いところですな。
945 ：919：2005/10/14(金) 02:04:58
ということで938が答えと考えまつ。みなさん色々ありがとうです。
946 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/15(土) 22:58:48
250個のコロピーをやったが、目的の断片が入っているのが15コロニーしかなかった俺は逝ってヨシですか？
947 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/16(日) 00:04:49
948 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 09:35:32
toxicなcloneだから少数個取れたってのはヤバいだろ。変異入りの証拠だと思う。
949 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 09:37:35
最近、コロニーが少ないのは波長を３５４nmから３１２nmに変えたせいぢゃないかと思うんだが、どうよ？
950 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 21:51:57
951 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 21:53:37
OKなわけにゃーだろ？
952 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 22:17:19
>>950 バカめ。１分子のプラスミドに１つでもチミンダイマーがあれば、そいつは形質転換能ほぼゼロだ。
953 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 22:28:11
>>952
それはプラスミドが細胞内に入らないという意味？
それはプラスミドが細胞内に入らないという意味？
954 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 22:41:08
なわけないでしょ。修復にはrecAが必要だけど、プラスミド増やすのに
使ってる大腸菌のほとんどはrecA-だからだよ。
使ってる大腸菌のほとんどはrecA-だからだよ。
955 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 23:00:28
>954
？？？
recAマイナスで修復がいかないのだったら、
蛍光灯のUVや細胞内の活性酸素でしょっちゅう入ってるダメージはどうやって
修復されてるんだ？
？？？
recAマイナスで修復がいかないのだったら、
蛍光灯のUVや細胞内の活性酸素でしょっちゅう入ってるダメージはどうやって
修復されてるんだ？
956 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/18(火) 09:11:59
>>955
> 蛍光灯のUVや細胞内の活性酸素でしょっちゅう入ってるダメージ
そんなに入ってない。
大腸菌の菌体内はものすごく還元条件がつよいので、そもそも
活性酸素はオケ。
ともあれ、RecA以外にもVsrとかRuvABCとかMutTSとか
ほかにもいろいろあるじゃろ？
修復系もちょっと勉強せぃ。
> 蛍光灯のUVや細胞内の活性酸素でしょっちゅう入ってるダメージ
そんなに入ってない。
大腸菌の菌体内はものすごく還元条件がつよいので、そもそも
活性酸素はオケ。
ともあれ、RecA以外にもVsrとかRuvABCとかMutTSとか
ほかにもいろいろあるじゃろ？
修復系もちょっと勉強せぃ。
957 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/18(火) 11:30:28
E.coli DNAポリメラーゼIはそもそも修復系酵素だったという落ちw
958 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/18(火) 22:46:11
結局大腸菌が直してくれるんじゃねーかｗ
959 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/18(火) 23:32:26
>>958 バカは勉強しろと言っても無駄だったか。
960 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/19(水) 12:41:27
ヒント：ライゲーション、TAクローニングの突出末端の塩基、チミンダイマー
961 ：947：2005/10/21(金) 01:26:05
962 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/21(金) 09:09:56
ttp://www.invitrogen.co.jp/products/molecularprobe/SafeImager.pdf
の図３でも見やがれ！ 言っとくけど、縦軸はlogだからね。
の図３でも見やがれ！ 言っとくけど、縦軸はlogだからね。
963 ：919：2005/10/21(金) 17:54:12
形質転換を短時間で済ますやり方ありますか？
964 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/21(金) 21:21:28
>>946
目的が達成されたら勝ち組。
クローンが取れたおまいは無条件に勝ち組。
>>963
on ice5分、室温5分回復培養なし（Cm）で
うまく逝った事がある。15kのプラスミドでは
うまくいかなかった。
それと関係ないけどアルカリプレップの
ソル3入れた後の液を大量の大腸菌に対して
ちゃんとトラフォメを行ってもうまくいかなかった。
目的が達成されたら勝ち組。
クローンが取れたおまいは無条件に勝ち組。
>>963
on ice5分、室温5分回復培養なし（Cm）で
うまく逝った事がある。15kのプラスミドでは
うまくいかなかった。
それと関係ないけどアルカリプレップの
ソル3入れた後の液を大量の大腸菌に対して
ちゃんとトラフォメを行ってもうまくいかなかった。
965 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/21(金) 22:45:38
なんでそんなことの時間を削ろうとすんの？時間掛かるったって、放っとくだけじゃん。
966 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/22(土) 13:27:14
>965
同意。
異常に時間削ろうとして変なプロトコルや、やたら金のかかるキットを使う人間がいるが、
意外と余った時間で漏れみたいに2chやってたりして、時間を有効利用しないばかりか、
結局実験失敗したりもする。意味がないことが多いな。
同意。
異常に時間削ろうとして変なプロトコルや、やたら金のかかるキットを使う人間がいるが、
意外と余った時間で漏れみたいに2chやってたりして、時間を有効利用しないばかりか、
結局実験失敗したりもする。意味がないことが多いな。
967 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/22(土) 15:23:33
不溶性のHisTagタンパク質をうまく可溶化する方法を教えてください。
968 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/22(土) 15:27:27
>967
尿素か塩酸グアニジンで変性
尿素か塩酸グアニジンで変性
969 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/22(土) 15:35:52
どろどろになちゃうんです。ゲル状に
970 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/23(日) 03:39:48
>>意外と余った時間で漏れみたいに2ch
お約束で
お約束で
971 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/23(日) 20:59:58
>969
DNaseI入れよう。Mgも忘れないように。
それか超音波破砕すればよい。
DNaseI入れよう。Mgも忘れないように。
それか超音波破砕すればよい。
972 ：ii：2005/10/27(木) 00:49:36
プラスミドに必要な配列の情報をどなたか教えてください。。
973 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/27(木) 01:26:24
つかぬことをききますが
大腸菌の培養を始めることになりました
そこでOD600測定に関して２，３質問します
１：大腸菌を入れたセルはどうやって除菌していますか？70%エタノールですか？
２：測定に使った（セルの中に入れた）大腸菌はまた培養液の中に入れていますか？それともそのままオートクレーブ滅菌ですか？
３：セルは大腸菌専用でなければダメですか？
大腸菌の培養を始めることになりました
そこでOD600測定に関して２，３質問します
１：大腸菌を入れたセルはどうやって除菌していますか？70%エタノールですか？
２：測定に使った（セルの中に入れた）大腸菌はまた培養液の中に入れていますか？それともそのままオートクレーブ滅菌ですか？
３：セルは大腸菌専用でなければダメですか？
974 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/27(木) 01:55:48
１．はい。EtOHです。
２．前培養のフラスコの中に入れてオートクレーブ滅菌。
３．プラスチックのディスポーザブルのセルを使っています。
もちろん、使いまわし。一箱買ったら相当持ちます。
600nmですから、石英のなんて使う必要がない。
２．前培養のフラスコの中に入れてオートクレーブ滅菌。
３．プラスチックのディスポーザブルのセルを使っています。
もちろん、使いまわし。一箱買ったら相当持ちます。
600nmですから、石英のなんて使う必要がない。
975 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/27(木) 16:17:17
なぜ、大腸菌は、プラスミドを１つだけ取り込めるのでしょうか？
976 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/27(木) 20:19:39
>975
思いっきり濃い濃度のプラスミドで形質転換すればマルチに入るが？
思いっきり濃い濃度のプラスミドで形質転換すればマルチに入るが？
977 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/27(木) 23:14:54
出来るだけ効率のよいコンピを（数回分のみ）つくりたいんですが、何かアドバイスください。
今考えてるのは
① 遠心はできるだけ低いgで。（菌が全部落ちてこないかもしれないが、気にしない）
② 操作は全て低温室で無菌操作とか気にせず素早く。（どうせ、抗生物質選択するので）
最終手段として「買う」という手もあるんですが…。
今考えてるのは
① 遠心はできるだけ低いgで。（菌が全部落ちてこないかもしれないが、気にしない）
② 操作は全て低温室で無菌操作とか気にせず素早く。（どうせ、抗生物質選択するので）
最終手段として「買う」という手もあるんですが…。
978 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/28(金) 01:56:00
形質転換効率がどの程度欲しいかによると思われ流
979 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/28(金) 05:35:14
エレポ用ならしっかりと洗う。
ケミカル用なら低温でじっくりと培養。
ケミカル用なら低温でじっくりと培養。
980 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/28(金) 08:49:50
>>977 菌体をsuspendするときには泡立てない。駒込ピペット＋乳首などで優しく手早く。
とにかく冷やす。チューブをみだりに手で握ることすら避ける。
とにかく冷やす。チューブをみだりに手で握ることすら避ける。
981 ：973：2005/10/30(日) 02:09:21
アドバイス、ありがとうございます。
来週にはトライしてみます。
来週にはトライしてみます。
983 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/30(日) 22:28:39
培養地にできた大腸菌のコロニーってかならず一個の大腸菌が増殖してできたものなんですか？
984 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/30(日) 23:23:37
985 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/31(月) 00:53:10
シリコンゴムでできたこんな形のやつ→Ω
駒込ピペットの先っちょにくっつけて、プコプコするの。
駒込ピペットの先っちょにくっつけて、プコプコするの。
986 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/31(月) 01:01:43
>>983 「必ず」とは言えない。十分に薄く蒔いてあれば「ほとんど」。