▼今実験で上手くいかない事を質問するスレ▼ part6

いま実験でうまくいかないことスレッドです。
グチからアドバイスまで幅広く語り合いましょう。
基本的に、生物関係の質問をしてください。

★過去スレ★
　いま実験でうまくいかないことｽﾚｯﾄﾞ
　　http://cheese.2ch.net/life/kako/967/967541407.html
　▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
　　http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/
　▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼
　　http://science2.2ch.net/life/kako/1026/10263/1026312578.html
　▼今実験でうまくいかないこと▼パート4▼
　　http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1093050850/
　▼今実験でうまくいかないこと▼パート5▼
　　http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1121097197/

☆主な関連スレ☆
　◆生物学専門家への質問はここに書き込めPart19◆
　　http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1143018006/
　◆2ch高校生のための生物質問板　５時間目◆
　　http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1145151082/
　質問に対して小学生でもわかる回答をするスレの３
　　http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1145937037/
　タンパク質の精製３
　　http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1104733094/

▼利用者の心構え
・質問をする前には、先ず自分でなにが分かっていないのかを纏めてから質問しましょう。
・調べれば直ぐに分かりそうなことは、なるべく質問せずに、自分で頑張りましょう。
・レポートのお手伝いをしてもらおうという、甘い考えでの質問は慎みましょう。
・質問する側の人は、教えてもらう側ですので、丁寧にお願いしましょう。
・教えてあげる側の人は、横柄にならず、詳しく、優しく、時には厳しく教えてあげましょう。
・即、答えを教えてあげるのも良いですが、相手に考えさせる機会を与えてあげましょう。



　　　　質問する人は、まず、本を読むところから始めよう。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　その苦労はいつか、あなたの財産となります。

みなさん、連休中も実験ですか？

連休のうちに実験です

連休中は実験です

連休が実験です

実験が連休です

実験中は連休です

山の上　一人　風がつおい〜お♪

　　
　　.∧∧ 　　　　
　　(　　ﾉ　
　 ./　 ｜　　　
　（＿__ﾉ
／　　　 　　

連休なのに倒れますた

塩崎外務副大臣は、韓日両国が感情的ではなく冷静に対応する必要がある
と強調したという。
これに対し林議員は「韓国民の感情は理性的。理性ある憤怒だ」と反論

ttp://blog.goo.ne.jp/pandiani/e/e1287db48361e97143ae335a6360f92b
ここの画像にあるような訳の分からん異常行動を毎日のように見せられている
日本人からすれば、

「韓国民は理性的だ。理性ある憤怒だ」
なんて言われても、ジョークにしか聞こえないんです

pubmedにアクセスできません。

>>12
ﾋﾝﾄ：アク禁。

ttp://japanese.donga.com/srv/service.php3?biid=2003042906088

わいせつサイトだ。世界中の有害情報サイトを言語別に分類してみたら、
韓国語サイトが英語に続き、２位という調査結果を実感させてくれる。
よりによってきまり悪い分野で韓国語が銀メダルを獲得した理由が知りたい。

しかし疑問がある。東南アジアで「セックスアニマル」といえば日本人だが、
日本語版のわいせつサイトは韓国の４分の１程度だ。
韓国人のセックス能力や関心がそれほど高いという意味だろう。

これに対する明確な統計は見つけにくいが、世界でバイアグラ販売国の中で韓国が主要
マーケットに属しているのは事実だ。物理的かつ時間的、文化的空間に「レッドゾーン」を
別途に設けて性を認める国とは違い、姦通罪が存在する韓国では一応禁止して、
密かに楽しめるようにする二重の性意識がわいせつサイトを煽っているのではないか。

一応言っておこう、>1乙と、
しかしひどく助長なスレタイだ。
5までの方が良かった。
うまく行かない事をただ書き連ねても良いスレだったのが、
”質問”を入れる事により、
質問としてあるべきフォーマットを求められるようになるかもしれない。
”スレ”はなおの事頭痛が痛い状態。
次はかならず元のタイトルとして立てるべきだ。

>>15
日記はチラシのうｒ（ｒｙ

DAT落ちな勢いだな。

age

マスコミ関係者の話

「ルーシー・ブラックマンさんレイプ殺人事件の犯人が元在日で、女性をナンパするのに
都合がいいから日本国籍を取得した」なんて記事にしようものなら、社内に死人が出るよ（笑）。
やつの家族は今でも全員在日籍のままで、被害者に謝罪すらしていない。オウム真理教にしても、
創価学会にしても、統一教会と同様、事実上は在日韓国朝鮮人のダミー団体みたいなもんだが、
そんな事実は怖くて書けない。とにかく彼らのことは「タブー」なんだよ。
上司は「朝鮮総連」と聞いただけで顔を引きつらせるよ。「触らぬ在日にたたりなし」だな。

どうして〜なんだぜ

前スレ　スナップショット
http://p2.chbox.jp/read.php?host=science4.2ch.net&bbs=life&key=1121097197&ls=all

今から377でシークエンス読むんだけどさ、
dyeがなくなっちゃったのよ。
作り方わかる人至急教えてくだされ！
お礼に得ろ画像上げるし

水が濁っていて実験できません。

自己解しました。

諸君　私は実験が好きだ
　諸君　私は実験が好きだ
　諸君　私は実験が大好きだ

　徹夜実験が好きだ　やっつけ実験が好きだ　追試実験が好きだ　コントロール実験が好きだ、
一発実験が好きだ　条件検討実験が好きだ　低温室実験が好きだ　無菌実験が好きだ　動物実験が好きだ
　大学で　研究所で　病院で　農場で　工業試験場で　水産試験場で　民間研究所で　海外で　保健所で　プレハブ実験室で
　この地上で行われる　ありとあらゆる生物実験が大好きだ
　試験管ラックにならべた　カラム操作実験の一連の溶出産物が、糞データと共に俺の作業仮説を吹き飛ばすのが好きだ
　何週間もかけて用意した実験サンプルが、一瞬の不注意でまったく無駄になったときなど　心がおどる
　卒業研究生の操る　研究室共用PCが何ヶ月もため込んだ実験生データをデリートしてしまうのが好きだ
　悲鳴を上げて　据えた匂いのする院生部屋から泣いて飛び出してきた後輩　あざ笑う時など　胸がすくような気持ちだった
　陰険な聴衆をそろえた　プログレスリポートセミナーで奴らが俺の発表をズタズタにこき下ろすのを聴くのが好きだ
　データの全くない修士論文発表の院生、なんのデータも示してない汚いスライドを指して
何度も何度も無意味な主張を繰り返している様など　感動すら覚える
　

>>22
一応組成をば

6×Loading Buffer Triple Dye
0.3%(w/v) Orange G, 0.03%(w/v) Bromophenol Blue, 0.03%(w/v) Xylene Cyanol FF, 15%(w/v) Ficol(R) PM400, 10mM Tris HCl(pH7.5), 50mM EDTA

え、dyeはブルーデキストランじゃなかったっけ。だめだよゲルに入ったら。

>>26
TaKaRaの6×Loading Bufferと組成が似てる気がする。

実習の時、操作の仕方を実演している。何度も同じことをしているから、実演する私はちょっと気が変になりそうだ。
「もう一回やって」
と某女子学生が何回か私に向かって叫ぶ。
「もう歳やさかい、１回しかできません」
と答えることはせず、もう１回実演するわしだった。
コラ　別の事を想像した研究者が居ただろう？

CMsong : 友達友達友達友達友達を呼んでください　
女 : 本当に本当に困り果てる時は友達を呼んでください
字幕 :5分以内貸し出し可能金額確認　 保証なしに, 担保なしに,訪問なしに

女 : 今電話してください
ttp://bbs.enjoykorea.jp/tbbs/read.php?board_id=phistory&nid=64873

抗体が欲しいときにタンパクを精製して感作するじゃないですか
この時に経口免疫寛容を利用して、大腸菌破砕液を餌に混ぜて投与→目的タンパクを発現した大腸菌破砕液で感作という流れで実験したら上手く抗体が出来たりしませんか？

２chはウソの宝庫だなw

アホドクターが目障りで実験がうまくいきません
というか、実験してると横からどーでもいいアドバイスばかりしてきやがります
所詮痴呆の医療短大出身か・・・
国立（法人化したけど）の院にくるなよ

>>31
そう思った時期が、俺にもありました。

ぶっちゃけていうと、ほぼ不可能。っていうか、非現実的。
ってことで、素直に精製してマウスに打ち込んで、脾臓取り出すべし

くだらない質問ですが、in-situ用にインビトロジェンのimage cloneで注文しろといわれたのですが、
どうやっていいのかわかりません　とりあえずNCBIでcdsくらいは検索できるのですが／／／

膜タンパク質を可溶化するときにはこれがお勧めっていう界面活性剤ありませんか？

>>36
SDSでも使ってなさい

蔵王で遭難の韓国人一行、捜索費用の支払い拒む（山形新聞ニュース）

　関係者によると、一行が支払い拒否を告げたのは、5人全員が救助された12日当日。
関係機関が宿泊先のホテルに集まり、ホテルからの通報や捜索の経過、費用などを説明した際、
一行は「捜索依頼してない」「マスコミに名前を出された」と強く抗議した。
　県警は遭難時、家族らの強い要請を受け不明者の実名発表は避けたが、新聞やテレビで実際に
報道されたことをめぐり、一行の警察に対する不信感は強く、本国に戻って損害賠償訴訟を起こす
考えも示しているという。

>>35
つttp://www.invitrogen.co.jp/

>>36
そのタンパクの構造とかが重要なら、先ず、何を取ってくるのかを検討しよう。
失活してしまった、ゴミなんて取っても仕方なかろう？
オールマイティーに使える界面活性剤なんてのは、存在しない。
相性やらなんやらの問題があるから、複数種類の界面活性剤が用意された市販セットがあるから、
それを買って、一番調子が良いのを使うといいよ。

>>37
ばか、そんなことしたら膜タンパクを取ってくる意味がなくなるだろ。

山遭対事務局の市観光物産課は「捜索費は当事者から受け取るのが原則」として一行に
請求し続ける方針だが、ホテル側は「温泉街の各施設が誘客に頑張っている矢先に、
今回の問題で水をさしてはいけない」との判断から、肩代わりすることで問題収束を
図ることを検討している。

意味が分かりません・・・悪くないのに頭を下げる癖はもうやめましょうよ。

>>39
目的によってはSDSで意味がなくなるとは限りませんがね。

CHAPSを使ってみなはれ。

Tween20とか

いろいろアドバイスありがとうございました
タンパクの使用目的は相互作用因子検索なので立体構造は必要です
当方ではTriton、コール酸、CHAPSを試しましたがダメでした

とりあえず複数種類の界面活性剤が用意された市販セットというのを使ってみます

>>41
学部卒よりつかえねー
日本の将来の為に、もっと勉強汁。

>>44=36
ちゃんと低温でホモってからヤってる？

ゲノムDNAとかプラスミドを制限酵素で切りたいんだけど、
自己切断しまくって目的のバンドが取れないって現象が続いてるんですよ。

業者問わず酵素なしのbufferだけでインキュベートしてもDNAが壊れて
同じ組成でMgCl2だけ抜いたバッファーではDNAは壊れない。
で、何かのヌクレアーゼがコンタミしたんだろうと思ってフェノール処理とか
やり直しても改善しない。酵素っぽいから熱で不活化されるかと思って65Cで
数十分処理してみても改善しない。当然自分の試薬は全てオートクレーブ済。
オートクレーブしてないのは10%SDS、phenol、PCI、EtOHかな。
自分だけにしか起こってない現象で困っております。

厨な質問なのは分かってますが、何でも良いのでアドバイス頂けませんか？

>>46
一番厄介なパターンだね。がんばれとしか言いようがない。
普通DNAは扱うときはオートクレーブ処理しなくてもそんなに消化されることはないけどね。

インキュベート時間が長過ぎるとか、フェノール処理が甘いとかそれくらいしか
思いつかない。ええと、酵素処理はplasmidで一時間、ゲノムで長くて一日だけど、
それ以上やってるってことないかな？ま、ないと思うけど。

>>46
RNaseぢゃね？
俺は短いのを切り出したくってRNaseをガンガン効かせたのね．
そしたら超スメア．まさかRNaseにDNaseがコンタミしてるなんて
思ってみなかったんだけど、純度が低いと超コンタミしてるらしいぞ．
だまされたと思ってRNase-でやってみ．
試薬とかってたいていの場合間違ってないし、
DNAの調整に腕もくそもないと思うので・・・
ちなみに俺はたいていover-nightで切ってるけど無問題．

RNase
ゆでなはれ

ラボ内の人間関係の改善からだね。

>>46
電気泳動槽をキレイに洗って、バッファーを新しくするとか。
これでラボ中トラブったことあり。

>>47-50
レス�d

>>47
最短5min〜最長24hrsで色々とモニターしましたが、短いと不完全切断、長いと
余計な切断で、処理時間の調整で解決させる策は無理という結論に至りました。

>>48-49
ありがと。今RNaseAとProteinaseKを新しく注文中でありまふ。
でもRNaseA(-)で取った回もあって、それは解決してなかったような。。。
確認してみます。RNaseじゃなくて、PKが犯人だったりする事例はあるんですか？

>>50
実際のとこどうなんですか？そういう人間って結構いるんですか？

>>51
レス�d
泳動槽やバッファーではなさそうです。やっぱりDNAの質に問題があるかと。。。

大腸菌strainを変えてみると見違えるように解決する場合がある。

>>54
レス�d
そうみたいですね。でもそれだとゲノムDNAの説明が。。。作業してきます。ノシ

>46
あなたの酵素がMg++依存性のnucleaseにコンタミしてる可能性は？

>46
試薬はオートクレーブしまくっといておきながら、チップやチューブが汚染されてたりしてな。
ひょっとしておまいに恨みがある奴が夜な夜な・・・

>>56-57
レス�d

>>56
そう思ってしまうんですがねー。さすがにあんまりでしょう。。。

>>57=>>50


もちっと頑張ってみます。では帰ります。ノシ

まず、使う試薬を全部高純度な物に切り替える。
次に、EDTAを入れてからサンプルをゆでれ。

>46=58
問題の「酵素」で他の手ごろなDNAを切断してみる、
別の制限酵素でも同じDNAを切断してみる、
という確認は？

あとは、incubateの時間の問題。
長すぎて、バッファが濃くなって、star活性出てるとか。

＃EcoRVとかBamHIとかで1hrくらい切ってみて比較したら？

「さすがにあんまり」では説得力に欠けるかと。
（安い酵素なら、もう一本注文したってええんやないの？）

>>56>>60
スマン。
俺の指や息からMg依存性のnuclease出てんじゃね、って言ってるのかと解釈してた。だから流石にあんまりだと。
実際そこまで疑ってマスクまでして実験した始末だし。（解決しなかったけど）

他の酵素、incubate時間も色々と試したんですよね。ダメでした。
添付でついてくるvectorとかは普通に切れるので、やはり自分が精製したDNAの質が悪いのだと思うけど。

ちょっち適当なvector培養して、RNaseA処理+/-、TE/water、等いろいろ組み合わせて、切ってみるわ。

レス�d

>> 添付でついてくるvectorとかは普通に切れるので
これを最初にやってれば...

ヒント：変な事をすると碌な目に合わない

ウェスタンでサンプルの分子量の大きいほうがスメアになってしまいました。
タンパク質量が多すぎたのだと思いますが、それにしても出るはずのタンパク
（シグナル伝達物質のpan-proteinのほう）などもうっすらとしか出ませんでした。
ローディング量を適量にして再度ランニングしていますが、
サンプルが悪くて大きい分子量の方がスメアリングを起こすようなことはありますか？
どのようなことが原因と考えられるでしょうか？

>>64
ゲルの出来が悪いんじゃね？

コロニーダイレクトＰＣＲで目的のバンド以外に別のバンドがでてたんですが、
目的のバンドが出ていれば発現に用いても大丈夫ですよね？
それとも目的のバンドだけのコロニーが出るまで探したほうがいいでしょうか

>64
膜たんぱく質？
SDS-PAGEやる前に普通はサンプルを加熱すると思うけど、この加熱をやめてみたら？
どうもアグる時があるらしく、加熱を止める事で改善した経験が何度かあり。

>>66
エクストラバンドはプライマー配列、Tm値等、色々出る理由があるから
目的の長さが増幅されたらそれで良いんじゃないかと。
H bufferでワークする制限酵素で確認したら尚安心できますかね？
そこまでやる必要ないのかな。

むしろPCRエラーとかは気にしないのでしょうか？
ファイデリティー高いTaq使ってるのかな？

いやいや、制限酵素でインサートチェックは必須だろ
可能性は低いがインサートが2つ以上入ってたりするし

みんなTaqはどこの使ってる？
ABのMaster Mix使ってるけど、200bp程度の増幅でも塩基置換や抜けが入ることがしばしば。

KOD最強説

>>70
HOTGoldstar DNA Polymerase（ニッポンジーン）

>>70 PCRチェックなら謎の大腸菌由来。あくまで謎よ。
クローニングならPfuかエッペンドルフのtriplemaster。
宝のLAとか。
まあ最近しみじみと思うのはシークエンス確認必須ということ。

シーケンス確認は必須だけれど、今じゃシーケンスは楽で早いからいいだろ。
ゲル板シーケンスやってた頃はポリメラーゼもよくなかったから、
何クローンも面倒くさいシーケンスしては1塩基変異→ orz を繰り返したもんだ。

免疫学を学んでいます。
免疫学について活発な議論をしている掲示板やメーリングリストを
ご存知の方はいらっしゃいませんか。

>>75
聞いた事ないな。自分で作ってみたらどう？

ミクシィでやってみたら？
はやらなさそうだけど

大腸菌系のコミュはあるな

>>76-78
みなさんありがとうございます。今のところなさそうですね。
生物板にも免疫学系スレがありますが、アンチ免疫っぽいタイトルでしたので。

「もう一回やって」
と某女子学生が私に向かって叫ぶ。
「もう歳やさかい、１回しかできません」
と答えることはせず、もう１回するわしだった。

まで読んだ

>>79
mixiでコミュ作ってよ。

>>81
mixiを使っている知り合いがおらず、私は使ったことがないのです。

>>82
誰かに呼んでもらえば？

ELISAリーダーのデータからき吸光度の書き方を教えてください。wellの数
よりデータ数が多いんだけど。

蛋白を過剰発現させてるんですが、
・ワイルドタイプの蛋白
・途中でストップコドンを挿入してそこで発現を止めた配列
を同じ種類の細胞に発現させたところ、後者のほうも僅かながらも発現しています。
ストップコドンを飛び越えて転写してしまうことってありえるのでしょうか？

植物の種、特にアラビドプシスで、
種子を収穫するときの種子の成熟度や、
種子の保存期間によって、
その種子から育った植物の生育に差が出るということはありますか？
多分、多かれ少なかれあると思いますが、
実際、どんなものか経験者がいれば返答お願いしすま。

>>85
×転写してしまう　○翻訳されてしまう

で、答は「ありえる」。
nonsense supprssionもしくはinformational suppressionでググれ。

nonsense suppressionですた。

PCR産物をMaeIIIで切断したもので50bp前後のバンドを検出したいのですが、
ローディングバッファーに含まれているBPBのせいで隠れてしまいます。
XCだけが入っているタイプ、もしくは色素が入ってないタイプは
どこに売ってあるのわかる神様教えてください。

もしくはローディングバッファーの作り方を書いてあるURLを教えてください。

12%グリセロール作って1/6容量添加してチャージしなさい。
あまったレーンにはDye入りのローディングバッファ適当に
マーカー代わりに流せばバッチグー。

>>90
ありがとうございます！！！！
さっそくやってみます！！！
おまけに2〜3行目のtipまで教えていただいて感謝感謝です！！！

>>90
で、できますた！！！！！　ほんとうに感謝感謝です！！！
今後ともよろしこ！

>>87
ありがとう、調べてみます。

>>93

translational readthrough も調べるとよし。

ここの人はみんな優しいでつね

すみませんが質問させてください。
（同じ質問を別板でもしていますのでもし気に障った方がいらっしゃいましたら
すみません。ただ、それくらい困っていると思って頂ければ幸いです。）

マウス精巣上体脂肪組織の凍結切片を作りたいのですが、全く上手く切れません。

未固定でOCTに包埋→ドライアイスメタノールで凍結
→10μmで切片作製（庫内温度-20℃）

でやっています。もっと温度を下げた方がよいとの情報も見つけたのですが、
具体的な条件が分かりませんでした。

もしご存じの方がいらっしゃいましたら教えて頂けますと幸いです。

よろしくお願いします。

>>96
パラフィンで包んでスカッと

>>96
クライオスタットは一筋縄ではいかないので、
条件検討する意欲や時間がないなら、>>97。

>>96
未固定でやろうと言うのがそもそも。。。

>>96
脂肪組織の凍結切片は難しいです。

固定後、30%ショ糖液に4℃で一晩つけ込んでOCT包埋。
-40℃以下（出来れば-70℃）で切る。

と良いかもしれません。

みなさま素早いお返事ありがとうございます。

>>96, 97 様
切片作成後脂肪染色したいのでできれば凍結で行いたいと考えています。
（それに加えてうちのラボにはパラフィン切片作製のノウハウもないのです．．．）

>>99, 100 様
参考にした文献には解剖後未固定でいきなりOCT包埋→切片作製
と書いてあったのでそれに習ったのですが、上手くいきませんでした。
温度条件は全く書いてなかったので温度を下げてやってみようと思います。

ありがとうございました。試してみてまた報告いたします。
もし他に情報をお持ちの方がいらっしゃいましたらお願いします。

>>101
そんなに難しくないよ。
ドシロートの学部生である俺ですら出来るんだから。

後ね、厚さ30μm以下の切片を作るのに凍結法じゃほぼ不可能だと思いますよ。

ワロス

童貞ハンター（マニア？）>>487>>491>>493さん

ここでもひと暴れしてください↓
http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1126962134/l50

>>102-103
大丈夫か？

おそらく間違えていらっしゃるのだと思いますが、>>102-103 様は私では
ありませんので念のため。

>>103 様
うちのラボでは30μm以下の切片を凍結で作っています。
というよりも30μmよりも厚い切片で実験している人はいません。。
実際、そういうものなのでしょうか？


その後の報告ですが、ドライアイス-メタノールで凍結後、-80℃で一晩凍結し、
庫内温度を-35℃まで下げて（うちのクライオスタットではここまでしか下がりません）
切ったところ、かなり改善が見られました。

きれいな切片、とはまだ言い難いですが、何とかデータがとれる気がしてきました。

みなさまありがとうございました。追加の情報をお持ちの方がいらっしゃいましたら
またよろしくお願いいたします。

組織見てる人たちは目が肥えてるからな。

凍らす時はゆっくりいくと、組織が綺麗なままで凍るお

質問させてください。
ウエスタンブロットで、ＨＡ−ｔａｇをつけた蛋白の分子量は
つけてないものにくらべて分子量はどのくらい変化するものですか？
いくらなんでも３０kDaも増えませんよね？
すみませんがよろしくお願いします。

>>110
ちょっと多い気もするが、泳動条件にもよるね。

ELISAをやってるんだがプレートの反応とめてすぐ吸光度測るのと
反応とめてしばらく経ってから測るのとで値変わる？

>>112
変わる

ウェスタンのストリッピングで、ベータメルカプトエタノールを使って50度に熱しているんですが、周囲から臭い臭いといわれて困ってます。
50ccチューブに膜を入れて、パラフィルムでぐるぐる巻きにしたりゴム手袋の中に入れて密封してみたりいろいろ試したんですが。。。
どなたか臭いの出ない良い方法をご存じないですか？
やっぱり無臭のストリッピング液、買うしかないしょうか？

面ぶれん再利用しない用に考える。
あるいは別の溶液。おれは酸性グリシンつかっている。
ばりばりに強い奴ははがれないが、
大きさ違ったらこれで十分。

>>114
ドラフトの中でやれば？

コンピテンシーが悪すぎるorz

>114

パック使ってないの？シーラーでパウチみたいにするやつ。

>>117
自作？　作りたてなら御愁傷さま。
コンピテント作りは疲れる。

コンピ作りか。
オレもうまくはないし、最近やってないが、
ひとつ気がついた事がある。
普通のプロトコルに従って出来た奴はわりと薄めの溶液になると思う。
菌濃度を数倍程度に濃くしたらあまり外れコンピが出来なかったような気がする。
もう一度言うが、オレはあまりうまく作れなかったので、
そんなわけねーよと言う突っ込みもあると思うが。

SDS-PAGEでバッファーが少しずつ漏れてて気づいたらもう泡の部分だけで通電してる状態のときってどう対応したらいいですか？
物の本によるとバッファーを足すのは泳動が乱れるから駄目なそうですが

バッファー足しちゃだめってどの本に書いてある？
それほど悪影響があるとは思えないんだけど。

ラボでずっと以前から使っているプラスミドをシークエンスしてみると、プロモーターの部分に
点変異が結構入っていました。
それでもちゃんと機能しているからいいんだけど、プロモーターってオリジナルとかなり変わっても機能してるものなの？

>>121
どんな泳動してるんですか・・・

>>123
ヒント：プロモーターの役割と、その機能機構を考える

>>122
試しにバッファーを足してみましたがバンドがフニャフニャになりました
(泡の部分だけで通電していた間に泳動が乱れたのかもしれませんが)

>>124
ゲル板の固定が緩かったりゲル板が欠けてたりしたら漏れますよ

で、バッファー足しちゃだめってどの本に書いてあるのさ？

泳動を止め、同じ条件で泳動した別のタンクから移すとか。やらんか。

>>123 機能しているとｵﾏｲさんがその口で言っているではないか。
それが珍しい事かどうかという意味の質問なら俺は知らない。
しかし、CDSより制限がきつくない事は想像がつく。

>>126
イラストレイテッド「タンパクなんて怖くない」

>>127
コストや手間の問題以外にもそれだと自分が泳動した時間だけ通電を止める必要があるのでその間にタンパクが拡散してよけい駄目になるかと

>>125,129
まず、泳動前に溢れるくらいのバッファーを継ぎ足さない？
あと、泳動中は電気止めてから流すって所までは、想定の範囲内。
停止から通電までが30秒以内なら、能動的拡散なんて無視できる範囲。
それで歪むって言うのは、ゲルの濃度が部分部分で勾配が生じていておかしいと考えられるか、
ゲル底面にSDSによる気泡が入っていたか、ダミーレーンにダミーサンプルが入ってないか辺りが怪しい。

この辺りは、テクと心配り。

おかしいと思ったら、最初からゲルを作り直す。

ガス透過性でペラペラでない硬い膜なんてないよな････

コンピテントセル作るとき菌のOD600どれくらいまで上げてる？

>>132

0.5-0.8

0.5-0.8ってかなり開きが無い？

0.6がベスト
培養時間は菌の種類とか、培養条件によるよね。

>>131 おい俺のハードコンタクトレンズは存在しないという事か？
酸素透過性とうたっているが。

>>132 >>120の話を覚えていたら試してくれ。

PVDF膜から、うまくタンパクを抽出できません。

膜状で酵素分解し、抽出後にＳＤＳ電気泳動を行い、ＣＢＢで染色をしたのですが

バンドがさっぱり現れません。

どうしたらいいですか？教えてください。

>>137
そんなもん条件書いてくれんとどうしようもないだろ
しかしPVDF膜で分解してSDS-PAGEって最初から分解したら駄目なんかね

>>136サンクス
その発想はなかったわ

DNAグレードと書いてあるハイドロキシアパタイトってタンパク精製用に流用できますか？

ていうかこれスレ違いでしたね。
タンパク質精製板で聞くべきでした。
すいません。逝ってきます・・・

>>140
ものによりけり

>>139 モノになったらここで教えてくれよ。
scientistは名誉だけが生きる意味だからな。
citationしてくれたら多いに喜ぶぜ。

age

>>143
どうやってcitationに入れるんだ？
謝辞がせいぜいでは　
Nanashi Genome no clone-san

マウスの写真撮りたいんだが動きまくってぶれてしまう
何かいい方法ないですか？

>>146
ヒント：シャッタースピード

>>146
ヒント２：ASA1600

>>146
ヒント：マウスにジッとしててねと頼む

>>146
ヒント２：薬品

>>146
ヒント（裏ワザ）：爆発音

ヒント：神沢瑞至

エーテルでも嗅がすのか･･･
殺しちゃいそうなので却下
あとマウスに負担かけすぎるのも却下で…

>>153
まぁ、マジレスすると催眠作用のある物質をガスで吸わして、
動きを鈍くさせるだけで十分だと思うよ。

よいデータがでません たすけて

つフォトショップ

おいw

>>155

銅鉄実験

serum starvationの際の血清の濃度は？
細胞ごとで違うよね？

知ってる細胞と血清濃度、皆さん教えてけろ

ところで、「今実験で上手くいかない事を質問する」ってのは、
「今実験で上手くいかない事は何ですか？」って尋ねることだよね。

>>160
>>15

>>160
もし本当にそうだと思っているなら、一度日本語を勉強し直すべきだ。

UVによる突然変異で酸耐性のある株を取得しようとしてるんだけど。
酢酸菌で培地に対して6.6％の酢酸添加液体培地では生えるけど、
酢酸無添加寒天培地だと全然生えてこなくて困ってます。
教授いわく、菌が弱ってるとそうなる。としかいってくれない。
でも、液体ではビンビンに生えるんだよなー。なぜだろう。

分かる人いる？

>>163
その寒天培地に酢酸加えてみ。

その菌株、俺の予想では酢酸要求株になってる。

http://www.youtube.com/watch?v=L3-v5Qe1yTs&search=Ah%21%20My%20Goddess%2019
http://www.youtube.com/watch?v=LewzRGXpK28&mode=related&search=Ah%21%20My%20Goddess%2019
生物研究の成果です、是非この際にご覧下さいませ、ませませ

>>163
レスありがとう、来週早々やってみるね。
酢酸の濃度は液体と同じにした方が良いかな？

>>166
そうだなぁ・・・どんな培地に酢酸入れてるのか分からんけど、
液体で6.6%で生えてるんだったら、俺なら0% 5% 10% 15%の4つ作って、
それぞれに植菌してみるけどね。

その液体培地を震盪培養にかけてたと仮定して話すけど
まず、酢酸添加液体培地で増やした菌体を低温・低速の遠心で落として、
SOCとかで洗浄して安定させてから希釈して、懸濁液で4つに撒くと良いんじゃね？

で、生えたやつを培地の濃度勾配からどの辺りがジャストか見極めて(適当で良い）、
その添加培地で3〜5世でスクリーニングすれば良い。

で、要求株かどうかを見極めるには、酢酸以外の酸でpH合わせてみ。
乖離式から適当にファクター見積もって計算すればいいと思うよ。

感受性菌じゃなくて耐性菌なら探すの大変そうだなあ

実験をはじめて数ヶ月の初心者です。

マキシプレップでplasmidを増やしたいのですが、寒天培地では大腸菌が増えるのですが液体培地に入れると増えてくれません。コンピセルはDH5alpha, ベクターはpGL2やpGL3のアンピシリン耐性のもの、とありふれたものを使っているんですが・・・

どなたかお助けください。

>>169
先ずは、改行から覚えてくれ。

なぜ液体培地で増えないか。
1.組成条件の違い
2.環境条件の違い

>>169
アンプの濃度を下げてみ

>>167
YPD(1:1:1)に入れて震とう培養させてる。
基本的に5％以上の酢酸には耐えられないのが酢酸菌の性質で、
それ以上で生育する酸耐性酢酸菌をUVで突然変異を得るという実験。
言ってみれば、運だけが頼りの実験かな？

洗浄は生理食塩水(濃度忘れた)でやってます。
常温で遠心かけて沈殿させてるので、ちょっと変えてみます。
プラス、酢酸以外の酸も添加して判別してみますね。

有り難うございました！

>>171
基本、寒天でも液体でもアンピの濃度は変えないからな〜。

>>169
・コンピの効率が極端に悪い
・形質転換作業時、ヒートショックが確実に行われていない
・プレーティングする際に菌が何らかの影響で死んでしまう
といった、根本的且つ簡単な部分が原因だと思われ。
あとは、ヒートショックしたコンピをSOCに入れるでしょ？
このあとの培養時間を延ばしてみたら？今は何分やってるか分からないけど。
通常なら1時間くらいだよね？だったら1.5時間にしてみ

>>169
寒天培地を作るときは60℃ぐらいでAmpを入れるから液体培地と同じ濃度入れても効果が低くなることがある
まあ、その辺が原因だと思うから寒天培地作るときに温度に気を使ってみるか液体培地のAmp濃度を下げるかしたらいいかと

>>173
質問の内容を読めよ馬鹿
コンピの効率が悪かったらAmp非耐性菌がプレートに生えるとでもいうのか？

マキシの前にミニで試す

培地にカナマイシンが入ってんだろｗ

>>169
うまく振盪できてないから酸欠になってるとか
試験管に10mlとか入れて振ってない？

>>172
まぁ、学部3回生の適当なアドバイスだし、上手くいったら万々歳だろうけど・・・
上手くいったら報告してよ、二人で喜ぼうや。

>>178
大丈夫、漏れも学部４年だから。実験の事はさっぱり。
実験ってより作業かな・・・意味分からないよｗ
うまくいったら報告する！いつになるか分からないけどナー
それと、4%以上酢酸を寒天培地に添加すると固まらないみたいだorz

観点固まらないなら、濃度あげるしか・・・

今度水草の光合成量を測定する実験を気泡数測定方でやるのだが、
�@いろんな状況を試し気泡数の多くなる環境をみつける
�A測定結果から考察して発展した実験をもう一回やる
�@の段階で電球にセロハンはったりする（いろいろな色にする）実験方法でいったら 先生にやり直せと言われてしまったんだが どうすればいい？

>>181
やり直す前に、実験に意義を感じられない。

>>182
漏れもそう思ったが、意義ある水草使った実験ってあるか？

大腸菌にトランスポゾンで無差別にノックアウトしてそっから欲しいノックアウト吊り上げるのってどれくらいの株テストするのがあきらめるラインの境目？

>>184
俺が教官ならお前をノックアウトする

>>184
10回やってだめなら、ちょっと条件を見直す。
そのサイクルを100回やっても無理なら、方向性を考え直す。

フローサイトメトリーについて教えてください。
マウスsplenocytes蛍光補正をする際、どのような抗体を使って行うのが一番良いのでしょうか。

>>187
途中で送ってしまいました。
フローサイトメトリーを行う際、2色以上で蛍光染色すると蛍光補正が必要になります。
マウスsplenocytesを使用する場合、どのような抗体を用いるのが一番良いのでしょうか。
やはり補正用ビーズで行うのが良いのでしょうか。

>>188
それでいいんじゃない？

ソフト的に補正することって出来るみたいだけどやってる人いる？

>>189
最初にサイトメトリー教えてもらったときは調べたい細胞でコンペ取るって教えてもらったんです。
そんなわけで手元に補正用ビーズがまだないのですが、ビーズがいいですかやはり。
購入を検討してみます。
>>190
automatic digital compensationというらしいです。
メーカー曰くovercompensationになりやすいらしいですけど、試してみようと思っています。
そのときのスタンダードを、ビーズがいいか細胞がいいか、抗体は何がいいかなど迷っていて、
また施設内でなかなか予約が取れないので、実際に試す前にこちらで相談したしだいです。

>187
キャリブレーションとコンペンセーションを混合してないか?

キャリブレーションなら専用のビーズが必要。

コンペンセーションなら
例えばFITCとPEの2重染色の場合
FITCのみでラベルした細胞でPEへの漏れこみを補正し、
次にPEのみで...略...FITCへの...略...をする。
勿論この補正の具合は使う細胞や抗体毎に違うから
実際に使う細胞と抗体が必要。

しっかり準備してから実験しような。

>>192
自分はサイトメトリーの初心者であまり詳しくないのですが、
施設（米国）のフローラボの責任者と、BDの担当者の両者に一部教えてもらったこと以下のとおりです。

まずビーズはヒトやマウスのリンパ球とほぼ同じFSを持つように作られているとのことで、
実際にキャリブレーション用ビーズとコンペ用ビーズを貸してもらいました。
SSは細胞によって違いますが、Voltageとゲートの調整でほぼ良いと言われました。

コンペンセーションですが、フローラボの管理者が言うには、コンペンセーションはあくまでも
蛍光スペクトラムの漏れ込みの補正であるので、粒子の大きさは関係なく、
ピークと漏れ込みの差がしっかり出るよう、できる限り蛍光強度が一様なものを使うのがよいとのことでした。
細胞毎にコンペンセーションが異なりうるのは自家蛍光が違うためだが、
多くの場合無視できるとも説明を受けました。
そのような理由より、サンプル細胞が少ない場合はコンペ用抗マウスIgGビーズの使用を勧められました。
マシンのコンペンセーションのヘルプファイルにもまずビーズでのコンペンセーションについて
書かれており、代わりに細胞を使うこともできる、とありました。

しかし現場では>>192さんがいうようなやり方で皆さんやっています。
私も同じようにやっています。
で、実際のところ正確なのはどちらかと思い、>>187で質問しました。

>>192
そこで教えていただきたいのは、コンペを取るときサンプルと同じ細胞を使いますよね、
でも使いたい抗体が何種類もある場合は、どのような抗体を使っていますか？

自分は、たとえばマウスの脾臓細胞ならCD3かCD8の単染色サンプルを、
樹状細胞ならMHCクラスIIなどを使って、コンペを取っていますが、
これでいいのかどうか、抗体毎に別の設定にすべきなのか、迷っています。

>187氏の最初の書き込みは
M1位のFACS始めたての様な印象だったけど、
結構バリバリとやっている方のようで...

そこはやっぱり試してみないと分からないのでは?
同じPE標識の抗体であっても、抗原が違えば漏れ込みの程度もやはり違うし。
ただ、コンペンセーションをそこまで厳密にやらなくても
得られる結果の解釈にさほど影響が無い場合もありますし...

よかったら↓でも質問してみては？
人がいるかは分かりませんが。

フローサイトメトリー総合スレ
http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1086184872/

(実は↑のスレ立てした1本人だったりします)

Wistar系ラットを2週間、
コレステロール添加食を与えるＴ群と
普通食を与えるＣ群に分けて飼育しますた。

その後両群の摂水量と臓器重量、体重を比較したのですが
・摂水量　　Ｔ群＞Ｃ群
・体重　　　Ｔ群＜Ｃ群
となりました。一体何故なのでしょう？
低レベルな質問すいません

・肝臓重量　Ｔ群＞Ｃ群　はうなずけるのですが。

>>196
当然、群のデータが取れたんだろ？
なら、データをよく見て、R2と有意水準α=0.05で精度を求めてみたら？

今月号のNature ImmunologyにFACSのこと書いてあったよ

>>195
お返事有難うございました。
私も実はそこまでコンペンセーションにこだわらなくてもいいのかなぁと思ったり。。。
フローサイトメトリー総合スレご紹介有難うございます。ぜひ活用させていただきます。
続きの質問が出た場合、そちらでさせていただきます。よろしくお願いいたします。

>>196
計算した結果は？

上手くいってないというわけじゃないんですけど質問です。
ヒト癌細胞をアガロースゲル電気泳動する際のＤＮＡサイズマーカーの各バンドのサイズをメモし忘れました。
制限酵素はＨｉｎｄ�Vなんですが、ＤＮＡの種類が分かりません。
λＤＮＡかとも思ったんですが、バンドが全部で9本あるので違うと思います。
サイズマーカー売ってる会社のカタログとかも調べましたが全然分かりません。
お願いですから誰かヒントください。

すいません、やっぱいいです。
スレをざっと見て自分の質問のレベルの低さが恥ずかしくなってきましたので。

>>201
マーカーを流した場合、入ってる全てのサイズが見えるバンドとして出るとは限らない。

取り敢えず、何を使ったのか、人に聞いてでもいいから、よーく調べてみ？

わざわざありがとうございます。
でも今は人に聞ける状況じゃない上、明日までにデータを提出しないといけないんです。

で、あの後更に調べたんですが市販のマーカーでhind�Vを使ってるのは二つだけした。
電気泳動ではサイズの対数と移動距離が比例するから、無理やり数値を当てはめてプロットはしてみたんですが
両方とも直線だとは言えない結果になってしまいました。
ただ、今回のアガロースは濃度が比較的薄めなので傾きが距離とともに大きくなっている
λＤＮＡの方が正しいような気もするんですが。
ただ少なくとも元々現れるはずのバンド数よりも多くのバンドが見えるなんてことはないですよね？

http://kasamatusan.sakura.ne.jp/cgi-bin2/src/ichi44392.jpg.html
グラフはこんな感じです。

マーカーの写真を見せてくれた方がいいのに

昔よく使ってたlambda StyIに似てるように見えるが、どれか薄いバンド
はないかい？

すいません、これがマーカーの写真です。
http://kasamatusan.sakura.ne.jp/cgi-bin2/src/ichi44409.jpg.html
見れば分かると思いますが、一番下が薄いです。

すいません、上げてしまいました。
しかし今確認したら、確かに凄く似ていました。
http://search.cosmobio.co.jp/cosmo_search_p/search_gate2/docs/FER_/SM0161.20060614.pdf
恐らく間違いないです。
本当にありがとうございました。
しかしなんであんなグラフ見ただけで分かるんですか？
驚きました。

当たったかなw
4.2kbが若干薄いね。

うん、まさしくλ StyIだ。
流石、専門で使ってる奴は違うなｗ

>>201-202=204
なぁに、聞いてみるもんだ。分かる事なら、誰かが答えてくれるｗ。

生物学分野の発見プライオリティ剥奪の恐れが各方面で高まっています。

ノーベル物理学賞受賞者を輩出しているカリフォルニア工科大学が
時空操作（タイムトラベル）専門のラボをもっているという重み。
http://www.its.caltech.edu/~kip/scripts/publications.html#top

時空操作は既に科学の対象。理論的、学術論文的には時空操作（タイムマシン）は
既に可能となっており、その社会論まで論議が進んでいるのが現状です。

様々な根拠から時空操作（タイムマシン）の兆候を認識した人物を
無批判に疑うだけの学問基盤の一部が既に失われています。
今、生物学等の研究分野全体が危機にあるのではないでしょうか？

K.S. Thorne, "A Voyage Among the Holes", Grand Street, 48, 149-180 (1994);
revised, English version of Ref. 30 above; extracted from the prologue of
Black Holes and Time Warps: Einstein's Outrageous Legacy (Norton, New York, 1994).

K.S. Thorne, Russian-language versions of selected chapters from Black Holes
and Time Warps: Einstein's Outrageous Legacy, translated by
M. L. Gorodetsky: "Cheorniye Diri i Iscrivleniye Vremeni:
Derzkoe Naslediye Einshteina," Priroda: "Glava 4, Zagadka Belikh Karlikov,
" January 1994 issue, pp. 90-102; "Glava 5, Skhlopivaniye Neizbezhno,"
Part One, February 1994 issue, pp. 78-89, and Part Two, May 1994 issue, pp. 75-82;
"Glava 6, Skhlopivaetsa, no vo shto," Part One, July 1994 issue, pp. 92-106, and
Part Two, "Rozhdeniye chornikh dir: vse bolee glubokoye ponimaniye," August 1994, pp. 86-99;
"Glava 8, Poisk," September 1994, pp. 96-109.

http://society3.2ch.net/test/read.cgi/atom/1152705042/

しかし
２０４のグラフはひどいな
バンドの真ん中を計ってるからかな
先染めならバンドのうしろ
後染めならバンドの前線を計る

実験初心者なのですが、今ちょっと困っていることがあります。
教えてください。
アルカリミニプレップ法(Solution1⇒�U(アルカリ)⇒�V(酸で中和)⇒グアニジン⇒75%エタ)
でプラスミドDNAを抽出しました。
Solution2も自分で作製しているのですが、10％SDS：2N NaOH：QW＝1：1：16(本来は1:1:8)
で作製してしまい、そのまま使用してしまいました。
その後、Solution3を通常量添加したので、おそらく酸性に傾いたかと思われます。
プラスミドDNAを採取後にアガロースゲルで電気泳動を行いましたが、長さがまちまちでした。
なので、プラスミドを取り直すべきか悩んでいるのですが、取り直しても同じだったら意味ないなぁ。
と考えています。
上記の操作(酸性に傾いたこと)が原因でプラスミドDNAが切断されてしまうことがあるのでしょうか？
アドバイスお願いいたします。
長文、失礼いたしました。

>>212
ゲルは何％よ？
取ったばかりのプラスミドを泳動すると、
たいていバンドが3本くらい見えると思うんだけど。

212です。
レスありがとうございます。
ゲル濃度は0.8％です。
100クローンくらい同時に(96穴プレートで)とってるのですが、バンドの泳動距離がばらばらでした。
Deletionしているのかどうかが微妙な感じで、正常なクローンがどれなのか判断がつきかねる状況です。
(普段は90％以上が正常クローンなので、バンドの高さがほぼ一定です)
大腸菌ゲノム？がいつもより多めに出ている気がしたのですが・・・。
よろしくお願いいたします。

>212
プラスミドはそんなに弱くない。煮ても平気だ。
ゲノムDNAが混ざってるようなら考えるまでもなく取り直せ。
それにしても、96 wellのプレップなのにキットを使わないでやってるの？

ゲノムはいつも出てるのですが、Sequenceでクローンの種類を分けるだけなのでこれまでも問題ありませんでした。
プラスミドはそんなに弱くないですか！　ちょっと見直したｗ
96wellプレップですが、試薬は自分で調製しています(お金ないのでｗ)。
安心しました。
明日、蛋白を発現させてELISAするので、その結果と合うようであればそのままで以降と思います。
ありがとうございました。
とっても助かりました。
教えてちゃんですみませんでした。
本当にありがとうございました。

ミニプレでSol2やSol3の濃度なんて適当や
まちがってSDS倍ほど入れたことあったけど
NaOH倍ほど入れたことあったけど
Sol3を半分しか入れなかったことあったけど
ちゃんと取れてた

氷冷５分とかいうのも適当や
Sol3入れて室温で混ぜてすぐSol3でおｋ

Westernのバンドがかすれてしまい、困っています。
ゲルは7.5%均一ゲル、10ugのタンパクを100Vで泳動、その後wet transfer

>>218つづき
を300mAで1時間行っています。一次抗体と二次抗体はハイブリバッグを使っています。
バンドがかすれたため、depelopping

>>219（つづき）
を2回行い、それでもだめでしたのでセルロース膜をポンソーSで染色しました。
そうすると高分子量のほうがまだらな赤いシグナルが出てきました。
いったい何が悪いのでしょうか。

分からん。
取り敢えず、ニトロセルロースをPVDFにしてみそ

>215・217様
214・216です。
アドバイスありがとうございました。
無事にELISAとの結果が合致しましたので、そのままSequenceまでいけました。
濃度とか適当でも大丈夫なんですね。
私のところに伝わるプロトコルではSol2とSol3の量は絶対に守るように！とのことでしたので心配でした。
どっちみち、遠心してしまうから大丈夫なのか・・・？

とりあえず、今回は一安心です。
ありがとうございました。

ミトコンドリアD-loop領域のPCR増幅という実験をやったのですが、
D-loop領域からの産物が増幅されませんでした。これは、ミトコンドリアDNA
とプライマーの配列が合致しなかったため、ってことまではわかったのですが、
実際にどのように塩基置換が起こっているのか調べるためにはどうすればいい
のでしょうか？

>>223
ゲノムの方言置換

>>221
ありがとうございます。
一度試してみます。

>>223
つ...http://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=568&goods_name=DYEnamic+ET+Terminator+Cycle+Sequencing+Kit

初心者なのでおかしなことをいっていたらごめんなさい．
自分4回生のペーペーなんですが，「ゲノム未知の生物の未知のｃDNA上流を読め」と４月にボスに命じられ，この５´RACEというものに悪戦苦闘しているうちにもう数ヶ月たってしまいました．
RNA回収→RT→ポリC付加→ポリGプライマーを用いたPCR→nested PCR
古典的な方法なのですが，どうにもうまくいきません．内部配列の一部がわかっているためPCRのテンプレートが目的の遺伝子を含むということは確かめられましたが，その上流がしっかりdCTPで修飾されているのかどうか分かりません．
手法を変える方向で検討しようかとも思っていますが，ゲノム未知の生物のcDNAの５´上流の配列を読んだことのある方，もしいらっしゃいましたらどんな手法で読まれたのか教えてください．よろしくお願いします．

初心者なのでおかしなことをいっていたらごめんなさい．
自分4回生のペーペーなんですが，「ゲノム未知の生物の未知のｃDNA上流を読め」と４月にボスに命じられ，この５´RACEというものに悪戦苦闘しているうちにもう数ヶ月たってしまいました．
RNA回収→RT→ポリC付加→ポリGプライマーを用いたPCR→nested PCR
古典的な方法なのですが，どうにもうまくいきません．内部配列の一部がわかっているためPCRのテンプレートが目的の遺伝子を含むということは確かめられましたが，その上流がしっかりdCTPで修飾されているのかどうか分かりません．
手法を変える方向で検討しようかとも思っていますが，ゲノム未知の生物のcDNAの５´上流の配列を読んだことのある方，もしいらっしゃいましたらどんな手法で読まれたのか教えてください．よろしくお願いします．

>>227-228
取り敢えず落ち着け。内容の前に指摘する点が2点。先ず改行、そして多重投稿。
焦ってるのは分かったｗｗｗ

cDNAの上流領域を読めという話だが、cDNAはmRNAの逆転写物だ。
普通、cDNAライブラリはmRNAをリンカー付加したpoly Tで逆転写すっから、
　　5'----------------AA・・AA-[リンカープライマー] 3'
　　3' ---------------TT・・・TT-[リンカープライマー] 5’
ってなってるわけだ。

因みに、5' RACE法はmRNAのpoly Aテールを無視して、途中にP1プライマをアニールさせ、
目的領域のmRNAのcDNAのみをゲットする方法だ。
俺は学部3回生でおたくよりも下なわけだが、おたくは5' RACE法が何なのかが分かってない気がする。
5' RACE法をmRNAに対して行うと、以下のようになる。

　　5' ------------------------------[poly A] 3'
　　3' ---------------------[P1] 3'

つまり、P1プライマー上流は、逆立ちしても読めへんのよ。なぜなら、情報が抜け落ちるから。

>>218,219,220
何kDのバンドを見たいのか、トランスファー装置、バッファー組成
にもよるが、ウェットトランスファーで300mA, 1hは短いと思う。
バンドがかすれているのは、おそらく転写されきってないんじゃないのかな？
プレステインドマーカーを一緒に流してたら転写がきちんとされているか
どうかはマーカーの転写具合でわかると思うが。
うちでは、BIO RADのウエットトランスファー装置で
200mA､5.5から6hぐらいで１５０とか２００kDぐらいのものを
見ている。
depeloppingて何のこと？

>>228,>>229

最近の5'RACEでは最初の逆転写の時に5'リン酸化プライマーを用いて
１本鎖cDNAを合成する。そのあとRNA/DNAリガーゼで1本鎖cDNAを環状にして
おたがい逆向きのnestプライマーセットを二組、合計4本のプライマーで2回PCRを行って
普通にTAクローニングする。

タカラからキットがでている。これ簡単。

取り敢えず、mRNAの配列をを沢山読みたいだけなら、俺ならこうするね。

poly Tで逆転写してcDNAを作成。その時にリンカーに制限酵素サイトを適当に追加。
超特異的なやつをチョイスする。
で、そいつをその制限酵素で処理してCIAPしてから平滑末端にその制限酵素サイトを
含んだリンカーを付着させて修復。
その後、その制限酵素サイト同士で環状にして、逆PCRにかける。

もしcDNAライブラリー化されたのを使うなら、そいつを組み入れたプラスミド配列が分かってるはずだから、
そいつごと、上手い場所を選んで逆PCRか、欲しい鎖側の上手い場所を選んで、RCA-PCRにかけるね。

今のその話だけで判断するのはイクナイと思うけど、きっと上流領域が落ちた状態で読んでる希ｶﾞｽ。
無いものは読めんよ。

分子の中の人だから、専門外の遺伝子の説明でミスってたらゴメンヨ。

>>231
んー、5' RACE法自体が、227-228のしたいことに合ってない気がするんだけど。

>>233

よくわかんねけど、degenerate primerでホモログの断片をクローニンしたあとで
全長が欲しいとか。
cDNAライブラリーこさえてあって、ハイブリかイムノスクリーニングで部分長のcDNAが
とれてるけど、開始metが見当たらない、つうふうに脳内補完したけど、ちがうの？

>>234
あー、そういう考え方もあったか。

まぁ、要約すると・・
質問に関する情報が薄いか、何してるのか分かってない可能性が高いってことか・・・

228の質問をした者です．
穴だらけの質問で失礼しました．無知とあせりがそのまま露呈してしまいました．
ご指摘下さった方，補足して下さった方，ありがとうございます．
＞degenerate primerでホモログの断片をクローニンしたあとで全長が欲しい
・・・という事なんです．
231の方のおっしゃっていた，環状にする方法で検討してみます！

いや普通に分かるよ。

GeneRacerつかって５'RACEやったけど増えん
たぶんRNAの質が良くないんだとおもう
開始コドンの上まで増やせればいいんだが，
おすすめのkitとかある？

タカラで出てない？

5'race．．．　ありゃぁ　運だな．

5' RACEは好んで取る方法じゃないね。

223で質問したものです。ゲノムの方言置換という解答をいただいたのですが、
いろいろ調べたんですがよくわかりません。
どういった方法なんですか？

Dako社のGFAP(Glial Fibriary Acidic Protein)　カタログナンバーz0334について質問です。
この抗体を使って、ラットの骨髄細胞をそめるべくウェスタンブロットをしたところ、
４０Kdaにシングルバンドが検出されました。予想では５０Kdaにシングルバンドが出ると思っていたのですが、５０Kdaには何も出ていませんでした。
質問は、この４０Kdaのバンドはなんでしょうか？タンパクがこわれていたからサイズがずれていたのでしょうか？

＞ラットの骨髄細胞をそめるべくウェスタンブロットをした

まずこの操作がよく分からない
組織染色したいけどとりあえずちゃんと染まるか確認したいわけ？

タンパク質精製スレと迷いましたがここの方が人口が多そうなので質問します
現在あるタンパク質を精製しようと思いアフィニティクロマト→イオン交換という順で精製を行いましたがまだ精製しきれていません
最終的にはSDS-PAGEの後バンドを切り出すのですがもう少し精製度を上げたいので、手軽な精製方法(カラムやキットが不要)があれば教えてください？
ちなみに今のところ硫安分画を検討しています

>238
GeneRacerは性能いいですよ。大概増える。
227の書き込みにも言えることですが、うまくいかない場合、その原因として最もありそうなのが5'側を修飾したtemplateの合成に失敗していること。その確認が最優先事項。
というわけで、まずは発現量が非常に強く、遺伝子情報が既知の遺伝子（GPDやベータアクチンなど）の遺伝子で５'RACE反応してみましょう。それで全然増えないなら、

お前の鋳型は既に死んでいる・・・。

ともかく、やたらとkitを買い換える前にポジコンを取って何が悪いか確認することが重要。

＞２４４様
　説明不足で申し訳ございません。
　免疫組織化学ではありません。ラットの骨髄細胞を取り出して、lysis bufferに溶かしてウェスタンブロット用にたんぱく質を取り出しました。
　細胞から取り出したたんぱく質２０マイクログラムをＳＤＳのゲルに流し、メンブレンに転写してＤａＫＯ社のＧＦＡＰを使って一次抗体反応をしました。
　Ｄａｋｏ社のＨＰのデータシートを見てもこの抗体のウエスタンブロットの結果が出ていないので、５０Ｋｄａ　（ＧＦＡＰのサイズ）以外のバンドも染めるかどうかがわかりません。
　さてはて、どうしたらいいもんでしょうか・・・

いくつか可能性を下にあげてみる
・サンプルが悪くSDS-PAGEでの泳動距離が理論値と異なっている(といってもせいぜい±10%ぐらいだが)
・目的タンパク質がサンプルに含まれていず、40ｋDaのタンパクは単にノンスペ
・選択的スプライシングによってその組織ではデータベースよりも短いタンパクが発現している
・抗体の選択を間違えている(本当にラット用の抗体なのかどうか)

>>247
まあ、10kDぐらいならずれることはある。シングルバンドとしてでている
のなら、まず大丈夫だと思うが、できればポジコンは用意したほうがよい
と思う。ポジコンとしては、GFAPが確実に発現している細胞のlysate、あ
るいはrat GFAP遺伝子を過剰発現させた細胞由来のlysateをとなりに流して
それでも、同じ位置にバンドが検出されればより確からしくなる。
あと、一般的に購入する抗体を選ぶときは、メーカーのデータシートに
WBに使えるとか書いてあっても信用しないほうがよい。論文や、口コミ
などの方が信頼性が高いよ。

>>247

>>249に同意。ポジコン置くべし。
いま扱ってるタンパクなんか，電荷かpHの問題なのか，
予想サイズ70kDくらいなのにバンドは110kD付近に出る。
メーカーのデータシートでもそのサイズでバンド出てる。

WB中。いま，トランスファーに入ったとこなのだが，
‥‥
7.5%ゲルが割れた。一部，炭素電極に着地した。
ちゃんと写るだろうか‥‥‥‥‥鬱だ‥‥‥‥‥‥‥‥‥

ほっぺを引っ張られたタマ姉みたいな
バンドになってたりして‥‥‥‥‥萌だ‥‥‥‥‥‥‥‥‥

培養細胞、数えるのすらめんどくさくなってきた。
大量培養めんどくせー。日にちかかりすぎ！

>>253
ヒント：極限定理で計算

LB brothと間違ってTB brothでプレートを大量に作ってしまった俺が来ましたよw
気づかなかったことにして、使ってもok?

>>255
実験内容によりけり。
基本的には、正直に申告して作り直し。

>>256
コンストラクション程度なら問題なさそうな気がするけど。
TBだとダメな実験て思いつかん。頭悪いなあ俺。逝ってきます。

>>256,257
LBのつもりで計って作ったので、TBにしても濃度が薄いんですよね。
だから、いずれにしても無理かも。
素直に作り直します。お騒がせしました。

>>258
大丈夫、前段階の失敗なら、さほど怒られやしないさ。

ELISAでタンパク質と抗体をプレートに固定した後、
結合相手のタンパク質を0.1nM-100nMのように
振ってその１次抗体と二次抗体+酵素で反応を見ています。

とにかく再現性が悪かったので、洗浄方法やプレートをCV＜5%の
保証されたものに変えたのですが、特に超低濃度側での値が高く、
予想されるKd値付近で値が下がり、その後高濃度では飽和します。
この変わった濃度依存性ってありえるものでしょうか。
再現性も結構悪いんですが、ELISA実験はそのようなものなのでしょうか。
洗浄は、使用バッファーを200ul入れ、２分待ってから、
流しに振って落とし、ペーパータオルに叩いて液をなくしています。

>>255
乾かせば濃縮されるんじゃない？
とりあえず何か蒔いてみたら？

つまらない質問ですがすいません

最近CBB染色が上手くいかず、全体的にぼや〜っとした感じに染まってしまいます
無数にあるはずの小さなバンドは全く染まらず、メジャーなバンドも一応は染まるのですがシャープなバンドになりません
ウェスタンや銀染だとちゃんと染まるので原因はおそらく最近新しく作ったCBB染色液にあると思います
誰かこのような問題の原因として考えられること及び解決策を教えてください

>>262
固定がうまくいう言ってないんじゃない？
そのCBB染色液を作り間違えている可能性が高いね。固定と染色を同時に行っている場合。

>>263
CBBの組成は0.1％CBB、50％メタノール、7％酢酸です
染色の時には前固定を行わずに直接CBB染色液に漬けています

今まではこのやり方で上手くいってたのに…

>>262
バンドがシャープでないのは、考えられる原因は3つかなー

1つ目は、ゲルが悪い。つまり、作った人がヘタレか試薬が劣化してる。
2つ目は、ウェルが悪い。つまり、流す前に掃除をしなかったことが原因。
ずぼらな子や、気の利かない子に多い。
3つ目は、流すsampleの質の悪さ。変なものがコンタミしてて邪魔してる可能性がある。

pBabeというレトロウイルスベクターにcDNAを入れて、ウイルスを作成して
発現させたいのですが、cDNAにpoly-Aシグナルが入っていてもいいのでしょうか？
RNA ウイルスなので、プロウイルスが出来るときにRNAがpoly-Aシグナルの後ろで
切られて、作成されないのでは？と思うのですが・・・

細胞の培養上清に分泌されるタンパクをWesternで見ようとSDS-PAGEをするのですが、
どうしても目的にものがバンドが横に短く縦に太くなって丸く見えてしいます。
これはサンプル中の塩濃度やPHが原因なのでしょうか？
また、対策方法があればお教えください。

分泌される糖鎖が付いているタンパク質はそういうスメアバンドを示すことがある。
あと培地ごとSDS-PAGEするよりはTCA沈殿とか冷アセトン沈殿するとかして
サンプルの塩濃度を下げてから泳動すると解決する事がある。

>>268
縦長だけだとスメアになっているで説明できるのですが、横が短くなっているので･･･。
塩濃度は透析膜を用いて、サンプルの溶媒を水に置き換えてはいます。
やはりアセトン沈や、セントリーコンなどを使った方が塩濃度は下がりやすいでしょうか？

隣り合ったレーンは？
レーンによって円濃度が違うと広がったり短くなったりする。
なるべくそろえよう。

>>266
当方もただいまレトロウイルス作成中。
いまmammalianの発現ベクターにのってるcDNAは、
stopの後に300bpくらいの3'UTRがあって、さらにpolyAもついてる。
教授曰く、これをそのままレトロのベクターにのせ替えると
polyAで転写が止まってうしろのIRES-GFPが転写されないから、やっぱりまずいらしい。
適当なサイトがないので、stopの直後にサイトつけてPCRで取りなおすよう指令されてます。

こんなんで回答になるか怪しいけど参考まで。

トランスジェニック植物をいま作っています。
アラビへのアグロの感染効率を上げる裏技があれば教えてください、、、
感染の活性が弱いんでしょうか？？活性の測定方法ってありますか？

あと、多少質問がづれますが、アグロ感染後の次世代の植物にアグロの菌が残ることってあるんですが？
残るならばどれくらいの世代まで植物体に残ったりするのですか？？

アラビってのはＡｒａｂｉｓ属のことですか？
アグロはＴ１を播くと生えてきますね
でもＴ２にまで行くってことはないでしょう

あら
びすー



















ドプシっ

>>273
レスありがとうございます。すみません、、「アラビ」とは「アラビドプシス」のことです、、
もしかしたら次世代まで残るかと思いました、、
まぁT1世代なら花芽に感染したアグロが確実に残ってそうですよね。
パーテクルガンの遺伝子導入ってどの程度細胞内に残存するもんですか？
一過性とは言いますが、、、
まぁ銃みたいなもので打ち込むわけですが、打ち込んだ瞬間、
金粒子についていたDNAはすぐはがれて、しかるべき場所に移動するんですか？
そして金粒子はどこにいってしまうんでしょうか？
細胞に悪影響は無いんですか？？

あとトランスジェニック植物作出の裏技も教えてください。

17kdaのタンパク濃縮の最善法は何でしょうか？

TFA沈殿

すいません、酵母のコロニーから簡単にPCRをするとき、
楊子でかきとって水にsuspendしてボイルした上清を
使えばいいのでしょうか？
それともグラスビーズでvortexした方がいいのでしょうか？

>>277
レスありがと。
クルードのサンプルから極力目的のタンパクを濃縮したいのです。
免沈以外ではないですか？

>目的にものがバンドが横に短く縦に太くなって丸く見えてしいます。
ロードした総タンパク質量が多すぎると、そうなることがあるけど・・・。

>>278
酵母でコロｐできるん？

ふつうに最初に熱で５分くらい煮るだけでコロピーできるよ

んじゃ、大腸菌のコロＰと同じ要領でやれば良いんじゃない？

PCRの予備加熱で一気にドーン

>>272 , >>275

シロイヌナズナの形質転換法のコツ

新鮮なアグロを使う。
　形質転換後、プレートを冷蔵庫に１週間以上置くと明らかに効率が悪くなる
健康な植物を使う。
　T0植物が形質転換までに鞘をつけないようにキープする
アグロを痛めない。
　集菌や懸濁の際に、Gが大きすぎたり乱暴に扱うと効率が低下する
dip法を使う場合、界面活性剤を多めに。
　減圧しない方が植物のダメージが小さく、トータルで形質転換体を多く得られる
全て経験に基づくので、理屈はよく分からない。おまじない要素もあるかもしれない。
通常1-2%程度形質転換体を得られる。うまくいくと5%越えもある。
秀潤社「改訂３版　モデル植物の実験プロトコール」参照のこと。

　パーティクルガンの遺伝子導入は、低頻度で相同組み替えなどを起こしてゲノムに組み込まれる。
　植物種によってはパーティクルガンでプロトプラストに導入して、安定的に形質転換を起こした細胞を選抜した後、植物体を再生する方法でしか形質転換体を得られないものもあったと記憶している。

そういうときもある

clontechのIRES-GFP vectorに遺伝子を挿入したいんですが、
いいサイトがないので、cDNAがPolyA部位を含む形でしか入れられないのです。
こういう場合、cDNA-PolyA-IRES-GFPの順になってしまい、転写の際、
IRESの前でちょん切られてしまうような気がするのですが、まずいのでしょうか？

いつの時代の人間だよ？
ＰＣＲでクローニングしろよｗｗｗｗ

>>286
>>271

マウス尾静脈からの静脈注射のコツを教えてください。
当方、プラスチック製の注射専用台を使用しています。針は27Gです。
マウスを白熱灯で温めた後、台にいれて尻尾を引っ張って
静脈と針が平行になるように挿入し、抵抗がなくなったところで静注します。
が、たまに失敗します。

人間ですと駆血帯を使用しますが、マウスでも何か工夫したら
もっと楽にできるのでは？と思うのですが。。。

S.pombeの二倍体を一倍体にしたいのですが、いい方法はありますか？自分がやってるのはＭＥＡ培地で数日の間、胞子形成させてからランダム胞子分析をしてＹＥ培地に撒いているのですが１個もコロニーが得られません(^_^;)
どうしたよいんでしょうか？何かアドバイスがあればお願いします(^∀^)ノ

顔が真剣じゃないから
まだ大丈夫だな

>>289
ひたすら数をこなせ
マウスがいないなら他研究質が屠殺処分する奴でいい、ひたすら数をこなせ
コツってのは言葉で説明できるもんじゃねえ

>>292
やはり鍛錬あるのみですか、がんばります。

タンパクをSDS-PAGE→CBB染色すると、
いつも決まって同じ大きさの、バンドともいえないような
変な形の線が検出されます。
試薬全て作り直しても出てしまいます。
どうしてですか？
同じ経験をしたことがある人いますか？

>>294
ゲルは手作り？
出てくる線はサイズどのくらいのところ？
ゲルのどういうところにどういう風に出るの？

情報少なすぎ。。。

写真希望。

>295
ゲルは手作りです。サイズは60 kDaくらい。
ばっちりとしたバンドではなく、
ゲルのど真ん中に、モヤッとバンドがあるようなないような感じ。

SDSとかに混入しているゴミでは？
filtrationしてみたら？

SDSはいちおう生化学用のを使っていますが、
どうなのでしょう？？

スタッキングゲル作製用の0.5M Tris-HCl(pH6.8)はカビが生えることがある

ちなみに、ほかの人は変なバンドが出てないです。
そして、私が教えた人はみんな出てます（笑）

>300
それも作り直しているので違うと思いますが、
どうでしょう。

とりあえず、泳動画像をうｐれ。話はそれからだ。

ケラチンじゃね？

CBB染色でケラチンが出るっていったい…

>304
file:///C:/Documents%20and%20Settings/Koichi/%83f%83X%83N%83g%83b%83v/%8C%A4%8B%86/%83V%83O%83%7D/sigA/%89j%93%AE%8E%CA%90%5E.JPG

画像が出ない…。

>>306
ちょｗｗｗ

どうしたらいいの…。

まぁもちつけｗ
このあたりのうｐろだ使えばいいかと。。。(vipのとあるスレより転載。画像サイズに注意）
----------
【主なアップローダ】　※PC閲覧許可&保存許可を忘れずに！ﾒｱﾄﾞ収集･ｱﾌｨ目的の個人ロダに注意！

◎ イメぴた（http://imepita.jp）　　 送信先：[email protected]　　　　（画像専用 追加不可）
◎ UPdoga（http://updoga.com）　 送信先：[email protected]　　（動画専用 追加不可 PCブロックOFF）
△ ＠ピタ（http://pita.st）　　　　　　送信先：[email protected]　　　　　 （重い＆鯖落ちの場合あり、04:20〜04:40の間定期ﾒﾝﾃ）
◎ ピクト（http://pic.to）　　　　　　　送信先：＊規制中＊　　　　　　（19:00〜04:00の間、夜間PC閲覧規制あり）
◎ ﾅｼｮﾅﾙｱﾄﾞﾚｽ（http://new.cx）　送信先：＊規制中＊　　　　　 （20:00〜04:00の間、夜間PC閲覧規制あり）

■ PC閲覧許可を忘れずに！（「PC許可！」「見れない」などと言われた場合） ■

【pita.st】　届いたﾒｰﾙの「マイページ★」のURL（＠ピタ専用管理�n）の
【pita.st】　「3.全ﾃﾞｰﾀ一括管理＞設定と色の変更」かﾍﾟｰｼﾞごとの「編集/設定」から、
【pita.st】　　★ ﾊﾟｿｺﾝからの閲覧→許可する
【pita.st】　　★ 動画配信方法→ﾀﾞｳﾝﾛｰﾄﾞﾀｲﾌﾟ（保存可）

【new.cx】 届いたﾒｰﾙの「削除/設定変更は」のURL（ﾍﾟｰｼﾞ設定）を開いて、
【new.cx】 　★ ﾊﾟｿｺﾝからの閲覧→許可する

【pic.to】 　届いたﾒｰﾙの「履歴/設定変更は」のURL（作成履歴）を開いて、
【pic.to】 　　★ 設定＞基本設定と色変更＞◎ﾊﾟｿｺﾝからの閲覧→許可する
【pic.to】 　　★ 設定＞基本設定と色変更＞◎動画を端末に保存→許可する

■ 携帯からPC系動画＆音声が見れない場合は… ■
　◎　ファイルシーク動画音声加工ﾂｰﾙ　http://fileseek.net/getmovie.html
■ パスワードをかけた場合は正確に伝えましょう。 ■
　★ ﾊﾟｽﾜｰﾄﾞはﾒｰﾙ欄か本文に明示してください。ﾛｰﾏ字のｽﾍﾟﾙが複数ある場合は注意。

>>306
(#＾ω＾)　ふざけるのも大概にしろ。

>306
おまえすごく頭いいな

も。。もしかして>>306は釣りか？釣りなのか？(´･ω･)

http://imepita.jp/trial/20060811/486640

↑できました？
パソコンは苦手なもので…。

>>314
まて、画像にレーン説明付けれ
(#＾ω＾)　ふざけるのも大概にしろ。

おおっ！？
観れた観れた★
レーンは、
１．マーカー
２．タンパクなしのloading dyeのみ
３．粗抽出画分
４．遠心した上清画分
５．沈殿画分
６．Flow Through画分
７から９．Wash画分
１０から１４．溶出画分。
Wash画分くらいから後ろまで同じ大きさのところにバンドみたいのが
あるでしょう？？？
ちなみにタンパクなしのレーンでは実際のゲルを見ると
同じようなバンドが見えました。

画像見るまではガラス板が汚れてるだけじゃないかと思ってたが。。。

シンプルに考えるとLoading dyeに何かコンタミしてるんじゃないのか？
Loading dyeなしのlaneではどうなんだ？

loading dyeなしではまっさらでつ。

>>306
よお！浩一
元気か？

>>319
おっす！久しぶり！

アラシはやめてください…。

もう>>317がFAちゃうんか？ｗ

エクストラバンドの出ない綺麗に染色できている友達だかのLoading dye借りたり
新しく作るか買うかしたLoading dye使って比較検討してみた？
少なくとも研究者（実験している人間）ならすでにやってると思うけど。。。

＃ま。。長いことこういう仕事やってると、時に訳の分からない（説明の
つかない）事が起こるのも事実だけどなｗ

いや2で見えるバンドよりちょっと上の奴を問題にしているんだろ？質問者は。
2ndレーンの奴は単に隣から漏れた奴だろう。
問題にしているのはとくに8、9にあるやつのこととおもう。あってるよな？>>316

で、やってる事は漠然とタンパクってわけでなく、
何かの精製という事のようだから、ノンスペでカラムにつくやつがその辺にあるってだけだろ。
情報少な過ぎってだけ。
その同じラボで問題のバンドが出ないって奴が同じカラム同じサンプルで出ないってんなら
なにか別の原因か。

精製カラムから出てきているものと判断。

アフィクロで合わせたんじゃね？

あるいはwashとelutionに共通しているからその2種のバッファーに共通かな。

しかし最近>>317、322の様なのを見るが、若いっていいね。
というかデータを先入観抜きに見る重要性という例を
こんなとこで見られるとは。

>>316の「ちなみにタンパクなしのレーンでは実際のゲルを見ると
同じようなバンドが見えました。」これが引っかかってたんだわｗ

確かにWashが不完全なのかも知れんねー
キット（取り説通りに）使ってんのかな？
Wash bufferのtotal量がどのくらいか分からないが結構な量の夾雑物だなぁ

いろいろ検討して下さってますが…。
試薬は全て作り直しました。
loading dyeも借りてやってみてもダメでした。
TEMED, メルカプトエタノールもその人のを使ってみました。
それでもloading dyeのみのレーン（２レーン）では
Wash以降のレーンと同じところに出たという意味です。
Washの３つのレーンでそれぞれ10 vol.ずつ洗ってます。
Eluteは1 vol.ずつ５画分です。
同じ量だけゲルにアプライしているので、うーん、という感じです。

普通であるなら考えにくいことなので。。。
Washに出ているバンドとElutionに出ているバンド強度が大差ないので
やはりカラム精製におけるノンスペ云々とは考えにくいのではないかと
（アプライしているサンプルを濃縮とかしていなければ）

【チラシの裏】
本来なら原因と考えられる点を一つ一つ潰していくんだけど。。。
試薬・ゲル作成に使う機材（ガラス板・コーム等）全て新品を買って
やってみようー
機材は使用前に十分洗浄（アルカリ処理等）して
サンプルがなくても出るようなのでチェックはdyeのみを泳動してもおｋ
【/チラシの裏】

チラ裏のようにして出るようであれば天狗の仕業とか言い様がないｗ

確かに、ガラス板、カラム自体をアルカリ処理してみるのは
試す価値がありそうですね。
やはり、皆さんもあまり経験がないことなんですね。。。
後でいろいろやってみて、そのうち報告できたらいいなと思います。
名前はmaroとしておきますｗ

浩一、早く実験しろよ

>>328
ちゃんと出来ている人が居るのに機材が悪いかもしれないから買ってくれだぁ？？？

道具のせいにするのは、下手な証拠。
RNAの実験してるわけじゃあるまいし・・・

RNAの実験w

器具に細心の注意を払わなければいけないのは、RNA扱う実験と培養系。
常識だろ

常識ねぇ・・・┐(ﾟ〜ﾟ)┌ﾔﾚﾔﾚ

スキルの無いものに限って、物や試薬のせいにしたがる。

的確なアドバイスも何もしてやれないやつが偉そうに（ﾌﾟ

>>336
スキルのない無能君乙ｗ

「○○をしたいのですが、アドバイス下さい」
こういう質問は比較的答えやすい。経験から教えることが出来るからだ。

しかし
「なんでＸＸになるの〜？」
という、主体性のない質問は、教える事が出来ない。これは、現場のものでも同じだ。

それが理解できていないようじゃ、使えないって自己紹介してるのと同じ。

>>339
>>1
>グチからアドバイスまで幅広く語り合いましょう。
>>15

おれはぐだぐだだべってもいいスレと思う。

>>340
質問はいい。何かしら答えてくれる人がいるから。
でも、それに対して気に入らないから突っかかるってのは良くない。

>314
こんなバンドならでるよ。
いろんなひとに聞いたけれど、手のケラチンかなんかだという人はいた。
Google検索でも70 kDaのバンドはケラチンであるという説明が見られるね。
しかし、Loading Buffer入れたとこしかでないんだよな、昔の俺の場合も。
昔CBB染色でやってたころはしばしばそんなバンドが出たけれど、固定不溶の染色液を使うようになってから
出てこなくなったような気がする。
あるいは、ちょうどそのころ手作業でチップ詰めするのをやらなくなったからかもしれない。
つまりチップ (もちろん、俺は素手では触らないが) からコンタミしてるのかもね。

とにかく、タンパク質の精製度には問題はない。
だから論文データ等で使うのに支障がでるのでなければ深追いしないほうが・・・

ケラチン混入が原因なら、どれだけ下手なんだと小一時間

>342
お〜！
同じ経験をしている人がいた〜！
そうですか…ケラチン説ですね。
ひとつ頭に入れときますｗ
私もちょっと調べてみたところ、還元剤の量が多いと60, 70kDaの偽バンドが
出るそうな。
いまサンプルをアプライするとき、
メルカプトエタノールを終濃度10%で使っています。
多すぎですかねぇ？？
今度調べてみますｗ

大杉。0.5-2%で十分＞βME

現在ウェスタンを行っているのですが目的バンドが出たり出なかったりします
サンプル以外にポジコンも流していて、これも出たり出なかったりです
元々抗体の抗体価が低いようでABC染色じゃないと染まらないのですが、染まるときは綺麗に染まります
ちなみに抗体は自家製のポリクロです

このような問題の原因として考えられること及び解決策をお願いします

>>346
まー、仕方ないんじゃね。自家製だし。
ウエスタンって、100%成功するとは限らんしね。

気にすることがあるなら、エレブロくらいじゃないかな。
カプで押し上げてあげることを考えて、バッファーに勾配つけて、
確実に転写させるとか、そんなもんじゃない？

サザンブロットでハイブリをやっているのですが、
時々いくらwashしてもバックが真っ黒になってしまうことがあります。
どうすればきれいに染まるのでしょうか？
誰か助けて。

もうちょっと情報だそうよ。。。
メンブレンは何使ってるのとかブロッキング剤は何かとか。。。
それだけでもたぶん分からないだろうけど。

>349
ま、教えてクンは質問の仕方もわからないというのはいつものことだから・・・

なんだっけ、どっかのメーカーのメンブレンの品質がある時から
がらっと変わった件がなかったっけ。

基本的なことで申し訳ないのですが、研究の全体像を捕らえる方法についてアドバイスをいただけませんか。
テーマはいただいたのですが、論文になるようにストーリーを考え実験するよう言われました。
全体図もぼんやりとは感じるのですが、浮かんでは消えという感じではっきりせず、
なので具体的な実験計画もうまく立てられず行き当たりばったりの感じになってしまいます。

>>352
アドバイスと言えるかどうか分からんがお前は研究に向いてない

>>353
やっぱりそうでしょうか。

352 は４年生かＭぐらいか
だったら論文なんか書いたことないだろうから
むずかしいだろう

研究の全体像なんてポスドクぐらいになってからだよ

とりあえずは
学会誌や国際誌に投稿する論文をどう書くか想像して
やれば

>>352
まず分かっていることと分かっていないことを分かることから始めれば？

4年かM1に言うにしては厳しいなぁ。

考えさせてみるっていう教育なのかもしれないが、
全体の方向を考えるのは教官の仕事だろう。
勝手にやれって言ってんのと同じだよねぇ。

ダメ教員の典型だとオモ。

今まで実験はほとんどやったことがありません。

>>355
論文をどう書くか想像して計画を立ててごらんと言われましたが、これがかなり難しいです。
他の論文のまねといっても、それを自分なりにアレンジするのが。。。

>>356
有難うございます。これは出来そうです。やってみます。

>>357,358
でもいい先生なんです。がんばって付いて行こうと思っています。

皆さんのコメントをいただいて、少し出来そうな気がしてきました。
がんばってみます。

だいたい教える側なんて出来る事は大してない。
実際にやる奴がアイディアもってやらないと。
ボスはかねとってくる役目、中間管理職は下のトラブルシュートと自分のプロジェクト、
上級院生は下に基礎を教えつつ同じく自分の仕事。
もちろん学位は自己責任で、ペーパーでないなら何年でも。
管理職のアイディアは潤沢な資金で雇ったテクニシャンで実現。
そんなラボが理想な感じ？

何を証明したいかをはっきりさせて、それをするためにはどういった実験をして、
どういったfigureが想定されるのかを考えてみればおのずと手を動かせる事が
できるんじゃないかな。いきなり論文全体を通して考えるのは難しいし、
やって行くうちに方向性も若干変わって来るだろうから全体像を掴むのは難しいけど。
まず現時点でやるべき実験を考えて、出てくるであろう結果を予想して次に
必要な実験を想定してっていうふうに２、３手先くらいの計画を立ててみたら？
全体像を常に頭においておく事はいずれにしても大切だよ。盲滅法でやっていくと
何がやりたかったのか分からなくなって、結局目標が分からなくなってお蔵入り
なんてことになりかねないから。

>>352
最も重要なのは、自分が何をすべきか理解する事だね。
その能力を付けられていないから、残念ながら君は迷子になっているわけだ。

もし言える事があるとすれば、自分の関わる研究について関わる情報を、
貪欲に学ぶしかないね。知識量が、実験に意義を見出す鍵になる。

聞いても良いなら、大まかで良いから答えてくれるとありがたい。
君は、なんの実験がしたいんだ？

プラスミドをキアゲンのキットでミニプレップしました。
約5500bpの発現用ベクターです。
泳動すると、主に20,000bpくらい？の大きな分子量のバンドと、4000bpよりやや小さい
分子量のバンドが出ました。

制限酵素消化すると、大きな分子量のバンドはそのままで、4000bpよりやや小さいバンドは
消えて、約5500bpくらいのバンドが出ました。

大きな分子量のバンドはゲノムのDNAのコンタミで、プラスミド自体はとれていて、消化も
うまくいっていると考えているのですが、正しいでしょうか？

>>363
分からん。

まず、泳動sampleの仕様が書かれていない。
だから、判断のしようがない。


クレクレ君は、情報をもっと出してくれ。

>>363
消化前4000消化後5000bpはおそらく目的plasmid。
環状だと本来のサイズが出ない。

大分子量のバンドはゲノムのコンタミ？
アルカリSDSのアルカリ(Solution2)がへたってると思われ

>>364
これ以上どんな情報がいる？

>>365
さんくす！

>>364
馬鹿は質問に答えなくていいから黙ってろよｗｗｗｗ

コピー数が少ないとゲノムのコンタミが目立つかも。
もすこし優しく取ってあげよう。

キットってカラム？
もしそうならそれでゲノムが出るのは何かおかしい

キアゲンのスピンカラムのキットです。
あと、細胞を溶かすとき、ついボルテックスをかけています。

わかってるならやめよう。

>>361
本当に目標がわからなくなりそうで心肺しています。
頭を冷やしてもう一度整理してみます。

>>362
はい、やはり勉強不足が一番の原因と思っています。
私は腫瘍免疫の実験をしています。マウスに腫瘍を植えて、T細胞を移入し、生存率と組織を調べます。
同時に抗腫瘍効果のメカニズムをvitroで証明しようと思っています。
このあたりまで理解しているのですが、この組織を調べる、vitroで証明、というところが
ピンとこないので困っています。

>>373
実際の所、説明できる時点で実験の内容は分かってんじゃない？
多分、あれだ。in vitroでの系外再現性を求める理由に納得がいってないだけとか。

組織を調べるってのは、固形腫瘍がちゃんと植わって育っているか確認ってことで、
スライスして組織染色とかするんじゃないかな。
in vitroは、系内で見えない現象を、系外で確認するって事だと思うよ。

大丈夫。やってりゃ、結論あたりに「答え」が出てきて、納得がいくようになるはずだから。

>>374
自分の理解はこれに毛が生えたような程度です。大丈夫でしょうか。
組織はおっしゃるとおり、免疫細胞移入数日後に免疫染色で調べるつもりです。
細胞内や細胞間相互作用のメカニズムをin vitroで調べます。

また各実験の準備等、下調べも良くわからず、始めてみると試薬がなかったり、
かなり無駄な苦労をしています。全体像がつかめていないからこそ
そういうヘマをするのだと思っていますが、みなさんは実験準備等は
滞りなくできますか？

そういうやついるね。
抗体無いのにウエスタン始めてみたり。
まあなれたら大丈夫だとおもうけど。

ただそれは研究像がどうとかとまた別の話だな。

>>375
実験に関しては、前もって自筆のプロトコルを作成する事をオススメします。
A4ノートに、ボールペンで殴り書きでも良いんで、自分で納得して書くことをお勧めします。
そうすれば、試薬が足りないなんて事はありません。

試料やサンプルを確保する事から、既に実験が始まっているのだと考えてください。
そうすれば、今よりは改善されるはずです。

>>352
横レスで申し訳ないが、「これから論文を書く若者のために」（著: 酒井 聡樹）でも読んでみるといいかも

本人乙

みなさん親切なアドバイス有難うございます。

>>376
そうなんです、自分は全体像も細部もはっきりしてなくて、本当にどうしようかと思って相談しました。
でも以前よりも少しよくなりそうです。

>>377
試料やサンプルを確保する事から既に実験が始まっている、この言葉とても心に染み入りました。
ぜひやってみます。とても勇気づけられました。

>>378
早速購入してみます。ご紹介有難うございます。

>>377 380
場所もな

>>381
おいおい、実験しようとする時に、場所の確保が出来ていなければ、しようとも思えんがなｗｗｗ
それ、実験始める以前の問題ｗｗｗｗ

タンパク発現とかで、LB培地に1%Glucoseを添加するときに、オートクレーブ後にGlucose溶液を混合する理由は、
オートクレーブ前に入れてしまうと加熱でメイラード反応が起こってしまうからってことでいいんでしょうか?

焦げるから

>>379
酒井先生ほど有能じゃありませーん
本の価値くらい分かったほうがいいよ
いい本に気付かないと、後々苦労が絶えないから

いい本に気づいたけど無能な奴乙

>>383
アミノ酸と糖が反応するからじゃなかったかな。
そのせいで、使えるグルコの量が予定より減るからってのが原因だった気がする。

だから、大目にぶち込めば問題ないはず。でも、質の悪い培地になると思う。



学部生の話だから、話半分で聞いてくれｗ

>>387
そのとおり

アミノ酸と糖が反応する　→　この反応の大部分はメイラード反応だから
383は自己解決してるんじゃねえの？

んじゃ、質問じゃねぇじゃんｗ

いや、高温での糖の反応といえば、メイラード反応かなと思っていたけど、誰も同意してくれる人がまわりにいなかったので、
確認したかったんです。
安心できました。thx

>>384は炭化とメイラード反応の違いも分からない馬鹿ってことでOK?

>>392
おｋ

初歩的な質問ですいませんm(__)m
大腸菌の培養についてです。
前培養、本培養それぞれを
行なう理由を教えて頂けますか？

>>394
宿題は自分でやｒ（ｒｙ


培養の理由：増やしたいから

>>394
前培養やってやらないと、大腸菌が拗ねて増えてくれないから

ミニプレップのときvortexしろ、つうのに、なんでペレットが残ってるまま次の操作をする？
溶液加えて振って遠心しろ、つうのに、なんでゆらゆらチューブを立てたまま水平に前後するだけで遠心するんだ？
制限酵素処理のとき10xバッファーと滅菌水と酵素をなんでプラスミドの元チューブに加える？

やってられねぇー！ええ、俺の教え方が悪いんですよ、、、、

>>397
ｵﾏｲが悪いんじゃないよ。
そいつが馬鹿なだけだ。

>>397
その場合言っても良いと思いますよ。
「君は、人の話を聞いてないんじゃないかな？」って

まあ教え方が悪いんだろうな

いや、本当に人の話聞かない奴は、どれだけ教えてもダメだわ。

高校以来、そこそこ以上の連中しか周りにいなかったので、
大学院に来て久しぶりにホントにダメな奴ってのと接するようになった。
それでつくづく思うのは、こういう奴らを使ってそれなりに機能してる
コンビニやファストフード店のマニュアルってスゲェ。大学院も見習わなきゃなｗ

そこの卒研生！
制限酵素を採取するのにピペットマンのチップを酵素液に深々を刺すな！
チップの中の容積より外側にべったーと付着してる量の方が多いだろが！

そういうやつらに限って
「製薬会社で研究職につきたい」とか
与太をぬかしよるからこの世の中は侮れない・・・
つうかそんなやつらの相手をしなければいけない
大企業の人事担当者が正直かわいそうです

そこで、コンビニやファストフード店並みのマニュアルですよ！

1000mlの緩衝溶液を作ってもらうはずが、
「全部混ぜてpH合わせたら１４００ml」になりました〜」だと。
おい、中和前に水１０００ml取ってそこに試薬を入れて溶かしたんだろ！

ここは使えない卒研生・ロンダM1の愚痴を語るスレではありません

使えないロンダＤ３の愚痴は？

基本的に
「卒研生＝どうしようもない程の馬鹿」
と思っている方が良いと思う。そうすれば精神的にも少し楽。

時々M1、M2でもﾊﾞｯﾌｧｰすら作れないようなｱﾌｫが存在するけど、
そいつらはオマケみたいなモンだから適当に相手しておけば良い。

ごく稀にまともに実験できないＤがいるが、
そんな奴は存在価値が全く無いので無視しておｋ。

>>397
もう分かっていると思うけど、vortexするといわないで、完全に懸濁すると教える。
溶液加えて振るって教えないないで、(いわゆるP2を加えると仮定するけど）
透明になるまで懸濁する、ただし、激しくはだめ、と教える。

つまりマニュアル的に教えたお前にも問題はあるんだよ。相手に考えさせなきゃ。
多少は。制限酵素の件はどうもいえないけどね。

ま、お互い大変だね。ただ、相手に考えさせる教えかたしていると、不思議と
相手は恨まないもんだよ。多少きつい言い方しても。例外はあるけれど。

>>397
まだマシだ。うちには
やる気無い、研究室に来ない、聞かない、聞いてもやらない、逆ギレする、
考えない、調べない、常人では考えられないことをする．．．
と、死んで欲しい奴がいるぞ


あ、1つ忘れてた。俺のカップラーメンを食う。

>>411
ﾜﾛｽ
おれも院生の頃は良く勝手に食ってたなーwww

>>410,411
自分で考えることを好まない学部生・院生が増えている気がする。
そいつらに、自分で考えるよう促すと煙たがり、断定的に教える者になびいてしまう。新興宗教の信者のようだ。

アマシャムから買った抗GSTヤギポリクロ抗体とHRP標識proteinG-HRPの組み合わせがピクともシグナルが出ません。
やはり、常番のシグマの抗GSTウサギポリクロ抗体とHRP標識proteinGでないと駄目なんでしょうか。

RP-HPLCを使用しているのですが、勾配をかけたときにOD280のピークが
20分付近で急に上がってその後、急激に下がります。理想はゆっくり上昇
してほしいのですが・・・・。どなたがなぜいきなり下がるか教えていた
だけませんか？ほんとに困っています...よろしくおねがいします。

A液は5％ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-0.1％HFBA
B液は80％ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ-0.1％HFBAです。

>>406
メスフラスコぐらい使えよ

おそらくRPーHPLCのカラムに不純物または前回誰かが使用したときの
夾雑物が残ったままになっているのであろう。

>>413
考えないだけならまだマシなんだよ。
ピペットを洗剤につけずに乾熱したり、何考えてるかわからん。
初めは使えない奴は雑用をさせとけばいいやと思っていたが、
今では居ない方がはるかにマシだと思ってる。
いつも監視しているわけにもいかないから、マジで死んでほしいよ。
幸いにも、奴はいつも休みか昼出勤で、いても殆ど実験せずに机でボーとしてる。
ボスも「奴はキレやすいから気をつけろ、あまりきつく言わないようにしておけ」と言う始末

訂正
>>「奴はキレやすいから気をつけろ、あまりきつく言わないようにしておけ」
「奴はキレやすいから気を付けろ、切れると何をするかわからないから、
あまりきつく言わないようにしておけ」

>>418
結局のところボスがぬるいのがいけないな
本人を説諭して、やる気をださせなければならないんだろうが。
その手のごみ院生のごみ度は他の院生に感染するんだ。

>>414
組み合わせがあってないんじゃない＞


>>418
一言言っちまえ。
「君は、もっと勉強すれば化けるんだけどねぇ・・・」

>>414 定番はそういう意味の時はていばんって読んでね。

>417さん
何回が勾配かけたら直りました！ありがとうございました！

>>420,421
そういうレベルじゃないから．．．
それと、学部で今年卒業。
ゴミどころか、硫酸ピッチみたいな存在だな。
酷過ぎて感染なんてせん。

俺もそう思われてるんじゃないかと心配になる学部生であった。

>>424
ちょｗｗｗ流石の学部生も、そこまで酷いのいるのかよｗｗｗ

少なくともうちのコースにはいないよそんなやつ。そういえば他のコースのラボのやつの後輩が実験中に電車でGOやってたたらしい…しかも専用コントローラー持参w

そういうバカって、毎日実験してたって進歩も無ければ達成も無いよな。
達成感も無しにどうしてこんな生活選んでるんだ、そいつらは？
給料も貰えない、先も見えない、拘束時間長い･･･
それでも大学院に留まって研究してるのは、日々、とまでは言わないまでも、
月単位程度で何かが達成できて、それを支えに出来るからじゃないのか？

国立の学生って、概して向上心がないよな。
今に安心しきってる感がプンプンする。

>>429
何で"国立"限定なんだよｗ

いや、私立の学生は確かに危機感を持ってるよ
危機感だけでどうにかなるもんでもないけど

私立出の方が、最近はマシだね。
むしろ、そちらさんの方が最近は使える。

国立の奴はダメだね。東大京大ってのは別として、
他の国立出は、そのブランドに慢心して他が付いてこない。
己を高めようと、勉強をしようとしない。

実験がうまくいかないことを詰問するスレ？

ウェスタンで出るか出ないか微妙なバンドを染めているのですが、止めるタイミングが分かりません
目的バンドが出た段階で止める(発色液を捨てDWで洗浄)と反応が進んでノンスペが上がってしまいます
かといってバンドが出る前に止めるわけにもいかず綺麗な図が作れず困っています

誰か発色停止のタイミングのつかみ方みたいなのか一瞬で発色を止める方法を教えてください

>>418
それはおそらく注意障害(ADD)だよ

>>434
ＣＣＤでやれ
無いならかりにいけ

>>434
ぶっちゃけ、それは当人のテクニックだね。

>>434

温度の低いところでやるかDAB試薬を薄めにして発色の速度を遅くしる

大腸菌のグリストで質問です

研究室に10年近く前のグリストがあり、これを起こそうと思いましたがまったく増えませんでした
教官はもう古くて仕方ないから新しく作り直せと言われましたがかなり複雑なコンストラクト(とある遺伝子に複数箇所変異を入れてる)で今から新しく作るかと思うとゾッとします
そこで質問ですが残ったグリスト(500μlぐらい)を溶かしてそれでミニプレップしたらプラスミドを取ったりできないでしょうか？

藁をもすがる思いです、よろしくお願いします

>>439

大腸菌のほとんど死んだグリセロールストックからミニプレップでプラスミドを回収することは可能です。

>>439
とりあえずやってみれ。他に方法ないし。

>>439
取れるよ(･∀･)

>>440-442
ありがとうございます
どうせ捨てるしかないグリストなので明日さっそく試してみます

>>443
条件さえ上手い事合わせれば、生きてる分だけ掘り起こせるかも。
1 sampleを複数sampleに分け分けして、同時にPCRかけてみて、
どれか一個でも増幅したらokでいこう。

グリセロールストックの形じゃなくって、プラスミドで取っといた方が安全だよね。

まぁ、よくあることだし。

なんでグリセロールストックで取っておくんだろうね

菌屋の伝統だね

でも１０年ぐらいで死ぬかなあ
ストリークじゃなくて
ストックをちょっとだけ薄めてスプレッドしてみたらどうですか

組織のdissociation cultureするために
PBSに粉末パパインを溶かしてるのだが、全然溶けてくれない。
失活を最小限に抑えて溶かす方法を誰かご存じですか？

>>449
溶液にぶち込んで、rtで1week放置。

とけた分だけつかえば無問題

>>449
ついでですが、パパインは還元剤を入れてやると酸化で失活していた酵素の活性
については復活しますね。目的に合うか話かどうかは分かりませんが。

＊＊＊

基本的なことで申し訳ないですが。。。

キアゲンのゲル精製キットで、バンド切り出したアガロースゲル溶かしたものを
スピンカラムに吸着させて溶出する方法で、制限酵素消化したプラスミドを精製
しているんですが、回収率が制限酵素消化前の10%くらいしかありません。
どういった操作に問題がありそうでしょうか？

泳動パターンは綺麗です。
波長長めのイルミネーターを使っています。
アガロースゲルはちゃんと溶けています。
カラム吸着時のpHは問題ないようです。

452ですが
ひとつ気になるのはスペクトルが変です。
220nm付近にピーク、230nm付近にショルダーがあります。
（普通は260nmにピークが来ますよね。）

スペクトルが変なのはアガロース由来の成分が除けていないためらしい。仕様ｗ
http://www.dojindo.co.jp/letterj/098/commercial_05_main.html

ウェスタンで感度を上げたいと思っています

普通ならABCや金粒子で標識された二次抗体を使うところですが自分の実験は
とりあえずちょっと見てみたい程度なのでそういうのを新しく買うことができません

そこで相談ですが、例えばHRP標識抗ラットIgG(マウス由来)という二次抗体があって
これにHRP標識抗マウスIgG(ラビット由来)を反応させたら感度があがりませんか？

つまり目的タンパクを抗体が認識し、その抗体を二次抗体が認識し、その二次抗体を
別の二次抗体が認識するというかたちです

こんな実験が上手くいくかどうか教えてください

HRP標識ﾌﾟﾛﾃｲﾝGてもいけそう

>>452
少量で溶出できるタイプは、古くなると収率下がるよ。
カラム冷蔵庫に保管してある？

>>453
グアニジンじゃないかな。エタ沈すれば消える。
吸光度の０点はちゃんと溶出バッファでやってる？

>>457
ありがとうございます。
50microLあるいは30microLで溶出するキットです。
まあ力技ですが、スタートのDNA量を増やしてとりあえずはしのいでいます。
次のロット購入時からは気を付けます。（違うキットかも知れませんが）

溶出バッファーは10mMのTris-HClのようです。
そのまま次の反応に支障がないとのことですのでそれ以外は入っていないと思います。

ある塩基配列のクローニングをTAKARAのLAtaq Polymeraseを使って行っているのですが、
変異が多すぎて困っています。
Pfu ultraや、Phusion、KOD plusなど他のいくつかのポリメラーゼで試してみたのですが、
まったく伸びてくれません。
現在、TAKARAのPrime Star HSと、InvitrogenのPlatinum taq poly high fidelityという
ポリメラーゼの購入を検討しているのですが、これらの使用経験がある方いらっしゃいましたら、
yieldやfidelityなどについての感想を聞かせていただけませんか。

>>459
（ ﾟдﾟ）ﾎﾟｶｰﾝ

KOD plus酵素を使ったPCRはタカラTaqに添付されてたdNTPsではまったく増えずに、
KOD plus酵素キットに添付されたdNTPsでしか増えなかった。

何が違うんだろう？

Phusionかからない？あれは相当いやな配列でもかかるという
印象なんだけど。
以前ゲノムDNAをPhusionで増やしたとき、6個中5個は普通の
バッファーでかかって変異もまったく入らなかった。
残りの1個も、DMSOをfinal 3％でいれたらかかったし、
変異も1ヶ所しか入らなかったよ。
(DMSO濃度はいろいろ振って試した）

まさかとは思うけど、LAtaqと同じ条件でPCR走らせてないよね？

>>462
ご回答ありがとうございます。
Phusionを使ったときの条件は、アニーリングを45℃−1分、
伸長反応を72℃1kbあたり30秒で行いました。
目的の塩基配列中にはGCリッチな部位は見当たらなかったのですが、
LAtaqを使った際に、ノーマルバッファーではかからず、GCバッファーのみで
伸びてきました。これの原因については何が考えられるでしょうか。

>>459
手元にPhusionのプロトコールないからうろ覚えだけど、
確かプライマーのTm値の計算法が他と違うんだよね。
Phusionのサイトで、JavascriptかなんかでTm値を計算できる
（URLは添付の説明書に載ってた）
あと、伸長反応時間、1kbあたり30秒でよかったっけ？
もっと短い印象があったけど、増やしたい長さによって違うんだっけか。

GCリッチに見えなくてもGCバッファーでないと増えない
ことは時々あるよ。二次構造とかの影響なんだろうけど。
自分がPhusion使ってノーマルバッファーで増えなかったときは、
最初にGCバッファーのみ、ノーマルバッファー＋DMSO10%、
GCバッファー＋DMSO10%、と条件を振ってみた。
どっちかのバッファー＋10%DMSO（どっちか忘れた）で少し増幅が
見られたので、いくつかDMSOの濃度を振って、最終的に3%に決めたよ。

>>459
一応念のため。LA Taqでサイクル数どれくらい回してますか？

ウチはクローニングはPrimeSTARに最近切り替えたけど問題なく動いてます。
こないだとった1.9kの断片は25サイクルで全長変異なし。

>>452
つPromega Wizard Kit

>>462
説明書を確認したところ30秒はゲノムDNA の時間でした･･･。
私の伸ばしたい断片は1.6kbなので、15秒でいいみたいです。
説明書もよく読まずに申し訳ありません。
この場合何か悪影響はあるのでしょうか。
素人考えで伸長反応時間は長いほうがよく伸びそうな気がするのですが。
Tmについては一度サイトで計算してみて、
DMSOについては、462さんの条件で一度検討してみたいと思います。

>>465
ご回答ありがとうございます。
LAtaqの時は、30サイクルまわしています。
もう少し短いほうがいいのでしょうか。
Prime STARについてのご意見も参考にさせていただきます。

プラスミドをGC richな部分で制限酵素で切った後、ライゲーションしています。
ライゲーションそのものはうまくいくのですが、再度その部分を切ろうとしても切れません。
シークエンスしてみると、配列が乱れていました。
GC richな部分を制限酵素で切った場合こういうことが起こるのはよくあることですか？
酵素で切る際にDMSOなど入れたほうが良いのでしょうか

>>467
その乱れは、法則性が無いかな？

ありませんね。☆活性かもと思って調べてみましたが違うようです。
毎回違う配列に乱れており、あまり規則性は無いように思います。

乱れって欠失？塩基置換？それとも挿入？

おもに挿入です。だいたい２塩基ぐらいがランダムに入ります。置換していることもあります。
なんなのでしょうね。

>>466 たった1.6K?16kじゃなく？
一応とれてるなら使えるとこだけ切った張ったしたり、
エラーのとこを戻すmutagenesisしたり。
それと、PCRエラーなのかtemplateに入っているのか確認とか。
30cycleはちょっと多め。25ぐらいふつう。

>>467説明足りない。セルフライゲーション？
切ったあと精製してる？
そうでないならライゲーションのとき制限酵素が死んでない可能性。
65度と言わず95度で殺す。特にBamHIは死ににくい。

>>467
472の場合だとしたら、バックグランドのコロニーを一生懸命
拾ってる可能性があるね。数がいつもよりも少ないとかなんか
ないのかな。

ありがとうございます。
酵素はSgrAIというやつで、NEBから購入しています。
ちゃんとライゲーションされているからきれてはいるようなのですが、思ったよりコロニーが少なく
なんだか変な風に切れている印象です。
変な風に切れたDNA同士でたまたまライゲーションされたものだけが増えてるのではないかと。
ロッシュも同じ酵素を出しているのでそれも試してみようかと思っているのですが
やはりGCが極端に多い（８０％）部位なので変な３次元構造をとってしまうのではと考えているのですが。
DMSOをいれたらどうかと考えたのはそういう理由です。

それから切断後、ゲルを流して精製してます。熱による不活化はやっていません。

>>474
可能性はあるね。幾何構造上の都合で、切れんでも良い所が切れている可能性や、
切りたい所がスルーされている可能性があるね。

ライゲーションしたコンストラクトが、大腸菌の中でつぶれてしまっているのでは？

>467
すっかり人気者になってるな。
PCRをしていないのなら、GCリッチだからといってそこで高次構造をとっているとは思えない。
変に末端が削れてもGCリッチな突出末端ができてライゲーションしていると思われる。
なるべく精製に気をつける (個人的には、もう、フェノクロしてしまえ、と思うが) のと、
ライゲーションは室温で短時間で終わらせてしまえばエラーは減る。

ただし、>477の言うようなこともあり得る。その場合はどうやってもそのコンストラクトはできないので、
他でコントロール実験してみるしかないだろうが、NEBカタログではうまくいくってあるから俺ならやらない。

>>478
言い忘れていましたが、そこの部分でＰＣＲを行っています。
そして標準のバッファーではＰＣＲがかからず、ＤＭＳＯを加えるとかかります。
だから相当な高次元構造をとっていると思っています。

次にＳｇｒＡＩで切る時にＤＭＳＯを加えたものとそうでないものを行って比較してみます。
結果は報告します。
色々ありがとうございます。

プラスミドを鋳型にSP6で完全長cRNA（3kb）をin vitro転写したいんですが
途中で伸長が止まって1.7kの産物ばかり出来てしまいます。
何か解決法がないでしょうか？

２つに分けては駄目なの？

>>480
直鎖化後のプラスミドのサイズは確認してる？
直鎖化のための制限酵素処理かＰＣＲでインサート内部が切れてるのでは。

あるタンパク質の抗体が欲しいのですが市販されていないためウサギを用いた抗体作成を行っています
しかし何度免疫感作してもウサギを変えても抗体価が上がりません(非常に弱い抗体は出来てます)
分子量は40kDa、特に害があるわけでも種間で相同性が保持されてるわけでもないのに不思議で仕方ありません
何とか抗体価を上げるいい方法はないでしょうか？
また、知り合いに変性抗原だと抗原性が上がると聞きましたが本当でしょうか？

>>480

polyAシグナルの後でプラスミド
きっといた方が効率よくRNAできるよ。

>>483

抗原タンパク質をホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドで処理すると抗原として認識されやすくなる

失礼します。データ処理のことですみませんが少し教えてください。
標準偏差はEXCELでだしたのですが、グラフに描くとき標準偏差バー(?)みたいなのが
だせません・・・。どうやってバーを書けばいのでしょうか？ほんと初歩的なこ
とですみません。どなたか教えてください。よろしくおねがいします(><)

>>486
質問する場所が間違ってるね。
ここ、生物板だから。

口で説明すんのめんどくさいなぁ。とりあえず、周りの人には聞いた？

488ｻﾝ
うちの研究室2人しかいなくて先輩にきいたんですが知りませんでした。ネットで探してはみたんですが…わかりませんでした…

ほい
http://www.google.com/search?rls=ja&q=%E3%82%A8%E3%82%AF%E3%82%BB%E3%83%AB+%E6%A8%99%E6%BA%96%E5%81%8F%E5%B7%AE+%E3%82%B0%E3%83%A9%E3%83%95&sourceid=opera&ie=utf-8&oe=utf-8

490ｻﾝ
申し訳ないです。助かります！ほんとにありがとうございました(>_<)

>>486の先輩の頼りなさと、>>490のググってくれる優しさに嫉妬(>_<)

pfu DNA polymeraseで増幅したPCR産物をそのままSma Iで切断したｐBSにクローニングしたけど、
seqenceを読んでみたら、PCRで増幅したinsert DNAの5’末端一塩基が足りない。
こういう現象は普通に起こるんですか？原因は何でしょうか？

ヒント：シーケンサーは正確に読めない

何回も読んだよ。

>>494
こいつはアホ

他のクローンも読んでる？全部欠けてんのか？
ならプライマー発注か合成ミスだろ
それから末端が欠けてるってのとは違うが、
Ｐｆｕ系は、塩基置換はおこりにくいけど欠失はよくおきるよ

insertの５末て
プライマーの５末ですやろ？

他のクローンを読んでない。
プライマーの合成ミスも考えられない。

497
そうです。

>>498
他のクローン嫁やカスｗｗｗｗｗ

ないよ

ちょw
それなんて夢のポリメラーゼを使った実験?

501
の日本語よくわかりません。

ごめん
今わかった。

確かに夢のポリメラーゼだな

pfuですか？
KOD plus と比べたら、どうちが強いかな？

ロシュがTaqポリメラーゼ値下げしたな

>>493
あのな、合成オリゴが3'→5'方向に合成されてるってこと知ってるか？
HPLCで-1の長さのオリゴを除くような精製をしないかぎり、5'の欠けたオリゴは常にコンタミしてるんだよ。
合成の効率が悪ければ、-1、-2のオリゴが半分くらいってことだってあるんだよ。
そもそも、一個だけシークエンスって、何だよそれ。トーシロかよ。

そうなんだ。はじめで聞いた。情報ありがとうー
もう一回実験やり直します！

素直だなw

>>508読んで、>>507の揶揄するような調子を反省してる。
正直スマンかった。

いいえ、ありがとう。実はさっきまですごい落ち込んでたのよ。みんなの意見を聞いたら
自信戻ってきたよー

509さんはいつもｗを使うよね？どういう意味なの？
すみません、時間があったら教えてー

たぶんｗ＝軽くワラ＝微笑

そうかなｗ

名無しのゲノムクローンさん発言しすぎだよねw

ここに書き込む以前に頼れる先輩やスタッフはいないのかねぇ・・・

確かに。
まぁ性格によってはなかなか質問しにくい雰囲気の研究室もあるんじゃないかな。

質問させてください。
遺伝子実験ど素人ですが、
あるオペロンのクローニングをしている者です。
サザンブロットのプローブをそのオペロンの一部でＰＣＲにより作製し、
サザンブロットを行いました。

結果、欲しい大きさのバンドがEcoRIで確認できました。
ですので、EcoRIで消化したゲノム（サザンブロットに使った試料）を
電気泳動にかけて、その大きさのゲル断片を切り取り、ＤＮＡを抽出しました。
そのＤＮＡをpUC19で形質転換して確認する前に、
プローブを作る際に使ったプライマーでＰＣＲにかけてみたんですが、
目的バンドが得られませんでした。(プローブの大きさのバンドが出るはずですよね？)
ゲルから切り出した試料だけでなく、ゲノムをEcoRIで切っただけの試料も同様に
目的バンドが得られませんでした。

どうゆう事なんでしょうか？
さっぱりわかりません。

この文章ももしかしたらさっぱりわからないかもしれませんが
よろしくお願いします。

切り出した位置がズレていたってのは？
オレだったら、そのサイズ、ちょっと上、ちょっと下をそれぞれ切り出して、
PCRでどの画分に目的のDNA断片が含まれてるかチェックしてから次に進む。

EcoRIのサイトがPCRの範囲にあったらどうなる？

＞519さん
幅を取って切ってるつもりなんですが。
サザンブロットの結果がでたメンブレンにゲル重ねて切ってます。
なんかいい方法ありますか？

>520さん
それはシーケンスで確認したのでないはずです。

あと、ゲルから切り出してないEcoRIでゲノムを切っただけの
テンプレートでのＰＣＲも目的の産物がでないんですよね。

>>521
制限酵素反応を１時間程度にしてやってみたら

>523さん
完全に、確実に切れてるところだけを見るってことですか？
ちなみに今は20ｈ反応してます。

チャットかよw
反応系を書いてみて

40マイクロリットル中に
ゲノム30マイクログラムくらい
EcoRI 1.5マイクロリットル（１０Ｕくらい）
です。37℃で20hです。

あ、どうも。
切れすぎちゃってるのかと思ったけどそうでもなさそうですね。
自分だったらPCR産物を酵素で切ってみて確認するかな。わからん。

そうですか。
ありがとうございます、チャットみたいに笑

EcoRIのバッファーって濃いからPCRを邪魔してるとか。

やっぱりそうですかねー
切っただけのんは精製してないんで。
明日、エタ沈してもう一回やってみます。

>>526
反応系がむちゃくちゃ。
DNAの濃度が濃すぎ。最高でも200ug/ulで。
制限酵素も酵素反応だから基質濃度が高いと反応しない。
それ以外にソースからコンタミしてくるinhibitorも無視できなくなってくるしね。
後、1Uの制限酵素がどれだけのDNAを切断できるか分かる？

いろいろカタログみると制限酵素の使い方載ってるからそれみて勉強してみなよ。

訂正

200ng/ulで
失礼。

>>531 制限酵素も酵素反応だから基質濃度が高いと反応しない

バカ発見！！

>>531
まあエタ沈しないならこのくらいでもできなくはないでしょ。

>>530
エタ沈（フェノクロもついでに）しないとサザンでも切り出しでも
泳動が乱れない？

>>529
まさかそこだったとはw

PCRのtemplateには制限酵素処理したゲノムどの位つかってるんだ？
　
結構多目に入れて初めてかかることもあるぞ。
試しに加えるtemplate(ゲノム）の量を振ってみたら？

鋳型に対してプライマーが過剰になるようにしないと、
増えないでしょ。
鋳型量とプライマー濃度が分からんから何とも言えないけど。

今日マウスの尻尾を持ってたら先端2cmぐらいの皮(?)みたいなのが取れました
出血は少ないのですが下の筋肉(?)みたいなのが見えてて痛々しいです
とりあえず絆創膏を貼っておきましたがいっそ尻尾を切断した方がいいでしょうか？
経験のある人教えてください

>>537
もっと、マウスの事を考えて扱ってあげるべきです。
相手は確かに実験動物ですが、一動物です。
物のように扱うんじゃない。

自分の身体で考えてみ。
「腕持ってたら怪我したんで、いっそ腕切断した方が良いねとか言われたんだけど・・・」
とかなって、喜んで斬られるか？

通常、消毒して安静にする。これ基本。
あんたは、動物実験に関する倫理事項を学んでこんかったんかい。

>>538
待て待て、あんたネズミから採血するとき一般的に尻尾を切断するって知らんのか？
下手したら化膿することを考えたらどっちが正しい選択か考えろよ
あんたは動物実験に関する基礎技術を学んでこんかったんかい

って愛誤に何言っても無駄か

>>539
あぁ、切って採血したわけね。それ、要は斬り方が下手なんだろ。
俺なら、採血後30秒以内に必ず血が止まって、完全に傷が塞がるぞ。

斬り過ぎたなら、そう言えよ。
そういう時は、瞬間接着剤で止めるのがセオリー。

>537
痛々しいまではグロく、絆創膏をはったところは萌え、そして尻尾切断まで読むとちょい猟奇的
なかなかおもしろい文章だ。

大腸菌のヒートショックって普通は１分くらいだけど、これを１０分とかやったらどうなるのでしょう。
要は温度が急に上がったときに形質転換が起こるんだから、１分といわずに１０分でも２０分でも同じことだと思うのですが。

温度を急に上げるところがキモ。
10分って。。菌に与えるダメージは無視？

ヒートショックって３７度〜４２度でしょう？
だったらそれほどダメージ無いように思うのですが

最近買ったNEBのEcoRI, 何回やっても、どれだけ長くインキュベートしても
Partial digest......
俺にいったい何が起こっているのだろうか。

Native PAGEって、SDS-PAGEのやり方そのままで、単に実験系すべてからSDSを除くだけでおｋ？

>546
特殊条件でのみおＫ

とりあえず、倫理と技術の両方を学ばずにマウスに触った537は逝ってよし。

マウスも気の毒に。こんな下手糞なカスに触られて。

>>542
ヒートショックでなにがどうなって形転が起きてるか分かってますか？

>>549 教えて

せめてググってから分からないところを聞け！

>>550
いや、本読めよ・・・マジデ

俺もしらねー
教えて！先生

形質転換なんて経験則だけなんだから、
ヒートショックで効率の上がるメカニズムなんて
誰も分かっちゃいないよ。
>>549がイキがってるだけ。

そもそもヒートショックの効果なんて大して無いからな

>>554
バカだなぁ。
コンピ処理の意味もわかってないのか？

>>556
俺も知りたい。文献だけでもいいからおしえてちょ

そんな知りたいなら俺が教えてやる。
そのかわり二度と訊くなよ！

大腸菌がびっくりして油断してしまうのだよ。
あれだ、突然女の子にキスすると相手もびっくりして
受け入れてしまう原理と同じなんだよ。

まあ、大腸菌にとっては突然キスどころか
突然レイプその上妊娠ぐらいの出来事だとは思うが・・・。

>>557
なんか「膜構造が不安定化してどうのこうの」って本には書いてた希ガス

>>558
お前ふざけてるだろ。








残念だが、起きてる現象はマジで近い。
瞬間的な熱衝撃で運動が激しくなり、不安定になった膜部分をDNAの一部が通過してしまうんだ。
ボケたようで、実は一番近い説明って、なんともいえんなｗｗｗ

>>561
素人が言い出しそうな仮説だが、証拠はあるのか？

院試勉強で読んだ「遺伝子操作の原理」という教科書に、
ＤＮＡの取り込みは早い段階で起こってて、
取り込まれたＤＮＡが分解されるのがＨＳで抑えられる
って書いてあった覚えがある。

>>563
ほー、それは知らなかった

>>562
激しくｶﾜｲｿｽ

で、結局真相は？
>>549先生どうぞ！

今、膜の熱運動説を支持する文献を必死で探してるんだから
ソッとしておいてやれよ。

うはｗｗｗｗバカが必死に否定したがってるｗｗｗｗｗｗ

どうせならRI標識されたDNAを用いてHSによって分解が抑えられるのか、それとも取り込みが促進されるかを実験すれば面白いのに

そういった実験って、あんまり聞かないよな。

質問します。
平滑末端DNAはリン酸化されにくいですか？
東洋紡のは一本鎖にして、リン酸化していますが、
宝は２本鎖でするようになっています。
リン酸化が悪いのか、なかなかPCR産物(KOD-plus)が
クローニングできません。

タカラの
ＢＫＬで一発ＯＫ
ただしＰＣＲ産物を切り出してからな

切り出しがめんどくさかったら
フェノクロ
Ｔａｑ反応系で７２℃１５分
あと
ＴＡクローニング

それもめんどくさかったら
フェノクロの代わりに
ＰＫしてゆでてから
バッファそのままでＴａｑ

>>569
いや、当然そういう実験の挙句に>>563のような結果を得てるんだって。

>>572
ありがとう。
PCR産物4Kだけど、やってみるわ

>>572
ＴＡクローニングで思い出したけど、ＴＯＰＯクローニングキットって賞味期限異様に短くないか？
買った当初は効果抜群だけど、あっという間に効果が落ちていって
数ヵ月後にはもうだめ。
高価なのにもったいない

>>575
食うの？

白血球中のイオン組成分かる人いますか？

ヒント：本

学生が本を読むのをやめたのはいつからか。

昔はcurrent contentsなんて本もあった（遠い目

>>578
洋書を探せばいいのでしょうか？
題名をご存知でしたら是非教えて下さい！

>>581
書籍を漁って調べる事も、勉強の一環なのだよ・・・

リンパ液ならとにかく、血球中だろ。
そんなの教科書レベルの話なのか？つか、調べてる人いんの？医学書？

とにかくw

ともかくって言いたかったんだろうね・・・

どこもかしこもリンパ液中の値ばっかり載っています。
もう少しがんがって探してみます。

ちゃんとあったよ。
よく調べてみ。ファイトファイト

いま、形質転換してて、氷中５分のあと、42℃かける前にSOC培地入れちゃいました！！
あわてて、直後に42℃-30secかけましたが、望みはないでしょうか？

ちなみにプラスミドはpETベクター、ホストはRosetta2(DE3)です。

ヒートショックなんかなしでもぷらすみどは入る

ありがとうございます。
とりあえずそのまま明日の結果を待ちます。

>>589
入らなねーよ

>591
まいくろいんじぇくしょん
えれくとろぽれーしょん

常温放置なら入らないこともないとか聞いた。

>>592
>>588のやってるのはどう見ても塩化カルシウム(ルビジウム)法だろ
そうやって意味のない揚げ足取りして嬉しいか？

>>588
SOCは37℃で加温していたもの使ってるんだろ？
だったら一応ヒートショックの効果はあるので入ってるんじゃないか？

HSの効果は高々数倍だよ。室温の培地を使っていても。

>>588
まぁ、蒔いてみれば？
全く入ってないわけでもなかろうし

どうでもいいがRosettaは形質転換効率がものすごくわるいぞ！
俺ならボスにばれないようにだまってやり直す

ヒートショックなんかしなくたって入るよ
>>591
マニュアル人間乙wwwwww

>>599
入りにくいのもあるんだ、実際に。

>>598
>Rosettaは形質転換効率がものすごくわるいぞ！

そうか？
いいものと比べたらそうかもしれんがすごく悪いという印象はなかったが…。

0.5mlくらいのディスポカラムでお勧めあったら教えて下さい。
下部がキャップで密栓でき，エッペンチューブに差し込める大きさのものを探しています。
お願いしますm(__)m

588です。
形質転換の結果をご報告いたします。
入っていました。

なんだかんだ言いながら、結局やり直しもしておいたのですが、無駄にでした。
（でも、ミスったらやり直すのが王道、という考え方は間違いではないと思います）



ところでLB培地のなかにできる結晶質の澱はなんでしょう？
滅菌後未開封でもできるようなのでコンタミではなさそうなのですが。。

ちなみにSOCは氷冷してありました。

クールショックかぁ！！！ｗ

コンピも氷冷してありましたので。。。

操作手順ミスによる精神的ショックはあったかもしれません。

>>606
誰が上手い事言えと・・・

>>603
教科書通りの組成で作って変な結晶が出来たなら間違いなくコンタミだよ…

>603
LB？売っているSOCにならコンタミに似てる感じの沈殿が生じているけれど、
自作するとでてこないんだよなぁ

>>603
なんか反応してんじゃね？
特に変わったものは入れてない？

>603
>LB培地のなかにできる結晶質の澱はなんでしょう？
溶けきってない寒天とかじゃないですか？

>>608と>>611は退場ね。もう少しいろいろ経験してからきてね。

>>612
で、結晶質の澱の正体は？

>>613
その正体を知るには何をしたらいいのかな？分ります？

とりあえず、全部新品の試薬で綺麗な器具を用いて作ってみれば？

>>612
あほかｗ　もっと色んな可能性を考えろｗ
Circle growとかカプセルに入ってるLB系培地だったらゼラチン様物質が
沈殿してくることあるんだよｗ

>>603は良くある提供情報不足

ふつーのLB培地です。

なんとかイラストレイテッドにかいてあるまんまのです。

>>617
ふつーって。。。おいｗ
なんとかイラストレイテッドなんてのはいらないから読まないけど
バクトトリプトンとイーストエクストラクトとNaClを混ぜて作ってるってことか？

そうでつ。

そもそも結晶質の澱ってのがどんなものかいまひとつ分からない

話は変わるがうちの研究室で誰かがLB培地作ってオートクレーブにかけずに帰ったことがある
で、そのLB培地は翌日の朝にオートクレーブにかけられたわけだが、終わった後で見てみるとなんか白いモヤモヤみたいなのが浮いたからコンタミだろうということで捨てた
まあ、単純に滅菌前のLB培地なんて微生物いっぱいだからそれを作っておいて滅菌しないで一晩放っておいたら繁殖して当然ってわけだ

>>619
コンタミかどうかっていう人がいるけど、それは簡単に確かめられるよね？
で、確かめてみたらいい。俺はコンタミじゃないと思うけど。

で、それが何かだけど、その変なものが悪さしないのであれば気にしない方がいい。
そんなことに気が散っていたら時間の無駄になる。どうでもいいことにかかわらない方がいいよ。
もっと大切なことがあるはずだからそれに注意を集中してください。

その物質が何であるのか、どうしてできるのかを答えることができる人は多分いないと思う。
ま、それでも何かいいたい人がいたらいったらいいと思うけど、まあ、無駄に時間使ってるなって
俺は思うけどね。

なんか変だけど気にせずやって上手くいくからまあOK、なんて常識を疑うね

明らかにおかしい現象が起こる以上は何か根本的な間違いをしてる可能性があるし、それで出たデータなんか信用できない
後でやっぱり試薬がおかしくて全部やり直しなんてのは絶対に避けたい
もし原因がたいした事でなかったら時間を少し無駄にするだけの被害ですむ

雑で適当な実験系でなんかそれらしい結果が出て喜んでるなんて子供の科学遊びだよ

沈殿物っていったってごく少量だろ？

少量の沈殿物が出たLB培地で培養した大腸菌で
得た結果が信頼できないって、どんな実験？

そんなセンシティブな実験で、
LB培地みたいなロットで差がでるような代物を使って大丈夫なのか？

>>622 言ってる事は正しい。
が、LBなんか大抵どうでもいいので、このばあい>>623が正しい。
もう少し経験積むと、大事なとこといい加減でもいい所が分かるようになるよ。
ロシアのロケットに衛星打ち上げてもらった話で、
最後に衛星を包む防寒布はおばあちゃんが針でちくちく縫ったらしい。
そんなかんじ。

水を疑った方がいいのでは？
ふつうは蒸留水や脱イオン水で作るけど
どうせ菌を殖やすだけだからと
水道水で作ったら沈殿できたよ

あ、ありうる・・・

精巣を乖離してとってきた細胞100個からｍRNA抽出してRT−PCRやってもバンドがでねぇよぉ。デジェネレィトプライマーだからか、テンプレートが少なすぎるからかー。卒研やべぇよぉ

ちゃんとコントロールとろうな。

予備実験で１年が終わりそうだな。

若いから大丈夫！ｗ

>>628
成体の精巣では同じプライマーでバンドがでるんス。薄いけれども。。。
乖離した細胞100個（あるステージの細胞だけあつめた）でも出るはずなんだけれど。。。出ないス。そしたら教授が「じゃあ千個集めろ」っておっしゃるんス。。。しんどいです。

>>629
まじでそんな感じなんス

>>630
あさーす！

>>631
そんな喋り方の子は、もう一年やってろｗｗｗ

成体の精巣で出るバンドを同じように出したいのなら、
100%マッチープライマーでやればいいんじゃないの

>>632
すんませんス！

>>633
それはそうなんですが、マネー不足なんス

やめて就活すれば全部解決o(^-^)o

酵母に関する実験やったんですけど、分光光度計ってのを使ってしました。
それで、分光光度計について調べてみたもののあまりわかりません↓
それと、分光光度計で出た％は、高ければ高い程、酵母の菌が適応されている（つまり、酵母の菌が増殖しやすい温度）ってことですか？
分かる人教えてください！！！！！！！
そしてそして
ここに酵母のスレのっけるのもし間違えてたらすみません..↓

それがわからないと実験がうまくいったかどうかがわからないんです...(o>_<o)

まあ、落ち着け。

分光光度計は、サンプルが光を吸収したり散乱したりする度合いを測る器械だ。
つまり、吸光度（Absorbance）の値が大きいほど、測った溶液の濃度や濁度が高いってことだ。
それは同じサンプルをより薄く希釈した場合に値が小さくなることでも確認できるはず。
酵母の培養液の濁度を測ってるんだから、その値が大きければ大きいほど、酵母の濃度が高い、
すなわち酵母が良く増殖したということになる。
こんなもんで分かった？

>>637
つ、釣られたんじゃないのか・・・？

>>635
就職しよううがしまいが卒論は通る必要があるわけだが
っていうか4回生がいまさら就活って無理だろ

オリゴのPAGE精製ってどうすればいいんでしょうか？
教えてください。

ここは実験のプロトコールを聞くスレではありません
それぐらい自分で調べましょう

>>640
20%のPAGで100V3hぐらいで良いのでは。
degenerateオリゴなら、バンドが分裂することもあるけど
それぞれのバンドを回収すれば問題なし。

回収したバンドは、2mLチューブに回収して
ゲルを滅菌したペッスルかスパチュラか1mLチップで砕いた後、
0.3MAcONaか1X TAEを入れて十分にボルテックスにかけ、
遠心分離して上澄みをとり、ゲルろ過。

オリゴメーカーもプロトコルを公表してるよ。
http://www.jp.amershambiosciences.com/newsletter/oligo_mail/oligo5.asp

polymeraseについて質問です。
phusionとpyrobestの各々の特徴・違いは何でしょうか。
ラボの先輩は、phusionの方が正確性が高いといっていたのですが、どこかにデータが出ていますか？

メーカーに問い合わせれば、喜んでデータ出してくれるよう。

もう一個質問です
PCRでテンプレートとして使用する、"RT産物"のRTって何ですか？

>>645
Room Temperature、つまり「室温」の略
テンプレートはPCRかける前に室温でしばらく放置しとかないと駄目だから

逆転写のＲＴだろ

>>646
ｱﾎﾊｹｰﾝｗｗｗ




















釣りか？俺は釣られたのか？ｗ

>>647
え、室温ってことじゃないの？
でも逆転写だったらGTだろ

リアルタイムPCRの話でしょ？

だからいつも書くけど質問する奴の出す情報が好きな杉なんだよ。

>>645-650
RTって書かれてる時は、どっちの場合もありうる。

どっちかってのは645の情報だけじゃ判断できません。
だから、どっちも正解。

いや、最初の質問は「RT産物」だからw

GTってなんだよwwww

まさか
G ぎゃく T てんしゃ ?
質の悪い釣り師に釣られたか?

Bluntingしたサンプルのコロニーが全く生えてきません・・・！！
制限酵素で切り出した４kb程度のバンドをキットでゲル抽出して、宝酒造のBlunting kitを使って平滑化→セルフライゲーション→宝酒造のDH5αコンピでクローニングしてます。
キットを使う時にDNA Dillution Bufferを使わずに全部ＴＥを使ってます。
クローニングする時に、コンピの量を全部半量（100μlのところを50μl）使用にしています。
LBAはAmp 50μｇ/mlです。

ボスに相談したら、キットが失活してるんでない？と言われて、新しいのを使うように言われたんですが、そんなに簡単に駄目になるものですか？
買ってから結構経ってるからって言われたんですが。

コロニーが全く生えてこないのが気になります・・・誰かこの哀れな初心者にアドバイスを・・・！！

インサート／ベクターの量比かMg不足かどっちかの様な希ガス

＞657
でもセルフなんですよー。
やはしライゲーションするときに付属のDNA Dillution Bufferを使わないと駄目なんでしょうか・・・？

>>656

5-末端がリン酸化していないとライゲーションされないから、
ライゲーション反応のときにPNKを加えておけ。

つーかブランティングにキット使うな。

すごく基本的なことをお聞きします。

オリゴをニトロセルロースメンブレンに固定したいのですが、
オリゴの入った溶液を一滴落として、UVをかければくっつくものなのでしょうか？

プラスミドを制限酵素で切って、そのまま再ライゲーションしようとしたんですが全くできません。
コロニーは少ないながらもできます。それをゲルで確認してみると、なんだか短いものができているようで
元のプラスミドは存在しません。
こういうときって何が考えられますか？

>>662
>>651
突っ込みどころ多杉ｗ

分子内　相同組換えが考えられる　from 経験者

なんかライゲーション関係の質問が多いな
基本的にリガーゼはすぐ失活するらしいから注意が必要
特に卒研生が入ってくる4〜6月ぐらいは…

あと、上手くいかないときはポジコンorネガコン入れてやってみろよ

何かコロニーができるということはリガーゼそのものは失活してないだろうよ

>>666
切れ残ったプラスミドが混入してるとか…

>>662
その短いものというのはどれぐらいのサイズ？
元のプラスミドが3kbpで短いものが2kbpぐらいならプラスミドの3次構造の影響だから問題ないわけだが

>>661
くっつくんじゃね？
UVの照射時間決めるのが面倒臭ければ、アルカリ固定もあるでよ。

RT-PCRについて質問です。
鋳型の元になるRNAから逆転写でcDNAを作る際、オリゴdTプライマーを用いてmRNA
を選択的に転写するのが一般的だと思うのですが、ランダムプライマーを用いて
全RNAに逆転写をかけることも可能だと聞きました。

その場合、polyA（DNAとしてはpolyT)をもたない部分は、テンプレートとして
機能しないということでしょうか。
だとすると、オリゴdTプライマーを用いた方が効率的で、ランダムプライマーを
使用する利点はないように思うのですが・・・。

ランダムプライマーを用いれば、より多彩なテンプレートができるからPCRがかかりやすいとか、何か利点があるものでしょうか。

オリゴdTを使うと、mRNAの5'側の配列がunderrepresentされるだろ。

>>669

死体とか病理検体のサンプルをRT-PCRするにはランダムプライマーが良い。
良質のmRNAであってもポリAから遠い5'ー末領域のPCRはオリゴdTより
ランダムプライマーかnestだろうなぁ。

つまり、目的とする配列がpolyAの近くならばorigo-dTプライマーで作成したテンプレートでPCRするのが効率的ということですか？
ただ、たまたまPolyAから遠かったときにはダメってこと？
結果的に、oligo-dTで作ったテンプレートではPCRが出来てramdomプライマーではPCRがかからないってこともありえますか？

オリゴdTの場合15mer-18merなんで逆転写時の温度を42-50℃にしてもOK
だけどランダムプライマーの場合、9merぐらいだから逆転写やアニール温度を
37℃にするとか、アニール時だけ室温ー30℃ぐらいでやって、延長反応時に
少し温度を上げるとか。

ランダムプライマーで温度低めの逆転写する場合、鋳型RNAの高次構造形成とか
考えると長いPCR産物を増幅するには向かない。つうことか。

教えてください
以前ある目的タンパクをsiRNAでつぶしたstableなtransfectantをつくりました。
そしたら結構細胞の特性が変わったのですが、今回ボスがその細胞に目的タンパクの
cDNAをトランスフェクトしたらもとの細胞に戻るかを確かめろなんて言ってきました。
同じ細胞中にターゲットが同じのcDNAとsiRNAを共存させるなんて前例あるんですかね？

>>656
ライゲーション反応の後、DNAをフェノール処理してエタ沈してる？
それをしないとトランスフォーメーションの効率はうんと下がるよ。
もしblunting/ligationしたサンプルを直接エレクトロポレーションで入れようとしたのなら、コロニーが出なくとも不思議ではない（取説にちゃんと書いてあるから、従っているとは思うが）。
私の経験では、宝のBlunting kitは（もちろんちゃんと保存してればだが）数年間は大丈夫だった（効率は下がっているかもしれないが）。
初心者と書いてあったからあえて書かせてもらうが、実験の計画に問題がないか(replication originとか薬剤耐性遺伝子が全てfragmemtにきちんと入っているか等）も再チェックした方がいいかもしれない。

>>674
なかなか面白そうな実験じゃないか。どのくらい蛋白量は回復するんだろうか。RNAiに
興味があるけれどなかなか手を出せない・・・

親切のつもりの書き込みが、単なる意地悪に見える。
馬鹿なのか、意地悪なのか。どのレスとはいわないよ。ただ、適切なアドバイスは
1/10くらいじゃない？

わかってる。おれのことだよな。

>>656
UVの波長間違ってない？

>>674
前例のあることに取り組む意味が分からない。

>>678
お前のことかどうか知らないけど、そのボスでさえ「キットが失活してるんじゃない」
てなこというご時世だからな。
キットがだめになったんじゃない？ってのはよく聞く言葉だけど、あれか、
便利な世の中になったな。だめになったですませることができるのだからな。

>>680があまりにも頭悪い件について

>>674

Stable transformantで安定的にノックオフした細胞を樹立することは難しい。
昔antisense RNAでファイブロブラストの接着蛋白をノックオフしたstableの細
胞ではがん形質が抑えられたという論文がCellにでたが、単なるリバータント
であることが後でわかった。
だから、ボスは、RNAiでノックオフしたので表現型がでたのか、疑っているのだろう。
単なるリバータントで表現型が変わったならば、RNAiでノックオフした遺伝子を
高発現して元に戻らないならば、遺伝子ノックオフと表現型は関係ないことになる。
transientでノックオフしてその表現型が出るか否かをまずチェックすることを
お進めする。

>>669
まぁ、世の中には原核生物を専門にやってる人も居るということで。
ポリＡがないから、磁気ビーズでrRNAを分離する。

新しいの使ったら死ぬほどコロニー出てきました・・・。
どうやら本気で失活していたみたいです。
お騒がせしました。
レスくれた方ありがとうございました。

でも、本当、キットに頼ってしまってる・・・危険だ・・・

相変わらず初歩的なモレキュラーの質問になると盛り上がるな・・・。

>>674
よく読んでないけど、尽きた先生の遺作のcellでそういう実験やって
ないか？

>>674
よくあるだろ。siRNAのターゲット配列に変異を入れたcDNAを使って。

それは圧制に使う場合の？

>>685
・実験が上手くいかない時は酵素が失活or誰かのバッファー作り間違え
・酵素が失活等の原因はすべて卒研生だ
・コンタミしてたら自分が下手なのではなく他人が妨害してる

これは研究室の基本だ

質問です。

一晩、低温室に放置されていたマウスの脂肪から
RNAをとったら、qPCRに使えるでしょうか？

解剖した後、少量の液体窒素に浮かべて
そのまま帰宅してしまいました。

助手の先生には怖くて聞けません...

みんなどうもレスありがとう

>>687
ほほう　ところで変異を入れるというのは、強発現させるには入れないとsiRNAで切断されてしまうからかね？
その場合はコドン中の塩基だけ変えてアミノ酸は同じになるように設計するんですかい？

>691
687じゃないけどそう。AA変えると実験系としておかしくなる。

でもそのタンパクの発現量をうまいぐあいに元と同じくらいにして
比較した、ってこと言わないといいデータとはいえないのでは。
細胞の特性比較なら。

>>690

俺ならやる。
RNAの分解が気になるが内部標準との比なら問題ないと思われ。
ターゲットが異常に分解されやすいRNAなら知らん。

けど、そのデータは恐くて発表できん。卒研レベルで時間なかったら出すかもしれんが。論文には使えんな。

ＨＴＥＣ使って実験してる人いる？

２種類の遺伝子を制限酵素配列付きのプライマーを使ったRT-PCRでとってきて、
ベクターに入れようとしています。

どちらの遺伝子についても全く同じ制限酵素サイトをつけました。
どちらもRT-PCRで増幅が確認されました。
作業は同じ試薬・器具・機材を用いて同時に行いました。

制限酵素消化、ライゲーション、形質転換と進めた結果、一方はきちんとベクター
に入ったのですが、もう一方がなぜか入りません。

どういった原因が考えられますか？いろいろ指摘していただけると助かります。

前世の因縁

前世は徳の高い僧だったので問題はないと思うのですが。。。

じゃあ前前世ｗ

>>695
ベクターのほうは同じものなの？
２つとも同じ制限酵素なの？

>>699
私は>>695ではないのですが、

>作業は同じ試薬・器具・機材を用いて同時に行いました。

だそうです。


>>695
2つの遺伝子の大きさは？

前前世はウニャニュペーギュールなのでよくわかりません。。。

失礼しました。
前前世はウニャニュペーギュール星人です。

入った方は1.5kbp、入らなかった方は1.6kbpです。
ベクターは構成物質選択マーカーが異なる以外は基本的に同じもので、同じ制限酵素で
同時に同じ実験操作で酵素消化し、ゲル泳動、精製を行っています。

制限酵素部位は一方向でしか入らないように２種類（BamH1とXho1）を使っています。

ちなみに、消化したベクターと挿入するDNAの比率を変えて（挿入DNAの方を多くしながら）
すでに３回やり直していますがうまくいきません。。

RT-PCRやミニプレップ、制限酵素消化もやり直しています。

アンピシリンは熱ショック後、SOC培養が必要ないがカナマイシンは
熱ショック後のSOC培養が必須。そのへんか？

まさかプレートの抗生物質間違えてないですよね？
私も>>704と同じようなことしか思い浮かびません。

片方がE.coliにtoxicな遺伝子ということはありませんか？

>>704
Amp、Kan、どちらもSOC培養を行ってからプレートにまいています。
ちなみに問題の起きている方はKan耐性のベクターです。

>>705
抗生物質の間違いはないと思います。
他の系でも使用中のストックソリューションですし、何度もやり直しのたびにプレートを
作っていますので。また、インサートのないコロニーはできています。

toxicかどうかはわかりません。
ベクターは発現用のpET、宿主はDE3なしのNovaBlueです。

>>695
俺もそういう体験何度もしている。
もういちど実験系でどこか間違えていないかみなおして、それでもダメなら
インサートされるｃDNAのあいしょうが悪いんだろう

そういう時は

・PCR後、一度TAクローニングして思い切りDQNを増やし、そこから断片を切り出す（確実にインサートができているのを確認）
・インサートを多めに設定してライげーション

してます。その場合、なぜか思ったようにインサートされず、色々な形のプラスミドができたりすることがあるから
よく確認するようにね

>>707
DQNだって。自分のあほさにｗ
DQN＝DNA

ありがとうございます。
手始めにインサートの量を一桁増やしてやってみます。

あ、先にTAクローニングですね。

だって、TAクローニングしておくとはっきりと「制限酵素で切れている」
のを確認することができるからね。
量も多く取れるから、ライゲーションがうまくいかない理由を考えて試行錯誤していける。
PCRでやると何度もPCRをやり直したりしないといけなくなったりする

>>708

>思い切りDQNを増やし

はこのスレの最高傑作ですｗ
人前なのに一人でPCを見て笑ってしまったｗ

>>706

プレートにグルコースは入れていますか？
私はpETとNovaBlueの組み合わせでなかなかうまくいかなかったのに、
プレートにグルコースを加えたらうまくいったことがあります。
発現用のE.coliじゃなくても漏れることがあるので。

どちらにしても他の方々が書かれているようにTAクローニングを行ったほうがよいかと。
TAクローニングで1日余分にかかるのでその間に並行してもよいかと思いますが。

>>695
同様の経験は私も何度もしています。
特に、発現ベクターを青白判定可能な宿主に入れた場合に多いようです。
到底toxicと思えない遺伝子でも、Bluntで入れると片方の向きばかりが取れることもありました。無理に自分のほしい向きを選ぶと全て変異が入った物のこともありました。

自分がやるのは、まず一度発現ベクター以外にクローニングする（他の方が指摘されているTAクローニングと同様でしょう）。
うまくいかない場合は宿主を青白判定出来ない物に変える（HB101など）。

一度クローニングした物を発現ベクターにサブクローニングできない場合は、可能であればベクターの種類を変えてみてください。

N末端でTagを融合させる必要がない場合は、クローニングに用いるN末側プライマーの3'を1~数bpくらいずらしてみることでうまくいくこともあります。

皆様、ありがとうございます。
ちょっといろいろ所用があるのですぐにはできませんが、近いうちにやってみます。

私の研究室（いわゆる「分子生物学」の研究室ではありません）では発現用のベクター
しかないのですか、TAクローニング用のものを買うべきでしょうか？その場合、何か
お勧めはありますか？

あと、RT-PCRは変異を入れたくないので KOD -Plus- を使っているのですが、
この場合、TAクローニングではなく、平滑末端にする方法を取った方がいいで
しょうか（この場合もお勧めがあれば教えていただければ助かります）？

>>714
あんまりタンパクの発現とかやったこと無いけどJM109とかでも
駄目なんですね。
HB101なら市販のサブクローニングレベルのコンピ簡単に手に入る
のでは？>>715さん

あとプライマーがたまたま合成不良だったりすることもあるかも...

>HB101なら市販のサブクローニングレベルのコンピ簡単に手に入る
そうですね。。（いろいろアドバイスを受けてどれが一番効果的か迷っています。）


>あとプライマーがたまたま合成不良だったりすることもあるかも...
ｶﾞ━(ﾟДﾟ;)━ﾝ

>>715

> あと、RT-PCRは変異を入れたくないので KOD -Plus- を使っているのですが、
> この場合、TAクローニングではなく、平滑末端にする方法を取った方がいいで
> しょうか（この場合もお勧めがあれば教えていただければ助かります）？

インビトロジェンのpCRII-blunt
これが最高
これ以外はお進めしない

これ、製造中止ですか？
なんか引っかからないんですけど。。

>>572
のように後でTaq系で処理してTAクローニングすれば？

pCR TOPO シリーズだな。

pCR TOPO Bluntは私も進めておきます。
TAクローニングでなくとも、ベクターを平滑末端の制限酵素で処理して、
インサート過剰状態でクローニングも可。

ちなみに、TaqでもTOPOや平滑末端ベクターにクローニングできるし、
平滑末端を生じるpolymeraseでのPCR産物でもTAクローニングできる。
正確な比率は自分で調べてもらうとして、要は最も多いのが平滑かT突出か
ということです。

少なくとも、TAKARAのEx-TaqからTOPOクローニングは普段からやっています。
TAKARA PyrobestからTAクローニングも経験あり。
きっとKOD＋でもTOPOクローニングできる（と思う）。

平滑末端用のZero Blunt TOPOがあるね。


でもpUCナントカをSma1で切ったやつにライゲーションでもいいかな。

あ、先に書かれたｗ

PCR生成物のAを付けたり、またはAを削ったりして結局どっちでもいけます。

pCR-BluntII-TOPOだね。私もこれが良いと思う。
でも、よほど忙しいとき以外は、pUC19などの適当なベクターをHincIIのような平滑末端の制限酵素で処理したものを保存しておけば良いと思う。

検索したら SmaI よりは HincII のほうが効率がいいという話があるね。

> 正確な比率は自分で調べてもらうとして、要は最も多いのが平滑かT突出か
ということです。

訂正：T突出　->　A突出

お恥ずかしい。

695です。
皆様いろいろすみません。

pCR-BluntII-TOPOのキットは結構なお値段ですね。
コンピテントセルは手持ちので済ませようと思います。

平滑末端だったらTOPOじゃなくても普通にライゲーション可能では？
TOPOをつかう利点は何？

早いから

平滑でもライゲーションそのものなんて３０分程度。

MBP融合組み換え蛋白をFactor XaでＭＢＰ切ろうとしてるんですけど、
蛋白をアミロースレジンにくっつけたままFactor Xa足して常温インキュベーションして
ほしい組み換えタンパク質だけフロースルーで回収することってできますか？
レジンやFactor Xaの取り説に載ってなくて今いち不安なんですが。

pCR-BluntII-TOPOのキットは生えたコロニーが原理的にはすべてインサート入り。

エチブロって発癌物質っていわれてるけど、本当に癌になった人いるのかな
生物学者で有意に皮膚がんが多いなんていうデータあるのか？

QIAGENのPlasmid Maxi Kitでプラスミド生成してるんですけど、
BUfferQCがなくなってしまいました。
代替方もしくはQCの作り方わかる人いませんか？

QIAGENのPlasmid Maxi Kitでプラスミド生成してるんですけど、
BUfferQCがなくなってしまいました。
代替方もしくはQCの作り方わかる人いませんか？

キアゲンに聞け

買え

いや。買うけど実験中に無いことに付いたので

訂正：無いことに気付いたので

いいからキアゲンにきけよ
ﾏｼﾞで教えてくれるから

ごめ、事故解決した。
自分で作ることにした。

>>734
んじゃ、原液を毎日手に塗りこんでみ？

タンパク質の一部分のアミノ酸50残基ほどの部位の抗体を作りたいんですが、
その部位のみ大腸菌でHisタグつけて発現させ、精製後に抗原にしようと考えています。
このときペプチドに対する抗体を作るときみたいに、
キャリアータンパク質と共有結合させたほうが良いでしょうか、
それともそんなことしなくても50残基ほどなら抗体はできるでしょうか、
抗体を作るネズミ（ウサギ）ちゃん、教えて！！










すみません、エライ人、教えてください。

>>743
ガキの言いがかりかよｗ

一般に抗体のできるエピトープの大きさは分子量１０００以上だから５kDaなら余裕

>746

ありがとうございます。
やってみます。

>>744
一般的に5kDa以上なら抗原として使えると言われるからギリギリセーフ
ただしいい抗体が出来るという保障はない
あとアミノ酸50残基にHisタグ(10残基程度)を付ければどうしてもHisタグ抗体が出来てしまうのでそれが嫌ならタグを外すこともお忘れなく

>>746は抗原性と免疫原性の違いを勉強しなおすべきかと…

>>745
実際、誰かが人柱でやってくれんと分からんしｗｗｗｗ


>>744
もしうまくいかなかったら、変性させてから打つという手もある。
どの道、実験体の命を粗末にしなくて済む結果が出ると良いですね。
ご健闘を祈ります。

エチブロ、マウスの尻尾に毎日塗りこむというのはどうだろう。

>>750
尻尾のガンを作るの？

アラビドプシスでとあるタンパク質をタグつきで発現させて、
そのタグに対する抗体で発現を確認したいんですが、
FLAG、HA、MYC、HIS等のどのタグが一番使えますか？
逆に、これは駄目とか。

経験者談、求む。

>>752
やってみないと分からない

細胞にJC-1かけて、蛍光でミトコンのパーミアビリティー見ようとしてるんですが、
そもそも全く光りません……。
フローサイトメーターもコンフォーカルもない貧乏研究室なのに、
教授に「これ（JC-1）でやってみてくれ！」と言われ、倒立型落射蛍光で見ています。
（この時点で、たとえ光ってもまともにデータ化するのさえ難しい気もしますが……）

初期の論文は顕微鏡使ってるんですが、大概がコンフォーカル。
現在ではフローサイトメーター使用が主流の試薬。
既になかなかしんどい条件がそろい踏みですが、
しかし全く光らないのは流石におかしいとは思います。
経験者の方がいらっしゃいましたら、ヒントお願いします。

ちなみに、指定の保存状態だと粉の状態で六ヶ月は安定らしいのですが、教授曰く、
「数年前に買ったまま、使ってなくてねー。まあ、ちゃんと保存してたし、大丈夫だろ」
……え、まさかもう……？

>>752

3連FLAGがお勧め

753氏と755氏のアドバイスを融合すると、
FLAG、HA、MYCを融合したタグを付けるのが、
ベストということですかな？

>>754
さっさと光らなかったといって買いなおせ
時間が無駄だ

>>754
フィルターセット間違えていないなら、買いなおした方が
いいとおれも思う。

ちなみに、目で見えない程度の蛍光しか出ないものは
コンフォーカル使ってもまともな絵にはならないぞｗ

>>757
>>758
ご助言有難う。
フィルターセット間違えてはいないと思います。
「目で見えない」というか、もうとにかく真っ暗なので、
やっぱり試薬が駄目なのかもしれませんね。

でも、恐らく買い直しってことになったら、この実験は中止です。
「試薬あるから使ってみてよ」ってことだったので……。

というわけで、うちでも出来る別の方法をアピールしてみます。
フローサイトメーター使えるならさて置き、
「うちの装置じゃこれは無理だよ！」と思っていたので、
そういう意味では幸運だったと思っておきます。

でもその代替手段に必要なものを買ってもらえるかな……
貧乏って困る……

>>756 釣り乙。釣りじゃないなら>>759を見習って何が目的で何が手段なのかよく見極めよう。

蛍光のポジコンは見えますか?　例えばGFPなど・・・。
俺の経験ではコンフォーカルの励起光の軸がずれてしまっていて、蛍光が見れなかっただけのことがあった。

コンフォーカルはともかく、蛍光顕微鏡を使いこなせない
ラボなんてないだろｗ
いや、ないと信じたい。

>>761
>>762
コンフォーカルはありません……。
他の蛍光は観察出来ているので、やっぱり光ってないのだと思いますが。

APGC法でRNAを抽出しているのだが、エタ沈の時に酢酸ナトリウムを加えると、溶液が白濁する。
遠心してペレットをDWに溶かしても溶けないんだけど、誰か同じような経験をした人いませんか？

質問です
自家製の抗体をウサギで作っていて、この前血液を採取しました
そして血清を取ろうと遠心(4000rpm、5min)したら血清がゼラチン状に固まってしまい回収できませんでした
このゼラチンの正体及びその対策を教えてください

>>765
ただのフィブリンだろ？
採血後に37℃１時間→４℃１晩をまじめにやれば大丈夫なはずだけど。
まあ、もう一度採血すればうまくいくだろう。

>>764 植物か？
ttp://abstracts.aspb.org/pb2003/public/P55/0761.html

>>767
そうです。海洋プランクトンなんですが･･･。同じく多糖が多いです。
酸性フェノールを加える前に溶液に酢酸ナトリウムを添加する際には
問題はないのですが、いざ抽出した後に塩を加えると、
もやっとした白いものが出てしまいます。
先輩は出たことがないといいます。私の腕の問題かしら？？

血漿からフィブリン等の凝固関連成分を除いて血清に近い成分にしたいの
ですが、硫酸プロタミン等を加える方法がググって出てきました。

この方法或いは関連した他の方法の詳細について書かれたサイトか文献・
書籍等を紹介して頂きたいです。
簡単な事でしたらここに書いて教えて頂いても結構です。
ヘパリン濃度が問題になるようでしたら用いる血漿は献血血漿として下さい。

>>768

kanagawa大？

>>768
酢酸ナトリウム加える必要あったっけ

定量的PCRやってる人いる？
最近流行のリアルタイムと、P32標識のPCR−サザンとどっちが定量性たかいかな
後者のほうが金もかからないで安そうだし

どっちも信用できん
ノーザンか、RNaseプロテクションやれ！

実際に発現してるタンパクの定量をやれ！

>>772
放射物使う実験は、実は避けたほうが良い。
色々手間がかかる。

>>772
ｳﾁのラボはﾘｱﾙﾀｲﾑPCRやってるけど、
ｺﾋﾟｰ数の少ないﾔﾂ（10^1〜10^2オーダー）は結構アヤシイ。

100コピー以下だとテンプレートに含まれるコピー数が毎回ばらつくのが
原因じゃないの。

すいません、
二本鎖RNAの中のNotIサイトって、GCGGCCGCなんですが、これはendnucleaseの
NotI処理でカット手切る者なのでしょうか？

>>778
>手切る
早まってはいけません＞＜

>>467とかでライゲーションしてもうまくいかないという人が数人いたけど
エチブロの入れすぎじゃないかな。
ずっとエチブロのストック使ってると水分が蒸発していつの間にか濃度が濃くなって
カラムで精製したＤＮＡに大量のエチブロがコンタミしてる。
エチブロはライゲーションを阻害するよ。

ライゲーションそのものはうまくいくのですが
ライゲーションそのものはうまくいくのですが
ライゲーションそのものはうまくいくのですが

少ない細胞数（〜１００個）でRT-PCRをやりたいのですが
お勧めのキットなどがあれば教えてください。
あと、細胞の形態をあまり変えずに細胞のmRNAを安定化させるような
試薬ってあるんでしょうか？

>>780
精製で除けないくらい濃いなら、見ただけで分かりそうなものだが。

プロトコールフォーラムでエチブロが原因のライゲーション不良が報告されていたね。
エチブロって実際、ほんのわずかでも十分なんだから決して入れすぎないことだな。

そんなつまらないことで「ライゲーションできねー」って何ヶ月も無駄にしたりするのってありがち。
そういう基本を忘れてはいけないね。

エチブロがライゲーションを阻害する？くだらないね。
現行流通している精製キット使ってうまくいかなかったことはないし、
キット以前のエチブロを除く行程無しの方法でやっても失敗したことはなかった。

もちろん多少は阻害するかもだけどね。

>>782

picopureか
RNAqueous Micro isolation kit
は？
LCM用のKitを探すといいやつがあるよ。

ありがとうございます。確かにいろいろあるものですね...
関連する質問なのですがT7-RNA増幅法により増幅させたRNAは、
通常のRT-PCRの発現解析系にもっていけるんでしょうか？

cDNAライブラリーをつくる意義を教えてください。
例えば１度、１種類の細胞集団からcDNAライブラリーをつくったとしたら、
その細胞からのRT-PCR（RNA抽出→逆転写）の操作ってする必要が
なくなるものなのでしょうか？あとEST解析って一回やるといくらぐらい
かかるるものなのでしょうか？

あるタンパク質を見つけ、その遺伝子が11q11.2にあることが分かったのですが、
これが何らかの疾患と関連付けられるかどうかが問題。
既知の疾患関連遺伝子の一覧とか、ないですか？
ご存知の方がいらっしゃったら教えてください。

初歩的な分子生物学のテクニックだけはやたら詳しく解説
されるなｗ

>>790
2chですから・・・

は？ 何が言いたいの？
どんな分野でも共通に身に付けてるべき知識だから、
答えられる人間の人数が多いのは当たり前だろ。
2chだろうがその外だろうが、generalが常にspecificを包含してるのは当たり前。

>>792
まぁそんなに必死になるなよ。

>>792
m9(^Д^)ﾌﾟｷﾞｬｰ

>>793＝>>794

>>790
初歩的なことしか教えることないしｗｗｗ

>>795
m9(^Д^)ﾌﾟｷﾞｬｰ

わかる事には答え、分からない事は分からないなりに手がかりを共に探し、
威丈高な質問には慇懃に対応し、思慮の浅い発現には憐れみを持って接する。
そういうスレに私はしたい。

実験すれど
実験すれど
猶わが研究、論文にならざり
ぢつと手を見る

>>799
ガンガレ・・・

50mM Tris-HCl pH8.0
5mM MgCl2
50mM KCl
10mM CaCl2
以上の組成のバッファーを使って、ペリスタでバッファーを循環させながら5時間泳動の条件でNative-PAGEをしたら、陰極に白いものが析出してしまいました。

10mM CaCl2抜きのときはそういうことはなかったので、これはたぶんCa塩の何かだと思われます。

泳動後、染色するとコントロールのバンドはきちんと見えるのですが、CaCl2は実質的にはほとんど析出してしまってバッファー中には存在しないためか、結果が芳しくありません。

同様の実験をやっている文献によるとTris-Glycine Buffer(pH8.8)に10mM CaCl2を添加したバッファーで泳動してうまく行っているようなのですが、この差が原因でしょうか(Tris-HClがいけないのか、それとも他の塩と共存させているのがいけないのか、、、)。
析出させないように泳動する方法が分かる方教えてください。

頭の体操ゲーム。
癒されるよ！！
http://www.hiyoko-team.com

>>801
間違ってたらごめん。
たぶん、Caの水酸化物が白くなってるんだと思う。

>>789
OMIM

ｵﾏｲﾓﾅｰか？

▼今実験で上手くいかない事を質問するスレ▼ part6
http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1146716446/l50

質問です。
この前、大腸菌にアンピシリン耐性遺伝子を導入した上でアンピシリンを含んだ寒天培地で
培養する実験をしたんですが・・・結果としては大腸菌が全然繁殖してなかったんです。
という事は実験の操作を誤った（大腸菌の植え付けに失敗した）か、
あるいは遺伝子導入がうまくいかなかったかなんですが、テキストを見ると
大腸菌の形質転換が起こる確率はかなり低いって書いてあるんですね。
という事は、今回大腸菌が繁殖してなかったのも実験の仕方が悪かったのではなく
単に運が悪かっただけ、というような事をレポートの考察欄に書いてもいいのでしょうか？
ご教唆願います。

コンピーテントセルをボルテックスにかけたか、
コンラージ棒を加熱し過ぎたか、
培地を作り間違えたか

すとっくの菌が死んでた可能性は？

学生実習だと思うけど、他の班はうまく行ったの？

>>808−809
早速レスありがとうございます。
培地は教授が作ったので多分作り間違いはありません。
ボルテックスとコンラージ棒はテキストに載ってないし使ってないと思います。
ストックの菌についてですが、アンピシリンを含んでない培地では増えていました。
他の班では大体うまくいってましたが何班かはうちと同様に菌が全然繁殖してませんでした。

>>810
コントロール実験してからここに来な。それまではくるな。

>>811
コントロール実験って何ですか(?_?)
実験の実施要領を見ると今年度中はそういう事をしないみたいですが・・・。

>>812
そうくると思った。学部生だろう？
なら失敗して当たり前。そっからいろいろ学びなさい。人に聞かないで。
方法はいろいろあります。ただ、それを2chに求めるのは愚の骨頂。
あなたこんなところで正解得られてもあなた成長しませんよ。

>>813
私も多分そう言われるのではないかと思っていました。
それにも関わらずここに質問を書き込んだのには理由があります。
私は元々細胞とか遺伝子の分野があまり得意ではなく、
テキストに書いてあるベクターとかの単語の意味も最初は全然わからなくて
一つ一つ調べてやっと実験の主旨を理解したんです。
勿論実験の際にも手順を間違えないよう注意を払いつつ遂行しました。
それなのに失敗してしまったのは正直言ってショックだったし、
元々知識がないので失敗した原因が全然わからないんです。
でも自分なりに失敗の原因を究明しようと本やネットで調べる事はしたんですよ。
だけど生物系の実験は化学とかと比べると資料自体が少ないし
形質転換が起きなかった原因にまで言及している文献は見つからなかったんです。
それで藁にもすがる気持ちでここに来ました。
だから人助けだと思って回答して頂けると有り難いです。

コンピテントセルがちゃんとできてなかったんじゃない？
もしくはプラスミドが精製できていなかったか

他の班が成功している以上は運が悪かったなんて書くのは愚の骨頂だろう

どこまで共通の試薬（コンピも含む）を使ったのかも
書いてないのでアドバイスのしようがないぞｗ

まあ、御託は良いから聞きな。
まず、失敗した時は、成功した例と比べて何か違いがなかったかを考えろ。
そのビビたる差異を見つけ出せない限りは、いつまで経っても解決しない。

で、その少ない条件から判断して、答えられる範囲で疑問を潰してあげる。

・自分が植菌したコロニーは、amp耐性がない
→形転を行ってセレクションを行った状態からの選択植菌なら、必ずamp耐性はある
・きっと、自分の取ったコロニーは遺伝子導入が上手くいっていない
→セレクションをかけて増えたやつは、全部成功している
・きっと植えた時にそいつの遺伝子に変異が起きていて、amp耐性がなくなった
→植菌群中一個体にちょっと変異が起きたくらいで、いきなり増えなくなるなんて事は起きない

一番可能性が高いのは、君が植菌をミスってる可能性。
つまり、コロニーを突付いた心算で、突付いていない。

>>817
こういうお馬鹿さんが、さらなるお馬鹿さんを教育している姿って痛いよね。
君は大学四年生からやり直した方がいいね。端から見ていると楽しいからいいけど。
自分に酔ってるところがどうにもおかしくて。

学部生の実験で一番多いのが、植菌ミスという事を知らないのか・・・

コロニーを取って増やしているんじゃなくて、
コンピとプラスミドからトランスフォーメーションしてるんだと思う。

>コンラージ棒を加熱し過ぎた
それときどきやらかしてるｗ
加熱しすぎてガラスが曲がるｗｗ
でもコンタミの心配なしｗｗｗ



自然に冷えるまでぼーーーーーっとしてるがな。

ん？トランスフォーム後はampプレートに撒くだろ？
そっからコロニー拾ってLBに増やすとき増えなかったという話じゃないのか？
コロニー自体が出来なかったの？

まあ学生実験なんて失敗しようが成功しようが関係ない
一連の操作、実験の原理(この場合セレクション)が理解できる事が重要
考察は自分なりに一所懸命考えて書けばそれでいいと思うよ

あと、ピックアップしたコロニー(爪楊枝につく細胞数)によってLBで増えるのが遅い場合もある
(夜LBにコロニー拾い翌日朝にはまだ透明、そのまま浸透すれば増えてくる)

>>822
>コロニー自体が出来なかったの？

よくわからんが、まさにそういう事を言ってるのではないかと推測すr。
次の段は同意。学生実験なんて結果なんてどうでもいい。
原理を理解し、どれだけ調べる努力したか。
それだけじゃない？

>>821
コンラージ棒は滅菌するために加熱するのではないよ。
アルコール飛ばすために加熱している。どういう教育受けているんだよ。

それは知ってる。でもしばらくあぶってると炎の色が変わってイイだろ？

花火感覚か

そこで使い捨てコンラージ棒が登場。

807ですがいろいろアドバイス有り難うございます。
あの後自分なりに考えてみましたが、やはり私たちの班はたまたま運が悪くて
失敗したのではないかという気がしてきました。
何故かというと、他の班のプレートを見せてもらったところ
形質転換に成功した班でも大腸菌のコロニーの数が１個や２個と少なかったんです。
という事は成功した班でも運が悪ければコロニーが０という事もありえたのではないでしょうか？
ちなみに大腸菌の植え付けは私ではなく他の班員にやってもらったのですが
横から見ていた限りでは特に操作に問題は見受けられませんでした。

また初歩的な質問にタカって、知ったかぶりして自尊心を満足する虫けらどもが集合してるなｗ

あれ、「コンラージ棒」を使わないって？

えっペンに１ｃｃ前後入ったヒートショック後の菌液をどうやってプレートに撒いたの？

まさか、「画線培養」じゃないよね？針金の輪（エーゼ）で、菌液を一適とって撒いたわけじゃないよね？

('A｀)　まあ、当人が納得したならそれで良いんじゃね。
上手い事マトメとき。

最近はビーズでスプレッドするのが主流になりつつあるよ

>>828
>形質転換に成功した班でも大腸菌のコロニーの数が１個や２個と少なかったんです。
それ失敗なんじゃないの？
入れたDNA量がどんなもんか分からんけどそれはいくらなんでも効率悪すぎ。

>>832
それなんだけどさビーズって高くない？
安いスプレッド用ビーズあったら教えてください！

学生実習の形質転換が失敗する原因は簡単だよ
残りかすの適当なコンピを使わせてるから。
それだけ。
いちいち学生実習のために１０００円もするようなコンピ買ったり、
３日も４日もかけて自作したりすると思う？
俺のとこは毎年フリーザーの整理ついでにやらせてるよ。

>>834
うちは普通のガラスビーズをオートクレーブして再利用してるわ

いまさらだが>>824-826にワロタ

>>836
シリコナイズ処理してないガラスビーズだと微量のDNAが吸着されちゃって
転換効率おちないか？でもってシリコナイズ処理したビーズって
オートクレーブするとシリコナイズはげないか？
あたりがいまのとこの疑問デス
でもすばやいレスさんきゅ♪

プレートに菌液をまいた後にビーズをまくから、ほとんど効率は変わらないよ
大量にプレートがあるときはプレートを重ねて一気にかちゃかちゃ広げられるから便利

>>835
うちは、毎回綺麗なの買って使わせてるぞ。

>>789
Ensemblとか

>>835
うちは、　毎回新しいの作らせて使わせてるぞ。

BIO-RADのでSDS-PAGEゲルがつくれません。
絶対もれます。コツありますか？
持っている5セット全てアウト。
買ってから3回くらいしかつかってませんから、老朽化してるわけではないはず。

>>843

ゴムパッキンから漏れるの？洗濯バサミの実際にあたる部分をパッキンの真上から当ててる？

どうしてもというのなら、あんまりやりたくないけれど、ゴムを濡らしておけばペタッ張り付くよ。
実験の精度？学生実験ならかまわないでしょｗ

>>843
パッキン挟む時に引っ張りすぎ。

QIAGENのQiafilterMaxiでプラスミド精製中です。
イソプロ沈とエタ沈のとき、しばしば沈殿をロストしてしまうことがあります（廃液入れに落ちちゃう）。
何かうまい対策はありませんか？
またはもっといいプラスミド精製キットはありませんか？

>>846
　
デカンタしてんのか？
ピペットで吸い取ったらいいんでない？

>>847
マニュアルに「注意してデカントしろ」とあったもので、ずっとデカントしてました。。
全量で30ml弱あるんですが、全部ピペットで吸うしかないですかね。

よく混ぜて沈殿をちゃんと脱水してからな

あと
デカントでのぞけない分はチビタンで底に集めてから
イエローチップで吸う

チューブの素材が悪いか、回転数が低すぎるんじゃないの？
沈殿が流れ落ちたことなんて一度もないけどな。

それから、遠心じゃなくってフィルトレーションでDNA沈殿を回収する
こんなキットもキアゲンにあるよ。
ttp://www1.qiagen.com/Products/Plasmid/QIAGENPlasmidPurificationSystem/HiSpeedPlasmidMaxiKit.aspx
「沈殿させたペレットを失うリスクがない」ってさ。

>>846
卒研生に教える時は１時間遠心するように言ってるよ。

>>846です。
よく考えたら昨日お礼を言うのを忘れてまた覗きに来ました。
まとめてですみませんが、情報ありがとうございました。>>847>>849-851
特に>>850のキットは面白そうなので、とりあえず買ってみることにします。
ウデは悪くてもカネだけは余っているので。。

手作業での培養細胞からのゲノムDNA抽出で、フェノール処理やPCI処理を行うのですが、
そのときの遠心は12,000xgぐらいでまわしてもかまわないのでしょうか。プロトコール
本では3,500rpm（2,000xg）くらいとなっていますが、これは15mlの遠沈管を使うから
だと思います。

自分の場合ははじめから1.5 mlチューブなので、もっと速くまわすことも出来るのです。
そのほうがきっちりフェノール層と水層を分離できると思うのですが、、。

もし高速だとゲノムが切れてしまうなどあるのでしたらしょうがないのですけど。
ご存知でしたらお教えください。よろしくお願いいたします。

たまに1.5mlチューブの首が飛ぶ事故はある

15000rpmで回すと

>>853
RCFとrpmの区別をきっちりつけような

つかぬことをうかがいます
ステンレス製のウォーターバスを常時37℃で使用していますが
茶色の水カビがいつも発生して困っています

都度、水カビを取ったり水を総入れ替えして洗っていますがすぐ元の木阿弥になってしまいます

水槽の材質が材質なので酸、塩基、塩素系漂白剤etc.を混入させるわけにはいきません

この場合みなさんどうされておいでなのでしょうか・・・・？

十円玉はどう？

祭りキターーーーーーーーーーーーーーー


【京大名誉教授】木村正夫氏(65)、日本人二人目のダーウィンメダルを受賞その３【超快挙】
http://food6.2ch.net/test/read.cgi/salt/1153646180/

何を動機にフード板に飛ばそうとするのかw

トルエン１滴って技がなかったっけ

>>856
うちは専用の製品使ってるよ。名前忘れたけど効果抜群

ところで、プラスミドＤＮＡにランダムにニックを入れる方法ってどんなのありますか？
ヌクレアーゼぶち込めば何とかなりそうな気がしています

ニックトランスレーションの半分だけやるんですな
今やキットすら売ってなさそうだから
ＤＮａｓｅＩ買ってManiatisでも読めばどうでしょ

ＢＳＡ1分子にＡＮＳって大体何分子ぐらい結合するんでしょうか？
文献探しても見つからなかったもんで……わかる方いたら教えてください

>>862
ボルテックスじゃだめなの？
ランダムにニック入って行く様がOCの増加として見られるぞｗ
確認のために、とかいって制限酵素で切断しちゃだめだよ

Mg++の入ったバッファーでDNaseIを掛ければニックが入る。
切れた分子が混ざると困るなら、ゲルに流してOCのバンドを切り出せばＯＫ。

>>863>>865-866
どうもありがとう。
たしかにボルテックスでも十分なきもしますが、酵素のほうが再現性が高いと思って。
ところでOCって何？

16SRっていうprimerがあるのですが、
sequenceをみると
CTTTACGCCCA(AG)TAA(AT)TCCG
と書いてあって、
Bases between parentheses are mixed at one position.
と論文に記載されているのですが、
これはつまり、下記の4つのprimerをつくって
全部一緒に混ぜればいいってことですか？

16SR-AA
CTTTACGCCCAATAAATCCG
16SR-AT
CTTTACGCCCAATAATTCCG
16SR-GA
CTTTACGCCCAGTAAATCCG
16SR-GT
CTTTACGCCCAGTAATTCCG

合成屋さんに頼む時にそういうオプションあるよ。
四種類作らんでもいい。

ウェスタンの一次抗体反応で、室温で１０時間くらい放置してしまったのですがもうだめですかね！？

大丈夫じゃない？多分。

まじすか？
こんなことしたことありますか？

5'-CTTTACGCCCARTAAWTCCG-3'と書いて発注するだけ。
普通は追加料金もとられない。

>>869
>>873
ま、マジっすか！！！
もうそれで頼んじゃいますた・・・orz

あとで混ぜても同じでしょうかね？

gi:45593430

てかそんだけしか違わないんならミスマッチで余裕で増えるし
混合プライマーにする必要なし
ってかアホだなお前

>>876
ミスマッチで増えてもらっては困るんですよ、
くらいの厳しい条件を考えています。

ってか、invitrogenで>>873に言われた通りに
試し注文やってみたらやっぱり普通にアクセプトされますた・・・orz
1万円くらい損したかなぁ・・。

あと、invitrogenで注文するとき、
スタンダード、とか、カートリッジ、とか
意味がわからないのですが、いままでなんとなく
カートリッジで注文していたのですが、
どうちがうのですか？

１６Ｓ　Ｒｉｂｏｓｏｍｅ増やすのか
ってか本物の配列書くって一回精神科いったほうがいいんじゃないか？

ミスマッチで増えてもらっては困る奴が混合プライマー使うな
ボケｗｗｗｗ

Hotstartとnestedとtouchdownを全部やってダメならまた質問してくれ。

868の人気に嫉妬ｗ
でもこんなの研究室にいたら嫌だな
ていうか注文済みなら聞くなよ

てゆーか
そんなプライマーの発注スルーするボスのいるラボ...

みんなはいちいちボスに報告してから発注してるのか？

>>878
いやこのプライマーは細菌扱う研究者なら本に載ってるので
誰でも知ってるんだよ。

なら、なおさらじゃね？

だけど、俺様は(plasmid増やす以外で)細菌は扱ったことがないので
このプライマーがいくら有名とは言っても俺様にとっては
始めての一歩なのじゃよ。

わかったか。

ニックトランスレーションキットあったよ
http://nippongene.com/pages/products/hybidization/nicktkit/index.html

OCはopen circular DNA。cccもついでに理解できるようにしといて

まさかdegenerateプライマーをニックトランスレーションでラベルしようとしているのでは・・・

>>886
うそ臭い煽りだな。

そもそも>>875の配列が出てきた段階で、
そのプライマー使った論文はリジェクトされるだろう。

>>886
degenerateプライマーと細菌扱ったことがあるかないかはまったく関係ないだろ
やっぱり精神科行け

16S rDNAのことでしょう。

ニック入れるのは、プラスミドの話だったね、失礼。

ありえないバカが登場

>>875
>45593430

すみませんが、giってなんですか？
PubMedでいろいろと45593430で検索しても
ヒットしませんですた。

なので>>889のように言われてもさっぱり意味がわかりません。

ちなみに俺様は大学院に4年間も行った経験はあります。

>>894

よく知らないけど、gi ってgene IDかなんかじゃないの？
てか、普通にEntrezで検索したらちゃんとヒットするぞ。

まぁ、ともかくアレだな。頑張れ。

うはっ

>>895
ありがとう。
Genbankとやらに行っていろいろとやっていたら
やっとヒットしました。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=45593430

しかしこれって俺様の実験とはなんの関係もないんだがなw
見当違いも甚だしい。
俺様がやろうとしているのは、
「細菌ならなんでもPCRでかかっちゃうprimerでのPCR」
なんでそういうことが必要かというと、
雑菌だらけのはずの検体からDNAが取れているかどうかを確認したいわけ。
その上で、特異的primerで陰性なら、
そこで初めてそのprimerでかかるような細菌はいなかった、
ということが証明できるわけだね。

わかったかな、ボクちゃん達の学生さん達はw

海外ポスドクが２ｃｈで素人質問？
それとも徹夜で２ｃｈしてる学生か。

ナメクジが言うことを聞きません
助教授も全く指導してくれません..orz

手作業で培養細胞からのゲノム抽出を行っているのですが、除タンパクが
不十分なのか、バンドがシャープになりません。ウェルからひっぱるような
かんじになります。ゆっくり転倒混和20分でフェノール処理やPCI処理をして
いるのですが、激しくすると切れてしまうらしく、困っています。

回数を増やすしかないのでしょうか。

>>900
フェノールが悪い可能性を最も疑う。
pHとか大丈夫？

>>900
いやそれでいい
うまく取れてるかどうかは
一部（１μＬまたは１μｇ）を適当な制限酵素で切ってみたらよい

>>857>>860
アドバイスありがとうございます
十円玉を（目立たぬよう）加温器の底に一枚沈めたところ
面白いように水カビの増殖がかなり押さえられており
硬貨自体にも異常はないのですが
効果を見極めたくもう少し様子をみてみます
近々トルエン一滴も試してみようかと思います

>>861
主成分など心当たりありますでしょうか？
アクアリウム板とか実験室のカタログなどあさっているのですが・・・
これといったものがみあたりません(>_<)

金魚が病気したときに用いるメチレンブルーはどうかな。水カビも防げそうだが・・・。
しかも、生体に支障がでないことから、安全性の点でも。

ときどき掃除して替えればいいのに

ヒント；EDTA

>>903
WAK-chemie
MEdical GmbH
っていうドイツの会社の。
高いけど効果は抜群。

こんばんは、無細胞（小麦胚芽）で膜タンパクの合成を試みているのですが、うまく合成できないようなのです。

：：状況：：　5'末端にGSTを付加する無細胞用gate wayベクターに自分の膜タンパク遺伝子を組み込んで
重層法でタンパク合成を行いました。96wellプレート、26℃、20時間。
その後バッファー置換せずに反応液をSDS化（加熱）し、抗GST抗体でwesternしましたがシグナルが検出できませんでした。

「反応液に界面活性剤を添加すると膜タンパク合成が成功しやすくなる」という話を聞いたのですが、
そのようなことがあれば、教えてください。
また「膜タンパクは低温で合成するのがよい」などの温度についての情報はあるでしょうか？

※合成できてるけど検出に失敗している可能性もあるので、
今後は>67のように、SDS-PAGE前の加熱を37度でやろうとも思います。
また合成後TritonX-100→遠心しようと考えています。

合成に関するアドバイス、また※に対するツッコミいただければ幸いです。
長文失礼しました。文献なども調べてるんですが分からないんです。。。

何回膜貫通？複数回？
サンプルバフッファーを加えてPAGEする前にボイルしてる？
もし上記に思い当たるなら、ボイルしたのと70度とRTを同時に流して
ウェスタンしてその結果をここに書き込んで。

ああ、これでは意味分からんな。もうしわけない。
サンプルバッファーいれて、ボイルしたのと、
そのかわりに低温処理したのとを比べてどうかという事だ。
もちろん、GSTなしでどうなのか、の情報ももしあるならいいね。

ていうか本人気づいているじゃない。
俺ってアホ？

ありがとうございます。＞＞９０１，９０２

膜タンパク質のコンストラクトを作成する場合、C末にタグを浸けないか？

船越とインビトロゲンのオリゴＤＮＡ受託サービスは
驚くべきサービスです

本当に驚きました。 こんな事があるんですね。

ていうか小麦での膜タンパク質合成の成功率ってどれくらいだ？
俺は２割くらいってきいたぞ。８割は失敗なんだから、気にするな！

率を出すより原因を考えろよ。

SoilMaster� DNA Extraction Kit使ってる方、
http://www.arbrown.com/product/speciality_chemicals/dna/nucleice/02_02.html

取説に書いてある-20度保存のふたつを除いて、
常温保存と書いてあるのはやっぱり常温保存されていますか？
冷蔵庫じゃダメですか？
常温保存だとコンタミしそうで怖いんですけど。

あと、遠心チューブがついて来なかったんですけど、
やっぱ業者に文句言った方がいいですかね？

バカめ ＞ 常温保存だとコンタミしそうで怖いんですけど

そういえば、去年までうちのラボで実験してたＭＤが、
１Ｍトリスやら５Ｍ ＮａＣｌまで冷蔵庫に保存してたな。

俺んとこの MD なんて10%SDS やら６M UREA まで冷蔵保存してたぜ

Trisはカビ生えないけどHEPESはどうかな。

>>917
現時点では、ビーズビーターを使わないキットでやった実験は論文になりません。
回収率が悪すぎるからです。

断片化していない遺伝子を回収する必要があるなど、
特定の目的がある場合はわかりませんが。

常温保存だとコンタミした菌が増殖する可能性はあります。
開封前ならともかく、何度も蓋をあけた試薬には
なんらかの菌がコンタミしている可能性は高いと思います。
5M NaClでもHalomonas sp.なんかは生きられるわけですから、
低温保存して増殖を防ぐのは意味がないわけではないでしょう。

5M NaClを低温保存する意味があるってどんなアホよ…
炭素源、窒素源なしでどうやって菌が増殖できるわけ？
低温だろうが常温だろうがコンタミするときはするけど、
ただ増殖はできないから用途によっては全く問題ない。

>>923
おまえは滅菌水にカビが増殖してるのを見たこともないくらい経験が浅い院生か？

>>924
滅菌水にカビ生やすラボも凄いな。俺は見たことないし、そんなずさんなラボに居たくないわ。
>>923じゃないけど。

自分も見たことないわ
よっぽど不潔な操作してんぢゃないの？

>924
俺も見たことない。経験浅くてすみません。

ちなみにTrisもHEPESも1M溶液では常温でカビ生えなかった。
P源がないからだと思う。Pを含むリン酸溶液なんかはSやNを空気中から取り込むのか
知らないが、下手な取り扱いでは菌が生えるようだ。

滅菌水にカビなんて経験豊富でもなかなかお目にかかれないと思うぞ…
つーかそれって大発見なんじゃないの？

>>924の人気に嫉妬

Trisはゴルジや液胞などの酸性コンパートメントに入ってpH低下を阻害する。
あとミトコンドリアのFoF1ATPaseを高濃度では阻害する。

だからオルガネラや生体エネルギー系の実験ではTrisはお勧めしない。

>928
そうだな。重水から核融合反応で他の元素を合成しつつエネルギーを得ているのかも。
>924はノーベル賞候補

924ではないが、それがなぜかあるんだよな。
論理的にはあり得ないが、事実生えてしまったら認めるしかない。

>>924
ああ、俺もmQ水を滅菌したやつで、
ときどきそこから分注するようにしてたんだけど、
5年くらい放置してたらそのうち濁って沈殿物が
見えるようになってきて捨てた。
滅菌水に細菌・真菌が増殖するのはあり得る話だと思う。

それはそれとして、
そのビーズとやらだといろいろと手間がかかるだろ。
俺様はおまいら雑魚どもと違って忙しい医者の合間をぬって
実験しているんだから、とにかく短時間で済ませたいんだよ。
仕事が22時頃終わってから実験始めるから、そりゃもう大変なんだよ。

mQでも死なないどころか、増殖する奴もいる。
（ミリポアかどっかのカタログか本に載ってたはず）
ただ、そんなに激しく生えてこないから、
直接PCRとかに使わなければ大丈夫だと思う。
滅菌水やTrisが目に見えるくらいコンタミするのは異常だとは思うが。

わたしは924ではないのですが・・・
ビーズビーターに１０分かけるだけですよ。

土壌用の抽出キットは３・４社ぐらいしか出してなくて、
MO bioが圧倒的なシェアを持っています。

この板には微生物の専門家は少ないようですね。
滅菌水でもバーナーの炎の下（もちろんクリーンベンチ内）で蓋を開けないと、
ホコリや生きたままの胞子が無数にコンタミします。

それで？ それが>>917が試薬を室温保存しないで冷蔵することの説明になるのか？

>滅菌水でもバーナーの炎の下（もちろんクリーンベンチ内）で蓋を開けないと、
>ホコリや生きたままの胞子が無数にコンタミします。
誰もコンタミしないなんて言ってないだろ。

みんな暇だな。
すげー瑣末な議論だと思うんだが。

そんなにコンタミがいやなら使用前にフィルター滅菌すればいいだけの話。
成分変わるほどコンタミしてれば、その試薬は数年ものだ。新しく作れ。
たいした手間じゃないのにね。まぁ手間かける前にコンタミさせないのが普通だが。

マイコプラズマ

�Aチャンの先生方、
ポリクローナル抗体を作成するときの参考にしたいので、
アミノ酸配列を入れたらエピトープの予測ができるようなサイトを教えていただけないでしょうか？
それからそのエピトープ予測というのは
どの程度信頼性があるのでしょうか？
ちなみに私は植物系なので、あんまり免疫とか詳しくないです。

明治維新時の「食人族系の先住民勢力（伊藤博文等）および在日勢力（大久保利通等）」による孝明天皇親子暗殺と皇室乗っ取り及び政権奪取
http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/4880861898/503-4909883-0820712
によって発生した明治維新の裏利権（国体の骨格）を通した先住民＆在日勢力による国家支配（水面下の黒社会支配；人食い殺人文化が基本）
　　↓
日本生態学会の超一流の数理生態学者（恐らく専門は絶滅生物学および「生態系のシミュレーション」）による
絶滅しない範囲で生態学的に殺人可能とされた人間数の算定（個体群生態学を駆使した魚類資源学の人間適用）
　　↓
国際捕鯨委員会での論議（欧米は反対）と殺人可能人数の確定（恐らく年に数万人レベル）
　　↓
日本生態学会の保全生態学者陣（東大農学部・鷲谷ら）による特定外来生物法の策定とデスノート殺人法としての違憲悪用
http://www.kasumigaura.net/usr/kikuchi/oyogerukasumigaura/pager/A0034.html
　　↓
殺害対象の国民のリストアップ（毎年、数万人；年金滞納者、健康保険高額利用者、税金滞納者、福祉費高額利用者、システム察知者、稼げない老人、
食用赤ん坊、アスベスト被害者等）。なお一部は無差別殺人（北日本流通の全てのタバコへの毒物混入工作など）
　　↓
役所（交通局、森林環境部）、警察、自衛隊、病院による殺害実行と自然死・自殺・事故死偽装（年間、数万人レベル）
　　↓
葬儀社等による遺体解体（少なくとも秋田県の場合は県民全員が死後に喰われるシステム）
　　↓
人肉、有機肥料、腎臓などの臓器リサイクル（腎臓1体３００万円が相場）
人肉を国内先住民（蝦夷系）、在日系の食文化に提供 →　ＣＪＤ（一部はアルツハイマーとして誤診）
　　↓
年間、１兆円水準の闇市場
　　↓
警察や役所の裏金 →　　複数の政党の政治家への闇献金（自民党も民主党も本質は同じ） ＆　「北朝鮮拉致」事件の捏造

http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1141552515/106-111
http://society3.2ch.net/test/read.cgi/hosp/1161559670/l50
http://society3.2ch.net/test/read.cgi/mass/1157543098/l50
http://www.megabbs.com/cgi-bin/readres.cgi?bo=history&vi=1161528338

>>941
厳密な意味でのエピトープ予測手法は今のところ確立されてない、と理解している。
なので通常は、タンパク質の親水性表面に露出している残基かどうか、を「エピトープになる可能性がある」
ための指標として用いることが多い。
だから通常のHydrophobicity plotでも書いて、親水性の比較的高い領域でも選ぶんだな。

943先生返答ありがとうございます。
なんとなく、そんな感じだろうとは思ってました。

とりあえずＣ末端を抗原にしておけ

整形の見破り方！


今や、美人の約70％は整形で作られている改造人間である。

ほら貴方の隣…美人な姉さん、可愛いギャルも、イケメンも、清楚そうなあの娘まで？！　

鼻、L型は豚鼻出来ない。I型でも定着してない場合、左右に動かすと鼻筋が反対に動く。
鼻筋を触ると大概真っすぐな異物が入っているのがわかることもある。レントゲンに写る。

目、埋没は瞬きする時不自然なことがある。強い光で目蓋を透かしてみると糸が見える場合がある。
切開はすっぴん時に皺部分を広げて観察すると天然には絶対にないうっすらとした傷がある。

包茎、ツートンカラー。

豊胸、仰向けになった時にもなくならない。ラウンド型はデコルテ部分まで盛り上がるが、アナトミカル型は一見しただけではわかりにくく、触っても硬縮がなければ張りがある程度で柔らかいので元胸があればばれにくい。
しかし、自然光の下でよーく見ると脇の皺か胸の下、乳輪にそって傷がある。
レントゲンに写るが素人は判断出来ない。


さー今夜はオフィスで家庭で学校で、飲み屋でもすっぴんなめなめ豚っ鼻＆揉み会するぞ！！(￣^￣)

あるタンパクをGSTフージョンプロテインとして精製しようとしています。
遺伝子をクローニングしてベクターに挿入、トランスフォームしたのですが、可溶性画分に発現していません。
DNAシーケンスで配列は間違っていないことは確認しています。
こういう場合、インクルージョンボディーとして発現してると考えるべきですか？
その場合、とりあえず確認するには不溶性画分にサンプルバッファーまぜてウエスタンで確認すればよい？
ちなみに目的タンパクは膜タンパクの類ではありません。

普通そういう時は菌体を破砕しただけのものと不溶性画分のものを一緒に流すだろ…
タンパクの発現はやってみないとわからないからGSTと結合させようが可溶性タンパクだろうが可溶化しないときは可溶化しない

>>947
大腸菌で発現させようとしてるんだよね？
まずインダクションかけた培養液から菌体回収→ボイル→SDS-PAGE
オーバープロダクションがうまく行ってればウエスタンしなくてもクマシーでバンドが見える。
ネガコンにインダクションなしのものを流しとけばok。
普通はそれがすんでからエクストラクト抽出を試みる。
んで、もしそれがチェック済みであれば不溶性画分にそのタンパク質が来ているはずだから、
サンプルバッファーに溶かしてSDS-PAGE。これもクマシーで余裕。
ウエスタンをわざわざする必要はないんじゃない？

>947じゃないんだけど、前同じような実験したときに
菌だけloading buffer入れてボイルしたら、
ドロドロの塊になっちゃってロードできなかったんだよね。
>949のloading bufferの条件ってどんなの？

>>950
ヒント：ソニケーション

ソニケーションは、loading buffer入れる前に掛けてるけど。

SoilMaster� DNA Extraction Kit使ってみたけど
このDNA抽出液は冷蔵保存？ 冷凍保存？

細菌のgemone DNAは扱ったことないのでわかりません。
細胞のgemone DNAは冷蔵保存と習いましたが。

蛍光観察初心者なのですが質問させてください
蛍光試薬で染色した細胞が励起波長で蛍光されて見えるのは分かったんですが
試薬の詳細に記されている蛍光波長っていうのは励起済みの細胞が蛍光波長で蛍光されるっていうことですか？

説明不足があったらすいません

おれは物理化学の出身だからそんなヘマな質問はしない。

>>954
何を言ってるのか意味不明なんだけどたぶんそういうことだｗ

>>955
サンクス　解決した

感謝すんなよｗ

>>950
それはソニケーションが不十分なんだよ

>>959
ソニケーションなんてしなくても過剰発現の確認くらいできるだろ。
SDSサンプルバッファーに溶かしててなおドロドロしてるって言うのなら、
それはボイルが不十分か、菌体入れすぎかどっちかだ。

先輩からベクターを分けてもらったときに、形質転換した後にプレーティングして、生えてきたシングルコロニーを液体培養してから
プラスミド抽出するように習ったんですが、もともと純粋なベクターがあるのだから、
プレーティングの段階を省いて形質転換して禅培養が終わった直後に抗生物質入りの培地に植え継いで培養したら駄目なんでしょうか?

シングルコロニーを取る意味を考えて見ましょう。

>>962
ライゲーション後などは不均一なプラスミドが混在しているので、コロニーを一つ一つ単離する意味は分かるのですが、
この場合、もともと均一だと分かっているので、良く分かりません。

強いて言うなら、形質転換が起こらなかった菌の死骸が培地に残るということでしょうか。
現時点では、それ以上は思いつきませんでした、、、、

それでいいと思うならやればいいじゃん。
俺は後で問題が起きたときに原因増やすようなことはやらないけど。

>>953
俺も土壌細菌のDNA扱ってるんだけど、抽出したDNAは
何本かに分注して、すぐに使う溶液は-20℃で保存してる。
残りは使うまで凍結保存（-80℃）（実際はそれほどブチブチ切れない）。
ちなみに使ってる抽出キットはFast DNA spin kit for soilだけどね。
あまり溶液量が無いと思うけど、どうせPCRで増幅するなら
少量ずつでも充分でしょ。