▼今実験で上手くいかない事を質問するスレ▼ part6

943先生返答ありがとうございます。
なんとなく、そんな感じだろうとは思ってました。

とりあえずＣ末端を抗原にしておけ

整形の見破り方！


今や、美人の約70％は整形で作られている改造人間である。

ほら貴方の隣…美人な姉さん、可愛いギャルも、イケメンも、清楚そうなあの娘まで？！　

鼻、L型は豚鼻出来ない。I型でも定着してない場合、左右に動かすと鼻筋が反対に動く。
鼻筋を触ると大概真っすぐな異物が入っているのがわかることもある。レントゲンに写る。

目、埋没は瞬きする時不自然なことがある。強い光で目蓋を透かしてみると糸が見える場合がある。
切開はすっぴん時に皺部分を広げて観察すると天然には絶対にないうっすらとした傷がある。

包茎、ツートンカラー。

豊胸、仰向けになった時にもなくならない。ラウンド型はデコルテ部分まで盛り上がるが、アナトミカル型は一見しただけではわかりにくく、触っても硬縮がなければ張りがある程度で柔らかいので元胸があればばれにくい。
しかし、自然光の下でよーく見ると脇の皺か胸の下、乳輪にそって傷がある。
レントゲンに写るが素人は判断出来ない。


さー今夜はオフィスで家庭で学校で、飲み屋でもすっぴんなめなめ豚っ鼻＆揉み会するぞ！！(￣^￣)

あるタンパクをGSTフージョンプロテインとして精製しようとしています。
遺伝子をクローニングしてベクターに挿入、トランスフォームしたのですが、可溶性画分に発現していません。
DNAシーケンスで配列は間違っていないことは確認しています。
こういう場合、インクルージョンボディーとして発現してると考えるべきですか？
その場合、とりあえず確認するには不溶性画分にサンプルバッファーまぜてウエスタンで確認すればよい？
ちなみに目的タンパクは膜タンパクの類ではありません。

普通そういう時は菌体を破砕しただけのものと不溶性画分のものを一緒に流すだろ…
タンパクの発現はやってみないとわからないからGSTと結合させようが可溶性タンパクだろうが可溶化しないときは可溶化しない

>>947
大腸菌で発現させようとしてるんだよね？
まずインダクションかけた培養液から菌体回収→ボイル→SDS-PAGE
オーバープロダクションがうまく行ってればウエスタンしなくてもクマシーでバンドが見える。
ネガコンにインダクションなしのものを流しとけばok。
普通はそれがすんでからエクストラクト抽出を試みる。
んで、もしそれがチェック済みであれば不溶性画分にそのタンパク質が来ているはずだから、
サンプルバッファーに溶かしてSDS-PAGE。これもクマシーで余裕。
ウエスタンをわざわざする必要はないんじゃない？

>947じゃないんだけど、前同じような実験したときに
菌だけloading buffer入れてボイルしたら、
ドロドロの塊になっちゃってロードできなかったんだよね。
>949のloading bufferの条件ってどんなの？

>>950
ヒント：ソニケーション

ソニケーションは、loading buffer入れる前に掛けてるけど。

SoilMaster� DNA Extraction Kit使ってみたけど
このDNA抽出液は冷蔵保存？ 冷凍保存？

細菌のgemone DNAは扱ったことないのでわかりません。
細胞のgemone DNAは冷蔵保存と習いましたが。

蛍光観察初心者なのですが質問させてください
蛍光試薬で染色した細胞が励起波長で蛍光されて見えるのは分かったんですが
試薬の詳細に記されている蛍光波長っていうのは励起済みの細胞が蛍光波長で蛍光されるっていうことですか？

説明不足があったらすいません

おれは物理化学の出身だからそんなヘマな質問はしない。

>>954
何を言ってるのか意味不明なんだけどたぶんそういうことだｗ

>>955
サンクス　解決した

感謝すんなよｗ

>>950
それはソニケーションが不十分なんだよ

>>959
ソニケーションなんてしなくても過剰発現の確認くらいできるだろ。
SDSサンプルバッファーに溶かしててなおドロドロしてるって言うのなら、
それはボイルが不十分か、菌体入れすぎかどっちかだ。

先輩からベクターを分けてもらったときに、形質転換した後にプレーティングして、生えてきたシングルコロニーを液体培養してから
プラスミド抽出するように習ったんですが、もともと純粋なベクターがあるのだから、
プレーティングの段階を省いて形質転換して禅培養が終わった直後に抗生物質入りの培地に植え継いで培養したら駄目なんでしょうか?

シングルコロニーを取る意味を考えて見ましょう。

>>962
ライゲーション後などは不均一なプラスミドが混在しているので、コロニーを一つ一つ単離する意味は分かるのですが、
この場合、もともと均一だと分かっているので、良く分かりません。

強いて言うなら、形質転換が起こらなかった菌の死骸が培地に残るということでしょうか。
現時点では、それ以上は思いつきませんでした、、、、

それでいいと思うならやればいいじゃん。
俺は後で問題が起きたときに原因増やすようなことはやらないけど。

>>953
俺も土壌細菌のDNA扱ってるんだけど、抽出したDNAは
何本かに分注して、すぐに使う溶液は-20℃で保存してる。
残りは使うまで凍結保存（-80℃）（実際はそれほどブチブチ切れない）。
ちなみに使ってる抽出キットはFast DNA spin kit for soilだけどね。
あまり溶液量が無いと思うけど、どうせPCRで増幅するなら
少量ずつでも充分でしょ。

次スレどうすんの？
>>980が立てればいい？

>>963
大腸菌のアンピシリン耐性は培地に含まれるアンピシリンを分解する能力である
だから耐性持ってる菌と持ってない菌をアンピシリン入り培地で培養すると最初は耐性菌しか増えないがアンピシリンが分解されると非耐性菌も増えてくる
そして耐性菌と非耐性菌だと非耐性菌の方が増殖しやすいから結果的に耐性菌が減る

>>962とか>>964を見習って原理も分かってないなら下手に工夫しようとせず上の人に教わった事を守るべき

967せんせえ、使ってるのがアンピシリンだなんてどこに書いてあるんですか？

精製した蛋白溶液のA280が糞低いのに、駄目もとでSDS-PAGEかけると目的の蛋白が精製されていることを確認。
これは、分光光度計のほうが問題と考えてもおｋ？

280nmで何が検出されているのか分かってます？

環でしょ？

>>969
濃度分かってるタンパク質のA280をその分光光度計で測ればいいじゃん。
エスパーじゃねぇんだからそれだけの情報で
お前さんの分光光度計に問題があるかどうかなんて分かるかヴォケ。

後からデータ回ってきてから矛盾に気づいたんだよ。
第一、分光光度計の台数ありすぎて、どれが該当機種か分からんのよさ。

>>972
だね、タンパク質濃度が低すぎるって可能性もあるし。
ま、精製に界面活性剤使ってるとかね。いろいろある。ま、勉強しなさすぎ。

なんつーか、聞く相手間違ってる気がしてきた。
普通に詳しいやつに聞きに行ってくる

ちょいと其処の百戦錬磨の皆さん、
ちょっと昔の本なんかには抗リン酸化チロシン抗体はいいのがあるが、
リン酸化セリンやリン酸化スレオニンに対する良い抗体は無い、
みたいなことが書いてありますが、
現段階でもウエスタンブロットでセリンやスレオニンがリン酸化された蛋白質を
高感度に検出できて使える抗体って無いんでしょうかね？
フナコシとかでカタログに載っているけどどうなんでしょう？
またPro-Qダイアモンドと、それらの抗リン酸化アミノ酸抗体によるウエスタンと、
どっちのほうが感度が良くて使い勝手が良いものでしょうか？

リン酸化セリンやスレオニン抗体は相性。合えばチロシン並に高感度だが、
外れればグダグダ。何種類も入ったサンプラーセットで試してみるしかない。
ProQは抗体に比べればかなり低い。銀染ではっきり見えるくらいないと染まらない。

>977
いやいやぁ、参考になりました。
これだから２チャンはやめられぬ。

現在あるタンパク質を大腸菌で発現させて精製しようとしています
しかしこのタンパク質は構造が不安定なようで超音波をかけると活性がなくなってしまいます
そこで超音波をかけずに破砕する方法としてリゾチームで細胞壁を壊した後に注射器でグチュグチュやろうと考えていますがこれって上手くいきますか？

低張バッファーで破裂させるのは？

質問です。この前学生実験でヒトの癌細胞からDNAの抽出をするというのをやりました。
で、実際に試験管の中に白い糸状のものが見えたんですが・・・
�@普通の細胞ではなく癌細胞を使った意味は何でしょうか？
癌細胞と普通の細胞の違いというと、サイズが大きい事とアポトーシスが無い（？）事を
思いつくのですがそれとは関係あるでしょうか？
�ADNAそのものはとても小さくて肉眼で見えるような大きさではないですよね？
テキストにはDNAを肉眼で観察するよう書いてあるのですがこの場合のDNAとは
DNAの束を指すのでしょうか？

>>979
超音波で失活ってちゃんと冷やしてやってる？
超音波処理の操作に問題がないのであればlysozyme freeze thawでやってみたら？

>>981
�@DNA抽出するにはたくさん細胞数が欲しいわけよ。
�A小さくてもたくさん集まれば肉眼で見えるわな。水分子だって超小さいぜ？

初歩的かもしれませんが、よろしくお願いします。
ウェスタンブロットで、あるタンパクのリン酸化バンドを検出しようとしています。
しかし、どういうわけかリン酸バンドが検出されません。
そこで、ニトロセルロースメンブレンから
PVDFメンブレン（一般にはタンパク結合能が高い）に変えてやってみたのですが、
今度はメンブレン全体が黒く染まってしまいました。
washもきちんと丁寧にやっているのですが。
何か良いアイディアがありましたら教えていただけませんか。

>>984
ブロッキングはしてる？
あとwashの条件詳しく

>>980>>982
それだと菌はつぶせてもDNAが残ってあまりよろしくないのではないでしょうか？

>>986
そのタンパク質が可溶性画分にくるのであれば大丈夫
不溶性だとちょっとめんどくさい

>>983
レスありがとうございます。
�@については、普通の細胞はどんどん死んでいくのに対して癌細胞は死なないって事でしょうか？
�Aについてですが、DNAが液状の層になるのではなく糸状になっているのがよくわかりません。

>>988
�@死なないと言うより増える
�ADNAが溶けていたら液状、溶けていなかったらもやもやしたのが見える。
　多分EtOH沈殿したのを見たのだと思われる。

DNaseIかバルナーゼでDNAを消化しちゃうこともよくやるよ。

それからB-PERとかbug-bustersとかいう、
大腸菌用のタンパク質抽出試薬も市販されてる。

皆さん回答ありがとうございました
とりあえず簡単に出来そうなlysozyme freeze thawを試してみます

>985
回答が遅くなってすみません。
ブロッキングは、ブロックエースで１時間しています。
そのあと、TBSTで１５分、５分、５分で１次抗体です。
１次抗体と２次抗体の間も、１５分、５分、５分
２次抗体の後は、１５分、５分、５分、５分、５分で現像です。
あと、リン酸化バンドはよく分離しなくてはいけないので、
それに関しては、目的のバンドが流れきるぎりぎりまで、泳動しています。