大腸菌について極めるスレ

1 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/07 20:50

　普段プラスミド作製、蛋白質発現に、またペットとして何気なく
培養している大腸菌。本当に、性質を理解して使っている？
　まずColE1って何よ？　オレは知らん

2 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/07 22:01

ColE1ってColE1系プラスミドのこと？

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4 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/08 05:09

oriって知ってるか?

5 ：1：02/05/08 21:31

コピーはじめるところだろ？　
たしかオリジンの略だ

6 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/09 01:11

Fのマイナスとかってなによ。

7 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/09 01:24

>6
フッ素イオン要求性だろ。
現在は日本の水道水は、虫歯予防のために殺菌課程の塩素処理の際に
0.1-0.5%くらいはフッ素も混ぜることになっている。それがMilliQを
通しても微量は残留しているから、実験室レベルで培養する際にはほと
んど気にしなくても大丈夫なのだが、例えばそういう処理をしていない
ヨーロッパのラボや、水道水よりも井戸水のほうがきれいだという理由で
井戸水をオートクレーブして実験するラボで、時々大腸菌のグロースが
遅くなるのは、実はこのF-要求性なんだって聞いたことがある。

8 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/09 01:30

・・・厨房。勉強やりなおせ。

9 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/09 02:32

>>5
そこまでわかってて、なぜColE1がわからんのだ？

10 ：1：02/05/09 22:47

なぜわかるんだ？

11 ：strasser：02/05/10 00:04

FのマイナスはFプラスミドを持ってないって意味ですなぁ。

12 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/10 00:07

どーでもいいが、ペットとしてってとこに誰か突っ込んでやれよ。

13 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/10 00:23

コピー数の少ないプラスミドの、
post segregatinal killing
知ってるかい？

14 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/10 02:35

http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW1/MG1337.html

15 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/10 04:37

ColE1は複製起点（ori）の一つだべ。
そこからプラスミドの複製が始まるだよ。
複製起点はプラスミドのコピー数を決めるとか何とか････。
molecular cloningの一章の触りだけでも読んでみてけろ。

最近は何でもかんでもキットになってたり、プロトコール追うだけで
ある程度のことが出来てしまうせいか、本来なら知ってて常識と思われるようなこと
(たとえばLacZが何なのか、とか）を知る機会が減っているように思えます。
知らないﾔｼをDQNの一言で片付けないで、ヒントの一つも与えてやることは
決して悪いことではないように思われです。
で、
>>13
それって何よ。

16 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/10 05:35

FとF’って何が違うの？

17 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/10 07:05

みんないいかげんな知識で物言ってる?

ColE1 is a naturally occurring plasmid of E. coli. Its replication is controlled independently of the replication of the host chromosome.
Two plasmids with the same origin of replication can not coexist in the same cell.
The ColE1 origin, defined by molecular genetic methods, is in a region from which two RNAs are transcribed.
An active RNase H gene is required for ColE1 replication. RNase H cleaves the RNA II transcript. The remaining RNA serves as primer for initiation of replication.
RNA I binds to 5' sequences of RNA II via pseudoknots and regular complementary pairing. This binding is stabilized by the ROP or ROM protein.
The binding prevents changes in the conformation of RNA II that would otherwise result in RNAse H cleavage.

18 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/10 13:12

>17
それはColE1 plasmidそのものの説明だよね。

最近はいろいろな種類のベクターが出回っているけれども
実験で使われるvector plasmidはほとんどはどこかのnaturally occurring plasmid
由来から人工的に手を加えられて派生して来た経緯をもっていて、
あるplasmidのoriの部分の派生経緯（系統）が何か、という情報が
重要になる場合がある。で、ここで質問されているColE1は複製起点
の系統の名前のひとつで、その名前の由来はColE1 plasmid ( >>17 )に由来している
ということだべ。

19 ：15：02/05/11 02:44

>>17は>>14のからのコピペだべ。
1の質問に対しての答えとしてはむしろ適切だったのかもね、お疲れ様です。
私はoriの方を聞きたかったんじゃないか思ってああ書いてしもうたが（藁
plasmidに関しては
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1006291034
こちらが面白いかと。

大腸菌でよくわけがわかんなくなるのは、genotypeの表記でしょうか。
これも調べればわかるんでしょうが、r- とか m-　とかの場合に
hsd何たらって書かれてることがありますよね。これは何でなんでしょうか?
つーかhsdって何よ?

20 ：15：02/05/11 03:16

FとF'は、FがF plasmidそのもの、F'は余計なものをくわえ込んでいる、ってことでしょうか。
F'は、F因子が染色体に組み込まれた形で存在するHfrという株由来のF plasmidで、
Hfr からF plasmidが切り出される過程で近傍の配列をくわえ込んでしまったものだそうな。

うーん、いまいち。
誰か詳しい人突っ込みｷﾎﾞﾝﾇ。

21 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/11 07:30

pUCやpBR322も確かColE1をoriですよね？
同じoriなのになんでコピー数が変わってくるの？

>>19
genotypeの一部はどっかのカタログに載っていました。
カタログの後ろの付録みたいなとこにあったと思う

22 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/11 08:52

生化学辞典くらい読んでみてよ

23 ：KAT：02/05/11 08:54

>>15
＞>>13
＞それって何よ。
　知らなくても良いと思います。

>>19
>これも調べればわかるんでしょうが、r- とか m-　とかの場合に
>hsd何たらって書かれてることがありますよね。これは何でなんでしょうか?
　制限酵素をコードする遺伝子のことです。この遺伝子に変異があると、r- と
言うことになります。クローニング用大腸菌では、他の大腸菌株や真核生物
由来の DNA でトランスフォーメーションが効率よく行くように、hsdR 遺伝子が
つぶれているもの(r- m+)が多いです。

>>20
>FとF'は、FがF plasmidそのもの、F'は余計なものをくわえ込んでいる、ってことでしょうか。
>F'は、F因子が染色体に組み込まれた形で存在するHfrという株由来のF plasmidで、
>Hfr からF plasmidが切り出される過程で近傍の配列をくわえ込んでしまったものだそうな。

　由来はともかく、F' は、F に改良を加えたもの、ぐらいの解釈でよいと思います。

>>21
>pUCやpBR322も確かColE1をoriですよね？
>同じoriなのになんでコピー数が変わってくるの？

　ori に mutation が入っているからです。

24 ：15：02/05/11 09:22

>>21
NEBのカタログの付録に幾つか載ってますね、解説つきでなかなかいいですわ、これ。
私が判らなかったのは、lacZでもΔ(lacZ)r1 とかΔ(lacZ)M15とか幾つかありますよね？
これってalleleが違うだけと解釈していいのだろうか、ってことです。
あとhsdについては、r-m+って書かないでなんでhsdRって書いてるのか。

コピー数についてですが、molecular cloningをちらっと見たところ
pBR322のoriはpMB1、pUCはpMB1をいじっってhigh copyにしたもののようですね。
細かいことはこれから折を見て調べてみます･･･。

25 ：15：02/05/11 09:32

>>23
ありがとうございました。判りやすいです。
hsdR,Sが遺伝子名ってことなんですね。
日本語もついでに勉強しに逝ってきます。

26 ：KAT：02/05/11 09:56

>>24
>lacZでもΔ(lacZ)r1 とかΔ(lacZ)M15とか幾つかありますよね？

　lacZΔM15 ってのは、多くの菌株に乗ってますが、βガラクトシダーゼの
一部分だけを持ったものです。それだけでは活性が出ませんが、pUC 等に
乗っている、これまた lacZ の一部だけ持った遺伝子と共発現させると活性が
出て、X-Gal 存在下で青いコロニー/プラークとなります。r1 ってのは良く
知りません。
　hsdR と書くのは、幾つかある遺伝子のどれに変異が入っているかを示す
ためです。r-/m+ は正しい genotype の表記では在りません。このように
書くのは、制限酵素系/DNA 修飾系を簡易に述べるときだけです。

27 ：KAT：02/05/11 10:01

追記： hsdR = r-/m+ でなくて、r-/m- だったかもしれません。この辺り
うろ覚えです。申し訳ない。

28 ：1：02/05/12 07:53

　ＤＱＮのｵﾚにいろいろ教えてくれてありがとさん。
とりあえず次、Ｆ因子、ＬａｃＺって何よ？　
　話が高度すぎてｵﾚ以外にもわからん奴がいるだろ。

29 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/12 12:01

極めるスレってタイトルならそのくらいは自分で調べないと。。。

30 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/12 23:14

http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/
日本発大腸菌データベースだべ。

31 ：30：02/05/12 23:15

ageておきます。

32 ：1：02/05/13 03:08

おおっ　すばらしい！
わけのわからんキャラクターが大腸菌への興味をそそる。

33 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/13 03:15

>とりあえずさ、Molecular Biology of the Geneくらい読んでおけ。

34 ：名無しゲノム：02/05/13 22:52

13kｂｐのプラスミドを単に増やす目的で
DH5αにトランスフォームしようとしているのですが
コロニーが生えてきません。
抗生物質などの条件はあっているのですが・・・。
インサートはレトロウイルスの構造遺伝子で毒性などはないと思うし。
大きいプラスミドをいれるのによいコンピなど
ご存知でしたら教えてください。

35 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/14 00:23

LacZの歴史
初代はただのLac、次が改良版のLacMKII、でその後LacZとなった。
それ以後LacZZ、LacG、LacW、LacX、など多数出現。最新型は確か
Lac∀

36 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/14 03:06

>>34
tasnsformationの条件は?エレぽ？

>>27
hsdRはr-/m+であってますよ。r-/m-はhsdSだそうな。

>>28
Ｆ因子は大腸菌同士が接合する時に必要になる遺伝子群を持ったplasmidのこと。
LacZはβ-galactosidase。

37 ：名無しゲノム：02/05/14 21:39

３４です。heat shockでやってます。

38 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/14 22:35

>>35
うまい。一瞬信じかけたぞ。

39 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/15 05:31

>>34
コンピは買ったやつ?自作？元気なコンピ?
コントロールとってる見ることをお勧め。
ヒートショックの時間は?
昔、でかいものを入れる時はヒートショックを長くするといいと聞いたことがある。
私が聞いた中で一番長かったのは3minだった。
あと、プラスミドの濃度は十分?薄すぎるとｺﾛﾆまったく出んことがある。
まああたりまえだけど。

それでも駄目なら、エレぽしてみるのもよしかと。

つーか、そのプラスミドは大腸菌からとってるんでないの？
つーことは大腸菌に入って当たり前のような気がするのだが。

40 ：KAT：02/05/15 06:26

>>34

>つーか、そのプラスミドは大腸菌からとってるんでないの？
>つーことは大腸菌に入って当たり前のような気がするのだが。(>>39)
　に同意。ここで聞くより、そのプラスミドを取った人に聞いて、
同じ株・同じ条件を用いるべき。ここで情報を得たかったら、インサートの
遺伝子の詳細、その遺伝子発現のためのプロモーター、ori 、抗生物質耐性
遺伝子の種類等、詳細情報が無ければコメントしようが無いよ。

41 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/15 09:41

DH5αを使う理由を小1時間問いたい。
お前本当にトランスフォーメーションしたいんか。
DH5αいいたいだけちゃうんかと。

42 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/15 11:05

>>41
ならばｱﾅﾀのお薦めは?

43 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/15 11:23

昔、どこかの雑誌の記事で、ハイコンピなる製品を買って、
それを希釈/小分けして使っている、という内容のものを
読んだ覚えがあるのだけど、出典知りませんか？

44 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/15 19:31

SCS1をスカジーと呼ぶ人は多いはず

45 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/16 22:17

大腸菌くさい

46 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/16 23:39

酵母のほうがくさい

47 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/17 02:06

ファージが一番ξ。

48 ：41：02/05/17 02:53

>>42参照

49 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/17 10:56

>>43
実験医学1998年9月号にあったよ。
お金の節約のために東洋紡のコンピテントハイを
5 ulずつ分注して使えと。
やってる人いるのか？
私は同じ記事の自分で作る方を使ってます。

50 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/17 11:29

10ulまでならやったことある。結構使えた。
1mlLB入れた後遠心して全量まいてた。

51 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/17 16:11

>>49,50

ありがとー。

52 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/17 16:51

>>49

見てきたけど、載ってませんでした。
載ってたのは、手軽なコンピテントセルの作り方でした。

53 ：49：02/05/17 17:06

>>52
ちゃんと読んだ？タイトルは「手軽なコンピテントセル作製と
形質転換法」なんだけど、最初に”究極に手軽で安価な方法”
として書いてあるって。昔コピーしたのが手元にあるから確かだよ。

54 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/17 17:47

もう一回見てくるね。

55 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/17 19:31

図書館、営業終了でした。また明日。

56 ：KAT：02/05/18 06:39

>>43 >>49-55
　私も以前、DH5αの市販の物を、10μlずつ分注して凍らせて
使っていたことがありました。結構使えましたよ。ligation mix
の transformation もばっちり。

57 ：1（ＤＱＮ脱出）：02/05/20 20:57

　もれきゅらーくろーにんぐを買ってきたぞ（実費）。
まずどこから読めばいいんだ？

58 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/20 21:14

>57
ワロタ。
おいらも厨房なので買おうかな。
どこから読めばいいか教えれ。

59 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/20 21:46

>>57,58
とりあえず、表紙の説明からだ！！

60 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/21 03:29

>>57
お、えらい。正直感動した。
とりあえず頭から読んでみよう。大腸菌のことは1章あたりを読むと
結構わかるようになるかも。わかんないことはここで聞くもよし、周りの
先輩方に聞いてもよし。

61 ：ピヨ彦：02/05/21 04:00

このスレ（・∀・）ｲｲ！

62 ：KAT：02/05/21 06:37

　M13mp系のベクターのクローニングサイトに終止コドン(TGA)を
フレームあわせて入れて、そいつを XL1-blue 等の supE の大腸
菌に導入したら X-gal/IPTG でプラークが青くなるかどうか、誰か
知ってる？

63 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/21 08:10

>>62
わからん。M13使ったことないんだよなぁ。
supE (glnV); tRNAに変異、コドンUAGにglutamineを入れる。いくらかのphage vector の生育に必須。
てとこまでは調べたのだが･･･。
たとえばM13mp18だと、クローニングサイトがlacZの手前なので、そこに
in-frameでTAGを入れてsupEの菌(XL-1blueを想定)に入れた場合、LacZは発現してしまう（青くなる）、
ってことでいいんだろうか････?
TGAの場合は関係ないからﾌﾟﾗｰｸは白いまま、ということかなぁ････。
誰か他の人、解答ｷﾎﾞﾝﾇ。

ところで、終止コドンって、なんでamber(UAG),Ochre(UAA),Opal(UGA)って
呼ぶのでしょうか?
あと、Molecular cloning でXL-1Blueのgenotypeを見ると、supE+になってるのですが
これってsupEとどう違うのでしょうか？
NEBのカタログを見るとL1-Blue は　glnV44になってたのでミュータントであることは
なんとなく想像はついたんですが。

や、その前に日本語勉強しに逝って来ます（藁

64 ：KAT：02/05/21 08:36

>>62
　TGA => TAG の間違いです。

>>63
　TAG なら理論的には青くなるはずなんだけど、どれくらい青
くなるのかとか、X-gal の濃度をどれくらいにしたら白いプラーク
との差がはっきり出るかとか、どなたか知りません？

65 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/21 09:20

>>ところで、終止コドンって、なんでamber(UAG),Ochre(UAA),Opal(UGA)って
呼ぶのでしょうか?

最初、amberが見つけられたんだけど、amberって琥珀色って意味もあるんだよね。
それで、同じような働きをするということで、そのあと見つけられたものに、
Ochre(黄土色)、Opal(蛋白色)と似た色の名前をつけたらしい。
あっちの人に、よくある話だ。
なぜamberと名づけられたかは、知らん。すまんな。

66 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/22 08:49

α-complementation　ｱｹﾞ

67 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/22 09:12

ハエの目色のミュータントから

68 ：63：02/05/22 09:21

>>65,>>67
なるほど、有難うございますた。

69 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/22 20:17

１・大腸菌AD494(DE3)株は、チオレドキシンの何が欠損してる
んですか？
２・また、この株を使ってのDsbシャペロン共発現は向いていない
でしょうか？また向いている株はなんでしょう・・・。AD494系が
ダメならBL21を検討するつもりです。

なにかｱﾄﾞﾊﾞｲｽプリーズ！

もうアトがない私立学生より。

70 ：69：02/05/22 20:19

大腸菌の培養について・・・

グルコースに代わる炭素源を持った培地で良いのがあれば
おしえて下され。ただしLBは除く。

いまのところグリセロール、ラクトースが考えられるんですが。

71 ：KAT ◆bKNOEhgY ：02/05/23 10:11

>>69
Δara-leu7697, ΔlacX74 , ΔphoAPvull , phoR, ΔmalF3 ,F' [lac+（ lacIq ）pro ] trxB :: kan
チオレドキシン・リダクテース（trxB）がつぶれてるみたい。この手の話は、
タンパク質の精製スレで聞いたほうが良いかも。

>>70
　テリフィック・ブロスでしょうか？グリセロールと、pH調整用に燐酸バッファー
が入ってます。

72 ：69：02/05/23 15:29

>>71
色々調べましたが、テリフィックについてはあまりのってませんでした。
詳しいことを知りたいです！

73 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/23 15:49

>>71
なぜLB以外というところに興味津々。

74 ：KAT ◆bKNOEhgY ：02/05/24 04:43

>>72

Molecular Cloning より
-----------------------------
Terrific Broth

Per Litter:
To 900 ml of dH2), add:
bacto-tryptone
bacto-yeast extract
glyceral

Mix and autoclaving for 20min.
Allow the solution to cool to 60-degreeC or less, add 100ml of a sterile
solution of KH2PO4/K2HPO4 buffer.
-----------------------------
著作権に触れるといけないので、全部書いていません。詳しくはモレクロを
見てください。こいつを使うと、ＬＢに比べてかなり菌量が取れます。５－１０倍
ほど。

P.S.
それにしても、ひどいネーミングですね。

75 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/24 08:21

辞書をひかれたし＞terrific

76 ：69：02/05/24 13:37

>>73
何故ＬＢ以外を使うかという質問に完全に答えるとテーマが
ばれちゃうかもしれないので、断片的に。

１・培地に含まれるグルコースが邪魔
２・分泌系の発現、しかも培地にでちゃうこまりもの。
３・代用できるＣ源の模索、M9培地を主流とする。

私には上についてくれる院生がいないという悲惨な状況。
自分で調べるのって、学部生では限界がありません？めちゃしんどい。

自分で勉強するのが大学なので文句はいえないが。

>>74
ありがとうございます（感謝感謝）。
もっかい調べてためしてみます。

77 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/24 15:17

TBはコンタミもテリフィックなのでがんばって扱ってください。
ふと思ったんですが、TBもLBもたいしてグルコース入ってないと思うんですが･･･。
yeast extract とかtryptoneからのtrace程度で問題になるなら、それこそ
とかの完全合成培地でやるしかないような気がします。
また、TBでいいんだったら、2 x YTでもいいんじゃないでしょうか。
これもモレクロにのってると思います。どっちも大して増えは変わんなかったような気がしますが。
もしかしたらlac系プロモーターの catabolite supression を心配してるのでしょうか？
LBでも効果出ちゃうんですか?

78 ：69：02/05/24 15:30

>>77
御丁寧にありがとうございます（＾＾）
ちょっと間違えました。
yeast extract とかtryptoneが問題でした～。

そう、それでＭ９培地に換えたら、グルコース効果が起こった
らしく、Ｃ源の検討にはいっているところです。

なんか、酢酸だけでも育成するって本当ですか？

79 ：1：02/05/24 22:03

LBってポリペプトンとかいーすと抽出物とかいれるけど、何が栄養になってるの？

80 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/25 00:42

>>79
お前の愛情だ。

81 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/25 02:33

>>78
酢酸だけでも増えるってのは初耳です。誰か詳しい方解説ｷﾎﾞﾝﾇ。

>>79
LBに入れるのはtryptonだとおもうけど、まあいいや。peptone もtryptoneも
ある蛋白の酵素分解産物で、アミノ酸源になってるんだと解釈してます。
自信ないですが。
yeast extractも酵母の死骸抽出液なんだろうなぁ。生き物の死骸はよい栄養に
なるんだろうか、肥料みたいなもんなのかな。

82 ：KAT ◆bKNOEhgY ：02/05/25 04:11

>>77
　いや LB にラクトース加えて培養しても、lacZ の発現が殆ど起こらないから、
グルコースがかなり入ってると思うよ。

>>78
　その話で行くと、M9-ラクトースがいちばん簡単でいいと思うんだけど、
ラクトースを酵素分解すると当然グルコースが出来るから注意。
　なら、M9-グリセロール？？そんなの聞いたこと無いけど。

83 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/25 04:41

>>82
そうなんですか、ｻﾝｸｽｺ。
M9-glycerol、聞いたことはないけど、生えないことはなさそう。

84 ：実験初心者：02/05/26 12:18

質問ｽﾚで答えが出なかったので質問させてください。

マニュアルとか見ると、大腸菌の濁度を光度計で600nmで測ってるんですけど、
なんでこの波長で測るのですか？

85 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/26 12:31

単なる散乱光だよ。

86 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/26 12:44

大腸菌って酵母みたいに栄養あるのか？喰えるのか？

87 ：実験初心者：02/05/26 12:52

>>85
どの位散乱してるかで量が居るか測るのですね。
ありがとう！

88 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/27 07:19

>>86
何を持って栄養と言っているのかわかりませんが、蛋白は豊富かと。
喰って見れ。

89 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/27 22:00

何かＨＢ１０１とかいう植物用の肥料を通販でやってなかったっけ。

90 ：　：02/05/27 23:13

>>86
ピペットで誤って吸ったら風邪引いた

91 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/28 23:55

>>90

一応ツッコミ、K12由来の大腸菌ならそれはあり得ない。

92 ： Difco：02/05/29 16:37

E. col　の合成培地では炭素源として

Sodium Acetate
Sodium Citrate
も使用されています。最終濃度は 0.2-0.5%で十分です。
また、Glycerolを使用することもあります。
当然、これらを使った培地では生育がグルコースよりもかなり遅くなりますし、LB
培地のような豊栄養培地から移したあと増殖するまで遅延があります。

Yeast Extract, BactoTryptonなどの詳しい組成はDifo Manualを参照のほど。

93 ：74=77：02/05/29 19:15

Yeast Extractっ本当に酵母の死骸か？
もったいぶらんと教えてけろ

94 ：　：02/05/29 21:30

>>91
単に風邪が流行っていただけの罠。
まずかった

95 ：>>93：02/05/30 03:18

http://216.239.51.100/search?q=cache:6G9B7P4hE1oC:ohly.de/sommer.htm+yeast+extract&hl=ja&ie=UTF8

96 ：1：02/05/30 08:03

もれきゅらーくろーにんぐの一章を頑張って読んでいるぞ。
エレクトロポレーション用大腸菌の導入効率は１０の９乗ぐらいと書いて
いるが、標準プラスミドはどんなのを使ってるの？たとえば、変異
colE1系のオリジンを持つpUC系のプラスミドはハイコピーだから
たくさん出るじゃん

97 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/30 08:08

>>96
コピー数と形質転換効率はまったく別物だと思ってください。
コピー数は大腸菌内でのプラスミドの数、形質転換効率は
おんなじ量のplasmid入れてコロニーがどんだけ出るか、ということです。
なので、標準plasmidは何使ってるのかはあんまり関係ないです。

98 ：69：02/05/30 12:59

>>81
酢酸だけの育成に関してはここで情報を入手。
ttp://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/Glyoxyl.htm

99 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/31 06:36

>>97
に追補
普通は形質転換効率にpUC18/19やpBR322あたりを使っているので大して
気にしなくてもいいです。
でも、プラスミドのサイズが大きくなってくると転換効率は落ちてくる。
エレクトロポレーションの場合、比較的大きなサイズのプラスミドを扱う
時にも使う人もいるので、そのデータも欲しいところですな

100 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/31 11:14

>>99
効率はかるときは重量でプラスミド入れてるんだから、
サイズがでかくなれば、分子数は減る。
だからといって、同じ分子数でもサイズが違えば効率が変わる罠。

101 ：ポスﾄﾞｷｭﾝ ◆yv7nVpfU ：02/06/04 12:26

K12の特徴ってなんなんだろう。
こんなこと聞いてるからDQNなんだろうな（藁

>>99
私は、ケミカルコンピでどうにも入らん時にエレポ、って感じですわ。
めったに使わない奥の手、といった位置づけにしてます。
うわさでは、15kまでならbluescriptSKIIで,ケミカルコンピで入ったという話
は聞いたことがある。
気合で入れたそうですが････。
そういえばどっかにそんなスレがあったような。どこだっけ。

102 ：1：02/06/11 21:21

話がマニアックすぎる！
大腸菌の株の特性について教えてけろ

103 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/12 05:35

>>1
具体的にどの株よ？

104 ：1：02/06/12 23:10

まずはおきまりのＤＨ５αだ

105 ：KAT ◆bKNOEhgY ：02/06/13 09:52

とりあえずモレクロには遺伝子型が

supE44 ΔlacU169(φ80 lacZΔM15 ) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1

とでてるね。インヴィトロジェンのカタログには

F- φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rK-, mK+) gal - phoA supE44 l- thi-1 gyrA96 relA1

と出てる。こちらのほうが詳しい。

106 ：KAT ◆bKNOEhgY ：02/06/13 11:16

　ＤＨ５αの元になった DH5 という株はtransformation の効率が
DH1 より良いとされているんだけど、モレクロを見ると DH5 と DH1
で遺伝子型が同じ。つまり、両方とも >>105 の上のものからΔlacU169(φ80 lacZΔM15 )
を抜いたものなんだけど、なぜ DH5 の方が transformaion の効率が良いのか
謎。インヴィトロジェンのカタログにある deoR, phoA あたりが
効いているのか？

107 ：ポスﾄﾞｷｭﾝ ◆yv7nVpfU ：02/06/17 08:35

X-gal/IPTG plateでのblue/white selectionが可能(ΔlacZ)
キアゲンのミニプレキット使う時にwashが一回少なくてすむ(endA-)、とか。
実際気にするところはそんな感じかなぁ。
あとr-m+であるところ、とか。
普通にトランスフォーメーションするならこの程度知っておけばまあなんとかなる、かなぁ。
突っ込みｷﾎﾞﾝﾇ。

特殊なことやる時はもっと細かく知っておく必要があるあるね。

108 ：　：02/06/17 20:38

この株はどんな特徴とか上手くまとまったHPとか知らないですか？

109 ：ポスﾄﾞｷｭﾝ ◆yv7nVpfU ：02/06/19 03:21

むしろgenotype覚えた方がよいと思われ。
どんなgenotypeの時に何気をつければいいか、とか
どんな目的にはこれ、とか。

110 ：ポスﾄﾞｷｭﾝ ◆yv7nVpfU ：02/06/25 03:07

おまえらどんな時にどんな菌使ってますか?
私は普段サブクローニングにはJM109だったけどDH5αに変えました。
理由はカイアジェンﾐﾆﾌﾟﾚキット使う時に洗いが一回少なくてらくだから(endA-)。
あと増えるのがﾁｮﾄ遅いのでｺﾛﾆの分離がよいような気がするから。

ところでTOP10ってどうよ？

111 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/25 07:18

良いけど高い＜TOP10

112 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/27 20:30

大腸菌の全ての遺伝子取るような計画はないのですか？

113 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/20 05:30

teiki age

114 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/20 05:41

ないだろ（ｗ

115 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/20 22:57

>>106
DH1から形質転換効率の良い株を選別したのがDH5。残念ながら形質転換効率の
改善に関しては原因遺伝子は特定されていません。Htfだかなんだかという名前
が仮に与えてあったと思う。

116 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 11:27

>112 コハラさんが随分昔にやったよ。遺伝権のサイトにでもあるかも。

117 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 14:19

112 > 大腸菌の全ての遺伝子取るような計画はないのですか？

既に実行中です。詳しくは
http://ecoli.aist-nara.ac.jp/
を参照のこと。

>112 コハラさんが随分昔にやったよ。遺伝権のサイトにでもあるかも。

これはゲノムをカバーする整列ラムダクローンの作成です。

これを元に日本のチームは大腸菌のゲノム配列を決めています。

118 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 06:53

グリセロールストックって－２０度で保存しちゃっても大丈夫ですか？

119 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 07:14

いいわよー、でも、溶かさないでねー。

120 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 09:38

2xYTやテリフィックを使うと収量増えますが、mid log phaseの範囲も
それに応じて上昇するんですか？
なにが聞きたいかというと、発現物が毒性があるらしく発現誘導すると
増えなくなるのでできるだけ増えたところから始めたいということです。

121 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 09:51

>119 お答えどうもありがとうございます
－２０度だとコンピテントセルがコンピテンＣを失うから
だめかとおもってました

122 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/01 10:32

遺伝子によっては、大腸菌で増やすとrearrangementが起こってプラスミドが
バラバラにされ、綺麗な形で増えません。こういう経験は皆さんありますか？

123 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/02 02:14

ありますよ。T7の系だと、LacIが入ってるベクターとかpLysSとか
RecA-のBLR(DE3)とか使えばそれなりに安定しますた。
あと、倍地に2％ぐらいグルコースいれるのも効果があるそうでっす。
transformationしたときにコロニーの大きさがまちまちになってたら要注意。

124 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/02 02:23

>>123
ほ～～。
素晴らしいアドバイスありがとうございます。

125 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/02 03:51

>>122
どんなふうにバラバラになったのか詳細ｷﾎﾞﾝ。
トランスポゾンとかのinsertion？ちょっと興味ｱﾘ。

自分はLambda-ZAPとかのin vivo excisionの時によく組み換えが起こって
困ったことがあったです。

126 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/02 04:44

>>125
某核蛋白なんですが、普通のマンマリアン発現ベクターからウィルスベクターまで
ほぼ１００％の確率でリアレンジメントがおこります。
インサートしたｃＤＮＡが無事でも、他の部分が潰れて異様に小さな環状構造になっていたり
ｃＤＮＡそのものがバラバラだったり。
大腸菌も色々試してみましたがだめ。

127 ：ポスﾄﾞｷｭﾝ ◆yv7nVpfU ：02/08/02 12:56

>>126
壊れ方や入ってるものに特徴あったりしませんでした?
大腸菌でも動いてしまうプロモーターを持ったプラスミドの場合は、
発現した蛋白が悪さしてる可能性もあるので、そういった場合は
>>123さんの言うようにリプレッサーもってる大腸菌つかったり、グルコース
添加するのもいいでしょうね(lac系のプロモーターの場合）。
離婚美ねー酢かなんかですか?
それ以外だと、rec系がつぶれてる菌を探してみるとか。。。。
これくらいしか思いつきませね。
KAT ◆bKNOEhgYｻﾝ光臨ｷﾎﾞﾝﾇ。

128 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/02 14:01

>>127
うーむ、参考になるなー。
でも、大腸菌は「これがいい」というのを色々使いました。
stratageneの「ｓｕｒｅ」とか。
でも、だめでしたね。

129 ：>90：02/08/02 21:06

塩辛かねーこら。。

130 ：ぺー：02/08/02 21:07

どこのメーカーか忘れましたが、トップテンワンショットだっけか使ったんですが、
あるプラスミドをこれで増やし、そのプラスミドのBamHIサイトをつぶして再び
トランスフォーメーションしたんですが、その時はまったくコロニーがはえません
でした。その後エレポでやったらはえてきたんですが・・・。
みなさんこの現象をどう検証されますか？

131 ：むー。：02/08/03 00:37

オレはXL-1 Blueがコンピの性能としては一番安定していると思うのだが・・
確かにgrowthは遅いし、あまり大きなベクターは入りにくいと聞く。
しかしオレは普通にコイツでコンピ手作りして、それでノックアウト用の
ベクター作るために16kbのマウスジェノムをpBluscriptIIにサブクローンして
ヒートショックで入った。BW選択も間違いないし。ウチにあるDH5αは勝手に
青くなったりして困ったもんだ。

132 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/03 01:18

>>131
うちのラボは金持ちなので、ＴＯＰ１０しか使いません。
効率は滅茶苦茶良いです。

133 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/03 04:16

>>130
最初のtransformationと、エレポでやったときのバッチが違う場合は
菌やtransformation method のせいではないような気がします。
どのようにBamHIサイトをつぶしたんですか?
制限酵素で切ってｸﾚﾉｰで埋めてblunt ligationとかだったら、ligation反応を
疑いたくなるんですが。いかがでしょう。

>>128
sure a,b 若しくは2b はカタログによるといずれもrecA1,recB, recJになってますね。
うーん、insertがリコンビネーションを促進する可能性のあるものだったんじゃないかという
ぐらいしか思いつかない。

134 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/03 11:19

>>128 ひょっとして青白選択しようとしてIPTG入れてるとか？
recombinaseを発現させようとしてるだけだったりして・・（ｗ

135 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/03 11:26

>>130 根ぴが死んでいます。ディープフリーザーの霜取りをしましょう。
1回2ドルのコストに耐えられるのならエレクトロポレーションの方が
根ぴも作るの簡単だし、効率も安定してますよね。

136 ：ぺー：02/08/03 22:22

>>130
BamHIはちょうどあったPfu turboで埋めてBlunt Ligationしました。
あとでBamHIで切れないことは確認しました。

137 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 20:21

質問です。
母に自家製ヨーグルトを作る趣味があるのですが、
容器に入れたヨーグルトを、日なたに置いて発酵させるのですが、

そして今日、2,3個の容器の中のヨーグルトの上面に、黄色いものがうかんでいたのです。
一つ、かきまぜて食べてみたのですが……まずかったです。
もしかして、この黄色いものは雑菌のコロニーだったのでしょうか？
容器の口は開いたままだったので雑菌がつく可能性は十分あったのですが……。

138 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 20:44

>137
そもそも食うなよ（笑）
雑菌のコロニーだと思うぞ。

139 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/03 18:10

当方、シロート。以下の質問をされたんだケド･･･
どなたかわかりますか？さっぱなんです。
「大腸菌において異種遺伝子を高発現させるためのに
考えるべき要素と、その対策、高発現を実現した際
に生ずる問題点とその対策」

140 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/03 19:04

プラスミドのコピー数
プロモーターの強さ
異種遺伝子のcodon usage
宿主菌種の選択
培地の選択
培養条件の至適化
発現誘導条件の至適化
誘導後の培養条件の至適化
培養後集菌までの時間

封入体の形成

これくらいしか思いつかないぞ

141 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/03 19:35

封入体の対策としてシャペロンも同時に発現させるシステムが
あるらしいねぇ。
作らせるものが毒性ちっくなモンだったらどぉすんのがベター？

142 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 05:49

>>140
まだまだだ。それは前半のことしか触れていないぞ。
後半の「高発現を実現した際に生ずる問題点とその対策」
には何一つ答えていないぞ。

143 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 07:21

>>142
煽りはいらんから、答えてくれぃ。
封入体以外にもあんの？

144 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 09:31

精製法とか？

145 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 09:39

>>137
日向で発酵させるのはやめてください。乳酸菌が死んでしまいます。
なお、黄色いのはつばから生じた雑菌です。
雑菌が入らないように、ゆるくふたをするか上に布をかぶせてください。

146 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 11:39

「作らせるものが毒性ちっくなモンだったら」

「高発現を実現した際に生ずる問題点とその対策」
発現誘導と同時にgrowthが落ちるので培養条件の至適化
封入体、沈澱生成の問題点
対策としてはシャペロン系の共発現
融合タンパク質による溶解度の改善

急激な発現にともなうアミノ酸のミスインコーポレーション
急激な発現にともなうN末端FMetのプロセシング不完全性
発現ストレスにともなう内在性プロテアーゼの誘導

対策としてはマススペクトルとN末端分析による生産物のチェック
プロテアーゼ欠損株の使用
プロテアーゼインヒビター使用

このへんでかんべんしてけろ

147 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 12:48

うぉぉぉー、やっぱり専門家はちゃうね、タメになります。

148 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 11:50

どなたかGatewayシステムのpEF6-DEST51って使ったことありませんか？
めちゃくちゃ増えないんです。
プラスミド５μl+XL-1Blue20μlでコロニー3個とかなんです。
ちゃんと増えますか？こいつ。
pEFって発育悪いんですかね。

149 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 12:57

んなこたぁない。
ところで、Gatewayの説明書、ちゃんと読んでるか？
DB3.1じゃないとダメじゃないのか？

150 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 18:38

>149
戴きものだったもので、、、。
ご指摘の通りのようです。助かりました。
　でもDB3.1は持ってない罠。

151 ：通報しますた：02/09/05 22:59

>>150
invitrogenのほ乳類発現細胞系はライセンスばりばりだぜ。
譲渡禁止ってのが結構あるぞ。
ちくっちゃうぞ～。

152 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/15 01:50

>>139他
翻訳後修飾とかは～？
大腸菌で発現させると活性ない酵素とかたくさんあるっしょ。

153 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/29 00:44

teiki age

154 ：質問君：02/10/05 00:28

すいません質問させて下さいm(_ _)m
ふざけた内容ですが、マジです。
さっき、ちょっと興奮して彼女のアナルに、ローション＆指何本か入れて遊びました。
始めての体験なので、心配です。肛門＆大腸が今後病気にならないか？
とりあえず、ボラギノールは買いに行くつもりはしてますが・・・

155 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/05 01:08

>>154
残念ながら、人間の大腸にいる大腸菌についてくわしいやつはここにいない。
極めたいのは、研究に有用な大腸菌で、人間の大腸では生きることができないような菌です。

156 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/05 03:30

じゃあラボで使ってる大腸菌はどこから登場したの？

157 ：yahoo：02/10/05 09:01

そういや大腸菌にインスリン作る遺伝子組み込んで人工的に作るそうな、人間に直接組んで遺伝病なおせないもんかね？

158 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 01:46

>>155
その通りだ。うちはXLなんだけどDHのとこは何がいい？

159 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 03:26

わざわざ大腸菌買ってるラボなんて知らないが、メーカーからクレームもないよ。

160 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/03 11:44

158について知ってる香具師は？

161 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/04 12:16

>>156
カワイイw

162 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/08 23:31

最初はウンチから分離。そのうち飼いならされて野性味を失った。

163 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/11 12:38

新スレ立ちました。こちらもよろしくお願いします。
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1016116176/l50
タンパク質の精製２

164 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/22 14:52

液体・プレートの培地上の大腸菌を4℃にしばらく置いている人は結構いると思う
のですが、そもそもやるべきではないのか、置いておけるとしたらどのぐらいの
期間までよいのでしょうか。
大腸菌を4℃に静置しておくと、プラスミド調整・タンパク精製のそれぞれの目的
について何か悪影響はあるでしょうか。

165 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/22 15:21

2-3週間おくと大腸菌が死滅してしまいます。
グリセロールストックを作りなさい。

でも半年ぐらいたったカピカピのプレートの表面から
大腸菌をTEで溶かしだしてミニプレップすればプラスミドは回収できます。

166 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/23 02:28

↑マジレス

167 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/23 03:39

グリセロールもいまいちあてにならない気がする。
ほんとになくなって困るものはMaxiPrepしてプラスミドで保存してる。

168 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/23 06:29

いや、2-3日ならOK、という程度の答えを期待していたので…
サンプル調整前の菌体、という意味です。グリセロールストックは
もちろん作っています。プラスミドもストック分は別にしてます。
少し長めのプラスミドで、大腸菌で増やしている間に変異や欠失が
入ったことがあるのですが、PCRと同じように大腸菌が分裂して
増えるほどこうした変異も増えていくものなのでしょうか。

169 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/27 01:41

理屈の上では君の言う通りです。

170 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/27 07:17

大腸菌はどうして室温で振っても増えにくいのでしょうか。
１６℃程度でもよく増える大腸菌は作れないんでしょうか。

171 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/01 04:15

一昔前ならこのスレ盛り上がったんだろうな

172 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 00:09

そうだねぇ

173 ：素人素朴な疑問：03/01/02 00:31

今はいい菌があるから発現・精製であんまり困らないってことですか？

174 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 00:45

大腸菌でとってもね。。。
だんだんセルフリ－に移行してくんだろうなと思うと
極める気にはならないねえ。

175 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 00:48

バカほど大腸菌で取りたがる・・・これは言い過ぎか

176 ：素人素朴な疑問：03/01/02 00:58

グラムスケールぐらいで量をとりたいときもやっぱりセルフリーが
いいですか？

177 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 01:03

>>176
大腸菌で取れるなら、今は大腸菌で取った方がよし。
でも、将来はセルフリ－に移行していくと思われ。

178 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 01:23

セルフリーってホントにいいの？
昔バキュロでいまいちだったのを、
ろしゅから出てた機械でやったけど、
結果はもっといまいちだった。

今はどれくらい進んでるの？

179 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 01:37

ロシュのはイイ噂を聞かないな

180 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 01:39

何かいいセルフリーの系を教えてちょ

181 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 02:51

>>177　なるほど。どうもありがとうございました。
セルフリーって、精製楽そうでいいですね。有機化学みたい。

>>180　大腸菌発現スレや前タンパク精製スレででてたこれはどう？
つうか、使った感想聞かせてください。ｗ

大腸菌の発現についておしえて。
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1016116176/62

182 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 11:22

>>181
大腸菌の発現についておしえてスレが放置される理由分かる？w

183 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/03 01:24

原核生物研究花盛りの時代が懐かしいな・・・

184 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/03 17:54

あんた何歳？

185 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 06:45

今年で五十になりますが何か？

186 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 12:35

いえ特に何も・・・・

187 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/07 00:37

やっぱり大腸菌さいこー
何もいれてないのにLB+Ampで増えたー

188 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/08 00:32

コンタミっていうんだよ。

189 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/08 00:41

いや、耐性を持ったんだろ

190 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/08 00:41

大腸菌だって増えるよ。
Amプレートに現れたサテライトコロニーをAm培地に植えて4日ほど振ると……

191 ：いいこりいのち：03/01/08 02:48

いやあ、イイスレだなぁ．一挙に全部読んだけど
俺は>>7が一番おもろかったな．

192 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/09 00:42

>>191
俺はおまいの名前に一票

193 ：山崎渉：03/01/11 13:27

（＾＾）

194 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/12 00:11

大腸菌は30℃で培養するとどのくらいの時間で２倍に増えますか？

195 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/12 01:41

WT、LBで40分くらい．

196 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/12 01:42

>>195
ありがとうございます。
意外に早いんですね。

197 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/12 11:35

ホントだ。でも数字のうえでは３割増なんだね。

198 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/13 03:11

>>197
どういう意味？

199 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/14 01:10

30分が40分になってもあまり変わってないように思えるが
3割増なので大腸菌にとっては一大事だ罠、の意。

200 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/14 01:10

キリ番ゲター参上！

201 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/15 00:18

じゃあインキュベーター足りない時は30℃で培養するか・・

202 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/16 00:19

42℃で培養するとどうなりますか？

203 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/16 00:46

氏にます

204 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/16 17:45

>>202
特別な遺伝子が死んでない限り大丈夫．
一部のプロテアーゼとかシャペロンとか
ヒートショックで誘導されるものが死んでると
生きないことがあります．

205 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/17 02:10

その時の増殖速度は？

206 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/17 10:11

０分

207 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/17 12:00

いやあ、ほんとにいいスレだ。
大腸菌を研究対象にしたのは学部生の時のみだけど、
ほぼ役に立たない自己満テクニックにはまるんだよね、、
ちなみに、得意技は片手での試験管さばきだったような・・・
自分の手早さにうっとり、そしてテクニシャン一直線(- -；
抜け出せてよかった、、のか？
得意技募集。

ちなみに、大腸菌を42℃で育てると
プラスミド落ちるだけじゃなく、
なんかステーショナリーくらいになると菌液が黒っぽく濁ってくる
気がしたんだけど、気のせい？？

208 ：山崎渉：03/01/18 12:57

（＾＾）

209 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/18 19:19

>>207
信でるからでしょ＞黒っぽい

210 ：207：03/01/18 19:59

あ、そうかも、、、
死んでるといえば、
肺炎双球菌みたいに自己溶菌すると透明になっちゃうのもあるけど、
ああいうのってどのくらい膜が分解されてるの？？

211 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/19 18:56

良スレ化記念カキコ

212 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/20 01:36

37度、抗生物質入りのLBで菌を振ってやって遠心して集菌すると
必ずペレットに黒いすじみたいな沈殿物が出来る．
あれ何か知っている人いる？

>>210
大腸菌をファージで溶菌させて遠心すると
moiとかpfuにもよるけど何も沈殿しないときがあります．
つうことは大腸菌の場合はかなり細かく溶菌されている？

213 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/20 01:40

タンパク取り用に破砕した菌のペレットにある黒い筋と同じものでしょうか。
それが出てる時はうまく壊れたんだな程度に思っていたんですが・・・

214 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/20 22:51

きっと代謝産物なんでしょ

215 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/24 11:42

焦げた培地成分だと思っていたが。

216 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/24 22:08

>>215
ありがとう．

217 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/24 23:14

試験官のフタのカスじゃねえよな。まさか

218 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/25 01:28

ディスポのフタツキチューブでも黒いカスでますた。

ちなみに、ウチノ彼女、コカンから白いカス、でますた。

219 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/25 01:38

↑　フロにはいるように言え！
そういうのが好きなカップルなら知らんが。

220 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/25 02:13

DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli
Justin Courcelle, Janet R. Donaldson, Kin-Hoe Chow, and Charmain T. Courcelle
Published online January 23 2003; 10.1126/science.1081328 (Science Express Reports)
http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/1081328v1

221 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/26 08:36

培地いつ焦げるの？

222 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/26 19:22

>>221
紫外線が多くなる季節に

223 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/26 21:51

>>222
イイ！気に入った．

ところでラクトース入りのLBをオートクレーブしたら
とんでもない色になりました．
０．５かけのコーラみたい．

224 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/27 05:21

大腸菌って実は40度くらいが増殖スピードが最速だったりしません？

225 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/29 22:42

>>224
37℃です

226 ：１０００どら熊：03/01/30 11:10

ベーギャラやってる方、自分以外にいますか？
活性が日によって違いすぎて、うまくデータがまとまらないんですけど、
ばらつき何％くらいはＯＫだと思われます？

今の実験だと平均で２０％弱はばらつきが出てるんで、いいんかなーと

227 ：いいこりいのち：03/01/30 12:01

>>226
ばらつきはきちんとやると出ないです．
Maxでも１０％くらいではないかと．
俺も苦労したけど条件を設定すれば大丈夫です．
もちろんミラーユニットが大きければある程度振れても
いいでしょう．

228 ：１０００どら熊：03/01/30 12:40

>>227
ミラーユニット２００くらいでつ。
条件を設定するとはどういう意味でしょうか？

集菌するときのＯＤは0.2～0.4でやってますが、
もっと揃えるべきなんですかねー。
培地の組成はきっちり同じくしてますし・・・、まあ
ピペッターがぼろいんで誤差はあるんでしょうが。

クレクレばっかで申し訳ないんですけど、あと一つ。
Z-buffer処理してからassayするまでどのくらい冷蔵保存
しててもいいんですか？一時間とかでも菌によってはすご
く変わってくるんでしょうか。

お暇な方いたら、お願いしまつ

229 ：いいこりいのち：03/01/30 15:47

>>228
ONPGでのベーギャルしか知らないが、
俺がクリティカルと思うのはアッセイに用いる菌体量と
公式に当てはめるときに用いるOD600の値です．（ONPG版）
アッセイに用いる菌体量は当然定常期の方が多いのですが、
薄めて対数期と同じにしてます．
公式に当てはめるOD600はその薄めた後のODを用います．
これでだいぶ是正できました．Zバッファ処理はアッセイの直前に
やってます．その代わり回収した菌をオンアイスで保存しています．
この時間は振れの原因にはなっていませんでしたが、
アッセイ時に28度で放置する時間（基質を入れる前）は結構重要でした．
データのばらつきは小さいばらつきの総和って感じです．
だからその他いろいろ原因があると思いますが頑張ってください．

230 ：１０００どら熊：03/01/30 19:36

>>229
なるほどなるほど。
いいこりいのちさん、どうもありがとうございました。
レス参考にして、自分でがんばってみます(早速ベーギャラ)。

でも、うちの教授は薄めて対数期のＯＤにもってくのは駄目だと
言ってたんですよねー。色んなプロトコールがあるんですね。
ではでは

231 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/31 11:23

>>212-216 あの黒いやつって最小培地系でやってもできますか？

232 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/31 13:34

>>231
できない．１×のＭＭを混ぜた後に
オートクレーブすると出るのか？

233 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/01 13:29

できるよ。やってみたら？

234 ：生物消防：03/02/01 14:28

質問版で答えが返ってこなかったので、教えてください！
大腸菌のβ-ガラクトシターゼ活性を調べたい時に、
トルエンを加えて激しく振るのは何でですか？

ついでに、そのあとONPG溶液を加えて37℃で30分振とうするのは
なんか意味があるんですか?

235 ：いいこりいのち：03/02/01 21:14

>>234
トルエンは菌を壊すためにやるんちゃう？
俺はクロロホルムとSDSだけど．
ONPGを加えて37度30分は何かの間違いじゃないか？
37度ではLacZがマックスの活性を持つしその場合のミラーユニットは
どうなるんだ？ONPG溶液を作るときにONPGを溶かす目的だったら
まだわかるが．

236 ：生物消防：03/02/01 21:35

間違いですかねぇー・・・ONPG。
トルエンのほうはありがとうございましたー！
って全然質問版じゃないのにごめんなさいっ。。。

237 ：１０００どら熊：03/02/02 01:31

自分も菌を壊すのはＳＤＳとクロロでやってまつ。
トルエン加えてやるやり方もあるんですね。
ちなみにＳＤＳとクロロ加えて５分間プレローディングして、
溶菌？させてます。

>>２３５
３７℃でアッセイするのはそーゆー意味だったのか。サンクスです

238 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/04 01:35

大腸菌は簡単に壊れるからいいよね。

239 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/08 14:20

30℃のプロトコールもある罠＞ONPG

240 ：いいこりの血：03/02/08 17:56

いぢめないでくらはい by　いいこり

241 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/08 21:30

>240
だめです。

242 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 00:50

大腸菌が生きるのに必須の遺伝子の最少セットを同定する、
なんてことをやろうとしているところがあったな・・・

これこそ極めるって感じか？

243 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 01:30

どこのラボよ？

244 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 01:39

酵母じゃないの？
真核生物だし

245 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 01:47

最近、AD494（DE3)株の匂いが香ばしく感じてきた。
逆にBL21(DE3)は鼻にかかった臭さがある。

このように匂いで大腸菌株を当てられたらプロですか？

246 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 01:49

>>245
ようやくかけだしの研究者として認められます。

247 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 01:53

>>246
道のりは長いでつね。

248 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 02:36

>>247
当然です。

249 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 04:08

>>245
エアレーションの効率で変わってくると思うのは気のせいでしょうか？

250 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 04:42

気のせいです。大腸菌はそこまでシビアじゃない。

251 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 12:28

ｼｳﾞｨｱじゃない

252 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 13:13

>>244
大腸菌です。

253 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 22:08

大腸菌は40℃で培養すると25分で倍になります。

254 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 22:12

培地に硝酸カリウムを入れて静置培養するとかなりの濃度まで増殖する。
呼吸鎖のシトクロムの発現のせいか遠心したときのペレットが赤い。

255 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/09 22:43

>>252
まあ酵母もやってるけどな

256 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/10 20:05

枯草菌も聞いた事あるな。
やっぱりメンバーを考えるとゲノムん時と同様に
大腸菌よか先に行くんだろうな。

>>254
知らなかった。どうして硝酸カリウムなんですか？

257 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/11 00:56

>>256
酵母が最速かな？
ちなみにどこの国でやってるの？
やっぱりアメリカ？

258 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/11 01:58

最小ゲノムってどんな風に決めんの？
strategy知ってる人がいたら教えて。

259 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/11 03:35

はしっこからひたすら読む
よんだらプライマーをつくる
また読む
これ最強

260 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/11 04:10

マイコプラズマの話
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1038782304/8

>>254 10ODぐらいまで行けますか？なんか精製した亜硝酸で変異入りまくりそうな予感

261 ：258：03/02/11 04:57

>このバクテリアの遺伝子のうち、生存に不可欠な必要最小限の
>遺伝子数は２６５、ないし３５０であることを突き止めた。
これがどうやって突き止めたのかが知りたいです。
ってそんなこと突き止めることが可能なの？

262 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/11 09:12

>>261
染色体上で大規模なdelかけて生きてこれるかどうかだとおもいまつ。

だてすんこ＆わーなーの方法使うと、かなり簡単に遺伝子の欠失が作れて、
マーカー遺伝子もそのあと除去できるから
同じ方法でどんどん遺伝子つぶしていけばいいのではないでしょうか。

大腸菌は東京めっとろぽりたん大学の加藤某がやってたと思います。

263 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/11 09:25

>262
実際に実験してる人間からすれば不思議で仕方ないけどねー。
合成致死になったり、一群の遺伝子を削っていくとどんどん弱ってきたり
そういう時どうするんだろうね。

264 ：258：03/02/11 15:26

>>263
激しく尿意！！
つうことは>>262のわんなぁの系を使っても最小セットは
わかんないってことだよなぁ？
例えば遺伝子Ａ単独ではつぶれないけどＢと一緒ならつぶれるってな
ケースもあるわけだし．
むしろ>>260のように思いっきりけずってから（あるいは１から）
付け加えていく方がミニマルになる可能性があるわけ？
加唐先生降臨キボンヌ！

265 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/11 22:14

>>264
よんだ？

266 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/11 23:26

単純にアミノ酸合成系とかは培地に加えたらいいから
最小セットは、「ある培養条件で」培養可能な～
となるんでしょうね。

あと、あるタンパクのN末端側は必須だけどC末端側は削っても大丈夫とかありますよね。
こういうのはどうなるのでしょう？

267 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/12 02:28

それは非必須遺伝子扱いです。

268 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/13 00:20

まずはゲノムが一番小さい生物でやるのがいいと思うんだけど。

269 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/13 11:31

>249
エアレーションの効率ではないけど、
試験管をたてる角度（撹拌具合）によってダブリングは変わってくるよね。
あれって、やっぱり菌密度のせい？？

270 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/13 11:40

下にたまるからだろ

271 ：631：03/02/13 12:15

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272 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/13 18:14

>>269
いや、エアレーションだろう

273 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/13 21:54

いや、下にたまって栄養取り合うからだ。

274 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/14 02:38

最小セット研究ってどれほど進んでるのよ？

275 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/14 12:08

>>274
２／１００％

276 ：938：03/02/14 12:15

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277 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/15 04:46

いいこりはこわいくさいにがい

278 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/15 21:27

喰ったのかよ！

279 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/16 01:01

激しくわろた！

280 ：修士中退無職無収入無資産３５歳：03/02/16 01:04

ピペットで吸っちゃったことがある

281 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/16 02:20

>>280
どんな味だった？

282 ：修士中退無職無収入無資産３５歳：03/02/16 02:26

おいおい
俺のハンドル見てから言えよ
１３年も前の学部時代に一回だぜ
しかも最近は頭の働きが悪くなってきてる
覚えてるわけないだろ

283 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/16 03:07

282 ：修士中退無職無収入無資産３５歳：03/02/16 02:26

頭の働きが悪くなってきてる
覚えてるわけないだろ

生まれつきだろw

284 ：ミュータントとれねぇよ：03/02/16 04:26

もうねあほかとばかかと。
LBはしょっぱいから菌吸うとしょっぱかった。
ほんとににがいのかと問いたい。クロラムフェニコール入りだと
にがいといいたいだけちゃうんかと。
ピペットの先が割れてると
勢い余って吸うことがあるという諸刃の剣。
まあ修士中退やそれを突っ込む>>283は
ゴム製の吸引するやつ（あの名前何つうの？）で
吸いなさいってこった。

285 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/16 04:42

安全ピペット

286 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/16 05:19

幻覚生物だったよな？

287 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/16 13:53

教えてくんですいません。
今、反復の多いちょっと変わった構造をとりそうな領域をできるだけ長く
クローニングしようとしているのですが、1k未満のものしかクローニング
できません。そこで、コンピテントを変えようかという話が出ています。
フナコシがキャンペーン中なのでSUREを買おうかという話が出ているので
すが、128さんがうまくいっていないということなので、どうしようかとも
思っています。
stratageneのサイトにはいいことしか書いていないのですが、実際に使わ
れている方のご感想がありましたら教えていただけないでしょうか。
今、主として使っているのはJM109です。

288 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/16 21:25

そりゃまたもっさいホストを使ってますな
sureもいいかもしれんが（使ったことないからわからんが）
その前に効率のいいホストを使ってみる
DH5αとか
転写されたらまずいのならDH5αF'とか

ベクターを替えてみるのも手
おもいきりもっさいpBR322とか

289 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/16 22:21

>>288
どーいー。SUREつかったけどDH5aとかわんなかったよ。DH5aで
取れる物は取れるし、取れない物は取れないし。DH5aのほーが効率いい。
君のこんすとらくとでどうなるかはしらんけど。

ベクター換えるのも手だけど、30℃や25℃はもう試してみた？

290 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/17 00:46

>>289
ナイスアドバイス

291 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/17 01:19

昔SUREで反復配列を取れた話を聞いたことがある。
効率はかなり悪いけど、他よりは10倍くらいよかったらしい。
いろいろ試してみたら。ものによるだろうから。

292 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/18 01:08

Stbl2を薦めていた人もいたねえ
うまくいかないこと2スレだったか……

293 ：287：03/02/19 08:17

>288-292
ありがとうございます。大腸菌の系統だけでなく、培養時の温度も
変えて試してみます。過去ログをみてみたら、SUREも悪くないよ
うなので、フリーザーを漁って出てきたエレクトロポレーション用
のXL1-Blue MRF'のフリーズストック（生きていれば）を含めて試し
てみます。ありがとうございました。

294 ：JM294：03/02/19 14:23

漏れ普段JM109でアレな時だけJM110使ってまつ。
なんか、真核細胞の餌はWA802、○○用は××、ってルールが
ラボにあるんだけど、黙って全部JM109使ってる。なんも問題ナシ（にみえる）。
こないだcDNAを外からもらったらDH10Bに入ってきた。
特に気にせずLB+G 37℃で培養したらすごい増殖が遅かった。
なんとかプラスミド回収できたのですぐJM109に移し替えた。
実験好調♪　でも、なんで増えにくかったのか調べてないや。
まぁ、困ったときはJMが助けてくれるからぃぃゃ。ウフ、アハ

295 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/19 17:58

温度、下げるんだったら16℃までさげてみなはれ

296 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/19 18:00

最近ﾊﾒ撮りにﾊﾏってる元ﾍﾙｽ嬢19才の夏美だﾖ☆
i-shotで撮った恥ずかしい写真を日替わりで毎日↓のﾊﾒ友募集掲示板に公開中♪
他にも激ﾔﾊﾞ投稿写真がたくさん!!いまだかつて無かった話題の禁断サイト
http://www.c-spot.org/?fuu
ぜひ見に来て下さいね★

297 ：高校少年ｓ：03/02/19 18:11

高校のうにの発生の実験についての質問です。
Q1.「卵の大きさが急激に大きくなるのは第何ステージか？」
Q2.「エキノプルテウス幼生からは汲んできた海水ではうまく発生が進まないのはなぜか？」
以上について、誰か教えてください。お願いします。

298 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/20 00:06

>294

全く問題ないと思われ

そのままやって良いと思われ

299 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/20 03:09

おめ！↓

300 ：大学院おっさん：03/02/20 03:21

>>297
Q1．おそらく32細胞期じゃない？急激ってのがよくわからんが。
Q2．汚いから。金属イオンとか界面活性剤がよくない。
Q3．激しくスレチガイ。高校生は先生にききましょう。

301 ：高校生：03/02/20 04:19

大腸菌を形質転換するとき
どうしてヒートショックをするんですか？
教えて下さい。

302 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/20 11:10

DNA取り込みが良くなるためだと言われてる。
実際は、やらなくても結果はあまり変わらない。

303 ：JM294：03/02/20 11:45

>>302
禿しく同意。前回の実験が失敗してたら景気づけにやってみるって感じ。

原理わかる？
この温度と時間が、膜の穴を塞がず、なおかつ大腸菌も死ににくい
条件なのかなーって思ってましたが、
「転換効率が上がる理由については不明」ってな本を読んだような・・・
フォローきぼん

ファージ使うときにやるヒートショックとは違うよね。。。たぶん。
むちすまそ

304 ：JM294：03/02/20 12:07

教えて君でごめんなさい。
青白判定できる菌ってゲノムのLac系壊されてるよね？
ってコトはマッコンキーで赤紫色にならんってこと？
JM109 + pUC19 → 赤紫色
JM109 plasmid- → ↑より薄い赤色
は確認したんだけど、ゲノムLac生きてそうな大腸菌も、
マッコンキーで生える別の非乳糖分解菌ももってないから
比較ができなかった世。

305 ：975：03/02/20 12:15

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306 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/21 04:28

>>304
俺のlacZ欠損株は白（黄?）だけどなぁ
もちろんワイルドは真っ赤だった

307 ：JM294：03/02/21 10:40

>>306
多大なサンＸ！
全然スレとは関係ないけど、今日、研究室の飲み会だ。
早朝にレスしてくださった306さんに敬意を表して
マッコンキー！と心で叫びながらカシスサワーを飲むことにするよ。
↑どうでもいいけど、そゆこと口に出す香具師もいるよね。。。

308 ：ペル名無しソーム：03/02/21 18:46

ニューオズマのＣＭに出てくる研究所ってドコだっけ？
マッコンキーを誇らしげに眺めてるシーンがあるけど、
ニューオズマで滅菌処理して実験してるんだろ？おめでてーな。

309 ：bloom：03/02/21 19:07

http://www.agemasukudasai.com/bloom/

310 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/23 11:49

>>303
形質転換の話だよな。
ヒートショックすると転換効率があがる理由は不明のはずだが。

311 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/23 13:27

誰も明らかにしようとしないのは何故だろう。

312 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/23 18:25

プ□メガのマークを背負った黒装束の男に狙われるから

313 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/24 03:26

ネタが古い

314 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/25 03:26

こいつもひーとしよつく！

315 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/04 16:54

ニューオズマって？

316 ：ペル名無しソーム：03/03/05 02:22

すまん。ＴＶＣＭしてんのはオズマだった。
http://www.primecard.org/osusume/ozma/

ディスカウントショップで売ってるコレの類似品（後継品？）がニューオズマかな。
ＣＭで言うには、除菌効果を調べた研究所では実際にコレを使用して衛生管理してるらしいよ。

317 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/05 19:21

>>316
殺菌剤で滅菌する代わりに使ってるのかな？
まさかオートクレーブの代わりじゃないよね。

318 ：ペル名無しソーム：03/03/08 03:29

週一回、オズマ使ってベンチを清掃したり、棚を洗浄してるってことかな。
エタノールで拭いても減菌できるガナー

319 ：山崎渉：03/03/13 13:43

（＾＾）

320 ：山崎渉：03/03/13 13:51

（＾＾）

321 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/14 15:32

96本組のコンピテントセル初めて使ったけどすごく便利。
贅沢？

322 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/14 16:09

コスミドのdeletionはどうすりゃええ？

323 ：灯台院生(´･ω･｀)ｸﾁｭ ◆ipJni/6Rlw ：03/03/16 02:37

>>321
金が余ってるならそれもよかろう。

324 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/26 07:12

>321
ディープフリーザーの場所を取らないので良いよ。

325 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/05 14:14

こないだコンストラクションしました。
pT7BLUEにある遺伝子のプロモーターを突っ込んだだけです。
シーケンスチェックもばっちりで次のコンストラクションを
行おうと3週間後に菌をプレートから拾ったところ、
菌の増えが悪い上にプラスミドはほとんど取れない状態でした。
ホストはDH5アルファなんだけどどうしてこんなことになるの？
誰かわかる人教えて。

326 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/05 16:57

菌が死んじゃってたんじゃない？

327 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/05 17:39

F+菌をオス、Ｆ－菌をメスというのはなんでですか？
精子を送り込むのとDNAを送り込むのを擬してるんだろうけど。
ちょっとおかしくない？

328 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/07 04:18

中田氏って点で正しいだろ。
でも複製しながらだからなぁ。。。
だいたいオスメスの定義もよくわかんねぇな。

329 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/07 13:35

＞325
プラスミドって抜け落ちることがあるみたい。でも大腸菌は抗生物質入りプレートで
生き続けてるし・・・。

330 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/08 03:57

だいたい二週間ぐらいすると死に始めるよ大腸菌様は。
>>325
三週間だと液体培地に移してもあんまり生えなくなることが多い。
一ヶ月するともうだめぽ。ちなみにDH5alpha' とJM109の場合ね。
他はあんまり使ったことないんで知らん。
とっととグリセロールストック作れ（ﾟДﾟ）ｺﾞﾙｧ !といったところでしょうか。
あと、知ってのとおりサテライトとかエスケープとかは結構出るので、>>329のような
場合でもプラスミドが入ってない菌が増えてることは結構ある。

331 ：325：03/04/15 00:29

なんでよ？
recAなしで組み換わったりとかすんの？
plateに植菌してから２ヵ月後でも
問題ないときだってあるのに・・・
その辺のメカニズムとか考えられる原因とか誰か列挙してほしいっす。

332 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/15 01:33

recAなしでも組みかわったりするよ組換えじゃなくて、死んだ菌体から出てきたDNAをとりこんで
適当につなげてDSB修復してるんじゃないかな

333 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/15 09:52

サテライト拾ってきたから増えないんじゃない？

334 ：山崎渉：03/04/17 08:50

（＾＾）

335 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/17 22:44

大腸菌が積極的にプラスミドに変異を入れるという話を聞いたことあるけどなぁ。
けど331の場合は十中八九死んだコロニーつってきたと思われます。2ヶ月放置した
プレートからつってきたコロニーはたまたまプラスミドが維持されてたまたま生き
てただけだと思う。

336 ：325：03/04/19 00:14

どうもレスくれてありがとう。
もっかい作り直してんけど、なんかもともとめっちゃ不安定みたい。
あたりをグリセロールストックしたけど、起こしても死にかけてるし、
溶菌してる感じ。コンストラクト自体がときしっく？
で、強いプロモーターをクローニングしてるから
更にターミネーター突っ込んだら安定化するかな？
>>332
DSB修復がrecAインディペンデントって知らなかったです。
勉強してみます。

337 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/19 05:48

冷蔵庫に入れておけばそう簡単には死滅しないよ。

338 ：ﾎﾟｽﾄﾞｷｭﾝ ◆2Syv7nVpfU ：03/04/19 11:27

久しぶりに読み返してみたけど、漏れとんでもない勘違いしとったな･･･。
恥ずかしいのでsage

>>325
インサートによっては、たまに菌がすぐ死ぬことがありました。
そういう時、私はplasmidが必要になるたびにtransformationしなおしてました。
アホ臭いですが。

339 ：山崎渉：03/04/20 03:57

　　 ∧＿∧
　　（　　＾＾）＜ぬるぽ（＾＾）

340 ：325：03/04/21 01:01

ターミネーター入れたら菌が安定になりました。
ほんとにそれが原因だったかはわからないけど、
強いプロモーターをクローニングするときは
ターミネーターを入れるべきといえるでしょうか？
誰か知ってる人いますか？

341 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/21 23:31

大腸菌のプロモーターをクローニングしてるなら、気をつけて悪いことはないだろね。

342 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/23 13:15

オレの下痢便、コンピテントセルに使えないか？

343 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/23 13:24

↑　そんな強い菌はラボで使えないでつぅ

344 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/23 16:55

オスとメスがいるってほんと？

345 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/23 17:29

>344
>>327

346 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/06 05:22

別にそれでいいよ。

347 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/06 13:08

大腸菌と直接関係ないけどさ、深夜番組の抗菌アイテム胡散臭いよなぁ。
スターファイバーとかの除菌効果を検証してる研究所って普段どんな研究してんだろ。

348 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/07 14:03

誰か、細胞外でプラスミドを複製する方法をしりませんか？

349 ：動画直リン：03/05/07 14:25

http://homepage.mac.com/hitomi18/

350 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/07 14:47

>>348
今ちょっと思いだせんが、TOYOBOが発明した細胞外複製はタンパクだっけ？
二層のヤツ。

351 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/07 15:33

＞＞３５０
TOYOBOは、タンパクの複製だ。

352 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/07 19:20

>>348
Templiphi でぐぐれ。

353 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/08 01:40

>>348
inverse PCRで具ぐれ

354 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/08 02:44

学部生はカエレ（・∀・）

355 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/11 03:37

大腸菌の遺伝子破壊株に対する相補性テストについて質問です。
大腸菌のある遺伝子をつぶしてその遺伝子をプラスミドで
相補しようとしたら表現形が回復しませんでした。
この場合どのように解釈したらよいですか？
タンパクはウェスタンで確認できました。
暇な大腸菌研究者の人、お教えください

356 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/11 03:47

>>355
発現量は同じでしたか？
プロモーターの選択、プラスミドのコピー数等が影響しているかも。
相補した遺伝子は同一大腸菌由来ですか？
コドンusageの違いや、真核生物のイントロン抜き忘れとか（そりゃないか。
ウェスタンに持っていった時の細胞の条件と、
表現型を見ている時の細胞の条件は同じですか？

357 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/11 04:19

琉球大農の比嘉教授の提唱する「EM菌」って何ですか？

＞ http://science.2ch.net/test/read.cgi/nougaku/994584145/112-130

>彼は論文はKYUSEIなんとか（世界救世教の関係誌？）という，自分で作った学会に投稿しています。
>当然，連大の主査の資格はとれません。博士課程の学生も皆無です。
>卒業生の多くはＥＭ関連の会社に就職していきます。

358 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/11 09:40

Peer reviewのある国際誌に論文がないのに評価なんか出来る訳有りません。
追試が出来てはじめて評価できますから。
だから何なのか分かりません。

以上

359 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/16 01:39

４度で長期保存すると中のプラスミドはおかしくなりますか？

360 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/16 01:54

ドロップアウトします

361 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/17 16:02

それはピンボケな答えだな。
答えとしては、頻度は低いがおかしくなる、が正解。

362 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/18 01:44

バキュロを使って昆虫細胞でタンパク質を作らせることになったんですが
pFastBacをＤＨ１０Bacにトランスフォーメーションしたものが
プレートにはコロニーが生えるのですが
そのコロニーをつついて液体培養しようとすると
３７℃で一晩ふってもぜんぜん濁ってこないのです
抗生物質は間違えていないことは確認しています
よろしくおねがいします

363 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/18 01:45

　
これで凄く稼いでる人がいるのね～。

http://www3.to/happynight

本気になってやってみよっと。

364 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/18 03:59

>>362
30度で振る。これちょっとだけ最強。

365 ：山崎渉：03/05/21 21:48

━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

366 ：３６２：03/05/22 22:23

>>364
ありがとうございました。
うまくいくのものがいくつかありました。
でも、何でなんでしょうか？

367 ：あぼーん：03/05/22 22:23

http://homepage.mac.com/hiroyuki43/jaz_b.html

368 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/23 00:57

>>362
ヤヴァイタンパクができちゃうときは
それを分解するためのシャペロンが必要．
そのシャペロンは低い温度だと余るので
ヤヴァイタンパクを分解するのに十分になる．

ドナーのプラスミド上に大腸菌で発現できる何かが
乗っているか、DH10Bac自体がへたってるか．

369 ：山崎渉：03/05/28 14:24

　　　　∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　(　　＾＾）＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣〕
　　＝ ◎――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉

370 ：厨：03/06/04 09:19

pLysSが入った菌のコンピテントセルを作ったら、解凍してるときに
死にまくってる予感。。DTT入れればいいんやろか？

371 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/04 13:06

えしぇりきあこおらい

372 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/07 12:08

>>370
漏れも同じ事をしてるけど死なないＹＯ！

373 ：1：03/06/13 00:40

　おっまだこのスレ残っていたんか。　皆様のおかげで某有名研究室に入れたぞ。
本当にありがとう。ﾏｼﾞ感謝
　今度はSingle Strand DNAをColE1ハイコピー型のpUC系ベクターを使って取ろうかと思っている
まずF因子について誰か詳しく教えてくれ

374 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/13 02:18

あなたが探してるのってこれだよね？この中にあったよ♪
http://endou.kir.jp/betu/linkvp/linkvp.html

375 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/13 23:50

>>373
詳しく説明するのは面倒だが、F因子は大腸菌に接合をさせて自分自身を伝播させる巨大プラスミドで、ssDNAの産生に使われるM13/f1系のヘルパーファージはF因子にコードされる性繊毛を使って感染するので、F因子を持っていない大腸菌には感染できない。

376 ：9匹目の猫：03/06/14 09:07

　お久しぶり(ハンドル名が変わっているから、分からないかも)。
希望の研究室に配属されたようで、良かったネ。

　Ｆ因子というのは、おそらく元々はバクテリオファージ様の物で、
375 の言っているように、環状のゲノムを持っている。こいつを
持っていると、大腸菌の表面に F-pili と呼ばれる繊毛が出来る。
この F-pili を通して、Ｆマイナスの大腸菌に接合することが
可能になる。野生型のＦ因子なら、この F-pili を通して自身のゲノ
ムをＦ－マイナスの大腸菌に移すことが出来る。結果、Ｆマイナ
スだった大腸菌が、Ｆプラスに変化する。
　ただし、研究室で使われている F+ の大腸菌株(JM109、XL1-
blue など)では、F-pili を通じたゲノムの転移に関する遺伝子が
つぶされているため、上で述べたような F ゲノムの転移は起き
ない。

377 ：9匹目の猫：03/06/14 09:07

　さて、ssDNA の調製に使用される M13ファージは、375 の言っ
ているように F+ の大腸菌にしか感染しない。一方で、XL1-blue
や JM109 の F 因子は転移能力が無いため、簡単に落ちてしまう
(つまり、F の無い大腸菌が出来てしまう)。そこでこれらの大腸
菌株では、F 因子を持った大腸菌だけ selection できるような仕
掛けがしてある。

　XL-blue では、F 因子にテトラサイクリン耐性遺伝子があるの
で、培地にテトラサイクリンを入れる事でＦ因子を持った大腸菌
だけ増やすことが出来る。
　JM109 の場合は、Ｆ因子にプロリンの代謝関連の遺伝子が乗って
いて、ゲノムではそのプロリン代謝遺伝子が欠失している。だから、
プロリンを含まないような培地で培養すると、Ｆ因子をもった大腸
菌だけ増やすことが出来る。

　こういった方法で、Ｆ因子が落ちないように工夫しないと、
ヘルパーファージが感染せず、結果として ssDNA が取れないと
いうような結果になりかねないので、注意。

378 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/14 11:45

>>373
ところで今時ssDNAなんて何に使うの？

379 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/14 12:38

シーケンスに使うのでは？

380 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/14 12:38

みてね～♪
http://www1.free-city.net/home/s-rf9/page003.html

381 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/14 13:31

>>379
今どきシーケンスにssDNAなんて使うか？

382 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/20 00:02

アンピシリン入りLB液体培地を吸ってしまったが、
一体大丈夫なんですか？
大腸菌に詳しい研究者教えてください！

383 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/20 00:57

大丈夫だ。

384 ：382：03/06/20 01:04

俺が大丈夫だとしても、元のLB液体培地が俺の口内細菌で汚染？
バレルの怖くて元に戻して置きました。

385 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/20 05:45

そう思ったら戻さないで捨ててくださいです････。

386 ：名無しゲノムのクローンさん：03/06/20 05:52

☆Ａ級美女が貴方を癒します☆
http://endou.kir.jp/yuminet/link.html

387 ：370厨：03/06/24 09:22

>>371 グリセロール15%入れたら生えまくるようになりました

388 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/06 05:32

遅レスでごみん
>>301 ヒートショックは何でしつよーかという問い、、。
確か、膜の流動性を良くするんだったっけ？
フリップフロップとかなんとか。
で、なんだかんだでDNAを取り込みやすいと。

あと、野場源で売られているRossetaBlue (DE3)ってどうなのよ。
評判聞かせて。

389 ：爪がえる負けるなISSAここにあり：03/07/06 05:35

すれ違いで質問してた、、。
こっちのほうがレスもらえそう、、。

訳あって、大腸菌に複数のプラスミドを入れる予定です。
今のところ、一つの大腸菌の中ににpMB1オリジンとp15Aのオリジンのプラスミド２種類が入っています。
まあ、BL21コドンプラスにpETが入っていると考えてくれれば結構ドス。
さらにもう一つプラスミドを共存させて合計3つベクターを入れてやりたいんだけど、
どんなオリジン弁当のベクターがいいですか？
もちろん選択マーカーは違うのにしなきゃいけんけど、、、。
だれかこんな事やってる、あるいは周りにいるというヒトがいたら
マジレス下さい。
あと、こういうことをすると、それぞれのベクターが一気に不安定になる等の
Tipsがあれば教えてくれると助かりまそ。

390 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/06 08:01

>388
BL21(DE3)pLysSやBL21(DE3)CodonPlus-RP(だったっけ)で発現しなかった(CBB染色)タンパクが
Rosetta(DE3)pLysSでは発現したことはあったよ。
でもRossetaBlue (DE3)とRosetta(DE3)pLysSは性質がまた違うかも、
参考にならなかったらごめんなさい。

391 ：388：03/07/07 10:03

390ばんさん
ナイスレスです。参考になります。
Rosetta(DE3)pLysSって、素敵やん（島田伸助っぽく）。

392 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/08 19:10

>>389
とりあえずやってみて結果教えて！
俺も俺の周りにも３つはおらんなぁ。
ひとつをラムダにいれて溶原化って言うわけにはいかんのか？
ハイコピーなプラスミドを入れるとそれだけで
とってもトキシックな感があるがどうかな？

393 ：1：03/07/09 01:59

最近雑用多くてしんどいわ。。。２ヶ月間実験してない。
ＢＴＷ、　375さん、９匹目の猫さん貴重な情報ありがとう。　
モレキュラークローニングで関連する章をしこしこ読んだが、
そこまで詳しくわからんかった。。。ドキュンから抜けられないし　鬱死
　別の本で勉強されたのですか（他の章に書いてあるのかな）？　

　結局、Ｍ９ＫＯファージをpUC系ベクターを保有したＪＭ１０９（Ｆ+）
菌に感染させることにしました。
Ｍ９ＫＯファージとＭ１３ファージは全く同じものと考えて良いのかな？

　　

394 ：1：03/07/09 02:06

　＞389くん　なかなか面白いことやってるね。　
モレクロにoriが違えば、共存できると書いてるが最高何個まで
いけるんかね？　ギネス登録をねらえるんじゃない？

395 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/09 02:40

　LBA寒天培地にトランスフォーメーションした大腸菌JM109を植えていて４℃冷蔵庫
に保存して一ヶ月になるのですが、大腸菌にインサートした目的遺伝子って
変異とかしている場合があるのですか？
大体、何週間で新たな寒天培地に植え替えすればよろしいのですか？
教えてください。
　ちなみに冷凍保存している株は無くて、変異されていたらすごくやばいんですけどね。

396 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/09 02:54

>>395は今更聞けないスレから来たな…ﾌｫｯﾌｫｯﾌｫ

397 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/09 05:37

普通はグリセロールストック作っとくもんなんだが････。
少なくとも私は寒天培地上での植え替えはあんまりしないです。
心配なら、プラスミドは持ってるだろうから再トランスフォームすればよろし。
１ヶ月ぐらいならまあ平気だとは思うけど、ものによっては駄目なことがある。

398 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/11 02:34

ところで、ミニプレップがめんどくさいから
コロニーを水で溶かしてboilしてcfg.してsup.を
トラフォメしたら生えるかなぁ？
やったことある人いる？

399 ：山崎渉：03/07/12 12:13

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

400 ：山崎渉：03/07/15 13:03

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

401 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/15 22:25

だれか容易に入手できるsuicide vectorをご存知でしたら教えてください。

402 ：sage：03/07/15 22:37

↑自殺それともアポトーシス？

403 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/15 23:05

グラム陰性菌に入れたいんですけど（破壊目的で）

404 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/16 17:53

>>401

大腸菌の遺伝子破壊はきょうびsuicide vector 使わへんで。

Datsenko KA, Wanner BL.
One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640-5.
PMID: 10829079

405 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/16 19:20

どうもありがとう。入れたいのは大腸菌ではないけど、広く陰性菌につかえるやつ知りませんか？？

406 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/16 19:22

☆頑張ってまーす！！☆女の子が作ったサイトです☆
　　　　　　　☆見て見て！！
http://yahooo.s2.x-beat.com/linkvp2/linkvp2.html

407 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/16 20:53

大腸菌以外に使えるかわからんがpKO3なんかはどう？
大腸菌ではすばらしくうまく逝った。
ttp://arep.med.harvard.edu/labgc/pko3.html
頼めばすぐにもらえる。

ところで大腸菌以外のグラムネガティブに使えるベクターって
どんなoriが必要なん？

408 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/16 22:28

緑膿菌とかｲｴﾙｼﾆｱとかは野生株でプラスミド持っているので
こいつらからoriをクローニングして使ってるんじゃないかなぁ。
ま、こういうプラスミドはファージやらＦに近縁で
コピー数がかなり少ない罠

409 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/16 22:36

夏です　　エイズ感染検査　　そんな時はこれ
簡単に誰でも自宅でなめるだけのエイズ感染検査キット、oraquickはここで
特別入荷！！！彼氏を、彼女の浮気をチェック！？1本の赤線ならokです！
http://www.labora.jp/hiv/index_pc.html
http://members.goo.ne.jp/home/oraquick

410 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/18 11:24

>>398
無理！コンピが10^10位だったらうまくいくかも。

411 ：なまえをいれてください：03/07/24 16:08

ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

412 ：名無しゲノムのクローンさん：03/08/19 01:06

>>405
どうもありがとう。入れたいのは大腸ではないけど、広く女陰をつかえるやつ知りませんか？

413 ：名無しゲノムのクローンさん：03/08/19 01:11

大腸以外に使えるかわからんがokuchiなんかはどう？
大腸ではすばらしくうまく逝った。
ttp://homepage.mac.com/hitomi18/
で頼めばすぐにオカズはもらえる。

414 ：名無しゲノムのクローンさん：03/08/19 01:22

大腸菌を生きたまま染めて蛍光顕微鏡で観察したいんだけど、
どんな色素がおすすめですか？

時間がたっても、色素の量ができるだけ変化しないもの
（代謝されない、外に漏れ出しにくい、bleach しにくい）
がベターです。タンパクなどは望ましくない。

415 ：名無しゲノムのクローンさん：03/08/19 18:03

少ない知識でのディスカッション。
ほほえましいのぉ。
がんばれ若者ぉ。

416 ：名無しゲノムのクローンさん：03/08/19 21:46

写真集だよん☆☆☆☆☆☆
http://www.sexpixbox.com/pleasant/teen/index.html

417 ：しゃけ：03/10/30 09:28

ああああああああああああああああああああああああああああ

418 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/30 22:29

大腸菌の何を染めたいか書け？
核酸なのか、タンパク質なのか、膜なのか？

話はそれからだ

419 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/18 21:20

質問させて下さい。
LacIqを持ってるプラスミドでtrcプロモータの下につないだ
遺伝子がIPTG添加前に発現してしまうのですが、
こういうのってよくあるんでしょうか？
ちなみにホストはXL1-Blueで、培地はLB+グルコースです。

420 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/19 00:51

グルコースが入っていれば普通は大丈夫なはずなのだが。
温度を下げてみなはれ

421 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/19 21:02

温度ですか、なるほど。今37℃ですが、30℃とか？

422 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/20 00:34

プラスミド取り以外は発現はいつも30度がおすすめどすえ
性質の悪い奴の場合には25度とか20度を使い分けて
みなはれ

423 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/20 21:09

へー、知りませんでした。常識でした？
けど、なんで温度下げると発現コントロールがうまく行くの？
っていうか37℃でダメなのはlacIqが働いてないせいなのかね？
それとも別の理由が・・・

424 ：名無しゲノムのクローンさん：03/11/20 23:21

lacIqでもプロモーターのリークは必ずあるから、安定なタンパク質ならバンド見えるよ。それほど珍しいことじゃない。

425 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/05 01:43

　　　　　　 lヽﾉ l　　　　　　　　ｌ l　ｌヽ　　ヽ
　 )'ｰーノ(　 |　|　 | ､　　　　　 / l｜ｌ　ハヽ　　|ｰ‐''"ｌ
　/　E.　　|　|　|／| ﾊ　　/ / ,/ /|ﾉ /l /　ｌ l ｌ|　ｌ　 E. ヽ
　l 　･　　i´ |　ヽ､| |ｒ|| |　//--‐'" 　｀'メ､_ｌﾉ| /　・　 /
　|　 co 　l　トー-トヽ| |ノ　''"´｀　　　ｒｰ-/// |　 co ｜
　|　･　　 |／　　　 | l ||､　''"""　 j　""''/ | |ヽｌ　・　｜
　|　 li　　 |　　　　 | l |　ヽ,　　― 　／　| |　ｌ　 li 　 |
　| 　 !!　 |　　　 /　| | |　　 ` ｰ-‐ ' ´||　,ﾉ| |　|　　!!　｜
ノｰ‐---､,|　　 /　│ｌ､l　　　　　　　 |ﾚ' ,ﾉﾉ　ﾉハ､_ノヽ
　/ 　　　　／　ノ⌒ヾ､　ヽ　　　ノハ,　　　　 |
,/ 　　　　,イーｆ'´ /´　　＼　| ,／´ ｜ヽl　　　　 |
　　　　／-ト、|　┼―- ､_ヽﾒr'　, -=ｌ''"ハ　　　　|　ｌ
　　 ,／　　|　ヽ　＼　　_,ノｰｆ' ´　　ﾉノ　ヽ　　｜　|
､_　　　 _ ‐''ｌ　　`ー‐―''" ⌒'ｰ--‐'´｀ヽ､_ 　　_,ノ　ノ
　￣￣　　 |　　　　　　　　　　／　　　　　￣

426 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/09 15:32

今現在レポートに終われています。それで、わかっていないのが、
大腸菌の世代時間。
あと、グラム染色で枯草菌と大腸菌についてやったんですが、この二つは何で色が違ってくるんですか？
あと、ほかの班は色が同じに（黒青）なったらしんですが、なぜなのでしょうか？
どうかご教授お願いします。

あと、ほかにレポートでネタになりそうなことがあったら投下してください。
お願いします。

427 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/09 16:18

世代時間→培地（栄養）条件、温度 etcによって変わります。

37℃では染色体の複製には約40分かかります。
あと、DNA の複製終了から細胞が２つに分かれるまでには20分かかります。
しかし、富栄養の条件下で、大腸菌は40+20の60分よりも短い時間で倍加します。
この点が原核細胞と真核細胞で大きく異なる点の１つであり、このへんの話をレポートで書くといいのではないかと思われます。
（何故可能かについてはご自分でお調べ下さい。）

グラム染色→洗いが足りなかった事が考えられます。

参考：http://www.google.com/search?q=グラム染色での偽陽性&ie=UTF-8&oe=UTF-8

428 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/13 22:29

最近チトクロムｃの実験をやって
ＵＶ法のたんぱく質の適正濃度ってあるとかＴＡが言ってたんですがそれっていくつなのかわかりますか？

グラフは吸収スペクトルでやったんですけど

429 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/07 23:19

>>389
問題なしやで。普通にやってる。

430 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/13 15:23

DH5αのlacZ遺伝子の塩基配列を知りたいのですが、遺伝子型の読み
方が良く分からず困っています。
野生型の配列は分かっています。
Φ80dlacZΔM15　と　Δ(lacZYA-argF)U169の意味を教えて頂け
ないでしょうか？
lacZΔM15はα-fragment領域のdeletionだと思うのですが実際ど
のように欠失しているのか良く分かりません。

他の遺伝子型に関しても時々意味が分からないものがあり困ることが
あるので、大腸菌の遺伝子型の表記法、もしくは解説がわかる文献や
ページ等があったらそれも含めて教えてくれたらありがたいです。
大腸菌に関しては専門ではないので、分かる人がいたらよろしくお願
いします。

431 ：おど：04/01/13 16:06

E.ColiにもZn fingerあるの？

432 ：いいこりいのち：04/01/15 01:42

>>430
M15はY、Aが残ってるからαコンプリメンテーションができる
U169はオペロンごとないのでZだけ入れても青くならない
>>おど
ある。smtAとかいくつか

433 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/15 18:24

>>430
Φ80dlacZΔM15 ファージ　ファイ（Φ）８０　の溶源菌、ただし
　　　　　　　　増殖性なし　ｄは（defective)
このファージにlacZΔM15が載っている。
Δ(lacZYA-argF)U169
　　　　　　　　Δは欠失の意味　lacZYA遺伝子からargF遺伝子にわたる
　　　　　　　　染色体領域が欠失している。U169は欠失の分離番号でしょう。

以上。

434 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/16 09:35

>>432　X-Galの分解にＹやＡが必要なわけないだろ

435 ：432：04/01/23 03:19

>>434
そだね．Xギャルの分解にY、Aはいらない．
だから>>432は間違い．すまそ．
オメガフラグメントについてはイーこりアンドサルモネラに書いてあった．

436 ：430：04/01/24 20:09

>>432, 433レスありがとう。

>>433
ということは、DH5αのαコンプリメンテーションに使われるlacZって
いうのは、本来の染色体領域ではなく、プロファージにのっているって
ことだったんですか？

大腸菌染色体のどこかの領域にあるDNA断片を導入したいと思っている
のですが（最初lacZにしようと思っていた）、他に大腸菌の生育に影響
しないような適当な領域ってないですかねぇ？　rpsL遺伝子とかも候補
に入れているのですが、、、

437 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/24 21:52

DH5αにホモローガスリコンビネーションでの挿入は無理だから
ラムダファージじゃだめか？
attBは生きてるんじゃない？

438 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/25 15:46

>>436
rpsLはribosomeのsubunitをコードする必須遺伝子だから
ここ潰して何らかの遺伝子を導入するのは不可能です。
MC1061とかに入っているrpsL変異（strA）は点変異だったと思います。

入れる場所としては437さんの書いたattBの他にはattTn7とかが無難だと思います。
枯草菌ではamyEに入れるが定番ですが、大腸菌の定番はどこなんでしょ？

染色体上への導入法は
>>404
など

439 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/25 21:12

基本的な質問かもしれませんが、
HB101をM9で培養したけど、ほとんどはえませんでした。
何か他に入れないとダメなんでしょうか？
教えてください。

440 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/26 02:54

HB101
Genotype
leuB6, proA2, recA13, thi-1, ara-14, lacY1, galK2, xyl-5, mtl-1, rspL20, supE44, hsdS20, (rB-, mB- at least thi-hsd from Escherichia coli B)

441 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/26 16:09

>>436
ということは、DH5αのαコンプリメンテーションに使われるlacZって
いうのは、本来の染色体領域ではなく、プロファージにのっているって
ことだったんですか？

質問のとおり、そういうことになります。この株では本来の染色体の
lacIZYaからargF遺伝子の領域にかけて欠失しています。

大腸菌染色体のどこかの領域にあるDNA断片を導入したいと思っている
のですが（最初lacZにしようと思っていた）、他に大腸菌の生育に影響
しないような適当な領域ってないですかねぇ？　rpsL遺伝子とかも候補
に入れているのですが、、、

rpsL遺伝子は先に指摘があったように成育に影響します。
大腸菌には増殖に必ずしも必要ない遺伝子がかなりあります。
これは、http://shigen.lab.nig.ac.jp/ecoli/pec/index.jsp
の大腸菌遺伝子地図を参照してみればわかります。
アミノ酸代謝の遺伝子などを考えてみてはどうかと思います。
特にすでに変異が知られているものは特に。

442 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/26 16:22

>>439

440のHB101 Genotype から、ロイシンとプロリンを加える必要があります。
どちらも最終濃度で５－１０マイクロg/ml, またビタミンB1要求性です。
これは１マイクロg/mlもあれば十分です。炭素源としてグルコースを
使用していれば問題ありません。あと、Ｍ９にはMgSO4 とCaCl2を添加するのを
お忘れなく。

これで成育しなければ問題です。

443 ：パピコ：04/01/26 16:33

ロイシンだけ入れてもいいの？
ロイシン入れるときはバリンとイソロイシンも入れたほうが
無難ではないの？よく知らんのでご教授願いたい>>442

444 ：匿名：04/01/26 21:32

Ｍ－15株を使ってるんですけど、膜精製で一番注意するところってどこですか？

445 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/26 22:36

439です。
ありがとうございます。
早速試してみます。

446 ：名無しゲノムのクローンさん：04/01/26 22:42

鞭毛・繊毛がないのに運動性が高い菌株なんてありますか？

447 ：430：04/01/27 11:07

皆さん、レス有り難うございます。
>>437
実は強制的にDH5αの中でホモローガスリコンビネーションを起こさせようと思っています。おそらく外からrecA, もしくはrecE等を発現するベクターを一過性に導入してやれば可能ではないかと思っているのですが、、、

>>438,441
rpsLについては、そうですか、知りませんでした。rpsLで変異率を測定する系があったので（ストマイ選択）、てっきりなくても平気なものかと思っていました。

>>441
これからそのページを参考にして他の領域を捜してみようと思います。
取り急ぎですが有り難うございました。

448 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/05 12:00

とあるタンパクをHis-Tagつけて発現させ、ウエスタンしてみました。
ペリプラズムにある目的タンパクはHis有、培養上清にあるのはHis無、
という結果でしたが、こういうことはしばしば見られることなのでしょうか?
また、原因として何が考えられるのでしょうか?
是非、ご教授お願いします。

449 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/05 17:17

どうやってHisタグが作られたのか考えてミロ

450 ：448：04/02/05 18:46

すみません、どういう意味なのでしょうか･･･?
ペリプラズムから培養上清に漏れてしまったときにHis-Tagが取れてしまう?
のではないかと思ってもみたのですが、そんなことはなさそうですし･･･
よろしければ、もうちょっと教えていただきたいのですが。

451 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/05 18:48

そのタンパクは何か教えナサイ

452 ：448：04/02/05 18:49

セルラーゼです。

453 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/06 01:52

どうしてsageなのデスカ

454 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/18 15:23

pUC18にあるタンパクの遺伝子を入れて、JM109
で発現させています。200mlまでの振とう培養では
ある程度発現するのですが、spinner(1L or 10L)に
スケールアップするとほとんど発現が見られません。
何が原因でしょうか？スケールアップする時の注意点
等有れば教えてください。

455 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/18 15:28

>>454
アンピシリン濃度は200μｇ/mlでやる

456 ：454：04/02/18 15:33

>>455
といことはspinnerで培養するとplasmidが落ちやすいということですか？

457 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/18 15:39

増殖している間に目的のタンパク質を発現しなくなった大腸菌が
優先して生えてくるようになる。

IPTG誘導性プロモーターの下流に繋げば？

458 ：454：04/02/18 15:50

>>457
tacプロモーターの下流につないで、IPTGで誘導をかけてます。
Spinnerで培養する時にそこから一部を取り、振とう培養したものでは
発現が見られているのでSpinnerと振とう培養の条件で異なるところが
影響していると思うのですが？

459 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/19 00:47

pUC18ってtacじゃなくってlacプロモータじゃなかったっけ？
まぁ、とりあえずT7プロモータも試してみるとか。
あと、IPTG誘導のタイミングと、その後の目的タンパク質の発現の時間変化はみておいた方がいいと思う。
前培養から本培養に入る（seeding)の時に、同時にIPTG誘導をかけはじめるとものすごく発現量が上がったことがあったので。

460 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/19 02:35

コンピテントセルってどこに保存されていますか？
一つしかない液体窒素容器には大事な細胞が入っているのでコンタミが怖くて入れてません．
メーカーさんに聞いたら-80℃だと1－2ヶ月くらいしかもたないかもって言われました．
皆さんコンピ専用の液体窒素容器をもっているんでしょうか？

461 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/19 02:46

-80℃で十分。効率下がったら作り直せば？

462 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/19 04:31

うちの子はそろそろ1歳だけど、まだ7乗ぐらいは出てると思う。

463 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/19 09:54

>>460
-80で十分。うちの電気な子は、一歳でも9乗オーバー余裕で出る。
メーカーさんって言ってるって事は、買ったか？
このスレでは自作がデフォルトだろ。何せ極めるスレだからなｗ

464 ：454：04/02/19 11:39

>>459
pUC18は確かにlacですが、目的のタンパクの前にtacを入れてます。
IPTG誘導のタイミングについてはスモールスケールで条件検討は行っています。
が、spinnerにスケールアップをすると発現しなくなるのです。
スケールアップする時の注意点等あれば教えてください。

465 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/19 11:52

>>464
スモールスケールからラージスケールに上げると
発現しなくなるのは比較的良くある話ですよ。
私も何度かはまった経験があります。

解決策は、出来るだけ条件をキープすること。
つまり、200 mlを 1 Lフラスコで振ってるとしたら、
1 Lを5 Lフラスコで振る、とか。数Lで良いのなら、
発現する条件である200 ml を並べて、数で稼ぐのも手です。

それで足りない量が欲しいなら、コンストラクトを変えるのが
最善だと思います。急がば回れ、です。ラージスケールで
発現しなくなる場合はエアレーションか何かの条件が異なる
為だと思われますが、基本的には道具立てを何か変えないと
解決しませんし、特効薬はありません。培養用具を変えたく
なければ、コンストラクトを変えるしかありません。

pET系につないでBL21系の株を使ってみてはどうですか？
一番信頼性があると思います。

466 ：454：04/02/19 17:22

>>465
貴重な意見ありがとうございました。
訳があってコンストラクトを変えれないので、もうすこし
条件検討を行ってみます。
やはりエアレーションが大きいのでしょうか？
菌は問題なく増殖してるのに。。。

467 ：460：04/02/19 22:55

>>461
-80℃で十分ですか．ありがとうございます．
>>462
意外にもつんですね．実際実験している人の意見は参考になります．
>>463
買いました.
今いるところは大腸菌の実験系がなくて自作する方が高くなりそうだったので．
マスタの頃はよく作ってたのでご勘弁を(^^;)

468 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/19 23:53

>>454
羽付き５L三角フラスコ最強！

469 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/20 00:34

エアレーションの問題だと考えるならば、坂口フラスコ、というのがあるから使ってみては？
http://images.google.com/images?hl=ja&ie=UTF-8&oe=utf-8&q=%E5%9D%82%E5%8F%A3%E3%83%95%E3%83%A9%E3%82%B9%E3%82%B3&sa=N&tab=wi
ただ、レシプロ（往復運動）の培養装置が必要で、沢山培養しようとするとそれなりの設備が必要ですが、エアレーションに関してはかなりイイです。
羽根付き5L三角フラスコでエアレーションが足りないと感じたときにはこれを使います。

あと、大量培養の時には、前培養→本培養へ持っていくシーディングのやりかたにも多少気をつけてみるといかがでしょうか？
前培養はあまり長くしない、とか、シーディングの前に培地を暖めておく、とか。（効くかどうかは知らんけど）
プレートのコロニーからいきなり培養したらうまくいく（つまりグリストにすると発現しなくなる）なんて言ってた同僚もいたな。
同じプラスミドが入っている同じ株の大腸菌なのに、いくつかのコロニーで比べると発現量に結構差が出る、なんてこともあった。

しかし、訳があってコンストラクトを変えられないとは大変ですな。
リークを抑える工夫をしてみる必要もあるかも知れないんだが。まぁ、がんばって。

470 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/20 18:13

大腸菌でタンパクを発現させようとしています。
精製にS･Tagを使おうとしているのですが、イマイチ評判がわかりません。
使った事がある人がいたら、何か情報を教えてください。

471 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/21 21:03

Colanic acidって日本語でなんて言うのですか？ライフサイエンス辞書に
載ってなかったです＿|￣|○

472 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/21 21:11

普通にGSTかHisタグかマルトース結合タンパク質にしとけ。>>470

473 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/22 16:28

Stagてカラムの溶出条件が厳しいんじゃなかったっけ？
フツーにGSTとかHISとかまるとーすにしといたほうがいいかと。

474 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/22 18:21

ビオチンTagはだめですか？

475 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/22 19:02

>>474

アビジンータグなんでは？

プロテインAタグというのを見たことが在る

476 ：470：04/02/23 10:45

返事が遅れてすみません。
>>472
Hisだと、他の奴も釣れてきちゃうので、もっと綺麗になりそうな奴を探していたのですが。

>>473
吸着させた後、トロンビンで切断して･･･って奴なので、簡単そうだったのですが。
一応、C末にHisもつける予定です。

477 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/02 17:05

質問です。
Novagenの大腸菌にHMS174(DE3)pLysSがあります。
これをpETで形質転換する時に、クロラムフェニコールはpLysSを
落さないために、アンピシリンはpETを落さないために、
入れるんだと思いますが、リファマイシンはなんのために、
入れるのでしょうか？

結果的には、リファマイシンを入れなくてもタンパク質は
発現したのですが、気持ち悪いです。
教えて下さい。

478 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/02 19:14

>471
コラニン酸。

479 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/03 13:38

>>477
recAをつぶすときにマーカーとしてrif使ったからじゃないの？
うちもコンピテント作るとき以外はBLR(DE3)pLysSにTet入れない。
というか、CmTetだとむちゃくちゃ育ちが悪い。

480 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/03 17:25

>479

ありがとう。スッキリしました！

481 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/04 02:44

>>454
　tac promoter を pUC に乗せるのは、きついよ。promoter 変えるのが無理なら、
ベクターを pBR に変えたらうまくいくんじゃないですか。
　あと、IPTG induction 前のリークをおさえるのに、培地に glucose を
入れる手があります。

>>447
　たとえ、recA/recE いれても、うまくいかないと思いますよ。homologous
recombination でゲノムに DNA を入れるには、それ用の大腸菌株を用いることが
必須です。そうでないと、入れた DNA が exonuclease (exoV) で分解されてしま
いますね。>>437 なんかが現実的な方法だと思う。

482 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/05 23:38

大腸菌に３種類のベクターを導入した人はいますか？２種類だとpUC+pACYCなんかを使いますよね？

483 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/07 13:10

>>482
それぞれ薬剤耐性が違うプラスミドなら、という話は
どこで見たんだっけ？
ベクタースレ？

484 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/07 23:02

菌体内で何種類のベクターまで共存可能なのか。しかも割と安定性よく。それが知りたいのです。

485 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/08 00:44

サンキュー、スキンヘッド。

486 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/10 10:50

共存のためにはオリを変えれば良いのではなかったか。
それを見分けるために耐性も変えなければならないが。。。。

487 ：教えてクン：04/03/10 17:47

そもそも何でoriが同じだとだめなの？

488 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/10 17:54

>>487
競合が起こる

489 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/11 01:30

oriが同じで競合が起こっても2種類抗生物質使えば一応
保持されると思うけど。
安定性は悪いので脱落者が多数出て育ちが悪そうだけど。

490 ：教えてクン：04/03/11 04:11

たびたびすんません。
競合って何に対してですか？

491 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/11 12:10

共存の相手に対して

492 ：教えてクン：04/03/13 01:21

つうことは複製のされやすさとか微妙な差で
不利な方が淘汰されるって考えてよいの？

493 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/13 01:25

勉強しろバカ

494 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/13 02:08

>>492
そういうこともあるけど、そうならないこともあるだろう。
ホントに知りたきゃ不和合性とかで具ぐれ．

495 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/15 14:17

お馬鹿な質問ですみません。
大腸菌はβ-glucosidaseを生産しているのでしょうか?

496 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/16 05:48

>>495
してない。遺伝子はあるけど。リプレッサーを壊さないと
出てこない。HNSが効いてるからひょっとしたら低温とか
浸透圧上げたりとかしたら出てくるかも。出てくるかどうかは
多分調べればわかると思う。

497 ：495：04/03/16 11:43

>>496
　ありがとうございました。
そういう情報はどこを調べれば載っているのでしょうか?

498 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/17 03:38

>>497
PubMedとかで論文読むしかない。
代謝系だったらKEGGがオススメ。
オーソログとかだったらMBGDがイイ。
bgl、hnsで調べろ。

499 ：495：04/03/18 12:55

ナルホド、どうもありがとうございました！

500 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/20 14:37

hage

501 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/21 15:45

極めた！

502 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/20 00:18

某サイトで推奨されてたMM○培地でpUC18(JM109)を培養したら、全く生えませんでした、なぜでしょうか？実際にはアンピシリンを入れて使いましたが・・・。お分かりの方ご教授よろしくお願いします。
MM○培地組成(全量1l)
bacto-tryptone 12.5g　bacto-yeast exract 25g、NaCl 8.5g、1MTris-HCl(pH7.2)
JM109
recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17(rK- mK+), e14- (mcrA-), supE44, relA1, Δ (lac-proAB)/F'[traD36, proAB+, lac Iq, lacZΔM15]
グリセロール4mlを800mlの水に溶かし、NaOHでpHを7.2に合わせ全量を1lに。

503 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/20 00:23

すみません、MM○培地の組成おかしいです。
ＭＭ○培地組成（全量1L)
bacto-tryptone 12.5g　bacto-yeast exract 25g、NaCl 8.5g、1M Tris-HCl(pH7.2)　Glycerol 4ml
NaOHでpHを7.2に合わせ全量を1lに。

504 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/20 00:31

アンピシリンストックを作り直す。

505 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/20 00:59

えらくrichな培地だな。1M Trisってのは行き過ぎの感じがするけど、ホントにこれで良いの？

506 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/20 01:39

行き過ぎのような気がしたけど、これでいいみたいです･･･。○洋紡のHPに載ってました。

507 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/20 02:35

1M TrisだったらそれだけでpH合いそうだし、NaOH入れるまでもないような。

1Mじゃないとおもう。Trisって毒性なかったっけ。

508 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/20 04:22

>>507

高濃度のTrisはF0F1 ATPaseを阻害しまつ。

509 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/20 07:51

trisなんて入れないだろ普通。naohだけでよくね？
グリセロールもいらん。

510 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/20 09:14

>>509 普通の培地じゃなくって菌濃度を稼ぐためのsuper richな培地なんだって。LBなんかで菌濃度が頭打ちになるのは、まずは培地のpHがシフトしてくるせいだって聞いたことがある。TBでもリン酸バッファー入れてるしね。
>>506 正解は、１Ｌあたり1M Tris-HCl(pH7.2)を20ml加えるでした。HPの記載が間違ってます。他の成分は培地１Ｌ当たりに加える量が書いてあるのに、Tris-Clのみ濃度表記なのはおかしいでしょ。

511 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/20 12:10

そういえばTrisでHClを使ってpHを調製して、最後にNaOHでまた調整するってまどろっこしいなぁって思ってました。
HPの表記が間違ってたんですね･･･。作り直してきます･･･。
皆さん情報ありがとうございました。

512 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/20 13:05

大腸菌の高密度培養で増殖が頭打ちになるのは「酢酸」の蓄積だと聞いた。培地の代謝により生じた酢酸自体が成長阻害物質となる。

酢酸を分解するような酵素など発現させればTBなどで極限まで増えるのではなかろうか？
まあリッチな培地ほどエアレーションを強くしないといけないのは
呼吸基質として酢酸を速やかに分解する必要があるからなのだと思う。

513 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/24 01:39

＞512
増殖が頭打ちになったcultureを遠心して菌体を除き、その古い培地に
フレッシュな菌をシードしたら普通に増殖を始めました。
ｐHなんかはかなり変わるようですが大きな影響もないみたい。
頭打ちになるのは阻害物質のせいではないと思うのですが、ホントは
どうなのでしょう？

514 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/24 03:04

growthがとまる理由っていくつもあるんじゃない．
菌密度とかｐHとか栄養とか．．．
その辺のからみ方ってどうなってるの？

515 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/24 11:53

>>513 普通に増殖ってことはさすがにないでしょ。増殖頭打ちと言う時点で既にODは10程度だろうから、10が11になっても増えたように見えないけど、0.1が１になるから普通に増えてるように見えるだけだと思うぞ。

516 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/24 11:55

>>511 TBとか2xYTとかrichな培地を使いたがる奴いるけど、何か意味あんの？LBでculture scale上げる方が楽じゃないか？

517 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/24 12:16

>>516
君はそうしてればいいんじゃない？
君の勝手です。

518 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/24 13:37

＞LBでculture scale上げる方が楽じゃないか？

明らかに楽じゃないだろＷ

519 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/24 13:45

>>517　意味無いって言ってんじゃなくて、意味を聞いてんだよ。

520 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/24 13:50

>>519

単純にTBはLBの二倍収量があるとするだろ。そしたら半分のスペースで
同じ量の菌体が採れる。
お前さんがタンパク屋じゃなくて、５０リッターで振ったことがないのなら
この意味は永久に判るまい。

それから、培地によってリコンビナントの収量が変わることは良くある。
だから最適なものを選ばなきゃいかんのだが、、、、それも判らない？

521 ：517：04/04/24 14:24

>>519
君が意味を知りたがっているのは推測できたが、
聞き方がなってないので、教えなかった。
520のような人間が出来た人がいてよかったな。

522 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/24 21:59

大腸菌の収得菌体量はDOの影響が１番大きいのではないでしょうか
ファーメンターを使うととんでもない量取れるでしょう。

523 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/24 23:20

>>520
５０ｌでしんとう培養するんか。すげーな。
世の中じゃそれが普通なのかな？
うちあたりじゃ、１０以上は振らずに通気培養しか
できないもので・・・

524 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/18 01:11

大腸菌が青と白のコロニーを作るのはなぜなのでしょうか？

青だけなら、ガラクトシダーゼが作られx-galが分解され青くなるのは分かります
白は、ガラクトシダーゼが作れなくなるため、x-galが分解されないので白いのですよね
簡潔にいうと

で、なぜ青と白のコロニーが同時に出現するのでしょうか？
普通、どっちかだけなのでは？

525 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/18 01:31

>>524
全部が全部ガラクトシダーゼを産生できるわけではないからです。
その中にはプラスミドが抜けているものや、ガラクトシダーゼ領域に
挿入・変異が入ったものもあることが予想できます。

もし、TF後のスクリーニングのことで聞いているのなら、
逆に、なぜ青白のコロニーを作らせる必要があるかを考えてみてください。

526 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/18 02:17

50㍑ってどうやって振るんですか？
元気だけは有り余っている学部生あたりが夜を徹して振るのかな。
きっと今晩も。

527 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/18 02:23

>>525
すみません、全部が全部なら
コロニーが白だけしかでないのもおかしいのでは？？
コロニーが青だけしかでないのもおかしいのでは？？

なぜ、lacz領域を制限酵素できって、ライゲーションにより勝ってにつながれた
場合では、青のコロニーができるのでしょうか？
laczのところに組換えしたら白になるけど、
制限酵素できって、その部分なくしてもガラクトシダーゼを産生するのでしょうか？

制限酵素できるだけでは、産生するけど
制限酵素できったところに挿入したら産生しなくなると理解してもいいのかな？
なぜだかはわからないけど

528 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/18 04:12

っていうかな、アルファコンプリメンテーションだろ？
だから挿入が少々入ったって白くならないの。
読み枠がずれないときれいな白にはならないでつ。

529 ：525：04/05/19 00:48

>コロニーが白だけしかでないのもおかしいのでは？？
>コロニーが青だけしかでないのもおかしいのでは？？
まず、詳細がよくわからないので、文意から読み取れないものもあることを断っておきます。
本当に100％青だけしかないですか？
私はcolony isolation後のpUC19を培養してspreadした場合、薄青のものや白が混じってお
りますよ。
白だけしかないものはLacZを合成する要素が元から無い場合では？
524では大腸菌としか書かれてありませんが、大腸菌がすべてlacZ遺伝子を持っている訳
ではありませんよ。

>なぜ、lacz領域を制限酵素できって、ライゲーションにより勝ってにつながれた
>場合では、青のコロニーができるのでしょうか？
>laczのところに組換えしたら白になるけど、
>制限酵素できって、その部分なくしてもガラクトシダーゼを産生するのでしょうか？
self ligationの事でしょうか？その場合は青コロニーが大半を占めるでしょう。
lacZを削ることによる呈色の有無は、削る部分によります。C末の数塩基なら色付き
が出るでしょう。
また528氏のおっしゃるように、plasmid上の遺伝子による相補などによって、染色体上
に中途半端な長さのlacZしか存在しない場合でも青コロニーの表現型となることができます。

>制限酵素できるだけでは、産生するけど
>制限酵素できったところに挿入したら産生しなくなると理解してもいいのかな？
>なぜだかはわからないけど
遺伝子の挿入によって転写がSTOPしたり、フレームシフトによってそれ以降のアミノ酸が変わる
ことで、そのタンパクが正常に機能しなくなります。今回の場合を例にすると、青色を呈しません。
525で書きましたが、この現象を利用して挿入断片の有無を色で識別するというスクリーニング法
が常套手段として利用されております。

530 ：525：04/05/19 00:52

訂正
旧）私はcolony isolation後のpUC19を培養してspreadした場合、
　　　　　　　　　　　　↓
新）私はプラスミドpUC19を保持する大腸菌DH5αの青いコロニーひとつだけとって培養して
　　寒天平板培地に広げてコロニーを確認した場合、

531 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/19 03:43

コロニーって青色と白色しかないのでしょうか？？

どっかのサイトで、赤とか緑とか自在にできたら特許だけで儲かるとかかいてたような気がしたので

532 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/19 07:43

コロニー移し変えるときに何使っている？
なんか製品番号とかあったら教えて？

533 ：531：04/05/19 22:14

help!!

534 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/19 22:44

コンピテントセル作りについて教えてください。
Ampのベクターを持ったままコンピテントセルにしたいんですが、
その場合、Amp加えたSOB培地で培養を始めれば良いんでしょうか？

535 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/19 22:50

Correct！Ampはlog phase中に分解されてしまい、その後plasmidを落とす間も無く増えてくれる。

536 ：534：04/05/20 09:31

535さんありがとうございます。
さっそくやってみます。

537 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/25 15:14

カタラーゼって、ケン気培養したら産生されてないのか？

538 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/25 16:24

てst

539 ：ぺー：04/06/01 01:17

defencinのような抗菌ペプチドの発現プラスミドを大腸菌で増やそうとすると
大腸菌は死にますか？プロモーターはＣＭＶです。

540 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/02 00:23

>>90
EtBrでなくてよかった。
うちの副手(院生）はかっこつけて
Etbrをピペットですうのに口でやった。
調子に乗ってたら口に含んでしまったようだ。
まったく。教授と違って経験浅いんだから、無理するなよ。
という私は学部生ですが。

541 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/03 01:40

みんながんばってたな。
面白かったです。ありがと

542 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/03 17:03

>>539
つ…　釣ってる？

543 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/03 20:51

>>541

えっと、大腸菌研究会の参加者の方ぽいですね。

同じく楽しかったです。

来年は100人くらい集まるといいですね。

544 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/08 16:00

pETベクターとOrigamiの組み合わせでアルドケトリダクターゼファミリーのタンパク質
発現させてるんですが、活性測定系は出来上がってるので測ってみると、IPTGで誘導
かけたサンプルよりかけていないサンプルのほうが活性が高いという謎の現象が起こっ
てしまいました(再現性あり)。
誘導かけると目的タンパク質が沈殿側に90%以上出ているという状況なので、漏れて
発現してる位の発現レベルでないとfoldingが上手くいかないようなタンパクなのか
なと思ってるのですが、こういうことってよくあるのでしょうか。

後googleにキャッシュが残ってた過去スレを漁ってたら、封入体を作らせない方法
として「TBでゆっくり発現させる」という方法が書かれてたんですが、断片的記述
だったので、TBで培養して誘導をかける、ということなのか、それとも培養して誘
導かけずに漏れてくるものを回収する、という意味なのかいまいちはっきりしませ
んでした。どっちの意味なのかご存知の方がいらっしゃったら教えてください。

545 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/09 08:52

ケトリダクターゼだったらorigamiはよくないんじゃないの？
活性部位は還元型システインの予感

と脊髄反射でレスしてみる。

546 ：544：04/06/10 08:21

>545さんのご指摘を受け早速手元にあったTunerにプラスミド入れて培養し
cellを破砕したら破砕液の色が全然違っていました。Origamiだとミルクの
ように白いのがTunerだと黄色味がかってる感じ。
しかし、TunerでもIPTGかけたときよりかけなかったときのほうが活性が高い
のは相変わらず。でもOrigamiよりは活性高いことが分かったのでTunerに
切り替えて大量培養してみたいと思います。

547 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/10 10:39

>>546
寝ずに実験したんですか？
それとも海外？

548 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/10 20:20

質問です。
ある人工タンパク質をBL21(DE3)pLysSで発現を試みました。
OD=0.6でIPTG0.4mM加え、25度で６時間シェイクしました。
そしたらOD=0.16まで減少し、菌が沈んでいる様子もなく、
菌が溶けてしまったかのようです。
コントロールとして、IPTG添加無しも同一条件で培養しました。
こちらは0D=1.0まで増加しています。
このような経験をなさった人、いますかね？

549 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/10 20:54

>>548

LysSはリゾチームを細胞質で発現していること示す。
人工タンパク質が大腸菌の細胞膜に穴を開けたり、
toxityがある場合、リゾチームがペリプラズムに出て
すみやかに細胞を壊します。

pLysSを持たない大腸菌で実験しましょう。

550 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/10 20:54

OD0.4になったと同時に37℃に昇温設定し、37℃になった時点でＩＰＴＧ添加。
添加後1時間から時間を振って回収してみそ。

551 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/10 22:23

金が溶けちゃうことなんて結構あるだろう？
SOSが動いて解けることあるんだからさ。
そういう時は定常期に入ってから誘導かけると
うまくいくことがたまにあったな。
他にはプレカルチャを3倍くらいに薄めてから誘導かけるとか。

552 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/11 00:09

>>548
ところで人工タンパク質って何ね？

553 ：544：04/06/11 01:22

>547
んなまさか。手抜きです。プレート蒔き→コロニー選択→全培養→本培養
と行かないで、ストックされてたコンピテント済み細胞にplasmid入れたら直接
本培養(つっても20ml位)に行きました。一応一部はプレートに蒔きましたし、
培養して菌が増えてきたらplasmidとってPCRできちんとものが入ってるのを
確認しました。

ちなみにTunerでとってきたサンプルの活性測定は、測定系を同室の人に
占領されてしまったので明日以降にずれ込み。冒険して時間短縮図った
意味なーし(苦笑)。

554 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/11 01:23

>>548
あるよ。うちの場合、誘導後30分で溶菌しちゃったみたいだけど。
何時間目ぐらいから減ってくるのかもっとよく観察してみよう。
0、30min、1、2、4、6 hのサンプルをとってOD測ったり発現チェック
したり、減りはじめる前に回収したり、IPTG減らしたり、色々やってみてくれ。

>>559にあるようにpLysSを抜いてみるのもいいかも。
抜いてあれば合成系が漏れるので、お漏らしさせつつ一晩培養。
de novoでデザインしたペプチドってたいてい疎水性が高いので
インクルージョンボデーがたんまりとできるはず。
そいつを精製する、という手もあるですよ。

555 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/11 09:41

これは>>559が見物だなｗ

556 ：554：04/06/11 09:47

おお！自分でgetしたりして>>559

557 ：548：04/06/11 16:03

皆様いろいろ情報ありがとうございました。
大変参考になりました。

558 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/11 20:24

>>557

>>554で説明しているpLysが無い大腸菌だと、漏れるというのは、DE3領域に存在する
tacプロモーター下流のT7RNAポリメラーゼがIPTG非存在下でも微量に
発現しているのをリゾチームが結合して押さえる働きをするから。

559 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/12 01:15

pETベクターでIFN-Bを発現してるのですが、コンピはBL21(DE3)STAR,プラスミドのコンストラクトもシークエンス済みなのですが、
いくら発現チェックしてもバンドが出ません。プレカルチャー後の本培養もIPTG添加群では白い凝集塊のようなものが出来、菌の発育が悪いです。
誘導条件は37℃で行っています。IPTG濃度は0.6mMで、plysSも試しましたが、駄目でした。どなたか良きアドバイスをお願いします。

560 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/12 17:13

pGEXとかpMal、pQEとかprotein A融合とか、チオレドキシン融合とか
いろいろためしてみそ。

561 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/19 18:51

死ぬほど遅レスですが。

>63
>ところで、終止コドンって、なんでamber(UAG),Ochre(UAA),Opal(UGA)って
>呼ぶのでしょうか?

最初に見つかった終止コドン(UAG)の発見者がハリス・バーンスタインという学生だったのですが、
ドイツ語のBernsteinは琥珀の意味なのでその洒落からamberになったとの由。で、色の連想から
ochre(黄土色)、宝石の連想からopal(蛋白石)と命名されたようです。

562 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/28 17:26

大腸菌取り扱い初心者です。
大腸菌のブルー・ホワイトセレクションで、白色コロニーからプラスミドDNAを回収したが
べクターにDNA断片が入っていませんでした。
また、別の薄青色コロニーからプラスミドを回収したところ、DNA断片が挿入されてました。
なぜ、そのような事がおこるのでしょうか。
どなたかご助言下さい。

563 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/28 17:43

１．frameがずれた。
２．挿入断片がちょうど３の倍数の残基数だったので、frameがあった。

564 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/28 17:57

書き込みありがとうございます。
本当に初心者なので、もう少し詳しく解説をしていただけると嬉しいのですが…。
宜しくお願いします。

565 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/28 20:23

>>563の解説が理解できるくらいには勉強しなさい

566 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/28 20:24

と書くだけなのもアレなんで、何故青白でセレクションがかけられるかを調べなよ

567 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/28 20:54

ブルー・ホワイトセレクションの原理については調べています。

lacZ遺伝子の中に増幅したいDNAがライゲーションされると、転写が抑制されたり、
正常なlacZタンパク質が発現しないために、β-galactosidaseが正常に発現できないため、
X-Galは分解せず、白いコロニーとなる。
ベクターにDNA断片の挿入されていないプラスミドの形質転換株は、IPTGにより
β-galactosidaseが発現するため、X-Galが分解して青いコロニーとなる。

という原理だと理解しています。
>>562 の内容について、文献やネットで調べているのですが『正しい読み枠の維持が重要である』
『短いDNA断片をクローニングしたベクターを持つ大腸菌では、うすい青色を呈する場合もある』
との記述があるところまでは既に調べていました。
しかし、理解力不足のため、読み枠や断片の短さがどのように関与していくのかが分かりません。

どうぞご助言下さい。

568 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/28 21:04

そこまで理解しているんだったら答えはもう分かったも同然じゃないか。

569 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/28 21:07

正常なlacZタンパク質が発現しないために、β-galactosidaseが正常に発現できないため、 X-Galは分解せず、白いコロニーとなる。
『正しい読み枠の維持が重要である』
『短いDNA断片をクローニングしたベクターを持つ大腸菌では、うすい青色を呈する場合もある』

このあたりがポイントかな。
断片が短くてフレームがあってると、正常ではないにしろβ-galactosidaseの機能を果たしちゃうわけだ

570 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/29 08:44

>>563 『１．frameがずれた。』ですが、
フレームがずれる現象はどの程度の頻度で起こるのでしょうか？

薄青色コロニーからプラスミドを回収したところ、DNA断片が挿入されていた理由については
『正常ではないにしろβ-galactosidaseの機能を果たしちゃう』という内容で
なんとなく理解できました。

白色コロニーからプラスミドDNAを回収したがべクターにDNA断片が入っていない理由は
まだ理解しきれていません。
宜しくお願いします。

571 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/29 09:44

まずボスか先輩に聞くのが筋ではなかろうか

572 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/29 10:34

それ以前だよ、教科書を読め。
まずは高校生物の遺伝子のところで、
遺伝暗号の仕組みを理解し直せ。

トリプレット、コドン、
の意味を理解できたら、
あとは予想できるはず。

573 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/29 12:15

自分で調べたことはいいとして、そこまで答えがでていながら理解ができないってのは
やばいぞ！　ちゃんと頭を使ってるか？

574 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/29 19:24

転写なんか抑制しねぇよ。
それに、α-complementationに言及しなきゃ、
満点はやれねぇな。
受験で覚えた知識はその程度でしょう。ぷっ。

575 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/29 19:38

α-complementationって何ですか？

576 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/29 19:42

大腸菌のまんこくせーよ

577 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/29 19:50

DB3.1ってどこがええの？
そこがわからんけどお金があったから買って使ってる。

578 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/30 00:59

F'が落ちてるから挿入なくても白。F'ありでフレームが合う、挿入断片が短い奴が青。
正しい菌を取り直せば解決。
↑Lacの相方がChromosomeじゃなくてF'に乗ってる場合ね。

579 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/02 20:09

>>575
β-ガラクトシダーゼの分子量は100kDa、
遺伝子(lacZ)は3075bpもあるわけ。
あれれ? pUC18よりも大きいじゃん。
つまりpUC18などベクターに入っているのは、
lacZのほんの一部でしかないわけ。
あとは自分で調べなしゃい。

580 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/02 22:11

>>577
門道でしょ。　…と釣られてみるテスト。

581 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/05 08:56

大腸菌DH5αのαだぁぁぁっ！
αサブユニットだけpUCに入っております

582 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/06 17:10

手っ取り早い発現の条件の至適化の検討方法ってありますか？
簡単な流れ教えていただけると助かるのですが・・・

583 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/06 17:25

ない

584 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/08 18:19

Col E1 = コリシンE1(大腸菌で作られるバクテリオシン)
ちょっとググってみたら、コリシンE5の研究がされてました。
ttp://wwwsoc.nii.ac.jp/rnaj/poster/p-33.html

585 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/08 23:39

ある機能未知遺伝子をBL21（DE3)で発現させる予定なんだけど、
組換えプラスミドを一度JM109に入れて、そいつからプラ抽して
あらためてBL21に入れるという方法がよいと先輩から教わりました。
こういう２段階を踏む方法ってのは一般的なんでしょか？
いきなりBL21に入れるのは邪道？

それと今、自作のJM109コンピにエレポでｐETプラスミド入れようと試みてるんだけど、
菌が全然生えてきません。インサートなしの空ベクターはちゃんと生えてきて、
形質転換効率自体は悪くないはずなんですが・・・。

エレポで入れる前に組換えプラスミドがちゃんと作成できたかどうかを泳動で確認したいと思うんですが、
確認できるだけのスケールで制限消化、Ligationをやる際のポイントというかアドバイスをお願いします。
以下に示したような現在のプロトコル通りの方法だとスケールが小さくて確認できないんですよ。

【各ステップの条件など】
プラスミド：pET21a,d
制限酵素：NdeI－XhoI、NcoI-XhoIなど（DNA5+10xbuf.5+制限酵素1ずつ,Total50)→37℃、Overnight
Ligation：（Plasmid1+Insert4+Takara Ligation Kit　I液5）→16℃、30min
エレポ：コンピ40+Plasimid3

また、各段階において形質転換効率を下げない工夫等もあればお願いします。

586 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/08 23:45

>>585
プラ抽ってなんですか？エレポはさすがに分かるけど。
こういう場では汎用的な言葉を使ってくださいね。

587 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/08 23:48

BL21は形質転換効率が恐ろしく悪い。
BL21は内在性DNase活性が強いのでプラスミド抽出してもあまりqualityの高いプラスミドが取れない。

588 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/08 23:55

ligationはovernightでやってみる。
形質転換前にプラスミドができたのかどうか確認する香具師はいない。
コロニーが生えてきてからmini.prep.するかコロニPCRで確認しろ。

589 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/08 23:57

>>586
プラスミド抽出の略です。汎用的な言葉だとおもってたんですが・・・申し訳ない。

>>587
なるほど。ありがとうございます。

590 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/09 00:00

>>588
やっぱ生えてこないことにはお話にならないんですね。
Overnightでやってみます。どもです。

591 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/09 00:05

>>589

汎用的な言葉な訳ないだろ？論文にもそう書くのか？
略語とかローカルな言葉使いはやめてくれ。普通に。

それはともかく、BL21はレコンビネーションとか起こりやすいから
プラスミドとかの維持はJM109とかでやること多いよ。
俺もそれをお勧めする。

592 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/09 00:25

Ligationについて
当ラボでは、TOYOBOのLigation highを使用しています。
マニュアルには16℃、30minと書かれていますが、だいたい3-4h反応させて
成功しています。Overnightに関しては、業者もやめたほうがいいという
場合もあるので、（でも友人はその系でやって成功しているけれども）
微妙にお奨めしません。
Ligation後にくっついてるか確認できたらいいですよね、ほんと。
あと、形質転換効率の概算と単位は付けた方がいいと思います。(μgとUは特に)

593 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/09 02:39

アドバイスどうもありがとう。
うまくいったらまた報告したいと思います。（｀Д´）ゞ

594 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/09 03:55

プラ厨なんて言葉見たことも聞いたこともないけど、
あの文脈で意味わからなかったら池沼。

>585
ところでコンピにエレポするのって普通なの？
普通は、まともな菌にエレポするか、
コンピにトラホメするもんだと思っていたけど。

595 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/09 09:38

>>585 エレクトロポレーションの時にそんなにライゲーション反応物を入れると、火花散りませんか？うちじゃ脱塩してからエレポにかけてますけど。

596 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/09 10:38

５９１は何様ですね。

597 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/10 00:16

ここのタンパク質高発現技術ってどうなの？
ためした人いる？
&150;ttp://www.bioleaders.co.kr/

598 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/10 00:30

まちがえた(;_;)
http://www.bioleaders.co.kr/start/japanese/product/product-02-01_30525.htm

599 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/10 00:58

>>595
うん、エタチンするよね。

600 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/10 01:27

>>594
まともな菌ってなんですか？
エレポといえば対数増殖期の菌体を洗菌したコンピテントセルしか
うちのラボでは使ってませんけどねぇ。（ライブラリとかには市販のコンピを）

>>595
火花は今の所散らないですね。
まだエタ沈熟練度も乏しくて、収率downを恐れて
なるべく少ないステップでやれればなぁと思ってるんで・・・。

601 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/10 19:14

エタ沈って、習熟度とかいう技法でもない気が・・
菌にエレポとコンピにトラホメの違いはイマイチ分かりにくいですね。

602 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/10 20:54

プラスミドのサイズが１０kbを超えると、化学法によるコンピテントセル
の形質転換効率は急激に下がる。したがって大きなサイズのプラスミドはエレクトロポレーションを勧める。

603 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/11 02:09

>600
すまぬ漏れの勘違い。
ずっとカルシウムとかで化学処理したやつだけをコンピと呼んでた＿|￣|○
ケミカルコンピとかエレクトロコンピとか言うんだね…

今まで、大腸菌以外にむりやり入れるときぐらいしかエレポは使ってなかったけど、
大腸菌では10kb越えてても化学法で一応なんとかなってたよ。(たまたまかもしれんが)

604 ：age：04/08/11 18:35

指導者なしでゼロから初めて１年の、組換えタンパク生産初心者です。
発現させたタンパクが培養条件を変えてみても沈殿画分に入ってしまうので、
尿素やグアニジンで溶かして透析などをやってみましたが、
どうしてもバッファーに溶けるものがとれません。
これまでに試したベクターはpGEX, pQE, pMAL です。
ちなみに目的タンパクはS-S結合が４個あります。
最近、やっと気づいたのですが、人工シャペロン（TAPS, CD, CA）、
Origami株、ペリペラズムへ輸送、チオレドキシン融合など、
S-S結合を改善させる方法があるのですね。
もっと早く気がつきたかった。

さて、そこで質問なのですが、どの方法がお勧めでしょうか？
すぐに実験可能なのは人工シャペロンですが、
手順として巻き戻しがないほうがいいですし。

605 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/12 04:30

当方、タンパク生産未経験者です。
↓こちらのスレを活用するのがいいと思います>>604
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1039524190/

初心者なら、ポジコンも同時に実験するのがいいと思います。

606 ：sage：04/08/12 17:02

アドバイスありがとうございます、６０４です。
そうですね。リフォールディングはタンパク精製のほうですね、行ってみます。
大腸菌関連だと、S-S結合を再生しやすいのは、
AD4944（trxB欠損）
Origami（trxB/gor欠損）
Rosetta-gami（trxB/gor欠損と使用頻度が少ないコドンに対応）
というのがあるんだそうですが、どれがいいかは当然タンパクごとに違うんでしょうね。
発現はばっちりしてるからコドンの使用頻度はとりあえずおいといて・・・
あ、すみません、自己完結しちゃってます。

ポジコンはできるものはしっかりやってますが、
一時にたくさんの条件検討をしたときほど、忘れたりするのが困りものです。

607 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/12 23:20

Rosetta-gami B が最強とは言うけれど。
ソニケーション時のpHも変えた？

608 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/13 02:16

目的タンパクがアルカリ側で不安定なので、
ソニケーション時のpH、酸側に振ってみましたが、違いはありませんでした。
でも、考えてみればアルカリ側ですぐに壊れるとは限らないですね。
今度、アルカリ側にも振ってやってます。ありがとうございます。

609 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/14 17:00

TOP10使って12kbほどのプラスミドをトランスフェクトさせています.
colonyをＰＣＲで確認してその後miniprepしてREで確認しているのですが
その際どういうREで切っても2kb弱のproductがみられます。これって何のコンタミ
でしょうか。（pUCを使ってます。）

610 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/15 12:21

1) RE buffer に2kb断片がある。
2) Loading bufferに2kb断片がある。
3) 幻

611 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/15 14:46

612 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/16 05:45

地図書け、話はそれからだ。

613 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/16 09:26

>>609
×トランスフェクト
○トランスフォーム

2kb
１）元の12kbが大腸菌内でおかしな組換えを起こした
２）アルカリ法でアルカリに置き過ぎて変性したままのDNA
３）ssDNA

614 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/16 11:37

要するにpartialな２ｋｂの断片が入ったのです。秋涼。

615 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/16 15:59

丁寧な構築図を示してくれないと、どうしようもないなｗ

616 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/18 21:25

基本的なことを聞かせてください。
novagen社のBL21とBL21(DE3)の違いについてですが、
BL21(DE3)がバクテリオファージDE3の溶原菌であるってことは
わかってるんですが、BL21の場合はIPTGの誘導のときに
大腸菌ゲノム由来のT7RNAポリメラーゼを活性化させているってことでしょうか？
その場合、DE3溶原菌にしたメリットってなんですか？

617 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/18 23:02

>>616 なんか壮大な勘違いをしている気がする。
T7ってのはバクテリオファージの名前だ。ファー
ジのRNAポリメラーゼが大腸菌ゲノムにあるわけは
ないだろ。DE3ってのはλファージにT7 RNAポリメ
ラーゼをクローニングしたもんだから、DE3溶原菌
じゃないBL21ではT7プロモーターからの発現は起
こらない。

618 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/19 00:55

はぁ・・。

619 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/19 02:58

617さんありがとうございました。
よく考えればわかるのに・・・
お手数かけました。

620 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/06 21:34

質問させてください。
ある遺伝子をpUC19にいれて大腸菌(JM109)で発現させようとしたところ、
まったく発現しません。
37℃で培養し、IPTGで誘導後、温度を20℃にして培養しても同じでした。
こういったことはよくあることなのでしょうか？
またその原因はなんなのでしょうか？
また解決法もあれば教えてください。

621 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/06 22:00

westernとかで見えないってこと？

622 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/06 22:03

いえ。SDS-PAGEでバンドが見えません。
発現してれば該当する場所にバンドが見えるはずですよね。
精製なんてしなくても、菌つぶして流せば。
それが見えません。

623 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/06 23:30

シークエンスは確認しましたか？

624 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/06 23:31

ざっと思いつくところ

・フレームがずれている
・配列が大腸菌向けじゃない（マイナーコドンが多い）
・目的物が銀でも熊Ｃでもうまく染まらない
・配列が短くてあっという間に分解

うちは3番目のケースだった。

625 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/07 19:23

pUC19で発現ねぇ・・・
ふつう発現ベクター使ってやるけど。

626 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/07 19:33

620です。
アドバイスありがとうございます。
シーケンスは確認しました。
別の実験で銀染色で染まるのは確認済みです。
熊氏ーはわかりませんが・・・
配列の長さも関係するんですか？
あとコドンの使用頻度も関係あるんですね。
どこ見れば載ってますか？
質問ばっかですんまそん。。。
次は一応コールドショックベクター使ってみるつもりです。
評判はどうなんですかね～

627 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/07 22:02

タグ付でやれ。

628 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/08 02:27

JM109は発現に適しているのか？

629 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/09 04:07

pUC19ってpUC18の逆むきに入れなきゃいけないんだっけ。
なんでそんなんつかうの？

630 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/09 14:08

融合タンパクにしたほうがコントロールがわかりやすくていいんじゃない？

631 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/09 22:13

なんかｲｲｶﾝｼﾞ･･･

632 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/10 17:06:04

それほど高レベルではないが学術的。
最近の糞スレ・糞レスにうんざりしてたから新鮮だ。

633 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/11 12:55:11

みなさんコンピは自作してますか？
ケミカル（塩化ルビ死有無法）だと
10の6乗コロニー/1 ug pUC118位しか行かない私は
下手くそなんでしょうか？そうなんでしょうね・・・
ケミカル、エレクトロポレイションとも、
自作だとどれくらいのタイターが出るのでしょう？
みなさんの自己ベストとアベレージを教えて下さい。

634 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/11 23:55:34

電気で、10^10 cfu/ug pBSII を少し切るくらい。

635 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/12 02:28:25

コンピを作るのに下手とかないだろう．
演歌ルビ時有無だったら気をつけるのは
ODくらい．
つうか国仲涼子かわいすぎ．

636 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/12 10:44:03

コンピ作るときのコツは、途中の操作を冷やしつづけること。低温室で全
ての操作をするとか、チューブの懸濁液の触れる部分を手で暖めないよう
にするとかに気をつける。
塩化ルビジウム法（Hanahan法）よりInoue法の方が安定して効率の良いも
のができるよ。方法はMolecular Cloningを参照。

637 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/13 15:31:49

漏れの場合、やたらタイターが低いと思ってたらプラスミドの入れすぎでタイターが頭打ちに
なっていただけだった。1/10、1/100とプラスミドの量振ってみたらちゃんと10^8台出ていると
判明。

638 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/14 03:15:14

蒔く時に薄めないといけないからタイターチェックは
pgしか入れてないけど...

639 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/23 16:57:04

1×10の6乗の細胞数って、大腸菌で考えたら何mg/mlなんですか？

640 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/24 10:48:36

細胞数を濃度で表すなんてちょっと俺には無理だが、
重さであらわすならドライウェイトで
３×１０＾－７ｇくらい。

641 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/25 14:51:58

>>636
冷やすことは当たり前ですよね。
それよりも短時間で処理してコンビ作ることのほうが大事と思われ。

>>639
かつてこのスレは良スレだった気がしますが、
あなたの様なシトがダメにしてるにょろ。

意味不明な質問はヤメて下さい。

642 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/26 01:48:24

形質転換の効率って普通はカウントするものなんですか？
生えてくりゃいいや～と思ってたんですが、それじゃダメ？

643 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/26 04:20:14

そりゃぁ、生えてくればいいのですが…。

生えてくる数の見当や、
生えてこなかったときなどのために、
コンピテントセルつくったら形質転換効率確認するのは常識。

644 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/26 04:55:12

月1くらいでコンピ作っている
俺はカウントしないけどね。（まとめて作れって？）
特に難しくないコンストラクションの時は
７乗もあれば十分っしょ。
つうかcfuよりLigation時のDNAの濃さが何より大事って
思うんだが。

645 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/26 09:43:04

>>641
「極める」スレなのに、大腸菌の重さも知らねえのかよｗ

646 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/26 10:05:21

>>465
細胞数：示量性状態量
mg/ml：示強性状態量
どうやって細胞数をmg/mlで表記できるってんだ？

647 ：641：04/09/26 12:12:46

>>639、>>645
たぶん、
自分で質問しておきながら、その質問の意味が、
ぜんぜん理解出来ていないんだと思うのですが…、

>>646さんの言ってくださってることは、
細胞数が1つでも、100億でも、mg/mlは変わらないってこと。
ちなみに、大腸菌が何mg/mlかって言われたら、
培養液中にしばらく置いていたら沈殿してくることからして、
たぶん、1mg/ml強なんじゃないんすか？

648 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/29 19:31:01

>>639
質問と罵声から判断して(藁)
「細胞数1×10＾6とは、何mg程度なのか?」
ということでしょうか？？

大腸菌で考えたら、Wet Volumeで10mg程度なのかなぁ・・・。
細胞数と質量の関係は考えたこと無いから良く分からない
ヽ(´Д｀)人(´Д｀)人(´Д｀)人(´Д｀)ﾉ

649 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/29 22:40:02

大腸菌の細胞融合とその再生法について詳しく書かれたプロトコールはありますか？
グラム陽性菌についてはよくみかけるんですけれど。

650 ：274：04/10/02 07:49:16

枯草菌はたまにあるけどね。大腸菌は確かに耳にしないな。

651 ：起原切れ助手：04/10/02 17:00:55

>>647
大腸菌一匹の重さと体積って知られていないのですか？

652 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 15:41:23

今日、E.coliが目に入った。
で、赤くなった。

対処法は？
やっぱ病院かな。。。

653 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/23 13:23:00

涙にはリゾチーム入ってるからほっといても殺菌してくれるんじゃねの？実験に使用する
大腸菌なんて実験室の外じゃ生きていけない類の株だろうし。

654 ：？？：04/10/23 14:56:44

質問させてください。簡単な質問かもしれませんが、初心者なので、許してください。
大腸菌の培養で使うLB培地にYeast extract、Triptone peptone、を入れるのは
それぞれビタミン源とかアミノ酸源だと思うのですが、NaClは何故入れるのでしょうか？
また、LB培地の炭素源はYeast extractですか？

655 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/23 15:31:22

その手の質問は普通に実験書を読めば？
そういうのを読んでもふに落ちない点をここで聞くのが宜しい。

656 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 00:49:49

普通はLBにグルコース追加しないみたいだね。
塩は浸透圧の調製とかそこらへんじゃないの。あと、
tryptoneじゃなかったっけ。

657 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/07 11:26:07

クロラムフェニコール入れた後ってODの上昇は止まるの？

658 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/07 11:43:31

>651 Molecular Cloning にもNEB のカタログにも出てるよ。

659 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/07 16:52:34

>>654

大腸菌のアミノ酸吸収にはNa+共輸送系を利用することが多い。
NaClを培地にいれ忘れても増殖することはするが、10g/literは
入れておいた方が良い。

660 ：Ｊａｚｚ：04/11/07 18:56:03

ホタテごはんもらったんですが、冷凍だったのですが、
かなり長期間冷凍した感じで、2階の人に解凍してもらったんですけど、
かなりアツアツに暖めてもらって食べたんですけど、
そのときは食べられたんですけど、食べ残して放置してたら
3時間でやばいにおいになりました。腐ってました。3時間前は
食べられたんですが、ﾅﾝﾃﾞ？。

661 ：Ｊａｚｚ：04/11/07 18:57:21

他の掲示板ﾆ書いたら頭が悪いとか言われたので書きました
なんで３時間でくさるんですか、涼しいのに。

662 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/07 21:14:38

てｓｔ

663 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/07 22:08:59

なんで腐ってるってわかったんだ？
オマイの鼻が悪いだけじゃないのか？

664 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/08 00:30:30

ゲノム断片をライゲーションさせたコスミドをファージに感染させて
プレートで培養させる時のコツってありますか？
溶菌させるパターンではなくて、コロニー生やすタイプのkit使ってる
んですけど全然生えてくれません。5個とか。むきゅぅ～
数百個欲しいんです。

ライゲーションできてないのかなぁ。。

665 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/08 01:02:41

lination前の断片のサイズが合ってることを確認してる？
コスは35-45kbのものしか取れないはずだから、小さい断片が
混じってたりすると、小さいのばかりligationされてしまい、
目的のものが取れない時があるよ。ちゃんとサイズ分画して
ゲル回収してるよね？
それと、断片とベクターの濃度比も重要。
俺はゲノムライブラリー作製したことあるけど、問題なく100万個近くの
コロニーが取れたよ。
ちなみにSuperCos1ベクターだけど。

666 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/08 01:43:31

>>661
部屋が汚いからすぐに腐るんでしょう
それかもとから汚染されていたとか
2階の人がケツを拭いた手で調理したとか

667 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/25 17:16:28

おなかがいたい時などに数をふやしそうな軽く悪玉っぽい菌ってなんですかね？
サルモネラですかね？

668 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/25 17:38:32

>>661
海洋性のVibrio なんて、ダブリングタイムが15分くらいなので、
新鮮でないとやばいよ。３時間経てば、２＾１２程度には増えてる
ってこと。約４０００培。これだけの菌がタンパク質を分解すれば、
窒素、イオウ化合物が出て、いやなにおいもするかもしれない。
一度、電子レンジで完全に滅菌すれば良いのだけど、それだと、
風味も無くなるし、とにかく早く喰うしかないね。

669 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/10 18:23:33

ヒートショックの前に氷で冷やすけど、プロトコールでは
大抵30分になっていますね。
これって10分くらいでも十分な気がするんですけど皆さんどうしてますか

670 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/10 19:12:45

手で握って、溶けかけたら即DNA入れる。
氷上で１分即ヒートショック。氷上で１分。
撒く。

671 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/10 21:44:48

>>670
それでやるとどのくらい効率が落ちる？
比較したことある？

672 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/11 00:30:22

>669
10分で十分だと思います。私はいつも10分です。。。
ちゃんと比較したことはないけど、そんなに効率もおちないし。

673 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/11 00:53:06

>>671
うちのラボのコンピで10e7 cfu/ugは余裕で行く。十分だろ。

674 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/11 01:08:02

最近、クローニングが急にできなくなりました。pRL124をつかって転写fusionを作りたいのですが・・・
原因であげられることを教えて下さいm(__)m

675 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/11 01:50:53

>>670
早いな～
コンピテンとセル何使ってるの？

676 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/15 13:19:18

>>669
DNA入れた後に時間置くのは、
細胞膜表面にDNAを吸着させるため。
たくさんDNA入れたら1分でいいかも…
でも、しばらく置いてたほうが効率あがるかも…

677 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 01:27:49

白コロニーばっか，ばんざい，って思ってコロピーしたら
スカばっかでがっくりって経験ありません？最近その
パターンがやけに多いんですが・・・．

678 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 03:45:53

>>677
どういうスカかということにもよるけど。
うちの場合はBamHIのスター活性でAGATCCで切れたやつが結構大量にとれる。

679 ：677：05/01/16 10:22:05

EcoRVとかで切って，ブラントでライゲーション，トランスフォーム
したら，インサートなしばっか，っていうスカ．ためしにスカシー
ケンスしたら，まごうことなきスカ・・・．

680 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 13:52:33

CIAPが十分除かれていないんじゃないの？PhOH抽出の前にEDTA加えてる？

681 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 15:54:52

ここで言いたいのは、白：青＝１００：１ぐらいで生えて、
いいじゃん！って白ピックアップしたらスカッとスカばっか、
て言うようなことでして。
ちなみにBAP使ってますが、フェノール３回くらい振ってます。強い
酵素らしいので。

682 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 17:03:12

いやさ、白なのにインサートが入ってないってことは、EcoRVが再生する
ようにきれいに戻ってるわけじゃないってことでしょ。これって、ちゃん
としたライゲーションができない（残存してるBAPでインサートまで脱リン
酸化されちゃってるとか）ときに、マイナーなベクターの分解物（端っこ
が削れたのとか）がライゲーションされたものの割合が大きくなってる
のが原因じゃないかって言いたかったんだけど。

683 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 17:17:23

682さんって、例えばベクターからベクターにインサートを移すとき
単純にカット＆ペーストで移したときでも
念のためにシークエンスしてる？

684 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 17:21:16

cohesiveなら切れることを確認しているだけでシーケンスはしてないよ。
bluntならフレームが問題になって、他の方法で確認できないときはシーケンスしてる。

685 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 17:24:32

なるほどな～
自分は出来る限りブラントは避けてるから知らないけど
何となくシークエンスしないと気持ち悪いからやってます。
でも、今まで１００％うまくいってるけど

686 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 17:26:20

>>681
フェノール3回つかうと、初めの２０％ぐらいしかDNA残らないんじゃないか？
初めから多めに使っておかないとだめだね

687 ：６７７：05/01/16 22:05:02

白スカを全部シ－ケンスしてるわけじゃないんだけど，
削れてはいないようなんです．もう少し悩んでみます．

688 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 22:32:46

>>687
削れてないならXgalが効いてないしか有り得ないでしょう。

考えにくいけど、CIP or BAPが訊いてないって可能性もあるけどね。
controlはきちんと置いてるの？
てか置いてなかったら論外なんだけどね。

689 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 23:29:18

根本的な解決にならんけど、ligationした後にEcoRVで切るとか

690 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/17 12:37:28

>688
そりゃあなた・・・。

691 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 01:02:09

ぶっちゃけここでligationについて聞いてる時点でやばいよ・・・・。調べればヒントはいくらでものってるし、
2chで聞く前にラボの人に聞きなさい。まだ間に合います。

692 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 12:37:47

ぶっちゃけLigationについて聞いたわけではなかったのだが・・・。

693 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 12:54:02

ぶっちゃけ何聞きたかったんだＹＯ

694 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 22:20:42

＞６９２
あ～　そうかもね　まあかわらんよ。ぶっちゃけここで
基本的なcloning（これならいいかい？）について聞いてる時点でやばいよ・・・・。
つうかそもそも大腸菌について極める刷れだべ

695 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/20 00:16:33

ｄｃｍとかのメチレーションされない大腸菌ってあるでしょ
あれってトランスフォームの効率異常に悪くない？

696 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/20 00:42:27

>692
そうだね，罰guyだったよ．

697 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/21 03:04:53

>>677
削れてなくて、変なインサート入ってないのに白ばっか。

答えは２つ。

１．６８８の言うようにＸｇａｌ　ｏｒ　ＩＰＴＧ（Ｌａｃの時）が効いてない。

２．ガラクトシダーゼがインフレームになってない　Ｏｒ　ミューテーション入ってしまった。

以上。

698 ：697：05/01/21 03:11:06

書き忘れた。

あなたの書き込みが正しければ、多分、
あなたのベクターはインタクトのまま形質転換しても青くならないでしょう。

まず、これを確かめてみてはどうでしょうか？

699 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/24 20:16:19

大腸菌のいろいろな株についてまとめてあるデータベース、サイトとかありませんか？

700 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/24 21:01:38

プラスミドを抽出し、制限酵素によって切断、
そこに目的遺伝子を加えて繋いだベクターを培養！培養！ぎゃはははははは

701 ：ボトムズ：05/01/25 06:05:53

皆様のご教授をお待ちしております。
質問一：キアゲンプラスミド精製キット（マキシなど）の試薬に賞味期限はありますか？
質問２：プラスミドがハイコピーなのかローコピーなのかはどうやって分かるんですか？

よろしく願います。

702 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/25 08:22:20

質問一：きちんと蓋を閉めてあれば、ずっと大丈夫。蓋が甘いとP2のpHが下がって溶菌しなくなる。
質問２：ここで聞け。ちなみにpUCシリーズやpBluescriptは全部ハイコピー。

703 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/25 12:15:23

pSC101はlow copy.

704 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/25 22:18:42

QIAGENの定義では

high-copy plasmids; pBluescript, pUC, pGEM, Cm-amplified low-copy plasmids

low-copy plasmids; pBR322, most cosmids

very low-copy plasmids; P1, BAC

となっています。

ow copy/high copyの定義は
大腸菌屋さんが考えているモノとQIAGENの定義では
少し違いがあることを申し添えておきます

705 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/25 22:30:33

relaxedとstringentの違いね

706 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/28 02:59:39

白コロニーしか生えないのは菌に問題があるってことは無いでしょうか？
βガラクトシダーゼの相方が落ちてたりすると白しか生えてこないような
気もします。

707 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/28 23:39:31

こないだ猛烈な腹痛＆下痢に襲われ医者で検便
したところO-18がおりました。こいつはO-157の友達らしいのだが、
特徴・毒性など詳しいことを誰か教えてくれ　つД｀）ﾀｽｹﾚ !!

それと大腸菌にお詳しい皆様なのでそれに対しての乳酸菌なんかにも
精通していらっしゃると思われるので、今出ている乳酸菌（LG21とかﾔｸﾙﾄ菌
とかKW乳酸菌とか）で一番熱い乳酸菌を教えてくれ。

たのむ。腹の調子が悪いんだ・・・・・orz

708 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 09:31:38

∩ﾟ∀ﾟ∩age

709 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 16:39:05

>707　悪いことは言わん、乳酸菌なんか食べずに、十分な水分とって、医者の薬飲んで安静にするべし

710 ：質問：05/01/29 23:46:29

タンパク発現を指導者なしでやっています。
今、pETvectorに目的遺伝子をinsertし、コンピテントセル（発現用でない）に形質転換して、
carbenicillinを含むプレート培地でコロニーは発育しました。
今度、plasmidを抽出後、発現させようとplasmid抽出のために液体培養しています。
ところが大腸菌が液地で発育してきません。
わかりにくいと思いますが、何かヒントをください。

711 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 23:56:40

簡単な原因として「抗生物質の量」の可能性はある。ただコロニーは作ってるのよね？微妙ではあるが・・・・
ホストは何使ってます？それと具体的にどの抗生物質をどれだけ使ってます？
これ重要よ。抗生物質はいつも同じ量入れればいいというわけではありません。
入れすぎると極端にgrowthが下がる場合ありです。
可能性として、ただgrowthがわるいだけという場合もあります。

あとは、液体培地に2% glucoseいれてみたら（catabolite repression）どうでしょう？
もし、液体培地でかうことにより若干目的タンパクが発現して、それが悪さをしている可能性もあります。

ひとついえるのは、この辺を聞くときはもっと具体的に（大腸菌の種類、抗生物質量等）かかないと
的確な答えは出来ませぬな。

712 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 23:58:58

711ですが
なんか日本語おかしい部分ありますね・・・。
＞もし、液体培地でかうことにより若干目的タンパクが発現して、それが悪さをしている可能性もあります。
　　　　　　　　　　　　　↓
もし、液体培地でかうことにより若干目的タンパクが発現して（leakyってことね）、それが悪さをしているのであれば、それが原因で大腸菌の発育が阻害されている可能性もあります。

713 ：質問：05/01/30 00:07:20

抗生物質には、100μg/mL carbenicillin , 30μg/mL chloramphenicolです。
コンピテントセルは、NovaBlue(recAクローニング株）ってpETのマニュアルにかいてあります。
培養は、２mLのLB培地でおこないました。
プレート培養時に、IPTGいれてるからでしょうか？

714 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 00:13:21

プレ-ト培養時にIPTGはいれないだろ。

発言誘導時だけいれろ

715 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 00:16:50

プラスミド調製のためだけなら、クロラムフェニコールはいらんよな。

タンパク質発現用大腸菌BL21DE3コドンプラス株の場合、プレ培養にクロラムフェニコールをAmpと共に
いれたりするけど、それと間違って無い？

716 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 00:27:38

読め＞ http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0968

大腸菌にpLysを保持するのにクロラムフェニコールが必要なんで、
NovaBlueにクロラムフェニコール入り培地では増えないんでないの？

717 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 00:30:01

「タンパク質の発現」という言葉に敏感なのは俺だけ？

718 ：質問：05/01/30 00:46:00

プレート培養時に青/白セレクションをしたくてX-galとIPTGをいれてるんです。
でも青色コロニーはできないし何がなんだかです。
白色コロニーをPCRで確認してもinsertのないものもありましたし。

719 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 00:50:50

>>716の言うとおり、NovaBlueならクロラムフェニコール入れたら生えるわけないよ。

720 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 01:03:16

なんだ　この低レベル議論は

721 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 01:04:58

そりゃ、マルチクローニングサイトを二種類の制限酵素で切って、なにかの拍子で末端が削れてセルフラゲーションが起きたプラスミドの場合、フレームがずれていたら、
青くなるわけないぢゃん。

アホですか？>>718

722 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 01:11:15

ところで、そもそもpETベクターってblue-white selectionできるのか？
ひょっとして>>710は低レベルの釣りか？

723 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 01:24:50

なにも理解しないで手だけ動かしているんだろうなw

724 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 01:26:59

おおいな、この手のトラブル。

そしてこの手のトラブル程いい加減な助言が与えられることが多い。
が、しかし、それでうまくいってしまうこともあるから怖い。
ただ単に手技がなっていないだけなのに。

725 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 01:35:58

pETシステムなんてバカ丁寧なマニュアルがあるんだから、まずはきちんと書いてある通りにやってみりゃ良いのにね。
www.cosmobio.co.jp/technical/tech_NVG_20040518/tech_NVG-1-A_20040518.asp

726 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 01:58:49

711ですが
・・・・間違いだらけでんがな質問者さん（泣）。みんなの言うとおり
マニュアルをまずよく読みなさい。
特に重要なのは
716「クロラムフェニコールほんとに必要なんかいな」
722「blue-whiteができるvectorとhostの組み合わせなのか」
この質問を理解できない場合・・・・　

即座に実験を一時中断し大腸菌-vectorに関して勉強しなおしなさい

抗生物質だってマニュアルにあるから

727 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 02:09:05

>721
あほはおめえだ　質問者は「全部」白だといってんだよ　おめえのいってるイベントが
そんなに頻繁に起こるわけねえだろが　ほんとにblue-whiteくさるくらいやったことあんのか？
懸命な奴、いや普通の奴だったらIPTGかx-galがへたってる方を疑うんだよ　ヴぉけ　

728 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 02:57:05

それ、テンション上げて指摘するとこ違う

729 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 03:32:36

まあまあ、皆さん。
710は　＞タンパク発現を指導者なしでやっています。
って言ってるんだし、許してあげれば？
指導者がいないと初めはそんなもんだよ。

俺が教えてあげる。
１．Ａｍｐ（カルベでも良し）プレートでコロニー形成。
２．Ａｍｐ液地で培養。（クロラム禁止、失敗原因はココ）
３．コンストラクトの配列確認。
４．発現用の菌（ここがポイント！ＤＥ３株を使うこと！）に形質転換。
（Ａｍｐプレート使用。クロラムは入れない。）
５．数個のコロニーを液体培地（Ａｍｐ）で培養。
６．菌濁度０．５ぐらいで終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧ入れる。
７．４時間後、１００ｕＬ分の菌液を遠心（１５０００ｒｐｍ、２分）
８．ペレットをＳＤＳサンプルバッファーにけん濁。
９．ホールでＰＡＧＥで確認。
１０．発言確認できたら大量培養。

後は精製するだけ。

730 ：729：05/01/30 03:36:54

詳しい原理とかは皆が言ってるようにちゃんと勉強すること！
では、頑張って下さい！

731 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 11:17:23

ヲレはHisX６タグならpQEベクターが好きだ
インサート確認したらそのままタンパク質発言できる

732 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 11:49:06

>>717
>「タンパク質の発現」という言葉に敏感なのは俺だけ？

遺伝子の発現と言うべきでつか？
英語でもprotein expression と言いまつが、gene expression とも言いまつか？
タンパク屋なのでわかりません。
（ちなみにオレは710～716のだれでもありません。）

733 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/30 12:18:19

＞７３２
両方言うよ。まあしいていえばgene expressionはmRNAのばあいかねえ・・・
びみょ～

734 ：B4：05/01/30 23:00:24

マヂすか・・・protein expressionていうのか、知らなかったorz
もっと勉強せねば・・・。

異種遺伝子を発現ベクターにのっけてDH5αで発現させてるんですが、
そうするとそのタンパク質は大量に産生されてるのがSDS-PAGEで確認できるのですが
その他すべてのタンパク質のバンドが見えないくらいに薄くなります。
これって一体どうなってるんでしょうか？
CBB染色液の質および染色時間、固定等は問題ないはずなのですが・・・。

735 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 00:59:59

736 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 03:13:00

SUREってつかってみたけど、発育するの遅くない？
２０時間かかってやっと小さなコロニーができた

737 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 07:06:18

>>734
同じ量の蛋白乗せてればそうなるかもね。

738 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/04 01:33:30

ColE1
せんしょたいじゃろ

739 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/04 01:35:29

＞734
ネタだと思うが一応警告しておく
OXさせたら、他の蛋白の発現が押さえられるのはしってるよな

740 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/04 03:11:04

>739
ネタじゃないのですが・・・。
あるタンパク質をガシガシ作るために他すべての
タンパク質の発現レベルを抑えちゃってるということでしょうか。
OXが何の略なのかわかりません。

741 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/04 22:50:20

それ以前に、例えば同じ40μｇのタンパク質をアプライしても目的タンパク1μｇ他39μｇの場合と目的タンパク39μｇ他1μｇの場合では他のバンドはうすくなるんじゃない。もうちょっと人に聞かずに自分で考えたほうがいいよ。

742 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/05 00:47:43

>>741
734はホールでＰＡＧＥしてるってことでしょ。
だから740が正解。

おーばーいくすぷれす

743 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/05 11:00:34

OX＞over expression

>>740

744 ：741：05/02/05 12:17:17

>>742
そういうことですか
ごめん、間違えた

745 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/05 14:23:54

＞744
素直だ・・・・。謝ってるよ・・・。君はきっといいやつに違いない。

746 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/05 22:41:30

蛋白研究者に悪人はいないよ。
隣のラボの結晶化職人にこの前飯おごってもらったしさ。
さて、えんしんでもすっか。

747 ：734：05/02/05 23:35:47

なるほど、over expressionがおこると
ほかのタンパク質の生産量が落ちるのですか。
オリやプロモーターなどからしてOXは考えられます。
参考にさせていただきます。

748 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/06 16:39:26

>>746

酵母研究者には悪人が多いような気がする。

遺伝学的手法を適用しずらい材料の他人の実験系をバカにしたがる。

749 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/06 16:59:20

>>748
酵母は再現性が良い実験系なんだね。
哺乳類の蛋白などをつかった実験はどうしても曖昧な結果がでたりする

750 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/07 23:57:45

high copyのplasmidを大腸菌ゲノムの中に組み込むと、大腸菌はどうなってしまうのでしょうか？

751 ：物知り男：05/02/08 00:27:46

oriが２つあることになるから細胞分裂を繰り返すうちに
high copyのoriはもげていきます。結局、ゲノムからははずれちゃいます。

752 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/08 00:53:34

>>751
早速のレスありがとう。
もう一つ質問なのですが、F因子のoriがゲノムに挿入されてoriが２つになった場合でもそうなるのでしょうか？　Hfrだっけ？　ちょっと忘れてしまいましたが。

753 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/08 01:17:43

おひおひ751はネタだぞ＞752
それほど単純じゃない

754 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 09:01:37

>>748
バカにバカって言っちゃ悪人なのか？

755 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 23:27:47

自分の方がバカだった場合
→　恥ずかしいヤツと思われる

相手がバカだった場合
→　反感を買う恐れがあるうえに、言ってもどうにもならない

756 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 23:38:06

バカに仲間意識持たれるより、きちんと切っといた方が人生分かりやすくならないか？

757 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 23:40:24

「しづらい」を「しずらい」と書くような>>748にしてみりゃ、もう少しお手柔らかに言って欲しいってことだろ。

758 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/23 02:06:29

あげえええええええええええええええええ

759 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/01 17:36:07

今年の大腸菌集会っていつなの？
誰かエロイ人　情報キボンヌ。

760 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/02 00:10:48

プラスミドのコピー数って培養中に変化しないのでしょうか？
例えば最初は高コピー数でもだんだん少なくなってくるとか。
あと酵母でも高コピー低コピーってあるんでしょうか？

761 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/02 01:59:39

酵母ではmulti copy / single copyはありますが、
multiのなかでhigh / low copyはなかったと思います

762 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/02 09:22:05

>>761
ありますよ。2micronとARSプラスミドじゃコピー数違うし、
ARSでものせるoriの強さによってコピー数は変わってきます。

763 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/03 01:51:10

Inoue法でコンピテントセル作るとき、18度で培養するのどれくらいかかった？
40時間くらい？

764 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/03 02:13:28

44-48時間くらい

765 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/03 02:17:26

>>764
ありがとう
まる二日だね

766 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/03 09:21:28

植える菌数による

767 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/04 01:07:25

>766
どあほう　植える菌株によるだ

768 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/04 02:19:38

10倍希釈くらいで植えればもっと早い。
朝植えれば、夜にはOK！（DH5あるふぁ）
XL1ブルーはなぜかねとねとになるけど
みんなわどう？
>>767は、どあほうなんて言うたらあかん。

769 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/04 02:43:45

え？そうなの？
てっきりコロニーを拾ってはじめから18度で培養するのかと思ってたけど

770 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/17 19:35:25

プラスミドフリー株の作り方知らない？

771 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/17 21:30:19

アク　オレ　継代

772 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/18 00:08:47

>>770
pBR322oriのプラスミドでMC4100株、
抗生物質抜きLB、24時間培養で約0.2％の株が
プラスミドを持っていなかった。
恐らく汎用のコンピ由来の株なら
もっと効率よく落ちるんじゃない。

773 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/18 01:56:28

サナダ虫につぃて詳しいですか???

774 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/18 02:36:56

>>770
レプリカとり続けることだよ。
プラスミド何使ってる？
場合によってはかなり時間がかかるけど。

775 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/20 19:26:14

プラスミドもしくはぶっこんだDNAによるよ。　おれがやったときは丸3日抗生物質無で飼っても
脱落しなかった・・・。　

776 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/21 01:45:13

いや、pUCでも１％はでるでしょ。黙ってレプリカとれよ。

777 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/06(水) 19:43:35

みんな生菌数はどうやって測ってる？
うちでは9.9ml＋0.1mlで2乗、4.5ml＋0.5mlで1乗を組み合わせて、
適当に希釈してプレートにまいてるんだけど、
9.9ml＋0.1mlの場合10mlのピペットで0.1mlでもずれると
大変なことになりそうなんだけど。

778 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/06(水) 20:16:13

>>777
俺は1mLLBに1μlで更にその1μlを1mLのLBに加えたもので
比較してる．これで大きくて2倍くらい振れる．
溶媒（?）の液量はそんなに気を使わんでもいいと思うけど．
生菌数を桁で言うだけ（生える生えない程度のこと）
だったらこれで十分です．

779 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/07(木) 13:28:52

competent cellいつも買ってたけど、このスレみてInoue法でつくってみた。
すごくいいね。ちゃんと測ってないけど、市販のと同等かそれ以上の効率はありそう。
作るのもそんなに難しくなくて、適当につくったのにこれだから
なんだか買うのがもったいなく思えてきた

780 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/19(火) 02:15:27

IPTGによるカラーセレクションの歴史背景を調べているのですが、
なかなかうまくいきません。
なにかヒントをください。

781 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/19(火) 03:11:46

モレクロとかに出てない？

782 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/27(水) 15:33:41

こんにちは。なんかとてもみなさん詳しそうですね。
そこで質問です。
こんど若い女性の大便を入手する手はずになっているのですが、
これを食してみたいと思います。
体調を悪化させずに安全に頂くには、どのような点に注意すればいいでしょうか？

783 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/27(水) 20:08:38

滅菌すればいいんじゃない？

784 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/27(水) 22:47:13

オートクレーブで滅菌

しかし、世の中いろんな趣味の奴がいるな

785 ：782：2005/04/28(木) 08:08:52

ありがとうございます。
オートクレーブってなんでしょか？
私は電子レンジで暖めるのを考えてました。

786 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/07(土) 00:13:57

素人の私の疑問なのですが
納豆菌は菌を殺すといいます。
大腸の中のよい菌はころさず本当に悪玉菌と呼ばれるものだけ
殺すんですか

787 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/07(土) 00:17:15

そうだね。

788 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/07(土) 00:31:02

>>782
食べ過ぎ注意

789 ：782：2005/05/07(土) 11:00:55

一口だけ初食糞しました。
うんちの中って繊維が張り巡らされているんですね。
うんちくさいのを口にいれてかみかみすると、
中からはまた違った臭いがしてきます。青汁？っぽい臭いと味。
前日に野菜をいっぱい食べたんでしょうかね。
臭いにくらべて、味はそれほどえぐくないです。
ただ、消化されて残った繊維がちょっと食べ心地悪くしてます。

野菜の繊維は超を綺麗にするとよく言いますが、この繊維が絡まったのが、
雑巾みたいな、というか糞吸着装置みたいにはたらいて腸の中を進んできて、
また、コンクリにまぜた鉄筋、ワラのような役割でうんちの型崩れを防ぎ、
綺麗になるんだなぁと実感しました。

790 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/11(水) 14:53:54

本日、ライゲーション後のミニプレで、制限酵素で切れないのがほとんどでした。
一部切れてるのもある。本来あるベクター側の切断なんだけど。
こーなると、何しても切れないだよな。あーあやりなおしか。
でも、こんな事がよくあるんでしょうか？
俺がやると一度でうまくいくことないや。ちなみにキットは、エッペンのファーストでう。

791 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/11(水) 15:03:20

>790
泳動したらバンドがスメア→ミニプレ時の精製がわるい
それ以外→DNAメチル化によって切れなくなった可能性

792 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/11(水) 15:39:31

＞＞790です。御返事有難うございます。
使ってるE.coliはDH5αですが、メチル化に関係するのでしょうか？？
ちなみに今日使った酵素は、EcoR1です。

793 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/11(水) 16:11:07

DH5αってIPTG入れるの？
入れなくても発現する株としない株があると思うんやけど。

794 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/11(水) 20:48:15

>792
EcoRIはDNAメチル化の線はなさそうだな。
酵素が死んでるか、あるいはミニプレ後のDNA溶液がおかしいとか。
一回エタ沈して水に溶かしなおしてからやってみてうまくいくのなら後者。
とりあえず実験してみないとどれが原因なのかはわからない。
TEのEDTA濃度を間違えて猛烈に濃く作った後輩はそれで失敗してたｗ

795 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/11(水) 22:41:22

>>790
俺と同じ症状、同じ菌株だ。
俺の場合は酵素反応がうまくいってなかった。
ポジティブコントロールとして、
絶対に切れることが確実なプラスミドを
切りたいプラスミドと混ぜて切るべし。

ポジコンが切れてライゲーションしたプラスミドが切れてなかったら、
原因はライゲーションしたプラスミドの配列。
両方切れてなかったら、酵素が悪いか、溶液が悪いか、

796 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/12(木) 00:05:53

>>790
だまされたとおもって、きっちりフェノクロをしてみなされ。

797 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/12(木) 23:11:11

各アミノ酸のstock solutionの作り方を教えて欲しいです。
特にチロシンが溶けなくて困っています。

798 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/12(木) 23:30:21

>>797
ヒントだけね。
チロシンは疎水性が強い。

799 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/14(土) 22:43:10

>>798
そういうネタはいらないって。
疎水性って今日び小学生もいわねえよ。

800 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/18(水) 00:08:39

え、だったら何て言うんですか？

801 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/18(水) 11:54:08

たまに、ミニプレ後の大量培養（50ｍｌ）で、キアゲンキット（midi）で、大腸菌は有るけど、
まったくプラスミドが取れん事がままある。何で？？

802 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/18(水) 23:36:31

コロニーから植菌しないでovernight cultureを植え継いでいたとしたら、そいつが原因だ。

803 ：名無しのゲノムクローンさん：2005/05/19(木) 00:34:33

大腸菌はオーバーカルチャーするとプラスミド抜け落ちちゃうんじゃねええ？12時間越えると厳しくなってくるだろ～。プレカルチャ～やんないでそのまま耐性液体培地に植えちゃえ～。

804 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/19(木) 01:12:11

同義反復

805 ：えいいち：2005/05/19(木) 09:31:29

>>785
121℃、20分
これで検索汁！！！

806 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/20(金) 12:23:07

801です。
どの本みても一応、プレカルチャーしてからと書いてあるんですけど、
pickUPから直接、大量やっても大丈夫なんでしょうか？？

807 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/21(土) 00:54:56

>>806　ちなみにどの本にそう書いてある？
キアゲンキットのマニュアルには、コロニーから直接植菌すると書いてないか？
問題のないプラスミドならどっちでも大丈夫だけど、大腸菌の生育が悪くなる
ようなプラスミドだと、overnight cultureの植え継ぎは致命的。何故かって？
アンピシリン耐性遺伝子の産物であるβ-ラクタマーゼは細胞外に分泌されるので、
overnight cultureにはしこたま蓄積してる。これを植え継ぐと、大量培養用の
培地中のアンピシリンは植菌した瞬間に分解されて、以後は全く選択が掛からない。
大腸菌の生育に影響しないプラスミドなら、それでも安定に受け継がれるから
問題ないんだけどね。

808 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/21(土) 01:09:49

んなあほな

809 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/21(土) 18:53:44

いや、だから大腸菌の生育が悪くなるようなプラスミドに限っては、ね

810 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/21(土) 21:04:38

>何故かって？
>アンピシリン耐性遺伝子の産物であるβ-ラクタマーゼは細胞外に分泌されるので、
>overnight cultureにはしこたま蓄積してる。これを植え継ぐと、大量培養用の
>培地中のアンピシリンは植菌した瞬間に分解されて、以後は全く選択が掛からない。

んなあほな

811 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 11:58:47

あほはお前。試してみろよ。

812 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 12:11:10

アンピシリンの使用
選択抗生物質としてアンピシリンを使用する場合は特別な注意が必要です。
かなりの量のβ-ラクタマーゼが産生され、それが培地中に分泌されてアン
ピシリンを完全に分解してしまうためです。さらに、大腸菌の代謝によっ
て培地が酸性になり、その培養条件ではアンピシリンが加水分解されやす
いからです。したがって、不安定なプラスミドをもつ菌がアンピシリン選
択下で生育しつづけられるのは、β-ラクタマーゼを分泌して培地中のア
ンピシリンが分解されるまでの間に限られることとなります。その後は、
プラスミドをもたない菌が死滅することなく過増殖を始めてしまいます。
1 ml当たり50 μgのアンピシリンを含む培地中における典型的なpBR322系
プラスミド増殖の場合では、培養液がわずかに混濁した時点 (1 ml当たり
約107個) で、この状態に達します。
ttp://www.cosmobio.co.jp/technical/tech_NVG_20040518/tech_NVG-5-C_20040518.asp

813 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 19:52:38

>(1 ml当たり約107個)

1 ml当たり約10^7個の間違いでしょ。
こんな濃く植え継がない。

814 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/23(月) 00:03:55

>>812、コスモバイオ
つーことはコロニーから大腸菌を増やせば
10^7匹/mL（だいたいA600＝0.01）に達してもアンプは分解されない
ってことなんだね．それとも10^7匹/mLになる前に回収して
プラスミドをとらなきゃいけないのかな．

マジな、おまいらな大腸菌舐めすぎ。

815 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/23(月) 01:36:13

だから普通アンプは100ug/mlにしないか？

816 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/23(月) 09:34:59

>>813　overnight cultureなら10^9 cells/mL以上行くから、
100倍希釈だと既にその濃度を上回ってるよ。おまけに、
>>812はコピー数の低いpBRの話だから、pUC系ならもっと
薄く植え継いでも危ないんじゃない？まあ、toxicityの無い
プラスミドなら選択が全く掛かっていなくても十分保持される
だろうけどね。

817 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/23(月) 09:44:42

>>815
プレートならともかく、液培でそのくらいじゃ差ないでしょ。酵素が基質を分解するって話なんだからさ。

818 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/23(月) 09:51:00

つかpMB oriの方を舐めすぎでは？
あれはそう簡単には落ちないぞ。
問題になるのは、本当にめちゃくちゃtoxicな奴だけじゃないか？

819 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/23(月) 09:56:59

言い出しっぺの801です。
いろんな本と書きましたが、バイオ実験イラストや遺伝子工学入門とかです。
molecular cloningには、大腸菌の育て方は、ラージスケールに至る過程で、
直接ピックアップかスモールスケールで、培養液30ｍｌでlate log Phase(OD600 ~0.6)
まで培養、次に500ｍｌに移すと書いました。
実際は、当方お必要な最終容量は50-100ｍｌで取れるくらい（数十ug）なので、
一段階目になると思われ。

820 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 00:14:55

よく考えたら、朝3mlに植菌、夜200mlに移して残りを凍結、って
習慣になってたけど案外いい線行ってたのか。

821 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 01:26:12

ってかさあ、「大腸菌について極めるスレ」なのにをまいらレベル低杉。
今年の大腸菌シンポにこのスレの住人が来ているかと思うと嘆かわしい、、、。

822 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 08:42:08

>>821
実験でうまくいかないスレといい、このスレといい、
宗教チックな香具師らが幅を利かせてるけど、
ちゃんと勉強している人はたまに見に来るけどめんどくさいから
レスしないんじゃないのかな？
今回のシンポは逝かないけど、去年みたいにいい感じになるといいね．

823 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 08:50:07

若い女性の大便を食べたらどうなるんでしょうか？
教えてください。

824 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 09:27:02

ひゃー、エラそう。どうすればそこまでの自信が持てるのかな。
ある意味、羨ましい。>>821 >>822

825 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 09:34:14

DNAフラッグメント調製どうしてる？

安いメソッドある？

826 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 09:40:25

気をつけないと、またエラそうな連中にツッ込まれちゃうよ。
安いってことなら、切り出したゲル片をフリーザーで凍らしたあと溶かし、
パラフィルムに挟んで押し潰して出てきたのをEtOH沈殿。
収率はあんまり良くないけど。

827 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/25(水) 07:41:24

Phenol/Freeze。安いが収率は良くない。

828 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/09(木) 11:29:56

質問です。
トランスフォーメーション中にLB 500ml入れて３７℃で１時間振盪ってかいてあるけど、1時間半はだめですか？
YTで１時間半もだめ？
プレートにまいてもなんにも生えてきません。
生えてこない原因をつぶしていて、あとこれだけなんです・・・

829 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/09(木) 11:32:35

おっと！ちがった。
500μlでした。

830 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/09(木) 12:47:36

>>828

形質転換の熱ショックの後、LBかSOCならOK、2xTYとかTBだと大腸菌が死ぬから止めれ。

831 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/09(木) 12:58:53

>>828

“あとこれだけ”って、あんた…
そんなのほとんど関係ないと思われ。
ちなみに熱ショックやエルポ後の培養には
普通SOCを使うけど…。

校正物質まちがえてるに、5000カノッサっ

832 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/09(木) 13:21:31

SupFとか入っているプラスミドとかだったら笑う。

833 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/09(木) 13:27:47

固体培地から液体培地に移すとなぜか増えません
Ａｍｐ５０から３０にとりあえず変えてみました
今度はえなかったら・・・しょぼん

834 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/09(木) 14:20:30

死ぬって・・・？１時間なら死なない？
ってか、プレートにまいたあとの培養にはつかっていいんですか、YT？
抗生物質入ってれば大丈夫ですよね。

835 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/10(金) 01:39:24

>>828
試しに４時間くらい続けてカルチャーしてから蒔いてみたら？
別に手間じゃないし。

836 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/10(金) 16:42:44

うんちを食べた場合は？
サワシリンを飲めばいいですか？

837 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/10(金) 16:43:38

このスレの意味がわかりません？
大腸菌で何をめざすんですか？

838 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/10(金) 21:28:00

素朴な質問。
このスレの上のほうでterrific brothなる培地が紹介されてる >>74
数倍の大腸菌が取れるそうな。
GST融合タンパク質で大量に大腸菌をカルチャーするとき
この培地を使えば融合タンパク質も数倍取れるんだろうか・
コメントください

839 ：sage：2005/06/12(日) 14:17:57

質問させてください。
大腸菌にT系ファージを入れて、溶菌させたら
白い物質が浮かんできたのですが、これは何ですか？

840 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/13(月) 09:53:14

>>839
アナルファックで中田氏された時の精液。

841 ：マウス：2005/06/13(月) 10:59:42

マウスに免疫するための
大腸菌の不活化、無毒化した抗原の作り方
教えてください。

842 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/13(月) 13:11:09

>>838

安定でプロテアーゼによる切断を受けにくいなタンパク質なら
数倍以上たまる。TBを1000ml振って改修した大腸菌からGST融合タンパク質を
１００mg以上回収したことがある。

843 ：名無しのＤＱＮ：2005/06/13(月) 19:43:38

なんで大腸菌の大コロニーは真ん中に芯ができるの？

844 ：名無しのDQN：2005/06/16(木) 16:33:24

何で死菌が多くなるとよくないのですか？大腸菌内のタンパクとかに影響がでるからですか？

845 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/16(木) 16:42:32

来週末、若い女性のうんちを食べることにしました。
サワシリンを用意しているので大丈夫ですよね？
勇気を出して、出た分全部食べてみようかと思います。

846 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/16(木) 17:02:18

http://local.milkcafe.net/test/read.cgi/nagoya/1118908706/

847 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/16(木) 17:10:27

アンピシリンとカナマイシン、どっちが光に弱いですか。

848 ：つまり：2005/06/16(木) 17:12:40

アンピシリンとカナマイシン、どっちがヘタり易いですか

849 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/16(木) 17:14:54

Amp

850 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/16(木) 20:25:58

DH5にあるプラスミドTFしたら
2日後にドーナツ型のコロニーが出来ますた。
死んだ？

851 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/20(月) 03:08:48

質問です

形質転換のときのヒートショクがありますが、
しかしク立夏ｒふぁふぁｆｆさふぁｓふぁｓ

852 ：851：2005/06/22(水) 20:43:10

解決しました。ありがとうございました。

853 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/07(木) 15:41:39

質問なのですが、、、
大腸菌でタンパク質を発現させた時に、
翻訳後修飾のようなことが起きたことはありますか？
あり得ないことなのでしょうか、、？

854 ：853：2005/07/07(木) 22:56:00

解決しました。ありがとうございました。

855 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/08(金) 13:24:30

いまさらですが教えてください。
大腸菌の遺伝子型が全部のってるようなHPはありませんか？
NEBのカタログもみてるんですが、よくわかりません。
一番知りたいのはXL10-GOLDの遺伝子型に書かれてる
△(mcrA)183 △(mcrCB-hsd SMR-mrr)173
　　endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1
　　lac TetR Hte [F' proAB lacIqz △M15
　　Tn10(TetR) Amy
のなんですが。

856 ：855：2005/07/08(金) 20:15:58

解決しました。ありがとうございました。

857 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/10(日) 14:37:54

普段あんまり大腸菌って使わない研究室なので、よくわからないのですが。
トランスフォーメーションでヒートショックした後LB500μl入れて３７℃で１時間振盪
して、その後10000rpmで１０秒ほど遠心して、上澄みを捨てボステックスで懸濁してか
ら、プレートにまいています。

もしかして10000rpmで遠心とか、ボルテックスってのがマズい原因なのかとふと
思いました。これって大腸菌にダメージ与えます？形質転換効率ってこういうので
変わるのでしょうか？

858 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/10(日) 15:34:26

>857
そんなに問題ないと思うけど、10000 rpm (って何×gだか知らんが) ではまわさない。
ボルテックスでは死なない。
というか、M9とか使うんでないかぎり培地交換しないでそのまままくよ。

859 ：857：2005/07/10(日) 15:44:12

>858
ありがとうございます。
ということは他に原因がある訳ですね。
考えてみます。

860 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/10(日) 15:50:07

オレはコンピの遠心は3000rpm５分、けんだくはピペッティングでやる

コンピ大腸菌はデリケートなんだよ

861 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/10(日) 20:28:10

SOCで振ったあとならボルテックスも10000×gの遠心も影響なし
＞８６０

教えるときは精確にね

862 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/19(火) 22:23:57

スレに関係あるかわかりませんが
pVK100とpKT230のプラスミドマップがあるサイトを知っている人
おりましたらご教授ください。
確か、medlineとか、ACCT？ACTT？に行けば見つかるらしいのですが。。
英語がまったくわからないので、困っています。。

863 ：もけぴろ：2005/08/02(火) 00:51:41

なぜ>>7の努力を誰も称えない？

864 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/02(火) 09:51:34

先日女性のうんこを食べました。
翌日、体が少しだけほてったような感じになり、
うでをみると、肌の皮の直下がやや黄色いくなっている感じがしました。

しかしさらに翌日、何事もなく元気に暮らしてます。

865 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/02(火) 21:15:06

そりゃ、良かった

866 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/03(水) 15:52:17

エッペンのキットで、Plasmid　midiがあるんだが、サンプルもらったけど、
途中、１５５００ｇとかで回すところがあるだが、7500ｇでもOKかな？
キアゲンは最終工程で７５００ｇくらいで回して取れるんだが、、、。

867 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/03(水) 20:19:26

ＯＫ
チビタンでもいける
どうせ次にエイドウするでしょ？

868 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/04(木) 09:33:28

しかし、便秘気味の高密度うんこって、すごいよね。
口に入れるとまずそのほどよい苦さがしてくる。
すると、うんこのくさい匂いが気にならなくなってしまう。

口のなかで噛み噛みすると、粘土っぽいそのうんこが、歯にこびりついて取れにくくなってしまう。
そして唾液に溶け込んだうんこが喉の奥へと流れ込んで行き、
ついにはうんこが喉を通って胃に入っていく。

よくすりつぶしたうんこなら、すぐ消化されれもするだろうが、
粘土ぽいうんこを飲み込むように胃に納めたりなんかしたら、あんまり消化されずそのまま体内を通りそう。
普通、食べ物がうんこになって肛門からでてくる。
今出てきたうんこは、
うんこを食べて消化されて別のうんことなって出てきたのか、
あるいは、食べたうんこが消化されずそのまま出てきたのか、
なんて考えてしまう。

869 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/04(木) 20:13:10

ここはうんこについて極めるスレではないよ

870 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/07(日) 17:30:44

質問ですが、、、
pBluescriptベクターにブラントエンドのDNAを組み込むいい方法知りません？
TAクローニングではブラントエンドにならないので。。。

871 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/07(日) 17:51:02

？？？　世も末だな

872 ：870：2005/08/07(日) 18:11:54

補足
１つのプラスミドにブラントエンドのDNAを同時に２つ組み込む方法を知りたいのです。
当然DNA1つだけなら出来るのですが・・・

873 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/07(日) 18:18:14

>870
>TAクローニングではブラントエンドにならないので。。。
これは何を言いたいのかわからないのだが・・・

Bluntで切れるとこがないんなら、何かで切ったあとでklenowで埋めてブラントにする。
もしインサートがPCR産物なら、ベクター側は脱リン酸化しない。
もしくは、インサートをリン酸化して、ベクター側を脱リン酸化する。

そもそも大腸菌について究めるものではない。スレ違い。

874 ：873：2005/08/07(日) 18:20:49

全然質問内容が違ってるｗ
補足がまったく補足じゃないし・・・
なんで同時に入れたいの？別々に入れりゃいいじゃん。

875 ：870：2005/08/07(日) 19:00:46

>>873
リン酸化の件、明日試してみます。
サンクス。
2つ入れるワケを言うと実験ネタバレなので勘弁。
大腸菌マスターはプラスミドにも造詣が深いと思ったので。。
やっぱスレ違い？スマソ

876 ：870：2005/08/07(日) 19:00:50

877 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/07(日) 19:29:02

わけわかんね

878 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/07(日) 20:40:50

質問スレにでもいけばいい

879 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/07(日) 21:13:24

大腸菌と言えば、バクテリオファージ

880 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/08(月) 11:13:33

大腸菌を用いて融合タンパク質を作ろうとしています。
そこで少し質問です。ちなみにpETベクターを用いています。
ＤＨ５αで形質転換したものでは目的のタンパク質が発現していませんでした。
やはりＤＨ５αを発現用宿主として用いるのはよくないのですか？
だれかこの辺に詳しい人教えてください！

881 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/08(月) 12:13:56

T7プロモーター．
普通のDH5あるふぁはT7polを持ってない．
だから発現しない．
普通のラボならおまいのようなミスは
すっげー怒られるし、する前に教わる．
今はつらいかもしれないけど、
必ず幸せになるんだという気合でがんばってくれ．

882 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/08(月) 12:46:14

>>880
おまえ馬鹿か？真性の馬鹿だろ？
税金の無駄や。とっとと机片づけて、便所の掃除でもやってろ。
何様のつもりじゃ。偉そうに。あったま悪いくせに、サイエンスやってる自分を金科玉条のようにおもってるんちゃうんか？。ってか、そんなんサイエンスちゃうし。ええ加減にせえや、このボケ茄子。たこ、カス。

まあ881の代わりに軽くいうといたわｗ。

883 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/08(月) 13:00:48

>>880
のう゛ぁげんのカタログ読め

884 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/09(火) 09:41:26

880です。
本当未熟者ですいません。カタログも読んだつもりでいて、全く読めてなかったのですね。
私はまだ学部生で実験というものを始めたばかりなので、と言い訳したくなりましたが、そんなの言い訳になりませんね。
こんな単純な事に気がつかなくてはなはだ恥ずかしいです。
みなさんからの厳しいお言葉、ありがとうございました。

885 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/09(火) 11:19:33

何も考えずにBL21DE3株大腸菌を使え。それで万事解決。>>880

プラスミド作製用大腸菌とタンパク質発現用大腸菌の種類が違うのがミソ

886 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/09(火) 12:47:04

>>885
やさしいね。

887 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/10(水) 21:30:57

発現させるタンパクがレアコドンを持っている時に特殊な大腸菌を
使ったりしますよね。皆さんがレアコドン対策に使って良かった、
悪かった大腸菌を教えてもらえませんか？

今のラボでｐＱＥ９（キアゲン）使って発現させたいタンパク質が
あるんですが複数種類のレアコドン持っているためか発現が極端に
少ないのでどれかひとつを選んで試してみたいのですが。
貧乏なラボなんで複数買って試すのは無理です。

888 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/10(水) 22:43:02

複数のCodon Plusを使ったことがありますが、タンパクによりけりでした。

889 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/10(水) 23:19:48

大腸菌で遺伝子破壊をしたいのですが、相同領域は最低何ベースあれば
よいでしょうか。破壊目的の遺伝子が短いのでそんなに長さがとれないのです。
経験のある方、教えてください。

890 ：ガセ2チェってホンマむかつく：2005/08/11(木) 00:05:10

>>887
たしかルシフェラーゼがレアコドンを持ってるんだけど、
シャペロン（DnaK)を共発現させたらちゃんと発色したって
論文があった希ガス

>>889
プラスミドでやるんなら500以上、まぁ1K以上で問題が
あったことはない罠．リニアフラグメントの系なら
λレッド使って、長くても40bpじゃなかったか？
6,7年前のPNASにのってるはず．

891 ：889：2005/08/12(金) 20:07:13

>>890
ありがとうございます。リニアフラグメントの方が効率が悪いように
聞いたのですが、40bでもうまくいった例があるのでしょうか。

892 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/13(土) 03:38:12

何をもって効率が悪いと言っているのか理解に苦しむのですが、

場所に依っては苦労するかもしれないけど
（Linear DNA の大量調整や複数回のエレクトロポレーション
あるいは、擬陽性のクローンのなかからあたりを探すとか）、
昔ながらの方法でプラスミドを構築する手間
２回のクローニングでプラスミドを完成させて、
大腸菌に入れて、シングルクロスオーバーを取ってきて、
それからダブルクロスオーバーで目的の変異株を完成することに比べたら
目的のストレインを樹立させることについての効率は圧倒的に
Wannerの系の法が優れていると思うのは私だけでしょうか。

893 ：890：2005/08/13(土) 12:25:06

>>891
リニアのほうは大腸菌のORFならだいたい取れてるよ．
つうかORFなら注文したら？
たしか慶応のどっかのラボが作ってたんじゃない．

>>892
個人的にはリニアの系は好きじゃないな．
例えばポイントミューテーションとか入れたいときって
薬剤マーカー除いた後にFRT(?)が残るじゃない．
更にλRedのせいでゲノム上にあるISとかの相同領域同士が
組み換わるって噂も聞いたことあるし．
まぁ純化すればいいんだけどね．

894 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/14(日) 18:03:15

大腸菌のカタボライト抑制について質問です。
ヴォートなんかの有名な教科書には、cAMPを培地に添加すると
カタボライト抑制が解除されるとあります。しかし、名古屋の饗場研は
培地へのcAMP添加は解除をもたらさないって言ってますよね。どっちが
正しいんでしょ？
Glc代謝時にLacの流入が止まっているのは、PTSのEIIAによるLacトランス
ポーターの阻害（inducer exclusion）が主要因というのは納得なのですが。

895 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/14(日) 18:33:08

足化

896 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/14(日) 22:01:26

ん～っと、久々のマジレス。
あれって、ワシがＭの頃だから結構前だよね。

今日場さんなかなか信じてもらえなくて大変だったらしいよ。

その辺のところちゃんと理解しておくこと　これ重要。
ってかさあ、ちゃんと理解してる人ホントに少ないよね。大腸菌の分子生物学を理解してる人って貴重だなと思う今日この頃。

このスレですら、馬鹿がアホなこと言いまくってるし。

897 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/15(月) 10:02:33

>>896
今日場さんって誰？
I場さんのこと？

898 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/15(月) 11:25:23

>>897
>>896は何も知らない素人なんだから
突っ込んじゃかわいそうだよ。
未だにGenDevとかにAibaって書いてあるのにもかかわらず
饗を「きょう」って読んじゃうんだからさ。
まぁ漢字が読めなくても大腸菌の分子生物学を
理解してるんだから別にいいかwww

899 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/17(水) 21:52:08

>>897
>>898
2人しか釣れなかったかｗ。

900 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/17(水) 22:01:28

( ´,_ゝ`)ﾌﾟ

901 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/19(金) 00:20:37

>>894
Glc+Lac培地でlacオペロンの転写が行かない主な理由は、Lacが細胞内に入らず、
リプレッサーが外れないからです（inducer exclusion）。
この条件では細胞内のcAMP濃度も低下するけど、この濃度低下がlacオペロンの
転写がOFFになることの理由ではありません（Glc+Lac+cAMPの培地でもオペロン
の転写がOFFのままなので）。

一般にcAMP-CRP依存のプロモーターを持つ遺伝子については、培地にGlcを加える
と転写がおちます（cAMP濃度が低下するため）。
この現象をグルコース抑制と呼ぶようです。

902 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/19(金) 01:05:02

>>901
教科書だとこの辺の話をなんかごっちゃにしてたり、
ぼやかして書いてる感じですよね。

グルコース抑制の正確な意味を知らなかったので勉強に
なりました。

903 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/19(金) 23:03:39

>Lacが細胞内に入らず、
これってﾊﾟｰﾐｴｰｽがｸﾞﾙｺｰｽに抑えられてるってこと？

904 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/19(金) 23:24:01

>>903
ちゃいまんねん。PTSのEIIAタンパク質が脱リン酸化状態だと、
Lacパーミアーゼを阻害してLacの流入を阻止する。で、この
脱リン酸化状態はGlc代謝のFluxがあると維持される。
なんで維持されるかは、PTSのEI、HPr、EIIA、EIICBの
リン酸状態の絶妙なバランスによる。

905 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/19(金) 23:25:19

↑Glcの関与は間接的。直接的にはEIIAがLacパーミアーゼ
阻害の主要因。

906 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/20(土) 00:30:18

ｸﾞﾙｺｰｽなくなる→EIIAリン酸化→ﾊﾟｰﾐｴｰｽによりLac流入→LacIはずれる→転写ON

ってこと？

907 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/20(土) 10:20:55

↑大体正解かと。

ｸﾞﾙｺｰｽなくなる→EIIAリン酸化、Lacﾊﾟ^ﾐｴｰｽから離脱→ﾊﾟｰﾐｴｰｽによりLac流入
→ｱﾛﾗｸﾄｰｽ出来てLacIはずれる→転写ON

908 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/12(月) 18:36:39

質問させてください。
pETベクター使って、あるタンパク質を発現させようとしているんだけど、
発現しない....。2種類の遺伝子で試して、どちらもまったくだめです。
気になっているのが、組み換え菌をIPTGで誘導するとき、非誘導のコントロールも
とっているんだけど、誘導した菌体は白く、非誘導の菌体は少し色を帯びているのだが
こんなもんですか？あと、非誘導の方が、菌の回収量が少し多い。発現タンパクに毒性は
ありません。なにぶん、初心者で、周りに経験者もいないため、大腸菌を極めた方々、
よろしくお願いします。
ホストはBL21(DE3)、遺伝子は一方は真核由来、もう一方は原核由来で、
組み込みの確認はシークエンスでしています。
あと、活性は当然出ていないのですが、SDS-PAGEで発現を確認する場合は、
菌体破砕液でやったほうがいいのか、それとも菌体そのものを流したほうがよいのでしょうか？

909 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/12(月) 21:21:20

インダクションかけたのとかけてないのでODの上がり具合に変化あった？

SDS-PAGEで発現確認するときは菌体適当量をSDSﾛｰﾃﾞｨﾝｸﾞﾊﾞﾌｧｰに入れて
ボイルしてそのまま流せばOK

910 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/13(火) 12:44:09

ちゃんとインサートが入ってるかもう一度確認
誘導かけるタイミングと培養温度・時間を変えてみる
なんで毒性がないってわかってるの？

911 ：９０８：2005/09/14(水) 10:49:17

＞９０９
ODは若干の差がありました。本当に少しですが、誘導の方が低かったです。
SDS-PAGEは菌体そのものでいいんですね。やってみます。

もともと、このようなことをする研究室ではないので、電気泳動の装置すらない状況です。
最近注文したので、もうすぐ届きますが。周りに経験者も全くいないため、
みなさんの力を借りたいと思っています。

＞９１０
もう一度、インサートを確認したほうがいいのでしょうか？毒性に関しては、組み込んだ遺伝子が
ごくごくありふれた酵素遺伝子だからなのですが、それだけでは毒性がないってことには
ならないでしょうか？

あとお聞きしたいのが、ちゃんとした形のタンパク質が生産されるかは別にして
正確に組み込まれていて、誘導をかければ、PAGEで何らかのタンパクの増加が
みられるのでしょうか？それとも、正確に組み込まれていても、コドンの使用頻度
の関係などで、タンパク自体ができないものなのでしょうか？

質問ばかりですみません

912 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/14(水) 10:53:28

Ni-カラムを通してみないとわからんよね。＞発現してるかどうか。

抗Hisx6抗体で認識する手もあるけど、高い、Hisx6の外側の配列コミで認識とか難しいんで
、むしろ駄目モトで精製してみろ。100ml LB培地ぐらいで増やして1mM IPTGで１時間誘導で
まずやれ。

913 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/14(水) 22:38:44

>>911
SDS-PAGEについて。
菌体にサンプルバッファーを入れてボイルすると、稀にタンパクが
アグってゲルに入っていかないことがあります（膜タンパクで特に）。
この場合には、TCAでタンパクを抽出してからサンプルバッファーに
溶かし、42℃でheatした後、SDS-PAGEにかけるとよいです。

914 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/16(金) 00:05:13

>>913
サンプルバッファーにいれてボイルしたときにアグるというのがいまいち想像できないのですが
SDS存在下、還元状態でタンパク質がどのような状態になってアグリゲートしているのでしょうか？

915 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/16(金) 00:17:22

ＴＣＡ沈殿なんかしなくても、単に
ボイルを避けて37℃とか42℃とかで処理すればＯＫ

916 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/16(金) 00:28:38

>>915
それだとねっちょりしてアプライしにくい。
サンプルがチップの先にくっついてピペットを持ち上げたときに
一緒について出てくる。菌体の量にもよるが。

917 ：９０８、相談者：2005/09/16(金) 02:33:42

>912
　インサート遺伝子の最後に終始コドンを入れてしまったので、Hisタグがついていないです。
こういうときに利用できるんですね。何も考えずに終始コドンを入れてしまいました。
もう一度ベクターから作り直したほうがいいですかね。

＞９１３－９１６
　PAGEのサンプル調製は、サンプルバッファーに菌体を懸濁し、ボイルまたは37℃とか42℃
で処理したものをアプライすれば基本的にはよいのでしょうか？それともサンプルバッファーに
懸濁後、超音波処理をして、ボイルまたは37℃とか42℃で、アプライでしょうか。何か本などを
見ると、超音波処理しているものもあるのですが、どちらがいいんでしょう？

みなさん、相談に乗っていただいてありがとうございます。

918 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/16(金) 03:18:04

>>917
サンプルバッファーに懸濁後、
数分ボイルしてそれをPAGEで流せばいいです。
それでダメなことは稀。
余計なことは考えない。

ちなみに、
話からしてタンパクにタグがないようですが、
精製しなくていいの？

919 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/18(日) 04:50:24

形質転換37℃培養はSOC？LB？ミリQ？どれ使ってますか？

920 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/18(日) 10:45:38

SOC＞LBだが日常のサブクローニング程度ならLBで十分。
Ampのときはそれすら不要というヤツもいるが、
たいした手間じゃないからやっとくのが無難。
難しいインサートだと逆選択がかかることがあるからね。
ミリQは論外。やる意味無し。

921 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/18(日) 11:05:28

一瞬スレタイが「太極拳について極めるスレ」に見えたので、
以後太極拳の話で↓

922 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/18(日) 14:13:06

>919
ミリQは全滅しないかもしれないけれど、大腸菌がかわいそうだよ。
俺にはそんなことできない。

923 ：919：2005/09/18(日) 17:18:33

920,922　さんくすです

924 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/21(水) 15:37:34

大腸菌とは直接関係ないのでスレ違いかもしれませんが質問させてください。
哺乳動物細胞中でT7 RNA ポリメラーゼを発現させたいのですが、
そのようなプラスミドベクターは市販されているでしょうか？
ググってもT7 プロモーターばっかり引っかかるので。

925 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/22(木) 01:02:35

>>924
まさか、pETシステムとかで
T7 promoter下にクローニングした遺伝子を
培養細胞内で発現させたいために、
さらにT7 RNA polymeraseを導入したいとかの
アホアホ話じゃないよね。

ホ乳類の細胞で発現させるには
普通にCMV promoterのベクターとかたくさんあるけど
それにT7 RNA Polの遺伝子をクローニングするのじゃダメなの？

926 ：924：2005/09/22(木) 01:35:16

>>925
レスありがとうございます。

pETシステムではありませんが、それに類する話です。
発現させようとしているタンパクが特殊なためか、
CMVでは発現してくれないのです…
幾つか文献を当たったところ、T7 RNA ポリメラーゼを動物細胞中で
発現させると非常に強く発現してくれるらしいのです。

その文献中ではT7 RNAポリメラーゼをコードしているリコンビナントのウイルスを用いて
細胞中に導入していました。
うちではウイルスを使いたくないので、ベクターのトランスフェクションで何とか出来ないかなと。
市販で無ければクローニングするのですが、
売っていれば値段と相談して購入しようと思っています。

ボスに聞くと、昔は売ってみたいです。
今は使う人が少ないからわからんと言われましたが…

ひょっとしてここではスレ違いだったでしょうか？

927 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/22(木) 02:45:15

ヒートショックって何でやるん？
ヒートショックし忘れてプレートに巻いたけど、
全然効率かわらんかった。
あれは迷信と違うん？

928 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/22(木) 02:55:38

>>926
確か、遺伝研のベクターコレクションにあったような気が…

929 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/22(木) 03:15:06

ヒートショックしてないよ。
どれかの日本語総説誌の手抜き実験コーナーにも書いてあった。

930 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/22(木) 04:40:21

>>926
BL21(DE3)をたねにPCRで取ってきたら？

931 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/22(木) 07:58:24

>>926
おとなしく文献どおりに
ウイルスをパラパラふりかけた方がいいと思われ。
その方が早くて簡単じゃないの？
2つトランスフェクションって
なんかよく分からなくなる悪寒。

○○細胞培養スレ○○ に逝くといいかも

932 ：926：2005/09/23(金) 04:17:03

いろいろなレスありがとうございます。

>>928
調べてみたら、確かにありますね！！
遺伝研から分譲してもらうのを第一選択肢とさせて頂きます。

933 ：pET23a：2005/10/04(火) 16:26:15

お一つ聞きたいのですが？

934 ：pET23a：2005/10/04(火) 16:32:22

Novablueからプラスミド抽出して、pET23aにトランスフォーメーションし、IPTGで誘導かけたのですが、目的タンパクがぱっと出ません。
なんか助言ありましたら、教えてください。

935 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/06(木) 23:23:27

　　　　　　　　　　　　　　　　ﾄ､　　　　　　　 /ヽ　 /＼　　　　　　　 _
　　　　　　　　　　　　/|＼　｜ヽ　　　　　〈三ヽ /三/|　　　　　/　!　　　/!ヽ
　　　　　　　　　　　　| l　ヽ |　　ヽ　　　　　!＼　／ _|　　　　　 /　｜　 ,' / 　!
　　　　　　　　　　　　| ﾍ　　!　　　ヽ　　　（　)）{　｝（　)）　　　　 ,'　　　!_／ /　　j 　　ジャンケンしようぜ
　　　　　　　　　　　　 ',　ヽ　|　　　　l 　　　ﾄｲ｀|i|⌒ Y=｝　　　 !　　　', ／　　 / 　　　　　
　　　　　　　　　　　　　',　　ヽ!≡　　 l　　　 { ヽ || r‐'ﾘ -i　　　　!　　≡ ! 　　 /
　　　　　　　　　　　　　ヽ　　 ≡　　!　　　　| ﾐ )!!= 彡-ﾉ＿　　 l　　≡ !　　 ,.'
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936 ：919：2005/10/12(水) 23:32:12

アルカリプレップのsol1にグルコースが入っているのは何故ですか?

937 ：919：2005/10/12(水) 23:36:20

ちなみに僕は919ではありません。

938 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 00:11:38

174 名前：名無しゲノムのクローンさん投稿日： 02/03/21 22:34
Sol 2を入れたときにpHが極端に高くならないようにバッファーとして
グルコースが入ってるそうな。Current Protocol in Molecular Biology
参照のこと。

939 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 09:22:26

>>938

グルコースに緩衝能は無い。
浸透圧調整だろ、勢い良く大腸菌が破裂すると大腸菌のゲノムが飛び散って
プラスミドに混入するのを防ぐためだ

940 ：919：2005/10/13(木) 12:53:18

>>938
>>939
ありがとうございます

941 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 13:35:19

>>939
Current Protocol in Molecular Biology, 1.7.3より

Glucose serves as a buffer in step 6 when the pH of the solution is
greatly increased by addition of NaOH. Glucose provides buffering in
the range of pH 12 and, by preventing the pH from rising too drastically
in step 6, increases the efficiency of precipitation in step 7 (when
the pH is lowered by addition of potassium acetate).

942 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 13:44:28

>939
強アルカリではあるよ。OHが電離する。

943 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 13:50:14

強アルカリ条件だと、グルコースの水酸基から水素イオンが放出されるらしいな。

944 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/13(木) 20:43:44

>>939 ボコボコにされてますな。ここは怖いところですな。

945 ：919：2005/10/14(金) 02:04:58

ということで938が答えと考えまつ。みなさん色々ありがとうです。

946 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/15(土) 22:58:48

250個のコロピーをやったが、目的の断片が入っているのが15コロニーしかなかった俺は逝ってヨシですか？

947 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/16(日) 00:04:49

>>946
条件によるんじゃない？
TA-cloningとかならダメダメな気がするが、
cloneしたいのがtoxicな遺伝子だったら
よくやったって気もする。

948 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 09:35:32

toxicなcloneだから少数個取れたってのはヤバいだろ。変異入りの証拠だと思う。

949 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 09:37:35

最近、コロニーが少ないのは波長を３５４nmから３１２nmに変えたせいぢゃないかと思うんだが、どうよ？

950 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 21:51:57

>>949
UVでDNAに変異が入るからという意味？
そういう変異は大腸菌が直してくれるからおｋ。

951 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 21:53:37

OKなわけにゃーだろ？

952 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 22:17:19

>>950 バカめ。１分子のプラスミドに１つでもチミンダイマーがあれば、そいつは形質転換能ほぼゼロだ。

953 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 22:28:11

>>952
それはプラスミドが細胞内に入らないという意味？

954 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 22:41:08

なわけないでしょ。修復にはrecAが必要だけど、プラスミド増やすのに
使ってる大腸菌のほとんどはrecA-だからだよ。

955 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/17(月) 23:00:28

>954
？？？
recAマイナスで修復がいかないのだったら、
蛍光灯のUVや細胞内の活性酸素でしょっちゅう入ってるダメージはどうやって
修復されてるんだ？

956 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/18(火) 09:11:59

>>955
> 蛍光灯のUVや細胞内の活性酸素でしょっちゅう入ってるダメージ
そんなに入ってない。
大腸菌の菌体内はものすごく還元条件がつよいので、そもそも
活性酸素はオケ。
ともあれ、RecA以外にもVsrとかRuvABCとかMutTSとか
ほかにもいろいろあるじゃろ？
修復系もちょっと勉強せぃ。

957 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/18(火) 11:30:28

E.coli DNAポリメラーゼIはそもそも修復系酵素だったという落ちw

958 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/18(火) 22:46:11

結局大腸菌が直してくれるんじゃねーかｗ

959 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/18(火) 23:32:26

>>958 バカは勉強しろと言っても無駄だったか。

960 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/19(水) 12:41:27

ヒント：ライゲーション、TAクローニングの突出末端の塩基、チミンダイマー

961 ：947：2005/10/21(金) 01:26:05

>>948
そうそう、そういう意味で言ってみたｗ
コロピーだから　そういうオチもありでしょｗ

962 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/21(金) 09:09:56

ttp://www.invitrogen.co.jp/products/molecularprobe/SafeImager.pdf
の図３でも見やがれ！言っとくけど、縦軸はlogだからね。

963 ：919：2005/10/21(金) 17:54:12

形質転換を短時間で済ますやり方ありますか？

964 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/21(金) 21:21:28

>>946
目的が達成されたら勝ち組。
クローンが取れたおまいは無条件に勝ち組。

>>963
on ice5分、室温5分回復培養なし（Cm）で
うまく逝った事がある。15kのプラスミドでは
うまくいかなかった。
それと関係ないけどアルカリプレップの
ソル3入れた後の液を大量の大腸菌に対して
ちゃんとトラフォメを行ってもうまくいかなかった。

965 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/21(金) 22:45:38

なんでそんなことの時間を削ろうとすんの？時間掛かるったって、放っとくだけじゃん。

966 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/22(土) 13:27:14

>965
同意。
異常に時間削ろうとして変なプロトコルや、やたら金のかかるキットを使う人間がいるが、
意外と余った時間で漏れみたいに2chやってたりして、時間を有効利用しないばかりか、
結局実験失敗したりもする。意味がないことが多いな。

967 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/22(土) 15:23:33

不溶性のHisTagタンパク質をうまく可溶化する方法を教えてください。

968 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/22(土) 15:27:27

>967
尿素か塩酸グアニジンで変性

969 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/22(土) 15:35:52

どろどろになちゃうんです。ゲル状に

970 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/23(日) 03:39:48

>>意外と余った時間で漏れみたいに2ch
お約束で

971 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/23(日) 20:59:58

>969
DNaseI入れよう。Mgも忘れないように。
それか超音波破砕すればよい。

972 ：ii：2005/10/27(木) 00:49:36

プラスミドに必要な配列の情報をどなたか教えてください。。

973 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/27(木) 01:26:24

つかぬことをききますが
大腸菌の培養を始めることになりました
そこでOD600測定に関して２，３質問します

１：大腸菌を入れたセルはどうやって除菌していますか？70%エタノールですか？
２：測定に使った（セルの中に入れた）大腸菌はまた培養液の中に入れていますか？それともそのままオートクレーブ滅菌ですか？
３：セルは大腸菌専用でなければダメですか？

974 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/27(木) 01:55:48

１．はい。EtOHです。
２．前培養のフラスコの中に入れてオートクレーブ滅菌。
３．プラスチックのディスポーザブルのセルを使っています。
　もちろん、使いまわし。一箱買ったら相当持ちます。
　600nmですから、石英のなんて使う必要がない。

975 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/27(木) 16:17:17

なぜ、大腸菌は、プラスミドを１つだけ取り込めるのでしょうか？

976 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/27(木) 20:19:39

>975
思いっきり濃い濃度のプラスミドで形質転換すればマルチに入るが？

977 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/27(木) 23:14:54

出来るだけ効率のよいコンピを（数回分のみ）つくりたいんですが、何かアドバイスください。
今考えてるのは
　①　遠心はできるだけ低いgで。（菌が全部落ちてこないかもしれないが、気にしない）
　②　操作は全て低温室で無菌操作とか気にせず素早く。（どうせ、抗生物質選択するので）

最終手段として「買う」という手もあるんですが…。

978 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/28(金) 01:56:00

形質転換効率がどの程度欲しいかによると思われ流

979 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/28(金) 05:35:14

エレポ用ならしっかりと洗う。
ケミカル用なら低温でじっくりと培養。

980 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/28(金) 08:49:50

>>977 菌体をsuspendするときには泡立てない。駒込ピペット＋乳首などで優しく手早く。
とにかく冷やす。チューブをみだりに手で握ることすら避ける。

981 ：973：2005/10/30(日) 02:09:21

>>974
ありがとうございます
当方ペプチド討論会に出向いていてスレ読めませんでした

982 ：977：2005/10/30(日) 15:49:18

アドバイス、ありがとうございます。
来週にはトライしてみます。

983 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/30(日) 22:28:39

培養地にできた大腸菌のコロニーってかならず一個の大腸菌が増殖してできたものなんですか？

984 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/30(日) 23:23:37

>>980
ちゅくび?
乳首という実験器具はどういったものでしょうか?

985 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/31(月) 00:53:10

シリコンゴムでできたこんな形のやつ→Ω
駒込ピペットの先っちょにくっつけて、プコプコするの。

986 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/31(月) 01:01:43

>>983 「必ず」とは言えない。十分に薄く蒔いてあれば「ほとんど」。

987 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/31(月) 01:36:23

>>984
あぁ、二ップルのことですね。nippleを訳すと乳首になるのは知ってたけど、ちょっと研究室では言えない･･･
「ちょっと乳首貸してもらえますか?」とかムリ。