○-○-○-タンパク質やってる人-○-○-○
1 ：名無しゲノムのクローンさん：
情報交換しませんか？
おもしろかった論文。
オススメの専門書。
うまくいかない研究。
何でも語ろう。
おもしろかった論文。
オススメの専門書。
うまくいかない研究。
何でも語ろう。
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2 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/16 15:27:25
２ならうれしい。
3 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/16 22:35:07
研究ねぇ・・・ほとんどうまくいきませんが、何か？
4 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/16 23:51:24
４様
5 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/16 23:51:59
6 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/17 00:48:14
あまりに範囲が広くて一つのスレにくくる意味があるとは思えんが
7 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/17 04:52:27
綿チンやってる香具師いねえ？
8 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 21:16:30
誰かBL-21って大腸菌使ってタンパク大量精製しているヒトいます？
なんか、まったく違う位置（SDS-PAGEの)にバンドができるんだけど・・・
めちゃくちゃ小さくなってるのよね、理論値より。
誰か分かるヒト教えてください！！
なんか、まったく違う位置（SDS-PAGEの)にバンドができるんだけど・・・
めちゃくちゃ小さくなってるのよね、理論値より。
誰か分かるヒト教えてください！！
9 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 21:31:49
プロテアーゼで切れているかストップコドンが入っているんじゃないだろうか？
もしくは途中から翻訳が始まっているとか
ごくまれに違う遺伝子を入れていることもある ばか
もしくは途中から翻訳が始まっているとか
ごくまれに違う遺伝子を入れていることもある ばか
10 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 21:39:06
シーケンサーで裏取りありです
なのに出てくるタンパクは短い・・・
ちなみにプロテインヒビター入れて処理してます
本気で分からない・・・・
なのに出てくるタンパクは短い・・・
ちなみにプロテインヒビター入れて処理してます
本気で分からない・・・・
11 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 22:26:38
>8
それって20-25 kDaくらいのとこにでるやつ？
どんなタンパク質のときでも発現しないとでてくる。
大量に目的産物ができたときはあまり目立たないのだが。
それって20-25 kDaくらいのとこにでるやつ？
どんなタンパク質のときでも発現しないとでてくる。
大量に目的産物ができたときはあまり目立たないのだが。
12 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 22:40:31
N末が正しいならC末が切れている（翻訳停止）んじゃない？
C末にhisタグつけて発現させて 精製かウェスタンすれば？
インヒビタ-は働いてないときもあるし
ためしに封入体画分もPAGEしてみて そいつは多分 プロテアーゼにはやられていないはずだから
C末にhisタグつけて発現させて 精製かウェスタンすれば？
インヒビタ-は働いてないときもあるし
ためしに封入体画分もPAGEしてみて そいつは多分 プロテアーゼにはやられていないはずだから
13 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 22:56:29
>>11
えっ！？も、もしかして発現していない時に、絶対にでます？
欲しいのは10.5kDaなんですけど、20-25にもなぜかバンドが・・
しかも、他は6-8kDa付近なんでつ・・・(つ_T )
ちなみにhisトラップカラム後にも20-25はでます？
>>12
サンクス
とりあえず、封入体画分の確認もしてみます
えっ！？も、もしかして発現していない時に、絶対にでます？
欲しいのは10.5kDaなんですけど、20-25にもなぜかバンドが・・
しかも、他は6-8kDa付近なんでつ・・・(つ_T )
ちなみにhisトラップカラム後にも20-25はでます？
>>12
サンクス
とりあえず、封入体画分の確認もしてみます
14 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 23:04:26
>13
多分出るかも
シャペロンの一種はニッケルにアフィニティーがあるようで
くっついてきます クロンテックのはコバルトだからくっつかないとか自慢していたような
タンパク精製の本には除き方も書いてあった
もしかして精製したけど違うバンドが除けないとか？
そういうのはよくありますね 非特異的な結合が
多分出るかも
シャペロンの一種はニッケルにアフィニティーがあるようで
くっついてきます クロンテックのはコバルトだからくっつかないとか自慢していたような
タンパク精製の本には除き方も書いてあった
もしかして精製したけど違うバンドが除けないとか？
そういうのはよくありますね 非特異的な結合が
15 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 23:09:31
>>5 の精製スレと内容がかぶりまくりだな
16 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 23:16:06
>>14
あ〜 完全に発現してないようですね(つ_T)
Niカラムで精製してますけど ずっと20-25付近は気になってたんです・・・
なぜかが分からない→とりあいずクロマト使って精製→はいっっ違う
って感じでつ(T_T)
なにかpET系ベクターに組み込んだやつを発現させるのに良い大腸菌ってあります？
とりあえずBL-21は終了ですね・・・
あ〜 完全に発現してないようですね(つ_T)
Niカラムで精製してますけど ずっと20-25付近は気になってたんです・・・
なぜかが分からない→とりあいずクロマト使って精製→はいっっ違う
って感じでつ(T_T)
なにかpET系ベクターに組み込んだやつを発現させるのに良い大腸菌ってあります？
とりあえずBL-21は終了ですね・・・
17 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 00:09:01
コドンの影響ならRosetta2かな
でもそんなには変わらないよ
フォールディングならOrigamiがよく効くけど
でもそんなには変わらないよ
フォールディングならOrigamiがよく効くけど
18 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 07:33:10
そんな小さいのが発現していないって、少しでも発現しているなら、上にもあったけど、
不溶性画分に行っている可能性は高いね。大腸菌の種類はそんなに影響ないよ。
でも、完全にないってありえん話だ。
不溶性画分に行っている可能性は高いね。大腸菌の種類はそんなに影響ないよ。
でも、完全にないってありえん話だ。
19 ：16：04/10/19 14:17:06
>>17、>>18
レスサンクス
大腸菌にはあまり責任ないようですね
不溶性画分の確認をしたんですがやはり6-8と20-25にバンドが・・・
単なる技術的問題な気がしてきましたよ(つ_T)
タンパク発現温度も色々試したんだけど・・・
みなさんも大体30度で発現させてますよね？
レスサンクス
大腸菌にはあまり責任ないようですね
不溶性画分の確認をしたんですがやはり6-8と20-25にバンドが・・・
単なる技術的問題な気がしてきましたよ(つ_T)
タンパク発現温度も色々試したんだけど・・・
みなさんも大体30度で発現させてますよね？
20 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 14:50:38
発現だけだったら37度でもいいのでは？ 活性がないなら温度を振ります
6-8と20-25のバンドはhis精製でも付いてきてしまうのなら
ウェスタンでは染まりますか？
SDS-PAGEするときに還元剤入れて変性させてみるとか
6-8と20-25のバンドはhis精製でも付いてきてしまうのなら
ウェスタンでは染まりますか？
SDS-PAGEするときに還元剤入れて変性させてみるとか
21 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 15:28:34
>>20
ウェスタンはやってませんが活性はみました
欲しいのはあるタンパクの結合ドメインなのでターゲット配列使ってシフトアッセイを
勿論ペケポンでしたが・・・(ｰｰ;)
これから低温発現（25度とかで）やってみるつもりですけどどうなることやら
そういえば結合ドメインだけの発現が難しいなんてことあります？
ウェスタンはやってませんが活性はみました
欲しいのはあるタンパクの結合ドメインなのでターゲット配列使ってシフトアッセイを
勿論ペケポンでしたが・・・(ｰｰ;)
これから低温発現（25度とかで）やってみるつもりですけどどうなることやら
そういえば結合ドメインだけの発現が難しいなんてことあります？
22 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 15:53:54
あんまり景気よく発現させると全部封入体行きにされるような気がする。
IPTG減らすとかも考えた方がいいよ。
IPTG減らすとかも考えた方がいいよ。
23 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 16:03:31
シグナル配列がないとうまく可溶化しないはず
24 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 16:23:01
25 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 21:32:21
26 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 21:55:48
くり返し使用したグルタチオンセファロース4BのGST結合量が減ったように
思います。
再生可能でしょうか？
思います。
再生可能でしょうか？
27 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 22:09:50
GSTは分からないですね Hisなら再チャージできますが。
シグナル配列は無くても可溶化するけど
大腸菌は封入体を作りたがる生物と考えた方がいいよ
機嫌を損ねるとあっという間に封入体
私の最近のお気に入りはCell free expression
ちょっと値は張るが ウサギ 小麦 大腸菌
朝PCRして 午後には発現しているからね
大体結果が出ます 最近は小麦が調子いいです
シグナル配列は無くても可溶化するけど
大腸菌は封入体を作りたがる生物と考えた方がいいよ
機嫌を損ねるとあっという間に封入体
私の最近のお気に入りはCell free expression
ちょっと値は張るが ウサギ 小麦 大腸菌
朝PCRして 午後には発現しているからね
大体結果が出ます 最近は小麦が調子いいです
28 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 22:35:13
>>26
７０%エタノールで洗うと吉。もうやっていたらごめん。
７０%エタノールで洗うと吉。もうやっていたらごめん。
29 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 23:04:36
30 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 23:22:28
おすすめのHPLCカラムを教えてください
Tosoh bioassist
waters sunfireとかの情報希望
Tosoh bioassist
waters sunfireとかの情報希望
31 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 17:10:35
たんぱくやってる人に質問。
たんぱくの扱いって、結構いい加減でも大丈夫なの？
俺は以前ＤＮＡ、ＲＮＡを扱っていたが、
チップの汚れやチューブの扱いにすっげー気を遣っていた。
たんぱくの奴らは、手袋もせずにいろんなものを扱ってるけど、それでいいの？
いろんなものがコンタミしないの？コンタミしても別に問題ないの？？
たんぱくの扱いって、結構いい加減でも大丈夫なの？
俺は以前ＤＮＡ、ＲＮＡを扱っていたが、
チップの汚れやチューブの扱いにすっげー気を遣っていた。
たんぱくの奴らは、手袋もせずにいろんなものを扱ってるけど、それでいいの？
いろんなものがコンタミしないの？コンタミしても別に問題ないの？？
32 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 17:50:04
>31
SDS-PAGEするだけなら雑でいいかも知れんが、機能をもたせたまま精製するには
ちゃんと丁寧に実験するのが必須。
コンタミのダメージの受けやすさは
DNA＜タンパク＜RNA
かと。
SDS-PAGEするだけなら雑でいいかも知れんが、機能をもたせたまま精製するには
ちゃんと丁寧に実験するのが必須。
コンタミのダメージの受けやすさは
DNA＜タンパク＜RNA
かと。
33 ：31：04/11/24 18:26:02
>>32
うをー、そうだよな、そうだよなぁ。
たんぱく扱うとき、ガラスの洗い物はどれくらいキレイにすればいい?
DNAと同レベルくらいは洗うべき?
今いるラボさ、洗い物は食器と同レベル、
最後にお情け程度にMQWでちょこっとすすいでおしまい。
それでデータの質が悪いとか、再現性出ないとか言ってんだよ。
「実験をもっと丁寧にやったらどうですか」って言いたいんだけど、
たんぱくは核酸とは違うから、扱いはこんなもんでいい、って皆が言うんだよ。
もう心配でさ。
うをー、そうだよな、そうだよなぁ。
たんぱく扱うとき、ガラスの洗い物はどれくらいキレイにすればいい?
DNAと同レベルくらいは洗うべき?
今いるラボさ、洗い物は食器と同レベル、
最後にお情け程度にMQWでちょこっとすすいでおしまい。
それでデータの質が悪いとか、再現性出ないとか言ってんだよ。
「実験をもっと丁寧にやったらどうですか」って言いたいんだけど、
たんぱくは核酸とは違うから、扱いはこんなもんでいい、って皆が言うんだよ。
もう心配でさ。
34 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 18:29:44
タンパクはガラス器具にくっつくしな
35 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 19:05:43
>>33
タンパクの方がDNAより洗い物は丁寧にしないと。
DNAは水にとけるから水洗いでいいし、オートクレーブすればDNaseは分解するけど、
タンパクの場合、器具に残るから。
前にいたラボでは、素手では触れないような強アルカリの洗剤でごしごし洗って、
流水すすぎを２０回以上して、DWで３回以上すすいで、
洗い終わったものは素手で触らない、というのを徹底していたよ。
タンパクの方がDNAより洗い物は丁寧にしないと。
DNAは水にとけるから水洗いでいいし、オートクレーブすればDNaseは分解するけど、
タンパクの場合、器具に残るから。
前にいたラボでは、素手では触れないような強アルカリの洗剤でごしごし洗って、
流水すすぎを２０回以上して、DWで３回以上すすいで、
洗い終わったものは素手で触らない、というのを徹底していたよ。
36 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 21:06:07
重クロム酸カリウム・硫酸混合液に一晩つけてから、
流水すすぎ２０回以上（手袋着用）、
ＤＷすすぎで３回以上（手袋着用）、
専用乾燥機で急速乾燥、
アルミホイルでぐるぐる巻き。
流水すすぎ２０回以上（手袋着用）、
ＤＷすすぎで３回以上（手袋着用）、
専用乾燥機で急速乾燥、
アルミホイルでぐるぐる巻き。
37 ：32：04/11/24 22:25:57
うちはそこまではしない。普通に洗剤→水道水15回→MilliQ3回。
あとはタンパク精製専用のガラス器具かディスポを使うようにしている。
あんまりにもデリケートな対象の場合は、おろしたてのやつを自分専用にして、人に使わせない。
あとはタンパク精製専用のガラス器具かディスポを使うようにしている。
あんまりにもデリケートな対象の場合は、おろしたてのやつを自分専用にして、人に使わせない。
38 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 22:33:13
おいおい、物理的に「キレイ」なことと「酵素学的」にキレイなことの区
別ついてるか？DNAワークで何でもオートクレーブするのは、ヌクレアー
ゼがどこにでもあるからだよ。汗の中とかね。プロテアーゼは定義からし
て不安定（自己消化）だから、バッファーまでオートクレーブなんかはし
ないで使う。器具を良く洗うのは重金属やディタージェントを除くためだ
ろ。「キレイ」にもいろいろあるんだよ。少しは考えて実験しろよ。
別ついてるか？DNAワークで何でもオートクレーブするのは、ヌクレアー
ゼがどこにでもあるからだよ。汗の中とかね。プロテアーゼは定義からし
て不安定（自己消化）だから、バッファーまでオートクレーブなんかはし
ないで使う。器具を良く洗うのは重金属やディタージェントを除くためだ
ろ。「キレイ」にもいろいろあるんだよ。少しは考えて実験しろよ。
39 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 23:22:13
40 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/25 20:53:21
タンパクやってる奴が全員酵素をやってるとは限らない。
41 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 08:32:51
ところでDNA仕事の時ってみんな手袋なんてしてるの？うちはRNAでもバッファーでインキュベーションする時以外は手袋なんてしてないよ。例えばNorthernなんかだとしない。それで問題があったことなんてないけど。
42 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 10:58:40
43 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 17:46:58
>>41,42
Northenのメンブレンとかも素手で扱うのですか。ワイルドですね。
Northenのメンブレンとかも素手で扱うのですか。ワイルドですね。
44 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 18:19:08
ピンセットで扱うから、どっちでも変わらないけど。
46 ：31：04/12/04 01:25:58
すっげー厨房な質問で本当に恐縮なのだが、
ポリクロ・モノクロ抗体はどう保存してる?
俺の今いる研究室さ、ポリクロ抗体を水で薄めて分注して-20℃に入れてんだけど、
(それでポジコンが出なくなったとか言って騒いでる)
薄めずに分注して-20℃の方がいいと思うんだが、どうよ?
ポリクロ・モノクロ抗体はどう保存してる?
俺の今いる研究室さ、ポリクロ抗体を水で薄めて分注して-20℃に入れてんだけど、
(それでポジコンが出なくなったとか言って騒いでる)
薄めずに分注して-20℃の方がいいと思うんだが、どうよ?
47 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 02:16:48
そのっとおりつうか、水で薄めるか普通？PBSだろ。
長期保存ならー８０
長期保存ならー８０
48 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 07:35:22
薄める必要があるなら別だが、普通はそのまま分注して-80にしている。
なるべく濃いままで保存したほうが悪くなりにくいそうな。
BSA入れることもある。
なるべく濃いままで保存したほうが悪くなりにくいそうな。
BSA入れることもある。
49 ：31：04/12/04 11:33:01
>>47
水で薄めて保存はやっぱりヘンだよな??
ラボに今ある試薬はあまり信用しないようにするよ。自分で買うかな。
>>48
なるべく濃いままで凍らせるか、安定剤入れておくのがいいよな。
抗体やたんぱくを扱うのが初めてなので、自分で本読んだりして調べてみたんだが
>>48と同様なことが書いてあった。
ラボの慣習じゃなくて本やおまいらの方を信用するよ。
新ラボへの新規参入は楽じゃないんだな。
水で薄めて保存はやっぱりヘンだよな??
ラボに今ある試薬はあまり信用しないようにするよ。自分で買うかな。
>>48
なるべく濃いままで凍らせるか、安定剤入れておくのがいいよな。
抗体やたんぱくを扱うのが初めてなので、自分で本読んだりして調べてみたんだが
>>48と同様なことが書いてあった。
ラボの慣習じゃなくて本やおまいらの方を信用するよ。
新ラボへの新規参入は楽じゃないんだな。
50 ：名無しタンパク質のリコンビナントさん：04/12/04 15:44:31
一回分を分注して凍らせる。（凍結ー融解を繰り返さない。）
もしくは
グリセロールを入れて凍らないようにする。
もしくは
そのまま冷蔵庫保存。（意外と長持ち）
いずれの場合も、総タンパク濃度が高い方が良い。
（抗体濃度が低ければ、ＢＳＡでも何でも入れて、総タンパク濃度を高く。）
もしくは
グリセロールを入れて凍らないようにする。
もしくは
そのまま冷蔵庫保存。（意外と長持ち）
いずれの場合も、総タンパク濃度が高い方が良い。
（抗体濃度が低ければ、ＢＳＡでも何でも入れて、総タンパク濃度を高く。）
51 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/05 09:31:31
>>11
その正体はなんですか？
その正体はなんですか？
52 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/05 11:29:39
おれはグリセロール アジ化ナトリウム入れて冷蔵庫
2年くらい使えてます
2年くらい使えてます
53 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 02:51:31
良スレ予感age
54 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 11:00:52
ポリクロ→高濃度で保存可能。50%グリセロールで-30 or -80度保存。
モノクロ→抗体自体が高濃度の場合、凝集する可能性大。
使用量をある程度目安を立てて少量づつ凍結保存
４度保存の時はプロテアーゼが入っていないことを祈る。
モノクロ→抗体自体が高濃度の場合、凝集する可能性大。
使用量をある程度目安を立てて少量づつ凍結保存
４度保存の時はプロテアーゼが入っていないことを祈る。
55 ：名無しタンパク質のリコンビナントさん：04/12/09 15:03:30
４度保存は精製度によりますな。
タンパク質がうじゃうじゃある血清なんかはそのまんま冷凍でいいんだけど、精製を始めたらとことんするか、それとも無難な保存方法を見つけるか。
タンパク質がうじゃうじゃある血清なんかはそのまんま冷凍でいいんだけど、精製を始めたらとことんするか、それとも無難な保存方法を見つけるか。
56 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 15:31:24
57 ：54：04/12/10 08:14:43
非働化は抗体が失活しないなんて保障はないんじゃなかろうか。
むしろ、熱処理でサヨナラする抗体はザラかと。
EDTA,AEBSFらへんを入れればマイルドにプロテアーゼ処理完了かな。
4度でも少しは安心。
むしろ、熱処理でサヨナラする抗体はザラかと。
EDTA,AEBSFらへんを入れればマイルドにプロテアーゼ処理完了かな。
4度でも少しは安心。
58 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/10 23:34:35
今、漏れの下半身からたんぱくが放出された
59 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/03 15:10:39
精製スレって落ちた？
もったいない
もったいない
60 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/03 15:19:50
>59
立てました。よろしく。
立てました。よろしく。
61 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/04 18:49:36
62 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/08(金) 06:12:54
この分野の就職はどうでしょう？いま生物系就職びりの林学をしているんですが枠が２人とかの公務員のために勉強するのもいやなのでこの分野に編入することを決意しました
63 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/09(土) 00:45:46
同じく就職ないよ
有機合成でもやったら？
有機合成でもやったら？
64 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/21(木) 20:54:30
すっげー厨房な質問で本当に恐縮なのだが、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル（ミニゲル）を、使う日の前日に作って
保存する場合って、どうやって保存してる？
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル（ミニゲル）を、使う日の前日に作って
保存する場合って、どうやって保存してる？
65 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/21(木) 21:02:12
＞＞６４
サランラップだ！！
ただし、コームを抜かなければの話な。
サランラップだ！！
ただし、コームを抜かなければの話な。
66 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/22(金) 01:24:26
大腸菌である蛋白質を発現させようとしています。
この蛋白質は他の発現系なら発現報告があるんですが大腸菌に関してはありません。
同じファミリーの分子に関して大腸菌での発現（封入体）、まき戻しで機能
蛋白質が大量に取れた報告があるのでそれほど苦労しないだろうと思って
ました。条件をふって（温度、ＩＰＴＧ濃度、誘導のタイミング、誘導後の
発現時間）何度か試したんですが、発現量が増えてくれません（この時は
機能蛋白質をそのまま発現させるつもりでした）。どなたか封入体へ大量に
発現させるために必要な情報をお持ちではないですか？今はとにかく封入体へ
大量に発現させる条件を検討しています。
この蛋白質は他の発現系なら発現報告があるんですが大腸菌に関してはありません。
同じファミリーの分子に関して大腸菌での発現（封入体）、まき戻しで機能
蛋白質が大量に取れた報告があるのでそれほど苦労しないだろうと思って
ました。条件をふって（温度、ＩＰＴＧ濃度、誘導のタイミング、誘導後の
発現時間）何度か試したんですが、発現量が増えてくれません（この時は
機能蛋白質をそのまま発現させるつもりでした）。どなたか封入体へ大量に
発現させるために必要な情報をお持ちではないですか？今はとにかく封入体へ
大量に発現させる条件を検討しています。
67 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/22(金) 01:31:51
>64,65
コーム抜いても乾かなければ大丈夫だけどね。
ゲルが乾かないように水で浸したキムワイプで包んだ上でラップしとけばＯＫ。
自分はこれで翌日はもちろん数日冷蔵庫に置いてから使った事もあるし（但し
確認レベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥね）。あと以前手作りのグラジエントゲルを
よく使っていた頃は同じような感じて（但し水じゃなくてゲル作った時の
バッファーでキムワイプを浸して）１ヶ月ぐらい冷蔵庫に置いてといても
使えたよ。
コーム抜いても乾かなければ大丈夫だけどね。
ゲルが乾かないように水で浸したキムワイプで包んだ上でラップしとけばＯＫ。
自分はこれで翌日はもちろん数日冷蔵庫に置いてから使った事もあるし（但し
確認レベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥね）。あと以前手作りのグラジエントゲルを
よく使っていた頃は同じような感じて（但し水じゃなくてゲル作った時の
バッファーでキムワイプを浸して）１ヶ月ぐらい冷蔵庫に置いてといても
使えたよ。
68 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/22(金) 02:20:19
>>64
セパレイティングゲルのみの上に水いれて、ラップかテープで上を塞いでる。
スタッキングは直前に作ることにしてる。
１日２日なら大丈夫だろうけど、キレイなサンプルスタッキングは
やっぱりキッチリとしたスタッキングゲルとセパレイティングゲルのpHの違いから来るわけで、
スタッキングまで作った状態で放っておくとそこが混ざってしまうだろうから。
セパレイティングゲルのみの上に水いれて、ラップかテープで上を塞いでる。
スタッキングは直前に作ることにしてる。
１日２日なら大丈夫だろうけど、キレイなサンプルスタッキングは
やっぱりキッチリとしたスタッキングゲルとセパレイティングゲルのpHの違いから来るわけで、
スタッキングまで作った状態で放っておくとそこが混ざってしまうだろうから。
69 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/22(金) 03:05:02
>>66
KSI-tag
KSI-tag
70 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/22(金) 05:06:13
71 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/22(金) 09:06:54
プロテアーゼの機能改変始めました。
よろしくお願い致します。
よろしくお願い致します。
72 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/23(土) 09:42:12
>>66
gene-10でぐぐれれ。
gene-10でぐぐれれ。
>72
情報頂いたのにすいません。
この蛋白質は諸事情で融合蛋白質の系を使えないんです。ベクターや大腸菌の種類を
変えたりちょっとコンストラクションの配列を変えたりなどでできないかと考えて
います。今使っているベクターはｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ）です。
情報頂いたのにすいません。
この蛋白質は諸事情で融合蛋白質の系を使えないんです。ベクターや大腸菌の種類を
変えたりちょっとコンストラクションの配列を変えたりなどでできないかと考えて
います。今使っているベクターはｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ）です。
74 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 20:16:31
既出・常識かもしれませんが質問させてください。
ある哺乳類ペプチドに対する抗体を作ろうと思っているのですが、特異性等を考慮して、
ニワトリに免役しようかと考えています。
ニワトリ抗体を扱ったことがないのでよく分からないのですが、卵黄中に含まれるIgYというのは
血清中に含まれるIgGとは異なるものなのですか？
血中のIgGが卵黄に移行するとIgYとなる。と書いてあるHPもあったのですが、その場合血清中の
抗体力価と、卵黄中の抗体力価というのは変わらないものなのですか？
また、例えば得られた抗血清を用いてウェスタン等を行おうとした場合、用いる二次抗体は
anti-chick IgGですか？ それともanti-chick IgYでしょうか？
教えていただけると幸いです。よろしくお願いします。
ある哺乳類ペプチドに対する抗体を作ろうと思っているのですが、特異性等を考慮して、
ニワトリに免役しようかと考えています。
ニワトリ抗体を扱ったことがないのでよく分からないのですが、卵黄中に含まれるIgYというのは
血清中に含まれるIgGとは異なるものなのですか？
血中のIgGが卵黄に移行するとIgYとなる。と書いてあるHPもあったのですが、その場合血清中の
抗体力価と、卵黄中の抗体力価というのは変わらないものなのですか？
また、例えば得られた抗血清を用いてウェスタン等を行おうとした場合、用いる二次抗体は
anti-chick IgGですか？ それともanti-chick IgYでしょうか？
教えていただけると幸いです。よろしくお願いします。
75 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/09(木) 14:37:43
免疫沈降の際、
Protein G sepharoseに非特異的なタンパクが結合しないように
前処理を施そうと思うのですが、
みなさんどんな方法を取ってますか？
Protein G sepharoseに非特異的なタンパクが結合しないように
前処理を施そうと思うのですが、
みなさんどんな方法を取ってますか？
76 ：名無しゲノムのクローンさん ：2005/06/09(木) 15:06:25
>>74
Ig"Y"だろ。卵一個でIgYは大量に取れる。が、CHCl3 extの影響かもしれんが、相対的に血清分画に比べてtiterが低い。Affinity purifyして使えば問題なし。2次抗体は当然IgGでいい。
>>75
ChIPでもない限りprecleanでOK.
Ig"Y"だろ。卵一個でIgYは大量に取れる。が、CHCl3 extの影響かもしれんが、相対的に血清分画に比べてtiterが低い。Affinity purifyして使えば問題なし。2次抗体は当然IgGでいい。
>>75
ChIPでもない限りprecleanでOK.
77 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/15(水) 02:46:00
78 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/29(水) 17:24:30
タンパク精製の前の前のスレみれない〜前のもみれない。
そこで質問です。
lysis bufferってなに使ってもいいの？種類があるなら教えて下さい！
そこで質問です。
lysis bufferってなに使ってもいいの？種類があるなら教えて下さい！
79 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/29(水) 23:05:26
80 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/01(金) 21:26:30
ある融合たんぱく質（合計で約１１ｋDa)をHisトラップ精製したんですけど
どうもGLoESかなんかのたんぱく質（１００ｋDa以上のがいくつか）がどうしても
くっついてきてしまって離れてくれません
アフィニティーカラムの洗浄をかなりキツクしてもだめでした
しかしタグの種類を変えるだけのマネーがうちにはありませんorz
なんか良いアドバイスあればお願いしますm(__)m
どうもGLoESかなんかのたんぱく質（１００ｋDa以上のがいくつか）がどうしても
くっついてきてしまって離れてくれません
アフィニティーカラムの洗浄をかなりキツクしてもだめでした
しかしタグの種類を変えるだけのマネーがうちにはありませんorz
なんか良いアドバイスあればお願いしますm(__)m
81 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/02(土) 16:21:01
>>80
もし本当にGroELSなら、ATP入りバッファーか10%位のメタノール入りバッファーで洗えば外れるかも。
もし本当にGroELSなら、ATP入りバッファーか10%位のメタノール入りバッファーで洗えば外れるかも。
あ、hisトラップか。目的のタンパクがGroEに付いてる訳じゃないのかな。
塩濃度は十分高い？
塩濃度は十分高い？
83 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/02(土) 18:13:16
>80
ATPアガロースに通す。
でもさ、GroESやGroELって100 kDaもないぞ。Nativeゲルなら別だが。
ATPアガロースに通す。
でもさ、GroESやGroELって100 kDaもないぞ。Nativeゲルなら別だが。
>81
塩濃度は500ｍMと1MのNaClで試してみました
ATPはこれから試してみます。
>83
そうなんですよね・・・。Groにしては大きすぎるバンドなので一体なにかが分からなくて
単に予想しているだけなんです。
DnaKで70、GroELで60くらいでしたっけ・・・
なので目的たんぱく質がアグってたり、Groがダイマー組んで目的たんぱく質に結合したり・・・・
なんて考えられないですか？
なんにしてもATPを試してからですね・・・・
塩濃度は500ｍMと1MのNaClで試してみました
ATPはこれから試してみます。
>83
そうなんですよね・・・。Groにしては大きすぎるバンドなので一体なにかが分からなくて
単に予想しているだけなんです。
DnaKで70、GroELで60くらいでしたっけ・・・
なので目的たんぱく質がアグってたり、Groがダイマー組んで目的たんぱく質に結合したり・・・・
なんて考えられないですか？
なんにしてもATPを試してからですね・・・・
85 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/02(土) 19:54:10
普通のSDS−PAGEで見えるならGroEではなく100kの何かでしょう。
S−Sでついてるなんてオチは？
S−Sでついてるなんてオチは？
86 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/04(月) 15:18:03
＞８〜２０
私も同じような実験をしています。
His-tag付きで欲しいものは11.5kDa。発現誘導前、発現誘導後、ソニケーションサップ、ペレットの順でSDS-PAGEをしました。
ものは極少量あるようにも見えますが、ソニケーションペレットに20-25kDaの不思議なバンドがくっきりどかっと見えています。
目の錯覚でもしや発言してないのかなぁ？ウエスタンやるべきですかね？
私も同じような実験をしています。
His-tag付きで欲しいものは11.5kDa。発現誘導前、発現誘導後、ソニケーションサップ、ペレットの順でSDS-PAGEをしました。
ものは極少量あるようにも見えますが、ソニケーションペレットに20-25kDaの不思議なバンドがくっきりどかっと見えています。
目の錯覚でもしや発言してないのかなぁ？ウエスタンやるべきですかね？
87 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/04(月) 15:25:49
88 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/04(月) 15:26:42
XちなみにL1-Blue→ちなみにXL1-Blue
89 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/04(月) 17:23:03
＞86
そうなんですか〜。今、同じようなことをラボでも言われました。ありがとうございます。
11kDa以下のタンパク見たいときってどのくらいの濃度のゲルですかね？
私が愛用しているのは第一化学のPAGミニで１５／２５ってやつなんですけど、これよりいいのがあっったら教えて下さい！
そうなんですか〜。今、同じようなことをラボでも言われました。ありがとうございます。
11kDa以下のタンパク見たいときってどのくらいの濃度のゲルですかね？
私が愛用しているのは第一化学のPAGミニで１５／２５ってやつなんですけど、これよりいいのがあっったら教えて下さい！
90 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/04(月) 21:07:31
低分子量ペプチドの分離にはTricineゲルが推奨では？
ヲレ的には尿素入りSDS-PAGEゲルで低分子量ペプチドの分離は十分に
いく。ただし、8kDa以下のペプチドはSDS-PAGEゲルのCBB染色時に
速やかにゲルから拡散で逃げだす傾向にある。
ヲレ的には尿素入りSDS-PAGEゲルで低分子量ペプチドの分離は十分に
いく。ただし、8kDa以下のペプチドはSDS-PAGEゲルのCBB染色時に
速やかにゲルから拡散で逃げだす傾向にある。
91 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/04(月) 22:51:24
92 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/05(火) 16:13:33
93 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/07(木) 00:27:13
ねぇ、なんでか分かんないですがヒスタグ融合たんぱくを発現させて
カラム通して精製したんですが、SDS流すと目的のたんぱくバンドもある
んですが、なぜか80〜100kDaの間に極太のバンドが3本見えるんです。
これ、なんのたんぱく質か分かる人いたら教えて下さい。
ちなみに目的たんぱくは15kDaです。
よろしくおねがいします
カラム通して精製したんですが、SDS流すと目的のたんぱくバンドもある
んですが、なぜか80〜100kDaの間に極太のバンドが3本見えるんです。
これ、なんのたんぱく質か分かる人いたら教えて下さい。
ちなみに目的たんぱくは15kDaです。
よろしくおねがいします
94 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/07(木) 11:45:59
>93
そんなに気になるんだったらMS
そんなに気になるんだったらMS
95 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/08(金) 12:36:12
Ｑ：これ、なんのたんぱく質か
Ａ：バクテリアのたんぱく質
よく見かけますね。ゲルの上の方に数本のバンド。
Ａ：バクテリアのたんぱく質
よく見かけますね。ゲルの上の方に数本のバンド。
96 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/26(火) 02:00:58
natureに出たERへのVCAM1の移行阻害の論文でさ、この化合物って
Sec61と相互作用してチャネルの機能が変化するからVCAMの移行がなくなるって
書いてるんだけど、これって小胞体ストレスにも関係してくると思いますか？
Sec61がVcaｍのみに働いているとは思えないし、どうなんだろう・・・・
Sec61と相互作用してチャネルの機能が変化するからVCAMの移行がなくなるって
書いてるんだけど、これって小胞体ストレスにも関係してくると思いますか？
Sec61がVcaｍのみに働いているとは思えないし、どうなんだろう・・・・
97 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/15(月) 22:52:46
大腸菌でとあるタンパクの過剰発現系を構築したんだけど
SDS-PAGEでもウエスタンでも見えない……ぐは
SDS-PAGEでもウエスタンでも見えない……ぐは
98 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/16(火) 07:18:16
ベクターを変えろ
99 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/16(火) 12:12:17
低温誘導発現系でやれ。
100 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/25(木) 18:52:35
ttp://www.uploda.org/file/uporg177463.jpg
（´・ω・） ｶﾜｲｿｽ
（´・ω・） ｶﾜｲｿｽ
101 ：名無しさん＠そうだ選挙に行こう：2005/09/11(日) 16:58:33
分子量10万程度の酵素のMSってとれる？
102 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/12(月) 03:42:44
>101
100kDaなんて、そのままじゃまず飛ばないね。
PMFのことじゃないの？
だったらトリプシンとかで切るから
100kDaだろうが関係ないね。
100kDaなんて、そのままじゃまず飛ばないね。
PMFのことじゃないの？
だったらトリプシンとかで切るから
100kDaだろうが関係ないね。
103 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/12(月) 15:23:34
pETベクター使って、あるタンパク質を発現させようとしているんだけど、
発現しない....。2種類の遺伝子で試して、どちらもまったくだめです。
気になっているのが、組み換え菌をIPTGで誘導するとき、非誘導のコントロールも
とっているんだけど、誘導した菌体は白く、非誘導の菌体は少し色を帯びているのだが
こんなもんですか？あと、非誘導の方が、菌の回収量が少し多い。発現タンパクに毒性は
ありません。なにぶん、あまり賢くないので、どなたか丁寧にこたえてくれませんか。
発現しない....。2種類の遺伝子で試して、どちらもまったくだめです。
気になっているのが、組み換え菌をIPTGで誘導するとき、非誘導のコントロールも
とっているんだけど、誘導した菌体は白く、非誘導の菌体は少し色を帯びているのだが
こんなもんですか？あと、非誘導の方が、菌の回収量が少し多い。発現タンパクに毒性は
ありません。なにぶん、あまり賢くないので、どなたか丁寧にこたえてくれませんか。
104 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/12(月) 18:22:18
30kDaを越えると難しいものもある。
ドメインごとに区切って発現させるとか、
GST融合、マルトース結合タンパク質融合とか安定なタグ付きで試してみそ。
ドメインごとに区切って発現させるとか、
GST融合、マルトース結合タンパク質融合とか安定なタグ付きで試してみそ。
105 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/12(月) 23:12:38
>103
困っているのはわからんでもないが、
マルチは良くない。
4年生なんだろうけど、9月だったらまだ
余裕はあるんだから、しっかり考えろ。
困っているのはわからんでもないが、
マルチは良くない。
4年生なんだろうけど、9月だったらまだ
余裕はあるんだから、しっかり考えろ。
106 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/12(月) 23:25:31
107 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/12(月) 23:28:43
ＢＭＡＬ１の体内の1日の変動を知りたいです
＞１０５
マルチって二ヶ所に書き込むことですか？とある事情で11月末までしか研究をできません。
そのため、あせってやってしまいました。すみません。これからは｢大腸菌について極める｣
の方に書かさせていただくので、相談にのってくださる方は、そちらでもよろしくお願いします。
＞１０６
PAGEはまだやっていないんですよ。というより、もともと研究室が化学系なので電気泳動の
装置すらありません。つい最近注文したので、届きしだい、やってみます。
もともと、このようなことをする研究室ではないので、電気泳動の装置すらない状況で
非常に困っています。みなさんの力を借りたいと思っています。
マルチって二ヶ所に書き込むことですか？とある事情で11月末までしか研究をできません。
そのため、あせってやってしまいました。すみません。これからは｢大腸菌について極める｣
の方に書かさせていただくので、相談にのってくださる方は、そちらでもよろしくお願いします。
＞１０６
PAGEはまだやっていないんですよ。というより、もともと研究室が化学系なので電気泳動の
装置すらありません。つい最近注文したので、届きしだい、やってみます。
もともと、このようなことをする研究室ではないので、電気泳動の装置すらない状況で
非常に困っています。みなさんの力を借りたいと思っています。
109 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/15(木) 08:19:24
おまえ面白いやつだな
どうやって発現しないとか確認したか書いてみ
相談にのっちゃる
どうやって発現しないとか確認したか書いてみ
相談にのっちゃる
＞１０９
怒られそうですが、正直言って、まだ酵素の活性しか見ていません（2回(2種類の遺伝子ともに)）。
これしか、今のところ方法がないので（思いつかないので）...。SDS-PAGEを近々行いますが。
もし109さんが相談に乗ってくれるのであれば、また、マルチだと怒られてしまうかもしれないので
｢大腸菌について極める｣ の方でよろしくお願いします。
怒られそうですが、正直言って、まだ酵素の活性しか見ていません（2回(2種類の遺伝子ともに)）。
これしか、今のところ方法がないので（思いつかないので）...。SDS-PAGEを近々行いますが。
もし109さんが相談に乗ってくれるのであれば、また、マルチだと怒られてしまうかもしれないので
｢大腸菌について極める｣ の方でよろしくお願いします。
111 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/17(土) 21:43:49
∩
⊂二⊃
⊂二二二⊃
⊂二⊃
⊂二二二⊃
112 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/17(土) 22:06:42
僕の身体はたんぱく質で出来ているような気がするのですが
あなたは噂のケイ素生物さんですか？どうもはじめまして。
兄弟の機械知性がいつもお世話になっているそうであんな出来の悪い奴の面倒を見ていただいてありがとうございます。
あなたは噂のケイ素生物さんですか？どうもはじめまして。
兄弟の機械知性がいつもお世話になっているそうであんな出来の悪い奴の面倒を見ていただいてありがとうございます。
113 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/27(火) 00:45:46
活性を保ったまま
タンパク質の濃縮をしたいのですが、
硫安分画とエタノール沈殿、どちらがいいですか？
タンパク質の濃縮をしたいのですが、
硫安分画とエタノール沈殿、どちらがいいですか？
114 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/27(火) 00:47:20
えたちん
115 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/27(火) 12:43:37
>>113
スピンカラムの方がいいよ
スピンカラムの方がいいよ
116 ：113：2005/09/27(火) 13:39:12
カラムで濃縮できるんですか？
117 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/27(火) 14:01:37
限外濾過
118 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/27(火) 20:04:30
119 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/24(月) 21:49:26
はじめまして。
今タンパク質発現で頭を抱えています。
ホスト BL21 star, ベクター pRSET で
1mM IPTGによる発現誘導を行いました。
すると、誘導前は発現していて、誘導後は発現の抑制が起こりました。
ポジコンではちゃんと誘導前は発現せず、誘導後に発現します。
誰かこんな経験されたことありますか？
今タンパク質発現で頭を抱えています。
ホスト BL21 star, ベクター pRSET で
1mM IPTGによる発現誘導を行いました。
すると、誘導前は発現していて、誘導後は発現の抑制が起こりました。
ポジコンではちゃんと誘導前は発現せず、誘導後に発現します。
誰かこんな経験されたことありますか？
120 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/28(金) 04:21:13
>>119
何が言いたいのかはっきりわからんがポジコンは目的とは別の遺伝子
が入っているベクター（キットに入っていたやつ）をトランスフォー
メーションしたクローンで、自分が目的としている遺伝子を入れた
ベクターをトランスフォーメーションしたクローンは誘導前は
生えてるのに誘導後生えないということ？
もし上の話の通り必要な量にもよるが誘導前にもれてるなら誘導しないで
そのままスケールアップしては？その原因を探るのが目的じゃなくて
タンパク取るのが目的でしょ？
それがだめならとっとともう一回コンストラクションから始めたほうが
早いと思うけどね。再現性があるならここよりもメーカーに問い合わせ
できるし。
何が言いたいのかはっきりわからんがポジコンは目的とは別の遺伝子
が入っているベクター（キットに入っていたやつ）をトランスフォー
メーションしたクローンで、自分が目的としている遺伝子を入れた
ベクターをトランスフォーメーションしたクローンは誘導前は
生えてるのに誘導後生えないということ？
もし上の話の通り必要な量にもよるが誘導前にもれてるなら誘導しないで
そのままスケールアップしては？その原因を探るのが目的じゃなくて
タンパク取るのが目的でしょ？
それがだめならとっとともう一回コンストラクションから始めたほうが
早いと思うけどね。再現性があるならここよりもメーカーに問い合わせ
できるし。
121 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/31(月) 00:09:13
>>120
これは、初めは正常に発現した（IPTG誘導後に発現した)コロニーから、ミニプレップでplasmidをとって、再びトランスフォーメーションして、発現を確認したんです。
そしたら、誘導前は発現して、誘導後は発現しなくなりました。再現性もありました。
で、誰か誘導前は発現して、誘導後は発現しない原因を知っている人がいないかと思いまして掲示板に書いてみました。
正常に発現したコロニーは残っていたんで、それでタンパク質とりました。
120さんには、解決の方法をいろいろ考えて頂いて本当にありがとうございました。
これは、初めは正常に発現した（IPTG誘導後に発現した)コロニーから、ミニプレップでplasmidをとって、再びトランスフォーメーションして、発現を確認したんです。
そしたら、誘導前は発現して、誘導後は発現しなくなりました。再現性もありました。
で、誰か誘導前は発現して、誘導後は発現しない原因を知っている人がいないかと思いまして掲示板に書いてみました。
正常に発現したコロニーは残っていたんで、それでタンパク質とりました。
120さんには、解決の方法をいろいろ考えて頂いて本当にありがとうございました。
122 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/31(月) 01:17:17
>>121
当該株の塩基配列をよんでみようよ。
当該株の塩基配列をよんでみようよ。
123 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/15(火) 22:39:07
リン酸化抗体使ってウエスタンしてるんだが、以前出ていたバンドが突然出なくなったです。
・サンプルは目的の遺伝子を導入したもの（タンパクそのものは容易にdetectできる）
・Triton lysis buffer
・プロトランっていうニトロセルロースメンブレン
・transfer bufferは20%メタノール入
・5%スキムミルクでblock→wash（PBS+Tween）
・カゼインフリーのbufferで抗体希釈
・二次抗体はアマシャム
・ECL
二週間前まで、比較的容易に検出できていたバンドがみえなくなりました。
どんな要因が考えられますでしょうか？ご教授下さいーーーー
学位論文ﾔｳﾞｧｽ
・サンプルは目的の遺伝子を導入したもの（タンパクそのものは容易にdetectできる）
・Triton lysis buffer
・プロトランっていうニトロセルロースメンブレン
・transfer bufferは20%メタノール入
・5%スキムミルクでblock→wash（PBS+Tween）
・カゼインフリーのbufferで抗体希釈
・二次抗体はアマシャム
・ECL
二週間前まで、比較的容易に検出できていたバンドがみえなくなりました。
どんな要因が考えられますでしょうか？ご教授下さいーーーー
学位論文ﾔｳﾞｧｽ
124 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/15(火) 22:41:29
すきむみるく（←リン酸化タンパク質）はやめておけ。最初からBSAかゼラチンにしとけ。
125 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/15(火) 23:06:48
ブロッキングからやめといたほうがいいでつか？
市販のカゼインフリーのブロッキング液などは使えますかね？隣のラボが持ってるらしいですが。
市販のカゼインフリーのブロッキング液などは使えますかね？隣のラボが持ってるらしいですが。
126 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/02/06(月) 22:35:19
PDBデータをいじるソフトでオススメ無いでしょうか？
ＯＳは出来ればＭａｃＯＳＸがいいです。
フリーでも有償でもいいです。
やりたいのは
・ＰＤＢから視覚化（リボン必須）
・アミノ酸の入れ替え
・原子の入れ替え
・構造をいじる（たとえば、シスをトランスに変えたり）
などです。
RasMol,MacPyMOL,など試していますがアミノ酸入れ替えなどは出来ませんよね？
ＯＳは出来ればＭａｃＯＳＸがいいです。
フリーでも有償でもいいです。
やりたいのは
・ＰＤＢから視覚化（リボン必須）
・アミノ酸の入れ替え
・原子の入れ替え
・構造をいじる（たとえば、シスをトランスに変えたり）
などです。
RasMol,MacPyMOL,など試していますがアミノ酸入れ替えなどは出来ませんよね？
127 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/06/07(水) 09:56:07
128 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/07/09(日) 03:02:14
部位特異的変異導入法のストラテジーを解説した
いい本または論文があったら紹介して下さい。
いい本または論文があったら紹介して下さい。
129 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/23(木) 22:55:28
石英セル(キュベット)を使って
多サンプルのタンパク質の定量をする場合、
石英セル(キュベット)をあらかじめBSAで
コートするのは定番なん？
なにもせずに定量していたら享受にどしかられたが。
多サンプルのタンパク質の定量をする場合、
石英セル(キュベット)をあらかじめBSAで
コートするのは定番なん？
なにもせずに定量していたら享受にどしかられたが。
130 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/23(木) 23:02:17
なぜ>>1はそこまで主旨不明瞭な文章が書けるのか。
まず、それについて話し合おう。
まず、それについて話し合おう。
131 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/23(木) 23:03:36
>>1イジリには秋田
132 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 00:03:43
133 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 00:04:35
>>128
何ヶ月か前の蛋白質核酸酵素の「実験キット解体新書」嫁
何ヶ月か前の蛋白質核酸酵素の「実験キット解体新書」嫁
134 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/26(日) 07:05:58
BSAコート何それ？
石英セルは壊れるのが怖くて使ってない。
ディスポの２８０ｎｍ対応のセルを洗って何度も使ってる。
これでもしっかり測ってくれてるから今のところ問題ないと
石英セルは壊れるのが怖くて使ってない。
ディスポの２８０ｎｍ対応のセルを洗って何度も使ってる。
これでもしっかり測ってくれてるから今のところ問題ないと
135 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/21(木) 15:54:54
ＢＳＡ＝ボビン・セラム・アルブミン
136 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/21(木) 15:58:46
＞１３２
激しく同意！馬鹿教授！
激しく同意！馬鹿教授！
137 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/12(金) 01:23:38
誰かアミノ酸配列からタンパクサイズ(kDa)を求めるフリーソフト教えてください。
138 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/12(金) 01:28:26
アミノ酸残基数ｘ110
139 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/12(金) 01:30:51
>>138
ありがとうございます！
ありがとうございます！
140 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/12(金) 08:39:34
141 ：名無しさん＠そうだ選挙に行こう：2007/07/29(日) 09:51:42
１４−３−３タンパク質やってるひといますか？
142 ：名無しさん＠そうだ選挙に行こう：2007/07/29(日) 09:53:39
おれおれ
143 ：名無しさん＠そうだ選挙に行こう：2007/07/29(日) 10:05:04
おれもおれも。14-3-3やってた女もヤッた。
144 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/30(日) 12:15:15
限外濾過で、Amicon Ultra 使ってる方いますか〜〜？
皆さん、何回くらいまでリユースしますか？
自分は、基本的には10回以下くらいに抑えて、しつこく再利用していたのですが、
この頃使っているロットのは、４回位でもう濾液の方にモノがいくようになってしまった。
しかし、今年になってラボ移ったので、使っている遠心機のｇのかかり具合など
色々、違う点はあるのかも。
皆さん、何回くらいまでリユースしますか？
自分は、基本的には10回以下くらいに抑えて、しつこく再利用していたのですが、
この頃使っているロットのは、４回位でもう濾液の方にモノがいくようになってしまった。
しかし、今年になってラボ移ったので、使っている遠心機のｇのかかり具合など
色々、違う点はあるのかも。
145 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/10/20(土) 00:07:55
ちょっと、通りすがりの者ですが、↓のスレでコイルドメインを語ってもらえませんか。
http://ex21.2ch.net/test/read.cgi/anime/1192759419/
http://anime2.2ch.net/test/read.cgi/asaloon/1192032787/
http://ex21.2ch.net/test/read.cgi/anime/1192759419/
http://anime2.2ch.net/test/read.cgi/asaloon/1192032787/
146 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/10/20(土) 21:01:10
>>126
少なくともPyMOLでは出来る
少なくともPyMOLでは出来る
147 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/03(土) 02:12:14
はじめてなのでちょっと教えてください。
pGEXに目的遺伝子二つ（どちらも2kbぐらい）をつないでBL21で発現させています。
可溶性分画には来るようになったのですが、これをGSTrapカラムで精製すると
どちらの遺伝子産物もほとんど（百分の一以下）カラムに結合しません。
ちなみにGSTだけで行うとちゃんと発現もして精製できます。
こういうことは普通なのでしょうか？
コンフォーメーションの問題だとすると精製までやってみて培養条件を
検討しないといけないということなのでしょうか？
pGEXに目的遺伝子二つ（どちらも2kbぐらい）をつないでBL21で発現させています。
可溶性分画には来るようになったのですが、これをGSTrapカラムで精製すると
どちらの遺伝子産物もほとんど（百分の一以下）カラムに結合しません。
ちなみにGSTだけで行うとちゃんと発現もして精製できます。
こういうことは普通なのでしょうか？
コンフォーメーションの問題だとすると精製までやってみて培養条件を
検討しないといけないということなのでしょうか？
148 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/03(土) 02:35:07
>>147はGST融合タンパク質がグルタチオンカラムに結合しないという意味
なんでしょうか？だとしたら，融合させたタンパク質の立体障害の可能性が
ありますね。リンカーの長さを伸ばす必要があるかもしれません。
なんでしょうか？だとしたら，融合させたタンパク質の立体障害の可能性が
ありますね。リンカーの長さを伸ばす必要があるかもしれません。
149 ：147：2007/11/03(土) 02:36:46
マニュアルにあるDTTの添加、超音波の時間を短くするというのはやってみました。
コンストラクト自体のもんだいと考えています。
あとLysisの時にTweenをいれているのがコンフォーメーションがおかしくても
可溶化に来てしまう原因ということはありうるでしょうか？
コンストラクト自体のもんだいと考えています。
あとLysisの時にTweenをいれているのがコンフォーメーションがおかしくても
可溶化に来てしまう原因ということはありうるでしょうか？
150 ：147：2007/11/03(土) 02:40:42
148さまありがとうございます。
入れ違いになりました。
>>GST融合タンパク質がグルタチオンカラムに結合しないという意味
なんでしょうか？
そうです。リンカーですか。
2kbというのも長すぎるかとおもって途中のドメイン
1kbぐらいにしてやりなおしているところです。
入れ違いになりました。
>>GST融合タンパク質がグルタチオンカラムに結合しないという意味
なんでしょうか？
そうです。リンカーですか。
2kbというのも長すぎるかとおもって途中のドメイン
1kbぐらいにしてやりなおしているところです。
151 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/03(土) 12:59:52
時間が短くても超音波破砕はやめた方がいいと思う。
同じ条件でGSTのみ発現した場合はチェックしてみた？
同じ条件でGSTのみ発現した場合はチェックしてみた？
152 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/03(土) 15:24:25
>151 じゃあ菌体破砕の方法はどれがいい？リゾチウム？
153 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/03(土) 18:09:30
個人的にはフレンチプレスがオススメだけれど、フレンチプレスがないなら
Lysozyme＋DNaseでいいんじゃね？
最後におまじない程度に一瞬だけ超音波処理。
超音波処理のみで壊すのは変性してつかなかったことがあるから嫌い。
（超音波破砕って実験ごとの差をなくすのが難しくない？）
サンプルが少量ならPIERCEのB-PERで。
Lysozyme＋DNaseでいいんじゃね？
最後におまじない程度に一瞬だけ超音波処理。
超音波処理のみで壊すのは変性してつかなかったことがあるから嫌い。
（超音波破砕って実験ごとの差をなくすのが難しくない？）
サンプルが少量ならPIERCEのB-PERで。
154 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/03(土) 18:16:54
超音波で変成は嘘だろw
氷水の中で20秒音波、１０秒休みとか、あったまらないようにやればok
GSTの立体障害によるグルタチオンビーズへの吸着の問題は、「変成ー再生してもいい」なら
ビーズとタンパク質溶液を混ぜた状態でNaOHを入れてpH11ぐらいまで上げて変成させて、徐々にpHを
下げて再生する。
あるいは6M尿素で変成させて、希釈しながら巻き戻せば、かなりの割合でグルタチオンビーズに吸着する。
GSTが二量体を形成するから、融合タンパク質との立体的は配置でグルタチオンビーズにアクセスしずらいんでないか？
上の方法は「変成させてから、巻き戻してもいい」場合に限る
氷水の中で20秒音波、１０秒休みとか、あったまらないようにやればok
GSTの立体障害によるグルタチオンビーズへの吸着の問題は、「変成ー再生してもいい」なら
ビーズとタンパク質溶液を混ぜた状態でNaOHを入れてpH11ぐらいまで上げて変成させて、徐々にpHを
下げて再生する。
あるいは6M尿素で変成させて、希釈しながら巻き戻せば、かなりの割合でグルタチオンビーズに吸着する。
GSTが二量体を形成するから、融合タンパク質との立体的は配置でグルタチオンビーズにアクセスしずらいんでないか？
上の方法は「変成させてから、巻き戻してもいい」場合に限る
155 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/03(土) 18:22:10
>>35
＞三井住友海上火災保険株式会社（社長 江頭敏明）のグループ会社
である株式会社インターリスク総研（社長 海浪憲一）は、新型イ
ンフルエンザ・パンデミック対策の重要性を普及啓発する目的で、
新型インフルエンザに関連する製品・サービスを取り扱う企業１０社
（下記ご参照）と「新型インフルエンザ対策コンソーシアム」の設立
に関し、１０月３０日に合意しました。
活動においては、「国立感染症研究所ウイルス第三部」から様々なア
ドバイスを求めます。
＞三井住友海上火災保険株式会社（社長 江頭敏明）のグループ会社
である株式会社インターリスク総研（社長 海浪憲一）は、新型イ
ンフルエンザ・パンデミック対策の重要性を普及啓発する目的で、
新型インフルエンザに関連する製品・サービスを取り扱う企業１０社
（下記ご参照）と「新型インフルエンザ対策コンソーシアム」の設立
に関し、１０月３０日に合意しました。
活動においては、「国立感染症研究所ウイルス第三部」から様々なア
ドバイスを求めます。
156 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/03(土) 20:45:19
>153 フレンチプレスぐぐってみたら、コーヒーと筋トレばっかでワロタ。
たしかに超音波は熱と泡立ちが気になる。微妙な位置調整も難しいよね。触ってないのにチューブが割れたこともある…
たしかに超音波は熱と泡立ちが気になる。微妙な位置調整も難しいよね。触ってないのにチューブが割れたこともある…
157 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/04(日) 14:32:50
超音波のダイアルが高すぎるとか？
いつも４でやってるけど？
メーカーはフィッシャー
いつも４でやってるけど？
メーカーはフィッシャー
158 ：147：2007/11/04(日) 23:31:32
みなさまありがとうございました。
変性して巻き戻すというのはやってみようと思います。
変性して巻き戻すというのはやってみようと思います。
159 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/04(日) 23:37:21
160 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/05(月) 20:15:23
お世話になっております。タンパクGの○田です。
161 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/05(月) 22:32:36
>>159
本物を買おうとすると、高級車買えます。
本物を買おうとすると、高級車買えます。
162 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/05(月) 23:50:57
今気づいたが、このスレタイの
○-○-○-
ってのは、○がアミノ酸を表していて、
それがポリマー構造を形成するって意味なんだな。
まぁオリゴマー程度しかスレタイには入らないが、
がんばったんだな。>>1
○-○-○-
ってのは、○がアミノ酸を表していて、
それがポリマー構造を形成するって意味なんだな。
まぁオリゴマー程度しかスレタイには入らないが、
がんばったんだな。>>1
163 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/05(月) 23:51:02
一般的じゃないのかもしれないがこの業界でしらなかったらモグリだろ？？ｗｗｗ
164 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/06(火) 01:33:07
>163 発現メインじゃないうえに貧乏研究室なんで、サーセンwwwww
165 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/06(火) 04:39:04
だんごじゃあなかったんだ。
166 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/12(月) 19:45:51
わし、ガチで団子だと思ってた
167 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/01(土) 01:25:26
最近、Ｈｉｓタグ精製がうまくいかない。
今までと同じタンパクを精製しようとしているのに、
なぜか平衡化バッファーでのカラム洗浄の時点で、
タンパクが溶出してしまっている。
バッファーを作り直そうが、Ｎｉを充填し直そうがうまくいかない。
どなたかアドバイスお願いします。
今までと同じタンパクを精製しようとしているのに、
なぜか平衡化バッファーでのカラム洗浄の時点で、
タンパクが溶出してしまっている。
バッファーを作り直そうが、Ｎｉを充填し直そうがうまくいかない。
どなたかアドバイスお願いします。
168 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/01(土) 01:47:36
Hisタグ精製はpH感受性が高く，塩基性でないと結合が弱まります。
私でしたら，bufferを作る際のpHメーターの標準液の劣化，あるい
は故障の可能性を考え，pH試験紙でbufferのpHを再確認します。
私でしたら，bufferを作る際のpHメーターの標準液の劣化，あるい
は故障の可能性を考え，pH試験紙でbufferのpHを再確認します。
169 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/03(月) 10:52:21
>>168
なぜかプロフェッショナルを感じさせるものがある。
なぜかプロフェッショナルを感じさせるものがある。
170 ：167：2007/12/04(火) 01:09:48
>>168
ｐＨ試験紙にて確認しましたが、ｐＨの影響ではありませんでした。
上にもあるように、超音波破砕時の何かが原因かもしれないので、
探っていこうと思います。
上ででている(熱や酸化)以外にも、何か超音波破砕における注意点はありますか？
ｐＨ試験紙にて確認しましたが、ｐＨの影響ではありませんでした。
上にもあるように、超音波破砕時の何かが原因かもしれないので、
探っていこうと思います。
上ででている(熱や酸化)以外にも、何か超音波破砕における注意点はありますか？
171 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/04(火) 05:04:54
His-tagなら変性しててもつくから、超音波破砕は関係ないと思う。
172 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/04(火) 06:20:38
私は超音波破砕の感覚を体で覚えました。破砕・遠心後に
目的物の大半が可溶画分に来ていれば大丈夫だと思います。
他にHisタグ精製がうまく行かない理由としては，例えば
(1) 菌の量が多すぎて吸着bufferの緩衝能が追いつかない
(2) メーカーの製品のハズレlotをひいた
等が思いつきます。(1)はbufferによる希釈もしくは透析を
十分に行うことで回避できると思います。(2)はもしお金が
許せば他の競合製品を使うことで再現性が改善するかも
しれません。もしNi-NTAをお使いならば，より性能の良い
・Clontech社のTALON
・GEヘルスケア社のNi-SepharoseやHisTrap
などに乗り換えることをお奨めします。
目的物の大半が可溶画分に来ていれば大丈夫だと思います。
他にHisタグ精製がうまく行かない理由としては，例えば
(1) 菌の量が多すぎて吸着bufferの緩衝能が追いつかない
(2) メーカーの製品のハズレlotをひいた
等が思いつきます。(1)はbufferによる希釈もしくは透析を
十分に行うことで回避できると思います。(2)はもしお金が
許せば他の競合製品を使うことで再現性が改善するかも
しれません。もしNi-NTAをお使いならば，より性能の良い
・Clontech社のTALON
・GEヘルスケア社のNi-SepharoseやHisTrap
などに乗り換えることをお奨めします。
173 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/04(火) 12:35:10
174 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/06(木) 16:02:11
キアゲンのNi-agaroseが今のとこ一番のお気に入り。
GEのもつくけどノンスペが多い気がする。
GEのもつくけどノンスペが多い気がする。
175 ：167：2007/12/06(木) 23:48:57
いろいろなご意見ありがとうございます。
カラムは、GEのHisTrapを使ってます。
菌体量は、1mlのカラムに対して約1gを使用しています。
破砕時にタンパクが酸化しているのが原因ではと先輩から言われたので、
次回、精製前にDTTを多めに入れてみようと思います。
カラムは、GEのHisTrapを使ってます。
菌体量は、1mlのカラムに対して約1gを使用しています。
破砕時にタンパクが酸化しているのが原因ではと先輩から言われたので、
次回、精製前にDTTを多めに入れてみようと思います。
176 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 00:06:44
DTTを入れているのですか。結合しない理由はDTTを入れている
からかも知れませんね。DTTはNiレジンを壊しますから。また，
タンパク質の酸化がHisタグ精製に直接影響しているとは考えにく
いんですね。酸化条件でもHis残基には影響ありませんから。
いっそのこと還元剤にDTTを使うのをやめにして，1-5mMぐらいの
2-メルカプトエタノールを使ってみてはどうですか？
からかも知れませんね。DTTはNiレジンを壊しますから。また，
タンパク質の酸化がHisタグ精製に直接影響しているとは考えにく
いんですね。酸化条件でもHis残基には影響ありませんから。
いっそのこと還元剤にDTTを使うのをやめにして，1-5mMぐらいの
2-メルカプトエタノールを使ってみてはどうですか？
177 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 00:09:26
そうそう，目的物にCys残基がなければ，還元剤を入れる
必要すらありませんよ。
必要すらありませんよ。
178 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 01:04:34
DTTがレジンを壊すってとこ詳しく
179 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 01:27:15
SH基は金属と結合と結合し，金属の硫化物のようなものを作ります。
DTTにはSH基が2個あるので，効果も相乗的に現れます。
試しにNiイオンの溶液にDTT溶液を加えてごらんなさい。真っ黒な
沈殿を作りますから。
HisTrapはDTT耐性があるとされていますが，それはあくまでも低濃度
DTTに対してでありまして，高濃度DTTを加えるとカラムは茶色っぽく
なり，アフィニティカラムとしての能力を失うことでしょう。
DTTにはSH基が2個あるので，効果も相乗的に現れます。
試しにNiイオンの溶液にDTT溶液を加えてごらんなさい。真っ黒な
沈殿を作りますから。
HisTrapはDTT耐性があるとされていますが，それはあくまでも低濃度
DTTに対してでありまして，高濃度DTTを加えるとカラムは茶色っぽく
なり，アフィニティカラムとしての能力を失うことでしょう。
180 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 01:32:06
なるほど，それなら2-MEでも硫化しそうなんだけど．
181 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 01:35:01
182 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 01:38:12
ああそうだ。
むかし，カラムの平衡化には還元剤を入れないbufferを使って，
サンプル吸着のときだけサンプルに還元剤を加えるという技を
使っていた気がしてきた。
むかし，カラムの平衡化には還元剤を入れないbufferを使って，
サンプル吸着のときだけサンプルに還元剤を加えるという技を
使っていた気がしてきた。
183 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 01:39:24
これからは気をつけてみます．
ご丁寧にありがとうございました．
ご丁寧にありがとうございました．
184 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 02:16:20
取り説くらい読もうな
185 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 08:04:45
精製タンパクは結晶化する上で、何日ほど保つのでしょうか・・・？
タンパクによって様々なのは承知ですが、参考としてお聞かせ願いたいです。
タンパクによって様々なのは承知ですが、参考としてお聞かせ願いたいです。
186 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 09:08:25
DTTはよくあるミステイクだね。
187 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/07(金) 10:03:28
GST融合タンパク質精製をルーチンにやっていて、Hisx6タグのときもEDTA入り破砕緩衝液で
やっちまったことがある、、、、、orz
やっちまったことがある、、、、、orz
188 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/05(水) 22:32:32
タンパクって等電点付近で溶解度下がるよな？
今結晶化やってるんだが、やっぱ等電点付近で結晶って出やすいもんなのかな？
今結晶化やってるんだが、やっぱ等電点付近で結晶って出やすいもんなのかな？
189 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/05(水) 23:51:33
等電点かどうかに関わらず結晶化はpH依存性が大きいからな…
190 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/06(木) 10:20:10
191 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/06(木) 20:24:50
リゾチームは塩基性タンパク質だけど，酸性でも中性付近でも
容易に結晶化するね。簡単な法則はなさそうな気がする。
容易に結晶化するね。簡単な法則はなさそうな気がする。
192 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/06(木) 21:18:44
そのタンパクによりけりって感じだよな〜
ほんと個性豊かで困るわ･･･
ほんと個性豊かで困るわ･･･
193 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/11/14(金) 10:41:19
救出
194 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/11/26(水) 11:38:26
誰かが見ていることを祈りつつ質問・・・
今あるタンパク質（RNA結合関係）の精製をやってるんだけど、どうやら精製したタンパクが
RNaseをコンタミしているみたいでRNAがｶﾞﾝｶﾞﾝ分解している状況にいます。
なんとかRNaseフリーの精製タンパクが欲しいんだけど、どうやったらかなりの純度で得られ
でしょうか？タンパク精製方法はHisタグ融合タンパクでアフィニティーカラムしてやってます。
タンパク分子量は約100k。30kのカラムで分画してみたけれどそれでもRNAは分解。
どなたかRNA関連タンパクの精製をしたことがある人でRNaseフリータンパクの得方を知って
いる人アドバイスお願いします。
今あるタンパク質（RNA結合関係）の精製をやってるんだけど、どうやら精製したタンパクが
RNaseをコンタミしているみたいでRNAがｶﾞﾝｶﾞﾝ分解している状況にいます。
なんとかRNaseフリーの精製タンパクが欲しいんだけど、どうやったらかなりの純度で得られ
でしょうか？タンパク精製方法はHisタグ融合タンパクでアフィニティーカラムしてやってます。
タンパク分子量は約100k。30kのカラムで分画してみたけれどそれでもRNAは分解。
どなたかRNA関連タンパクの精製をしたことがある人でRNaseフリータンパクの得方を知って
いる人アドバイスお願いします。
195 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/11/26(水) 20:48:36
196 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/11/26(水) 21:28:50
>>194
(1) His tagがプロテアーゼで切り取れるのなら，切り取ったあともう一度アフィニティ
精製すれば相当綺麗になるよ。目的物が素通り画分にきて，残りがカラムに残る。
(2) RNase inhibitorを精製中や精製後に入れるのも効果があるよ。TOYOBO社の
SIN-101とかSIN-201とか。
(3) RNase活性はEDTAで抑えられることがあるよ。大抵は活性にMgが必要だから。
(4) pHが高め(pH 8<ぐらい)だとRNAが自発的に分解することがあるよ。
(5) 目的物自体がRNaseである可能性も頭の片隅に残しておいて損はないよ。
(1) His tagがプロテアーゼで切り取れるのなら，切り取ったあともう一度アフィニティ
精製すれば相当綺麗になるよ。目的物が素通り画分にきて，残りがカラムに残る。
(2) RNase inhibitorを精製中や精製後に入れるのも効果があるよ。TOYOBO社の
SIN-101とかSIN-201とか。
(3) RNase活性はEDTAで抑えられることがあるよ。大抵は活性にMgが必要だから。
(4) pHが高め(pH 8<ぐらい)だとRNAが自発的に分解することがあるよ。
(5) 目的物自体がRNaseである可能性も頭の片隅に残しておいて損はないよ。
197 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/11/28(金) 04:12:01
>195-196
ﾚｽｻﾝｸｽ。とりあえずRNaseインヒビターやらEDTA添加とかでは改善されなかったので、
もしかしたら精製度が足りないのかもしれません。もしくは不明たんぱくの混入？
次はイオン交換とかを検討してみます。
ﾚｽｻﾝｸｽ。とりあえずRNaseインヒビターやらEDTA添加とかでは改善されなかったので、
もしかしたら精製度が足りないのかもしれません。もしくは不明たんぱくの混入？
次はイオン交換とかを検討してみます。
198 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/12/19(金) 11:10:36
質問です。
ウェスタンブロットのウェット式ブロッティングのことで質問があります。
目的のタンパク質は450kなのですが、時間や電圧、電流はどの値がいいのでしょうか？
装置の説明書には1時間、100V、350mAと書いていました。
ウェスタンブロットのウェット式ブロッティングのことで質問があります。
目的のタンパク質は450kなのですが、時間や電圧、電流はどの値がいいのでしょうか？
装置の説明書には1時間、100V、350mAと書いていました。
199 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/12/19(金) 13:08:18
一本のポリペプチドが450kDaってありえなくね？
200 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/12/19(金) 13:32:35
201 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/12/19(金) 13:40:10
>200
おまえ丁寧な馬鹿な。そういうのホントたちが悪いのよな。
おまえの調べたのは平均質量であって、分子量じゃないのな。しかもおからの分解物な。
おまえ丁寧な馬鹿な。そういうのホントたちが悪いのよな。
おまえの調べたのは平均質量であって、分子量じゃないのな。しかもおからの分解物な。
202 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/12/19(金) 14:40:04
203 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/12/19(金) 14:54:49
じゃあとりあえず、250 mAでオーバーナイトやっとけ、間違いない。俺やってるから。おんなじくらいのタンパク質。
204 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/12/19(金) 16:49:23
205 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/12/20(土) 00:17:54
プロトコルも糞もないやろ、こんなもん。コンスタントカレント250 mA、4度で夕方から次の朝まで、別に24時間やろうが48時間やろうがそんだけでかけりゃもんだいないわな。
206 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/12/20(土) 06:19:07
400kオーバー、たいへんですよね。ゲル薄いから破かないようにね。
Dystrophin, AKAP450, ApoB-100あたりの論文が参考になるのでは？
むかしむかーし、私がAdenomatous polyposis coli（300kくらい？）の
ウェスタンやった時は、サザンやノーザンみたいなプロトコルだったかも。
Dystrophin, AKAP450, ApoB-100あたりの論文が参考になるのでは？
むかしむかーし、私がAdenomatous polyposis coli（300kくらい？）の
ウェスタンやった時は、サザンやノーザンみたいなプロトコルだったかも。
207 ：名無しゲノムのクローンさん：2009/07/30(木) 23:29:36
たんぱく質 無駄にしてしまった。。。
208 ：名無しゲノムのクローンさん：2009/08/29(土) 14:42:01
オナニー乙
『蛋白質 核酸 酵素』 休刊のお知らせ
http://gimpo.2ch.net/test/read.cgi/scienceplus/1260214752/
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