タンパク質の精製２
938 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 21:33:03
へたくそ、うまくいくまで繰り返せ
939 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 21:38:26
>937
サンプルに10mMイミダゾール入れとくんだよ。それからカラムの平衡化はちゃんとやってるの？
Ni-NTA→イオン交換が定石だが....誰か経験者に見てもらわんと失敗するだろうなぁ。
サンプルに10mMイミダゾール入れとくんだよ。それからカラムの平衡化はちゃんとやってるの？
Ni-NTA→イオン交換が定石だが....誰か経験者に見てもらわんと失敗するだろうなぁ。
940 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 21:43:50
いやさ、そのくらいは分かってるつもりなんだけどな。
イミダゾール抜きの条件でNi-NTAにロードしたらノンスペのバンドが
出たもんだから、おまじないだと思って入れたのよ。そしたら急に
目的のバンドも結合が下がった。6xHisってその程度の濃度のイミダ
ゾールで競合されちゃうの？それとも末端削れてHis-tagが短いとか？
イミダゾール抜きの条件でNi-NTAにロードしたらノンスペのバンドが
出たもんだから、おまじないだと思って入れたのよ。そしたら急に
目的のバンドも結合が下がった。6xHisってその程度の濃度のイミダ
ゾールで競合されちゃうの？それとも末端削れてHis-tagが短いとか？
941 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/04 21:47:39
経験上5mMイミダゾールでHis6が落ちたことないなぁ。
N末端のフォールディング次第だろうけどNi-NTA→イオン交換でやったほうが早いんじゃネーノ?
N末端のフォールディング次第だろうけどNi-NTA→イオン交換でやったほうが早いんじゃネーノ?
942 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/06 20:21:40
ジョーカー ：よくタンパクの精製なんてやってられるな
./ ;ヽ
l ＿,,,,,,,,＿,;;;;i ＜簡単さ！
l l''|~___;;､_y__ lﾐ;l His tagがついてるからな！
ﾞl;| | `'",;_,i`'"|;i |
,r''i ヽ, '~rーj`c=/
,／ ヽ ヽ`ｰ"/:: `ヽ
/ ﾞヽ ￣､::::: ﾞl, ホント 精製は地獄だぜ！ フゥハハハーハァー
|;/"⌒ヽ, ＼ ヽ: _l＿ ri ri
l l ヽr‐─ヽ＿|_⊂////;`ゞ--―─-r| | / |
ﾞlﾞl, l,|｀ﾞﾞﾞ''―ll＿__l,,l,|,iﾉ二二二二│｀""""""""""""|二;;二二;;二二二i≡二三三l
| ヽ ヽ _|＿ ＿ "l￣￣￣￣￣￣ |二;;二二;;二='''''''''''￣ﾉ
/"ヽ 'j＿／ヽヽ,￣ ,,,/"''''''''''''⊃r‐l'二二二T￣￣￣ ［iﾞ''''''''''''''''"ﾞﾞﾞ￣`"
／ ヽ ー──''''''""(;;) ｀ﾞ,j" | | |
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943 ：& ◆HsAdOdHy/I ：04/12/08 23:29:07
基本的な質問なんだけど、
SDS−PAGEで分離した後、WesternBlotして、
その後、ゲルをクマシーなんかで分離することはできるの？
SDS−PAGEで分離した後、WesternBlotして、
その後、ゲルをクマシーなんかで分離することはできるの？
944 ：いえい！：04/12/08 23:31:18
タンパク質化学式教えて（ ´,_ゝ｀）
945 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 00:44:01
Hisx6タグ付タンパク質が旨く精製されない場合、立体障害でNiカラムに
付かない可能性がある。その場合、六M尿素もしくは６Mグアニジン塩酸で変性した条件でカラムにかけるとよく吸着する場合がある。
付かない可能性がある。その場合、六M尿素もしくは６Mグアニジン塩酸で変性した条件でカラムにかけるとよく吸着する場合がある。
946 ：943：04/12/09 02:48:50
947 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 03:07:28
948 ：名無しゲノムのクローンさん ：04/12/09 05:03:37
＞＞９４６ 申し訳ない書き間違えました。クマしーで
染色することはできるのという質問でした。
勘違いが会ったら教えて欲しいんだけど、
くましって全部のタンパクに染色するんだよね。
一方ウエスタンは固定化した抗体にだけくっつくので、
ウエスタンで見えないバンドはクマシーで見るのだと思った。
SDS−パゲで分離 ウエスタンで膜にトランスファーしてみる
SDS−パげで分離 ゲルを染色してバンドをみる
の２通りがあるんだよね。
染色することはできるのという質問でした。
勘違いが会ったら教えて欲しいんだけど、
くましって全部のタンパクに染色するんだよね。
一方ウエスタンは固定化した抗体にだけくっつくので、
ウエスタンで見えないバンドはクマシーで見るのだと思った。
SDS−パゲで分離 ウエスタンで膜にトランスファーしてみる
SDS−パげで分離 ゲルを染色してバンドをみる
の２通りがあるんだよね。
949 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 05:45:37
950 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 11:09:10
>>943
ウェスたんでみえないバンドはどんなのがあるのかしりたいと。
1.同じサンプルを普通にPAGEして普通に銀戦
2.ブロットされたモノで抗体によって染まらないのを見たいとすると
蛋白量がシングルバンドで100ngを下回るときは銀戦上回ればクマシー
でどうでしょう。
ウェスたんでみえないバンドはどんなのがあるのかしりたいと。
1.同じサンプルを普通にPAGEして普通に銀戦
2.ブロットされたモノで抗体によって染まらないのを見たいとすると
蛋白量がシングルバンドで100ngを下回るときは銀戦上回ればクマシー
でどうでしょう。
951 ：943：04/12/09 14:09:27
>>949,950
ありがとうございます。
よく考えたらウエスタンしたときに
タンパク質は膜に移動して、アクリルアミドゲル
にはもはや残っていないんだね。
よく知らないのでわかりづらくなって悪かったべ。
ありがとうございます。
よく考えたらウエスタンしたときに
タンパク質は膜に移動して、アクリルアミドゲル
にはもはや残っていないんだね。
よく知らないのでわかりづらくなって悪かったべ。
952 ：名無しタンアパク質のリコンビナントさん：04/12/09 14:58:51
トランスファーがどれぐらいの効率で行ってるか気になって、トランスファー後のゲルを染めることもあるな。
953 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 15:08:53
ここも自演スレかｗ
954 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 15:32:49
どこが自演なのか皆目検討つかんが。
一匹、二匹、ちょっと抜けたヤツがいて、みんなでわいわいやっているだけでしょう。
一匹、二匹、ちょっと抜けたヤツがいて、みんなでわいわいやっているだけでしょう。
955 ：M1：04/12/10 00:24:54
明日Hi-Five買うから勉強しといてって教授に言われたんですが経験が少なくて...メーカーのプロトコールに載っていなくて初心者が失敗しやすい点があったら教えていただけないでしょうか？教授が気性が荒いので失敗は許されないんです。
956 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/10 18:44:16
ひぇ〜。
XL-1Blueで発現させたらWBで1本しかバンドでないのに、
BL21に入れたら2本になった。
XL-1Blueで発現させたらWBで1本しかバンドでないのに、
BL21に入れたら2本になった。
957 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/11 22:42:41
ミリポア社のMatrex Red Aについて教えて下さい。
現在、調べたところこの樹脂は、アフィニティーに分類され、樹脂の構造まで分かりました。
が、何の要因で吸着するのか？（何を特異的に吸着しているのか？）が全く分かりません。
どんな情報でもいいので、知っている方がおられましたら、書き込みをよろしくお願いします。
現在、調べたところこの樹脂は、アフィニティーに分類され、樹脂の構造まで分かりました。
が、何の要因で吸着するのか？（何を特異的に吸着しているのか？）が全く分かりません。
どんな情報でもいいので、知っている方がおられましたら、書き込みをよろしくお願いします。
958 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/12 01:48:55
>>957クマしー吸着
959 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/12 17:54:56
クマしー吸着って何ですか？
今日、図書館行っても分かりませんでした。
ネットでもゼロ件でしたし。
今日、図書館行っても分かりませんでした。
ネットでもゼロ件でしたし。
960 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 09:20:46
現在、GST融合タンパク質の精製を行なっています。
Thtombinで切断後、BenzamidineによりThrombin除去を行ないましたが目的タンパク質もBenzamidineに結合してしまいました。
切断後にSDS-PAGEにより目的タンパク質は確認しているので、Thrombin除去に問題があると考えております。
そこで、Benzamidine以外でのThrombin除去の方法をお教えいただけないでしょうか？
Thtombinで切断後、BenzamidineによりThrombin除去を行ないましたが目的タンパク質もBenzamidineに結合してしまいました。
切断後にSDS-PAGEにより目的タンパク質は確認しているので、Thrombin除去に問題があると考えております。
そこで、Benzamidine以外でのThrombin除去の方法をお教えいただけないでしょうか？
961 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 13:52:04
だれにも聞けないのでどなたかお答え下さいm(_ _)m
lysyl endopeptidaseであるペプチドを切断するのですが
そのペプチドの試料とlysyl endopeptidaseのモル比が１：１００
になるように加えたあと。。。
と書いてあります。モル比ということはどういうことでしょうか？
またその求め方をどなたかおしえてください。
lysyl endopeptidaseであるペプチドを切断するのですが
そのペプチドの試料とlysyl endopeptidaseのモル比が１：１００
になるように加えたあと。。。
と書いてあります。モル比ということはどういうことでしょうか？
またその求め方をどなたかおしえてください。
962 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 14:20:37
モル計算知らないわけじゃないよね?
参考
モル数＝試薬の重さ／分子量
モル比＝試薬１の重さ／試薬１の分子量 ： 試薬２の重さ／試薬2の分子量
ところで試料とモル比１：１００じゃなくて１００：１じゃないの？
参考
モル数＝試薬の重さ／分子量
モル比＝試薬１の重さ／試薬１の分子量 ： 試薬２の重さ／試薬2の分子量
ところで試料とモル比１：１００じゃなくて１００：１じゃないの？
963 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 15:39:56
964 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 15:41:51
GST-fusionのことはくわしくないけど、ゲル濾過やイオン交換ではだめなんかい？
965 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 16:24:10
966 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 10:03:43
967 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 19:38:41
>>960
タグ無しで発現-->Benzamidineで精製
タグ無しで発現-->Benzamidineで精製
968 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 20:11:34
>967
それでいいと思う。
ただし、カラム内でアグっているのをBenzamidineにくっついてると勘違いしていたら
あとは言うまい。
それでいいと思う。
ただし、カラム内でアグっているのをBenzamidineにくっついてると勘違いしていたら
あとは言うまい。
969 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 21:57:55
俺ならイオン交換一発
酵素の微量な残りも気にならないし。
酵素の微量な残りも気にならないし。
970 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 11:52:35
967
タグ無しだと、目的タンパク質が活性を持たないのでだめなんですよ。
だから、GST fusionでやっているんですよね。。
968
8M Ureaで溶出を行なったら、目的タンパク質とThrombinがようしゅつされましたので、アグっている訳ではないとおもいますよ
タグ無しだと、目的タンパク質が活性を持たないのでだめなんですよ。
だから、GST fusionでやっているんですよね。。
968
8M Ureaで溶出を行なったら、目的タンパク質とThrombinがようしゅつされましたので、アグっている訳ではないとおもいますよ
971 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 19:05:11
972 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 19:54:53
>>960 = >>970
968さんのため息が・・・
タグ無しで活性ないなんて…アグってるんでしょ、その段階で。
GSTつけて活性出るの…ナニユエそれを切り捨てちゃう？
ureaで溶出…変性すればアグってても溶け出てきますよ。
aminobenzamidineとかでやってください・・・
968さんのため息が・・・
タグ無しで活性ないなんて…アグってるんでしょ、その段階で。
GSTつけて活性出るの…ナニユエそれを切り捨てちゃう？
ureaで溶出…変性すればアグってても溶け出てきますよ。
aminobenzamidineとかでやってください・・・
973 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 21:05:44
974 ：961：04/12/18 22:21:03
>>962さん>>963さん
私はB2のアホ学生です。
お返事ありがとうございます。
ラボの何人かに聞きましたが、「Lys-Cの分子量がわからないから」
ということで現在必死にしらべております。
wakoのカタログには２AUと力価しか書いておりませんでした
どなたかLys-Cの分子量を教えてくださいm(_ _)m
私はB2のアホ学生です。
お返事ありがとうございます。
ラボの何人かに聞きましたが、「Lys-Cの分子量がわからないから」
ということで現在必死にしらべております。
wakoのカタログには２AUと力価しか書いておりませんでした
どなたかLys-Cの分子量を教えてくださいm(_ _)m
975 ：968：04/12/18 22:43:42
>972
フォローありがと。
960は何をしたいのかわからんのだが・・・
活性云々抜きでタグ切りたいってことは構造解析か？
GSTならpGEX6Pのほうにのっけて、Prescissionプロテアーゼがベストだと思うが。
それならプロテアーゼがGST融合だからカラム一本だべさ。
フォローありがと。
960は何をしたいのかわからんのだが・・・
活性云々抜きでタグ切りたいってことは構造解析か？
GSTならpGEX6Pのほうにのっけて、Prescissionプロテアーゼがベストだと思うが。
それならプロテアーゼがGST融合だからカラム一本だべさ。
976 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 22:47:11
wako のプロダクトインフォにかいてあるぢゃん
>>976
どこでしょうか・・みつかりません・・
どこでしょうか・・みつかりません・・
978 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/21 10:00:08
>960
この間のフナコシニュースにビオチン化トロンビンというのが載っていたけど・・・
アビジンビーズでトロンビンが除けるとかいうやつ。
この間のフナコシニュースにビオチン化トロンビンというのが載っていたけど・・・
アビジンビーズでトロンビンが除けるとかいうやつ。
979 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 03:41:51
すれ違いかもしれんが・・
エリスロポエチンとGCSFの等電点っていくらだったっけ？？
エリスロポエチンとGCSFの等電点っていくらだったっけ？？
980 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/26 11:38:51
すごく基本的なんですが…
硫安沈殿で沈殿した奴は透析で100%溶けますか？
液量少なくしたいから、できるだけ透析はしたくナインだけど、酸でもアルカリでも
溶けないんだ…
硫安沈殿で沈殿した奴は透析で100%溶けますか？
液量少なくしたいから、できるだけ透析はしたくナインだけど、酸でもアルカリでも
溶けないんだ…
981 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/26 13:12:20
硫安で沈殿したタンパク質って水とか塩無しのバッファを少し入れれば溶けるでしょ。
硫安沈殿の原理から考えれば。
硫安沈殿の原理から考えれば。
982 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/26 22:37:59
沈殿・・・100%は溶けないな・・・(;´_ゝ｀)
透析しても、溶けない奴はあるね。
透析しても、溶けない奴はあるね。
983 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/27 01:42:54
変性モードだから・・・
アセトン沈殿がよくね？
アセトン沈殿がよくね？
984 ：980：04/12/27 09:37:50
>透析しても、溶けない奴はあるね
やっぱり…
ありがとうございます。またいろいろ試してみます。
やっぱり…
ありがとうございます。またいろいろ試してみます。
985 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/27 09:53:33
六ﾓﾙ尿素で溶かして透析しる
986 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/27 11:48:26
変性させてどうするんだ。
変性させないところが硫安沈殿のいいところだと思っていたのだが。
溶けない部分って本当に必要なものなのか？
硫安を抜いて再溶解して来た部分だけを使う、溶けない部分は使わないでは行けないのか？
全然溶けないっていうんなら、話は別だけど。
変性させないところが硫安沈殿のいいところだと思っていたのだが。
溶けない部分って本当に必要なものなのか？
硫安を抜いて再溶解して来た部分だけを使う、溶けない部分は使わないでは行けないのか？
全然溶けないっていうんなら、話は別だけど。
987 ：980：
>>986
結局それでＯＫでした。
結局それでＯＫでした。