●●極上protocol集●●

ミニプレから構造解析まで試行錯誤を重ねた末に完成した
極上プロトコル集を書き連ねていくスレ。

あなたの実験のお供にぜひどうぞ。

分野違いの実験のは欲しいな。
いつか役に立つかもしれないから。

バイオ実験イラストレイテッドのように
注意点を書いてくれるとなおうれし。

重複にもほどがあるぜ

　　「実験の裏技ありますか？？」２　　　
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/996490423/l50

実験のこだわりをかたるスレ
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1024759626/l50

コロニーから直接プラスミド調整

>>3, >>4
漏れにはこのスレの目指す方向性は違うと思われ

>>5
どのくらいの量とるかとか、それをやると収量がどうとか
書いてあげると親切

とりあえず1は4とタンパク精製ｽﾚからこれは、というものを拾ってきてください

はいわかりますた

>>1
拾ってこなくて良いから削除以来出してきた方がいいですよ。ココ

良スレの羊羹

朝　plasmid入り大腸菌をLB（アンピシリン入）で培養開始

次　プラスミドを入れるyeastをYPDで培養開始（多めに入れる）

３　LBが濁ってきたらyeastのLiAc処理開始

４　処理中にminiprep

５　plasmidを加えてtransformation終了

＊transformantsを得るだけならこれでいける
　　

次回の激ウマプロトコールはGFPでみる目的タンパク質の局在

次回っていつだYO

禿道

12さん。よろしくおながいします。

E.coliを使った組み換えタンパク発現についての
極上プロトコールおせーて

＞１６
まずはベクターの選択
目をつぶってInvitrogenのカタログをぺらぺらめくって適当な
ところで止めよ。それを購入
次、こんすとらくと作り
適当に制限酵サイトを入れた目的タンパク質のcDNAを
作る。それをさっき購入したベクターligationだ。
発現
今作ったベクターを適当なE. coliにTFして、IPTGつっこんで終わりだ。
大腸菌回収して電気泳動してみよう。
君のほしかったものがたっぷりとinclusion bodyにあるだろう？（ｗ
最後に巻き戻し
適当な巻き戻しバッファーで一週間ぐらいほっておけ。
ほーら、活性が表れただろう？
終わり

＞１７　タダでもらえる適当なE. coliおせーて

けつの穴に指突っ込んで培地にこすりつけて分離しろよ

http://petitmomo.com/mm/
ここがちょっぴりエッチ系のめぐが運営している出会いサイトです。
もしよかったら使ってみて、、、
ヨロシクです。

めぐ(^o^)-☆

タンパク質の精製スレって凄いな
２ちゃんねるで一番使えるスレなんじゃなかろうか

>>21
タンパク質の精製２
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1039524190/
に移行よろしくお願いします。

あれこそ良スレ。

あ！カキコしようと思ったらプロトコール持ってくるの
忘れてた・・・逝ってきます

figure捏造これ極上。

真面目におながいしまつ

おなごを口説く極上プロトコルきぼん！

場数をふめ！

場数はどうふめまつか？

今から渋谷か新宿へ逝け

逝きますたが「キモい」と言われて蹴られますた・・・

>>31　をまいじゃ当然だ罠

メソッド本からの抜粋カキコスレにしよーよ

stepの作り方が知りたいのかね。それともgradient?

stepは、

まず濃いめAAのlower gel mixに5-15%くらいのGlycerolを入れて、
組み立てたゲル版に注ぐ。すぐに通常のseparation gel mixを
注ぐ。適当に混ざって境目がなだらかになる。後は普通に。

Tipsとしては、TEMEDをかなり控え目にすること。すぐ固まると
むらが出来る。重合開始を遅くして、重いlowerが水平になる
時間を稼ぐ。目安としては通常の半分-1/4くらいで試してみては？

あと、どちらかのgel mixにBPBを少しだけ足してうっすら色を
付けておく。成功したかどうかが目で確認できるように。

ゲル溶液はゲル版の真ん中から注ぐこと。端を使うとうまくできないよ。
Glycerolの濃度はゲルの厚さやなにやらで適当な量が変わってくるから、
試行錯誤だな。

mixの温度や脱気は気にする必要ないよ。普通に。
BPBは入れすぎると泳動を乱すから、控え目にね。
stepが通じるかどうか・・・。うーん。正確には、この手のゲルは
step gradient gelと言うんだが、漏れの周りならアメ人にもstepで通じる。
けど、通じないとこもあるかもね。

さて、普通のgradient gelだけど、これもperistaとか複雑な装置は
使わなくて出来るよ。

まず、lowerとupperのgel mixを用意する。lowerには例によって
20%のglycerolを加えておく。どちらかにBPBで薄く色をつける。
どちらにつけるかは大した問題ではない。

次に、ゲル一枚分のlowerとupperを、正確に量り取り、TEMEDを加えて
混ぜる。例によってTEMEDは控え目に。

適当な大きさのシリンジに、18Gか21Gくらいの針をつけ、upper、lower
の順でそっと吸い上げる。界面を乱さないように、そっと。

全部吸い上げたら、そのままシリンジを引いて、中に気泡を入れる。
気泡が界面をかき混ぜて、きれいなgradientが出来る。気泡は10個
弱かな。適当に好みで調整。このとき、引き込む気泡の数を覚えて
おいて一定にすると、再現性の良いゲルが出来る。

さらに、シリンジを45度に傾けて一回転し、なじませる。

そのまま、そっとゲル板の中央から流し込む。シリンジを垂直に
保つこと。注射針をガラスプレートに沿わせると良い。

あとはアルコールを重層して、待つのみ。複数枚作るなら繰り返す。

peristaとgradient makerを使わないので完全なlinearではないけど、
使用上大した問題ではない。実にきれいに流れるよ。ゲルを染色する
場合は、固定前に5分ほど純水でゲルを洗ってglycerolを抜いておくと
よい。ウエスタンならそのまま何の問題もなく転写できる。

Tipsはstepの時と同じ。TEMEDの量は重要。重合開始に10分くらいは
かかるように減らしておく。但し、30分もすれば完全に固まって
ほしいものだね。

> TEMEDの量って固まる速さを決める役割なんですか？
> TEMED入れる理由はそれ？
> たくさん入れても少なく入れてもできたゲルは同じです？

同じです。APSとTEMEDは重合開始剤として働くのよ。TEMEDの
量が少ないと、開始反応が少なくなり、必然的に重合時間が伸びる。

出来上がったゲルの固さはAAとbis-AAの濃度にのみ依存。

つか、その手の本見れ。
原理もしらんで実験してるとそのうち痛い目見るぞ。

ウエスたん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1001508029/351-366n

361 ：340 ：03/01/07 00:03
喜んで貰えてなにより。長文書いた甲斐がありました。

>357
極上プロトコールってしらんけど、２ちゃんに上げた時点で
転載自由と理解してるから、どこへなり載せて貰っていいよ。
ただこれはラボプロトコルじゃなくて漏れのoriginalなので
もし良かったら出典を、340@ウエスたん准とでもしておいて
貰えるとうれしいが。

>359
電気泳動准に書いた方が良かったかもね。今電気抵抗で盛り上
がってるようだが。まあ良かったら試してみて下さい。
市販の馬鹿高いの買う気がしなくなるから。

↑（・∀・）ｲｲ!!
試して見よっと。340@ウエスたんさん、サンクスコ。
転載してくれた人もサンクスコ。

ようやくスレの目的に合ってきたな。
俺も探してこよーっと。

騙された

◆◇◆◇◆最新情報◆◇◆◇◆
http://yahooo.s2.x-beat.com/linkvp/linkvp.html

>42
What do you mean?
グラジエントなら漏れはうまくできたよ。感謝感謝。

何人の貧乏研究室のオバカサンが騙されるかな

何人の貧乏研究室のオバカサンが◇◆最新情報◆◇に騙されるかな

俺はうまくできたぞ。自分の腕が悪いのを手法のせいにするなよ。

グリセロール入れて固まるわけねーだろ！

最新情報に騙された人じゃなくて、成書にあるグラジエントのプロトコールを読んだことのない人のようです。

48は本気でバカなのかな。
無知蒙昧にも程がある。

良スレ候補age

他人にプロトコールを親切に教える人が少ない一つの理由として、いい加減に真似をして失敗しただけなのに
教えた側のせいにする奴がいる、ということが挙げられる。
勝手を知った人間に対面で教えている場合はともかく、不特定多数に向けて知らせるような場合はなおさらだ。
そして失敗した側のレベルが低いほど、教えた者の与り知らぬところで陰口として広めようとする傾向もある。
そういう陰口が表に引き出され、反論される機会を与えられたという点で、匿名掲示板でこのようなトピックの
話をする意義があるのではないか。
もちろん教えた側が間違えている場合もあるわけで。

>>52を要約すると>>47

でも丁寧に教えてくれる（方が多い）この板が好き・・・

PCR-based epitope tagging method

restriction site=RS　vectorの都合に合わせて選択
target sequence=TS　目的の遺伝子の全長または部分配列

5'-[RS]-ATG-TACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT-[TS]-3'
5'-[RS]-[stop codon*]-[TS]-3'

*任意のstop codonを選択

これでPCRするとHA-tagをつけられるよ。
上の配列をテンプレートにしてコピペすると便利。

Anti-HA(12CA5)抗体で検出できます。

逆にC-teminusにHA-tagをつけたい時は上記の要領で
HA sequenceをtarget sequenceの3'側につけるだけだよ。
その時はHA sequenceを逆にしないとダメだよ。

ではお試しあれ。

目から鱗でつ(T_T)↑

100 mM 2-ME, 2 % SDS, 62.5 mM Tris (pH 6.7) で50℃、30分インキュベート。（70℃まで上げてもよい）
↓
wash (PBS-T or TBS-T)
↓
ブロッキング

>>55
kozakなしでいけますか？

いけます

kozakって大方ベクターにはいってないでつか？

ベクターに付加するものがあらかじめある時はね。

（＾＾）

いまのところ・・

1 day transformation (for yeast)
Step & gradient gel
PCR-based epitope tagging method
Membrane striping

の４つが登録されています。
これから何個集まるか分かりませんが
>>１が責任を持って編集し冊子にして
今年の分生でｺｿｰﾘ配布します。

>>55
teminus->terminus

引っ掛かりたいやつはひっかかればいいさ

>>63
マジでやるんだろうな？w

>>48とかの指導をしている（していた）人の徒労が偲ばれる

>>68
思いこみだけでデータを作ってる可能性もあるよねw

ほんとだ
思いこみだけでレスをしてる可能性もあるよねｗ

>>48は、まじめに実験してなかったんだろ(w
ファル○シ○か何かの、グラディエントゲル作成キット
取り説にグリセロール添加は書いてあったんだけどね〜

>>70
具体的なソースを希望

>>71
グリセロール入れるレシピは"バイオ実験イラストレイテッド"の5巻にも出てるよ。

69は68の間違いを指摘しているのれすか？

>>73
ワロタ

実験全体を高速化するコツが知りたい

大勢でやる

使わない時でも遠心機には空のチューブを入れて回しておく。

そうすると他の奴とカブらず自分が専有できる

賢い･･･ツーかなんてわがまま。

な、賢いだろ。ﾜﾗ

ついでにゲル枠も予め組み立てておくといい。

ここって極道protocol集だっけ？

他人が使ってる遠心機は止めてでも自分の試料を遠心する。
ほかの機械についても同様。

教授に怒られたら、
「こんなやつの実験より俺の実験のほうが重要だから当然だ」
と答える。

この勢いで仕事したらノーベル賞がもらえる。

でも、考え無しのムダな実験ばっかで何年も何もデータの出ないヤツと、機械の予約がかち合ったりしたときって…

考えなしのヤツが勝つものだよ(w

>>72さん
ありがと〜
会社の捨てちゃった器具の取説だったから助かったよ〜

ステップはうまくいかないようですね

どううまくいかないのかを書いてもらわないと、
フィードバックにならないのだが。

それに元プロトコルにも試行錯誤が必要かもと書いてあったのでは？

とにかくうまくいかない奴は、どううまくいかないか情報上げろや。
誰がどこでやってもうまくいくプロトコルなんてないのは、
人に教えたand/orラボを移った経験のある奴なら身にしみてることだ。

ここが本当に極上protocol集になるためには、善意でprotocol上げてくれる人の好意を一行で否定するんでなくて、きちんとしたフィードバックが
必要だと思うぞ。みんな研究者として、貰うだけ貰ってあとは知らんぷり
なんてことは日常してないだろ？

なあ、86よ。そうは思わないか？お前さんみたいな一行レスで否定してた
日には、protocol上げてくれる奴なんていなくなるぞ。

>>87
同意。ちなみに俺はゲルうまくできて感動した。

禿堂。自分では何も貢献しないくせに、文句ばかり垂れるヤシが
多いね。うまくいかなくても詳細な状況が分かれば作者含め住人の
フィードバックがあるだろうに。そういうヤシは、実社会でも
よくいるけどね。

関係ないが、オープンソースの世界では、バグレポートも立派な
貢献だったりする。ここが発展するとしたら、オープンソース
ソフトウエアみたいにみんなで改良していくというのもいいかもと
思った。Original＋FAQ+troubleshootingみたいな感じで。
Originalの投稿があったら、その後でFAQとtroubleshootingを
みんなで作っていくとか、どう？

無理かなあ。

どうもステップgelのプロトコールを執拗に非難しようとしている個人がいるようだ。
その彼にしても幾らかは実験の経験があり、うまく行くための何かを求めてこのプロトコールを目に留めた
と思われるので、彼に対するマジレスを書いておきたい。

「アクリルアミドってのは、粉を量って水に入れてレンジでチンして冷めたら固まるってものとは違うぞ？」

これを読んで腹が立ったなら、お前の救われる余地はその分まだ残っている。
そのぐらい見当違いのことを、お前は2chの悪い部分を体現したようなやり方で書き込んでいるんだ。

質問があるのですが、
10% SDS-PAGE ゲルを作ろうとして
分離ゲルに10% グリセロール
濃縮ゲルにBPBを加えて作ったところ
ゲルが混ざりあって境目が見えなくなりました。

ゲルはちゃんと固まって、
そのゲルを使ってサンプルを流したところ
バンドはちゃんと分離したんだけどこれで良いのですか？
別に問題なし？

固まったゲルの下に水が溜まってたのが少し気になるのですが。

君はここに書き込む前に、身の回りの人にアクリル網戸ゲルの
作り方をきちんと習いなさい。話はそれからだ。

固まったゲルの下にたまってたのは水ではなく重合しなかったアクリルアミド溶液でしょう。

>>92
分離ゲルがちゃんと固まったかどうか
ビーカーに残ったゲルで確認しているのですが
グリセロール入りのモノが固まらないです。
これは仕様？

>>93
レスありがとうございます。

濃縮ゲルと混ぜ合わせると固まるのですが。

単にTEMEDとかの濃度の問題かもしれませんが
グリセロール添加のプロトコルだと
分離ゲルと濃縮ゲルがただ混ざりあっただけの気がするのです。

これは別に問題なし？

>94
だからお前さんは根本的に理解できてないんだよ。もう一度
ゆっくり頭を冷やして、教科書を読み直して、周りの人に
アクリルアミドゲルの作り方をならって、なぜステップゲルが
便利なのか考えて、それでも分からなかったら質問板に書き込め。
はっきり言ってレベルが低すぎて話にならん。

こういう奴らが必死に批判してたのかと思うと、かなり笑えてきた。
94みたいな奴は何をやらしても駄目なんだろうな。自分の知識レベルを
恥じろよ、まじで。protein gelなんて学部の教養レベルの知識じゃねーか。

【破滅に】グリセロール入れて固まるわけねーだろ！【向かう】

ここは雑談、質問スレではありません。

キリ番ゲター参上！

また切り版下駄ーか。
通報しといたよ。一応

>>94
一度だけマジレスしてやる。

step gelは、【濃い濃度の分離ゲルを薄い濃度の分離ゲルの下】に作って、
一枚のゲルで広いレンジのタンパクを分離するためのものだ。濃縮ゲルと
分離ゲルを混ぜるな。あほ。

グリセロールはアクリルアミドの重合には全く関係ない。固まらなければ
APSとTEMEDを疑え。あほ。

アクリルアミドゲルは空気に触れている面は固まらない。ビーカーに
残っているゲルの量が少ないと固まらないぞ。知ってたか？

これで理解できなければ質問刷れに逝ってくれ。頼むからもうここを
荒らすな。いいか？

何だかんだ言って生物板住人は優しい。

>>102
了解しますた

ちょっとかわいそうになってきた。実は素直ないい子なのかな。
とりあえずもうちっとnormalゲルの勉強をしてみ？原理やtipsなど、
極めれば奥が深いよ。そのうちグラジエントが欲しくなったら
挑戦してみたらいいんじゃないか？

藻前様の叩かれ方は少し気の毒だが、step&gradientのprotocolが
実にいいので住民が反応するんだと思うのよ。漏れも実際作ってみたが
とてもうまくできたし、漏れには目から鱗のprotocolだったからね。
まあ、もう少し経験を積んでから見直せば、いろいろと分かることも
あるんじゃないかな。ねえ。>104=94

最新の極道protocolをおせーて

たくさん書きたいので新スレたてろや
極道protocol

>>83
Tﾈ皮さんのその話有名だなぁ。。。
作り話かと思ってたが、こうあちこちで耳に
するてことは事実なんだろうなぁ。

と、激しく遅レス。

わしは↓の方法で密度勾配遠心を楽してます。
ttp://web-mcb.agr.ehime-u.ac.jp/methods/gradcnt/gradient.htm
結構定番かな？わしは初めて知ったとき目からうろこだった。
凍結融解より一定したグラジエントが作れる。

>>108
いや、俺も本当かどうかは自信ない・・・。

ウソに決まってるだろーが

>108
他にも役立ちそうな情報が載っておりました。サンクス。

「あちこちで目にすればそれは正しい」という論理への突っ込みが細かいことに思えるくらい、
遠心機と朝日賞のエピソードは皆のイメージにはまっていますね。
スレタイ【緊急事態】トネガワに遠心機止められました【助けて】
みたいな感じで。

108さん。できればここにカキコして下さい。

極道スレが立ってしまったがこちらが荒らされないのでいいか。

つまらなかったから下がりまくる羊羹

大腸菌と酵母を混ぜてシャーレに広げる。
数個だけ生えてきた酵母には…ｳﾏｰ

サプレッサー変異が！

>>72
情報ありがとう。ありました。

>>112
人のウェブサイト上の情報なので、転載するなら著者に許可を頂くのが筋かと。
アドレスの紹介だけなら問題ないとは思うのだが、２ｃｈへと、ということになると
それすら嫌う人もいるようだし。

上記の簡単グラジエントと似た発想で、再現性よく何本ものグラジエント遠心チューブ
が作れるやり方が載っています。

（＾＾）

108のHPを見つけて実践してたら上司に
「そんなの古い研究者はみんな知ってるぞ」といわれました・・・

しかし定量性を確認されたご本人のHPですので、
プロトコルのみ（HPにあるデータは無し）で転載の許可をいただけるか
ﾒｪﾙしてみましょうか。。

PCR機もないころから科学者やってる上司・教授らの
古の実験方法を聞くと面白いですよ。
制限酵素を自分で精製してからDNA切ってたという話も聞けました。

我々が知らなかっただけで一般的な方法なのであれば
ここに書いても問題ないと思うのだが。

ゲルの泡消す方法めっちゃ楽ですわ
謝謝

それこのスレじゃないよ

キットを使わないRNA抽出プロトコル希望

materialくらい書けよ

Plasmid vector を用いた siRNA (標的配列決定・Promoter等)construct作製法およびその高効率transfection法希望。

>126
まだ、あんまり経験者いないかもね。

>124
AGPCとかじゃだめなの？

>>128
それでいいから書いてみたら？

>>126
機揚げんに頼む。
ttp://www.qiagen.com/jp/siRNA/
日本ジーンに頼む
ttp://www.nippongene.jp/pages/products/sirna/sirnasynth.html


つーか、これ役に立つ？
ttp://www.jbios.co.jp/RNAiselect.htm

目的キーワードをググるだけで結構ヒントページヒットする。

ショ糖密度勾配遠心グラジエント作成。

1. 濃い（重い）しょ糖溶液を遠心チューブにとりこの上から軽いしょ糖溶液を静かに重層し、
きれいな界面を作りチューブラック上に立てます。　この時点で斜めにしたり界面を決して乱さないことが重要です　

2. 必要本数のチューブに１を作製したのちこれら遠心チューブにシリコンゴム栓をはめたのちラックごと静かに横に倒します（室温）。

3.　１−３時間そのままにしておきます。

4.　時間がたったらゆっくりチューブラックをおこしチューブをたてにします。これでリニアグラジエントが何本もできました。
同時に作ったものの均一性はかなりあります。

>>131
シンプルでイイ！！

>>130
www 検索はやってる。日本も海外も。
でも、「これは」と言うのは無いね。

シークエンスキットは1/20にケチる
8μL/20μL反応系 -> 0.4μL/10μL反応系
テンプレートとプライマーはfull strengthで
塩っけが足りなくなるので
10xbuffer（400mM Tris-HCl pH9, 10mM MgCl2）を0.9μL入れとく

>>124
Chirgwin, J. M., A. E. Przybyla, et al. (1979).
ﾒIsolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.ﾓ
Biochemistry 18(24): 5294-9.

補足
材料によってはAGPCよりもGTCでホモジナイズのあと軽く遠心してCsCl超遠心にかける方がきれいに取れる。

>134 同じく10ul反応系で1ulまで減らせたと喜んでいた自分が・・・

反応後のエタ沈
80%EtOH 40ulを分注した1.5ml tubeを用意
10ulの反応後の産物を加えてボルテックス
cf. top speed 15min ppt
70%EtOH 40ulを入れる
cf. top speed 5min ppt

ABIのガイドに載っていた塩を加えない方のプロトコールの量を計算したら
上記のような感じになった。
丸底のチューブしかなくそれでやったり、遠心機が室温でそのまま回したり
しているが一応できている。
supを除くチップを替えずに一本でやっているが、それによる害も無さそう。

rinseの70%EtOHの量 200ulに訂正

シークエンスキットは1/40にケチる
そのかわりPCRサイクルは99回に増やす
しかしこれをやるとPCRの耐用年数が下がるという諸刃の剣
素人さんはRI室にこもってなさいってこった

>>1
これかい？
http://homepage3.nifty.com/digikei/ten.html

ブラクラ

何の脈絡も無く【>>1 これかい？】などと書き込めるセンスに脱帽。

すみません。
制限酵素で切った５’末端を、
ポリメラーゼで埋めるのではなく、
削ってブラントにする方法知ってる方いませんか？

>>143
スレ違いだよ。でも方法はある、ってゆーか基本だろ。

>144
そこをなんとか。
すれ違いなので、分かり次第消えます。。。

Mung Bean Nuclease・・・

↑
おっとっと
逝き過ぎちまったぜぃ

RNA抽出なし、RT-PCR
これはRNA抽出が出来ないほど、サンプルが少ない場合に有効
（ちなみに僕は　Single-cell RT-PCR　をしてます）
1)少量のRT bufferの中に細胞（ピックアップして）を入れる
2)液体窒素で凍らせる
3)65℃　5min
4)RT酵素などをいれて、RT-反応
5)これでcDNAは出来てます。
PCRのサイクル数は40ぐらいがいいかな。
やっぱcDNAの量がすくないから伸びにくい
（産物は500bp以下が良い、僕はさらにnestしてます）
あんまり長い距離は伸びないけど、
intronをはさんでプライマーを設計しとけば、
ゲノムのコンタミもないよ。

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>>148
ぬお。さっそくやってみるよ！

148はちょっとテストしてみて上手く行ったら採用します。

>>150
どうだった？

だめぽ…か？

>>147
緑豆はendoだぞ。。。

ココリコは遠藤だぞ

最速の電気泳動をおせーて

いやいや、シークエンスの難しいテンプレートの対処法を。。

プライマー作りなおせよ

ばばんばんばんばん

テンプレートの問題なのにプライマー作り直してもナ。

マルチですいません。
口腔粘膜細胞からのRNA抽出を考えているんですが、
どのキットが１番簡便ですか？
それと、液体窒素使わなくていい方法とかあるんですかねぇ？

サーマルサイクルの条件検討をして、プライマーもＴｍ値などを参考に別の場所にずらすとか。
プリセットの条件に98℃で変成させてるのがあるんだけれど、そういうのだろうか。

＞162
invirogenのtryzolか日本ジーンのisogenはどう？
tryzolの血液から抽出するやつは、確か液体窒素無くても
ＯＫだと思う、っていうか、どんなサンプルでも
いきなりisogenとかにぶち込んで、ホモジナイズすれば
RNAとれるはず、フェノールが入ってるから、
RNaseは失活するよ。

ごめん間違えた
＞161
だった。

>163
ありがとうございました。

ここは質問スレじゃねーんだよ。

>166
うっっっせーーんじゃぼけGA!!!
なんかプロトコール書いてみろよ！！
大したことできネー癖に
愚痴だけは天下一品ってやつか。
他を批判することで自分が賢いと思わせる
お前ミてーなやつを「冷笑家」っていうんだよ
そういうやつっていつも心の中では
軽べつされてるんじゃないかとおどおどしてんだよね
（　´ _ゝ`）かわいそうに・・・

ｵﾏｴﾓﾅｰ

>>163
確かにTRIzol試薬を用いてのRNA抽出はシンプルでよいと思う。
特にサンプル量の多いときに適す。しかしRNAの質はいまいち。
けど普通のRT-PCRぐらいになら特に問題なし。
RNAの質にこだわるときは、キアゲンRNeasyキットのカラムを使って精製してるよ。

>>169
TRIzolを用いたプロトコールをおながいしまつ。

>>170
ttp://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/15596026.pdf
invitrogenのホームページで見られます。レス遅くなったからもう見つけてたかな？

ありがとうございます

148できませんですた・・・

>173
しゃあないよ。そういう微妙な実験がどこでもうまくいくとは思えない。
まあ148の環境ではうまくいってるのだろうけどね。

漏れ自身、ラボを移って今まで当たり前に出来てたことが一時的に
うまくいかなくなった経験を持ってるから、そういうのは仕方ないと
思う。

漏れもここに書きたいTipsは結構あるんだけど、漏れの環境以外で
うまくいくかどうか自信がないので書けないんだよね。

まあ、何はともあれご苦労さんでした。情報サンクス。

>>174
ゲル話以降、そのままやって上手く行くわけではないと
みんな理解しているのでTipsをおながいしまつ。

あれ？カキコしたのにあがらなかった？？

漏れもTRIzol愛用してまつ。

>>177
俺も

誰か>>148できた香具師いる？

じゃあプロトコールを改良してなるべく多くの人がうまくいくようにしよう。

今更ながら>>89の、

関係ないが、オープンソースの世界では、バグレポートも立派な
貢献だったりする。ここが発展するとしたら、オープンソース
ソフトウエアみたいにみんなで改良していくというのもいいかもと
思った。Original＋FAQ+troubleshootingみたいな感じで。
Originalの投稿があったら、その後でFAQとtroubleshootingを
みんなで作っていくとか、どう？

とかがｲｲと思った。

>>181それがあっての180のレスです。

じゃあさっそく１４８のどこをいじると汎用性が高くなるかだが。

でもいま生物板は厨房のスクツだから難しそう。

>>148の、
3)65℃　5min
てこれ、RNA壊れちゃいそうなんだけど。だって、RNA抽出した段階でRNase freeの溶液中で
上記の過程なら当然よくやるけど。だからちょっとどうかと…。
うまくいってる人がいる以上、何かコツがあれば是非知りたい。

>>185
ネタなんじゃねーか？

素敵なcoprecipitation protocolｷﾎﾞﾝﾇ

TRIzolは確かに悪くないが、TRIzolやるくらいなら自分で試薬作った方が安上がりで
良くないか？うちは原法（APGC法）で使うGTC solution 、2M NaOAc、Phenolの
３つを混ぜてTRIzolもどきを作って使っているが・・・。

アグロバクテリウムから何から
バクテリア君の巨大プラスミドはこれで取れるらしい。

megaプラスミド抽出法
１，菌培養
２，1MNaCl入り50-20TEで二回洗浄
３，ペレットを50-20TEで懸濁して 1mlを50mlチューブに。
４，19ml Lysing bufferをいれて34℃で 20min 溶菌。
　　　Lysing buffer…50-20TEに4％SDS　pH12.45に調整したもの。
５，2M Tris-HCl(pH7.0)を1.8ml加える。
６，軽く混ぜて粘りけがなくなったらNaClを終濃度3%になるように
　　加える。ちょっとまぜて三十分放置プレイ。
７，完全に溶けたの確認したらさらに20分放置。
８，3%NaCl飽和フェノールを22ml
９，ミセル形成まで優しくまぜる。
１０，大体二層に分かれたら遠心管に上層を移す。
　　　このときは大体でよい。
１１，8000〜10000rpmで20分遠心。室温。
１２，上清をとってエタ沈。塩はいらない。
１３，後はいつもどおり70%EtOHで洗浄。乾燥。

どうしてもタンパクが多少入るが，低電圧で泳動して切り出して
抽出すればよいんだと。
かなりうまくいけば12Mくらいのも取れるとか。
ちなみに欲張って菌を多くしすぎると最後までタンパクだらけで
収拾つかなくなる。ゲノムDNAもこれで取れマフ。
温度とpH管理がカギ。

50-20TEって何ですか？

50mM 20mM

細かいことをいうけど
混ぜるときは優しく手短に。
9までの操作はビーカー内でやるとよいです。
それ以降のエタ沈なんかは50mlのチューブ内でやるとよし。
取れたDNAはかなり粘性あり。（当然ですが…）

>>192
補足サンクス

抗体ケチるプロトコール希望

age

過疎板のくせに気づいたら相当さがってた。age

過疎板だけに下がっていても平気だと思うよ。
上げてもわりきり学園とか貼られるだけだし。
他のスレである程度まとまったプロトコール話を転載する場所という印象が強くて。
レス数消費してしまってもいいなら議論・雑談もここでする？

>他のスレである程度まとまったプロトコール話を転載する場所

その方向でお願いします。

ここで一度おさらい。↓

おながいします↑

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おまいらミュータントづくりした後どんな方法で確認しますか？

アミノ酸の点変異？
シークエンスは当然として、
デザインの時点で制限酵素サイトを仕込んでおく。
変異の位置そのものに入れるのが難しい場合は近傍にサイレントで入れる。

ミュータント作製のプロトコールとしてまとめねば。

>>203
よろしくおながいします。

>>202
四分子解析

ｺｰﾎﾞ屋さんｷﾀｰ!!

ｷﾀｰ!

春厨がきたよ‥

復活、最近書き込めなかったよ。今出張で丘崎。２週間います。
>185
この操作ってＲＴ反応の効率を良くするためのステップで
僕が使ってるのは、invitrogenのthremoscript。
友達はSuperscriptIIでもできたみたいだよ。
僕もRNaseが働いてRNAが分解すると思って幾つか検討したけど、
どうやらうまくいかないときは、このステップのせいではないみたい。

あと、逆転写の時には、Gene specific primerを使った方が
いいです。これ１４８では書き忘れてた。
このプロトコールの原型は
one step RT-PCRキットなどの方法を汎用性があるように
改良したものなんだ。ちなみに僕が成功しているものは
single-cell(neuron),neurosphere
友達は極微量のmotoneuronでできたらしい。
質問とかあれば何でも聞いてね。

な、なんて親切な！

（＾＾）

（＾＾）

保全あげ

（＾＾）

　　 ∧＿∧
　　（　　＾＾ ）＜ ぬるぽ（＾＾）

なんとなくあげ

http://homepage.mac.com/ayaya16/

華麗にあげ

保守ありがとう。
ついでにプロトコルも書いてくれると嬉しいっす。

速攻ジェノタイピング
1)しっぽに0.1% SDS,0.1N NaOH を100ulとH2Oを50ulぐらい入れる。
2)98℃、15min
3)TEを300ulぐらいいいれる。
4)1ulをtemplateに使ってPCR
*遺伝子やプライマーによってかかりにくい。
*速さ重視ならTakara Z-Taq、お勧めはeppendorf HotMaster Taq 安くて、ノンスペが少ないです。

http://homepage.mac.com/hitomi18/

いいね。試してみよーっと！
てゆーか一般的？

220は一般的な方法をすごくショートカットしてある系です。
タイピングはＰＣＲのかかりやすさで随分ショートカットできるんだよね。
普通のプロトコール（かかりやすいけど時間がかかる）が知りたいならおしえるけど。

よろしくお願いします。

>>194
抗体を希釈する溶液にBSA(3%位) in PBSTを使う。抗体反応を4℃で行う。
使った抗体溶液は回収して４℃に保存。これで１ヶ月は使い回せます。

セミドライのウエスタンでトランスファーを間違えて
2時間もやってしまいました。大丈夫でしょうか？

　 ∧＿∧ 　　
　（　・∀・）/＜　こんなのみつけたっち♪　
ttp://www.yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku04.html
ttp://yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku10.html
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＞２２０
丁寧タイピング
1)しっぽを lysis buffer(TrisHcl 10mM,Nacl 150mM,EDTA 10mM)＋ProK処理 65℃ overnightで
なるべく振とうする
2)遠心して不純物を落としたあと、上澄みをフェノクロ(以下室温で操作する）
3)0.7等量の2-propanolを加えて、イソ沈そのあと70%EtOHでリンス
4)5minほどドライアップして、TEなどに溶かす。65℃1hrとかO/Nとかvortexとかしてよく溶かす。
5)定量してtemplateに0.1ugほど使う。
＊溶かしが甘いとバンドが出にくい。操作は室温の方がいいみたい。
定量はめんどいんで、１サンプルだけやればいいでしょう。
タイピングPCRではtemplate量はそんなにそろえなくても大丈夫。
＊これでもバンドが出にくいなら、プライマーを変えた方が良い。

>226
白金電極が焦げなければ平気。
タンパクが裏に抜けてしまうかどうかはメンブレンによる。
ということでどうでしょうか？

228さんありがとう！

226です。
229さん、ありがとうございました。

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ジェノタイピングに関して補足。
論文に書いてあるタイピング用のプライマーって
時々すごくかかりにくい時があるんだよね。
そんな場合はかならずしも、参考論文通りにタイピングせずに、
プライマーを変えたり、ＰＣＲの系を変えるべきだよ。

保守あげ

本当の完全無料サイトはココだよ！　
２５０の動画が完全無料で見放題だよ！
今すぐ抜けるよ！ http://www.gonbay2002.com

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━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

いい感じでプロトコールたまってきますた。

そろそろ目次レスが欲しいね。

月曜にまとめましょうかね？

　　　 　∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　(　　＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣〕
　　＝ ◎――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉

age

手抜き実験のススメって本すごいな。
大腸菌の形質転換が７分って・・・。
今まで３０分以上かけてたのが馬鹿らしい。

http://life.fam.cx/mfg/

http://homepage.mac.com/yuuka20/

>>224
ガイシュツにもほどがある

下げってきたので、分裂酵母の最速transformation法でも。
１．SD液体培地で対数増殖期後期まで培養する（ODなんて測らず、目で見てだいたいで）
２．1M Sorbitolで細胞をwash
３．約200microのSorbitolにけんだくしてエレポ
４．約800microのSorbitolを加える
５．selection plateにまく（効率が悪い場合は菌体を遠心して濃縮）
慣れれば形質転換操作は45分で終わる。
しかもLiAc法ではどうしても入らなかったDNAも入ったことがあるよ。
操作を全て氷の上（遠心は4度）でやれば、さらに効率アップ。

>>224
どこの出版か教えて下さい

>>249
224 ：名無しゲノムのクローンさん ：03/05/16 01:31
よろしくお願いします。
??????????????????
244ならたしか羊土社。
もともとは、なんかの雑誌の連載記事。

>>250
ありがとうございます。
羊土社で調べたらありました。
どうも情報サンクスです。

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

保守

無修正画像サイトの入り口♪

http://angely.h.fc2.com/page004.html

ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

このスレの目次 (1)
>>11 1 day transformation(Yeast)
>>17 E.coliを使った組み換えタンパク発現
>>34-39 step/gradient ポリアクリルアミドゲルの調製
>>55 PCR-based epitope tagging method
>>57 Membrane striping
>>83 実験全体を高速化するコツ
>>108 >>131 ショ糖密度勾配遠心
>>115 酵母の形質転換
>>130 siRNA construct作製法およびその高効率transfection法

このスレの目次 (2)
>>134 >>137 >>139シークエンスキットは1/20にケチる
>>135-136 キットを使わないRNA抽出
>>146 5'末端を削ってブラントにする
>>148 >>209 RNA抽出なしRT-PCR
>>163 >>169 >>171 RNA抽出の簡便なキット
>>189 >>192 megaプラスミド抽出法
>>203 ミュータントのデザイン
>>220 速攻ジェノタイピング(マウス);丁寧タイピングは>>228 >>233
>>225 抗体ケチるプロトコール
>>248 1hr transformation (yeast)

　　　 　∧＿∧　 ∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　（　 ・３・） (　　＾＾ ） ＜これからも僕たちを応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣￣∪￣￣〕
　　＝ ◎――――――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉&ぼるじょあ

なんか下がってきてない？

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

　　　 (⌒V⌒)
　　　│ ＾ ＾ │＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　⊂|　　　　|つ
　　　（＿）（＿）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎パン

hoshu

保守しておきます

ageとくかな....

http://profiles.yahoo.co.jp/tengaiten2002

再浮上

sage

あぼーん

　　 　 ∧＿∧∩　　／￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
　　　 （　´∀｀）/　＜　　先生！こんなのがありました！
　＿ / /　　 /　　　　＼＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＼⊂ノ￣￣￣￣＼
　||＼　　　　　　　　＼
　||＼||￣￣￣￣￣||
　||　 ||￣￣￣￣￣||
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿　　
￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
http://cse.fra.affrc.go.jp/ksaitoh/3700POP5.html

リクエストしてもいい？

ベクターを制限控訴で切断後、平滑末端化して脱リン酸処理するのですが、
これらすべてを同じバッファーでできますか？
もちろん次の反応に移る前には熱処理などして前反応で用いた酵素を不活性化させます。
制限酵素処理と平滑末端化、
制限酵素処理と脱リン酸処理は同時にできる事は知っているのですが、
これら三つをバッファーを交換する事無く行った経験のある人、いたら教えてください。

せいげんこーそしょり　
↓
くれ脳（＋ｄNTP)
↓
アルフォス

バッファー置換も熱処理もしません。
うまくいきます。

>>271
漏れはいつも制限酵素反応とあるふぉす脱燐酸化反応とくれのうで埋めるをいっぺんにやっている。時間短縮にもなる。dNTP入れるのを忘れるなよ。

ベクターの制限酵素とＣＩＰ処理は一緒にやってる罠

しっかし，
制限酵素とＣＩＰとくれのう３重処理って
何に使うの？

CIPはdNTPを基質にしてしまわないか？

>>275 良い指摘だ。>>273 は何と答えるのだろうか？

＞＞273　制限酵素とＣＩＰとくれのう３重処理って
何に使うの？
えっとですね、、。
クローニングするのに、ちょうどよい制限酵素サイトがないのでベクターを切断後、
平滑末端化してクローニングしようと。でも、平滑末端だとセルフライゲーションが
起こっちゃうのでCIP処理でそれを防ごういう訳です。
275さんの質問の答え、僕も興味あります。
dNTPも基質になるのだけれど、競合してベクターの脱リンを阻害するほどではない、
という事ですかね？

あり得ねえ…

医科研では常識

CIPはdNTPを基質にしてしまわないですよ

>>987654321

>>277
ブラントの酵素で切りゃいいだけじゃないの？

そういう酵素サイトがないからコマってるの。

>>280 なわきゃねえだろ、あんな消化酵素みたいなnon-specificなものが！

klenowは3'->5'-exo活性を持ってるので
制限酵素のキレ方によってはdNTPなくても
ブランティングできるんじゃなかったっけ

>>285　dNTP入れなきゃどこまでも削れるだろが！

キレた？

ねたキレ？

1×SB　5mM disodium borate decahydrate or 10mM sodium hydroxide
pH adjust to 8.5 with boric acid

このバッファーでアガロース電気泳動すると発熱しにくい　300Vで10minくらいで終わり
ゲルの透明度も上がり　低分子域の分離能も上がる　3k以上の分離が悪くなるのは目つむって

1st forward primer + 2nd(nested) forward primer + Pfu + cDNA template = 3'RACE
テンプレートの3'側配列がわからなくてもクローニングできるらしい　やったこと無いけど

いーね

iinee

もったいない

age

あるtag付きのタンパク質を発現させて、
免疫沈降か何かでそれに対する結合タンパク質を探すようなことできませんかね？
ＣＢＢとかじゃさすがに検出苦しいでしょうか？

>>294
そのtag付き蛋白をぶち込むサンプルの種類、
予想される結合蛋白質の量に依存するんでは？
一般にCBBは1バンドあたり100ng、銀染色で1ngあれば見える。

tag付きの蛋白質に対する抗体があるなら、ウェスたんで１次抗体代わりに
その蛋白ぶち込むとかどう？
一番だるいのは免沈やって銀染して、tag付き蛋白質に対する非特異的結合蛋白が
やたら多いとき。

誰かEtOH固定した培養細胞からゲノム抽出するprotocolお願いします。

↑
普通にやれば？
無問題！

796 名前：もえっちょ君 ◆AIo1qlmVDI 投稿日：04/05/18 09:32 JDpeM999
深海って火星と同じくらい調査がまだ進展してないんだぜ！
受験英語でそんな題材の長文があったよ。

797 名前：あなたのうしろに名無しさんが・・・ 本日のレス 投稿日：04/05/18 09:38 xc44s40a
遠まわしに言うなよ。
ようするに深海には火星人がいるってことなんだろ？

798 名前：もえっちょ君 ◆AIo1qlmVDI 投稿日：04/05/18 10:21 JDpeM999
全然、ちげえよ！
具体的に言うと、深海って火星と同じくらいに調査がまだまだ進展してないんだぜ！

799 名前：あなたのうしろに名無しさんが・・・ 投稿日：04/05/18 10:37 xc44s40a
あ、そういうことか。読解力なくてｽﾏｿ。
深海には火星人しかいないなんてちょっとﾋﾞｸｰﾘだよね。

800 名前：もえっちょ君 ◆AIo1qlmVDI 投稿日：04/05/18 10:53 JDpeM999
だからちげえっつーの！
深海と火星が同じなんじゃなくて、未知の部分の大きさが深海と火星で同じなんだよ。
つーか、火星人の話を俺はしてねえだろ！

801 名前：あなたのうしろに名無しさんが・・・ 投稿日：04/05/18 12:10 C3fA6lty
ということは火星人がいるだけでなく
深海の面積は火星の面積とほぼ等しいと

802 名前：もえっちょ君 ◆AIo1qlmVDI 投稿日：04/05/18 12:48 JDpeM999
ということはじゃねえよ！
未知の部分の大きさは、面積の大きさって意味じゃなくて、未知度の大きさだよ。
100�uのとこを1時間調査するのと、200�uのとこを2時間調査するのでは、
面積は均しくないけど、未知度は同じみたいな、そういう感じ？
俺がいつ火星人の話をしてんだ、馬鹿！

培養細胞からRNAとプロテインを同時に抽出するprotocolご存知でしたら教えて下さい。

とらいぞーるとかのパンフにかいてあるYO

>>300
とらいぞーるでDNAとRNAとプロテインを同一サンプルから
同時に抽出することってできますか？

ぱんふよんでくれ

今はいいキットが売ってるから
遺伝子実験はかんたんだよ
実験について考える暇があったら
論文読めよ！！

55 ：灯台院生 ◆ipJni/6Rlw ：03/01/11 00:17
PCR-based epitope tagging method

restriction site=RS　vectorの都合に合わせて選択
target sequence=TS　目的の遺伝子の全長または部分配列

5'-[RS]-ATG-TACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT-[TS]-3'
5'-[RS]-[stop codon*]-[TS]-3'

*任意のstop codonを選択

これでPCRするとHA-tagをつけられるよ。
上の配列をテンプレートにしてコピペすると便利。

Anti-HA(12CA5)抗体で検出できます。

逆にC-teminusにHA-tagをつけたい時は上記の要領で
HA sequenceをtarget sequenceの3'側につけるだけだよ。
その時はHA sequenceを逆にしないとダメだよ。

ではお試しあれ。

↓
普通にやったら２つのプライマーのTm値がかなり違う気がするんですが
どうすればよいでつか？

>>304
分子生物学の教科書からやり直せ

いや、オレは>>304じゃないけど、これだけTmに差があると結構トラブるよ。

本当にいいものが１個取れればやり方も他に何個とれたかも関係ない、それが物取りクオリティ。
変なバンドが出ても目的のものだけ切り出せばいいんだよ。

>>305
あらあら、強がっちゃって。
俺もわからないから教えてって素直に言えばいいのにw

こうやって悩んでる時間があるのなら
とりあえずプライマーオーダーしてPCRかけてみたら ?
Tmがどうであろうとかかるときはかかるモノだし、
バンドが汚い程度なら>307のように回避法もある。

綺麗に仕事をこなそうとしすぎて
非常に無駄な時間を費やしているように感じられるが.....

てか分らないなら実験するなよ

中途半端にPCRかかって
いくつかのサブバンドの中から目的のバンドを取ってきたいとき

チェック用に産物を流したアガロースゲルの中の
目的のバンドを
イエローチップで突っつく

P200を50μLぐらいに調節して
ピストンをゆっくり引きながら突っつくと
１μLぐらいのアガロースのかけらが吸える

そのアガロースのかけらを
エッペンチューブ（ミリＱ100μL入り）の中に吐き出す

vortex

その水１μLをテンプレートに同じプライマーでもう一度ＰＣＲすると
あーらふしぎ

にせバンドが目的のよりも長いときはたいていばっちりだ

短いときにはミリＱに泳がせたアガロースの破片を
ＵＶあてながらさがして
もう一度イエローチップで吸い取って別のエッペンにうつして
同じことをやる（要するに一度外側を洗う）

ありきたりな誰でも知ってる技乙

旧型の3100でもPOP-7が使える
phredスコア連続で＞20は760bpぐらい
ぽつんと低いところを除けば使えるのは900bpぐらいまで

http://www.invitrogen.co.jp/products/molecular_biology/11666001.shtml
http://www.arbrown.com/product/speciality_chemicals/dna/cloning/fastlink.html
上記二つのように、コロニーから迅速にプラスミド抽出するプロトコール、
または、試薬を知っている人居ない?

「プラスミド」がほしいのか
「インサート」がほしいのか
よ〜く考えよう

インサート確認のためのプラスミド（出来ればスーパーコイル）が欲しい。

インサート確認だけならプラスミドはいらんやろ

>>317
プラスミドを抽出せずにどのようにインサートの入ったコロニーを確認するんですか？
コロニーPCRなどを使うんですか？

age

人居ないなー

protocolじゃないけど１つ
パッキンが駄目になって吸えなくなったピペットマン
シリコンのコーキング剤を使って復活

>>314
こんな方法もある
1.コロニーを掻きとる
2.アルカリSDS法のSol�T20μlに懸濁
3.Sol�U40μを加える
4.室温1分
5.Sol�V30μを加える
6.氷上1分
7.フェノクロ100μlを加えvortex、遠心
8.水層15μlを電気泳動(厚めのゲルで多く流した方がいいかも)

まあ、早い話がコロニーを掻きとってミニプレップだ
これだとCCCプラスミドしか取れないがインサートが500bp以上なら十分に判別できる

以下に注意点をいくつか
・インサートの入っていないベクター(CCC)をネガコンにする
・培養時間を長くして大き目のコロニーを作る
・コロニーはしっかり掻きとる(培地をえぐるぐらいの勢いで)
・失敗する時は失敗する

>>321
ありがとう。
この方法ならチューブ1本で出来ますね。
似たような方法で一度やったことあるんだけど、
そのときは円濃度が高すぎたのか、汚すぎたのかわからないけど、
バンドが乱れすぎてうまくいかなかった。
今度この方法でやってみます。

このスレ良いんだけど
いちいち文句を言うやつがいるから
なかなか進まないね。

にぽんジーンの最速コンピ
混ぜてすぐヒートショックで10^7っていうけど
普通の自作コンピで５分氷冷でも10^7ぐらいはいくよ
５分ぐらい待つのはなんでもない

0.4uL反応系やて
http://www.genome.org/cgi/content/full/15/10/1447
0.03125uLプレミックスやて

アタシが教授ンなってみなさんのデスクの前で世間話をしているときに
「このプロトコル、極上ですよ」と言ってください。
で、アタシが「どれどれ？」と聞くから、そしたら
「実は実験でにナニナニを工夫するのですが⋯」と打ち明けてください。
わかりましたか、はい！　お？早いねぇ、じゃキク蔵さん！

環状DNAのラダー作ろうとすると、
OCができちゃうからめんどくさいな。
2, 5, 10kbくらいで作ろうかな。
塩化セシウムでpurifyするのにもo/nで神経使う実験せなあかんしなぁ。

どうせ保存中に切れるからあきらめなさい。
3kbのocは5kbのccと同じ位置だよ。

http://jbt.abrf.org/

なんかない？

>>321
・失敗する時は失敗する
warota

あげ

BigDye ver1.1の使用時の希釈倍率を4倍、20ﾏｲｸﾛﾘｯﾄﾙでやってる。1サンプルあたり２ﾏｲｸﾛﾘｯﾄﾙ
皆さんどんな感じ？

10μlで十分

0.2か0.4でいんでないの

BigDyeの希釈倍率が高くなるほどテンプレートの濃度の許容範囲が狭くなる。
ルーチンなら10ﾏｲｸﾛﾘｯﾄﾙ反応系で0.5ﾏｲｸﾛﾘｯﾄﾙ。
通常は１-1.5ﾏｲｸﾛﾘｯﾄﾙ使ってる。

DNA断片をアガロース電気泳動して切り出し精製させたら、「消えた」という

やっとこさTAクローニングさせたら「コロニーが一つもはえてこない」という

失敗する度に一週間も来なくなるのは学生がへたれなのか？

>>337
教え方に問題があると思う。

どのへんが？

PCR産物がバンドとして見えているのに、クローニングできないとかシーケンス出来ないというのは死んでいい

というか氏ね

新しいキットを次々試すのわ悪いことでわない

プリオン検出 おすすめは？

>341
ProtinaseK処理後にWestern

アンカーみすった。
× >341
○ >342

酵素（制限や逆転写）てvortex禁止が多いけどvortexしたら失活するの？

>>345
試してみれ。

経験上、ちょっとぐらいなら殆どの酵素でどうってことないが、その必要あるのか？

プロメガのｐＧＥＭ−ｔは水で１／１０ぐらいに薄めても
１０００個ぐらいコロニーが得られる

こんなにコロニーが出たらピックアップが大変なので
普段はＳＯＣを加えたトランスフォーマントの１／１０を蒔いてます

>>345
酵素化学やってるやつに
酸化して壊れると聞いた
酵素にもよるけど
ＰＣＲ酵素はどれもたいてい大丈夫
制限酵素もペンペンはじくぐらいはおＫ
くれのーやリガーゼはだめぽ

>>333

>>134

>>333

http://www.google.co.jp/search?hl=ja&q=%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%AF%E3%82%A8%E3%83%B3%E3%82%B9%E3%80%80%E3%81%91%E3%81%A1&lr=
シークエンス　けち
の検索結果

アクリルアミドゲルのエア抜き
ちょんぱでできるって知ってた？

>351 kwsk

アクリルアミド原液とバッファや尿素を入れて溶かしてから
ＴＥＭＥＤとＡＰＳ入れる前に超音波洗浄機で１，２分「湯煎」
以上

何気に5年か、このスレも。

そういえばちょんぱかけると
水中に細かい泡が出てくるときあるよな
あれって溶けた空気が出てきてるのかな

ピペドの怨念が出てます

　　　　　　　　　 　　　＿＿＿_
　　　　　　　　　　　／　　 　 　＼
　　　　　　　　 　／　─　 　 ─　＼
　　　　　　　　／ 　 （●） 　（●）　 ＼　　　それはない
　　　　　　　　|　 　 　 （__人__）　 　　 |
　 　　　　　　 ＼　 　　 ｀ ⌒´ 　　 ,／
　r､　　　 　r､／　　　　　　　　　　ヘ
　ヽヾ　三　|:l1　　　　　　　　 　　　　ヽ
　　＼>ヽ/ |｀ ｝　　　　　　　　　 　　|　|
　　　ﾍ　lノ `'ｿ 　　　　　　　 　　　　|　|
　　　　/´　 /　　　　　　　　　　　　 |.　|
　　　　＼. ｨ 　　　　　　 　 　 　 　　|　 |
　　　 　 　 |　　　　　　　 　 　 　 　 | 　|

http://cse.fra.affrc.go.jp/ksaitoh/SampleSheets.zip

わりと便利だった
全部を別シートにして１つのファイルにまとめたけどな

http://d.hatena.ne.jp/bunzaemon/searchdiary?word=*%5Bace%5D
の中の
ace_modoki.pl
も便利だったよ
できればphred callもついでにやってくれるといいんだけど

BIO-BIKのフリーズボックスの小さいほう
ディーププレートと同じサイズなので
プレート遠心機にかけられます

超音波で脱気ができるのは、基本中の基本だけど安定しないからあまり勧められないな。
減圧濾過が一番簡単、昔懲り過ぎて、真空ポンプに直結して、泡どころじゃなくてボコボコして、こりゃすげーと思ったけど、良く考えたら沸騰しとったてことねｗ

ゲルの脱気は沸騰するまでやってますが何か

沸騰させたら、組成比が変わるだろ。まあ、煮込まなければ、そんなに結果かわんねーけど。

正直ゲルの脱気なんか必要ない

脱気しないと、固まるのがおせーのと、でかいゲルの時スマイリングが激しい。
かりかりに脱気するとテンポ良く実験できるし、結果もシャープ（なような気がする）ｗ
2枚流して、片方ウェスタンしても、びったり重なるを目指してます。

TAクローニングキットのベクターは１０倍に薄めて使う
この場合インサートは２０倍ぐらいに薄めるか
むしろ
ほとんど増えていないぐらいのほうがよく入る

ライゲーションがうまくいかないあなた
一度
２μlでやってみな
１０μlのときの１００倍効率よくなる
はず

コロニーのピックアップには
0.2mの白金線

アラビドプシスを高速で育てて
世代時間をなるべく短くしたい。
エコタイプはコロンビア。
巷では世代時間は6週間とか言うけど、
もっとかかるよね。

超高速で育てる方法があったら
教えてくさだい。

>>369
モーツアルトを聴かせる

マジレスすると青色光下で育てろ。二週間で花が咲く。
（赤色光が花成を阻害するから）

皆さん、レス、サンクスです。

>モーツアルトを聴かせる

これって都市伝説ですか？
そういう題名の本が昔、売ってましたが。
音の振動みたいなのが生長に良いんでしょうか（眉唾）。

>マジレスすると青色光下で育てろ。二週間で花が咲く。

低窒素にしても花が咲きやすいですが、
こっちの方が、なんとなく、種の収量が多そうですね。
でも、花が咲いてからが結構時間がかかるよね。
鞘の成熟を高速でするには、どうしたら良いんでしょうか。


…もう、4月からアラビドプシスを使わない仕事に転職しますが…。

アブシジン酸を使うとかが考えられるけど、基本、老化はどうにもならん。
バッククロスとかホモ化とかだったらF1の状態で次に進めるという手はあるが。

>>337
PAGEにきりかえたらどうよ？

215とか313など

remember 312

サイス

事態を長引かせているファクターに関してすべて特定せねばならないわけだ
構造主義的アプローチ

>>137
scriptMDMA

script213

script199