★★実験の手抜き・節約・時間短縮method★★

みんなの裏技を披露しましょう

とりあえず、DNA用のチップ、チューブ、試薬は
めったにオートクレーブしません

mupidでは、ほとんどの場合、５〜１０分くらいしかエイドウしない。
毎回、きちんと端の方まで流す奴はDQN

エタチン後に、真空乾燥とかする奴はDQN
リンス後、spin downして、残った液体をピペット万で捨てとけばいい

>3
お前の実験は信用できん。

大腸菌のトランスフォーメーションの時、
アンピシリンで選択する場合は、
前培養（LBで一時間くらいあっためるやつ）は省略する

形質転換後、
プラスミドのインサートを手っ取り早くシーケンスしたいときは、
コロニーPCRでインサートチェックし、
目的のサイズが増えてきたら、それを精製して、
dye-terminatorでseqence
これなら、コロニーが生えてから、４時間後にはsequence反応が終わる

>6
お前の実験も信用できん。

もともと必要ない

>8
お前の実験も信用できん。
Taqで30cycleもやって増やしたDNAは
errorの山。そんなsequencingなんて意味無し。

トランスフォーメーションからミニプレップに進む場合、
真面目な人は、
トランスフォーメーション→単一コロニー化→液体培養
とすると思うが、
俺は、
単一コロニー化と液体培養を同時にスタートする。
まず、トランスフォーメーション後のコロニーを楊枝でつついて、
液体培養液に浸け、そして、その楊枝でプレートにストリークする。
コンタミしたことは、ない。（多分）
しても、いくつもやるわけだから、一個は正常なのが取れる

>>10
PCR産物を、ダイレクトシーケンスする場合は、
errorは問題になりませんよ。
知らないの？
>>8
必要ありません。
>>5
10分も流せば大丈夫でしょ。
ちゃんとチェックするときだけちゃんとながせば。
っていうか、そもそもちゃんとエイドウするときにmupidはつかわないよ

in situ nybridizationで、組織が堅くて、
うまくハイブリ液が広がらない場合は、
カバーガラスで表面張力を利用してなぞると、
切片はきづつかないし、はやく終わるからいいYO!

チューブ内の溶液を混ぜるときは、
チビタンなどで、スピンダウンしている最中にふたを開けて、
回転しているチューブをさわってはじく。
こうすれば、混ぜるのとスピンダウンが同時に終わる。
指は多少いたいが。
酵素反応の時は、そ〜っと指ではじきましょう（藁

ここまでのレスをまとめると、
５，８，１０はＤＱＮということでよろしいでしょうか？

photoshopでバンドを作成。
これ最強

PCR産物を制限酵素処理するときは、
L bufferなら、PCR液のまま。
M bufferなら、必要10xM液の1/2volume
H bufferなら、忘れた（笑）

ここにいるやつの実験は全然信用できん。

ここにいつ奴=
16とツッコミ以外は全部１

前培養って、アンピシリン以外の抗生物質でも、
いらないやつある？
カナマイとかハイグロとかは？

>12
errorは問題にならない、の意味がわからない。

>>21
いいか、おれが説明するからよく聞けよ。
errorがおこっても、それの何百倍も正常なものがあるから、、、

めんどくさいから止めた。
勉強しろ

アガロースゲルを作るときは、
必要な量のTAEと、必要な量の半分の水に、
アガロースを加えて、レンジで溶かしたら、
水を注いでメスアップ。
これなら早く冷えるし、早く溶けるし一石二鳥

>20 転写／翻訳を阻害する抗生物質は前培養しないとだめ。
アンピシリンは細胞壁合成を阻害するので省略可。

ちなみに、けっこう、実験医学だか細胞工学の本からパクってマス。

>>24
ちなみに、転写・翻訳を阻害する抗生物質って何？

>>26 自分で調べろ

>>27
おせーて

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>>28 生化学事典引け

いままでのを見る限り、
時間短縮というよりは、たんなるなまけものって感じだな。
良い子はまねするな。

数リッター単位で大腸菌を大量培養するときは
本培養用の培地は予め滅菌せず使う。
抗生物質やIPTGは粉のまま度場度場と投入。
収菌のときちょっと匂うけど実験には全然問題なし。

理論的にも経験的にも、問題のないものしか書いていません。
早く実験を終わらせて、大量に実験する、もしくはゆっくりやすんで
２ｃｈなどをすることが大切です。

>>20
昔、そのテの手抜きに興味があって、いくつかの抗生物質（と、もちろん対応
する耐性遺伝子を載せたなるべくidenticalなplasmid）でタイムコースを
とって確認したことがある。

結論は、６の言うとおり、アンピシリンは、形質転換直後にまいても
一時間液培後にまいても、効率は全く変わらなかった。
一方、カナマイをはじめクロラムフェニコール、テトラサイクリン等は、転換直後
にまいた菌はほぼ全滅。
なにしろ10年近く昔、教官に隠れて趣味でやった実験なんでよく覚えてないのだが、
確かカナマイの場合、転換後15分ぐらいからコロニーがあらわれはじめ、1時間後
にはほぼ安定する。2時間以上液培すると再びコロニーの漸増がみられる。
おそらく液体培地の中で細胞分裂をはじめている影響と思われる。

妙だったのはテトラサイクリンで、どれだけ前培養しても、決して出現コロニー数が
安定することはなかった。だらだらと増えていくのみ。テットの薬剤耐性はかなり
特殊なんで（確か細胞膜のポンプ活性）、耐性が出るまでに時間がかかるのかな、と
思ったことを覚えている。
こんなんで役に立つかね。

ワンタッチで詰め替えできるチップって、どれが安い？
今、BM BIOとかってと頃の奴使ってるんだけど。
これだと、ばら売りの２倍くらいの値段。

あと、0.2mlを安く、大量に収納できるケースを探しています。

>>34
神！

あの、ちょっと聞いていい？
１はどれくらいの研究歴なの？
いや、こういうのって、どれくらい信用していいのかわかんない
し、気になるんだけど。

で、１はどうよ？

もうすぐ１０年です．

ただし，これを読んでも，初心者にはいきなり教えない方がいい．
昔，後輩に，前培養の意義を教えてから，
アンピシリンのときはしなくて良いよ．
っていって，やらせてたら，
一年後に，そいつかカナマイでやったときにも前培養せず，
しかも前培養の存在すら覚えてなかったりした．
あるていど，基本的なことを覚えさせてから，
おしえましょう．

まだ書きたいが，用事があるので又今度．
他の人の裏技もおしえてね．

>>39
おー、１０年選手ですか。私と同じくらいですね。
信用してよさそー。
初心者には、おっしゃる通り、一度正式な方法を教えてからに
したほうがいいでしょうね。

PCRの反応はMg濃度が重要だ、といくら説明しても理解できないドキュンがいる。
PCRも出来ないのに博士論文発表会をやりたいとか、アホ？もーみてらんない

これまたその昔、俺がまだS35を使ってマニュアルシークエンスをやっていた頃、
ゲル板がうまく作れないのが悩みのタネだった。
一抱えある２枚のガラス板の間にスペーサーをかまして、
その間にゲル溶液をつつーっと流し込んで固めるアレだ。

どんなにきれいにガラス板を洗浄したつもりでも、なぜか気泡が入ってしまう。
まあ１個２個なら、そこを通るウェルを外してアプライすりゃいいだけだが、
薄いプラ板で気泡を除こうとゴチャゴチャやってるうちに、ゲルが固まりはじめて
ダイナシにすることもよくあった。

業を煮やした俺は、研究室が空になったある週末の夜、失敗しないゲル作りを確立
するべく試行錯誤を試みた。
おめーはそんなことばっかりやってたのかという突っ込みは勘弁してくれ。
深夜一人で、硬化剤（APSとTEMED）の濃度を変えてみたり、フレッシュな試薬を
使ってみたり、ゲルを脱気してみたり、ガラス板の洗いを工夫してみたりと
いろいろ繰り返した挙げ句、ついに再現性良く気泡が入らない方法を見つけた。
それはくだらないほど簡単なことだった。

硬化剤を入れた後、ゲルを流し込む前に５〜１０分待つ、ただそれだけ。

ゲルが固まり始めるちょっと前、粘度が上がってきたところで流し込めば、
表面張力が非常に強いので空気を押し出す力が強く、気泡が全くできない。
要するにそれまで手が早く動き過ぎていたと、そういうことだった。あほらし。
その日以来俺は、ラボでゲル作りの達人の名を欲しいままにした。（この
テクニックを誰にも教えなかったから。だってばかばかしすぎるじゃないか）
しかしテクを一人占めに天罰があたったのか、その後ラボに
キャピラリシークエンサーが導入され、俺の時代は終わりを告げた。

裏技というほどのものじゃないし、なにしろ思い切り時代遅れなネタだが、
DNAフットプリンティングのときなんかには、今でも使えるんじゃないかね。

あのー、ここ↓じゃ駄目なんですか？
「実験の裏技ありますか？？」２
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/996490423/l50
パート１はこちら
http://cheese.2ch.net/life/kako/972/972458683.html

素晴らしい。

>どんなにきれいにガラス板を洗浄したつもりでも、なぜか気泡が入ってしまう。

おー、やったやった。

>硬化剤を入れた後、ゲルを流し込む前に５〜１０分待つ、ただそれだけ。

そーか、そんな簡単なことだったのかぁぁぁ。
今じゃもう必要無いが…。
34先生、弟子にして下さい。

というわけでコッチに移行↓
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/996490423/l50

>>23
アガロースゲルは、作るたびに融かすんじゃなくて、試薬瓶に沢山融かして
おいて、65℃の乾燥機（インキュベーター）に保存しておき、必要な時に必
要なだけ使って、残りは再び65℃保存。これ、最強。

>>44ごめん。そっちのスレに同じ質問あるかどうか分かんなかったんで。

というわけでコッチに移行↓
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/996490423/l50

>45
おれはMupidのgel作成容器を大量にもっているので、
一度に作って、４℃に保存してるけど。precast gelみたいな感じで。
いちいち固めるよりも使いたい時にさっと冷蔵庫から
出して使える方がいい。

最早ミニプレプ

大腸菌o/n culureを45sec. maxでcfg
sup捨て、50マイクロlの0.1MTrisにresusp
等量のフェノクロ加えvoltex
cfg 1min max
sup取って、1/10vol 3M NaOAc, 2vol. Et-OH
すぐにcfg5min max
sup捨て、70%Et-OHでrince, cgf 30sec.
sup捨て、30マイクロL TE。

10分以内に終わる。

>48
でもそれって、制限酵素cutによるinsert checkくらいにしかつかえないでしょ。
sequencingやtransfectionにも使えるんならいいけど。
きちんとQiagen mini-prepすればすべてに利用可能なので、
そっちのほうが最終的には時間の節約になる。

>48
純度と収率はどれくらいですか？

>>49
スレは、★★実験の手抜き・節約・時間短縮method★★なんで、「節約」の
つもりなのでは？　どっちかっちゅうと「倹約」かな？

mini-prepは、機械でとる（笑）
手でとるより、プラスミドがバシッと切れるから笑える。

プライマーのTm値は、
バイオ実験イラストレイテッドNo,3の
表を使って決めると楽で正確

>>47
俺の部屋では大量に作ってTAEに漬けてる。
立場の弱い人間ばかりが作る事になりがちだけど。
後、４回生が作ったりすると穴空いてる。

>>54
俺はD2だが、俺が作ってる
ただし、他の奴にはめったに使わせない（笑）

bandが５本以下の場合は、ゲル抽出せずにクローニングして、
miniprepで選ぶ

>>23
そんなことして，ゲル固まりませんか？

>>57
すぐにやれば大丈夫です。
っていうか、水と混ざった所は、ゲル濃度が下がるので、
固まらないよ。
２％のゲルまで大丈夫だった

キャピラリーシーケンスいいよね〜
もはやゲルを作る木がしない。
しかし、ゲルを作ったことがない世代をみると、
かわいそうになる

エタ朕の前に氷におくやつはDQN

>>59
今度うちの部屋でもついにキャピラリーシーケンス導入！
もうあのでかいゲル作らんでいいかと思うととても嬉しい。

>48
この方法じゃＲＮＡいっぱい出るんじゃないの？

>>48
O/Nは時間がかかりすぎる

>61
sequencer買う金があるなら、業者に出した方がいいんじゃないの？

>>64
スピードじゅうしなんでしょ
>>62
でてもいいんじゃない？
制限酵素処理とかと同時にRNase入れておけば。
っていうか
>>48
の方法ってどの程度きれいになるの？
そのあとぺぐちんすればシーケンスもできるの？

エチブロなどの危険物用の手袋は、
RNA用や、チップ詰め替え用に用いた手袋を保存して置いて
再利用する。
超みみっちい。
しかし、こんなことをやっていながら、
チップはワンタッチで詰め替えの奴を使っている。
いまだにチップやチューブを再利用してる奴いるか？
また、ワンタッチで詰め替える奴の普及率はどのくらいなのかな？
箱後と使い捨てっていう強者いる？

箱ごとね

in situ ではいぶりのときにカバーガラスをかぶせる時に、
気泡が入らないようにするには、
カバーガラスにもはいぶりえきをすーっと一筋塗っておく。
一年かけて編み出した。
もっと良い方法ある？

>>14
それ、やってみました。
素晴らしい！！
効率がグーんとあがりました。感謝
指も痛くないですね

お役立ちスレが分散するのはもったいないからこっちにいこうよ。
「実験の裏技ありますか？？」２
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/996490423/l50

>>70
そっちはほとんど死に掛けてた上に、mupidすれとかしているきがする
じゃあこっちは倹約とかかな
正直どっちでもいい

>66
フィルター付きを箱ごと使い捨てにしてますが、何か？

>>72
ホントなの？？
すごい危険な菌を扱ったりしてるのか？

ゲル入りPCR

ゲル抽出の後，即PCRをかける方法．
電気泳動後（GTGクラスのアガロースが望ましいが，ふつうのでもいい，
ただし，余計なバンドのコンタミが増えるかも），
目的のバンドをパスツールでつついて取り出す．
100ulのTEに入れて，９５℃で５分温める．
それをテンプレートにする．
PCR反応液の1/20以下にしたほうがいい．
かなり応用範囲の広い方法だよ．

自分の精液ゲル・・・

>68

カバーガラスは使いにくい。黎明期は皆使ってたけど、
今はパラフィルムが主流だと思う。

適当な大きさに切ったパラフィルムをおいて、
上にハイブリ液をのせて、
スライドグラスを上からちかづけて、
液の張力でフィルムをはりつけせてから、
ひっくり返してハイブリする。

>76
私もパラフィルムですね。
でもスライドグラスにハイブリ液のっけて、そっとパラフィルム乗せるだけ。
ぜんぜん普通か･･。

なんでtransformationのときに抗生物質がアンピシリンだと前培養がいらなくて
カナマイシンだといるのかがわかりません。アンピシリンは細胞壁合成を妨げ、
カナマイシンが転写翻訳を妨げると聞いても？？？？
ヒントだけでもプリーズ！

sage

耐性遺伝子が発現する前に効いたらどうするよ。

>78
静止期と細胞分裂がヒント。どの時点で耐性遺伝子産物が必要か、
考えてみたら分かる。
静止期にも翻訳は必要だろ。それがジャマされたらどーなるよ？
アンピシリン耐性なら、増殖期に入る直前までに獲得されていたら
OK。

>73
コンタミとかが起きないようにすごく気をつかってて
マイクロピペットもオートークレーブ可能なタイプ、
P2（大腸菌）エリア、泳動エリアなど区画がきっちりわかれ
そのエリア専用の器具（ピペット、遠心機）もあるよ。
ピペットを実験台に直でおくのも厳禁、バッファーなども
出来るだけ作製済みのものを購入、水もお高い水を
購入して使ってます。

>>83
すげーな。
研究対象生物はなによ？
ただの実験生物なら笑うよ。マウスとかハエとか戦中とか雑草とか

パらフィルムか。。。
やられた。
俺のラボは原始時代だったのか？

パラフィルムでやると、ハイブリ後にはがすのが大変なんて事は
ないですか？
カバーガラスなら、傾けただけで滑って行くんですが

ご心配なく。
強引にはがしても、切片が傷む事はまずありません。
これはガラスでもいっしょですが、ハイブリの時の
湿度とふたの密着性には気をつけて。
湿箱を用いる場合は、水にしないで、ハイプリ液と
同じホルムアミド濃度溶液にすると、ハイブリの
ムラがなくなります。
もっとも、お金があれば、ハイブリをスライドメーラー
内でやってしまうのが一番です。

ハイブリの後、ホルムアミドの入った溶液中につけてパラフィルムが
浮いてくるのを待てば完璧だよ。

＞８5、８６

そう、わざわざパラフィルムを剥がしたりしない。
ハイブリ後のスライドをラックに載せて、
洗浄液にいきなりつける。パラフィルムは軽いので、
溶液に浮いてきます。それをピンセットで回収して捨てます。

手軽な上に、コストもはるかに安いです。
（日本はパラフィルム高いんだっけ？僕は現在海外。）

このスレ結構好きだからあげ。

こっち↓が元祖＆本スレ。
「実験の裏技ありますか？？」２　　
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/996490423/l50

今時でなんですがPCRの時にミネラルオイルを重層しています
どうやったら効果的にミネラルオイルを取り除けますか？

91>
パラフィルムに乗っけてつつーっと流す
パラフィンが疎水性なのでオイルがくっつき反応液をはじく

>>91
まだそんなラボあるんだねぇ。

＞９３
それがさあ、他の人が使っているもんだから、
しょうがなくて片隅にあった古いPCR使ったンよ。
オイルの要るやつ。

そしたらそっちの方が全然バンドが濃いんだよ。驚いたよ。
むろん全く同じ条件。

古いPCR使ってる皆さん、嘆くなかれ。あれ、結構いいのかもよ。

>>94
ん〜、ホント？
試してみたい気もするが、もううちのラボにはミネラルオイルを必要とするサーマルサイクラーはないよ。

検証実験報告求む。

昔ラボの権力者にいぢめられて、泣きながらミネラル・オイルのいる
ＰＣＲ使ったらいきなりクローニング（５’ＲＡＣＥ）がかかった事が
あります。
悪くないと思った。

同じＰＣＲ機使っても、オイル使用した方が結果が安定していて
いいですよ。ここ一番ではわざと使ったりしてます。

＞必要とするサーマルサイクラーはないよ。

オイルフリーのPCRでも、オイルを入れてまわして御覧。
オイル無しでかけるよりもイイよ。まじで。

かかりの悪いプライマーでつかうと結構うれしい。

オイルフリーのサーマルサイクラーにオイル入れていいの？
オイル漏洩による電気系統への影響が心配だ。
まぁ熱伝導率とかを考えるとオイル入れた方がいいに決まっとるが。

>98
それ試してみたけど、結果は変わらなかったな。

>>99
明らかに話を誤解しとるな。
チューブの外のオイルじゃなくて、チューブの中に
蒸発防止の為に入れるoilのこと話してんのよ。みんなは。

いや確かに昔は、オイルを入れないと使えんサーマルサイクラーも、
あったんだが（COYとか、、、遠い眼。。。）

＞９８、９９、１００

プライマーによるよ。

測定データを直線回帰し、そのスロープさえ求まれば問題ないので、
測定点2点しか取ってない。
おれの実験は信用できん！自分で言ってしまったりする。

>>99
一般にオイルは絶縁体。

>>102
GCがrichな時に効くの？

>105
漏れの成功例は確かにGCリッチ（ゲノム）でした。

O/N の大腸菌カルチャーを遠心し、ペレットダウンする。
　
Solution I , II , III をベンチに用意する。

ダルイと思って、大腸菌をマイナス８０℃で保存。

夜は飲みに行って、次の日プラスミド回収。これ最強。

>>107
-20℃でいいよ。最強じゃないし。
GST fusionタンパクとかMBP でも、ドライペレットで凍らせるのは常識。
セシクロ用（時間節約組には縁が無いか）とかGST用とかの、たまたま
失敗しそうなものは、スペアを作っておく。これ常識ね。時間の節約にもなる。

おれもそれはあまりにも当たり前で、書こうとはおもいもよらなんだ。

金曜の夜にカルチャー始めて、翌朝に他人に4℃に移してもらって、
土日は彼女とデート。これ最強。

>>110
金曜にプレートを渡し、「（土曜にプレカルチャーして、）日曜の夜くらいに培養しといて」
という方が最強。プラスミドを渡してトランスフォーメーションからやって貰うのが
もっと最強。以前、そういうの普通にやってたよ。

>>66
チップ、エッペン＆シリンジ洗って再利用してます。
スライドグラスも。

そっか。チューブに入れる方かぁ。
ホットボンネットによる影響が出にくいのかなぁ。。。
オジサン勘違いしていたよ。ご指摘どうもありがとう。>>101


>>104
ウチにある古いサーマルサイクラーには
「オイル漏洩は致命的な電気系トラブル発生の原因になる恐れがあります」
って書いてあるーよ。

CG培地のサンプルをどっかからもらって、
金曜の夜植菌＞月曜朝回収。
意外といける。

>>113
考えてみた。たしかに原因にはなりうる。
スイッチや可変抵抗の接点についたら接触不良起こすかもしれない。
しかし水だと回路のどこについてもショートするから、それよりは
はるかに安全。まあそんなところだ。

>>112
ネタ？

>>116
マジ

実験しないに限る　

＞１１８
いいこと言った。

実験嫌い。
バイオ員ふぉに移ろうかしら。

x-galを大量に入れると早く判別ついていいね〜

taqを大量に入れると余計なバンドがふえてこまるね〜