僕のtwo-hybrid日記

ま、IPも擬陽性バリバリだけどな。

結局結合タンパク取るには何がベストなんだ？

>>718
おれは１０年かけてどんなものでもIPできる境地に達した。
IPはおれにまかせろｗ

酵母2-hybridでベイトコンストラクトがちゃんと発現してるか確認しないで使うのは御法度

イムノブロットとかでベイトコンストラクトがちゃんと予想分子量にシグナルがあるかどうか
調べた方が良い。

そんなことは無い。
ウエスタンで検出できる量よりはるかに少ない発現量で十分。

おれはクロンテックのシステムでmyc（HA？）の抗体でベイトを検出
できたことがない

最初,2hybridのベイトこさえて5mM 3-ATで生えてこなかった。念のためWBやったら切断されてて
DNA結合ドメインとベイトが分離していた。

リンカーを詰めて再度、ベイトをこさえたらDNA結合ドメインとベイトの合計分子量にバッチしシグナルが出た。
だがしかし、80mM 3-ATでも生えてきたよ、、、、、orz

lysate調整の時に切れたんじゃないの？＞WBやったら切断されてて

>>716
ありがとうございます。
とりあえず、Y187はあるのでそれでやってみるかな。
ベクターを変えるというのはGAL4のシステムからLexAに変えるということでしょうか？
それともGAL4で別のにするのでも意味があるのでしょうか？

>>721
ベクター変えるぐらいしか思いつきませんが、発現していない場合、
どういう対処法があるのでしょうか？

stratageneのcytotrapはいかがでしょうか。
核内と核外で普通に考えたらまったく異なる結果がでるはずですが。
経験者意見をお願いします。
当方細胞骨格系の遺伝子のy2hを考えています。
結局キットはclontechがいいんですか？

迷うよりやった方が早い。
何度も言わせるな。

俺は727ではないが。
やった方が早いとは言うけど、キット何十万もするからなあ
俺はmatch makerでいろいろとってきた経験があるからあれだが、
改良されたmatch makerは核内移行シグナルがついてるから、
cytotrapと同じ効果が得られるんじゃね？
それとも細胞質と核内じゃ結合環境が違うということか？

この人はどうしてそんなことが言い切れるのだろうか？＞核内と核外で普通に考えたらまったく異なる結果がでるはずですが。

全くということはないだろw
結局ADとBDに核内移行シグナルが付加されてるから普段核内にない分子が核に
入ってきて結合する．
だからいままで核には存在しない因子も取れてきている．
ただ微妙な塩濃度等？が影響している場合は取れない．

おまえらウダウダ言ってる暇があったら、
実際の細胞にタグ付き発現させてマス解析しろよ。

お前計画をしっかり立ててから実験しろ．
無駄な実験で人生無駄にしたいんですか？

二つのキットを比べたやつなんているか？
あれ１キットだけで50万だろ．

マッチメーカーよいよ．
クローンテックはライブラリーの質がすばらしいのでは？
SMART方は本当にすごい

クロンテックのカスタマーサービスのひどさはガチ

今の時代
免疫沈降やってでてきたバンドを切り出して
あるいはまとめたままの状態で、
LC-MS/MSするのがベストじゃね？
two hybridのメリットって何よ？

やればやっただけ時間が経つからピペット土方の暇つぶしになるよ

極微量しか発現しない因子も取れてくる可能性があると思うがどうよ？
素人ちゃんなんで、
大きなことは言えないが。

３週間（実労５日）で候補が取れること。

LCMSやるのにどれくらい金かかると思ってるんだ？
一つ一つバンド切り出してたら結合タンパクが多い場合
大変じゃないか？

ハビチュエーション因子の研究で清水先輩がLC-MSで検出したABC輸送体断片はなんだったんですか？

バカだなぁ。
どうせTHでものが取れたら細胞で免沈とかやって確認するんだろ、
だったら最初から免沈してマスの方が早いじゃねーか。

それに今時THで新規遺伝子取れて相互作用ドメイン決めましたとか言っても、
JBCが関の山だろ。

マスで取ったって改めて免沈のデータは要求されるだろが。
てか、グズグズ言ってるより論文出せよ、な。

マスが行ってりゃIPでウェスタンのバンドが出ないなんてことは無いだろ、１週間で出来る。
でもTHからだと、IPの実験系から組まなきゃ行けないじゃん。

てか、グズグズ言ってるより論文出せよ、な。

IPってそんなに大変か？

サイトトラップはホストの株をちょっといじらないとバックが酷いらしいよ。
>>747
モノによるよ。シングルIPなんかはあんまり信用されない時代だけどな。
最近はTAPtagという便利なのがあるから酵母屋さんは楽になったね。

てか質量分析やるにしてもバンドがたくさんある場合はどうするのよ？
あれってまとめてMSできるんだっけ？
マスコットサーチじゃ限界あるだろ？

俺プロテオミクスはあまりしらんが，LCMSMSってLCで分画を取るからなん種類タンパク質が混合さろていようが一回で解析できるんじゃね？

いまの流行はMudPITでしょ？

どっちでもいいから、論文出せよ、な。

>>752
revise中です＞＜b

mudpitって受託やっているところあるか？
受託どころか、日本で持っている研究室ほとんどないだろ？
日本だと現実的じゃないよ。

>>754
日本の事情はよくしらんけど理研でやってる人は何人かいるはずだよ。
アメリカでは普通にやってるねぇ。別に珍しくもなんともないよ。先週も
サンプル作ってfacilityに持ってった。

費用はいくらくらい？
うちは金持ちラボだが、
5サンプル出したら300万は軽く超えるだろ。
なかなか手を出しずらいよ。

1サンプル350ドルだったと思う。
まぁ安くはないけどね。

そんな安くないだろ。
俺のいるところは、
一回最低数十万はするぞ。
一時間あたり1万みたいな。

>>758
さぁ、どうなんだろうね。学内利用者と学外利用者で全然値段が違うらしいし
正直適正価格がどの辺りなのか、門外漢だから知らないなぁ。
けどルーチンでやってるから1サンプル数十万円ってのは有り得ないと思うよ。

》758

学外と学内では二割くらいしか違わないが、
大学によって格差があるんだよ。
探せば758の言うようなところ何箇所かあるよ。
高いところは設備が最新なのかもしれんが。

免沈して取れてくるタンパク質の同定なんて、
mudpit使わなくても、
nano-LC-MS/MSで十分じゃね？
mudpitは数十以上ある場合に使えばいいんじゃん？
nano-〜だと何種類までオッケーなんだろうか？

全種類

誰だよage嵐してるの。

良スレage

今追い込まれながらtwo-hybridしてる…
でない…

2ハブリッドは二ヶ所のラボでやった、どっちもジャンク遺伝子しか釣れなかった
失った時間＞PRICELESS

>>765
捏っちゃえよ