僕のtwo-hybrid日記

何かと問題が多いとされているtwo-hybridを、今日から始めるので
実験日記を書きます。
ベイトは、植物のとある転写因子で、アクティベーションドメイン
の有無などは分かりません。
とりあえずくっつくタンパクを探します。
two-hybridは片手間にやってる実験なので、進行は遅いかもしれません。

とりあえず、初日。

良く解析されてない遺伝子なので、全長をベイトにすることにする。
kitはMatch-maker2.
開始コドンから終止コドンまでを増幅するプライマー（両端に
制限酵素サイトをつけたもの）で、cDNAをテンプにしてPCR.
無事増幅されたので、制限酵素処理後とりあえずBluescriptに
クローニングしてトランスフォーメーションしといた。
明日白コロニーが出ることを祈る。

なんでベイトベクターにクローニングしないの？

以後なるべく下げ進行いたします。
>>3とりあえず、PCRで塩基が間違って増幅されてないかを
シーケンスで確かめないといけないんだけど、
ベイトベクターだと、ダイターミネーターしかつかえんから、
ちゃんと読めないかもしれないのでBluescriptにした。
それ以上に、ベイトのベクターは、青白選抜できないので、
インサートが入ってるクローンを選ぶのが大変なので、
Bluescriptでちゃんと確認してから、切り出してベイトに
入れた方がいいと思ったんです。

うーん。実験日記か。なんでこういうスレいままでなかったんだろ。
いいかもしれない。
乱立はやだけど。
あと、ミニプレップ日記とかも困るけど。

オレもツーハイブリやっとるけどね。
もしCG1945なら生育が遅いよ。特にBD側にpAS2-1とか使っているとね。
SC-Tでコロニー化して、そこからAD側をtransfectしたりするのなら、結構時間がかかる。

あと、なんでTA-cloningしないの？

>>3
ベイトベクターは大腸菌ならlow copyで、色々と不便なことも多いよ。

転写因子でtwo-hybridか・・・・・
バック高そうだね・・・・・
AT100とかでスクリーニングする羽目にならないことを祈りましょう

うまく絞り込むか、徹底的に力仕事でいくか、覚悟がいるな。

今日は取りあえず白コロニーが沢山生えたので、
シングルコロニー化と液体培養を同時にやっといた。
明日マシーンで16クローンミニプレップして、
制限酵素処理でインサートチェックして精製してシーケンス反応する予定。

みなさまレスどうも。ちなみに俺、コンタミ以外の酵母見たことありません。
いままで。
こんなんで平気なのかな？
>>6制限酵素サイトでクローニングすれば向きも決まるし、
なによりも、in-frameでつながると思ったんですよ。
それに予算はたくさんあるので、プライマー長くしとけ。ってかんじで。
>>7
転写因子だとバック高いんですか？
こりゃ早めに全長じゃなくて細切れにしてベイトつくったほうがいいかな。
>>8
やっぱりバックグランドとの戦いですか。。。。
ある程度しぼりこんだらシーケンスして面白そうな奴だけに絞り込む予定です。

Ser/Thr-rich
Glutamine-rich
Proline-rich
Acidic domain
PEST motif
WD-40

どれもベイトに入れると、数十mM3-ATでも生えてきたりします。

ベイトによる転写活性化能を調べてからじゃないと
スクリーニングには取りかかれないと思われ。
ちがってる？

あとね、ベイトベクターを作成したらGal4DNA結合ドメインかLexAとの融合タンパク質が正しく発現しているか
イムノブロットでチェックしないといけない。

3-ATが低濃度で増殖阻害がかかるけど、まず酵母内での産物確認してみたら、フレームは合っているのに蛋白質分解を受けて
ベイトのDNA結合領域のバンドしかみえなくて中止して、一部デリートしたコンストタクトは正しい産物が出来ていたけど
１００mMを超える3-ATでも生えてくるので、結局ストップしたことがある。

サイトトラップ、、、って、どうよ？

３−ATって、危ない物なの？
取り扱いとか注意した方がいいんですか？手袋とか、、。
あと溶液にした物をー２０℃で保存しても大丈夫ですか？

書いてなかったけど、ベイトができたら、ベイトだけで増えないかどうか
をまずはじめにチェックします。

プロリンリッチのように見えなくもない配列が、ど真ん中に
あるようにも見えるんですよねえ。。。。

3-ATはカタラーゼを不可逆的に阻害します。ポルフィリン環をもつタンパク質を阻害するのかもしれません。
カタラーゼが阻害されると、酸化ストレスにより、DNA破壊などがおきるかもしれませんから、むやみに素手で
触るのはやめましょう。

名スレの予感・・・

でもいきなりtwo-hybridって泥沼にはまる典型的なパターンの様な気がしてならない

劇物も注意が必要だが、なによりも、-80℃のフリーザーをなめてかかると
手がぼろぼろになるな。

＞１８
便乗質問でスンマセン、
ありがとうございやす。

私は3ATはあまり気にせず素手でさわってる（笑）
オートクレーブは不可、培地をオートクレーブしてから60℃くらいまで冷まして
フィルター滅菌しながら加えてよくまぜる。
泡だらけの培地になりやすいので、オートクレーブする際にスターラーバーを
いれておくとやりやすいよ。

書き忘れてた。
-20℃保存は不可、用時調整と教わった＜3AT

>>22
LBのようにぐるぐるまぜても泡が消えるとは限らない（ｗ
泡立つ培地ってSCね。YPDはLBみたいなもんでしょ。

疎水性アミノ酸もいっぱいあるからなぁ。

SCは、はじめからすべての選択アミノ酸をDropOutしたものを一つ作っておいて、後から必要に応じて加えるのは常識だが、Agar培地でも後から塗ればいい。単独の10xくらいの選択アミノ酸(あるいはアデニン)だと薄いので、100x,500xにしとく。

>>10
向きを揃えたほうがsequenceのとき便利なのね？　いや、ま、いいんだけど。yeast用vectorに入れないんならいちいち切るの面倒でないかなと。

＞コンタミ以外の酵母見たことありません。

うーん、、、、毎回コンタミさせる人いるんだよねー、、、、それは手技に神経が払えるようになると改善されることもあるけど、細胞やったことあるのかな？　それがあるのとないのとで結構違ったりする。酵母とかの細菌用のクリーンベンチ使ってるよね？
それから、細胞やったことなかったら、参考程度に細胞の培養本読んでも良いんじゃないかとおもう。

ライブラリーから「青コロニーつった!!」と思ったら転写因子だったということはある話。

Sarah J. Fashena, et al.,GENE,250,1-14(2000)
と
関連Ｗｅｂ(paperにある)を参照してもいいだろう。

カビらしきものが見えたら、すぐさまその周辺のagar培地をテイネイに切り取る。それで助かるときは助かる。胞子がすでに散ってたら南無阿弥陀仏.....

白金針で焼くとその衝撃で胞子が飛び散ってしまうこともある。

いやーみなさん、いいひとだ。役に立つ情報だらけだ。
今日はとりあえずシーケンス反応しといた。
月曜か火曜にキャピラリーで読む予定。

コンタミ酵母しか見たことない。ってのは、
要するに、酵母を扱ったことがないってことです。
植物を培養するとよく酵母が増えてきますので.
それから、match makerのBDベクターに入れるときに、
制限酵素サイトを使ってin-frameでいれるので、ぷらいまーにつけといたって事です。

そろそろコンピテンとセル作ったほうがいいのかな。

Competent Cellsは要事調製にしてる。つくるのに、そんなに手間かからんと思うけどな.......　適度なO.D.まで培養して集菌し、水で洗ってLiAc/TE溶液に溶かすだけ。もし二段階でBD側とAD側のvector入れるのなら、BD入ったのを再Competent Cells化する。BD側が入った効率をチェックしないといけないときには二段階でやる必要がある。

＞24
もちろんSC。two-hybridの時ってYPDプレートは使わなくない？
backを減らすため、できるかぎりpoorな培地にまくようにしている。
29さんの言う通り先にbait側のプラスミドが入った酵母をつくっておいて
そこにlibraryをtransformし、直接selection培地にまく。
コンピテントセルは当然用時調整。できるかぎりtransform効率をよくしないと
libraryがもったいない。
っていうか酵母のコンピテントセルって保存きくの？

yeastのCompetent Cell を保存して使ったことあるヤツいるのかな??　いたらどういう条件でどうなったか知りたいよなぁ....

カビは一晩でどばぁと増える。
ついでにちょっとageとく。

なるほどなるほど。
ちょっとした学会がらみで忙しいので、
シークエンスを読むのは明日の夜からになりそうです。
SCってあわだつんですね。

>>31
Dohmen RJ, Strasser AW, Honer CB, Hollenberg CP
An efficient transformation procedure enabling long-term
storage of competent cells of various yeast genera.
Yeast. 1991 Oct;7(7):691-2

>>33
なんで泡立つのか考えてみよう。

ポジのコロニーからBD or ADどちらかのPlasmidを回収したい場合、要らない方のマーカーを加えた培地でしばらく振ってやってDNA回収すると割合としては自分が求めているものが多くなる。

>>22
Liauid YPDを使うことがある（ｗ
二段階でＢＤとＡＤ入れるとき、ＢＤ側はＹＰＤでも良いな。ＡＤ側入れるときもＹＰＤで数時間カルチャーしてやって集菌してコンピテントセルにすることもある。スピード重視のときなど。もちろん脱落が考えられるが影響ない系なら良いだろう。

>>31
Invitrogenと一緒になる前のLifetechにも、frozen competent yeast
を売ってたよ。失敗ナシの謳い文句で。

>>36
BDのplasmid回収することなんてあんの？

BDのplasmidを回収するときももちろんあるよ。もちろん状況により、だが。

prey vectorを回収しようとしたら、染色体に入っていたり、bait vectorとfusionしていたことがあった。
prey vectorのマルチクローニングサイトの両側のプライマーを造っておき、シーケンスとゲノムからインサートの
PCR増幅に使え。

>>40
BDのプラスミ回収するのって何のため？
参考までに教えてくださいな。

>>42
libraryがADばかりとは限らないから。事前にそういう系でツーハイブリに関して何かが行われている場合。

>>41
そのときのvectorの名前はわかりますかねぇ？

>>43
BDをライブラリーにしたらself-activatingなクローンが山ほど出ると
思われ…

>>34
情報thanks！そのうち論文をみつけてきます。
しかし、1991とは結構古い論文だけど
yeast扱ってる研究室の人で、その方法使ってる人いるのかな？

>>37
だからプレートって書いたのにぃ（笑）
baitいりの菌にtransformするときは、選択培地でO/Nで培養して
翌日朝にYPDに植菌し直してlog phaseまで培養。
やはりコンピテントにする酵母は元気でないとね♪
どうせ播くのは選択培地だから問題なし。
>>41
そんなめったにないことのためにプライマー作っておくのはもったいないかと(^^;

>>21
そういうのがないと裏付け取れている場合は関係ないよ。ライブラリーといっても、何か未知のものを釣るとかいうのではなくて、mutagenesisなどの場合ね。色々と裏づけした上でやり直すのなら、ひっくり返せば良いけど。

＞46

クローンを取ったら、プレイベクターのinsertをpBluScriptに移してしーけんすするのか？
プラいまーを買うのは無駄ではない

primerをケチるほどではないかなぁ。数にも寄るけど。

クローンが取れてそのうちの50個をシーケンスしたら、
そのうちのひとつが機能の不明な遺伝子だった・・
（blastnでヒットした）
さてどうしようかなと思案中。片手間にやってた実験だったから。

どうでもいいが、見ていてすごく効率が悪いと思う。
横にこういう後輩がいたらイライラしそうだ。
３ATはオートクレーブしても大丈夫だよ。
その代わりちょっと高濃度必要になるがその濃度を把握しておけば問題ない。
baitは直鎖化して染色体にintegrateしてしまえば二段階でtransformationする必要無くなるし、
ADライブラリーの形質転換効率もグンと上がるが。
primerをケチって無駄な手順を踏むのもどうかと思う。

>>48
たしかにsequence用のprimerはいりますねぇ。
頭はactivation domain内に、後ろはterminator配列を選ぶと、汎用性が高くなるかな。
でも、ふつーにプラスミド回収して取れてこないようなクローンを解析するくらいなら
解析するcandidateを増やすなぁ・・・・
>>51
高めのAT濃度で使う場合はいいかもしれないけど、1mMとかで使いたい場合は
やっぱりオートクレーブはしたくないなぁ(^^;
baitをintegrationしちゃうのはいいかも。プラスミド回収も楽になるし。
マーカー内のサイトで切るんですよね？
2micronとかあるプラスミドでもちゃんと入ります？

>>50
できないんなら、さっさとできる人にわたしましょう。

ま、色々と手技の違いもあるね。あんまりにもヒドイものでなければ、寛大に解釈していた方が色々な意味でうまくいく気がするけど。

うわっ、みなさんどんどんわたしに関係なく盛り上がってますね。
ちなみに、予想外に学会関係の仕事が忙しくて、現在なかなか進んでません。
シーケンスしたところ、全部正常なものが入っていたので、
制限酵素処理して、フェノクロ、エタ沈後、BDベクターにクローニングして、
大腸菌に入れときました。
ホントなら、ゲル抽出した後にクローニングするんでしょうが、めんどくさいので
そのままやって、後でスクリーニングすることにしました。
Bluescriptベクターが入ったものと、インサートが入ったものと、何にも入ってないもの
しか生えてこないはずなので、コロニーPCRでスクリーニングします。
で、その後一応ジャンクションをシーケンスして（キット付属のダイターミネーター用のプライマーで）
イーストに入れる予定です。

>>1
日記だろー、返事書いてどうする。盗み読みする気分が出ないじゃないか（笑

面白いね、このスレ｡
1さん、頑張って

two-hybridって立ち上げるのに結構大変なのに、上の連中は
いとも簡単にできると思ってる。
苦労してやっとこ始めて成功した時のボスのセリフ
「なんだこんな簡単にとれるのか」

クロンテックのライブラリ、アンプリファイが疲れる・・・・・・・・

two-hybridで釣れなかったら釣れなかったとき。それはあくまで自己責任。やれと言われて何も考えずに「はいやります」と言ってやって出なかったとしても、直接の責任はスタッフにあるのではないしな。スタッフの上昇志向アイデアに振り回されるのが嫌なら自分でできる限り判断のできるようにしておくことは大切かね。もちろん、相手にしているのが"なまもの"であり、分子レベルのことだから、いくら頭の中で「いける」と思ったからといって、絶対という保証はないよ。
それは、やってみないとわからん。実験科学なんだし。どちらかといえば、two-hybridはやってみなわからんことの要素が大きいからね。やってみないとわからんことを逆に言えば、バクチの要素が強いということだな。バクチで負けてもやっぱり、じ、自己責任なんだな.....
だけど、バクチで勝てば、や、やっぱりおいしいんだな......

テーマはあくまで自己責任で。

ツーハイブリが比較的継続的に動いてきたラボでは、トラブルシューティングも行いやすい。
そういうところでやるのなら、手技に関しては、やるかやらんかの差だとおもう。得た結果に対する議論はまた別の話だが。

みんなＡＨ１０９のトランスフォーメーション効率は
どのくらい？
Ｙ１９０に比べてえらい落ちちゃうんですけど・・

>>14
遅レス失礼。サイトトラップ、リバータントが高くて苦労した。あと、バックで
Ａキナーゼばっかり取れた。

>>60
まあ、そうなんだけど、シーケンス見るまでなら１ヶ月で答えが出るん
だから、とりあえずやってみるというのもアリなのでは？しかも、ほと
んどincubation timeばっかりの１ヶ月だから、副業で十分ＯＫ。

bait構築　1 week
bait TFとself-activation check 1 week
library TF 1 week
colony PCRとseq　1week

〆て１ヶ月

私はやったらだめとは言ってないですがねぇ......
事実、自身もツーハイブリやっている身だから。

ツーハイブリには落とし穴も多いけど、ツールとしては有用だからねー。ツツケば何かしら出ますからなあ。出るというのは何にもなかったと言うのが「出る」ということも含めて。手技的に困難なところはあまりないし(普通にmolecularやっている人なら)、純molecularすぎてLB-ampなんかに慣れすぎているといささか困ることもあるだろうけど。

更新遅くてスイマセン。あくまでも、サブの実験なので。
本日は、コロニーＰＣＲでインサートチェック。
ちゃんと入ってたので、培養しといた。
明日プラスミドとって精製してジャンクションを一応シーケンスでチェック。

まだベイトも構築出来てませんな。あはは。
イーストでも増やしてみるか。
コンピテントセル用の。

ちなみにベイトの遺伝子は、苦労してクローニングした
植物の発生関係のmutantの原因遺伝子です。
先生がこのスレを見てないことを祈ります。
見てたら絶対ばれるな。

それから質問。
AD用のlibraryを作るときの逆転写のプライマーって
どういう風に設計すればいいですか？
ランダムフライまーですか？
全長cDNAにしない方がいいんでしょ？

自分でライブラリ作るんですか？

ランダムプライマーのライブラリーだと結合部位の同定もついでに
できてしまうことある。
オリゴＤＴのライブラリーは全長（もしくはほぼ全長）なので、
トランスフォーメーション効率をかせげる（言い方変かも）。

MADS-boxかい？＞67

>>69
違います。
これ以上は内緒。
>>68
全長だとbackがたかくなったりしないんですか？
それから、AD用のベクターに入れるときに、
in-frameで入れる方法なんてないんですか？
ADライブラリーの作り方についてもっと情報募集いたします。

バックの高さはベイトに依存することのほうが多いと思うけど。
比較したことないのでちょっとわかんないです。
in-frameでいれる方法はわかりません。
１／３になっちゃうのは仕方ないと思っていますけど・・・。
あ、ランダムプライマーだと１／６か。

そういやbaitって何も付けないでも無視できないくらい転写活性化能高いよね？
bait-ビコイドをネガティブコントロールに使うのを推奨されているけど、
コントロールにbaitだけでもいいの？

あげ

先週末、イーストYH109をふやしとくか、と思ったが、
アデニンが当研究室にはないことに気付いて発注しといた。
明日届くだろうから、明日から増やして、週末にトランスフォーメイションだな。
ベイトは多分、ちゃんと出来てるだろう。
一応明日シーケンス。

んでその後どうなったん？

かなり休載が長期にわたったが、復活あげ

ちょっとノックアウトのスクリーニングで忙しかったので。
ベイト完成したとおもって、一応ジャンクションをシーケンスしてみたら、
ATGのAが抜けていることに気付いた。
多分プライマーの質が悪かったんだろう。
ってことで作り直した。
でも、いちいち、まじめにやるのはめんどくさいので、
プラスミドのシーケンスは、
コロニーPCR→カラム精製→ダイレクトシーケンス
でやった。
これなら一日で終わる。
で、今日ベイトベクターに入れてシーケンス。
うまくいってりゃ明日取りあえずベイトだけで増えてこないかチェック開始だ！

で、ターゲットライブラリーを作るときの
プライマーは結局どうやって設計すればいいの？
植物にはpre-madeなライブラリーなんて売ってないんだよ。

ああ、もうこれで完全に指導教官にはばれるな。
まじめに実験してるので許して下さい。

相互リンク
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi?bbs=life&key=995004144

メンテage

更新遅すぎ？
ってなわけで、ベイト完成。
ベイトのみでトランスフォーメーション中よ。

全くわけが分からないので、トランスフォームした溶液を
２５ulまいたら、まきすぎのような気が。
なんだかびっしり生えてきてるように見える。

あと、コンピテントイーストの培養ってまじめにやったほうがいいんですかね。
液体培養してるときにフラスコ倒れてガタンゴトン言いながらまわってたけど、
今回はいいか。なんて感じで適当にやっちゃったよ。
細胞工学に、two-hybridの実際。
なんて連載があったみたいだが、全く役にたたんな。あれは。
ちなみにシロイヌナズナのGさんは、シロイヌナズナの適温である
22℃でハイブリさせたら上手い具合にとれた。
なんて書いてたな。奥が深い。
さすがEMM研に居ただけはある。

ちなみにtwo-hybridをやった人にアンケートとったりしたサイトがあるらしい。
どこで失敗したかとか。
http://www.fccc.edu/research/labs/golemis
だってさ。
これから見てみます。

↑けっこういい！

形質転換効率はまぁ一回計ってみたらいいんでないの？　薄めに撒いてさ。練習も兼ねてるんならそんなに無駄でもないでしょ。
O.D.600=0.5〜0.7程度の間でそんなに厳密にならんでもよいと思うけど、自分の手技による形質転換効率を一切知らないでやるのはちょっと怖いかねぇ。
Libraryを無駄にも急激な重複を避けるためにも。

実験日記を２ｃｈに書くというのは、面白い試みだと思う｡よってあげ。

面白い。もっとつっこんで。

どうやって測るの？

>>89
ん？　transformation効率はかったことないの？　結構、初歩的なことだと思うのだが......
定義は状況により変えてもいいが、「コロニー数(オーダー)／μg(DNA)」がまぁ一般的かねぇ。
大腸菌のコンピセル作ったときも、pBR322使って一回計らない？　うじゃっと生えてきてコロニー確認できなくなったらだめだから薄く播くんだけども。
独立コロニーが確認できる程度に薄く播いて、そのコロニー数を数えて、そのときのDNAの量から判断する。もちろん、DNAは、自分が使うLibraryのものを使う、O.D.値を揃えるなど、条件を揃えることは必要だが。

数少ない貴重な優良スレなのでage

1000めざそうぜage

めざそうあげ

わたしもtwo-hybridはじめたばかりです。
今日transformantを培地にまきました。
お互いがんばりましょうあげ

yeastは大腸菌(Amp耐性)のようにあま〜くみているとすぐにコンタミする。
ふたの開いたプレートの上に手をかざすなんてのはご法度だ。

質問板にも書いたが、まったく生えてきませんでした。
ポジコンも。
プレート間違ったのかなあ。
SD/-Try or -Leu/+X-gal
でいいんですよねえ。
それから、３日も30℃に置いといたら、プレートひび割れしませんか？

びっしり生えてきてるようにみえたのは、気のせいというか、
死んだ酵母であると思われます。

で、びっしりすぎて栄養が足りなくて生えてこないのかも。
とおもってストリークしなおしても生えてきませんでした。
とりあえずちゃんとマニュアル読むか。
現在ライブラリーようのサンプリング＆他の実験中。

>>96
yeastの株とvectorいうてみ。ついでに、この株でこのベクターが入っているから、この欠損培地で生きられると復唱してみ。

ポジコン生えないってことは、glucose入れ忘れ、選択培地間違え、その他栄養源で枯渇しているものがある、そんなところかねぇ、とりあえず考えられるのは。

プレートのひび割れは自分では経験したことない。
一週間とか放り込んでいてもそんなこと経験したことない。

incubatorの中の湿度は適当なのだろうか？
agarの濃度は適切だろうか？
SD培地は混ぜると泡立つからと、あまり混ぜずにプレートでこかされてしまったと言うことはないだろうか？

>>97
いきなり死なんよ。
というかねぇ、普通播くとそのときにyeast見えるよ。スプレッダーにもついているのが確認できるし。薄く播くと見えないときもあるけどね。
らしきもの、がだけど(こびりついたみたいなイメージ)。それが２日か３日で電灯にかざすとコロニーが小さく確認できるようになる。そいつらが大きくなってきて1〜2mm程度になったらツツケルワケダな。

欠損培地上で、しばらく増殖が止まっている状態のまま放っとけばどんどん死んで行くだろうが、播いていきなり死ぬということはないよ。

>>98
たとえyeastの面積あたりの濃度が高いとしても、nonコロニーというのは不自然だとおもうがねぇ。
栄養が足りないと言うんなら、播くyeastの量を少なくしても、ほとんど変わらんと思う。そもそも培地が持っている栄養源が少ないんじゃないのか？
量を１オーダー間違えたとか、10xと100xを間違えたとか。

オレはプレートはセレクション完全欠損培地で固めて、あとから必要な栄養源を塗ってからyeast播いてるけど、そういう手技で、必要な栄養源を塗り忘れたっていうのなら、生えてこないのはわかるけどね。

あんまりcriticalではないと思うけど、transformation時のPEGはきちんと二回くらいTEでwashしてやろうね。それから、DMSOは買ってきたらすぐに分注して-20℃で保存。細胞保存用のだと、常温保存されていたりするものを使っても、yeastは生えてくるけど、あまりに悪いものを使うと成長に響く。

んでもって、どうしても生えないんなら、ポジコンのみをとりあえずやってみる。
それがでるまでやってみる。

うーむ、貴重なご意見どうも。
ポジコン生えないって事はグルコース入れ忘れとかいてますが、
グルコースなんて入れましたっけ？プレートに。
YPDAの事を言っているのかしら。
SD泡立った記憶がないので、量を間違えたかもしれません。
それから、ダイタイ何日くらい培養したら、コロニーになりますか？

しまった！！
今ちゃんとマニュアルよんだら、
SDに２％グルコース入れろって書いてあった。
100番さんどうもありがとう。
初心者以下だな。おれは。
これでもふつうの漏れキュ等ーテクニックには自信あるのよ。

>>102
>>ダイタイ何日くらい培養したら、コロニーになりますか？

オレは今はCG1945株とpAS2-1を使っているから、成長は遅い。どんなに遅くても、４日目にはツツケル大きさのコロニーが出現している。３日目には0.x mm程度のコロニーは電灯にかざすと確認できるよ。

インキュベータの中にファンがついてるタイプだと乾燥します。
水を入れた瓶をいれて湿度を保つか、プレートをラップでくるみましょう。

>96
プレートは、私のラボでも乾いてひび割れます。
多分incubatorの中のfanの風が強くて、プレートの中に微妙ながら風が入って、乾くみたいです。
対策法としては、プレートをキムタオル等で包んで、直接fanの風が当たらないようにすると良いと思います。
私はこれを始めてから、すぐにはひび割れなくなりました。

そうそう。ちょっとまえに大腸菌でのtwo-hyのキットを売り出したところがあったよね。
あれってどうなのかなあ。ぱっと見バックがすごく高そうに見えるんだけど。
やったことある人いる？

ちょっとめんどくさいかも知れないけど、私は酵母のプレートは
良く乾かして、使う時には酵母をまいた後、パラフィルムを巻いています。
ひび割れませんよ。
（ただし、作りたての新しいプレートだと水分が出てくるので注意してね。）
カビがコンタミしても他に拡がるのを防げますし、そのまま捨てられます。
large scaleのtransformationのときは絶対に役にたつと思いますよ。
そのままコールドルームへ入れておけば後からでもコロニー拾えますし。
プレートが乾いちゃったら死んじゃうからね。

２ハイブリッドやって長いんですけど、今のラボはプレートまきまき用の専用区画がないんで、
ベンチでやってます。それで、
コンタミを完全にゼロにするの難しいんですよね。（単にヘタクソなだけという話もありますが。）

皆さんどうもありがとう．
確かにインキュベーターの中にファンがついてます．
パラフィルムで巻いたりしても酸素不足にならないのかな？
今日トランスフォームしてやり直します．
みずいれた瓶いれてラップで防御しよう．

>>酸素不足
ならないですね。スクリーニングに使う程度の期間なら。

108です。
酸素不足が心配？いやーその気持ちよくわかります。
でも大丈夫ですよ。酵母のラボ何研究室か見ましたけど、
みんな平気でビニールテープ巻いて密封したりしてましたし。

ファンのついてるインキュベータ持ってるなんてうらやましいです。
ひょっとして冷却機能もついてるやつですか？いいなー。
（でも2hybrid screeningだけなら無くても実験できるよ。）
水を入れるのは私もやったことあるんですが、
こっちはメンテナンスが面倒臭いんですよ。
カビの原因になるし。

なにはともあれ、今度はうまく行くといいですね。

うーん、臨場感あっていいなあ。あげ。

>111
カビ困るよね。汚く使う人と一緒はいやだけど贅沢いってられないし。

酵母は無気呼吸もできるから、酸素不足は心配しなくても大丈夫だよー

>>1
two-hybrid どうなってんの？

さてはお盆休みか？

いや、実はあんまりうまくいかないもんだから黙ってたんだが、
生えてこないんだよねえ。
よく考えたら、区論テックのSDminimum baseって、
sugar最初っからはいってんだよねえ。
ばいちかえて蒔きなおしても生えてこないんですよ。
ペースト状にうっすらと生えてるように見えるんですが、ひょっとしてこれって
生えてるの？
そうはおもえないんですよねえ。
やっぱり大腸菌しか使ってないラボでやるのは大変だ。
こんどこうぼやってるラボに聞きにいってきます。
ちなみに今ほかの実験もやってるので、怠け者だと思わず、温かく見守ってください。

>ペースト状にうっすらと生えてるように見える

検鏡するとどう？　やたらと小さいモノが見えないかな。
いずれtwo-hybridには無用のブツな気がする。

transformはどうやっていますか？

Li法なら冷やすの禁止

「two-hybridでまさに今人生を棒に振っています」

っていうスレタイトルに変えるか？

人生棒にか。
そうなったりして。
ていうか、人生棒に振るくらいの覚悟でやんなきゃだめかな？
サブの実験だからって手を抜いちゃだめだな。
transformationは、クロンテックのマニュアル法です。
よく分からんが、PEG-LiACとかつかうやつ。
冷やすの禁止って、集菌してる時とかに？
今日アポ取ってもらった。酵母やってる人に。
一応聞いてくる。

"気楽"に実験やるのは、再現性のある結果出す上でも大切なこと。ただし、手を抜くのとは違う。
毎回手を出す新しい実験に、人生かけてたらいくら人生あっても足りない。

PEG/LiAc法はフツーのyeast transform法。

ペースト状ということは、yeastはいるんだと思うよ。ただし、transform成功してないと感じるが。プレートを直接見ているわけではないから、語弊があるかもしれないが、そのペースト状になっているところから、transformantがコロニーを形成していく。コロニーを形成しないということは、plasmidがきちんと入っていないんだよ、多分。
yeastがいるかいないかくらいは、酵母をいくらやったことがないといっても、判断できるのでは？　yeastいるのに、生えてこないのなら、選択培地を間違えているか、transformationに失敗しているかといったところだろうな。プレート上にyeastがいるのかいないのか、それ確認するの大切だと思うが。

冷やすの禁止はわかるが、かといって、数コロニーも生えないというのは、冷やす冷やさないが効いているとは、解釈しにくい。

以前、4℃で集菌したことがあるが、生えるのは生えてくるぞ。

ぽじこん・ねがこんはどう？それと比較した結果を教えてよ。

みなさまありがとうございます。
コウボやってる人に尋ねてきましたが、
解決法いまだ判別しませんでした。
今度は、heat shockした後に、YPDAで回復期間を設けてやって見ます。
ちなみに、こないだも書きましたが、ポジコン、ネガコンともに
生えてきてません。
だから、培地が違うかなんか入れてないかだと思います。
もう一回やってできない場合は、そのラボに出張してやってきます。
ちなみに、現在、two-hybrid以外に、
in situ,knock-out screening,epigenetic mutant の検出、
植物の形質転換等をいたしております。
こちらのほうは順調なんですが。
やはり、初体験の実験で、自力でやるのは大変ですよね。
cDNA library作ったときは、３回目にしてようやく６００万pfu
の良質なものを作ることができました。

>transformationは、クロンテックのマニュアル法

HSの後の冷やしは省略して、速やかにR/Tで遠心が吉。

>>126
今日聞きにいったところの人もそんなことおっしゃってました。
どうもありがとうございます。

あと、素性がばれるといけないので、みなさんなるべくsageてくれると
ありがたいです。
なんか進展があればあげます。

つかってるPEGの分子量はいくつ？
以前、初心者の人で6000のを使って「生えてこない」と困ってるのを見たことがあるので。
ちなみに私は3350でやってます。
HSの後冷やすの良くないとは知りませんでした。
4℃の遠心器使ってるけど、5秒しか回さないから影響なかったんだろうなあ。

1は漏れキュ等ー手クニックに自信があるそうだから
試薬、培地、プラスミドは当然チェックしただろう。
125、プレミックス培地に責任転嫁すな（本当に不良ロットだったらｽﾏｿ)。
手技を疑え。操作を手早くすれ。
初心者は操作に不慣れなためにインキュベーション時間を延長しがちだ。
でむそは用が済んだら即覗け。
128は時間をかけないところが良いのでは。１は他のじっけんがんばってください。

ぺぐそ

すみません。私もヒートショックのあと冷やすのが良く無いとは知りませんでした。
いつも氷水で急冷してから、４度で１０分も遠心してました。
もしよろしければ、どなたかなぜいけないのか教えていただけないでしょうか？
ひやすことで、どれくらい悪影響があるのか御存じでしたらそれも教えていただけると
有り難いです。
ちなみに私の手技では形質転換効率は５x１０（４）cfu/microgram DNA程度です。

sage

>>131
細かいことはフォローできないが、細かいリクツは説明つかないのでは？　transfectionの手技自体、リクツあってないようなもの。
行き着くところ、結果オーライで、〜10^4のefficiencyなら、問題ないのでは？

いや、HS後の冷却がダメだとか、意味がないと言ってるんじゃないよ。

１の場合は、heat shock後の冷却が中心に効いて上手くいかないのではないとおもう。オーダーが下がるっていうんなら話はわかるが、生えない、ボジコンも生えないっていうのは、基本的な手技を疑った方がいいとおもう。
YPDで回復させるというのも、効果としては低い気がする。私もyeast扱い始めのころに、同時に複数のサンプルのtransfectionやって、相当メチャクチャしたけど、一応、基本的なプロトコールに従って出来た。

ちなみに、この指摘もあまり意味がないと思うが、DMSOは新しいのを使っているよね。細胞凍結用で常温保存しているヤツなんかを、無菌だからと培養やっている人から分けてもらったりすると、効率のオーダーが下がるときがある。

酵母を４℃に入れると、眠りに入る。
やってみればわかるが、４℃に一週間から二週間放置した株と、30℃に入れておいた株と、同時に培養スタートすると、30℃の株の方が成長はやい。

それと同じで、熱ショック加えたあと、冷やしすぎると、酵母の元気がなくなるということでいいのでわ??

本筋ではないのですが、ぺっとりしたペースト状の「何か」が生えた経験を
お持ちの方はいらっしゃいますか。１さんの描写のような何かが私のプレートでも
生えたことがあります。別のラボでも見ました（結局screen自体はうまくいって、
謎が未解決のままです）。現役の臨床検査技師さんの見立てでは
「バクテリアではないみたいだけど...」で、酵母ではない研究者の方は
「酵母か死んだ酵母だと思うけど」とおっしゃいました。
コンタミでなければ酵母から派生したと考えるしかありません。
そんなこんなで、たまに「死んだ酵母が増殖して」いたのでした。
これっていったい何だったのでしょう。情報求む！

酵母two-hybrid用にもらったvectorがBSだったことがあったな。
何も生えてこなかった...

>>136
意味がイマイチわかりにくいんだが、とりあえず「死ぬ」という表現は適切でないだろう。
確実に増えている、それもセレビジエなら、出芽している様子が検鏡で観察できるのかな？　派生したというのも、「自分で形質転換した」という解釈ならまだわからんこともないが。

新鮮なＰＥＧとＤＭＳＯ
３ＡＴもロットによってばらつきがかなりあるので、できればメーカーに
データシートをもらって純度を見た方が無難
純度の高いライブラリー
確実で手早い操作
ＨＳの時間
プレートをインキュベターの中で乾燥させないように・・

気をつけてるのはこのくらいです。
でも気がつくのに凄い時間かかりました。
一人で立ち上げるのは大変なのでがんばって下さい。

1はまだ挫折してなかろうな？

俺はこれでTFの効率が一気にあがった。
「The Gietz Lab Yeast Transformation Home Page」
http://www.umanitoba.ca/academic/faculties/medicine/biochem/gietz/index.html

>>140
ｵｵ。

yeast扱っていない人にプレート見せるときは気をつけよう。
大腸菌の感覚で、ほいっとふたを開けられるときがある。
コンタミ確率100パーセントでないにしても、やはり気持ち悪い。

結果気になるのであげ

re-age

結局1は、はまって終わったのか？

そういえば、昔やり始めの頃酵母の株を変えてみたらできた事がある。
まえ、区論テックの株を使っていたら出なくて、酵母をやっているラボから貰った株を使ったら一発で出た。
もちろん、株そのものの問題より、それを管理する能力の差だったのかもしれない。
そういう経験ってない？

株に関しては、変異が入ることはまず考えられない。
しかし、genotypeが維持されているかどうか確認したほうが良い。
使おうとしている株が、本当にその株かどうか確認しなさい。
多分違うんだよそれ。
ほかから株をもらいなさい。

あげ

区論テックのマッチメーカー３は何故か区論テックの培地で無いと生えんかったが細工でもしてるんでしょうか？
ちなみにAH109です。

俺もAH109使った時はあんまりよくなかった。
YPDでは生えるのだけど、選択培地ではポジコンが生えなかったことがある。
それ以来使っていない。

あるbaitでbackが異様に高くなる現象は、どう考えればよいのでしょうか。
もちろん、コンタミしていないという前提ありでなんですが。

>>151
baitの配列に酸性アミノ酸が多いとかの理由で、bait自身に
転写活性化能力がたまたまでちゃうとか。

んー。同じドメインをもつ別のタンパクではそんなことないんですよねえ。
なんでなんだろ。

同じドメインもってても、アミノ酸配列が全部同じなわけじゃないし。
諦めて、別の領域をbaitにしましょう。

ですねえ。もうちょっと３ＡＴとかで粘って、だめだったらあきらめるのも
視野に入れないとですね。

next?

ストラタのbacteria-basedのtwo-hybrid、試したヒトいない？

>>151
yeast内部での発現baitを解析してみた？
あとは、baitのみのtransfectantをシングルコロニー化して各コロニー間で差が出るのかでないのか？
コンタミとはいわんが、クローンごとの差が反映されやすいことはあるかもしれない。

>>158

ええと、それはWesternということなんでしょうか？いちおうタグをつけた
重要だとみなしているbaitとつけていないbaitがあるのですが、酵母のWesternは
少し難しいと聞いており、少々二の足を踏んでいる状況です。
後者の、baitのみのtransfectantは、一応チェックできているはずです。
というのもbaitとpreyを２回にわけて入れる方法をとっているというわけなのです。
クローンごとの差というのは、もちろん感じております。また、それが素人ゆえの
実験操作の不手際さであらわれているのかという不安もあります。ただ、何度か
（５回くらい？）行った感触からして使いづらい傾向（backが高い）が現れている
のは否めません。

日常的に酵母からタンパクとってます。
特に難しくはありません。
気をつけるのは、細胞壁を壊す必要があることとlog phaseの細胞を使うことくらいでしょうか。
回収目的がウェスタンだけだったら、かなり気楽にできます。

ところでウェスタンを使わないチェックはどうやってるのでしょうか。
栄養要求だけですか？

baitのみのtransfectantsの各クローン間で差が出るのは腕とは関係無い気もしますが。
これはbaitのみのtransfectantsのウェスタンをすればはっきりすると思います。

それからHis要求での選択の後、Adeとかの栄養要求でも一回選択できます？
できるんだったらとりあえずやってみるのも可かと。

そのbaitに対するポジコンがあれば、もちろんそれを用いればよいのでしょうけど、
ぼくの実験はlibraryからのscreenなのでこの方法は使えませんね。

やっぱり、westernがbestな方法なのでしょうね。きっと。

baitの発現がWesternで確認されなくても、スクリーニング成功したよ。
だいたい、reporter遺伝子の上流にくっつくだけ発現してりゃあ良いんだから。
あんまりbaitが高発現だと、prayの発現が悪いとdominant negativeに喰っちゃ
うことだってあるんじゃない？

>>162

そうなんですよね。baitのβ-gal活性がないのに、preyを入れたときに
backが高くなるということは、baitの発現が高すぎるという原因もあるという
ことに気づきました。

ただ、preyの発現が悪いというのは相対的なものかもしれません。というのも、
別のbaitでpositive cloneが取れてきたため、実験系自体が悪いともいえない
ような気がしてきたものでして。

>>160

Adeの栄養要求というのはpreyのplasmidに組み込まれている場合ということ
ですか？
もしそうなら、それは出来ないです。
そうでないなら、どのような方法があるのでしょうか？


あと、思うこととしてbait同士がdimerを形成する場合というのはどういう結果と
なるのでしょうか？文献からこの線も捨てきれない事情があります。
この場合、BD-BD-ADとなったりする可能性はあるのでしょうか？
もしあるとすれば・・・、いや、あったとしても、backが高くなる理由には
ならないかな。

Hisの他にAdeの栄養要求性でbaitとprayの結合を見れる菌株があるのです。
Adeでselectionすると、ほとんどbackはでません。
私はいつも、-Hisで選択した後-Adeにレプリカして、両方で生えてきたやつを
positive cloneとしています。

ちなみに私、baitの発現チェックなんてしません（爆）
backがどの程度あるかだけはチェックしますが。

three-hybridやってるひといる？

>>159
YeastのWesternが特に難しいということは無いですね。
>>160氏のように、普通のタンパク抽出の方がWesternよりも気をつける面が多いと思いますよ。
Western用のタンパク抽出の場合、きちんとProteinase InhibitorかましてSDS-Ureaで変性下で細胞砕いてやるというだけです。

それから、タグってどういう意味なんでしょう？　Anti-DBD/Anti-ADで落とせば、つないでいるものに関わらず、原理上、Westernで確認することは出来ます。

>>BD-BD-ADとなったりする可能性はあるのでしょうか

立体障害の点がクリアできているのなら可能性はあると思いますね。
当然、BD side Dime形成でinteraction siteが隠れてしまうとかはナシですが。

>>162
>>baitの発現がWesternで確認されなくても、スクリーニング成功したよ。

要は何を持って「screeningした」と結論するかということ。もちろん、Westernで確認できたからscreeningが成功したとは結論付けられないはずですね。
単純にいくつかのバリエーションとしてのクローンとって、あとは別の系で検証するのなら問題は無いでしょうが、two-hyである程度までの結果として取り扱っていこうというのなら、後ろ盾は取っておくのが賢明でしょうな。
結果が出たなら、まぁいいけど、151さんのように何が悪いのか分からないなら、色々堀を埋めて行くことも大切ですよね。

つーはいって、適当にいろいろなベイトを試してうまくいったら
喜ぶっていうスタンスじゃダメなの？
ほとんど作業はないし、合間にやるものじゃない？

>>157
ストラタのbacterioMatch，
使ってみたけどcarbenicillin選択がうまくかかりません。
yeastやin vitroで結合が確認された組み合わせもポジティブになりません。
もちろんyeastでのアッセイ同様，蛋白質によるんだろうけど，
すくなくとも私の研究には使えそうにないな。

いろいろと考えた結果、Ubiquitinなどのgeneralなendoの結合タンパクが
くっついているためbackが高くなるのではないかと思い始めました。
例えばUbiquitinならば、

　　　Ub-Ub-(n)-Ub　
／ ＼
BD AD
binding-site Pol→
----------------------------------------

みたいなかんじで。だから、β-gal活性は低いけどcolonyとしては
現れるのではないかと。

下手な図で申し訳ないです。

うーん。図がうまく書けてない。。。

>>169

もとい、
binding site-BD-Ub(n)-AD→Pol
みたいに、直接にBDとADのinteractionではなくということです。

ストラタのbacterioMatchですが、全く役に立たないです。というのか、あれで
うまくいった人っているんですか？代理店サイドでも調査が始まったそうですが・・・。

酵母のたたりだよ。

Two-hybridして陽性のクローンが出たら、
その次はやはり、in vitro binding assayして調べなきゃいけませんか？

で..1さんの実験はどうなってるの？

僕もこれからTwo-hybrid立ち上げようと思うのですが、
膜タンパクでは適用できないって聞いたんですけど、
本当ですか。誰か教えてください。

陽性のクローンなんて出まくりだよ。
でもほとんどが、疑陽性。
これをふるい落として、意味のあるbinding蛋白を選んで、そこからまた次に繋がる実験をするのは、やはりなかなか厳しいものがありますよ。
CO-IPやGSTpulldownは必須ですが、その次じゃぁ何をするかということになりますからねぇ。
死々累々の実験ですから、これをmainにやっていくのは、要注意。結構、撃沈する院生が多いです。

最近もcellやnatureのペーパーでtwo-hybridのデータあまりみないね。
ほとんどがIP〜mass spectrometryになった。

>>176
そりゃー、核に移行してくれないbaitでは、原理的にできないでしょう。
Rhoとかでtwo-hybridする時は、ミリスチル化される部分を除いてるはず。

>>178
そうでもないよ。もはやあんまりあたりまえの技術だからなんだろうけど、Cell
みたいにスペースの余裕がある論文でも、two-hybridで取ったとしか触れられな
くなってるけどね。何と言っても、とりあえず何も考えない奴でも始められるの
で、裾野が広いのが強みでしょ。

で１の実験はどうなってんの？

>177
どーやって意味のあるのを選べばいいの？

>>177
phenotypeに戻りましょう。
遺伝学的データがサポートされていれば、
Goでしょう。

はじめまして。面白いスレですね。ちょっとかきこします。
クロンテックのtwo-hybrid system 3とpretransformed libraryを
つかって、なんとかスクリーニングまでたどりつきました。
酵母は周りにやってる人がいないのでかなり不安でしたが、一応
ここまではマニュアル通りに動いてます。
しかし、なんだか陽性クローンが２００個くらい出てきそうな様子
で、正直な所途方に暮れています。これら全部restreakして調べる
べきなんでしょうか。みなさんはどうしてらっしゃいますか？

とりあえずre-streakだけしといて、20個くらいずつ
プラスミド回収して解析していく。
絶対おんなじ遺伝子がいっぱいとれてきてるはず。
そのうち新しいのはでてこなくなるからそこで止め。ってのでどう？
いや、面白そうな遺伝子が取れた時点で止め、ってのでもいいんだけどね（笑）

200くらいだったら少なくとも何がとれたかくらいは一ヶ月くらいでできるので、
それこそ面白いやつだけやるってかんじでしょうね。

でも、やっぱりジャンクは多いですけどね。

>187
おれも同じような状況に陥った。

×187→○185

>184
200クローンぐらいなら、少しがんばれば、yeastからplasmid取り出して、大腸菌に入れなおして、またplasmid取り出せるはず。
そのplasmidを、すべてシークエンスして、dataを集めてからが、本当の試練。
enzymeで切って、流して、泳動パターンを見て、同じクローンかどうかを判断するのは、意外と難しいと思います。
気合を入れて、キアーゲン＆シークエンスマシーンにしばらくなるべき。

>185-189
アドバイスどうもありがとうございます。
とりあえずひとまず全部フリーズストックして、何回かにわけて
全部シークエンスに持ってこうと思います。
（臨床系の人間なので、時間と設備が結構限られてしまうので
全部一気にやるのはきびしそうなので、、）

>>190
僕もつい最近、系を立ててやってます。
実際、４００クローンほど、１次スクリーニングで
取れて来ました。
とりあえず、２０クローンぐらい先に進めて（curing retransformation等）、
シークエンスしてみて、同じのが取れて来そうだったら、
残ったクローンはそのインサートに対して
colony PCRかけようかと思ってます。

>>191
libraryのマーカーがLEU2だったら（っていうかLEU2以外のlibraryって無いと思うけど）
curingするより、HB101とM9-Leu培地を使って LEU2 plasmidをとった方が早いよ〜
どうせリトラは必要なんだし。

>>184
クロンテックのpretransformed libraryだったら少なくとも１回大腸菌で
増やしているので、コロニーPCRと制限酵素処理でおおよその見当がつくでしょう。
どの酵素だったか忘れましたがPCR産物をダイレクトに処理できるはずです。
多く検出される遺伝子をシークエンスすれば良いでしょう。

>>176
核移行できないものならCytoTrapでやってみたら？

＞193
良く知らないのですが、yeastでもcolony PCRって
できるんですか？glass beadsとか使って壁破壊して
からということでしょうか？？

>>193
CytoTrapってSos-Rasを利用してるっていう奴ですか？
なんかまともに動かないという噂を聞いたのですが、どうなんでしょう？
（あ、私は176じゃないです）
>>194
確かglassbeads使わなくても出来ますよ。
詳しいやりかた忘れたけど（＜役に立たねー！）
まあ、roughにでもplasmid回収してからのほうが確実ですけど。

私も似たような噂を聞きました＞CytoTrap

>>195
菌株の関係でfalseが出やすいみたいですけど、どのみちCo-IPで確認するわけなので、
通常の系で出来ないものを試すにはいいのでは？
colony PCRは滅菌水に縣濁してboil、それをテンプレートにして行う。
昔の大腸菌colony PCRと同じ。最近大腸菌は反応液に直接縣濁してるので。

>>193
falseが出やすいって、リバータントが出やすいってことでしょうか？
（菌株はcdc42-tsでしたっけ？忘れましたけど）
ただ結合をみるだけならともかく、スクリーニングにそういう菌株は辛いような。
結合見るだけならそれこそco-IPだけでいいと思いますし。
baitのマーカーがURA3なら、5-FOA使えば何とかなるかもしれませんが・・・

知ってるDrが、Sosを使った系でコロニーが計１０００個ぐらい
でてきて、restreakして残った（？）５００個を全部調べて
どれもノンスペだったとかいってました。
なにをどうやったのかは知りませんが。

９月からtwo-hybridを動かしている者です。
クロンテックのGAL4のsystem3とpretransformed libraryを使ってます。
何とかMatingまでこぎつけてscreeningをしたんですが、
SD/-Ade/-H/-L/-Wの培地でコロニーが600個ほど出てきてしまいました。
それで今のところ50個くらいを解析したのですが、ほとんど同じクローンが拾えてきません。
何かやり方に問題あるのでしょうか？
Help求むです・・・。

>200
やり方に問題があるのではなく、two-hybridがそういうものなだけです。
200,300個くらいシークエンスすると、多分いくつか同じシークエンス（もの）が出てきますが、出現頻度が高いイコール重要　ではありません。
ここらへんが、two-hybridで、死者が続出する原因だと思います。

two-hybridやって塩基配列解読して関連遺伝子が無いときって皆様どのように対処してます？

結局two-hybridで多くの種類のクローンがつれてきた場合、
true positiveとfalse positiveの判別はどのようにやるのが一般的なのですか？
細胞工学のtwo-hybridの特集で頻繁に見られるfalse positiveのクローンがリストになっていたと思いますが、
それを頼りに判断するのでしょうか？
スクリーニングを初めてまだ１ヶ月ほどですが、はやくもげんなりです（汗）。

>>200=203
re-transformしてOKならco-IP。それでOKなら大抵信じてもらえます。
あと、いかにもノンスペでとれてきそうな遺伝子はとれてきてますか？
HeatShockProteinとかribosomal protein とか。そういうのがとれてきてたら
多分系自体は動いてるとおもいます。
ところで、false positive クローンのリストっていつの号に載ってます？
>>201
出現頻度が高いイコール重要ではない、ってのはわかりますけど、
結合の強いやつって大抵たくさんとれてきません？
>>202
わたしは酵母の人なので、とりあえずつぶしてみて、phenotypeが
bait つぶしたときのと同じならGOですかねぇ。
phenotype がでなくて捨てた遺伝子も多数あり。
って two-hybridスクリーニングに限った話でもないですが。

解析していて出てくるのは確かにHeatshock proteinとかも出てきますが、
他に良く出てくるのは酵素関係のものです。
それ以外にもBACクローンとかRIKENのものとか固有名詞？がないクローンもでてきます。
false positiveのリストは細胞工学の2000年のVol.19とVol.20にのってます。
やはり解析を続けるべきでしょうか？

黙って免沈しろ。

陽性疑いのクローンが出来てきたら、yeastでのmating assayで、擬陽性をふるい落とすのもお勧めです。
baitの発現vectorのみや、同封されてるネガコンのvectorのみとも、拾ってきたクローンが反応して、アミノ酸欠損培地でコロニーが生えるようなら、擬陽性と思われます。
ようするに、クローンのタンパクと反応せず、tagやGAL4等と反応してるということですから。
IPは必要ですが、数十から数百クローンに対してやるのは、非現実的ですから。

>>200=203
難しいところですねぇ。酵素関係か。bait遺伝子の機能とは関係なさそうなんですかね？
取れてきてる名無し遺伝子がちゃんとin frame になってて、ある程度の
アミノ酸長があれば、それを解析していくという手もありますが。
でも、これってはまるパターンでもあるしなぁ・・・

ところで、念のために確認しますけど、re-transformはしてますよね？
207さんも書いてますけど、GADと反応するようなタンパクもとれてくる可能性も
あるので、回収したクローンをもう一度 baitの発現vector または bait と
co-transform しなおして、bait とco-transform したときのみ HIS+, ADE+ に
なることを確認する必要はありますよ〜。
私はいつも co-transform で確認してますけど、
207さんの書いてらっしゃる mating assay でもいいと思います。

ストラタのバクテリアTwo-Hybridやってます。
酵母よりも慣れてるので手を出しましたが、苦労が多い。
カルベニシリンは800μｇまで上げてやっとスクリーニングらしくなりました。
添付の陽性コントロールだと確かにこれでも生えてきて青くなるので、
システムは一応働いていると信じて続けてます。
今のところ1次で約100個、これが２次で全滅、やり直し中。
ただ、宣伝文句と違って、プラスミドに毒性が高いらしく
30度培養でゆっくりとしか生えて来ず、大腸菌のくせに全然スピードアップにならない。
コピー数が少ないらしくプラスミドの回収率が極端に悪い。
Transformationの効率が悪く、プロトコールどおりで10+4オーダーしか入らず、
10倍以上のスケールが必要で、５万円の別売りコンピテントセルがあっという間になくなる。
試しに自分でコンピテントセルを作ったり、エレクトロポレーションも試して見ましたが、
自作だと全然入らない。
良く考えてみると、いつもは大腸菌には1つだけプラスミドが入って形質転換されると
信じてサブクローニングなんかしていましたが、Tow-Hybridみたいに1つの大腸菌に
2種類のプラスミドが入ることは可能なんでしたっけ。
ひょっとして５万円のコンピテントセルが作り出したノンスペか？
そこで、どなたか知ってる方お教え下さい。
大腸菌に2種類以上のプラスミドを導入するコンピテントセルは作製可能でしょうか、
その作り方はどんなのでしょうか。

ストラタのキットは大問題になっています。

>209
自作のコンピテントセルだと製品の半分くらいの効率で入ったよ。re-transformなんかでは使える。作り方は培養を低温でする普通のやり方だけど。

>>209
Baitをあらかじめ入れた改変ハナハン・コンピでは形質転換効率はそれほど
悪くなかったですよ。ただ、やっぱりスクリーニングはだめでしたけど。
ネガティブコントロールも少し培養が長いだけで青くなります。（メーカーからは
すべてのコロニーが青くなる前に（差のあるうちに）スクリーニングしてくれ
との解答がきました・・！）





青くなる前にスクリーニング

ベーＧＡＬとか免沈とかやる前に取れてきたものは全部シークエンス
しちゃう。それが一番速い気する。
金かかるけど。

1の最新情報希望

>>213
賛成。シークエンスは昔のように苦労も金も少なくて済むようになっている。

>>212
自作のコンピしか使わなかったけど10^6ぐらいでてたよ。
とにかくtargetがろーこぴーだから、seqenceにやたら時間がかかった。
incubationがo/nなだけで、合計時間はyeastと大差ないと思う。
おまけに取れてきたものはUTRやらinvertやらごみばかり。
baitの大半があぐってるし、targetもあやしいから当然の結果なのかな。

バクテリアでGSTやHisタグ付けたタンパク質を発現しようと思っても、結構な
確率でアグって使いものになんないのに、ライブラリー入れてスクリーニング
なんて出来るのかね、大体。

ストラタのキットの成功例ってないの？

ぼくストラタで大成功
１ぬけた！！！

ハッキリ言ってCELL狙ってます

＞２１９
なんか間違ってんだよ、それ。

1は？

＞１
日記なんだったら毎日書きなよ。いろんなアドバイスももらえるしさ。

1はあめりかにいったから、もう２ｃｈ見てないみたいよ。
丁度、夏の２ｃｈ閉鎖危機の辺りに行くことになって、
かきこめなかったんだって

1ってどこの人だったの？

うちのラボの助教授は5年間位、スクリーニングを続けてる。
ここ2年はtwo-hybridで。
取り合えず、手を動かしてるから研究してる気になってるが、
あまり価値なし。
とれた遺伝子の機能解析を全く行っていない。
なのに、研究者として優秀だと勘違いしてる。
東大出身だと自分の負けを認められないのかな？
こんな阿呆みたいなスタッフは他にもいますか？

どこにでもいるだろ

＞２２５、２２６
うちにもいるよ。くそにもならん当代出身のババア助手が。
昼ごろ出勤してきて、夜８時には帰る。その間なにをしているのかよくわからない。

実験はしない、やってても遅いうえに何の実験やってんだか。つかえねえデータばっか出しやがる。
そのくせ他人のデータにはケチをつけ（そのケチの付け方も的外れ）、教授助教授には迎合し。。
僕と一緒にやろうということになった実験はナーナーになって先延ばし。業を煮やした僕が「いい加減始めないと。。」というと『じゃあ自分で勝手
にやればあ！？」と逆ギレする始末。
僕はマジでキレてます。今は口もきいてません。

酵母の中ではリン酸化は起きないの？

なんだ、どいつも偉そうなゴタクだけ並べやがって答えらんねえのか糞ども。

質問に答えてほしいの？煽られるのを待ってるの？

リン酸化は起きますが、酵母には内在性のtyrosine kinaseが無いので、
チロシンリン酸化を起こしてやるためにはtyrosine kinaseを発現させて
やる必要があります。外から入れたtyrosine kinaseが働かないということは
ありません。yeast two-hybrid systemでチロシンリン酸化依存性の（例えばSH2とか）タンパク質の
結合を解析するためにkinaseを入れてscreeningしてる人もいますよ。

>209
ストラタのキットで
pGT(non transformant)とpTRG_GAL11を混ぜたやつだけでコロニーがいっぱいでてきたよ！どうするよ！
あと自分のやつだと大きいやつと小さいやつがでてきたがどうするよ！

そうそう、東大出身は自分がすごく頭が
いいと思いこんでいるから、うまくいかなくて
どつぼにはまっても絶対にあきらめない。
５年たっても７年たっても同じことをやりつづけるよ。
自分のプライドのために。そして院生、ポスドクの
屍骸の山があとにのこされるのであった。ああーめん。

＞２３１
では、セリン・スレオニンによるリン酸化は起こるのですか？

>>228
tri-hybridなら可能でショ。
細胞工学か実験医学に乗っていたよ

>>234
ものによりけりでしょ。酵母に保存されているキナーゼなら可能性アリ。

で、結局ストラタのバクテリオなんたらはどうなの？

せっかくもとのライブラリーは10+6オーダーなのに，酵母に入れるとなかなかそこまでは入りません．
何回かくり返せばいいのでしょうが，効率が悪い．
で，質問．
Pretransformed Library買って，matingさせる方法って，簡単に効率良く行くものでしょうか？
やってみるとやっぱりいろいろ問題があって苦労するとかはないでしょうか．情報お知らせください．
クロンテック，値上げしてますます高くなって，手を出すのをためらってます．
あと，たとえば自分で，まずLibraryをtransformさせたのをストックしておいて，
効率が悪くても何回かのtransform分をためておいて，
毎回matingさせてスクリーニングしたりもできるものでしょうか？
baitを何種類かでスクリーニングしてみたい時にはそのほうが楽に思えますが，
どうなんでしょうか？
経験ある方，お教えください．

age

＞２３７
そのまえに、トランスフォーム効率が悪い原因を明らかにしたほうがいいんじゃないの？

１はまだ日記つけてんの?


今日も免沈　明日も泳動　歩きながらもディスカッション

GAL4とLexAってどっちがいいんですか？
今は無きLexAの法が擬陽性少ないって聞いたんですけども
本当ですか？

ssDNAをヒートショックするときにlibraryも一緒にヒートショック→急冷したらどうなりますか？

ssDNAやlibraryをどやってヒートショックすんの？age

あげ

たいへんなんだなぁ〜。

変な質問なんですが、
２つのタンパク質が（直接）相互作用しないことを言うためには
どうすればいいのでしょうか？

>246
無理

>>240
立てば免沈　座れば泳動　歩きながらもディスカッション　では？
>>241
菌株によるような気もしますがねぇ。
確かに最近LexA使ってないなー

Bactero Matchわたしもだめでしたー。
１次スクリーニングで何百かにしぼって
２次スクリーニングで全滅っす。
あれで成功するひといたらまじ聞いてみたい。

carrier DNAは既製品が高価なのでherring testis DNAをソニケーションしたいと思っていますが、どなたかソニケーションの至適条件は御存知ありませんか？オーバーソニケーションはキャリア能が著しく損なわれると知人に聞きました。

ソニケーションは全くしない方が効率が良い。10mg/mlだと粘くてハンドリング
が大変なので2mg/ml。

　two hybridで釣ってきても面沈で引っかからなければ、だめだと思うのですが、それでも論文にするやつは？

逝って良し

>>252
あのさ、あんたkineticsって分かってる？

使わないでおくと停止するけど、腕につけた途端正しい時間を指すようになる時計だろ?

わらた

はらわた

はわらた

というわけで、252は物理・数学に弱いＭＤであることが判明。
博士（農学）カモ…

>254,259はkineticsで万人に説明できるようになってからえらそうにしなさい。

>252,259
どうせ間違いだらけだろうけど、説明してくれよ。

>>260,>>261
おいおい、煽るのはともかく、オマエらも分からんのか。

>>262
説明して！

結合はON rateとOFF rateのバランスで決まるんで、いずれの値も大きい
場合には、vivoでは結合していても、washの過程でコンポーネントの濃度
が事実上ゼロになるＩＰでは解離しちゃうってこと。

で、こんな説明で納得したんかよ？>>252, >>260, >>261, >>263

Good!

>264
vitroに持ってくる前にホルムアルデヒドで結んじゃえば？

>>246
〜しない。これを示すのは極めて困難。もっと具体的な情報を書いてみたら？

＞＞２５２
Two-hybridで酵素を引っ掛けたものの、IPでどうしても落ちず、止むを得
ずpull-downとBIAcoreでkinetics出してデータまとめて論文にして投稿し
たよ。後の実験で、baitタンパク質がその酵素の活性に影響を与えること
がわかり、vivoでもそれが証明できた。だから別にIPで落ちなくても諦め
る事はないと思うよ。IPだって塩濃度とかいじるけど、よく言えば最適条
件の検討、悪く言えば落としに行っているだけだから。

>>264
なっとく。
IPって結局意味無いのね。って極論か。
でも、生物屋やMDはkineticsを全くわかってない奴がほとんど。
そういうやつらがReviewerをやっているんだからまったく鬱だ。

kineticsを勉強するのにいい本ってありますか？

>>269
それでも綺麗なIPデータがあるほうが良いデータである、というのは間違いのない事実だね。
他にファンクショナルなデータでもあれば別だが。

>>272
おまえもkinetics全くわかってねーな。
物理と数学勉強してから大学入り直せ。

>>273
すまんな、俺は既にＣＮＳ持ってるんだ。
お前みたいなデータがでないのを理屈こねて言い訳していると話が先に
すすまんのだよ。せいぜいＪＢＣでもだして喜んでいるんだな（藁

>>274
うわ、いやなやつ。
どうせじぶんでとったCNSじゃないんだろ。
あたまわるそうだし。

架橋剤つかってもIPでだせなかったら、
やっぱりジャーナルの質は２ランク落ちるでしょ。
つうか２ハイブリッて関係ないもん取れ過ぎでは？

>>274
生物系の研究だとバカでもCNSに論文が載せられる証左だな。
従来型分子生物学しかできない人々はこれから淘汰されることになるだろう。

この期に及んで、とお思いでしょうが、実験に使用している菌株名と入手先を教えていただきたいのですが。

>>272
ま、そりゃそうだね。でもIP出ないからって諦めることは無いと言うことが
言いたかったのよ。IP以外の方法でも結合確認できたら、望みは十分あるよ。

>>278
俺は酵母はAH109株を使っているよ。入手先はクロンテックです。

http://fry.to/ft25ffg/

http://fry.to/zollp25/

　携帯対応

男性より女性の書き込み多し
女性性65％男性35％割合です
穴場的サイトです。
幼い中高生直アポ直電
OL〜熟女迄の出会い
　聞ける穴場サイトです
　

two-hybridだけでペーパーになってることありますか？
その時には他にどんなデータが必要なのかな？

>>272
「ほうが良いデータ」って、何に比べて良いんだよ？自分の見ている相互作用
がIPできないはずのものだったら、どうしようも無いだろ。それともIPできる
相互作用の方が大事な相互作用だとでも言うのか？それとも良い雑誌に出すた
めなら落ちないものでも落としてみせるってか？

＞落ちないものでも落としてみせるってか？

架橋剤を
使うのは有りでしょう。
細胞内で相互作用がなかったら、
two hybridもkineticsもクソもないゴミですから、
intercationを確認する作業は大事です。

それとも生理的意義は重要ではない、
生化学的データがほしい、というの？

どうやらツーハイやったのに免沈で落とせなかったために有名誌にリジェ
クトされたことがトラウマになっている奴が一人このスレッドに
紛れ込んでいるようだな。




う　ざ　い　ぞ　。

＞２８４

そりゃ自分だろ。
ツーハイやったのに細胞内ではまるで結合しないらしいものひいちゃったのか？

いまうちのラボでもツーハイで釣れたものにボスが熱狂してますが、どーしたらいーでしょうか？

>285
kineticsにくわしいのに、免沈できなくて論文リジェクトされたのは
あなたですか？

当たりは数十個に１個と伝えてくれ。

>>281
出来ることは出来ますが、まともなjournalにはacceptしてもらえないと思った
方が良いです。BBBやJBですらも無理でしょう。国外の雑誌で見掛けた事はあり
ますが、その時は取れてきたタンパク質をぶつぶつに切って、baitタンパク質
との結合領域を決めてましたね。もちろんtwo-hybridで。何にしても信用は
してもらえません。

>>286
IPで落ちるかどうか試してみましょう。出なければpull-downで。とにかくtwo-
hybrid以外の方法で結合を確認することが重要です。

プラズモンセンサーをしる！＞286

FRETで相互作用をかいせきできんの？

>>291
まあやって出来ないことは無いだろうけど、両方の蛋白が蛍光を発するもので、
FRETが起こるような位置関係に無ければならないので非常に難しいかと思われ。
例え二つのタンパク質が相互作用していてもFRETが起こるとは限らないからね。

保守あげ

アタリが数十個に一個って、ホントはくっついてないのにくっついちゃったように見えるのがあるってこと？
それとも、この実験系ではくっつくが実際に細胞の中では起きてない相互作用ってこと？

>294
後者が正解ですな。two-hybridでは確認できても、それ以外の実験系では
確認できないものがゴマンとあります。いろいろな実験系で試しても、相互
作用が確認できるものをアタリとしています。

>>294,295
two-hybridの原理をちゃんと把握しましょう。

ベイトやプレイが何かによってはどっちもあり得ます。

教えて君してもいい？>>296

やだ、まだこのスレあったの？！　驚

ありましたが、何か！？

>>296
教えてくれ〜

>>299
おっと放置プレーｽﾏｿ。すっかり忘れてた。

もし仮にﾍﾞｲﾄとして転写を活性化するような因子、もしくは転写を活性化するような因子とyeastの細胞内で結合しうる蛋白を用いた場合どうだろうか？
ﾍﾞｲﾄがﾌﾟﾚｲと相互作用していなくともyeast細胞内でｾﾚｸｼｮﾝﾏｰｶｰが発現するだろう。
どんなスｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞ方法を使っているのかはよく分からないが単純にgrowth
が+　or　-だけで判定しているとそういうﾊﾞｯｸｸﾞﾗｳﾝﾄﾞが出る可能性もある。
また何か解らなかったらｶｷｺしてくれ。放置ﾌﾟﾚｰのお詫びに解る範囲でお答え
するよ。

それは、単純にベイト依存性をチェックして落とせるんじゃないの？

>>300, 301
議論ｷﾎﾞﾝ

うーん。ﾍﾞｲﾄの依存性がﾁｪｯｸできるのかな？まずどんな条件でｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞを
行ったのかがｲﾏｲﾁよく解らないのでﾁｮﾄ議論しようがない。

まあ>>294は最低限、生えてきたyeastからplasmidを回収してﾌﾟﾚｲが存在
すること&ﾍﾞｲﾄとﾌﾟﾚｲを入れ替えてもyeastはhappyに生きられることを確認
するべきだろうな。

今からﾁｮﾄ落ちます。また今夜出没予定です。

なるほろ〜
勉強になります。

baitとpreyの入れ替えなんて自己満足以上の意味あんのか？bait特異性が確認できたら、two-hybridの仕事はそこで終わり（結合領域を決めるとかはともかく）。すぐに本来のシステムで検証でしょ。two-hybridなんて所詮first screeningの手段なんだから。

>>305
　>baitとpreyの入れ替えなんて自己満足以上の意味あんのか？bait特異性が確認...
baitとpreyが何かﾜｶﾗﾝから答えようがないな。bait特異性をどうやってするんだね？
使っているbaitが酵母内で何かと相互作用している可能性を排除できるのかね？
まあbaitとpreyを入れ替えるのが自己満足以上の意味があるのかという質問には「ある」
と答えさせてもらおうか。データはたくさんあればあるほど信頼性は増すのでね。

　>two-hybridの仕事はそこで終わり（結合領域を決めるとかはともかく）。
同意だな。two-hybridなんざで蛋白同士が結合するなんて主張しても弱すぎて相手にされん。
特に機能未知の因子なんかではね。IPするなり、合成効果を見るなり、共局在を見るなりしない
と論文にするには苦しいな。

ｵﾄ、>>306
bait特異性をどうやって確認するんだね？←訂正

age

>>306
bait特異性ってのは、そのpreyが問題にしているbaitに対してはpositiveで、コントロールのbait（キットに入ってるから皆ラミンを使ってるね）に対してはnegativeってことで十分だろ。
baitとpreyを入れ替えてnegativeになったらやめんのかよ。two-hybridが擬陰性になる理由なんて５億６千７百万あるぜ（藁

>>309
>bait特異性ってのは、そのpreyが問題にしているbaitに対してはpositiveで、
コントロールのbait（キットに入ってるから皆ラミンを使ってるね）に対しては
negativeってことで十分だろ。
baitとpreyを入れ替えてnegativeになったらやめんのかよ。two-hybridが擬陰
性になる理由なんて５億６千７百万あるぜ（藁
↑
何を言いたいのかよくﾜｶﾗﾝがコントロールのbaitで擬陽性になったらどうするんだね？
two-hybridが擬陽性になる理由なんて５億６千７百万あるぜ（藁。擬陽性になったら
見なかった事にでもするのかね？

まあ、あんまし揚げ足とってもしょうがないがbaitとpreyを入れ替えてnegativeだっ
たらcandidateから外すというのも絞り込む方法の１つだな。多分複数個あるんだろ？
こういう手法を使う人はそんなに珍しくないぞ。論文読んでるかな？plasmidから切り
出してvectorを変えるくらいすぐにできるし大した手間じゃないだろう？

研究を進める上で最も重要なのはここは100%確かであるという土台をキッチリと作る
ことだ。two-hybridでもIPでも共局在でもなんでもいいからとにかくこのデータは100%
信頼できるという土台を作りたまえ。焦って前に進むことばかり考えてると経験上ろくな事
はないな。俺としてはtwo-hybridなんかは片手間でできる仕事なんだから同時進行で次の
実験を進める事をお奨めする。

そもそも>>294のquestionはbaitとpreyが結合していなくともyeastが生えてくる事があるの
かってことだろう？Answerとしてbaitやpreyの性質によってはあり得る。しかしなにを使っ
たのかﾜｶﾗﾝから答えようがないで何か問題でもあるのか？

>>310そもそも>>294のquestionはbaitとpreyが結合していなくともyeastが生えてくる事があるの
>かってことだろう？Answerとしてbaitやpreyの性質によってはあり得る。しかしなにを使っ
>たのかﾜｶﾗﾝから答えようがないで何か問題でもあるのか？
結合しなくても激しく生えてきますが。。。。ばか？

>>311
ん、何が言いたいんだね？夏厨か？yeast two-hybrid法って知ってるのか？
それとも日本語が理解できないのか？ﾏｱ、ｵﾚﾆﾊﾄﾞｯﾁﾃﾞﾓｲｲｶﾞﾅ。

元々の質問者もいないようなのでそろそろ落ちるかな...

>310
ああ、こういう知ったかぶりして、その実なんも分かってないヤツっているよな。

> コントロールのbaitで擬陽性になったらどうするんだね？
> two-hybridが擬陽性になる理由なんて５億６千７百万あるぜ（藁。
> 擬陽性になったら見なかった事にでもするのかね？

これで、baitとpreyを入れ替えて結果がpositiveでもnegativeでもやるこた
変わらねえだろってのに対する反論になってると思ってんのかね。

controlのbaitで擬陽性になることだってあるだろうが、それはtwo-hybrid
のレベルじゃ答えがでるこっちゃねえんだよ。two-hybridの結果からはpositiveとは言えない以上、よっぽどsexyな分子でもない限りそこで捨てる
だろ。それでも執着するなら、それは本人の思い入れで理性のレベルの話じ
ゃない。偉そうな能書き垂れてねえで少しは頭使えや。

http://s1p.net/vbnm

朝までから騒ぎ！！
皆さんお待たせです
復活しました！！

　女性に大人気
　メル友掲示板
　よそには無い
　システムで
　安心して遊んで
　楽しんでください。

保守あげ

あげあげ

何げに良いスレだね

何を言う！！

生物板で僅少の良スレなり。

最近はtwo-hybridも皆順調なのかな。

近々始める予定なのでご指導ご鞭撻よろしくお願いします。

おう、何でも聞いてくれい。

ありがと〜

ｳﾌ

GAL4とLexAどっちがいいの金？

一般論ですが、LexAのシステムのほうが感度が良く、酵母のものではないたんぱく質を用いているため、ノンスペも少ないと言われています。だからレックスの方がベターかなと言う気がします。

じゃあGAL4のメリットないじゃん

システムのセットの値段がLexより安い事かな。あとは、ベクターの種類が豊富なので、ベイトたんぱく質の発現量を選択出来ることかな。毒性有るたんぱく質を高発現ベクターに入れて酵母に突っ込むと、生えてこないことがある。

なるほど。
ありがとございます。

安かろう悪かろうってこと？

同じbait & preyの組み合わせで比べても、LexAの方が感度が良いってことは
無いよ。酵母のタンパク質じゃないからノンスペが少ないってのも、後発の
LexAの開発者の宣伝文句で証拠がある話じゃない。うちのラボでいろんなbait
についてこれまでやってみた結果だと、強い相互作用のものはどっちでも取れ
てくる。弱めのものはどちらか一方でしか取れないこともあるが、GAL4でしか
ポジにならないのとLexAでしかポジにならないのが同じぐらいある。どっちも
試すだけのマンパワーがあるならそうした方が良いだろうし、どっちか一方だ
けなら、既に近所のラボで使ってていろいろ相談できる方にするのが良かろ
う。

ためになるなぁ〜げ

age

age

age

最近質問鎮静化か?

Two-hybridって立ち上げてお蔵入りになるのってどのくらいの割合？

９９％保証するよ

うちではscreeningしてみたうち論文にこぎつけたのが３割かな。

なかなか厳しいねぇ

それより1はどうした？

氏にますた

ソースきぼんぬ

今は研究を辞めて、というか大学を辞めてフリーターしてます。

そうか・・・

two hybridで採れたほとんどがartifactじゃないの？

論文読んでるか、おまえ。

345はリア高なので許して下さい＞３４６

今もツーハイでスクリーニングなんてやってるわけ？

論文読んでるか。

卒業までやることなくなってきたからツーハイでもやろっかな。
ほかにやることねえしなあ

タンパク質同士が結合するのって何結合が多いの？

みんな知らないの？

ダイサルファイドゥボンドもしくはハイドロジェンボンド

だとしたらどうしてtwo-hybridで検出できるの？

俺も知りたい

漏　れ　も　！

細胞内だから疎水結合＋イオン結合だろ

だよな・・・つか弱くない？＞疎水＋イオン結合

>>354
ツーハイブリッドの仕組み把握してるか？

>>359
核内で結合を見る＝ダイサルファイドゥボンドができない環境＝タンパク質間結合にはダイサルファイドゥボンドが多い＝two-hybridで検出＝なぜ？っていう流れですが何か？

>>360
ネタだよね？

360痛いから素無視の方向で。

痛いのはここまでのレスだよ。

ageときます

α相補性ってどうよ？

確認ならともかく、スクリーニングには使えないでしょ。

SOSにベイトを繋いでミリスチル化基ライブラリーによりRas経路を活性化させる「サイトトラップ」って、どうよ？

cdc25のsuppressorによるバックグラウンドが高すぎる。これも一対一の確認ならともかく、スクリーニングはかなり辛いものになると思われ。

cdc25＞cdc2の脱リン酸化酵素？それともrasのGTP交換因子？

ras経路をバイパスするマルチコピー差プレッサーってそんなに沢山あるの？

367にもRas経路って書いてあるだろ！
マルチコピーサプレッサーじゃなくて、ホストの酵母がRas-cAMP経路を活性化するような変異を噛むってこと。

マルチコピーサプレッサーとして、Ａキナーゼが取れて来る…ね、Ａ山先生！

>367
どこのメーカーからでてる？

>372
Stratagene

サイトトラプ話は禿しくガイシュツですね・・・

>>373
あんがと。勉強してみます。

おまいらcytotrapについて語ってるが実際にやったのか？

GATEWAYのシステム使ってる奴いる？
どうよ？

ライブラリー自作に失敗したので、萎えますた＞サイトトラップ

N末に短いミリスチル化基付加コンセンサスサイトが付くだけなのになんであんなにでかいプラスミドなんだ？＞pMyr

へたくそ！

>>379
未経験者が！ペッ！！

本物の相互作用って何個スクリーニングするとあるの？
何パーセントくらいなの？軽く一桁かな？

何万もスクリーニングするから１パーもない

>>378
で、やめたの？

1は何かいいの釣れたの？

>>384
お前らが釣れた

>>385
お前が一番釣らr(以下略

age

既出ながらケリの付いていないBacteriomatchは結局のところ使い物になんの？市販されるようになってから何年か経つのに、論文じゃ見かけないけど。

だめなんじゃん

保全age

1でてこい

.

コロニーたくさん出てきました。
ベイトとくっつくもの沢山あるってことすか？

それはこれからお前が明らかにする

どうしても一方向のIPしかとれないとき、相互作用の確信を持てますか？

落ちないほうの抗体がまずい（多量体中にあって露出しているかとか）

それってスレ違い

１が来ますように

片手間らしいから

400~~

やめちゃったんじゃない？？

じゃあ今日からここはボクの日記にします。

じゃあ早速書いてくれ>>402

年末にベクターを注文した。
年明け早々にも持って来てくれると業者が言った。

選んだのはBacterioMatchか？

ライブラリはどうしましたか？

ボスがアメリカの何とかって人からもらうと言ってました＞ライブラリ

＞＞４０５
違います

大晦日age

正月age

新ボクは週明けから実験再開？

>>411
ベクター来るまで休みじゃね？

明日から頑張ります！
ご指導よろしくお願いします！

がんばれや。正月はちゃんと休んだか？

＞＞４１４
ありがとございます！
しっかり実家で休んできました！！

初日の成果を期待あげ

まだ何も届いてないだろ

＞＞４１７
そうです。
まだ何も来てないので別の実験してます。

ベクターとプライマーが届いたのでPCRして
制限酵素で切ってライゲーション。

特に今のところ問題ないです。

システムくらい教えろ

ﾏﾀｰﾘﾏﾀｰﾘ

（＾＾）

>>421
おそらくGALだと思うけど。

>>421×
>>420○

保全あげ

結局、two-hyで取れてもなんの手がかりにもなってない気が・・・
免沈でやっとくっつきますっていえるんだよね。だったら最初から免沈やれよ的な
実験方法だよね。

指が２０本の訳をおしえて？

you have twenty digits in total

>>426
免沈でどーやってスクリーニングするつもりだ？あ？

プロテインチップ使えやドアホ

プロテインチップが免沈か？というツッコミはともかく、そんなもん、two-hybridよりよっぽどいい加減だろ。おまけにたかだか数百のタンパク相手にスクリーニングかよ。

すごい良いスレになるかと思ったけど、
やっぱ日記系は大変なんだな。
途中でみんな逃げちゃう。
まあ良い発想だったよ>>1は

いまごろ>>1は何やってるのだろうか、、、、

>429
最近では免沈で落ちてきたバンドを質量分析使って片っ端から読む
奴が増えてきているから426はバカにするほどとんでもないこと言って
るわけではない。

結局とれてきたものと何か機能的に関係あるかどうか解析しないと
いい論文にならない。というか、そうでないと信用できない。

ひとまずsequenceをしてin frameであることを確認。
まだまだペーペーの僕でもここまでは何とかできた。ホッ。

あ、戻ってきた。

ところで30℃のインキュベーター確保するのも結構大変じゃないか？

>>434
ｻﾝｸｽｺ。折れも3年間ツーハイやってたんだよね。で、駄目だったわけで、その経験
からこういう発言をしたわけ。助手が考えたテーマだったんだけど、教授にこう言
われて反対された。いやな香具師だったけど、助手じゃなく教授を信じればよかった
と今も思う。ま、結果論だけどね。

まだかなまだかな〜新ボクの日記はまだかな〜

ライブラリーが届きました。

>>436
30℃専用のがあるので大丈夫です。

（＾＾）

成功祈願

なにかと並行してやってるサブテーマなんだろか。

30度だったらその辺の暖かい部屋に置いておけば育つんじゃない？

あのねえ、タンパク質のインタラクション調べてんだろ？
温度だって重要なファクターなんだからてきとうじゃだめだろ

>>444
温度ってそれほど重要なファクターになるの？
無知なので教えてください。

>>445
例えば、22度が適正な生育温度な生物のタンパクでは
30℃では取れてこなかったものが、22℃でイーストを育てると
ちゃんと取れてきたりする。

>>446
じゃあ大腸菌で組み換えタンパクを発現させる時は
そのタンパクの由来する生物の至適温度がよいってことか？

まあ、なんだ至適温度なんて一概に言えることでもないような気もするが。

★http://www6.ocn.ne.jp/~endou/index2.html★
　　　　　　★こんなサイト見つけました★

>>448
いるいる。
こうやって話の腰を折る香具師（w

新ボク用age

コロニーがたくさん生えてきた。
こんなにくっつくタンパクこんなにたくさんあるのかな？
スクリーニング条件もっと厳しくしようかな？？

そうやってハマっていくのか。。。

そうやってハマって逝きます・・・

ああ、いっぱい免珍しないといけないね・・・やることがいっぱいあって
よかった・・・かな？　ここから片手間の実験でなくなってくるんだよな・・・

>>455
禿道

シーケンス読むことを考えるとあまり数が多いのはお薦めできないな

つうかおまえら。
数が多い時点で信ぴょう性が、、、

>>458
条件を厳しくした結果を待ちましょうや。

>>457
今のシーケンサーを甘くみちょるな。w

>>460
どうせ海老愛さまさまなんだろ。ﾌﾟｯ

べっく男最強！

ﾊｧ？どこが？

コロニー多いとプラ抽が大変なんだよね。クローンがかぶって来たら、シークエンス
行く前にPCRで落とすべし。

>>464
なにいってんだ？コロニーPCRでふやしてシーケンスだろ

１００個くらいシークエンスしろ。アッという間にできるぞ。

とりあえず全て読めとの指令によりシーケンスの鬼と化していました。
転写因子が沢山釣れました・・・

面白そうな奴だけにしとけー。

経験からいうと、ここからはくっつく奴を探すのではなくて、こじ付けが出来そうな
めぼしいクローンを選んでそれをどうにかくっつける作業になる。

http://www.agemasukudasai.com/bloom/

>>467
疑陽性な悪寒

がんがれよ。ところで、こういう風にイーストでたくさん取れた場合、条件を厳しく
するというがそれはどの程度効果的なのだろう？　いくら条件を厳しくするといって
も、イーストの話だよね。その条件を厳しくすることで、真ん丸での陽性率って上が
るのだろうか？

>>472
弱い相互作用は偽という前提で厳しくするから金銀財宝を失うこともある。

だからこそおいしそうなクローンを「くっつける」わけですわ。

厨房とは相互作用できん！

イーストでの相互作用の強さとまん丸細胞での免疫沈降での相互作用の強さは比例
するの？　もし比例するならイーストで真っ青のクローンを取ると免珍が出来やす
いってことになると思うけど、でも折れはそうは思えないんだよね。もし経験者が
いたら教えてYo!

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>>476
する。

>>478
だったらあるベイトに対して論文で報告された免沈もできるクローンがあるとする。
それをコントロールにしてそれよりも青く染まってるクローンを拾えば、かなりの
確率で免珍まで出来るクローンが取れるということになるんですが・・・本当にそ
うでしょうか・・・それならみんなもっと成功してるはずなんですけど。するって
だけでなくて具体的に教えていただけると幸いです。

>476
しない。

プロテインキナーゼと基質の相互作用って
Two-hybridで検証できるもん？

K>M変異体とか結合するけどリン酸化しない
不活性型キナーゼにしないとだめ？

ユビキチンープロテアソーム系を使った新しいタイプの
Two-hybridシステムについて教えて下さい

＞４８２　おれもしりたい

オーソドックスのものと比べてどういう利点があるんでしょうか？
また、これからの新しい手法にはどういう利点が求められているんでしょうか？

（＾＾）

（＾＾）

新年度あげ

>>484
利点
膜タンパク質にも使える。
転写活性化能を持って古典的two-hybridが使えないbaitにも使える。

欠点
経験の蓄積が少なくどこまで汎用性があるか不明。
試料が広く出回っていない。
ご近所に相談できる人がいない。

（＾＾）

みんなもうやってないの？

やらされてまつ

まーツーハイはスクリーニングにはおすすめしないね、俺は。

スクリーニングに使わないで何に使うと？

結合部位の決定

そうだな。俺もこの方法でスクリーニングはやりたくない。

学部にはちょうどいいだろう。

でもさ、major impact journalにコンスタントに出ている某ラボの論文、読んで
みたらほとんどがtwo-hybridで取った新しい分子の解析だったよ。もちろん取っ
てからの仕事が凄いんだけど。結局、アメリカのビッググラボが予想もしてない
ような分子を取って、こっそりデータを積み重ねるってスタイルにしようと思っ
たら、two-hybird位しかないんじゃない？

>497
そのラボはY2Hに関してのノウハウの蓄積があるからこそできると思われるが、、。私も>494に同意。

>497,498
日本にもそういうラボがあるが、Y2Hに関してのノウハウの蓄積という
か、その後のデータをでっちあげるノウハウの蓄積があるんだと思う。
中には変異体の表現型まで一致するきれいな論文もあるが、怪しい
論文が多い。多すぎる。
実際にY2Hのクローニング論文がノックアウトなどで否定されている
のを何度も見たことがある。

http://homepage.mac.com/hitomi18/

Y2Hはむやみとリボゾームタンパク質やHSPがひっかかってくるよな。

ttp://www.fccc.edu/research/labs/golemis/main_false.html
false positiveの簡単な一覧です。参考までに。

とゆーわけでﾂｰﾊｲはｶﾞﾁﾝｺ向きでｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞ向きではないとゆーことでよろしいか？

漏れもそう思うから意義無しっす。

　　　 　∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　(　　＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣〕
　　＝ ◎――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉

だれかいたら教えてください。

酵母でインサートチェックのコロニーPCRやってるんですけど
同じ一つのコロニーでも、インサートが確認できたり、できなかったりで
結果が安定しません。

滅菌水10ulにコロニーをPickして１００℃で１０分ボイルしてその上清1ulを
サンプルにして、20ulの系でPCRを行っています（酵素はKOD Dashです）。
サンプル調製やサイクルなどでコツなど知っていらっしゃる方がいたら是非
教えて下さい。よろしくお願いします。

懐かしいスレが上がってるな。それはともかく、酵母のコロニーPCRはなかなかtrickyで決定版がないように思うが、とりあえずこんなのはどうだ？

http://www.vbl.yamaguchi-u.ac.jp/koubo/method.html
http://www.users.kudpc.kyoto-u.ac.jp/~o51267/kozutsumi/protocol/protocol/yeastbud/yeast_pcr.html
http://food.food.kyoto-u.ac.jp/bunya12/KIMURA/prot.html#for%20PCR

>>506
そもそもインサートチェックってのはアタリが出れば良し、じゃないの？
KOD dashを使ってる時点でリッチラボとみた。
増幅の長さを短くしては？３００ｂｐぐらいとか。

>>507
早速レスありがとうございます。
やっぱりZymolyaseで処理するのが一番確実なのでしょうか？
NaOHを使う方法は知りませんでした、早速明日試してみます。
ありがとうございました。

>>508
>>増幅の長さを短くしては？　　
というのはどういうことでしょうか？

説明不足だったのかも知れませんが、上に書いた「結果が安定しない」というのは
青コロニーをPickしてレプリカプレートに移して、再度コロニーPCRかけると
最初Pickした時検出できたインサートが検出できなくなったりすることが結構ある
ので何かプロトコールにまずい点があるのかと思ったのですが・・。
プライマーはMCSの両端を挟むプライマーを使っています。

コロニーPCRの失敗は多くの場合、菌体の入れすぎが原因と思われ。楊枝も物によっては悪さをするので、チップを使うのが吉。

みなさんありがとうございました！！
NaOHでサンプル調製して、菌体の量少なくしたら、うまく行きました。

酵母が多すぎてもだめなんですね。素人なものでなるべく多いほうがいいのかと
思っていました。>>510さんありがとうございました。

もうスクリーニングの段階なので時すでに遅しなんですが、今後の参考のために
もう一つ・・・（ずうずうしくてすいません）。

Maitingさせた酵母をプレートにまく時、どのようにしてまくのがよいので
しょうか？？　というのは、生育してきた酵母がちゃんとコロニーに
ならず、一面に広がってしまったようなプレートがいくつかあって、部分的に
青いところはあってもどこまでが単一コロニーなのかわからないのでPickUP
できないものがありました。
播き方は大腸菌とほとんど同じで150ｍｍのプレートにX-Galを塗って１５分
くらい乾かして、そのあとコーンラージ棒で菌体を200ul塗り広げました。
乾かし方が甘かったのか・・、菌の量が多いのか・・、塗り方が下手なのか・・、
そういうプレートもたまにあるのか・・、知ってる方がいたら教えて下さい。
よろしくお願いします。

mating法はClontechのプロトコルだとどうしても菌体量が多くなりがちだ
よね。きれいに均一にまけてれば問題ないだろうけど。コツは十分プレー
トを乾かしておくことと（作ってから２日ほど室温に放置）、5mm径のグ
ラスビーズなどを使って均一にまくことかな。菌が厚くたまったあたりが
うっすら青いのは怪しいので無視。

グラスビーズって使ったことないんですけど、どうやって使うんでしょうか？？
あとプレートにはX-Galはあらかじめ混ぜておいたほうがいいってことでしょうか？
すいません、本当に初心者なもので。

platingしたい菌の懸濁液と、滅菌しておいたグラスビーズを15cm dishなら
10〜20コくらいプレートに載せて（注ぎ？）、プレートを水平に縦縦横横とジャ
ラジャラ振ると均一に塗り広がる。グラスビーズは良く洗って再利用できるよ。

あ、X-α-Gal（だよね？）はあらかじめ混ぜておいた方が楽だけど、
platingの直前に塗り広げた場合よりは発色が薄くなると言われているけ
ど、強い相互作用を示すものなら気にしなくて良いんじゃないかな。Ade
Hisで選択をかけて生えてきたものが数百程度なら（パイロット実験を
やっておくっちゅうことね）、最初のスクリーニングのプレートにはX-α
-Galを入れないで、拾い直す次のプレートに多めに入れるという手も。

グラスビーズってそうやって使うんですね。
早速今日発注しておきました。
本当にご親切にありがとうございました。

も一つ言うと、150mmプレート使う意味ってあんまり無いんじゃない？直
径が150mm:90mmなら面積は25:9、高々2.5倍でしょ。あんな使いにくいプ
レート50枚まくより90mmのプレート150枚まく方が合理的だと思うけど。
やたら大きいプレートまいて仕事した気分になってる人、もう一度考え直
したら？

>517
そんなに使いにくいか？？？

酵母の相互作用系をやりたい初心者です、教えてください。
One-Hybridのライブラリー作成＆スクリリーニングキットって
使えますか？なんか出たばっかりなので手を出せずにいます。
ものはアラビです。よろしくおねがいします。

クロンテックはだめだね。Three-Hybrid Systemをやってみたけど、
お話にならない。BD, ADヒュージョンに加えて第３のタンパク
（アダプターみたいな感じのタンパク質）をMetプロモーターで誘導
発現させるんだけど、誘導のためにはメチオニンを抜いた培地に置換する。
ところがキットについてくる株(AH109, Y187)は調べたところ
メチオニンを抜いた培地では生育できなかった。
クロンテックに問い合わせたところ、理由は分からないがやはりこれらの株は
メチオニンを抜いた培地では生育しないらしい。
他の先生は苦労しながらも工夫して実験しているだとさ。
元の株が生育しない条件でどうやってスクリーニングしろっちゅうねん！

培地にちゃんと硫酸アンモニウムとか入れてる？

☆頑張ってまーす！！☆女の子が作ったサイトです☆
　　　　　　　☆見て見て！！
http://yahooo.s2.x-beat.com/linkvp/linkvp.html

age

>521
硫酸アンモニウムは終濃度がg/Lとなるように加えています。
クロンテックにMET関連の遺伝子に変異が入っているのか
聞いてみたのですが特にそのようなことはないということでした。
521さんはAH109株がメチオニンを抜いた培地で生育したのでしょうか？
だとしたらもう一度菌体を起こしなおして調べてみます。

>524
しかしＡＨ１０９のMetに変異が入ってるのは
うちのラボでは定説です。
いや、絶対入ってるって。

ＦＬＡＧとかＭｙｃとか複数のＴａｇ使ってＴＡＰしてとれたcomplexを元に、
Ｙ２Ｈ、ＩＰの実験を行いスクリーニングから取れたと言い張り、論文作成。
その後に、ＴＡＰで複合体をとった論文を作成。
この方法ならソコソココンスタントにＹ２Ｈの論文がかけるけどダメなの？

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

>>520
Y187がダメなのはClontechのカタログにもはっきりそう書いてある。
www.clontech.com/techinfo/vectors/ vectorsA-B/pdf/PT3212-5.pdf
だけど、AH109は大丈夫だって書いてあるし、pBridge+AH109でググッたら-MetでcultureしているＤ論もあったよ。
www.biosci.ohiou.edu/faculty/holzschu/liyun.thesis

ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

本日のラボミーティングで、Two-hybrid系を立ち上げることになりました。
初心者で右も左もわからないので、入門用のプロトコール本や詳細の掲載されている
メーカーホームページなど紹介していただけると嬉しいです。
Yeastは扱ったことがないくらい初心者なのですが、現在どこのメーカーのシステム
が優れているのでしょうか？　大腸菌でできるシステムがどこかからでていたような
気もするのですが、やっぱり真核細胞でやった方がよいのかな？？
（ウィルスのタンパクとアソシエートするマウスの感染細胞内タンパクを
　cDNAライブラリーからスクリーニングしようと考えています）

よい情報を御存知の方、優しく指導してくださる先輩諸兄、基礎から叩き
込んでやろうという鬼教官の方々、よろしくです。

　　　 　∧＿∧　 ∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　（　 ・３・） (　　＾＾ ） ＜これからも僕たちを応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣￣∪￣￣〕
　　＝ ◎――――――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉&ぼるじょあ

>>531
ご近所に酵母やってる部屋があったら、そこの誰かに作法を教えてもらうのがなんつっても楽だよ。慣れればなんてことないんだけど、やってるヤツには当たり前すぎてプロトコルに書かれていないようなところに落とし穴があったりする。なんだったらうち来る？

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ひろみって、ひょっとして広海？

広海＠遺○研

今すぐ会いたいの。ひろみはあなたなしじゃもうだめみたい。。。。

私、遺○研にいるから・・・・・ポスドクに来て、くれる？

７日間会費フリー、１０分間無料になってるの、だから来て♪
あなたに会えなくちゃ、寂しくて死んじゃいそうだから
待ってます。来てくださいね！
→　→　→　http://www.nig.ac.jp/labs/DevGen/hiromi-j.html

>>537
不覚にもワロタ

せっかくの夏休みなのにっ！アメリカはもう学校ないんだよっ！

むーっ。あたし、あなたに会いにいけないじゃなーいっ！

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なつき、ずっとずっと待ってるからね！遊びに来てね！
え？・・・モチロン、遊びじゃなくてマジなのも大歓迎、だよ(*^.^*)

常陸の受託スクリーニング試した人いますか？

困った時のtwo-hybrid

オレはtwo-hybrid奴隷…

「イラストレイテッド」シリーズにtwo-hybridがついに出た！

>543
【どんなタンパク同士も】バイオ実験イラストレイテッド　two-hybrid【くっつけてみせる !!】
みたいなキャッチコピーなんかな？

>>544
【ク○ンテックに】バイオ実験イラストレイテッド　two-hybrid【騙されるな !!】

InvitrogenのProQuest Two-Hybrid System with Gateway Technologyを
使っているかた、いらっしゃいませんか？
スクリーニングした後、酵母からpreyプラスミドがうまくとれないんです。

>
>‥∞‥。☆゜‥∞‥゜★。‥∞‥。☆゜‥∞‥゜★。‥∞‥。☆゜
>　
>　ねえ、ちょっと・・・マジやばいんじゃない？　この動画！！
>　　　↓↓　　　　　　　　　　　　↓↓
>　http://moro00.e-city.tv/　http://moro00.e-city.tv/
>
>　ハッキリ言って、丸見え！　素人はお金のためなら何でもヤル。
>　撮られた時はこんなにバラ撒かれるとは思わなかったんだろね。
>　けっこうカワイイ娘なのになぁ・・・ そのへん歩いてたりして！
>
>‥∞‥。☆゜‥∞‥゜★。‥∞‥。☆゜‥∞‥゜★。‥∞‥。☆゜
>

インビトロジェンのゲートウェイtwo-hybridはどうですか？
なんか簡単そうだけど。

>>546 酵母内でlow-copyのプラスミドなので回収でトラブルことがあります。どういう方法で回収していますか？
最悪の場合、prey specific primerでPCRして、Gatewayでsubcloningするという手もありますが。

プラスミド回収はいろいろ試しました。
kitのmanualに書いてある方法、ガラスビーズや酵素で
細胞壁を破壊する方法、またキアゲンのkitでも精製をやりました。
けど、どれもうまくいってません。

low-copyのプラスミドとはいえ、うまくいく人はちゃんと取れるのでしょうか？
また、このInvitrogen ProQuest Two-Hybrid Systemはプラスミドが
取りずらいだけで、あとは問題のないシステムなのでしょうか？
まわりにこのシステムを使っている人がいないのですごく不安です。

>>550 ProQuestはbackgroundも低いし形質転換の効率の良い宿主だし、良いシス
テムだと思うよ。それから、それだけいろいろ試してプラスミドが回収できない
のは、大腸菌のコンピテントセルの出来に問題があると思われ。Inoue法で丁寧
に作るか、electroporationにスイッチするかしたら？

酵母においてプラスミドが染色体に挿入されて、普通のプラスミドが落ちることはよくある。
ゲノムをとってPCRして終わり。

結局、形質転換はうまくいかなかったので、prey specific primerでinsertを
増やそうとしているのですが、ほとんど増えてきません。
よっぽどプラスミドが少ないのか、それともPCRを阻害する物質が入っているのか・・・
何か良い解決法はないでしょうか？

プレイベクターとベイトベクターが融合して巨大なプラスミドになって
回収されたことがある。

PCR前にDNAを精製する

サイトトラップ、どうよ？

>>556 reversionがチョト大杉。酵母に慣れた人に相談するがよろし。

>>551
へたったコンピだと入んないね

>>546
手を広げすぎて原因がつかみにくくなってると思われ
何かを改善しようと新しい方法に手を出すのことを悪いとは言わないが、
広げすぎても、結局何がなんだかわからない。

PCRテンプレはどの方法で取ったんだ？
もともと精製度が悪い条件でPCRすら伸びないものをコンピに入れても拒絶されるだろう
ローコピでもZymolase処理して、各ステップていねーに処理して、
10^7〜10^8くらいのコンピにいれれば普通は入ると思われ

まさかローコピでないプラスミドでもザイモ処理法で取って入らないのなら手技に問題あろう
→ゴミがおおいこと原因と思われ

保守、書き込み、あげ。

ぜんぜん書き込みがないね。
Two-Hybridって、もう流行が終わったの？

簡単すぎて論じることがあまりないの。

今や外注できるよね。日立のカスタムスクリーニングどう？

このスレのまとめ - wikich
http://pwiki.chbox.com/pukiwiki.php?%A5%A6%A5%A7%A5%D6%A5%ED%A5%B0%CE%AE%B9%D4%A4%C3%A4%C6%A4%EB%A4%F3%A4%C7%A4%B9%A4%AB%A4%CD%A4%A7%A1%C4%A4%CE%A4%DE%A4%C8%A4%E1

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mating法ばんじゃい！一発で10^7クローンをスクリーニングできた！

このスレもそろそろ3年か

低レベルな質問ですみません
培養細胞用のディッシュにyeast screening用の培地まいちゃったんですけど
大丈夫ですか？
寒天培地だけどポリエルリジンとかが悪さしたりとかしませんか？
作りなおしたほうがよいですか？
至急レスお願いします！

大丈夫だ。安心して実験しる。

コートされているシャーレだと高いだろ。ボスに見つからないよう注意せよ。

1はどうした

初心者で２hyをやっていますが、どうもmating効率があがりません。
細胞数や培地や細胞状態、温度、プラスミドの変更、、、などあらゆるものをチェックしましたが原因不明です。なんかポイントがあるのでしょうか。教えてください。
こんなにコロニーが出てくれないと困ります。各酵母は元気なんです。

age

>>570
振り混ぜ過ぎ

>>570

PEGが古くなると、てきめんに酵母の形質転換効率が下がる。
リチウム溶液からPEGまで作り直すことを進める。
キャリアーDNA/RNAも1-5kbpぐらいの長めがいいらしい。
ハイブリダイゼーション用キャリアーDNAの数百bpは短すぎると聞いた。

DNA添加、PEG処理、DMSO添加、熱ショック、の後、軽く遠心してPEGを除き、YEB培地に
resuspendして2時間30度で振る、そのあと選択培地で３回洗って、選択培地アガーに
やさしく蒔く。

ツーハイブリッドで泥沼にはまりかけてるので書き込みします。
酵母株はHF7cを用いてクロンテックのcDNAライブラリーを購入して
スクリーニングしています。
トラフォメ効率は高いのですが、3ATをプロトコル最高の15mMいれても
バックが高すぎて陽性コロニーがつつけない状態です。
ベイトは5つ作って自己活性化能が無いものを使っているのですが…

実は以前も別のライブラリーを用いてスクリーニングしました。
トラフォメ効率が非常に低かったのですが、
コロニーの大小は差が見られたので大きめのコロニーをつついていました。
その後リトラでも陽性だったものをいくつかIP、pulldownして
みましたが、すべてネガでした。
ちなみにベイトはずっと同じものをSD(-Leu,-Trp,+His)に
継代したものを使っています

プレイのライブラリーをベイトを持つ酵母に導入するとバックが高くなる、、、

というのはベイトに繋いだ目的のタンパク質が、プレイのGAL4acid pachかVP16領域と相互作用してんではなかろうか？

ベイトコンストラクトが転写活性化能を持たなくても、空のプレイ
プラスミドを入れたら転写活性能が出るのでは？

以前のプレイライブラリーと今回ので、プレイプラスミドの転写活性化
領域に違いはあるのか？

ヲレは以前、培地に3-ATを50mMぐらい入れて気合いでポジティブなクローンを
とったことが有る。

>>573
matingの効率の話をしてるんであって、形質転換効率は関係ないよ。

>>575　いまいちよく分からないんだが、自己活性化能のないベイトを
選んだんだよな。それを選んだ時には15mM 3ATで生えなかったのか？
それなら継代中にベイトかホストに変異が入って生えるようになっち
ゃったってことじゃないの？一般論としてプラスミドを持った酵母は
プレートなどで継代し続けない方が良いよ。早い段階でグリセロール
ストックを作って、マメにそこから起こしなおすべき。

>577
GAL4acid pachかVP16領域というのは知らなかったのですが、
プレイプラスミドの転写活性化領域は、同じベクターに
同じ制限酵素サイトで入っているので、同じだと思います。

空のプレイプラスミドを入れたら転写活性能が出るという可能性も
考えられますね。その場合、別のベイトを作り直すしか
ないのでしょうか？

>579
ベイトを選んだときの培地には3ATは入れておらず、3ATを
入れたのはライブラリーをトランスフォームした後の
選択培地のみです。ベイトのみで15m3ATで生えるかどうかは
今度調べてみたいと思います。
ベイトをずっと継代し続けたのは、教官にそれで問題ないと
言われたからなのですが、今度最後作り直してストックは
作ろうと思います。

なんも理解せずに手だけ動かしてるんだなw
Gal4やVP16でググレ

酵母2-hybridで接合するような実験ってあったか？

教えてくれ。

preyのlibraryをあらかじめ形質転換した酵母のlibraryがあるんよ。
これをbaitを持った酵母とmatingさせて、二倍体をscreeningする。
ttp://www.clontech.co.jp/archive/200001/pdf/200001-24.pdf

追加
genome wideの網羅的相互作用解析プロジェクトではこれを使っていることが多い。

thanx

>>575
漏れは100mMの３AT入れてポジティブクローンが生えてきた・・・・数個だけど
しかもそこからprayプラスミド回収して塩基配列決定までしました・・・・
取りあえずボスはこの中のどれかが本命だと言ってます・・・・ほんまかいな・・・

配列決定する前にベイト、ネガコンと再形質転換して再現性と特異性を見とくべき。
特に思い込みの強いボスだと、面白そうな遺伝子の顔見ちゃってからじゃ再現性無いって言っても聞いてくれないなんてことにならないとも限らない。

これからtwo-hybridを立ち上げようと思っています。BD matchmakerの mammalian two hybrid assay kitを使ったことある方はいますか？mammalian cellの系は、酵母とくらべて効率はどうなんでしょうか？

懐かしの名スレが上がったな。
558日記つけてよ。

mammalianの系は特定の２つのタンパク質の相互作用の検定には使えても、新規相互作用分子のスクリーニングに使うのは難しかろう。

＞590
どうもありがとうございます。
特定の蛋白質間の検定に使おうと思ってます。

mammalの系は、matchmakerの他にTOPOなどでも出ているようですが、使ってみた方はいますか？

>>588　えーと、スクリーニングに使わないなら、何の効率について訊きたいの？

特定のタンパク質間の検定なら、酵母でツーハイ+哺乳類でtag付
のIPでいいんじゃないか？

基本的すぎる質問で申し訳ないのですが、誰か教えてください。
コロニーＰＣＲでは、コロニー、つまり大腸菌を系に加えて行いますよね？
そして、大腸菌内のプラスミドが増幅していきますけど、
このとき、この大腸菌の菌体、本体はどうなっているんですかね？
細胞壁が破れなくても、その中のプラスミドは増幅するんですか？
素人的には、増幅させたいプラスミドのみを系に加える、
というならば理解できるのですが、
プラスミドが大腸菌内にある状態で系に加えて、
細胞壁に囲まれた中にあるプラスミドが増幅するの？
という疑問があります。
誰か、教えてください。

大腸菌の脂質二重膜は９４度２分ぐらいの過熱処理でスカスカに壊れます。
外膜と細胞膜の間にあるペリプラズマ空間のペプチドグリカン細胞壁は
もとからスカスカですのでプラスミドぐらいの小さなDNAはくぐり抜けられます。

>>594 two-hybridと何の関係があるのか？

ごめんなさい。関係はありません。
スレでこんな事聞くのも申し訳ないと思いながらも、
気になって、書き込んでしまいました。
ありがとうございました。

レスありがとうございます。

＞593
すでにIPでは確認済みなんですが、mammalの細胞の中でも結合しているかどうかを確認したいんですよね。
酵母を使うことも考えたのですが、ラボではまったく酵母を扱っていないので、セットアップが面倒かな、と。mammalの細胞はルーチンで扱っているので、可能であればそちらでツーハイができれば、と思いました。

＞592
トランスフェクトの効率や、レポーターが非特異に発現しやすくないか、とかの情報があればうれしいです。「効率」というよりは、「使い勝手」と言った方がよいかもしれませんね。

何か情報をお持ちの方、教えていただければうれしいです。よろしくお願いします。

>>598
意味がよくわからないんだけど、哺乳類の細胞でIPしてついてるなら、
細胞の中で結合してるってことだろ？それでいいじゃん。

>>598
俺もわかんない。
mammalianでもtwo-hybridはいくつかの候補の中から
あくまでスクリーニングに使うものという認識だし。
俺があほなのかな？
どっちにしろそこまで分かっているけど、どうしてもやりたいというなら
酵母に戻る意味はないからmammalでやったほうが良いんじゃないでしょうか。

>>600
588さんがボスにいわれたことを理解できていないのか、そもそも
彼のボスがよくわかっていないのか、少し気になるな。

DUALSYSTEMSのDUAL membrane kit2ってどうなんでしょうか？
ご存知の方、使われてる方いましたら情報お願いします。
膜タンパクをベイトにスクリーニングやりたいなと考えています。

>>602
私も興味あるのですが、詳細を教えてもらえないでしょうか？
ググッても見つからなくて。
Cyto-trapとはどう違うのでしょうか？

>>603
レスが遅くなってすみません。
Cyto-trapはミリスチン化配列をつけてターゲットを膜に配置させますが、
膜タンパク質をベースとしたこのDUAL membraneでは膜タンパク質自身の持つ
配列（シグナル配列やミリスチン化配列など）で膜に移行するため
自然な形で相互作用が見れるのでは、と思っています。
Cyto-trapはあまり詳しくないので誤解しているかもしれませんが。

詳しくは以下のサイトをご参考にしてみてはいかがでしょうか
Dualsystems Biotech社
ttp://www.dsbiotech.ch/

日本代理店(?)コスモ・バイオ株式会社
ttp://www.cosmobio.co.jp/product/products_DSB_20031029.asp
ttp://www.cosmobio.co.jp/product/product_DSB_20031111.asp

「DUALmembrane kit 2」は販売終了していました･････
「DUALmembrane Starter Package」は８４万円かぁ（汗）

使われてる方いましたらぜひ情報お願いします。

>>602
ご丁寧にありがとうございます。
なるほど。
確かに興味深いですね。
Cyto-trapはいろいろ問題がこのスレでも言われてますものね。
私からもぜひ情報を頂きたいです。

けど、同じく84万円はうちの研究室では気楽に買えないです（涙）。

ageさせていただきます

酵母のホスト細胞の選択なんですが、ラボに以下のストレインが
あるんですが、どれを選択するのかベストなんでしょうか？
Y190
CG1945
HF7C
SFY526
AH109

age

1から一気に読んだ。疲れた。
最近実験デビューしたばっかりの超初心者がボス指令で臨むtwo-hybrid。
日記には‥‥できるかなぁ（汗）

とりあえずX-α-Galも手元になく，スクリーニング開始後に3AT濃度検討とか
なんか早くも迷走中？
His+クローン星の数ほど生えるけどAde+どこにいるんでしょうか。とほほ。

>>609
一応、Wanker のところの Y2H データーベースとか、みといた方がいいと思うぞ。
出てたからやらないとか言うもんでは無いとは思うが。

ttp://141.80.164.19/neuroprot/ppi_search.php?select_cat=Synonym&gene_input=shp1&select_set=Y2H+network%3A+All+interactions&pushed=Submit&hidden=don%27t+use

>>607
文句無しでAH109。形質転換効率も高いし、何よりHis+Adeの選択は強力だ。

X-β-Galはプレート上では感度が低いので勧めないと
ClontechのYPHには書いてるけど，やっぱりαじゃないとダメでしょうか。

プラスミドの回収は原始的にガラスビーズですが
Zymoprepの方がやっぱりいいのかなぁ。

細かく分からないことだらけ。

>>610
なんだかうまく見られないけどがんばってみます。

ＡＨ１０９はベータだとプレートは不可能だよ。
つーかアルファもだめだって。
ＨＩＳとＡＤＥだけで、スクリーニングはＯＫだよ。まじで。
あと、３ＡＴは必要ないよ。つーか３ＡＴをいれないとダメなときは
絶対何もとれない。そのときはベイトを断片化してから
スクリーニングをやり直すべし。

ベイトをつくったときに、からのプラスミドを入れたのと、ＨＩＳのプレートに
ぬって比べてみ。
からのプラスミドより元気に生えたらもう、擬陽性だらけになるからダメ。
そのときは、ベイトに入れるインサートを小さくするんだよ。

AH109でHis+Adeの選択をかければ、まともなbaitならpositiveはそんなに
出ないはず。X-α-galもX-β-galも普通必要ないよ。
プラスミド回収はガラスビーズで十分。これもスケールダウンして、大きめ
のコロニー一個をそのまま20μLのスケールで潰して、上清の５μLを大腸菌
のtransformationに使うだけで、コンピの出来が良ければ100以上のコロニー
が出る。baitごとの特殊事情もあるけど、まずはやってみないと分からない
ので、ガンガレ。

>>613,>>614
マジですか‥‥baitだけ入れたAH109，-Trp-Hisプレートでかなり元気に生えます。
空baitベクターとの比較はしてませんけど。
条件検討では3AT 2.5mMか5mMの低濃度でバックグラウンド抑制できそうなのでいけるかと思ってました。

Adeで選択かけるとスクリーニングプレートほとんど何も生えてこないんです。
まあcotransformationが効率悪くてまだ10^4オーダーしかクローン検定できてませんけど。
次からsequentialに切り替えてみる予定なんです。

大腸菌のトランスフォーメーションはやっぱりelectroporationですか？

ちなみになぜかAH109はーadeはダメ。
かならず、-his-adeのプレートでないとダメだよ。理由はしらん。

１００万個ころにーだして、１００個ぐらいポジだったらＯＫだけど、それ以上だったら
やめたほうがいい。

エレポはめんどくさいので、おれは普通にケミカルこんぴつかってたよ。

すいません。
Baitを３種類作って、一回のスクリーニングで全部混ぜて、ライブラリースクリーニング
したら、一個のホスト細胞に入るプラスミドは、一種類だけなの？
それとも複数個はいるものなのでしょうか？
baitは同じ遺伝子で、少しずつドメインを変えただけど、要は、この遺伝子
産物につく遺伝子を取りたいのですが・・・

プラスミドの濃度にもよるけど、ある程度の形質転換体数を稼ぎたければ
そこそこの高濃度でやるだろうから、複数のプラスミドが入ることは普通。
下手すると２、３割くらいまでそうなる。手抜きをしないで、それぞれの
Baitに対してスクリーニングしたら？そこまでは大した手間じゃないんだから。

.>>複数のプラスミドが入ることは普通。

つうことは、positiveで拾ってきてコロニーから回収したライブラリー
由来のプラスミドのなかにもネガティブの混ざりものが混入している
ってこと？
セカンドで行かなかったから捨ててしまったコロニーが山のようにあるんだけど？

あくまでプラスミドの濃度による。大腸菌に回収する前に試しにpreyプラスミド
のクローニングサイトを挟むprimerでPCRしてごらんよ。私の経験では、
10^9の細胞を使って3.6 mlのスケールで形質転換するときに、20 ugのprey
libraryを形質転換して、出てきたpositiveの５％程度が複数のprey plasmid
を含んでいたよ。

でも、それならば、一個のコロニーから回収したプラスミドはmultipleに
なるはずだけど、これまでシークエンスして、一つのコロニー由来で
いろいろなプラスミドが取れたという経験はないんだけどなあ。
たいてい１０個回収したら、３−４個がdeletionなどが起きている奴で
intactの奴は、全部同じ遺伝子というケースがほとんどだった。

インサートが違えば大腸菌のTF効率もコロニーサイズも違うからね。
しかも５％程度だっていうんだから。そもそもどれくらいのDNAで
TFしてどれくらいの形質転換効率なのよ。

>ちなみになぜかAH109はーadeはダメ。
かならず、-his-adeのプレートでないとダメだよ。理由はしらん。

、-his+adeのプレート??

とりあえずAH109をフリーズストックから起こし直して，
連続トランスフォーメーションでもう１回スクリーニングかけることにしました。
-His-Adeにありったけまいてみます。

>616
試しにヒートショックかけてみましたが，うちのcompetentでは
10ugぐらいDNAつっこんでも１個もコロニー出てくれませんでした‥‥
まさかゲノムに組み込まれてないよなぁ。泳動流してみます。

Ade+クローン2個シーケンスしてみたら，片方読めず
もう片方はプライマーに挟まれたMCSがきれいに読めた。
インサート何も入ってないってどういうこと？？　はまってるかも。

-Trp-Leuでもう１回振ってプラスミド取り直します。
よく考えたら，プラスミド取りにいくときってpreyだけ欲しいから
-Leuで振った方がいいんじゃないかな？

よく考えなくてもそうだと思うがｗ

>>609 baitのベクター何使ってる？

>>609 インサート無しのクローンって、再形質転換してもAde+だった？
上で議論のあったみたいに、一つの酵母に複数のpreyプラスミドが入ってたんじゃないの？

>>628
PCRでインサートチェックしたらバンドは1本だけ（MCSよりサイズ大）だったので大丈夫かと‥‥
本当は再転換で結合の確認もしたいし，E.coliに入れてからシーケンスも読みたいんですが，
事情があって，偽陽性でもいいからcandidate候補のリスト出さなきゃならんのです。
確かに空ベクターと両方入ってる可能性あると思います。

>>627
ClontechのキットなのでpGBKT7です。一応preyのベクターに特異的なプライマー使ったはずです。

>>626
実験動き出してるのに後からこういうことばっかり‥‥（汗）
最初は律儀に-Trp-Leu-Hisで振ってますた。
でも，選択培地だと増殖に時間かかるからYPDでいいって言われたんですよ。
さすがにそれはやめました‥‥

そうそう、酵母にプラスミド入れたままにしてると、すぐにプラスミドがおかしくなるよ。
スクリーニングでポジティブが取れたら、すぐに-trp-leuの液体培地５０ｍｌに
コロニーをありったけいれて、３０度で、一晩から二晩振ってすぐにプラスミドを回収しないとだめだよ。

それと、酵母からプラスミドを回収するときは、エレクトロポレーションが標準だよ。
もし、ケミカルでしたければ、酵母の細胞壁成分を除くような方法でプラスミドをとらないとだめだよ。

それと、回収するときは、普通４つぐらいの独立した大腸菌のクローンから
プラスミド回収しないと、中には変なのが混ざっていることはよくあるよ。

経験的にいって、
スクリーニングは-trp-leuで１００万個コロニーが出る条件で、
-his-adeプレートにまいて、コロニーが１００個でる程度が一番よく
本当のポジティブが取れる。
それ以上だと、擬陽性ばかりで話にならなくて、
それ以下（１０個以下）だと、なにも無い。

上に書いたぐらいの頻度になるように調整するには、作ったベイトと
空のベイトを-hisのプレートにぬってみて、同じぐらい生えるのを基準にするとよい。

それと、一つの遺伝子しかやらないと、外れる率があるから、なんだかんだといって、
５つぐらいの遺伝子について、それぞれやったほうがいいよ。

ちなみに、上にかいたのはクロンテックの酵母とプラスミドとライブラリーの話です。
ライブラリーはだれかが、増やしたものは使わないほうがいい。
ライブラリーはクロンテックから買ったのをちゃんとプレートで増やしたものを使わないと
分野によっては何もとれない。（分野によっては取れるけどね）

>>630 プラスミド回収のために50mlで培養だって？せいぜい1.5mlでやってますけど。
手抜きのときにはコロニーを掻きとってグラスビーズで潰して回収することすらあるけど。

>>629 PCRで良さげなバンドが出たなら、そのPCR産物をdirect sequencingしたら？

あ、それから-Trp-Leu-Hisで振るのは選択が掛かったままだから、複数のprey
が入ってるときにpositiveなプラスミドのコピー数が上がって、そっちが
取れやすくなるというメリットもあるよ。

実験をうまくやるコツは、これで大丈夫だよっていうのをまったく
信用しないで、基本どおりまずやることだよ。

バカにだまされないでね。

まあ、こういうと、みんな、たいていへそを曲げるんだけどね。

さすがにプラスミド回収のために50ml培養とは、基本に忠実とは言わんがな。

>>632
まあ、本当のポジティブとは何かという問題があるがなｗ

>>637
５０ｍｌの培地を数百振ってプラスミド回収するのは
ただのヴァカだよね。

まあまあ、>>636もちょっと偉そうなことが言ってみただけなんですから、見逃してやりましょうよ。

まあ、いいけど。
で、とれてんのポジティブ？？

大腸菌のtwo-hybrid使ってる人います？
Bacteriomatchのなんですけど…

これから使おうかと思ってるんですが
経験者が周りにいなくて、良いのか悪いのかも分からなくて。

器具は揃ってるけど、一から試薬を揃えて始める場合、
どれくらいのコストかかる？

全部買うか近所に分けてもらえるかで全然違う。

>>642
何の役にもたたない

AH109をストックから起こし直して，baitの形質転換体作り直しますた。
いままで使ってた種菌より元気な気がするのは気のせい？
来週からスクリーニング再開です。
本当に使うか分からないけど，3ATの濃度もポジコンとネガコンで検定しておきます。

>>634
PCRかけ直してみましたが，低分子の非特異以外はバンド1本でした。
精製も兼ねて，バンド切り出してからシーケンスかけました。
明朝どう出てますやら。

>>609
シーケンスどうだった？

連休でひと休み。

>>647
今度はちゃんと読めますた。きれいでした。ほっ
数個読んだのですが，どれも全くのゴミというわけではなさそうでした。

PCR産物をインサートにしてクローニングと，大腸菌に導入と
ボス指令で平行してやります。
Competentも新しく作り直したので，これでダメならelectroporationです。

明日はbait入りAH109にライブラリー導入。Ade+たくさん出ますように。

あんまりたくさん出ても困るよね。

インサートの無いMCSが読めたのは何だったのだろうね？

YPD Plus Liquidがコンタミしてた‥‥ショック。
仕方ないので普通のYPDでtransformしました。
やっぱり効率かなり落ちるんでしょうか？

Yeastmakerキットごと買い直すとろくまんえんだしなぁ

YPD plusって何が入ってるんだろね？

結局，トランスフォーメーションは10^4台しか入らず。
何がいけないんだろう？

今週のチェック項目
・pGBT9コントロールでのAH109トランスフォーメーション効率
・（ないと思うけど）baitの毒性：空ベクターとの増殖の比較
・ライブラリーの量と質

どうせキャリアDNAもそのうち足りなくなるし，キットも新しいの買ってもらおう。
これでPEGも新しくなるし。
新しいの届いたら今度は速攻分注です。

そういえば，YPDにA入れてないけどこれも関係あるのか‥‥

Matingに切り替えも視野に入れてY187のbaitも作りますか。

AH109ならYPDにはAde入れないとダメ。テキメンに効率落ちるよ。

とってもバカな質問だけどプラスミドとベクターとホストの関係を教えて。。。

>>655
プラスミド　輪っか状のDNA
ベクター 運び屋　プラスミド状のベクターに目的の遺伝子などを導入する
ホスト　宿主　大腸菌など　　ホストにベクターを導入→ホストを増やす→ベクターも増える

はじめまして。ClontechのMATCHMAKER3とPretransformed Libraryを用いてMatingによるY2Hを
行っています。User Manual通り操作していますが接合効率が非常に悪く原因が判りません。
次回、Bait酵母数を増やしてMatingする予定なのですがどこまで増やしてよいのでしょうか？
ご存知の方、お教えください。また、接合時の振とう速度が速すぎるとMatingに悪影響があると
Manualには書いていますが逆に遅すぎるのもよくないのでしょうか？現在、15rpmにて行っています。

matingはなかなかトリッキーだよ。上手くいくときはすんなり行くんだけどね。
気をつけることはgrowthが良い状態に保つことと、振とう速度が速すぎたり遅すぎたりしないこと。
growthがstationaryに入っちゃうと接合しなくなるからね。振とうは、パートナーが出会う機会を
十分保ちつつ、接合しかけの細胞を剥がさないように。底に沈まない程度なら十分だと思う。

>>657
まずはBaitをフリーズストックから起こしなおしてみましょう。
あと，培地も作り直す。これだけでも改善することはよくります。

振盪は，例えば自分は2Lフラスコに50mLを入れて，40rpmでまわしてます。

同じくClontechのキット使い

ありがとうございます。40rpmでもう一度トライしてみます。
Bait酵母数は5×10^9個で行っているのですがもう少し増やしたほうが
接合効率はあがるのでしょうか？あと細かい質問ですがmatingの際、
私も2Lフラスコを使用しているのですが、往復振とうと旋回振とうで
接合効率が変化し得るのでしょうか？変化するとすればどちらの振とうが
より効率的かご教授ください。よろしくお願いします。

しばらくです。

トランスフォーメーションはまだ1.3×10^5cfu/ugpGBT9くらいしか効率上がらず，
ライブラリーも40万クローンどまり。
-Trp/-Leuプレートに蒔き忘れて効率チェックできなかったり
スクリーニングプレートに蒔いてる間にトランスフォーメーション液こぼしたり（泣）
いろいろあったけど，Ade+コロニー100個越えたのでここらでひと休み。
とにかくシーケンス読むことにしました。

あまり効率上がらないようならmatingでのスクリーニングも考えてましたが
こちらも簡単にはいかないようですね。

プラスミドのレスキューですが，
酵母から大腸菌にelectroporationで直接回収している方っていますか？

うちでは上手くいかなかった＞ 酵母から大腸菌にelectroporationで直接回収
グラスビーズで潰してsupをそのままtransformationする方法を、コロニー１個
からにスケールダウンしてやってます。８割これで取れるので、残り２割を液培
して取り直してます。

レス忘れますた。

>>652
specially to promote transformationて書いてあるけど実に謎です。
YPDでrecoverしたら効率やっぱりよくなかった。
一回，両方で振って比較してみようと思ってるんですが，ライブラリーのときは
効率下げたくないんで，陽性クローンの再確認のときにやってみようかな。

>>654
ありがとうございます。YPDにAde加えたら（そのせいだけかわからんけど）
1ケタ効率上がりました。AH109の増殖自体も速くなって，OD上がりすぎて一回実験ダメにしましたw

>>662
そうですか…実はいま大腸菌のトランスフォーメーションでトラブル発生して困ってます。
competentを作り直そうとして，ふと，どうせならelectrocompetentで作って
一発で回収できれば楽でいいかなぁと。
Clontechのマニュアルには効率>10^9が必要とありましたが，どれくらい出るcompetentでしたか？

>>660
baitの数はなんとなく足りてる気がします。
ところで，空ベクター入りAH109とbaitベクター入りAH109で
mating効率が変わったりとかはありますか？
（単独でのレポーター活性が無いかを調べるときに，
空ベクター入りY187とmatingとかさせていると思いますが）
そもそもそこでおかしかったら，bait依存的ってことになってしまいます。

振盪は，うちは基本的にすべて旋回でやってます。
理由は分かりませんが，先輩にそう教わったもので。
でも，効率はかなり変わるでしょうね。

空ベクター入りAH109とbaitベクター入りAH109での比較は行ったことはありません。
ただ、キット付属のコントロール酵母（AH109[pGBKT7-53]とY187[pGADT7-T])で
試しにmatingを行ったのですが私のBait酵母を用いたときと同様、接合効率が非常に
悪かったため、手法に問題があるのではないかと考えています。プロトコール通り
行っているつもりなのですが・・・。ちなみに単独でのレポーター活性、毒性などは
特に問題なかったです。一度接合時の振とう速度を変えてやってみます。
ありがとうございました。また報告します。

規制中？

ひさです。今週ミーティングがあるので実験に追われてます。

酵母から大腸菌へプラスミドを直接入れるのは成功率低いので，
簡略化したプラスミドプレップの後エレクトロポレーションでレスキューしています。

いまのところ，1酵母クローンあたり大腸菌のクローンは1種類なので
ややこしいことにはならず助かっています。
しかし，1つ1つクローンをレスキューしてミニプレップ→インサートチェック→シーケンスって
予想以上に力仕事ですね。聞いてはいましたが。
うちの環境だと，マシーンでミニプレップしたサンプルはそのままだと汚くて読めないので
1回精製のステップを入れないといけないのでかなりめんどいです。

まあ，しばらくはあまり頭使わず手を動かすだけなのでがしがしやります。

>>667
直接酵母をコロニーPCRにかければいいじゃん。ダメだった？

>>668
コロニーPCRは一応動いてはいるので，産物をダイレクトシーケンスでも
配列決定だけならよかったんですけどね。
その後の再形質転換とか，さらにその先の実験に使うことを考えると大腸菌にとった方がいいかなと。
あと，PCRのダイレクトシーケンスは一度ゲルからバンドを切り出さないとうまく読めなかったので
その手間が‥‥と思ってました。しかし今やってることの方が大変かも（汗）

βアクチンとか大腸菌にとっても仕方ないですし。

全てをコロニーPCRでやれって言ってるんじゃなくって、いくつか大腸菌に回収したら
それと同じプラスミドはコロニーPCRで簡単にハネられるじゃん。で、新しいものだけ
大腸菌に回収する。

Matchmakerのシステム３を使っているんですけど、
X-alpha-galでコロニーの青さってどのくらい意味あるのですか？
あれで結合の強さなどがどれくらい言えるのでしょうか？
コントロール並みに青くならない奴はやっぱりハズレなんですか？
詳しい人教えてください。

baitもしくはpreyのタンパク質の発現が酵母にtoxicでないかぎり
（形質転換体の生育がベクターのそれに比べて遜色がないかぎり）、
結合の強さと青色の濃さは相関してるよ。
コントロールはバリバリのポジティブだから、そこまで青くないポジティブは良くある。

one hybridの話だけど、
通常、ターゲット配列をレポーターに入れて、
cDNAライブラリ+ADを発現させてスクリーニングするよね。
これ、逆とかできるのかな？
つまり、ランダムな配列をレポーターに入れて、
ある転写因子+ADをベイト？にしてスクリーニングとか。

>>673
CHIPアッセイじゃだめなの？

age

>>673 そうやってp53のtargetを取った（と称する）仕事がサンタのところから出てなかったっけ？

すいません、Clontechのpretransformed libraryを買ったのですが、
非常に高価なので増やしてから使いたいのですが、SD-Leu-液体培地で振って
ストックを作ればいいのでしょうか？　Libraryの栄養マーカーはLeuです。
ストックを作るとき、なにか接合効率を上げるために操作を加えるのでしょうか？

SD-Leuで増やせば良いと思うよ。

え、マジで増やして大丈夫なの？>>pretransformed
増やして液体窒素で凍らせればおｋ？

machmakerのlibraryリストからpretransformedのlibraryはなくなっているね。
やっぱり、看板通りうまくいかないのかなあ？
全部Xho I-(dT)15をプライマーにして作っているけど、これはサイズカットしないでそのまま
vectorに入れているのかなあ？たとえばbaitが2.5kbサイズのmRNAでN末のところに結合するとき、
こういうドメインは本当にライブラリーの中に入っているのかなあ？

>>679
増やすことについては、Ｙｅｓ
だけど、10倍程度の増幅に留めておくが吉（それで十分でしょ）

液体窒素で凍らせることについては、Ｎｏ
大腸菌（液体窒素）と培養細胞（ゆっくり凍結）の間のサイズの細胞なので、
ディープフリーザーにチューブごと収めるが吉

beta-gal assayでフィルターに移してから、発色させるのは手間がかかるんだけど
大腸菌のプレートのように予め、アガーに入れておいて発色させるやり方で問題ないのでしょうか？

問題ある

もれ、プレート作るときに,x-gal入れているけど問題なく発色するぞ
Clontechのmanualにもplateに入れるやり方を使っている。

問題ある。細胞質に発現したbeta-galは、そのままではX-galをかけても発色しない。
フィルターアッセイはフィルターの上で溶菌させてbeta-galが外に出るようにしてる。
プレートに入れて染まることもあるけど、それはbeta-galの発現が高いというより、
溶菌しやすいコロニーが染まってることが多い。

plateに入れるのはalpha-gal＞Clontechのmanual

>>685　plateに入れるのはalpha-gal＞Clontechのmanual

スマソ。alpha-galだったわ〜

なんでalpha-galならOKなの？

分泌されるから。
hostによるけどね。

原理も分からんで実験してる奴って結構いるんだね。

>分泌されるから。

分泌じゃなくて、細胞壁を通過して細胞質に入っていくからじゃないの？

>>690
はあ．．．ここにも原理を知らない奴が一人。

baitのサイズに関して質問なのですが、全長が2.8kbもある奴なんですが、全長を
そのまま、vectorに入れてもいいのでしょうか？
それともいくつかに分割して1kbくらいのものをオーバーラップさせていくつか作った方が
いいのでしょうか？

age

>>692
実験の原理を少しは考えやがれ

>>692

既に結合すると報告されたドメインをbait側のベクターに入れてもサイズによってポジティブにでたり
でなかったりする場合はけっこうある。たとえば５００bpの結合領域が入った部位を
いれて発色しても、この部位が入った2.8kbのものを同じベクターに入れても発色しない
ということはよくある話。だからいくつかのものを分割してオーバーラップする形で
baitを作った方が一般的にはうまくいく。
694は単なる馬鹿だから無視しろＷ

>>691
原理なんて知らなくても良い遺伝子が取れれば勝ち

>>696
勝ち負けが好きならもっと向いてる分野があるよ。

Y190使うと、IL-培養で、p15x25枚にまいて軽く10^7は突破するんだけど。
AH109を使うと、その１０分の１も行かない。
株はクローンテックのキットについてきたものを使っています。
どうしてだろうか？形質転換効率がめっちゃ低い。

漏れもAH109にbaitをtransformして、それにライブラリーを入れているんだけど
効率がめちゃ悪い。
メイティングしないと駄目なのかな？

それ、何かがおかしいよ。AH109はむしろ形質転換効率が良いことで知られている。
ＹＰＤじゃなくってアデニンを加えたYPADで培養してる？ baitにtoxicityがあったりしない？

ところで、10^7って、library DNAどのくらい使って？ IL-培養って何？

>>700

すでにbaitが入っているので、　SD　1L培養で、library50-100ugを一回の形質転換で
使っている。この方法では、Y190では問題なく行っているし、baitも同じものを
使っているので毒性の問題ではない。

どのプロトコールに従ってるかわからないけど、
ＳＤで前培養→ＹＰＡＤで本培養（３〜４時間）でぐっと効率上がるよ。
この間の２回程度の分裂でのプラスミドの脱落は無視できる程度。

PEG溶液を新しくすると、おどろくほど改善することがある

50%PEG溶液って毎回作ってリフレッシュした方がいいのでしょうか？
それとも２−３ヶ月は保存可能でしょうか？

濃度が問題だから、しっかり密栓してあれば１年でもＯＫ。
チューブの口にPEGが析出するなどして水蒸気の出入りがあるなら１週間でもダメ。

こんにちは。現在5回膜貫通蛋白質の細胞質ドメインをベイトにtwo-hybridでスクリーニングをしています。
ベイトは3AT50mMでやっとバックグラウンドがおさえられたのですが、
スクリーニングプレートSD-LWH,SD-LWHAには無数のコロニーが生えてきてしまいました。
一応その中から大きいコロニーを700個拾ってきてα−gal活性を見ると、700個全て陽性という結果になりました。
候補を絞るにはgrowthcheckをすると教わったのですが、あまりにも候補が多すぎてこのまま進むべきではないような気がしています。どなたかアドバイスをお願いします。

このまま進むべきでないって判断は、経験的に言って正解です。

スクリーニングの仕方を変えた方がいいです。一番いいのは、ベイトを断片化して、バックグラウンドを生じる領域を
除いたベイトを作成することです。

こんどはじめようと思っております。
宝買収以前からClontechキットを使っている方が多いようですが、
Invitrogenと比べてどうなんでしょうか？
ざっと検討した感じではこんな感じですが、

Invitrogen-　ベクターが低コピーで抑えられる、レポーターが３種類
Clontech-　売っているライブラリーが多い。

の他に違いがあるでしょうか？

迷ってる暇にサッサとやるが吉。ともかく、バックグラウンドの生えない条件で
ポジティブが出るかどうかは、やり始めてから３週間で決着がつく。
それがホンモノかどうかは、もはや酵母の実験のレベルでは分からない。
どっちのtwo-hybridのシステムが良いかなんて、エサのタンパク質に拠るし、
やってみるまで分からない。ともかく、そこは迷うところじゃない。
Clontechだって今やレポーターは３種類あるから、そこもポイントじゃない。

相互作用がわかっている組み合わせでやってみて何も出てこない。
53とTの組み合わせでは出るのでシステム自体は働いている。
シーケンスはチェックしている。-Leu-Tryプレートには生えているので、
Transformationの問題ではないし産物に毒性があると言うわけではなさそう。
フォールディングが上手く行っていないか、核にに移行していないと
いうことでしょうか？

翻訳効率が悪い
分解されやすい
立体障害で結合しない
いずれかの因子が活性化されることが結合に必要
etc.

N末C末を削ったものでもやってみたけど駄目。
他の相互作用する遺伝子をスクリーニングしようと思ったのですが、
撤退ですかね。
原因を究明しても対処できそうにはないし。

スリーハイブリットってなんですか？

>>710
てか、ホントに結合すんの？
誰かの捏造データだったんじゃ？

M2Hで網羅的解析のできる方法ってあるの？調べた限りないんだが．

>>710
酵母のtwo-hybridはシステムが変わると結合したりしなかったりする
酵母研究者の間では結構有名なんだけど。まあ、知らない人はしらなかったりする。
ベクター変えたり酵母を変えたりしただけで結合が見えなかったりするものなんだよ
IPとかとは違うんです

あっ、ちなみにtwo-hybridはがたがた言わずにとりあえずやれって授業で教わったことあるよ

ま、IPも擬陽性バリバリだけどな。

結局結合タンパク取るには何がベストなんだ？

>>718
おれは１０年かけてどんなものでもIPできる境地に達した。
IPはおれにまかせろｗ

酵母2-hybridでベイトコンストラクトがちゃんと発現してるか確認しないで使うのは御法度

イムノブロットとかでベイトコンストラクトがちゃんと予想分子量にシグナルがあるかどうか
調べた方が良い。

そんなことは無い。
ウエスタンで検出できる量よりはるかに少ない発現量で十分。

おれはクロンテックのシステムでmyc（HA？）の抗体でベイトを検出
できたことがない

最初,2hybridのベイトこさえて5mM 3-ATで生えてこなかった。念のためWBやったら切断されてて
DNA結合ドメインとベイトが分離していた。

リンカーを詰めて再度、ベイトをこさえたらDNA結合ドメインとベイトの合計分子量にバッチしシグナルが出た。
だがしかし、80mM 3-ATでも生えてきたよ、、、、、orz

lysate調整の時に切れたんじゃないの？＞WBやったら切断されてて

>>716
ありがとうございます。
とりあえず、Y187はあるのでそれでやってみるかな。
ベクターを変えるというのはGAL4のシステムからLexAに変えるということでしょうか？
それともGAL4で別のにするのでも意味があるのでしょうか？

>>721
ベクター変えるぐらいしか思いつきませんが、発現していない場合、
どういう対処法があるのでしょうか？

stratageneのcytotrapはいかがでしょうか。
核内と核外で普通に考えたらまったく異なる結果がでるはずですが。
経験者意見をお願いします。
当方細胞骨格系の遺伝子のy2hを考えています。
結局キットはclontechがいいんですか？

迷うよりやった方が早い。
何度も言わせるな。

俺は727ではないが。
やった方が早いとは言うけど、キット何十万もするからなあ
俺はmatch makerでいろいろとってきた経験があるからあれだが、
改良されたmatch makerは核内移行シグナルがついてるから、
cytotrapと同じ効果が得られるんじゃね？
それとも細胞質と核内じゃ結合環境が違うということか？

この人はどうしてそんなことが言い切れるのだろうか？＞核内と核外で普通に考えたらまったく異なる結果がでるはずですが。

全くということはないだろw
結局ADとBDに核内移行シグナルが付加されてるから普段核内にない分子が核に
入ってきて結合する．
だからいままで核には存在しない因子も取れてきている．
ただ微妙な塩濃度等？が影響している場合は取れない．

おまえらウダウダ言ってる暇があったら、
実際の細胞にタグ付き発現させてマス解析しろよ。

お前計画をしっかり立ててから実験しろ．
無駄な実験で人生無駄にしたいんですか？

二つのキットを比べたやつなんているか？
あれ１キットだけで50万だろ．

マッチメーカーよいよ．
クローンテックはライブラリーの質がすばらしいのでは？
SMART方は本当にすごい

クロンテックのカスタマーサービスのひどさはガチ

今の時代
免疫沈降やってでてきたバンドを切り出して
あるいはまとめたままの状態で、
LC-MS/MSするのがベストじゃね？
two hybridのメリットって何よ？

やればやっただけ時間が経つからピペット土方の暇つぶしになるよ

極微量しか発現しない因子も取れてくる可能性があると思うがどうよ？
素人ちゃんなんで、
大きなことは言えないが。

３週間（実労５日）で候補が取れること。

LCMSやるのにどれくらい金かかると思ってるんだ？
一つ一つバンド切り出してたら結合タンパクが多い場合
大変じゃないか？

ハビチュエーション因子の研究で清水先輩がLC-MSで検出したABC輸送体断片はなんだったんですか？

バカだなぁ。
どうせTHでものが取れたら細胞で免沈とかやって確認するんだろ、
だったら最初から免沈してマスの方が早いじゃねーか。

それに今時THで新規遺伝子取れて相互作用ドメイン決めましたとか言っても、
JBCが関の山だろ。

マスで取ったって改めて免沈のデータは要求されるだろが。
てか、グズグズ言ってるより論文出せよ、な。

マスが行ってりゃIPでウェスタンのバンドが出ないなんてことは無いだろ、１週間で出来る。
でもTHからだと、IPの実験系から組まなきゃ行けないじゃん。

てか、グズグズ言ってるより論文出せよ、な。

IPってそんなに大変か？

サイトトラップはホストの株をちょっといじらないとバックが酷いらしいよ。
>>747
モノによるよ。シングルIPなんかはあんまり信用されない時代だけどな。
最近はTAPtagという便利なのがあるから酵母屋さんは楽になったね。

てか質量分析やるにしてもバンドがたくさんある場合はどうするのよ？
あれってまとめてMSできるんだっけ？
マスコットサーチじゃ限界あるだろ？

俺プロテオミクスはあまりしらんが，LCMSMSってLCで分画を取るからなん種類タンパク質が混合さろていようが一回で解析できるんじゃね？

いまの流行はMudPITでしょ？

どっちでもいいから、論文出せよ、な。

>>752
revise中です＞＜b

mudpitって受託やっているところあるか？
受託どころか、日本で持っている研究室ほとんどないだろ？
日本だと現実的じゃないよ。

>>754
日本の事情はよくしらんけど理研でやってる人は何人かいるはずだよ。
アメリカでは普通にやってるねぇ。別に珍しくもなんともないよ。先週も
サンプル作ってfacilityに持ってった。

費用はいくらくらい？
うちは金持ちラボだが、
5サンプル出したら300万は軽く超えるだろ。
なかなか手を出しずらいよ。

1サンプル350ドルだったと思う。
まぁ安くはないけどね。

そんな安くないだろ。
俺のいるところは、
一回最低数十万はするぞ。
一時間あたり1万みたいな。

>>758
さぁ、どうなんだろうね。学内利用者と学外利用者で全然値段が違うらしいし
正直適正価格がどの辺りなのか、門外漢だから知らないなぁ。
けどルーチンでやってるから1サンプル数十万円ってのは有り得ないと思うよ。

》758

学外と学内では二割くらいしか違わないが、
大学によって格差があるんだよ。
探せば758の言うようなところ何箇所かあるよ。
高いところは設備が最新なのかもしれんが。

免沈して取れてくるタンパク質の同定なんて、
mudpit使わなくても、
nano-LC-MS/MSで十分じゃね？
mudpitは数十以上ある場合に使えばいいんじゃん？
nano-〜だと何種類までオッケーなんだろうか？

全種類

誰だよage嵐してるの。

良スレage

今追い込まれながらtwo-hybridしてる…
でない…

2ハブリッドは二ヶ所のラボでやった、どっちもジャンク遺伝子しか釣れなかった
失った時間＞PRICELESS

>>765
捏っちゃえよ