タンパク質の精製

1 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/18(日) 11:42

厨房なんすけど、タンパク質の精製って大変ですよね？
寝れないですし。
Ｘ線のサンプル取りなんか、純度要求されまくりでやだなー。
みなさんどーすか？

2 ：サイキョー：2001/02/18(日) 15:23

ドキュソな友人がこともあろうに
「え？酵素精製で博士論文書いたの？タンパク精製って簡単だよね～？」
といいやがったので、一瞬殺意を覚えたことがあります。

3 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/18(日) 16:25

今、苦しんでます。
まさに、X線のサンプルです。
発現量少ない、大腸菌だと可溶化しない、活性バックと分離できないと、三重苦で死にそうです。
でも、寝れないことはないよ。
そこまでタンパクにつきあってらんないから、発現検討以外は、機械にお願い。

4 ：サイキョー：2001/02/18(日) 16:33

大腸菌株をタンパク質生産量が高くて、内在性プロテアーゼ活性が低くいBL21DE3を使って
pETヴェクターで発現させたら、あかんの？
この株はＴ７RNAポリメラーゼをlac制御で発現させて、リゾチームを構成的に共発現させているから、
培養時のリーキーな発現は抑えられるし、凍結融解でリゾチームの働きで細胞の破壊が容易。

使用コドンの偏りによる低発現なら、外来tRNAを導入した株もある。
インクルージョンボデイーを変性系のカラムクロマトグラフィーで精製して、そのあと
基質を含む緩衝液中で透析するとか、ATP-Mg存在下でgroE,groLで巻き戻させるとか、、、＞1

5 ：悩める生化学者：2001/02/18(日) 17:11

メーカーのカタログ鵜呑みにする奴はドキュソ

逝ってよしっ！！

6 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/18(日) 19:13

＞３　仲間がいる～と思ってうれしくなってしまった。
X線サンプル、私もいい所まで行ってるんだけど、これでもかというくらいハードルがでてくる。
構造とけるのを夢見て、がんばってるけど。蛋白って、何個か精製したことある人ならわかると
思うけど、そんなマニュアル通り行かないよね。でも、困らせるやつでも、長くつきあってると
愛情がわく。そんな私はマゾ？

7 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 04:04

Dakara Tanpaku Ha Omosiroi
GANBAREYO.

8 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 10:51

大丈夫だよ
苦労は報われないかも知れないけど、失敗を積み重ねた
ひとはよい研究者になれるよ。

9 ：3：2001/02/19(月) 12:51

ああ、苦しんでるのは、私だけじゃなかった（笑）。
皆さん、ありがとうございます。

>>4
pET-BL21(DE3)系でやってます。
pET系も、はまる奴ははまるけど、出ないのはとことん発現しないです。
特に、アフィニティータグとかつけてると、出にくいようですね。
シャペロンもトライしてますが、ダメなようです。
refoldしようとしてますが、元の発現量が少ないので、うまくいくかどうか・・・。

たしかに、タンパクってマニュアル通りにはいかないですよね。
ゲノム・プロジェクト以降、タンパクの時代だと信じて、研究を続けます。

10 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 13:57

タグつけると発現は増えるけど、一般に沈む・・・。
でも俺のタンパクはタグつけて発現減って、浮くようになった。
ペット系は、漏れないって書いてあるけど、induction かけなくてももれまくりが結構ある。

昔、某研究室がプロジェクトで読んだゲノムのORF をpET で全部発現させようとしていたけど、１０個やって４個くらいは変な挙動（induction 前に発現するとか）を示したようだ。

結晶は、俺の友達のはpUC18だと結晶化しないのに、pET11 だと結晶化するという変な場合もあるからベクターも変えてみる価値も有り。
ちなみにＮ末シークエンス読んで、同一タンパクであることを確認していますし精製タンパクなので原因不明です。

リフォールディングは、グリセロール濃度を上げるとうまくいくこともあるよ。
濃度４０で失敗した人が６０で成功した・・・ってほとんどどろどろの溶液じゃん？！って話を聞いたこともある。

11 ：サイキョー：2001/02/19(月) 14:03

知人はマルトース結合タンパク質融合タンパク質で目的のタンパク質を
可溶性画分に回収したけど、切ったとたんに不溶性になって泣いていた。

たしかに、ベクターやタグをいろいろ換えるのはいろいろ試してみないとだめみたいね。

12 ：非通知さん：2001/02/19(月) 14:07

プラスミドってなぁーに？？
教えてください。

13 ：酵素屋：2001/02/19(月) 14:22

蛋白（酵素）の精製を馬鹿にしてるヤツ以外と多いんだよね。
自分でできもしないくせにね。生化学の基本だよね。

核酸を対象にした実験系は実験書読めば
何の遺伝子であろうが大抵うまく逝くんだよね。
それにいまはいろんなキットがあるからね。

その点、蛋白は一般法が少ないから大変だけど、
うまくいったときの充実感も大きいよ。

便利なキットが利用できるような実験系を組んで
研究を有利に進める事も大事な能力だけど、
いざというときに蛋白の精製ができる能力も大事
だよ。

試行錯誤すると思うけどがんばれ。

14 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 15:23

だれかバキュロしてるひといない？

15 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 15:27

最近構造生物関係者で○トースバインディング使ってる
人いますか？

一時期、マルトースをつかっているひとが軒並みうまく
行かないので、Ｘ線業界ではほとんど使っている人が
絶えたってききましたけど。
せっかくとけても、切れないか、きったとたんに不溶性になる
のです。

16 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 15:48

＞１５
近くにいるけど、あまりうまくいってない様子。
私はGSTがすき。

17 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 16:01

＞１３
激しく同意です。
いいこと言いますね！

18 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 16:51

私もＧＳＴが好き
でもＧＳＴは経験的に５０％はインクルージョンボディになる

19 ：3：2001/02/19(月) 16:59

うう、みんな苦労してらっしゃるんですね。
私も頑張ります。

>>14
バキュロもやってますよー。手軽でいいですね。
ただ個人的には、中途半端だなあ、と言う印象を持っています。
何でもいいから量を取るなら大腸菌か酵母、Native formにこだわるなら、動物細胞でこつこつ取った方がいいのでは？と思っています。
>>18
His-tagやFLAGなんか、十中八九不溶化しますよ。（苦笑）
refoldは、巻戻ってるかどうかの確認が簡単にできないとやっかいですね。
可能なら、活性とか見るのが一番なんですが。

20 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 17:15

１８です
可溶化させるパワーが私の経験で一番強いのは
thioredoxinです
でも、市販のエンテロキナーゼ切断のコンストラクトは
エンテロがだめだめなことが多いです

21 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 22:38

発現や精製が上手く行かないときはアミノ酸を置換したほうが結局早道だったり
するのではないでしょうか？　もちろん研究の方針によるでしょうし，活性を測る系
がないとダメですけど・・・
結晶化の場合特にフォールディングが重要と考えられるので，発現効率を一定に
するような培養をお勧め致します．不溶化対策には低温培養などどうでしょう？
もうやってるとは思いますけどね．

22 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 22:57

結晶化の場合、refoldingは避けましょう。
イソグルタミン結合とかproline異性化とか
Gln/Asnのデアミとかドツボにはまります。

23 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 23:31

>>22
分子置換ができるタンパクならあまり問題ない。
>>21
低温培養よりもTerffic でゆーーーーーっくりと発現させた方がうまく行くことが多かった。
ただ、発現しなくなることも多かった。
不溶化したら低温試して、Terffic やってマルトースバインドやって、ってパターンかな。そこまで粘ったことないけど。
His-tag つけると発現は良くなるから活性測定系ができあがってるタンパクならrefolding が好き。

24 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/19(月) 23:35

真核生物の遺伝子を大腸菌とかで無理矢理発現させるから難しくなるんで
ピチア酵母とか使うのは大丈夫なの？
ヒーラ細胞とかCOSで大量に発現させてコンベンショナルナ方法で精製するのでもいいような気がしますが。

25 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 00:02

>21
素人の質問なんだけど、アミノ酸の置換ってどういう基準で置換する
アミノ酸を決めてるの？
論文とか読んでていつも不思議に思う。

26 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 01:43

タイトル見て期待しながらこのスレ読み始めたんだが、「蛋白質の精製」っつったって、
どいつもこいつもリコンビナント蛋白質の精製ばっかりやないけｺﾞﾙｧ!!
過剰発現系なら精製できて当たり前やこのガキどもがっ！（なんつったりして。）

つか、現在、ごく少量だけ発現している内在性蛋白質複合体（活性だけわかっていて
遺伝子は不明）を某ほ乳動物の体組織から精製中・・・何が不満でオメーはそんなに発現量が
少ないんやー。精製している途中で無くなってしまうー。エドマン分解もできやしねぇ。

立体構造なんてぜーたくは言わねぇから、俺にだけそっと君の一次構造を
教えてくれー。いやマジで。Ｎ末だけでいいから。そしたら後は遺伝子クローニング
して過剰発現させて楽勝楽勝。

27 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 03:21

今度、うちの研究室の先輩がポスドクでプリオンやってる研究室にいくなぁ～～～～～。
精製きつそ。

28 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 03:25

>>26
君の場合は精製するだけで論文になりうるから精製に命かけられるが、そうでない場合はいっくら精製に手間取っても意味ないからな。
過剰発現系なら確かに精製できて当たり前なんだが、それはそれで苦労する。

あと発現しなくて困っている方々。
ORF の最初の20bp くらいをホストのcodon usage に合わせてやるとアホみたいに発現することもあるよ。
スタートが重要らしい。

29 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 04:51

蛋白精製についてのおすすめの参考書とかってありますか？
よろしかったら、紹介してください。

30 ：生化学師団蛋白精製大隊最先任軍曹：2001/02/20(火) 06:34

＞２９

あらゆるプロトコルがキット化され、女子中学生がPCRでもサザンでも
シークエンスでもできるようになってしまった現代の分子生物学。
俺たちが青春を捧げた研究も、いずれコギャルがケータイ片手に
ブラウズできるようになってしまうのか？

だが心配はいらない。唯一マニュアル化できない漢（おとこ）の戦場が、
蛋白質精製という無法地帯に残されている。敵（蛋白質）が変われば
武器（精製法）も変わる、過去の知識などあてにはならない、やってみなけりゃ
わからない、先にタマ取ったもん勝ち、情け無用のキリングフィールドにようこそ。

それでは新米兵士の君に、生き残るための教練書を哨戒、違った、紹介しよう。
「Protein Analysis and Purification」　Ian M. Rosenberg, Birkhauser
「Guide to Protein Purification」 Murray P. Deutscher, Academic Press
「Protein Purification Methods」 E.L.V. Harris and S. Angel, IRL Press
「蛋白質・酵素の基礎実験法」　堀尾武一、南江堂　＜ちょっと時代遅れだけど。
あと、Amersham Pharmaciaが出しているクロマト関係の小冊子には全て
目を通しておけ。

31 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 06:42

＞３０

おおっ、素晴らしいッス！
ありがとうございます。

32 ：酵素屋：2001/02/20(火) 07:44

>30
「蛋白質・酵素の基礎実験法」　堀尾武一、南江堂
この本はいいよ。日本語だし。私はバイブルと呼んでいる。
初版はかなり前のモノだけど、
最近（といっても２、３年前）新版がでてたよね。

33 ：サイキョー：2001/02/20(火) 11:35

酵素精製の実際例をやたら書いてあったファルマシアニュースのバックナンバーとか穴の空くほど読んだなぁ、、、、、

34 ：ＨＤＤ理論：2001/02/20(火) 13:03

あとね。
英語の本ですけどAcademic Press社、N.C. Price編集
Protein LAB-FAX ISBN 0-12-564710-7
はコンパクトだけどいろんなことが書いてあってお薦めだよ。
＞３０
漢と書いておとこと読む、その心意気に乾杯

35 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 13:17

>26
二次元で展開して切り出したものをＭＳにかければいいんじゃないの？
でデータベースからサーチ．あるいはＭＳ・ＭＳでシークエンス解析をする・・・
微量タンパク質について今よくやられている方法だと思いますが．
>25
理屈はよくわかりません．まあCysをAlaなんてのは考えれば納得
できますが．あとはランダムに変異をかけて活性のある奴をえらん
でるのかもしれません．
>24
まったくもってそうなんですが，糖鎖があるとまたややこしくなりますね．
活性あって量をかせぎたいだけなら問題ないですけど．

36 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 15:50

精製開始して３日目で力尽きました･･･。

37 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 18:27

＞３６　もしやうちの研究室の人間じゃ・・・

38 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 21:19

>>35
26の追っかけてるものは、複合体(これ重要)で、
活性でしか追えないんだから二次元展開しても同定できん。
良く読め!というかタンパクは素人だな?

39 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 21:33

複合体は役者がそろうまではすごく難しいよね。
そろっても難しいけど。
ストイキオメトリを決めろなんて意地悪なコメント
もらうとへこむよね。
しかも、複合体のコンポーネントの一部が膜蛋白
だったりするとドツボだよね。
討つ山車脳。

40 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/20(火) 22:07

膜は鬼門だ

41 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/21(水) 04:05

>40
まったくですねえ。

42 ：獣医大隊分子生物小隊バキュロ分隊伍長：2001/02/21(水) 19:09

>>30
軍曹殿！只今より精製前のフィルター濃縮と
精製物の糖鎖の有無を調べるであります！！

突撃ぃー

43 ：４２じゃないよ：2001/02/21(水) 19:15

分隊長殿、・・・たった今、敗戦が決定いたしました。
ああ、バキュロで出したタンパクの、His-tagが使い物にならなかった。
うがああ、もう一度コンストラクションの見直しだああ。

44 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/21(水) 19:24

がんばれ～！！
キレイなもん取れたら、結晶化してあげるからねん♪

45 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/21(水) 20:02

お話に混ざれないほどの素人なんですが(恥)
生体試料から膜タンパクを精製するのに死ぬほど悩まされてます。
．．．ここに書いてあった参考書、いまから注文してきます。
ありがとうございました！！

46 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/21(水) 20:10

＞サイキョ－さん

厨房の僕に、レスありがとうございます。返事遅くなってすみません。
僕が使ってるホストは BL21(DE3)CodonPlus RIL で codonusage を合せて
あります。ベクターは pET24aで蛋白にGSTタグを付けて発現しています。
一応リッター当たり 10 mgは取れるんで問題にはしてないんですが。

そして、この後にGSHゲルでアフィニティー精製してタグ切って･･･という具合に精製
しているんですが、その後にカラム操作が３回あって時間が結構かかるのが悩み？です。
僕の手際が悪いせいなのか、よく２～３日はぶっ続けで精製してます。
これだけ時間かかるのってめずらしいですか？
ちなみに途中で止めるようなことはしてませんです。
やれやれ。

47 ：46：2001/02/21(水) 20:17

>一応リッター当たり 10 mgは取れるんで問題にはしてないんですが。

発現量が高いんで可溶化が悪いことはあまり問題にしてないんです。

48 ：獣医大隊分子生物小隊バキュロ分隊伍長：2001/02/21(水) 20:42

ぴーがらがら（無線機の音
43！43！！
獣医大隊第二バキュロ分隊で分泌タンパクでシグナルつけたままN末にタグつけ
ていたことで、分隊が危機的状況にあると報告アリ！

2等兵の学生諸君は全員戦死の模様。

そちらの作戦の詳細報告を求む！

ニッケルがキレートされていないか再度確認を要請。
無血清培地は特に危険！！

49 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/22(木) 15:10

厨房の僕もようやく、精製の最後のバッファー交換＆濃縮に入りました。
長かったです。
ここまで来るのに５日もかかっちゃっいました。

ところで、ヒドロキシアパタイトってNaClの影響を受けるんですかね？
扱ってる蛋白の等電点は5.5くらいでバッファーのpHは8.0。
サンプルインジェクトのときに入ってた塩濃度は100 mM。
これがすっぽ抜けてしまった。酸性蛋白なのに。
塩を抜いたらちゃんとくっついて問題なくクロマトにかけられました。
でも、前回と溶出位置が違う。
前はリン酸100 mMあたりで溶出されたのに、今回は
なんでだろー？？
分かんない事だらけだ。
これで、ほとんどまる１日ロスしました。

教訓: 手を抜かずにAmicon しておけば良かったです。
とほほ。

50 ：酵素屋：2001/02/22(木) 15:23

ハイアパの原理って実際のところ
あんまりわかってないんじゃない？
イオン交換的な作用もあるとは思うけど。
私が知らないだけ？

精製で「もう手詰まりか？」って時に試してみると
結構うまくいったりする秘密兵器。

51 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/22(木) 15:43

参考書頼もうとしたら、洋書は２ヶ月くらいかかるといわれた･･･。
そんなに待て内臓。

52 ：43：2001/02/22(木) 16:31

（ぴー、がががが）
４３上等兵であります！
分隊長殿に報告いたします！
当方面で戦っているタンパクは、Ｃ末端側にtagが付いているので、スプライシングの影響は考えなくていいです！
分隊長殿のご推察通り、無血清培地を使用しております！
一応、カラムにくっつくことはくっついております！
が、しかし、どうもきれいに分離せず、大々的に希釈をしてるんぢゃないか？というような有様です（涙）。
おまけに、カラムを通すと比活性が落ちるていたらくです・・・。
とりあえず、一度タンパクを変性させてからカラム通して、果たしてこのタンパクにHis-tagを使うのが適当なのかどうか確認しようとしております！
場合によっては一旦戦略的撤退を行い、別のタグなどの新たな戦力を投入する必要もあるかと考えているところであります。
あっ、教授の哨戒がっ・・・・ぴぴーぷつっっ

53 ：獣医大隊分子生物小隊バキュロ分隊伍長：2001/02/22(木) 17:31

(ぴーぴーががががっ）
43！43！！
こちら獣医大隊分子生物小隊第一バキュロ分隊分隊長（伍長）！
当分隊、分泌タンパクネイティブ作戦経験豊富につきジェネラルサポー
ト（後方砲撃支援）が可能！！

目標タンパク質が落ちないぎりぎりのイミダゾールを数十回射出！
その後高濃度のイミダゾールで一気に溶出！！

ところで、そちらの所属大隊は、獣医大隊か？

54 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/22(木) 22:36

精製どころか、培養細胞がコンタミしてエラいことに・・・。
鬱だ・・・。

55 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/22(木) 23:18

DEAEで失活して、あきらめたんですけど。
ギガパイトもだめでした。
吸着されると総活性が１０㌫くらいになります。

56 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/22(木) 23:48

>>55
まかーの人が泣くから「パーセント」は
「％」か全角カナ「パーセント」で書くのがよいと思います。

57 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/23(金) 00:19

>27
プリオンは正常型の精製は結構面倒くさいけど、異常プリオンに関しては
partialでよければはっきり言って簡単です。
基本的にprotease抵抗性だし、ちょっとやそっとで変性しないので。

58 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/23(金) 00:21

う～･･･
うちのラボでは精製屋さんがソルジャー扱いされてるように思えてならい。
蛋白取れて当たり前の風潮が過ぎるんじゃねえか？
末端の解析屋がのさばり過ぎだぜ。
俺だって解析したいのになんでやらせてくれないんだ？？？
あーむかつく。
同じ授業料払ってるのに！

59 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/23(金) 00:41

失敗は成功のマザーですよ。

60 ：43：2001/02/23(金) 09:00

（ぴー、ががががぷぴー）
４３上等兵であります！
分隊長殿に再度報告いたします！
Niカラム吸着後、0.1～0.2Mイミダゾールでwashしております！
しかし、低濃度のイミダゾールでも、じわじわだらだら他のタンパクと一緒に溶出してきて、実にキレの悪い分離になっております（涙涙）。
また、カラムを通した際の、活性の低下の原因がつかめておりません・・・。
His-tagがだめなら、潔くconventionalな精製でこつこつ攻撃を加える作戦で行く覚悟を決めつつあります！

ちなみに、自分は農学大隊から、現在公立研究所小隊に所属しております！
獣医大隊とは共同戦線を張った経験が有ります！

61 ：バキュロ分隊長：2001/02/23(金) 11:22

（ぴーぴーがーががー）
43！43！！
0mMと10mM（～50mM）でウオッシュはどうか？
我が分隊での過去の戦闘では100mMから溶出だらだら出つづけるそちらの
敵と同様なタンパク質と遭遇経験アリ。その際、0mMと10mMで断続的に攻
撃を加えた後10mMで洗浄後、1000mMで一気に溶出で濃縮成功。
それでもだめなら、Wash液のpHを6.2ぐらいにあげるよう助言。
0.1Mのwashでは危険危険！！

ニッケルカラムは一旦系ができると、作戦活動が容易、戦費もすくなくて
済むので、もうすこし戦線を維持するよう助言。

まったくだめなら、やっぱりパーフュージョンか？
どちらにせよ、昆虫細胞の培地が酸性で、酸性条件で可溶している
ものが、アルカリ性にして析出する可能性もあり、グルタチオン
等のゲリラ兵との戦いに骨が折れるが、そのぶん完成すると笑いが
とまらないほどの戦果が期待できる。

62 ：化学屋：2001/02/23(金) 16:30

皆さんがむばってちょ。
貴方達のおかげで我々モデル錯体屋は飯くってます。

63 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/23(金) 16:33

ATP合成酵素の高分解結晶構造キボンヌ。

64 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/23(金) 18:29

Cobalt column
(TALON)

65 ：名無し酵素の基質さん：2001/02/23(金) 21:22

植物生体内の微量酵素を追って荒野をさまよっています。
5ｋｇつぶして20U位しかない酵素。
最後の３つのバンドが別れてくれない・・・・
一本になったらカメラに収めて即論文なのに。
はまってます・・・

66 ：サイキョー：2001/02/23(金) 22:37

私は２００リットルスケールで大量培養して、最終的に３００マイクログラムの新規酵素を単一に精製してアミノ酸配列を決めて、
抗体を作ったり、自作のライブラリーでcDNAをクローニングしてキャラクタライズしたことがある。

未知の酵素精製を一から自分でやるなんて、２０代でないと出来ない気がする。

67 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/23(金) 23:08

Ｇタンパクやってる人いますか？

68 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/23(金) 23:17

ある女性研究者が一度に４００匹のマウスの腹を割いて材料集めをして最後に5μｇのGTP結合タンパク質を精製した、という話を聞いたことがあります。

69 ：バキュロ分隊長：2001/02/24(土) 11:51

>>64
どうなの？いいの？
普通にNiでやるのと。
昆虫細胞培養上清濃縮物でもつかえます？？

70 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/24(土) 13:35

お金のある研究室がうらやましい。

71 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/24(土) 14:32

>>69

TALON は以前、一度だけ試したことあるけど、収量が少なくて全然駄目だった。
条件が悪かったのかな？うまくいった人いますか？
うちでは、その後はNiを使っているけど。

72 ：43：2001/02/24(土) 15:02

>>69
分隊長殿へ進言。
Niでやって余りうまく行かなかった奴については、成功した例があります。
Niでうまく行くぶんについては、Niのほうがいいような感じです。

73 ：バキュロ分隊長：2001/02/24(土) 17:45

うーん。分泌で（シグナル保持したい）うしろにタグつけたいから、ベクターとか
出なく、むりやりタグつけてるからなぁ（強引。
抗His抗体反応しねーし（謎）。そういえば、昔この板で東大サイキョウ氏に
HisTagについて聞いたことがあったなぁ。その節はありがとうございます。

ところで、HisTagでおもいだしたけど、Z-Maxってどうなったの？うってねぇじ
ゃん。超微量タンパクを免疫するときよく使ったんだけど・・・。

>>72
うむ。了解！！感謝する。ところで、バキュロはひとに言えないコツが多くあるが、
お互いがんばろうではないか。

私はいまから、今日二回目のセルカウントである。増えすぎるので、一日2回
はカウントしている。かといって減らしすぎるとへたる。培地はくそ高いから
毎日大量に接種して使わないと、もったいなすぎる。
なにげに、かなり独特な世界なような気がする。ばきゅろ・・・。

74 ：名無し酵素の基質さん：2001/02/24(土) 19:35

＞サイキョーさん

師匠と呼ばせてください。

75 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/25(日) 00:41

age

76 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/25(日) 02:35

>>67
うちのけんきゅうしつでやってますよ。
ぼくじゃないけど。

77 ：67：2001/02/25(日) 11:09

>>76
低分子？三量体？
実は同じ研究室の人って落ちはないよね･･･。

78 ：no name：2001/02/25(日) 11:13

おれも動物組織から酵素精製してる。
終わりが見えない。あーいつになったら........言うまい。あ、それとHAカラムで成功したひと、成功例教えて下さい。お願いします。

79 ：泥沼歩兵部隊第３小隊：2001/02/25(日) 11:55

ガガガーピピピ
こちら泥沼戦での生還経験豊富な第２２特殊歩兵部
隊第３小隊！
バキュロ分隊長殿に７１、７２のコメントに関して
補足情報あり、報告しますっ

TALONはNiに較べてspecificityが高いので、
細胞由来きょうざつ物がひっかかってこない
のでワンステップできれいになるし、洗いも
タイトで行ける。NiとちがってCoは洗っても
外れてこない（そのかわり自分でチャージす
るのもできないので割高）
Niで収量が多く確保できる蛋白質には必要なし。

なおNiカラムも何種類か試すといいよ。
Qiagen純正品、アマシャムファルマシアのキレートHiTrap、
SIGMAのカタログにのっているやつ、マグネットビーズの
やつ。
薄い濃度のHisでwashするときも、回数よりもwash bufferに
付けておく時間を長くして工夫するほうがよい。
以上報告終わり

80 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/25(日) 12:03

>>79
Chelating SuperoseにCoをくっ付けて
TALONの代わりに使えないかな？
TALON買うお金がなくってさ。

81 ：泥沼歩兵部隊第３小隊：2001/02/25(日) 12:07

Chelating Superoseではコバルトの保持力が
弱いので、TALONの良さの「がんがん洗える」が
スポイルされる恐れがあります

82 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/25(日) 12:09

>81
なるほど！
素早いレスありがとう。

83 ：バキュロ分隊長：2001/02/25(日) 15:07

ぴーぴーがががが
 >>79
第２２特殊歩兵部隊第３小隊
79!79!!
報告了解。

TALONは日本語マニュアルが好感度大（pdfで確認）
ちなみにカラムの再生は可能
以下マニュアルより抜粋

「ベッド体積の10 倍の0.2M EDTA （pH7.0 ）で洗浄して、樹脂からコバルトイオンを除去します。
ベッド体積の10 倍の超純水で、過剰なEDTA を洗浄します。樹脂を50mM CoCl2 溶液（ベッド
体積の10 倍）で帯電させます。ベッド体積の10 倍のMilli Q H2 O で、過剰なコバルトイオンを
洗浄します。Extraction/Wash Buffer （ベッド体積の10 倍）で樹脂を平衡化します」

私はこれからバイオアッセイの発色作戦とウイルス接種作戦にはいる。

ぴーがががが

84 ：サイトスケルトン小隊ネイティブ精製チーム：2001/02/25(日) 16:55

私は、植物細胞からある既知タンパクAを含む複合体を精製し、その中に既知タンパクB及びCが含まれることを
証明しようとしています。ちょっと事情があって免沈は不可です。
この複合体は細胞中の含量が少ないことが分かっており、また
かなり弱いと言うか容易にdissociateする可能性が他の実験から示唆されています。なるべく穏やかに
細胞を壊したいのですが、こういう場合にソニケーションはマズイんでしょうか？
他の実験ではソニックでやってます。
ちなみにこの細胞はちょっと特殊なので市販の細胞壁を溶かす酵素は効かないみたいです。
細胞の壊し方（バッファ条件など）についてご意見をお願いします。

85 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/25(日) 22:04

age

86 ：＞84：2001/02/25(日) 23:50

植物細胞骨格の研究者ってウサギ骨格筋から精製されたアクチンを使うことが多いけど、
自分の植物材料の奴を精製して使わないの？

87 ：生化学無知：2001/02/26(月) 06:50

>>84
液体窒素は駄目なの？

88 ：サイトスケルトン小隊ネイティブ精製チーム：2001/02/26(月) 16:33

>>86
良く知りませんが、ウサギ骨格筋アクチンはアクチンカイネティクスの「スタンダード」だからでは？
ウサギ以外の哺乳類などのアクチン結合タンパクの実験で用いたりしますし。
すみません実は厨房ですね俺・・・・

>>87
凍結融解で破砕ですか？多分細胞に割れ目は入るでしょうが結局分厚い細胞壁を取り除く
必要があります。細胞壁はちょっとやそっとでは壊れなさそうです。
でもこんど試してみます。液体窒素処理後の細胞ならソニックで少しは
壊れやすいかも。タンパクが変性しなけりゃグッドかも。
とりあえずどーも！

89 ：＞88：2001/02/26(月) 17:02

プロフィリンとかコフィリンかいな？＞アクチン結合タンパク質

ナムハイチュアの後追い？

90 ：サイトスケルトン小隊ネイティブ精製チーム：2001/02/26(月) 19:48

???>>89
細胞骨格タンパクは結構たくさんありますよ。アクチンだなんて一言も言ってないのに・・・・・。
良く知らないんですけど、そのナムハイチュアって人は何をしたんですか？厨房な質問でスミマセン。
よければ名前のスペルかref.をお願いします。
今回私が研究対象にしているタンパクは内部以外の人は知らない。自分のラボの本流でもないし。

91 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/26(月) 20:53

Nam Hi-Chua@Rockefeller Univ.＞ナムハイチュア

チューブリンαβγ、キネシン、ダイニン、サイトケラチン、セプチン、ミオシン、EF1α
このへんのどれか？

92 ：サイトスケルトン小隊ネイティブ精製チーム：2001/02/26(月) 22:17

ボッシュートです

93 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/26(月) 22:28

？？？？

94 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/27(火) 10:22

>>93
ヒトシ君人形＠世界不思議発見だろ、おそらく

なにげにこのスレ面白いぞ、頑張れ、戦士達。

95 ：バキュロ分隊長：2001/02/27(火) 12:05

ぴーがががが
サイトスケルトン小隊ネイティブ精製チームへ
当方大量発現屋につき微量生体試料の精製については
援護できない。

健闘を祈る。

（本日の当分隊の危険作戦：DW2、RNAceFree化作戦。発ガン注意！）

96 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/27(火) 16:00

ただ今から精製開始いたします。
終了予定時刻は 29日の18:00です。

97 ：バキュロ分隊長：2001/02/27(火) 16:13

ぴーがががが（無線機の音）
バキュロ分隊より
突撃作戦を敢行する96へ連絡！！

残念ながら、・・・・・・
今年は・・・
29日が
・・・
存在する可能性は
・・
・
ない・・・。

無駄死にするなよ・・・戦友。

98 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/27(火) 16:54

えー、ちなみに96は native formです。

99 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/28(水) 03:26

age

100 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/02/28(水) 18:06

人の脳みそからGq精製したいよ

101 ：高井義美：2001/02/28(水) 18:14

＞100

神戸牛からにしとけ

102 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/01(木) 03:42

＞100

してもいいけど自分からにしとけ

103 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/01(木) 03:51

牛よりGq少なかったらショックですね。
･･･でも実際のところどうなんだろう？

104 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/03(土) 20:49

サルの脳味噌って、いまは中華料理屋には卸していないの？

105 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/07(水) 07:37

106 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/09(金) 00:28

精製できた？

107 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/09(金) 02:22

今やっているサンプル、精製は楽だったけど解析ができね～。
NMRです。

108 ：バキュロ分隊長：2001/03/10(土) 11:23

遠征より帰還した。

サイトスケルトン小隊ネイティブ精製チーム殿

尿素がどうで・・・という話を以前聞いたがどうか？

109 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/10(土) 16:10

タンパク質精製は気合いと根性だ！

110 ：サイトスケルトン小隊ネイティブ精製チーム：2001/03/10(土) 16:49

>>108
バキュロ分隊長殿
尿素をどう使うのでありますか？

111 ：バキュロ分隊長：2001/03/13(火) 09:37

>>110
googleで索敵！！
http://ss.cryo.affrc.go.jp/seika/h09/cryo97033.html
培養した大腸菌の菌体を超音波破砕処理し、融合蛋白質を含む不溶性画分（封入体）を遠心分離で調製した。これを8M尿素で可溶化後、
ゲル濾過することより融合蛋白質を精製した。
との記述を発見！！

これの応用はできないか？？

112 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/17(土) 00:10

age

113 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/22(木) 01:23

agetoku

114 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/22(木) 03:38

>>111
8Ｍ urea 使ったら native とは言えないがいいのか？
つーか助手に聞いとけ。

115 ：43：2001/03/22(木) 13:05

分隊長殿に報告！
これはrefoldの一つの方法であります！
透析の代わりに、ゲル濾過で尿素を除き、変性タンパクからrefoldしているのであります。
比較的refoldしやすいタンパクで用いられる方法であります。
ただし失敗すると、カラムごと自爆するので、事前の敵情分析が欠かせません。

refoldの場合、pH、タンパク濃度、温度、変性剤濃度あたりをメインパラメータとし、
それに添加剤（還元剤や界面活性剤、glycerol、二価金属など）の有る無しと濃度、
巻き戻しにかける時間を検討することになるであります。

116 ：サイトスケルトン小隊ネイティブ精製チーム：2001/03/22(木) 14:13

>>111
バキュロ分隊長殿
女の子に後方撹乱されておりました。事態は悲劇的ながら収拾した模様。

えーゴホゴホ当方複合体相手につき尿素は使用不可の模様
これより別作戦の任務により、当戦場をしばらく離れます。
武運長久ヲ祈ル

117 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/23(金) 00:42

http://202.26.186.229.2ch.net/

118 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/23(金) 22:52

119 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/27(火) 16:06

元同僚がポスドクの３年間、酵素精製に専念していた。ようやく最終標品の２次元電気泳動のスポットを
N末シーケンスしたけど、結局ハズレということになり、いまは別のファンドで給料をもらいちがうプロジェクトを
始めたと聞いた。

せめて部分精製でまとめて論文にしろよ。とにかくガムバレ！（泣

120 ：泥沼歩兵部隊第3小隊：2001/03/27(火) 17:07

泥沼歩兵部隊第３小隊よりバキュロ分隊長殿へ

当小隊はこれより論文reviseのための泥沼戦に突入
活性を失った変異体がただしいfoldを維持しているかどうかを
確認するために、中スケールで重窒素標識を導入、NMR測定
を敢行するための試料調整に入る

平行で流さなければならず、期限も迫っており、年度代わりで
作戦決行スケジュールが極めてタイト
しばらく後方支援不能

121 ：age：2001/03/29(木) 08:10

ほい♪

122 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/03/30(金) 13:10

123 ：名無し酵素の基質さん：2001/04/05(木) 20:29

65です。
うううー。やっと精製終わったよお。
もうカラム見ると吐きそう。

124 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/04/06(金) 10:32

>>123
おつかれえ。
がんばって樹脂洗おうねー。

125 ：サイキョー：2001/04/06(金) 11:27

大昔、タンパク精製に取り憑かれて、寝ていても低温室でカラム操作をしている夢を見ました。

うなされていて「そのフラコレを止めてくれ、、、。活性ピークが出ない、、、」とかうわごとで言っていたらしいです（藁

126 ：123：2001/04/06(金) 13:03

>>124
ラジャーーー！！

>>サイキョー師匠
行き詰まっているときに夢見ました。
カラムをかけた後のタンパクを電気泳動したら無数のバンドが出ているという、、、うなされました。ふー。

127 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/04/07(土) 02:21

＞125,126

その気持ち分かります。

128 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/04/07(土) 04:40

３週間かけて精製していたタンパクが、最後のハイアパですっぽ抜けした。
FT受けは自分が洗浄したものではないポリビンで、コンタミした可能性大。
銀染して確かめないといけないところだけど、
感情が高ぶって実験が手につかない･･･。
マジで今泣いてます。
帰って鮭飲んで寝よう。。。。。。。。。。。

129 ：あぼーん：あぼーん

あぼーん

130 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/04/08(日) 17:02

しきり直し。

pGEXで発現するGSTって、２量体化するの？４量体化するの？

２量体化だと思っていたけど、別の院生は４量体だと主張するし、どっちや？

131 ：：2001/04/08(日) 19:15

2量体化すると言う話はよく聞くが・・・

132 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/04/13(金) 12:29

Hisx6タグタンパク質がアグリやすい理由を教えて下さい

133 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/04/13(金) 21:33

Hisタグってもともと可溶化目的だったっけ？？

134 ：...：2001/04/13(金) 23:59

前のレス全部呼んでないので同じことを聞いているかもしれませんが、
どうやってタンパクを取り出していけばいいんですか？
今日教授からＧタンパクを精製して～といわれ一瞬固まってしまった。

135 ：＞133：2001/04/14(土) 01:39

N本研究室＠KO医学部薬理ですか？

136 ：ご冗談でしょう？名無しさん：2001/04/14(土) 01:56

>>135
医歯薬板で山田スレあげてるの貴方？

137 ：＞136：2001/04/15(日) 17:50

ヤマダカヲルのことですかあ？

138 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/04/17(火) 15:49

age

139 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/04/20(金) 07:34

age

140 ：泥沼歩兵部隊：2001/04/20(金) 18:27

２量体です。
＞１３０，１３１

141 ：あぼーん：あぼーん

あぼーん

142 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/04/27(金) 23:55

age

143 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/01(火) 23:07

age

144 ：：2001/05/08(火) 01:19

age

145 ：泥沼歩兵部隊：2001/05/09(水) 01:01

ごめんなさい、ネタがないっす。

146 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/11(金) 00:05

age

147 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/11(金) 00:06

age

148 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/13(日) 04:44

>>132
そりゃ丸まってるはずの蛋白のはじっこに紐がぶらさがってたら、からまりやすいだろ。
しかも2価イオン(Niとか)が糊の役目しちゃうしね。
だからEDTA入れると微妙にアグリにくくなるよ。
Histag入れる意味なくなるけど(藁

149 ：泥沼歩兵部隊：2001/05/13(日) 11:44

148に補足。
それを防ぐためにも、tagを速やかに切り離すための
プロテアーゼサイトの導入と溶出後のプロテアーゼ
処理を行うとよいこともある。
ただしそうすると、切れにくかったり、電気泳動では
切れたかどうだかわからないという事態があるので
GSTやMBPを使うほうが、後々切り離すなら話はシンプル
なおLifeTecnologiesのpPRO-EXというシリーズの
His-Tagがあるけど、それについてはリンカーが結構長く、
しかもその性質が悪くて、リンカー由来でアグリやすくなる
という通信を傍受した。情報源の確認はされていない。
見当を祈る。

150 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/13(日) 12:26

PMSFやPefablocなどのプロテアーゼインヒビターを使うと
目的タンパクの表面にセリンがある場合に修飾されてしまうのですか？

151 ：んなこたーない：2001/05/13(日) 13:34

>>150
んなこたーない。そんなこと有るんだったら、
とっくにPMSFなんか使われなくなっている。

152 ：：2001/05/14(月) 13:27

age

153 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/17(木) 00:19

age

154 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/17(木) 01:03

気合いと根性と鉄の意志があれば上手く逝くこともあります＞酵素精製

155 ：泥沼歩兵部隊：2001/05/17(木) 01:20

同意。

156 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/17(木) 18:04

結晶屋の態度がでかいぞ！
てめーでやれ、てめーで。

157 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/18(金) 09:27

>>156
激しく同意。

158 ：日本アメリカ化計画：2001/05/18(金) 12:50

Ａ型は徒党を組んで国民を操ろうとする。注意せよ！
特に全国民の５％しかいないＡＡ型は偏固で神経質。

159 ：156：2001/05/18(金) 14:47

>>157
相手が同じだったりな(w
うちは東京の私立の変なやつ。
自分で精製できないから手広くむしってるらしい。

160 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/18(金) 20:58

構造業界狭いから、どこなのかｳﾞｧﾚｳﾞｧﾚ(藁
うちは自分で精製してます。徹夜明けでねむい…

161 ：厨房：2001/05/19(土) 04:06

ＤＱＮな質問なんですけども
乳酸菌の膜酵素の活性を調べるために
菌体のs-layerだけを剥がしたいのですが
どうしたらよいのでしょうか？現在先に進めずに困ってます・・

162 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/19(土) 10:18

結晶化させるタンパクに、Hisタグついてちゃだめ？
切らないとダメ？

163 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/19(土) 14:15

末端がふらふらしていると結晶化しにくいといって
嫌がるひとは多いみたいだね。

164 ：157：2001/05/19(土) 22:45

>>159
うちは企業･･･。
企業名出すと誰だかばれるので出せない（ｗ

165 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/20(日) 00:44

企業の内部ででかい顔をしている結晶屋には
一度鉄拳制裁を加えるべし。
（わざとプロテアーゼをしこんでおくとか）

しらじらしく「なんかコンタミさせたんじゃ
ないの？結晶化母液回収してマスでも飛ばし
てよ」とかって、こっちから仕掛ける。もち
ろん同じロットの試料を微量だけ取っておいて
「あれ、うちでとってあったぶんは分解してないよ」
とか言う。できればちゃんと社内文書として証拠が
残るような形でやれ。

166 ：１６１：2001/05/20(日) 04:02

>162
Hisタグは有っても無くてもとにかく
膜のs-layerだけを剥がして持ってこいと言われてます。
分からないのでそれらしきものを論文のリファレンスを参照に
取り寄せて調べようとしてます。
膜酵素を取り扱ってる方はどうしてるのでしょうか？

167 ：１５７：2001/05/20(日) 04:51

>165
ス･･凄いっすね（汗

168 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/20(日) 13:56

専門じゃないのでS^layerという定義がわからないんだけど
詳しく教えてくださいそうしたら何かアイデア出るかも。

169 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/21(月) 12:06

>>167
IPTGストック、謎の液体と総とっかえられ事件勃発＜某国立大学
中退院生の置き土産に2ヶ月気づかず
自分には関係ないのでﾜﾗﾀ

170 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/21(月) 12:07

>謎の液体

流行の水道水か？

171 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/21(月) 23:21

IPTGとDTTってよく間違えないか？

172 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/22(火) 11:34

結晶屋にはNMRでやるからいい！と言いましょう
結局動きが見たいんだから結晶じゃあね

173 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/22(火) 11:36

まぜとけば？>>171

174 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/22(火) 13:21

>>172 概ね同意．
ただしラベル代の出どころはプロジェクト開始前にはっきりさせとくこと．

あれだけ説明したうえで，資料も渡しといたのに…
いざラベルの準備の段になって確認すると
「あれラベルって精製の後にするんじゃないの？そんなお金ないよ」
photo-affinity labellingみたいなものと思いこんでいたらしい
鬱死鬱死

175 ：名無しさん＠お腹いっぱい。：2001/05/22(火) 14:06

においでわかるだろ　 >>171

176 ：１６１：2001/05/23(水) 00:08

何回もすみません、s-layerを簡単に説明しますと
グラム陽性菌は細胞膜上に多糖がペプチドで架橋された
ペプチドグリカンの層で覆われていますが、さらにそのうえに
蛋白質や糖蛋白の層があります、これがs-layerです。
本を読むとタンパク性サブユニットの二次元的結晶配列になってるってことです。
このs-layerだけを剥がしてこいと言われてますが分かる方がおられたら
アドバイスお願いします。

177 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/23(水) 00:49

↓ここに名前が載っている人の論文でも読んでみたらどうでしょう。>>161
http://microota.nutr.med.tokushima-u.ac.jp/foodmicro/jp/history.html

178 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/23(水) 03:46

非イオン性界面活性剤で中の物だしちゃうとゴーストセルになりますよね。
これを回収するだけでもかなりエンリッチされるのでは。
適当な速度を見付けて遠心するとか、もっと原始的にフィルター使うとかは駄目かなあ。

個人的にはプロトプラスト作るため逆にs-layerだけを壊す方法が知りたい。
イーストのザイモレースでしたっけ？あんな感じでなんか適当な酵素ないもんですか？

179 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/23(水) 22:09

結晶化に持ち込むタンパクって、ゲルろ過かけてる？

180 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/24(木) 00:57

かけてます．

181 ：161：2001/05/24(木) 15:13

177さんどうもありがとう
でもその人の論文は月曜日に取り寄せるように頼んだから
来週にも手元に届く予定です・・・
ここで聞くと手っ取り早くいけるかなと思っていましたけども
地道にやっていきます

182 ：MMP：2001/05/24(木) 22:20

MMPの精製って簡単に出来るものですか？収率とかってどのくらいなんだろう･･･？
購入するか、精製するか迷っています。誰か教えてー。

183 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/25(金) 02:29

>>182
まず文献読め。

184 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/25(金) 19:16

蛋白科学会逝く人いますか？

185 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/25(金) 23:36

来週末阪大であるやつですか？
行きますよー。

186 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/25(金) 23:42

膜タンパク質の結晶化をやっているのですが、なかなか結果がでません！
バッチ法,透析法で行ってます。
透析法では、ＰＣをつかってリポソームを作ってそこに組み込もうと計画していますが、
まず、リポソーム作製にてこずってます。
なにか良いアドバイスがあったらおねがいします！！！

187 ：泥沼歩兵部隊第３小隊：2001/05/25(金) 23:45

＞１８４
分隊長どの！　本隊も蛋白質科学会に参加するであります！

188 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/26(土) 00:01

へー偶然。
じつは顔見知りだったりして・・・・・・笑

189 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/26(土) 00:19

＞１８４
Ｔ教授のちかくにいます・・・・構造解析しながら・・・・

190 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/26(土) 13:33

あげ

191 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/26(土) 14:41

あげあげ

192 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/27(日) 02:25

蛋白質科学会の目玉ってなんかありますか？

193 ：184：2001/05/27(日) 12:40

僕はＸ線のＨ先生の発表は見に逝きます。

194 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/27(日) 16:42

age

195 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/27(日) 23:53

Ｘコヤンですか？あの時間帯のワークショップ、裏番組も見逃せないのが
多そうですがＸコヤンを選んだのはなぜ？（決して悪い選択ではないと思
いますけど・・・）

196 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/28(月) 03:37

ワークショップだりー

197 ：184：2001/05/28(月) 03:48

>195
Ｇタンパクやってるので･･･

198 ：N本イクちゃん：2001/05/28(月) 04:01

＞Ｇタンパク

呼んだ？俺に聞いてくれ！

199 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/29(火) 11:05

age

200 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/29(火) 23:36

土曜日、楽しみに蛋白研いっくっぞー！

201 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/30(水) 00:19

アドバイスください、先輩方！
ＬＢ培地中に分泌された蛋白質を回収するにはどうしたらよいでしょう？
ちなみに約３kDaだったりします・・・。

202 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/30(水) 00:56

>201

ぼくたんでよろしければ･･･

可溶性蛋白でサップにあるなら、
培地を超遠心して、
サップ回収して、
濃縮＆バッファー交換して
後はフツーに精製するが・・・

もしかして pLysS とか使って集菌のとき懸濁した？

203 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/30(水) 03:59

202の方へ・・・。201で質問させていただいた者です。

まだ研究室に配属されたばかりの新米なので、専門用語すら
わからないであります。まず、「サップ」とは？
また、「pLysS」とは？
すんません。勉強しなおしますー・・・。

ちなみに懸濁とかしてません。

204 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/30(水) 04:03

>>203
「サップ」はたぶんSupernatantの略で上清のことだ。

205 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/30(水) 12:00

>>202
3kDaじゃ限外ろ過で濃縮は無理だな。アセトンかアルコールで沈殿させて
PAGE（アクリルアミドゲル電気泳動）で流してゲルのバンド切り出しだろう
か。あるいはゲルろ過カラム、HPLC。

がんばって勉強してくれ。おれもだがな。

206 ：201：2001/05/30(水) 12:24

できるだけ活性体で回収したいんでＨＰＬＣは使いたくない。
というかＨＰＬＣ使っても活性体のまま回収できることって
あるのかいな？　アセトニトリル使うと変性してると思うのだが
・・・。
このテーマうまくいくのかな？

207 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/30(水) 12:47

3kDaのタンパク質ってアミノ酸のして30個の「オリゴペプチド」ぢゃん？

アンフィンセンの仮説を援用するまでもなく、水溶液中でもっともエネルギーの低い
安定した構造に自動的にαへりっくすやらベータシートになるだろう。
逆層HPLCやトリクロロ酢酸沈殿して変性したって、中性緩衝液にもどせばどうということはないと思う。
むしろマストパランみたいにリン脂質小胞でも加えて膜表層でへりっくす形成を促進するとかやればいいよ

208 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/05/30(水) 13:01

ミニタンじゃダメなの？

209 ：泥沼歩兵部隊：2001/05/30(水) 14:07

泥沼歩兵部隊第3小隊より伝令！
まず２０１さんへ。

LB培地ではなく、M9培地でもモノが分泌されているか
どうかを確認して、M9で試してみることをお勧めします
培地成分夾雑物が少なければ少ないほど後々の精製がラク
になること請け合いです。
ただしペプチド鎖としては3kdaでも、活性体は構造をもったテトラマー
とかの可能性もあるので、現時点の情報だけでは助言に限りがあります。

＃＃２０６さんのコメントに関連して。
不思議なことにかなりの種類の蛋白質で逆相クロマト
によるアセトニトリルグラジエントでの活性を保持したままの
分離精製回収の成功例が報告されておりますっ
カラム上で巻き戻りが起きているのか、それともカラム上では
変性していないのかは不明でありますっ。
それよりもテキはTFAの酸性でありましょう。

＃＃２０７さんのコメントに補足
というわけで、該当ペプチドは逆相で精製できる可能性高いのでは？

＃＃２０５さんに補足
3kDAだと分子量が小さすぎて通常のPAGEでは苦労する可能性が
あるので、低分子用buffer系を試す必要があります。ATTO / 第一化学
などの電気泳動メーカーのカタログを熟読すると、良いと思われます。

＃＃２０８さんに補足
ミニタンはミリポア社のポンプ循環方式の限外ろ過システムのことで
濃縮に使えます。

以上、同じ戦場の空の下で、貴官のご武運をお祈りいたしますっ！　

210 ：201：2001/05/30(水) 18:10

泥沼歩兵部隊さん、その他の皆さん、ありがとうございます！
自分の知識の無さをあらためて思い知りました！
とりあえずM9培地あたりから試して行こうと思います！
っていってもM9培地とは？という状況なんですが、それくらいは
調べます。

それでは201伍長、突貫いたしまーす！

ほかにもこんなやりかたもあるよーという方、どしどし
かきこんで下さい。この実験大変行き詰まっております！

211 ：Nobody：2001/05/30(水) 20:29

＞201
大腸菌発現で菌体外へ分泌されるって、普通は聞かないけども、
何かシグナルなどに工夫しているの？　単に漏れ出ているだけ
なら、菌体蛋白質もウジャウジャ出てきて精製難しそー。
その辺の詳しいことを書けば、もっといいレスが出てくるかも。

Ｍ９培地使う場合でもカザミノ酸加えておけば生育速度は悪く
ないという話聞いたことある。

212 ：201：2001/05/30(水) 21:47

元はといえば、DsbABCDっちゅうシャペロンを使うとか言い出したのが
まずかった。そいつが分泌を促進する機能をもってて（？）、元のプラスミドも分泌シグナルを
つけたやつに換えた（ライゲーションやり直し）。
ペリプラズムへの移行シグナルなので、そこを調べたけど、ＳＤＳでは確認できず、
ウエスタンでも無理。大腸菌を破砕しても見当たらず。あとは培地か？

担当Ｍ.Ｋ教授は、ＬＢを一回凍結乾燥したら？とか言ってるけど、それっていろんな
粉がまざらないの？

213 ：Nobody：2001/05/31(木) 09:00

＞２０１
コンストラクト変えたんなら、まずデザイン通り発現しているか調べるこ
とが先決だろ。　ウェスタンで使った抗体は大丈夫？　ポジコンで反応し
てるか確認した？　分解されやすくて検出できてないのかもしれんぞ。
分画しないで、サンプリングした培養液を直接TCA処理してからウェスタ
ンしてみろ。　分画中のプロテアーゼの影響を抑えられるから。

シャペロン云々や培地を調べるより、まず発現の確認が先だな。

214 ：あぼーん：あぼーん

あぼーん

215 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/03(日) 19:00

cell free の蛋白発現系って凄いね・・・

216 ：泥沼歩兵部隊斥侯小隊：2001/06/03(日) 21:37

蛋白質科学会参加の各部隊の皆様お疲れさまでした。
至るところに我らが同朋、戦友、歴戦の古強者など
が跋扈しており、実に勉強になりました。

217 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/04(月) 19:09

>215
だまされるな！

218 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/04(月) 23:40

蛋白質科学会終了アゲ

219 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/04(月) 23:43

行ってきたなり。蛋白質科学学会。
勉強になったなり。
それにしてもパンフが売り切れるほどの人気だとは思わなかった。

220 ：あぼーん：あぼーん

あぼーん

221 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/05(火) 12:46

蛋白質科学会でなんかヤナことでもあったのか？
ほかでも脱糞しとったが。

222 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/05(火) 23:28

あげあげ

223 ：素人さん：2001/06/06(水) 14:24

ペリプラズムに含まれる蛋白質だけの回収って可能？可能ならどのように・・・・。基本的な質問でスマン。

224 ：＞223：2001/06/06(水) 16:21

E.coli in LB medium
↓
spin at 7Krpm for 7min at 4C
↓
resuspend in 10mM Tris-Cl
↓
spin at 7Krpm for 5min at 4C
↓
resuspend in 20% sucrose, 2mM EDTA, put cell suspension on ice for 7min
↓
spin at10Krpm for 6min, remove sup. completely
↓
resuspend pellet in ice-chilled H2O,quickly., put suspension on ice for 7min
↓
spin at 10Krpm for 6min, transfer sup into new tubes

225 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/07(木) 20:24

膜たんぱくの結晶化。
アドバイスください。
なんかいい界面活性剤ありませんか？

226 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/08(金) 01:20

ジギトニン・・・忍々♪

227 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/09(土) 16:41

age

228 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/10(日) 12:41

あげ

229 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/12(火) 01:36

初心者です。精製をはじめました。
T7リゾチームを共発現させてるので凍結融解で破砕はOK。
でもそのままでは粘性が高くて遠心で落とせないので、
ストレプトマイシン硫酸塩を加えて遠心するとうまく落ちてくれる。
なんでも粘性の原因のゲノムDNAも一緒に落ちてるそうな。
でも、ストレプトマイシンってリボゾームに結合するんだから、
DNAではなくRNAに関係しそうなんだけど…
と指導してくれてる先輩にきいたら嫌がられてしまった。知らないのかな。
精製は順調なのでいいのだけど、いったい何が起きてるんでしょう…

230 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/12(火) 15:30

229>>で？

231 ：２３１：2001/06/12(火) 21:00

教えて下さい！
いま、バキュロやってます。
Novagen社のプラスミドpBACgus-6のlef-2って何ですか？
何のために入ってるんだかわかりません。

232 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/12(火) 21:30

>>229
核酸なら沈殿するんじゃないの？

233 ：229：2001/06/12(火) 21:53

>>232
もしかして、塩化銀↓みたいに単純に溶解度の問題だったのでしょうか。

ストレプトマイシン硫酸塩(水溶性) ＋核酸 →
ストレプトマイシン核酸塩(不溶性) ＋硫酸イオン

234 ：おさかなくわえた名無しさん：2001/06/13(水) 08:00

>>231
バキュロのessentialな遺伝子です

235 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/13(水) 08:18

キットの説明書さえ読めないヴァカがいる

236 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/13(水) 17:20

スカトール処理ってやったことある人います？
トリプトファンで特異的に切断する化学切断法です。

切断後のペプチド（2kDa）を回収しようと思ってるんですが、
バッファーが酢酸と塩酸なんで、バッファー置換が必要です。
なにか良いアイデアないですか？

このままでは卒論が書けない・・・。

237 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/14(木) 03:21

>236
うむ。透析膜とか抜けてしまうのだな？
・・・中和じゃだめなん？

238 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/14(木) 04:48

ゲルろ過は？

239 ：泥沼歩兵部隊：2001/06/14(木) 10:32

SepPak C-18というディスポの逆相精製カートリッジに
吸着させることができれば、最後はアセトニトリル
TFA－水系で溶出して、凍結乾燥を繰り返して
カウンターイオンを極力へらす・・・というのが
いいとおもわれます。
ミリポアのSepPakやそれに類する逆相系ディスポをあ
たってみてください。

240 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/14(木) 13:28

HPLCでピークが近すぎる場合はどうしてますか？

241 ：236：2001/06/14(木) 15:37

バッファーが酢酸とかのままゲル濾過にかけてもいいものなんですか？
ゲルがいかれそう。

アセトニトリルとかＴＦＡが入ってる溶液をそのまま凍結乾燥に
かけてもよかですか？　機械壊れても弁償できん・・・。

＞240
濃度勾配をもっとなだらかにしたらいいんでないの？
そんな単純な問題ではないのかな？

242 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/14(木) 20:18

>>241
濃度勾配をゆるくしても重なってしまうのです。

243 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/15(金) 20:03

＞240
HPLCじゃないとだめなん？

244 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/15(金) 23:11

>241　10%酢酸でゲル濾過日常。低吸着だし凍乾で飛ぶし良いこと多い。
アセトニトリルはポンプの油と混じると良くないのでトラップを付ける。

245 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/16(土) 00:41

age

246 ：ショ糖：2001/06/16(土) 11:39

ショ糖密度勾配遠心法により蛋白を分離しようとしているのですが、
どうもうまく分離できません。
なぜか、わかりませんが、恐らくショ糖勾配がうまく作れていない
ことが原因ではないのかと思っているのですが。

この方法を行うにあたっての注意点を教えてください。

247 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/16(土) 11:51

まあ、つくっただけのチューブから分画とって屈折率計で密度を測定してみることですな。それが
あかんなら、近くの人に訊いてくれ。ポリアロまーチューブなら軽い方から底上げで入れてたし、ニトロセルロースなら（まだあるんか？）重い方からたらし込みで入れてたけどな。

248 ：深草練兵場：2001/06/16(土) 15:24

>>244
右に同じ！筆者のラボではアセトニトリル含有試料を遠心濃縮していますが
まったくポンプへの影響ないです。ただガラストラップのついた冷却器
（マイナス１２０℃）を遠心機と真空ポンプの間に挟んで使っています。
ただし遠心に要する時間はむちゃくちゃかかりますが・・・
>>240
HPLCの送液にどのような系を使っているかわかりませんが、
A液とB液をある一定の比率で混合してカラムに流し込むのであれば
A,B両液の比率を振ってみては？
それでリテンションタイムが結果的に遅れても
複数のピークが分離できればOKだと思います。
筆者の場合これで分離の悪さはあらかた改善されました。

249 ：240：2001/06/17(日) 21:29

>>248
ありがとうございます。
さっそく試してみます。

250 ：名無しのゲノムのクローンさん：2001/06/18(月) 03:03

初心者です。
タンパク質の精製ってふつうはHPLC使うんですか？
有機溶媒に溶けにくいサンプルの場合はどうしたらヨイですか？
酸（トリフルオロ酢酸）じゃないと溶けません。
酸にとかしてカラムクロマトとかありですか？

251 ：サイズクロマト隊将校：2001/06/18(月) 09:27

>>246
>>どうもうまく分離できません。

どううまく分離できないのか説明したまえ。うまく分離できなかったと
判断する根拠は何かね、２４６上等兵？　（勝手に階級を決定。ショ糖
勾配ぐらいできないようでは下士官にすらなれん）　247の言う屈折率計
を使うのは、実は最後の手段だ。それよりも前にやることが山ほどある。

まずは別のチューブをもう一本用意し、コントロール蛋白質だけを落として
みたまえ。ファルマシアから出ているゲルろ過カラム用の標品が
そのまま使える。とりあえずBSA(66KDa)、catalase(230KDa)、
thyroglobulin(670KDa)の三つを試してみろ。これらがきれいに
分離できないようなら、はじめてショ糖勾配の出来を疑え。

ショ糖にこだわる必要はあるのか？　グリセロール勾配という手も
あるぞ。２％ずつグリセロール濃度が違うバッファをそぉーっと
チューブに積んで作るだけだから、正確にはなだらかな勾配では
なく段階的勾配にすぎないが、濃度を最適化すれば極めてきれいに
分取できるし、何より何の道具も要らず可及的速やかに作れるのが
魅力だ。成功を祈る。

252 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/19(火) 23:12

age

253 ：泥沼歩兵部隊第３小隊：2001/06/20(水) 22:01

サイズクロマト隊少佐殿に敬礼！

254 ：254：2001/06/21(木) 17:44

精製ではないのですが、SDS-PAGEで見られたバンドが
自分の目的としているタンパクかどうかを証明するのに困っています。

最後のステップとしてゲルろ過(FPLC)を行い、
タンパクと活性のピークがきれいに一致し、SDS-PAGEでもほぼ1つのバンドになっています。
が、うす-く1:20ぐらいでメインのバンド以外に1本見えています。
メインのバンドが目的のタンパクだと考えているんですけど、
決定的な証拠として
native -> 切りだし -> 活性測定
というのは可能ですか？

255 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/21(木) 23:34

意図がよくわからんが。「可能ですか？」と聞かれてもどんな蛋白質か書いてないんじゃ
答えようがないよ。そんなもん、物によって違うにきまっているじゃん。

「ベストな方法ですか？」と聞くつもりだったならまだわかるけど。答えはＮＯだな。
活性が測定できるなら、抗体ぐらいどっかにあるだろ？　まあ普通はそれ使って
ウェスタンブロッティングが一番お手軽だろうなあ。両方のバンドが特異的抗体で
染まってしまうなら、翻訳後修飾とかデグラデーションの可能性がでてくるので、
万能じゃないけど。

256 ：254：2001/06/22(金) 00:01

すいません、もう少し詳しく書いてみますのでよろしくお願いします。
モノはカビが生産している植物細胞壁分解酵素の1つです。
セルラーゼではないです、もっと、マイナーな酵素。

活性測定も自分で合成した基質を用いているぐらいで、
抗体も自分で作らないと無理です。

パラニトロフェノールを使った活性染色も考えてみましたが、
PNPに対する活性が低いためうまく行っていません。

可能ですかと聞いたのは、SDS->切りだし->免疫
という、方法を聞いた事があったためです。
活性を保持している状態でゲルから取り出せれば、モノである証明になると
思いました。

257 ：泥沼歩兵部隊斥候：2001/06/22(金) 01:20

たとえばキチナーゼとかと同じように、
何らかの発色する基質やラジオアイソトープ
のようなものを使って「オーバーレイアッセイ」を
かけることはできないか検討してみたらどうでしょうか？
DNAポリメラーゼなんかではSDS-PAGE後にゲルから
SDSを抜いて、ゲル内で巻き戻した一部の活性を利用して
ゲル内オーバーレイアッセイで活性を見たりもしています。

細胞壁を分解してできた生成物にたいする感度よい
呈色反応なんかないのかな？

258 ：＞２５４：2001/06/22(金) 02:29

その酵素をコードするcDNAはまだクローニングされていないと理解していいのだね？

君の言う「SDS->切りだし->免疫」、つまり単一のバンドとして見えている蛋白質を
切り出して直接抗原とするという手ももちろん有りだ。ただし蛋白質が大量に
必要だぞ。確かに、切り出したものに活性があるならそれに越した事はないが、
SDSでフォールディングが壊れるから、うまくいかない可能性が高いと言われている。
普通SDS-PAGEで切り出すのは、活性が失われていてもかまわない場合に限るよ。
それに、仮にそれで抗体ができてうまく染まったとしても、それ自体では、君の見て
いる活性とそのバンドの関係を証明することにはならない。だいいち時間がかかる。

まずはSDSを入れないPAGE、いわゆる非変性ゲル泳動を試してみることをお勧めする。
この場合は、分離能が悪いことが欠点だが、バンドが二つだけなら、うまく分取
できるかもしれん。それで切り出し・溶出・透析後に活性を測定してみろ。
切り出したサンプルをSDS-PAGE泳動して、バンドが一本だけなのも確認すること。

切り出した蛋白質でエドマン分解かマスクロを外注して、その蛋白質の
一部でいいからアミノ酸配列を決めてしまうのも定石だ。その情報があれば、
ホモロジーサーチで別の生物のカウンターパートが同定できる可能性がある。
もしそれがほぼ同じサイズと活性を持つオルソログだったなら、もう君の精製に
ケチをつける奴はいない。

259 ：254：2001/06/22(金) 14:06

泥沼歩兵部隊斥候様
私の目的としている酵素は細胞壁からフェノール誘導体を遊離させるものです。
エステル結合を切るので、PNP-Acetateを分解させて、PNPの発色を見る
ぐらいの呈色反応しか手持ちの技にはありません。
しかし、PNP-Acetateに対する活性が低く、酵素の量が取れないため、
なるべく、いつも用いている基質を使いたいと考えています。

258様
はい、今クローニングを行うために、精製を行っているところです。
いわゆる非変性ゲルとは、SDS、メルカプトエタノールを入れずに
行う、Native　PAGEですよね？
切り出し、溶出、透析について詳しく教えていただけないでしょうか？
研究室にあるタンパク関連のプロトコール集を見ましたが、
見つけられませんでした。

とりあえず、目的と思われるタンパクをブロッティングして、
来週頭にでも、N末を読める段階にはしました。

アドバイスありがとうございました。
精製はたぶんうまく行っていると思ってもらえているんですが、
以前、N末を読んで卒業された先輩のデータが間違っていて
引き継いだ方が読みなおす羽目になった事があったため、
教授が少し慎重になっているようです。

260 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/23(土) 05:58

融合タンパク発現系でアフィニティかける時って
微量の界面活性剤入れないと
シャぺロニン持ち込んだりしちゃうものなの？

70Kあたりのバンドは怪しいって良く聞くけど＜dnaK

261 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/25(月) 01:06

界面活性剤だけではシャペロニンのもちこみは
さけられないものと思われ。
そもそも「きちんとフォールドしている蛋白質」への
シャペロニンのアフィニティーはかなり低いので、
70kDaのバンドが見えた時点で、その融合蛋白系は
きちんと巻き戻っていない（変性している）状態で
コンストラクト作り直しが必要という説も。

262 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/27(水) 17:43

GST融合タンパク質の完全なる単離精製って可能なん？
アフィニティーだけじゃ駄目なんよね。

263 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/27(水) 18:06

>>262
陰イオン交換とゲル濾過を併用すれば可能だ。

264 ：はむじろう：2001/06/28(木) 05:43

牛の脾臓からあるタンパクを精製したいんですが、血が多くて困っています。
脾臓って灌流できるんですか？あるいは、赤血球と脾臓細胞を分離する方法って
ありますか？だれか教えてください。

265 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/06/30(土) 18:47

あげ～

266 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/02(月) 06:39

Klett unitsって何？？？
調べても、あたりまえすぎるのか、どこにも記載されてなーい！！
バカすぎる質問かもしれませんが、しってる方教えてくれませんか？？

なんで濁度でグラフ書かないんだろ、今読んでる論文・・・

267 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/02(月) 07:14

age

268 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/02(月) 16:12

age

269 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/07(土) 10:01

age

270 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/07(土) 14:17

>>266
K.U.、つまりKlett unitsはクレット計というもので濁度をはかってます。
だから、クレットの値でグラフを書いているのであれば、それは濁度でグラフを書いていることになるのです。
俺はお気に入りなのですが、このクレット計を使っている研究室って少ないんでしょうね。
大腸菌の研究をしている研究室には必ずあるけど、他の研究室ではなかなか見かけない。
けど、分光計でOD計るより楽です。
ＯＤ６００とリニアな相関性があります。
濁度を測る機械はクレット計以外に色々なものがありますが、リニアになるのはこれくらいしかなかったです。
新しい機械が売り込まれてくるたびに濁度測定しましたけど、古いのが一番と言うことなんでしょうかね？

271 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/09(月) 00:18

あの～、チュウボウな質問なんですけど、
精子からはどんなタンパクが精製されますか？

272 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/11(水) 02:37

ウェストウェスタンやったことのある人いますか？
あるタンパクに相互作用するものを釣ろうとしてるんだけどうまくいかないので手を出してみようと思ってるんですが・・

273 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/11(水) 02:43

>>272
細かい条件検討必要だけど、
自分の目的のタンパク質に近いタンパク質の論文を
参考にやってみれば？

274 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/14(土) 15:17

あげます

275 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/14(土) 20:25

>>271
開くﾁﾝ

276 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/18(水) 05:15

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277 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/18(水) 05:20

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278 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/18(水) 10:14

タンパクゲル乾燥中のひび割れ防止剤の組成教えて下さい。グリセリンとイソプロパノールみたいだけど。

279 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/18(水) 13:37

>>278
20%メタノール、5%グレセロール。
グリセロールは2%にする人もいるがお好みで。

280 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/18(水) 13:44

>>278
私はアトー株式会社から出ているアンタイクラック（亀裂
防止剤）を使ってます。これで割れたことないっす。

281 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/18(水) 15:19

>>279
酢酸をいれておくとゲルが柔軟になってわれにくくならない？

282 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/19(木) 05:31

>>281
もちろん酢酸存在下ウェットな状態ならゲルが割れることはまずありえないが、
乾燥させれば酢酸は蒸発してなくなってしまう。そして割れる。しかも臭い。

酸っぱい匂いのするゲルを大量にノートにはさんでおくと、
なんか哀しくならないか？　

283 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/19(木) 11:36

話題かえてすいませんが・・・

グリセロール入りタンパク質溶液からグリセロール（グリセリン）
の除去って可能ですか？しかも遠心（限外濾過）を使わずに。

284 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/19(木) 12:05

透析じゃだめなん？
PD-10はだめなん？
あと硫安沈殿で回収して再融解（回収率の
よしあしは君の腕にかかっておる）

285 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/19(木) 12:11

ATTO CompactPageで市販プレキャストのゲル
つかってるひといますか？

286 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/19(木) 12:12

284>>
ふふふ、透析膜を通過していまうほど小さいのだよ・・・。

287 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/19(木) 21:24

ちょっと気になったんですけど、硫安沈殿の回収率に必要な腕って何でしょう？
タンパク量は十分にあって、失活もしにくいタンパクと仮定して。
うちの後輩が、扱いやすいタンパクにも関わらず、
硫安カットで活性を減らしてしまうので、コツがあれば教えたいのですが、
私は普通にやってるだけなので、教えようがなかったり。。。

288 ：硫安塩析：2001/07/19(木) 21:34

氷水で翼冷やす。
少しずつ硫安の粉を加え、粉がビーカーの底に貯まらないようにする
硫安を入れ終わったら３０分ー１時間、攪拌する
４度で１００００g３０分は遠心する
５０％を越える硫安の場合、重力gと回転時間を長くする
薄い蛋白質溶液の場合、攪拌時間を十分長くする。
硫安沈殿を長期保存する場合、ー７０度以下に保存する。
攪拌している間に酸化しないよう、DTTかメルカプトエタノールを多めに入れる。
プロテアーゼ阻害剤を高濃度入れておく。
目的試料の回収率を上げるよりも、混入してくるいらない蛋白質をなるべくカットするような硫安濃度範囲を選ぶ

289 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/19(木) 21:44

＞284
SpectraPorという会社に3000カットの透析まく
があるけど、それでもとおるかな?
もしそれでもとおるんならそれはペプチドであって
蛋白ではないから、立体構造を気にしなくていいので
たとえば逆そうとかたとえばSep-Pak (@Millipore)とか
で脱塩かのうなり。

290 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/24(火) 02:00

惜しいんであげときます

291 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/24(火) 22:01

ATTO CompactPageで市販プレキャストのゲル
つかってるひといますか？

292 ：283：2001/07/25(水) 15:41

289>
　３０００の透析膜・・・。おしい。
　実は２８００のペプチド。しかもジスルフィドが数個あるので・・
　活性体を得るには逆そうは使わんほうがいいとおもうのだが。

ここ最近、ペプチド精製について話題がのぼってますなー。同じことしてる
人いるんだ。

293 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/26(木) 00:59

微妙なとこですな
＞ジスルフィドが数個
だけど25merくらいのペプチドでジスルフィドが数個
というのであれば、逆にジスルフィドさえ切れなければ
逆そうでとっても活性は失われないと思われます。
逆層条件（TFA酸性）だったらけっこう大丈夫じゃないか？という
気もしますです。

294 ：泥沼歩兵部隊負傷兵*現在休養中：2001/07/26(木) 01:06

>292　どの

ガガガーピピピピー

当方、敵暗号無線を解読したところ重大と思われる情報を発見
http://www.spectrapor.com/dialysis/spectra_por_6.html
問題の敵兵器にはMWCO 3500のもののほかに1000, 2000が
ある模様・・・
この情報が貴部隊の戦況打開につながらんことを後方より祈る
・・・オーヴァー

295 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/26(木) 22:29

硫安を粉の状態でいれんでもいいと思うが、飽和硫安つくってスターリングしながらぺりすたゆっくりおくればよい。そばにいる必要もないし、断然楽できるし、結果も安定してると思われ。

あと、投石幕、言外濾過幕は1000どろか500cutもあるよ。使ってみれ。そんだけ。論文角のあきたぞえ・・。

296 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/27(金) 02:22

age

297 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/27(金) 13:14

age

298 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/29(日) 08:58

age

299 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/29(日) 16:57

>295
硫安処理にそんなに時間かけるわけにもいかないし…。

300 ：fushianasan：2001/07/29(日) 16:58

301 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/29(日) 22:24

精製の基本わかってないね。マテリアルは何使ってるか知らないけど、
硫安処理で収率10倍ちがったらどうするの？10倍用意するか？それこそ、
無駄な努力だよ。もうちょとよく考えてみれ。

302 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/30(月) 18:09

私の酵素は90%飽和などにしたい＆培養上清なので濃縮しても２Lとか
あったり。
失活しない事を良い事に、ざらざらー一気にと放りこんでいます。

303 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/31(火) 01:10

おおおおおおおおおおおおおおおおおお、バンドが増えた…。

304 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/31(火) 02:28

http://cheese.2ch.net/test/read.cgi?bbs=life&key=996509857
このすれに活気を

305 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/31(火) 20:39

硫安をすると次のステップに進む前に
脱塩しなければいけないことが多いので
あまり好きでないです。
次のステップが
疎水性クロマトやゲル濾過なら問題ないと思いますが･･･。

306 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/07/31(火) 21:03

それは透析がすきか、キライか、透析チューブに吸着して
モノがロスるかどうか、できまるとおもいます。
私はただサンプルを氷温・4度で保存しておくよりも、
透析バッファの中に放りっぱなしのほうが好き・・・
スターラー独占するなってよくおこられますけど（＾＾；

307 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/01(水) 11:33

MY先生のエンドセリンの精製はどうしたの？

308 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/01(水) 21:47

NEBのfactor Xaってどうよ?

309 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/01(水) 21:59

質問変更
和光→伊藤ハムのFactor Xa (from bovine)ってどうよ?

310 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/01(水) 23:37

factor Xa・・・高いから嫌いだ。
蛋白の大量精製には向いてないと思わん？

貧乏研究室より。

311 ：>>310：2001/08/02(木) 00:48

308=309 です。
すげー同意。
そもそも構造関連やってるところでものとりで
thrombinでうまく行った所はよく聴くけど
FXaでうまく行ったと聴いたところはほとん
どないのだが。
共同研究者様がくだされた有難いベクター
なので、注文をつける立場にあるわけもなし。

窮余の策として安いFXaを探しておりまする
情報をお寄せください。

312 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/02(木) 05:27

そう！私もファクターXaでうまくいかなかった。
高いし、効率もわるいから、別の方法で考えたものだ。
GST融合とかやってる人で、苦労したことない？

あと、安いFXaなんてないやろ？
自分でアミノ酸残基インサーションして化学的切断した方が
速くない？ブロモシアンとかでメチオニン切ったり。

FXAでうまくいった人の経験談もとむ！！！

313 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/03(金) 03:09

うちのラボの人がやってる。
うまくいってないみたいだけど。

314 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/03(金) 11:50

俺、マルトース結合蛋白質を除去するのにFXA使ったよ。
カルシウム入れて12時間以上コールドルームで放置プレイで
きれいに切れたし、何も問題なかったけど。
認識部位の前後にスペーサー入れといたらいいんじゃない？

315 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/03(金) 15:04

MBPの発現系はFactor Xaなんだよな～。
カルシウム入れるのが味噌なのかもね

316 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/03(金) 21:03

新しい蛋白質発現のテーマをはじめた。
発現実験をした。
いきなり沈澱画分にものがあることが判明。
しかも2種類とも。
欝だし脳

317 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/04(土) 05:13

後輩がFXaでダメだった。
試しにサンプルをSuperose 6にかけたら全部Voidに出てきた（お）
切断サイトがマスクされてんのか？
ところでMBPってモノマー？

318 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/04(土) 05:28

>>316
よくあるよ、そういうこと。内容よくわからないが発現させるモノは
高次構造維持して無くてはダメなの？もしそうなら敢えてロス覚悟で
発現量少ないうちに回収ってのもあるよ。

319 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/04(土) 05:29

>>1
厨房か・・・・・本当ならすごいな。

320 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/04(土) 05:32

ところで還元剤でGST切り出せるベクターを広告で見たんだが
使った人いる？結果教えてくだされ。（で良好なら分けて～）

321 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/04(土) 08:41

GSTは初耳です。
NEBのやつ？
CBDじゃなくて？

322 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/04(土) 08:46

>>319
この板では厨房とは大学院生のことを意味する。

323 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/04(土) 09:20

316 > 318
X線用のものとり仕事なので逃げ道なし、です。
ああ、また怒涛のrefoldingが始まる。
そういえば、誰かrefolding screening kit使っている人いる？

324 ：>323：2001/08/04(土) 11:10

おいらもそのつかいごこち、ききたい。

325 ：うふぅん：2001/08/04(土) 14:33

>>312
あたしがやった訳では無いけど、FXa使ってた知り合い（その人はHisTagだったけど）は
FXaは高価過ぎ、ていう訳で、トリプシンで切ってた。
４℃で一晩放置プレイで限定分解ね。
そうすりゃ立体障害の小さいリンカーの部分が選択的に切れるらしい。
何分３年も前の話で記憶が曖昧なので、嘘だったらｽﾏｿ

326 ：名無しゲノムのクローン：2001/08/04(土) 19:27

＞＞311　沸こうの化多路具で死らべ増したが　　Fxa　2つ鹿ありませんでした、１つは、値段書いてナカッタデス

327 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/04(土) 21:45

>>322　ありがと、なんせ２ちゃん初心者なもんで。
>>321　失礼、おたくのが正しいでしょう。広告でちらっと見ただけなもんでね。
>>323　がんばってね、としか言えないか・・・・・　　

328 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/06(月) 17:51

age

329 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/07(火) 10:42

age

330 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/07(火) 13:55

NEBよりもwako / 伊藤ハムのFXaのほうが微妙に安いことが判明した。
だれか使った人情報求む。

331 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/08(水) 14:57

age

332 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/09(木) 17:56

Butyl-Toyopearlのタンパク吸着能てどのくらいになりますか？
(1.4 M 硫安を含む100 mM Tris(pH8.0)で平衡化させたとき)

333 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/09(木) 23:30

あげ

334 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/10(金) 00:18

>>332
そんな質問に、キミが納得する解答を出せる人などいないと思う。

335 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/12(日) 01:07

補欠分子団を含む蛋白質の場合、それらはどうやって取り込ませていますか？
in vitroの発現系だとどうするんだろうとか、思ってしまいます。

336 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/12(日) 08:07

あげ

337 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/14(火) 10:46

age

338 ：泥沼歩兵師団：2001/08/14(火) 18:04

（１）無細胞発現系カクテルの中にあらかじめ補欠分子を入れておいて
様子をみる
（２）蛋白合成がある程度終了したころを見計らって補欠分子を入れて
様子をみる。
たいていどっちかの方法でうまく行くはずです。

339 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/14(火) 18:28

>>338
レスありがとうございます。
ちなにみちゃんと補欠分子が入ったかどうかは、どうやって確かめられましたか。

340 ：泥沼歩兵師団第3小隊：2001/08/14(火) 18:42

自分で直接やったわけではないので詳細には答えられませんが
その系では補欠分子に吸収があったので、再構成できたことが
確認できたようです。
御健闘をお祈りいたします。

341 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/16(木) 23:07

精製つらいっス…。

342 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/16(木) 23:21

>>341
ごくろうさま。精製ってカラムの選択が命だから大変だよね。

自分のは硫安→MonoQで（CBBなら）即シングルになったからよいかったけど。。。

343 ：でも好き：2001/08/17(金) 13:42

ConAアガロースゲルに悩まされています。
２４度でゲル８ｍｌに対してサンプル（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５）
タンパクを３０ｍｇ程度しかアプライしていないのに糖たんぱくも未吸着
画分に出てきちゃいます。
どなたか相談にのって！！

344 ：ほふ：2001/08/17(金) 15:02

糖蛋白を吸着させる絡むってWGAとかConAとかピーナッツレクチン（←ちょっとうろ覚え）とかあるっしょ？ConA以外の絡むを試したら？
タンパクについている糖鎖によって吸着できる絡むが全く違うんだよ。

345 ：でも好き：2001/08/17(金) 15:27

ConAで吸着するんです。でも条件がいまいちなのか完全に吸着しないんです。
メチルグルコシドで溶出もされるのですがどうも未吸着にも
その糖タンパクが出ているみたい・・・困ったです。

346 ：名無しゲノムクローンさん：2001/08/17(金) 17:49

>343
ConAなどレクチンは吸着脳低い。ものに寄るけど１桁、できれば2桁タンパクを少なくしないとだめ。
量鳥にはむいてない

347 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/17(金) 18:09

アニオン交換カラムについて

POROS HQはどうよ
やっぱMonoQの方が良いのかな

348 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/17(金) 18:44

試してみたいきはする
Toyoperlはどうよ？
＞３４７

349 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/17(金) 18:56

どうも、横レスです.
僕はタンパク質工学に興味がある学生です.
大学院からタンパク質を学びたいと思っています.
今の講座はバイオしかやらないので、essensialとcellなどの教科書は読んでいますが、
タンパク質工学に関する本は読んでません.
タンパク質工学に関する入門テキストのようなものがありましたら
教えてください。厨房でした

350 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/21(火) 16:03

古典的名著
タンパク質工学の物理・化学的基礎　江口至洋　共立出版

あと
蛋白質機能の分子論　濱口浩三　学会出版センター

351 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/24(金) 02:42

age

352 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/25(土) 21:03

＞３４７
いまさら　MonoQでなくともいいかとは思うが、、
POROS HQ
ものが小さいわけね。POROSは尾をひく感があんだけど、どうよ？
Toyoperl
固いのはいいんだけどね
UnoQ
オープンでつむならいいねぇ　よく着くし

353 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/25(土) 23:30

UNO-Q 初めて聴きました。どこのベンダーですか？
BIORADだったっけ？
いままでオープンといえば馬鹿の一つ覚えのように
Sepharose　FF系を使ってまして、いいかげん日本の税金で
福祉国家Swedenをうるおすのは辞めたいとおもってたので（笑
APBよりも安ければとてもうれしいです。

354 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/25(土) 23:58

2ch潰れたらみなさんどこに避難しますか？
生物板残ってるのも奇跡だね。

355 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/26(日) 02:45

荒らしとかは来て欲しくないから
誘導したくないけど
こんなところは？
http://www.onweb.to/ken9/

356 ：名無しゲノムのクローンさん：2001/08/26(日) 02:52

このサーバー復活は一時的なもので
ゆくゆく２ちゃんは消滅するのかな。
ー速報板から

357 ：名無しゲノムのクローンさん：01/08/26 10:42

確かにこのスレだけは消えないでほしい
あとMollecular technic専用スレと

358 ：名無しゲノムのクローンさん：01/08/26 16:45

Sepharose　FF ものがでかいときの吸着、分離に難があるような気がすんだけど
HPをくらべてだけど、どうよ？
対コストならToyoperl もいいけど、固いから大きなカラム積むとしんどくない？
固いから使いやすい場面もよくあんだけどさ
POROSのスピードも魅力はあるし、分離もいいとは思うけどさ
UNO-Q パックしかなかったはず、確かたんたいに対するかんのうきの数が多いじゃなかったかな？
だから　詰め込んだパックよりオープンで積ましてくれりゃ　いいのにと思ったんだけど
分離は結構いい感じだったけどね　Momo-Qの対抗馬にはいいかもね
オープンでDEAEならBio-gelは結構使いやすいのではないかな

359 ：名無しゲノムのクローンさん：01/08/26 23:22 ID:snH/x2Vs

なにか裏技ないですか？
どんなことでもいいんです。
それが使えるかどうかわからないけど…。

360 ：名無しゲノムのクローンさん：01/08/27 03:55 ID:jhiPdBH2

なんでみんな、オープンにセファロースＦＦとか使うのかなあ。
高いでしょ、アマシャムファルマシアのレジンって。
皆さんのラボ、お金が使い切れないほど余ってるんですか？

俺はワットマンの５２系を使ってます。イオン交換の基本４種類は
全てそろうし、フローも早いし、何より安い。再生する必要なし。
使い終わったらどんどん捨ててしまえばいい。

・・・と思ってたら、最近SP52が生産中止！何ぃーっ！許さん！
SP53は粒子が細かすぎるんだよなぁ。

361 ：泥沼歩兵部隊：01/08/27 10:51 ID:rnhmDQKs

なるほどホワットマンですね
樹脂がやわすぎて、ちょっと？という気がしたので
最近使ってませんでしたけど、たしかにセファロース高すぎです
お金余ってませんので、必ず何度も再生して使っていますが、
手間も性能低下も考えると賢くないなと思ってます。
ホワットマンもういちど検討してみますね、どうもありがとう。
でもそういえばホスホセルロースP11は愛用しています。

362 ：名無しゲノムのクローンさん：01/08/27 11:37 ID:jhiPdBH2

基本的には、俺はレジンの再生は嫌いなので、なるべく安くあがるような
メディアが好みなんですよ。

Ｐ１１もよく使います。イオン交換としても、アフィニティとしても
使えるんで、ちょっと精製で壁に突き当たったときは、試す価値あり。
プレサイクリングがちと面倒なのがたまに疵かな。それと、Ｐ１１って、
他のレジンに比べて、やたら尾を引く傾向がない？　俺だけ？
カウンターイオンの交換速度が遅いって事かな。

うぅー、それにしてもSP52の生産中止は痛い。誰か、どこかの代理店に
500グラムボトルが残っているのを見つけたら、俺のために一本キープ
しておいてくれない？　（ってヲイ）

363 ：名無しゲノムのクローンさん：01/08/28 00:00 ID:AJ.oJI/c

ベッド５lのカラムはDE52で積んだけど、こんな馬鹿なことはいまはしないだろうね
ワットマンのものはあんましタンパクしてないようなとこにはよくねむってんだよね
期限切れで捨てようとしてんのもらってました　なんの期限なんだか
wakoのセルロースでもいいんじゃないの　同じだし
再生なんて　すぐできんだし、使いやすいと思うものを使うほうがいいとか
腕があればなんでもOKだけどね　固いモノだと腕関係ないし　きれいに積むこと前提だけ
どさ
P11でうまくいっちゃうと楽だよね　全くだめな場合も結構あるけどさ
HAも結構使えるよね　とくにセラミックタイプ　つまらないし
でも金があるなら　やっぱり　ファルマシア

364 ：名無しゲノムのクローンさん：01/08/28 00:39 ID:VIgelyAI

自分の精液からスペルミン精製して売りたいんだけど

365 ：名無しゲノムのクローンさん：01/08/28 01:27 ID:VhGpOMTI

トーソーのDEAE-Toyopearl650Mが一番。強度は高いし、流速も上げられる。
どんな溶媒を通しても膨潤しない。分離も大変良い。
高濃度塩溶液で洗って、オープンカラムの上面付近を詰め直せば繰り返しカラムを使える。
汚れが酷い場合には、界面活性剤とアルカリ処理、最後にメタノール80％で洗えば
必ず再生できる。

366 ：名無しゲノムのクローンさん：01/08/28 22:26 ID:I1v4bGog

トーソーのToyopearl 確かに使いやすいとは思う。
ただ、縮まないゆえに　長くつむとバックプッレッシャーが結構かかるのが難
私も愛用してました　さすが工業用で頑丈　

367 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/01 02:20 ID:pOlZpNFM

age

368 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/02 05:51 ID:xNRSOR32

今年からたんぱく精製をやることになった厨房ですが、
僕に「タンパク質の精製」とはなにか（心構えとかコツとか）
を教えて下さい。

369 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/02 12:47 ID:tP.DUmq.

>363
HAのセラミックタイプってどう？

370 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/02 18:23 ID:1WfxAeCk

HAって　つぶれやすいでしょ　つまりやすいし
セラミックタイプはその心配が少ない分楽
値段が違うけどね。

371 ：クローン大戦：01/09/03 01:31 ID:oiQb1QRk

明日は朝からMBP-蛋白を精製して参ります。
コールドルームに逝って来ます。

372 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/03 01:35 ID:8RFyjGtg

MBPって使いづらい。GST-融合タンパク質のほうがいろいろ便利では？

373 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/03 08:36 ID:oCHrngGs

>370
セラミックＨＡなんざ使ったことねぇぞ！　金持ち院生は逝ってよし！

うちはお金がないの・・・じゃなくて、そもそもＨＡでフローを上げなきゃ
ならんようなスキームを用いること自体に、どうも抵抗を感じるのは俺が歳
なのか。イオン交換の代替として使うには、癖がありすぎるだろうよ。

それに、ＨＡの利点のひとつは、（もちろんモノにもよるけど）イオン交換から
高ソルトで抜いた溶出液を、透析抜きでいきなりアプライできるってことだろ？
俺は、最後の最後、サイズエクスクルージョンかける直前に使うのが好きだな。

いつか、自分で焼いたＨＡ使って精製の論文書くのが夢。誰も再現できねぇ。ﾋﾋﾋ

374 ：クローン大戦：01/09/03 11:44 ID:oiQb1QRk

>372
GST-蛋白でやってみたもののnativeと同様の活性が見られなかったんです。
MBPだったらでるかなぁって思ってやってみます。今から超遠心です。
コールドルームに逝って来ます。

375 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/03 12:06 ID:dOOr.pos

和光のクロマト用高流速HA好きです。割と安いし！

376 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/03 21:11 ID:uRJ2NjKs

>373
時間かけられるものしか扱わないならそりゃいいだろうよ
>透析抜きでいきなりアプライできるってことだろ？
そう、時間かけらんないとか高い界面活性剤使うときとかすごく役立つ
ただ、高ソルトだけでおとせることもあるしさ

>サイズエクスクルージョンかける直前に使うのが好きだな。
これも同感　ちょっと重くして次かけてる
初期にバッチに使うのもありかと思うけど

HAにEDTA入りBuf.使う奴がいたのには驚いた　信じられないことするやつもいるものだ

377 ：369：01/09/03 23:06 ID:hkb5Brsc

>373
やっぱ、セラミックHAは高いか。。。
愛用してくれるなら数十グラム程度だったらあげてもいいけど。

欧米だとプロセスで数百キロ単位で買ってくれるけど、
日本は大型カラムがあまりないから商売にならん。

378 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/04 00:40 ID:12Ew2WMk

リン酸カルシウムの結晶だから、酸やアルカリにも弱いよね＞HA

379 ：373：01/09/04 05:07 ID:NcDI9Za6

>HAにEDTA入りBuf.使う奴がいたのには驚いた　信じられないことするやつもいるものだ

ﾋﾋﾋ　いるいる。ちったぁレジンのケミカルな分子構造に思いを馳せろやｺﾞﾙｧって感じ。
でも白状すると、俺も厨房だった頃、EDTAのことなんて気にせず使ってた。
1mMくらいだと、極端な影響もでなかった気がするが、きちんと比較とってないから、
でかいことは言えんなぁ。ま、若気の至りっつーことで。

>369
ありがと。でも輸送量の方が高くつくと思うんで、お気持ちだけで。材料屋さん？

弱い弱いと言われているが、そんなに弱いかＨＡ？　ｐＨ５以下にしないってのは
常識として、普通に蛋白質と遊ぶ分には、問題無いとおもわれ

380 ：369：01/09/04 06:59 ID:RXXdVv0A

>378
酸には弱いけどアルカリには強いです。NaOHで滅菌可能。

>379 （お気持ちだけで。材料屋さん？）
HAのメーカーです。毎日粉と遊んでます。
若干EDTA使っても粒子表面に変な錯体できないし、
ガンガン溶かさなければ分離にさしたる影響なし。
（EDTA使わざるをえないユーザーさんから依頼あって
検証やりました。）

>ｐＨ５以下にしない
最近はｐＨ５以下で使いたいっていうユーザーさんも
出てきたんでより耐酸性があるフッ素化セラミックアパ
開発中です。　来月出す予定。

381 ：373：01/09/04 08:20 ID:NcDI9Za6

>369
おおうっ、メーカーの人ですかい！そりゃぜひお友達にｽﾘｽﾘ。

常日頃疑問に思っていたのだが、Ｃａのかわりに他のアルカリ土類金属、
ＭｇやらＢａやらＳｒやらを使っても、アパタイトにはなるんだよね？
蛋白質を吸着させる上で、なんか違いがでる可能性ってある？商品として
売ってるのを見たことないんだけど、マーケットにはならないのかな？

それから、俺、無機苦手なんであまり突っ込まないで欲しいんだが、カルシウムと
リン酸を溶かし込んである溶液のアルカリ処理ってのが、ＨＡの合成法のひとつ
じゃない？その際に、リン酸イオンのカウンターとして何かバルキーなイオンを
使う事で、沈殿するアパタイトの原子間距離を変化させるってことは可能かな？
それができれば、同じ組成のリン酸カルでも、蛋白質に対する吸着度が変わって
くるはずだから、色々カスタムメイドなＨＡができて(ﾟдﾟ)ｳﾏ-だと思うんだけど。

いや、373にも書いたけど、いつかオリジナルなＨＡ焼いてみたいと思ってて。
ちなみに俺の興味はマイルドな条件下での水溶性蛋白質のクロマトなんで、
ニトリル系で溶出とか、そういったことはおいといて下さいな。今後ともﾄﾞｿﾞよろしく。

382 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/04 18:19 ID:nME7GX0Q

横から厨房質問でスマソ

質問スレ行きかもしれないけど、
「オープンカラム」の定義ってなんですか？
これの対義語はなんですか？

383 ：泥沼歩兵部隊：01/09/04 20:10 ID:5wQxBm5M

>382
うちでは「オープン」の反対語は「プレパック」です。
ともかくカラムに詰まった状態で売っているものは
すべて「オープン」ではないということで。
Bioradやアマシャムファルマシアのカラム管には、中圧程度に
加圧してクロマトグラフィー装置に接続するためのアダプタ付きの
ものがありますが、基本的にはそういうのもオープンだと思うん
ですが。
まちがってたらごめんなさい。

384 ：382：01/09/04 23:26 ID:nME7GX0Q

>383
ありがとうございます。

じゃあ両者の違いとしては
詰められた状態で売ってる「プレパック」が
クロマトにつないで高圧で使えて分離能が高く、
「オープン」てのは自分で担体を好みに詰めて
精製条件を検討するためのもんで
ふつーあんまし圧は上げられない、と。
こんな理解でよろしいですか？

タンパク精製の実験してる先生と先輩がよく
「これはオープンだからこういう条件で…」
とか熱くディスカッションしてるんですが、
たまに実験の材料取りのために
決まったカラム＋プログラムでだけクロマトを使う人間としては
そもそも「…オープンてなに？」
てなかんじでヨコミミで聞いてるもんで。

385 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/04 23:51 ID:NcDI9Za6

>382,383
えええ？　うちでは違うぞ。オープンの反対はやっぱりクローズドだろう。
プレパックだろうが、自分で詰めようが、密封して圧をかけるカラムは
全部クローズドだよ。ＨＰＬＣとかＦＰＬＣが高圧～中圧。ペリスタポンプで
ちまちまやるのがロープレッシャー。いずれにしてもクローズド。

うちでオープンといったら、文字どおり、密封してないカラム。上部がオープンに
なってて、自分でバッファを入れるタイプ。バッファは重力で落とす場合もあるし、
遠心かバキュームで引っ張る事もあるけど。ＤＮＡを放射性ラベルした後の
ゲルろ過カラムがその典型。あとは小スケールのニッケルカラムとか。Bio-Radから
出てるエコカラムだかポリパックだかいうディスポのカラムも、自分で詰めるオープン。

俺的には、バッチ＜オープン＜低圧＜ＦＰＬＣ＜ＨＰＬＣの順で、大掛かりというか、
金がかかるカラムという感じ。「オープン・クローズド」は「流速を気にしない・流速
がクリティカル」という分類だな。他のラボでは違うの？

386 ：369：01/09/05 20:47 ID:stCV1fzg

>381
Srのアパなら文献も出てますが、HAP,FAP以外はマイナーすぎて
あまり研究がされてません。よって上記以外の商品はなし。

>色々カスタムメイドなＨＡができて(ﾟдﾟ)ｳﾏ-だと思うんだけど。
可能性はあるけど、焼成温度変えるか表面形状を変えたほうが
手っ取り早いと思うんだけど。

387 ：369：01/09/05 20:53 ID:stCV1fzg

>HAにEDTA入りBuf.使う奴がいたのには驚いた

タンパク活性維持のためにprotease阻害剤としてEDTAを添加する場合が
あります。ごく微少濃度であればEDTA通液しながらでも分離可能。
（奨めないけど）
EDTA3mMで７C.V.までは耐えられます。
溶けちゃっても、細孔分布、結晶構造、官能基、表面形状に変化無し。

388 ：泥沼歩兵部隊：01/09/06 16:59 ID:xAUgqzps

>385
オープンの反対語がクローズドである、というのに基本的には
異論はないです。（＾＾；

＞　バッチ＜オープン＜低圧＜ＦＰＬＣ＜ＨＰＬＣの順で、
大掛かりというか、金がかかるカラムという感じ

これも原理的にはそのとおりなんですが、うちでは
HiTrapのXLシリーズとかresourceとか、プレパック・中圧・低分解
能高吸着とかプレパック・中圧・高分解なんてのが乱立してきてい
て、手間と金の点からも385さんの不等号列に下克上がおきつつあり
ますんで（笑

バッチ＜オープン＜低圧＜ＦＰＬＣ＜ＨＰＬＣ
　　　　　　　**************
　　　　　　　　↑
　　　　　　　この辺

でもって、カラムの専門家からは気合が足りないと怒られるか
もしれませんが、385さんも書いているBioRadエコノカラムは
もちろんオープンですが、仮にその上に加圧接続ユニット
をつけて「みかけクローズド」にしても、性能的にプレパック
中低圧を超えられないのです（泣
なもんで、うちでは自分でつめたカラムはふたがしてあっても
「オープン」と同じ扱いです・・・これはきっとSepharoseFF
なんかのシリーズでは、もともと高流速のため、加圧による分
解能改善効果が小さいからなんじゃないかと思います。
Toyopearlなどは使い方しだい腕しだいで分解能向上が望める
んじゃないでしょうか？　横レス、スマソ

389 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/08 20:22

FPLCは販売終了のようですね
うちでもオープンの反対語がクローズドです
>「みかけクローズド」にしても、性能的にプレパックを中低圧を超えられないのです
Toyopearlはプレパックも自分でつんでも大差ないですね
場合によっては２個つんで、本命は２つ目につけるなんてこともしますけど
精製パターンとしてはDEAEオープン　何か　Qのプレパック　なんてのでいいのでは
まあ、ゲル濾過なんかは大半は自分で積むしかないのですし、腕の見せ所だと思いますが

390 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/10 23:42

カラムたてるときたたくの？

391 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/10 23:46

はい叩きます。粒子を限界まで詰めてデッドスペースが小さいほど、溶出ピークが狭くなると聞いています。

392 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/11 14:04

乾式は叩くね
湿式は叩かないけど、良いんだよね？

393 ：393：01/09/18 03:57

タンパク質精製でこまってまーす。
細胞破砕をした際に分解物がでてきて分離できません。
目的タンパク質の分子質量は60kDaで分解物は43kDaです。
今までに試したカラムはニッケル、陽イオン、ハイドロキシアパタイト、
疎水性カラムです。何か良い方法はありますか？

394 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/18 12:51

蛋白質分解酵素阻害剤をかたっぱしからためしてみそ
PMSF
ベンザミジン
ベンヅアミド
ロイペプチン
アプロチニン
ペプスタチン
APMSF
E64
nアミノカプロン酸
EGTA,EDTA
ラクトシスチン
MG115

395 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/18 12:59

>>394
うちは、1stチョイスとしては
APMSF
Leupeptine
Pepstatin-A
E64
Phosphoramidon
のmixtureを使っている。EDTAは、まれに金属を必要とする酵素やレセプターの場合、
悪影響が出るので、使い方には慎重を期している。

>>393
Niを使ってると言うことは、His-tagか？
affinity tagがついてるなら、それでなるべくきれいにして、余計なタンパクの
邪魔を無くしてから、高分解能のカラムを使うように。
イオン交換とか、余計なタンパクがあるのとないのとで、全然分離が違う
ことは、ままある。

396 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/18 23:59

His-tagの位置をN末かC末に付け替えれば、部分分解産物はNiカラムに付かないのでは？

397 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/19 00:30

小っこい方がくっつく

398 ：　：01/09/19 09:00

>>396
この場合どうかはわからんが、どっちに付けても、His-tag付き切れ残りはやっぱり
存在することになるんじゃないのか？
結局、カラムにくっついてきそうな気が・・・

399 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/19 10:12

>393

正攻法的な解決法：それだけサイズが違うなら、ゲルろ過カラムで分離できる。
君の彼氏に「今度のクリスマスには、ファルマシアのSuperdex75が欲しいの」と
かわいらしくおねだりしてみる。

決定的な解決法：コンストラクトからやり直せｺﾞﾙｧ!
Ｎ末にHisタグ、Ｃ末にGSTくっつけといてカラム２本使えや。

本質的な解決法：そもそも部分分解してしまうような抽出の仕方が問題。
もっとマイルドな細胞の破砕法を試みる。

逃避：濃ゆいSDS/PAGEゲル（１５％ぐらい）を使って43kDaを流しきってしまう。
60kDaのバンドだけが残っている状態をボスに見せて「先生、精製できました！」

400 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/19 15:41

>399
warata

401 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/20 04:00

DFPいいによい

402 ：393：01/09/20 15:23

色々なアドバイス感謝感謝です。
とりあえず、がむばってみます！

403 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/20 16:09

ページの下の方にある加護のバナークリックしてくださーいｶｯｶｯ!
http://www5d.biglobe.ne.jp/~musume/

404 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/28 03:45

有料スレあげ

405 ：名無しゲノムのクローンさん：01/09/30 12:09

大腸菌由来の蛋白で50KDくらいのところに、めちゃめちゃ
histagによくくっつく強いバンドあるんすけど、これって
なんだか同定した人いませんか？
こいつをdeletionした変異体大腸菌をホストとして売り出せば
カネになると思うけど・・・
少なくとも私はかいます

406 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/04 12:01

優良スレあげPART2

407 ：でも好き。：01/10/08 16:38

とってもためになるレスなのであげておきますね。
また参考にさせていただきます。

408 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/08 17:06

名スレの予感

409 ：408：01/10/08 18:07

>>380
HAのカラムってバッファーにリン酸系のを使えって感じで書いてあるんですけど、Tris使っても構わないんですか？
リン酸バッファーだと安定性が悪いんで。
なんかリン酸カルシウムだから、リン酸バッファーの方が具合がいいんでしょうか？

410 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/08 23:04

>405
構造上無理っす。

411 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/11 19:49

GST融合タンパクが不溶性で出てきた人っている？
可溶化して、カラム上でトロンビンで切ったら、GSTも流れて来たんだけど、
対処法ってある？

412 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/11 21:58

GST融合タンパクが不溶性になってでてきた。
不溶性になったやつを精製した人っている？
可溶化して精製した後、トロンビンで切ったらGSTまででてきたよ・・・。

413 ：泥沼歩兵部隊：01/10/11 22:30

とある大腸菌内溶解度予測プログラムで予測すると、GST融合蛋白は
相手になにをfusionしても、大抵50%の確率で不溶性、というふうに
予測が出ます。
実際の感じでも、よほど小さいペプチド以外は、不溶性にいく確率が
高いような気がします。気を落とさずに頑張ってください。

なお、同じソフトで計算するとお勧めは、Thioredoxinです。これは
何をfusionさせても70-90%の確率で可溶性、という予想が帰ってき
ます。TRXはよいaffinityカラムがないのが欠点といえば欠点です。

なお、上記のソフトは
DL Wilkinson & RG Harrison, Biotechnology,1991 (9) 443 - 448
のデータに準拠しているらしいので、統計が古いという欠点は指摘されています。

414 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/11 22:39

↑
おもしろいですね。ちなみに、そのソフトを紹介していただけませんか？

415 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/12 10:35

>409
遅レスの上380でもないが、俺はいろいろなバッファをHAに使っている。
言うまでもないことだが、リン酸緩衝液に限らず、どんな緩衝液も、
最適な緩衝能を示す範囲が限定されている。蛋白質によっては、リン酸バッファ
ではバッファライズできないｐＨでＨＡを使いたい場合もある（主に塩基性の
上の方で）。ＥＤＴＡ濃度さえ気をつければ、TrisだろうがHepesだろうが、
全く問題無し。

もちろん、リン酸バッファが使えるｐＨの範囲なら、なるべくそっちを使う。
塩強度ではなく、リン酸の濃度勾配で溶出できるのがＨＡの最大の強みだからね。
溶出に塩濃度勾配を使うときもたまにあるけど、それじゃただのイオン交換と
あまり変わらない。

416 ：408：01/10/12 13:35

>>415
有難うございます。
俺の酵素、pH低いと失活するんで困ってました。（pH８から９までじゃないと圧倒的に失活する。）別のバッファでやってもイオン交換と同じような程度には使えるって事ですね。
一応HA使わずにアミノ酸シーケンス出来るくらいまで粗精製したんですけど、今度ちゃんと精製する時にやってみます。

417 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/13 01:07

>413
どうも。なるほど、そういうプログラムもあるんですね。
ちなみにその確立は個々の目的タンパクに依存性なの？
それともそのタンパク内のどこをリコンビナントにするか依存性なの？
どうしてもGST画分が除けないので、ゲル濾過してみることにしました。

418 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/13 01:42

>416
>pH８から９までじゃないと圧倒的に失活する。
それなら、ぎりぎりリン酸緩衝液が使える範囲内じゃないか？　Na2HPO4が
だいたいｐＨ９ぐらいだから。もっとも、緩衝能はかなり落ちるから、
少し濃い目（0.1M）ぐらいで吸着させてみるとか。

それと、確かにイオン交換のように使えはするが、同じような程度に、
ってわけにはいかないよ。塩濃度勾配だと、exchange rateが遅い
ので溶出時にブロードになるし、なによりＦＲが低い。イオン交換の
代わりに使うぐらいなら、まず他のイオン交換樹脂を試した方がいいかも。

419 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/14 12:13

>416
ファルマシアにきいてみたら？

420 ：でも好き：01/10/14 16:13

あげておきますね。
今日も日曜だというのに実験です。
しかもやっぱりアフィニティーに翻弄されている・・・
ConAアガロース経験者いませんかぁ！？

421 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/14 16:17

４２０＞
はーい！呼びました？

422 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 14:51

どなたか助けてください。
当方、pMALベクターを使い精製を試みているのですが、ミニプレップ、インサートPCR
であたりの物を培養しても、蛋白が発現してきません・・・マジレスです。

423 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 15:06

pMALの場合にはfusion partnerがそもそもでかいので
「発現しない」ということはふつうあまりおこりませんが、
あまり発現量自体が多くないので「発現してても見えない」
というケースはよく聞きます。

424 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 15:28

アクチン精製やっておられる方おられませんかー？
当方ただいま、
Isolation and Properities of Actin, Myosin, and a New Actin binding Protein in Alveolar Macrophages
という論文を読んで、遠心・透析のみでアクチンの精製を行っているのですが、
polymerize,depolymerize がうまく行きません｡
よい文献などございましたら教えていただきたいです｡
よろしくお願いします｡

425 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 16:02

横レスすいませんが、タンパク質工学を学ぶ上で参考になる本があったら、
ぜひお願いします。独学で学ぶ予定です。

426 ：泥沼歩兵部隊：01/10/15 18:56

古典的名著　江口至洋　「タンパク質工学の物理化学的基礎」
共立出版

これはいい本なのですが絶版になってどこでも手に入りません
もってる先輩で使ってないヒトから言い値で買う価値のある本
です。古本屋でみかけたら即ゲット

蛋白質機能の分子論　濱口浩三　学会出版センター
これも古い本ですが入門にはよいと思います。

蛋白質のフォールディング　原理・機構・応用
RHペイン　シュプリンガーフェアラーク東京
最近ではタンパク質工学そのものへの興味よりも
フォールディング機構に切り口のある本によい本が
あると思います。お勧めです。もう何冊か、最近出て
いるフォールディング関係の日本語の本もいちどご覧ください。

最後に今年の8月の蛋白質核酸酵素の増刊
「新世紀における蛋白質科学の進展」ですが、玉石混交と
いってしまうには玉のほうが多い、日本の蛋白質科学も
レベルが高くなったなあと思わせる本だと思います。特に
若い人たちの書いているところがどれも粒ぞろいに面白
いです。入門には向きませんし、構造生物学が大分はいっ
てますが一応お薦めしておきます。

427 ：泥沼歩兵部隊：01/10/15 19:08

＞４１４さん，４１７さん
大腸菌でのinclusion body生成確率を予想するソフトについて。
遅レスごめんなさい。いろいろ手を尽くしてみましたが、やはり
内部からのアクセスからしか受け付けていないようで、外部へ公
開しているサーバーの移植は現時点ではムリのようです（そもそも
当該の論文の作者に断りなしにつくってしまったらしいです、苦笑）
担当者は、私のいる組織を辞めてしまったので、誰かがどこかの
UGサイトにアップするまで、しばらくは公開の可能性はないみた
いです。

428 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/16 21:23

426さん、
お返事ありがとうございます。
私はフォールディングすら知らない厨房ですが、
大学院からタンパク質について学びたいと思います。
うちの大学の図書館ではお勧めの本は手にはいりそうにありません。
もしよろしければ、もっと他にも紹介してください。
返事が遅れた上にすいませんが、お願いします。

429 ：でも好き：01/10/16 21:32

＞４２１さん
上手くいった条件で再度試しても糖たんぱく吸着しませんでした。
レクチンが吸着能失うのってどんな時ですか？
もちろんゲルを凍結させたりスターラーで攪拌したり
ｐＨを５以下にさげたり８以上にあげたりはしていません。

430 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/16 23:02

>429
上手くいった条件、というのは詰め替えしていない同じカラムで、同じ（あるいはバッチ違いの同純度の）
サンプルを処理したのに吸着しなかった、ってことですね？疑われる事は多々あるのですが、そこはおいと
いて、質問にある「レクチンが吸着しなくなる条件（？）」としては、そうですね、レクチンもタンパク質
ですから変性してしまった、というのが怪しいのですが、どういう条件で使われているか不明なので、なん
とも言えませんね。あと、吸着条件は本当に前回と一緒？二価イオンを入れ忘れた！なんてことはない？
あとですね、例えば大腸菌の破砕液のようにエンドトキシンが大量にあるサンプルを流すなんてことを繰り
返すと、どんどんエンドトキシンなどの汚れが蓄積して、新たにサンプルをロードしても、もはや吸着できん、
ということも考えられますね。
時間に余裕があったら、もう少し条件詳しく教えて。それと、手っ取り早くは新しいゲルを調達しよう！その
方が前進するかもよん。

431 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/21 14:54

ちょっと、精製の話とはズレますが、
N末が読めないときって、どうしていますか？
EndHで処理すると分子量が小さくなった
タンパクが2つでてきたりして
(もとタンパク47kDa、EndH後、43と40弱ぐらい)
よくわからなくなってます。

432 ：424：01/10/22 16:41

まじで困ってます｡
どなたかアクチン精製法ご存知ないですか？

433 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/22 21:19

DNaseI のAffinity chromatographyでめちゃくちゃきれいになりまっせ。
試してみなはれ。

434 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/22 22:49

>431
>もとタンパク47kDa、EndH後、43と40弱ぐらい
糖タンパクなのね？２本のうち一本はEndHにコンタミしているプロテアーゼで
削れた可能性もあり。シークエンスしてみれば？あとN端がどうしても知りたい
の？エンドペプチダーゼで内部の配列を調べるってのはなし？ピログルタミル化
などの修飾ならいろいと切り出し酵素があるからタカラのカタログでも参考に
どうぞ。

435 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/24 17:44

>>424
DNaseIは粗精製ので良いからね。定量用のを買うと高いよ。
でも、なんでM-phageからとりたいの？
アセトンパウダーからとれば良いじゃんよ。こっちは失敗せんよ。

436 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/26 10:39

優良擦れあげ

437 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/27 08:55

age

438 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/31 02:28

あげあげ

439 ：　：01/11/01 22:10

あの、タンパク質のFoldingを解明するプロジェクトってのがあるんですけど、
どうですか？
http://www.rr.iij4u.or.jp/~kouwow/

440 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/03 04:43

age

441 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/06 12:36

失活したーage

442 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/09 10:29

皆様順調ですか？
私は不調です。
培養からやり直しになりそうです。

443 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/09 13:20

精製祈願age

444 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/09 13:50

こないだやったMono Qは、久々に会心のクロマトになった。
メインバンドだけピークになって、あとはずいぶん遅れてだらだらと・・・
あとゲル濾過一本で精製終わりそう！

445 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/15 00:45

くそー、何やっても失活する。

446 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/15 01:16

あのー聞いても良いですか？なんで、ゲル濾過したものの吸光度測るんでしょうか？
あと、sds-pageも最後に吸光度は測りますよね。吸光度の原理とやらを教えてやってください！！！

447 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/15 12:25

現在、とあるタンパクのＮ末を読もうと
手動エドマン法で格闘してますが、
ＨＰＬＣでアホほどピークが出ます。
これってそもそもサンプルの精製自体が不充分？
それとも過程の技術に問題がある？
だとしたら注意しないといけないところってどこ？
すでに2ヶ月近くやってます。
どなたか思いつく方、助けてください！！
いや、ほんとマジで。

448 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/15 14:06

>>447
いまどき手動で読んでいるとは。
シーケンサーが近くにないなら外注した方が早いよ。
サンプルは，SDS-PAGE->PVDF Blot->Amido Black Stainで目的のバンドが
見えれば量は十分、どうせSDS-PAGEにかけるからそこそこきれいならＯＫ。
あと、Ｎ末が修飾されていると読めないので注意。

449 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/19 23:30

俺はもうダメです・・・。
みなさんがんばってください。

450 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/19 23:36

どうした？
とりあえず話してみ。

451 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/20 00:13

>447
ＨＰＬＣでいろいろ出てくるのは試薬，チューブ，水あるいはサンプルへのこんたみでしょう。
サンプルの純度と量が少ない可能性があります。
むかし手動法をやりました。５，６本同時に反応を進めれば，シークエンサーより早くたくさんサンプルをこなせます。

452 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/24 01:46

ネタ切れ？
dat逝きになるのはもったいないのでage

453 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/24 07:43

　おととい友達が His-Tag の付いた失活した蛋白質を Ni-column に結合させて
カラム中で folding させて溶出したら活性が出たって喜んでた。これって、一般
的なの？もしそうなら、includion body の蛋白精製にいいなって思う。

454 ：しろうと：01/11/25 00:14

核酸を除去したいんですけど、
プロタミン硫酸やストレプトマイシンは使えません。
塩化マグネシウムでやろうと思ってるんですけど、
これってどのぐらい添加したら良いのでしょうか？

455 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/26 11:07

DEAEじゃだめなん？
>454

456 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/04 19:04

会心のクロマトの予定が機械の故障のおかげでお流れー
活性もお流れー
さよならー

457 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/07 07:19

１の電気泳動結果↓

　　　　　　　　　　　　＝
　　　　　　　　　　　　＝
　　　　　　　　　　　　＿
　　

458 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/07 12:41

モノはどれですか？
>457

459 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/07 13:09

上から、HSP70、培地のBSA、HSP47、目指すタンパクの分解産物、14-3-3の巻き込み

目的のタンパク質はCBBでは見えません。

460 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/07 13:10

＞?453
オンカラムまき戻しは運がいいとうまくいきます。
試してみる価値あり、です。
欠点は、うまくいかなかったとき、カラムごと
だめになることもある、ということです。
なのでプレパックのカラムで試すと助手に怒られます。

PEI沈澱は? > 454

461 ：ブンケイ：01/12/07 18:18

どんなタンパク質でも精製って可能なの？出来ないやつもある？？

462 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/09 03:49

精製できないことを証明するのは
タンパク質を精製するより難しい

463 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/09 14:42

>>462
なんか深いね・・・要するにどういう事？？

464 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/09 15:04

negativeなことを証明するのはとっても難しいということ、だけでは。
この遺伝子は、マウスには存在しません。というのも、以前は非常に難しかった。

465 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/09 16:07

ホウレンソウからRuBISCOを精製しただけで
「俺はタンパク質精製のスペシャリストだ！タンパク質精製なんてかんたんだ！」と
ほざく馬鹿がいた。

芯でくれ！

466 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/19 15:05

フラクション１,age

467 ：泥沼歩兵部隊：01/12/19 16:08

＞461
私の蛋白精製の師匠は、深夜低温室のなかで
ドカベンのテーマの替え歌で
「とれない蛋白があるものか♪」と
歌いながら、カラムをかけていました。
駆け出しだった私は、その背中に偉く感動しました。
修練あるのみです。

468 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/28 07:53

age

469 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/28 20:36

不溶性タンパクの可溶化に分子シャペロンを使ってみようと思うんだけど、
誰か使ったことある人いる？
またシャペロン遺伝子との共発現っていうのも考えているんですが、どうなのかな？
情報きぼーん。

470 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/29 01:47

>>469
なかなか難しいらしい。
俺の研究室の人は断念してた。

471 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/29 16:05

>>470
それは不溶性を可溶化してシャペロンぶち込んで、再生する方法？
それとも共発現？
あとシャペロン何使ってた？GroE使う予定なんだけど。

472 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/06 13:46

良いスレです。

473 ：ようやく就活開始Ｍ１：02/01/07 03:06

タンパクの精製が生かせる企業ってないかな。

474 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/07 11:37

多くはない。
だが製薬企業では、本当に難しい蛋白質(病態関連)が
できる人は喉からてが出る程欲しいらしい。
活性型の膜結合状態のレセプターやチャネルが
mg単位で精製できる、そして精製系を自分で開拓できる
人材だったら、すごく重宝される。

475 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/10 17:02

recombinantってやっぱり大腸菌で精製するしかないですか？
mammalianの遺伝子なのでやっぱりmammalian細胞でHisとかGSTタグを
つけた蛋白を精製したいですけど大腸菌みたいにはいかないのでしょうか。

476 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/10 21:48

横レスですが、タンパクの勉強をする際（研究の）、
どういった本を読めばいいですか？
大学院からタンパクのよていです。

477 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/10 21:58

>>475
mammalじゃないけど、せめてeukaryoteってことで
baculovirus系使ったinsect culture cellとかはどうよ？
初めてだとrecombinant virus作るのに
詳しい人に習いに行く必要があるかもしれんけど、
一度high titerのvirusさえ手に入れてしまえば
圧倒的に大腸菌よりラクだぞ。
His、GST、その両方を担いだベクターもたくさん売られてる。

478 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/11 21:31

バキュロは金かかるっていわれたことあるのでぜんぜん考えてなかったんだけど
そんなに楽なら今度やってみようかな。
今とろうとしてる蛋白、大腸菌だといっぱい分解産物出てきて全然作れなくて
困ってるんです。

479 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/12 16:48

>>478
「簡単」は、組み換えウィルスを作る段階までは当てはまらないと思うぞ。
>>477の言う通り、ラクなのはウィルスを取ったあとからだろう。
発現ベクターにインサートを組み込むまでは大腸菌と一緒だが、
1)昆虫培養細胞にtransfection
2)ウィルスのシングルプラークをとってくる
ってのは、やったことがないなら誰か経験者に習うのが無難だと思う。
ベクターができてから失敗がなければ２週間後くらい？には
ウィルスが取れるはず。

それさえできたら、
あとは細胞の植え継ぎの度にウィルス混ぜといてやるだけで、
３～４日後には目的のタンパクを大量発現している。
10cmディッシュ１枚で大腸菌500mlカルチャーよりよほど大量に取れたし、
大腸菌のように細胞のdensity測りながらIPTG足すなんてことしないでいいので、
俺の場合はバキュロに切り替えて非常に快適だった。
タンパク質によるんだろうけど。

施設はCO2はいらんから27℃で使えるインキュベーターがいる。
あと、金は確かにかかるかも。血清も必要だし。

分解産物ができるのか。
大腸菌の培養温度振ったか？低温で育ててみれば？
どうせバキュロを試すつもりがあるなら、
>>469あたりにもあったけどシャペロンと共発現てのはどうよ？
俺は最近やってないが、PharmingenだかInvitrogenだかで
共発現ベクターが出てるはず。

480 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/12 17:36

>>471
ラボの先輩がGroELを共発現をトライしてました．
可溶画分に来るようになるけど，その後どうやってもモノとGroELを分離出来なかったようです．
まあ蛋白の性質によるからやってみないと分からないけれども．

あと，インクルージョンボディに大量発現しているのなら，沈殿から6M尿素で変性させて
可溶化し，透析で尿素を除くとうまく巻き戻る場合がある．

>>476
蛋白質の実験一般なら，「蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武一編（南江堂）が良いと思う．
内容が古くさいけど，基礎項目が詳しく書いてあって，定法でうまくいかない場合に役立っている．

481 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/15 18:59

>>479
大腸菌は20℃でも30℃でも37℃でもふってみたけどどれもinductionして
一時間ぐらいからE.coliをWBしてみるともう分解しちゃうんです。
ほしい大きさのも存在はするのでN末とC末にGSTとHisつけたものを今作ってるし
あとスケールアップしてinductionを30分ぐらいにしてみようかなと考えてます。
シャペロンのキットはカタログ見たけどちょっと見つけられなかったです。
バキュロはキットの説明書(Invitogen Bac-to-Bac)
見る限り簡単にできそうに見えたのですが、、、

482 ：＞481：02/01/15 19:50

俺は同じ様な困難に直面している。
GST-欲しい物ーHisx6のコンストラクトを作るのもかったるいので
GST融合タンパク質をとりあえず精製して、大量にSDS-PAGEして
全長タンパク質のバンドだけ切り出して、電場で溶出、
アセトン沈殿してから、ウレアで可溶化、一晩透析しようかと思っている。

どうだろ？

483 ：479：02/01/15 21:43

>>481
ごめん、明らかに勘違いさせる書き方だった。
共発現ベクターってのは自分でインサート２つ組み込むの。
シャペロンがあらかじめ入ってる奴があるかどうかは俺も知らない。

俺がやってた頃はBac-to-Bacなんていう便利なものは無かったから、
確かにこれはラクかも。

484 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 00:39

Invitrogenから昆虫細胞用の形質転換ベクターが出ています(pXIN-DEF38, 39)。
バキュロは収量は多いし比較的短時間で出来ますが、３回も回せば確実に変異
が入ってしまうので、おすすめ出来ないと思います。

485 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 02:47

このスレは、
もしかすると、
これまで生物板に立てられたいくたのスレのなかでも、
１、２を争う、
超優良スレなんじゃないかな？

とキャリ夫風につぶやいてみたり。

486 ：>482：02/01/16 11:49

結局おいらはバキュロでもやってみることにしたよ。
今ゲートウェイ使ってるからそのままBac-to-Bacを使う予定。
バキュロウイルスって保存できないのかな？
保存できるなら変異が入っても大丈夫なのでは？

ゲルから切り出すステップは僕の実験の目的(活性が必要)には不適なのでだめです。

487 ：486：02/01/16 11:53

>486って書きたかったのに>って化けてしまいました。

488 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/16 13:29

>>484かどなたか、
バキュロで変異が入ったかどうかって
どうチェックすればいいんですか？
「３回回す」ってのは、passage 3ウィルスを大量発現に使うってこと？
passage 2ウィルスを大量に作っておいて
そっからちびちび使うのでもダメなんでしょうか？

489 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 04:36

>>480
不溶性で大量に出てるGST融合タンパクを8Mウレアに溶かし、
2Mまで希釈はできるのだが、完全に透析すると再不溶化する。
かといって、2Mのままカラム流すと結合はいいのだが、
トロンビン消化でGSTが一緒に落ちてくる。しかも同じぐらいの量。
どうも目的タンパクとアグっているようだ。現在配列から見直すことにした。

490 ：M2 ◆8fbZZkx. ：02/01/17 04:51

>>484,488
変異が入るのってウィルスを３回anplificationしたらって事ですかね？
うちは結構気にせず使っているような・・・・
モノによっては使っているウチに発現量がへたってきたりタンパクの活性が落ちてきたりします。
そんなときはまたstockしてあったplasmidからウィルス作り直します。
変異が入っているかどうかはウィルスからPCR出来ると聞いたことがあります。
たぶん組換え起こす部分の配列かなんかのプライマー使ってsequenceすればいいんじゃないでしょうか。

491 ：490：02/01/17 04:53

タイプミス。。鬱だ・・
amplification

492 ：文系学生：02/01/17 05:03

タンパク質を精製するとどのようなことがわかるんですか？
それは社会的にどのように役立つんですか？

493 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 05:39

>>492
悪いんだけど、そういう初歩的かつ一般的な質問は、質問スレにいって
やってくれませんか。ここはテクニカルな議論をする場所です。
せっかくの良スレを荒さないでください。

494 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 05:41

>>492
君、文系とちゃうでしょう！

495 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 16:50

>489
俺も不溶性のGST融合蛋白と遊んでいる。
8M→2Mの希釈のときrapid dilutionに
なっているかどうか検討したほうがいいと思う。
あとdilutionするバッファーに弱い非イオン性
界面活性剤をあらかじめ薄くいれておくというのが
常道である。なお俺はUreaではなく5M Gdnを
使っていろいろ試していたが結局sarkosyl法の
ほうが回収率がよいことがわかってショックを受けた。
sarkosyl法についてはGSTキットのマニュアルに
出ている。やはりマニュアルは良く読むべきだという
ことがわかってちょとガカーリ。

496 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 16:52

GSTダイマーの影響では？＞一緒に落ちてくる

497 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/17 23:12

>>495
rapid dilutionてなんですか？
厨房質問スマソ

498 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/18 01:52

>>480
GroEL発現ベクターって、市販されてるんですか？

499 ：489：02/01/18 03:20

>>495
rapidのほうがいいってこと？
一応いきなり希釈して、１時間ぐらいまわしといてる。
sarkosylはチェックしてみるは、さんきゅ。

>>496
DTT入ってても効果がないんだが、解決法ある？

500 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/18 12:51

>>489
pHを9ぐらいに上げてみる。
タンパク濃度を下げてみる。
とかも試してみてもいいかも。
俺もrefoldingで困っていたとき、この二つが有効だった。

501 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/20 01:59

GST-fusionでは不溶性だったが、MBP-fusionにしたら可溶性になり、
活性も検出できた、という話は結構聞きます。

502 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/20 14:35

チオレドキシン融合タンパクって作ったことある人いますか？
本当に可溶化するのでしょうか？
ＭＢＰは私の周りでは評判あまりよくないです

503 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/21 07:26

MBPはバルキーだからね。フォールディングが安定することが期待できるので、
特にＮ末端側につけるのが有効なことが多い。今まで失敗したことなし。
まあラッキーだっただけなんだろうけど。Hisタグみたいな小さなタグは
個人的に嫌い。目的が違うといわれればそれまでだが。

504 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/21 09:05

実際、Hisタグ << GST < MBPの順でfusion蛋白質は可溶化されやすくなる、
という文献はあるそうです。
また、市販のGST-fusionに使われているGSTは何故か日本住血吸虫由来ですが、
E. coli由来のGSTの方がはるかに高発現するそうです。

505 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/21 11:07

>504
日本住血吸虫由来……ってマジ？
当方pGeX 6Pシリーズを使っていますが。

506 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/21 12:28

http://www.apbiotech.com/stiboasp/showmodule.asp?nModuleid=164393

をみてください。
pGEX vectorsは全てSchistosoma japonicumのGSTを使ってます。

507 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/21 16:01

maltose Binding proteinは、それ自体異様に抗原性が高いので
抗体作製には向かないと思います。
寄生虫由来のGSTは、融合タンパクとして抗原に使ってもそこそこ良い抗体ができるようです。

508 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/22 17:14

age

509 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/22 22:00

抗体作成時はHis6以外のタグ、MBPやGSTなどはたいてい切り落とすでしょう。
それに抗原にするんだったら別に可溶化する必要はありませんから、MBPやGSTを使うのはbinding assayやその他の活性測定をするときじゃないですか？

510 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/22 22:20

不溶性のまま免疫すると、Westernにしか使えない抗体が得られる可能性が
高いです。
免疫沈降、染色に使える抗体が欲しい場合、可溶化して免疫した方がいいです。
運がよければ、機能阻害抗体を得ることもできます。

また、GST-fusionのまま免疫してもよい抗体が得られるのは、抗原が哺乳類
以外の場合が多いと思います。哺乳類蛋白質（特に種間保存性の高いもの）を免疫
する場合は、GSTを除去した方がいいと思います。

511 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/23 10:56

Schistosomaって日本語?で「ジストマ」のことだったんですね。
それにしてもこのスレは名スレッドだ、あげ。

512 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/23 11:42

>>510

そうなんですか。
それはいいこと教えてもらいました。
ありがとうございます。

アジュバントと混ぜてしまうと、不溶性のタンパクも（アジュバントに）
溶けてしまうのでわざわざ可溶化する必要はないと聞きました。
幸い、免疫沈降、染色にも使える抗体がとれましたが、これはラッキー
だったんでしょうね。

513 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/23 11:54

ん？別に不溶性のまま免疫しても免染に使える抗体になるよ。
ポリクロなら精製度の方が問題だよ。
モノならELISAの抗原は可溶化したのを使うからそこでセレクション出来てる。

514 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/23 17:48

>>510,513
抗原が不溶性だろうがなんだろうが
Westernだけでなく免染にも使えるか、といった抗体の能力は
ほぼ運任せな気がしてるんだけどそうでもない？

以前金がなくて外注できなかった時、
不溶性の組み換えタンパクをSDS-PAGEのゲルごとアジュバントに混ぜて
ウサギ２羽に自分で打って自分で採血して抗血清を得て、
全く同じ様にaffinity purificationをしたのだけど、
片方はWestern以外は全く使えず、
もう片方は免染や機能阻害にも使えたことがあった。

可溶化されたタンパクを打ち込んだほうが
いろんな用途に使える抗体になりやすいってことはありますか？
そのような差を経験をされた方はいらっしゃいますか？

なんかタンパク精製の話題からビミョウにズレてきた気もするが、
きっと抗原精製してる人もいるだろ、あげ。

515 ：513：02/01/23 20:08

「運任せ」・・・その通り！！＞514
俺もそう思ってる。
ちょっとズレ過ぎな気もするのでさげ！

516 ：510：02/01/23 23:47

　SDS-PAGEで目的タンパクを切り出し、免疫すると、Westernにしか使えない
ことが多い、という話はよく聞きますし、数年前の実験医学や幾つかのラボの
ホームページにのってます。514の方は日頃の行いがいいのでしょう。

　どうしても不溶性ならば、inclusion bodyをTritionで洗ったのち、PBS中で
sonicationし、アジュバントと混ぜるといいと思います。免疫沈降や免疫染色に
使える抗体が得られる可能性はあります。ただ、ポリクロをaffinity精製する時に、
できれば可溶性抗原を固定化したカラムを使った方がいいですので、やはり可溶性
タンパクは欲しいところです。おそらく514の方はSDS-PAGE後transferした
membraneでpurifyしたのかと思いますが、得られる抗体の量がケタ違いです
（一連の実験で精製抗体のロット差はできれば避けたいのですよね）。

　運任せでは困るような場合、精製度の高い可溶性抗原を調製し、しっかりアジュバント
（できればFreundとRIBIの両方を試す）と混合してエマルジョンにし、血清をaffinity精製
すれば、affinityとspecificityに優れた抗体が「確実に」得られると思います。

517 ：510：02/01/24 00:06

補足です。
免疫染色に使えるか、という点ですが、免疫組織染色の場合、in situ
hybridizationとの比較から、目的蛋白質を染めているかどうかの大まかな
検定は容易だと思います。

免疫細胞染色で、細胞のどこに局在しているか、ということを正確に知る
のは、かなり難しい問題です。核、中心体、スピンドルなどはnonspecific
に染まりやすいので、そのような部位がそまった場合には簡単には信じて
もらえません。同一タンパクの異なるdomainに対する抗体で共通のパターン
を示すとか、mycタグ付きタンパクを発現させ、anti-mycで染めても同様
であるなど、色々やる必要があります。

という訳で免疫染色できる抗体がとれた、と判断するには十分なデータを
とるべきだと思います。

518 ：514：02/01/24 11:27

>510様、ご丁寧な解説ありがとうございます。
確かにmembraneでaffinity精製しました。量は確かに少なかったですね。
日頃の行いはさておき、かなり僕のケースはラッキーだったようで。

もしできましたら実験医学の年・号と、
「幾つかのラボのホームページ」がどこらあたりか
教えていただけると幸いなのですが。今後の参考にしてみたく。

519 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/24 12:14

アクリルアミドゲルから切り出すとウエスタンにしか使えない場合が多い
と言う人もいるが、どうでもいいという人もいる。
抗体作りが始まって以来、未だに王道がないということは「やっぱり
最後は運任せ」ということではないか？

520 ：510：02/01/24 13:09

実験医学でSDS-PAGEで目的タンパクを切り出して免疫する方法が記載されて
いたのは1995～1997の間だと思うのですが、分かりましたら連絡しますね。

ホームページとしては京都大学ウイルス研究所の上村研究室の「上村さんの
雄叫び」コーナーが最も面白くてお勧めです。

なお、membraneでのaffinity精製は以下の２点からもお勧めではありません。
１）membrane上での目的タンパクのrenatureは部分的である可能性があり、血清中
の立体構造を認識する（つまり免疫沈降等に有効な）抗体が吸着しない可能性がある。
２）membraneにtransferされた蛋白はcovalentに結合している訳ではないので、
抗体を溶出する際に抗原もはがれてくる可能性がある。この剥がれた抗原は精製抗体中
の最もaffinityの高いものと結合してしまうことになるので、かなり邪魔になります。
calmodulinなどはmembraneから剥がれやすい蛋白の代表です。

521 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/24 18:39

最近ナカライが売り出した高純度精製SDSは、すくなくとも
ザイモグラフィーなどでは、SDS-PAGEで分離した蛋白質をゲル中で
SDSを除くことでrefoldingする成功率があがっているそうです。
不純物の長鎖スルホネートが活性阻害の原因だったそうです。
(ナカライカタログみてください)

ってことは、SDS-PAGEから切り出した蛋白で免疫するときにも
「いい抗体がとれる」かもしれない、と思うのですが。

522 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/24 19:43

>521
アマシャムのplusone SDSではどうなんだろ？

523 ：510：02/01/24 20:36

>518様、
実験医学はバックナンバーを調べただけなのですが、1997年、No.6
（5月号）、p669みたいです。1996年かも知れません（図書館から
帰ってくる間に忘れてしまった）。

ナカライの高純度SDSというのは、MB gradeというCalbiochemが
製造元のやつですか？　カタログが手許にないので、オンライン
カタログしか見てないのですが。随分高いですね。SDSを除いて
refoldさせるのはどういうプロトコールなのでしょうか？

524 ：514=518：02/01/24 20:48

>510様
ご丁寧にありがとうございます。探してみます。
「上村さんの雄叫び」、
抗体作製以外にもタメになることがたくさんありますねぇ。
うちのボスにも、どうせウェブサイト公開するなら
あれくらいやってくれと言ってみよう…。

御礼のみにてsage

525 ：510：02/01/26 03:43

過去のレスを見ていて、幾つか思ったことを列挙します。

１）融合タンパク質からThrombin, Factor Xa, PreScission proteaseなどで
　切り出すというステップは重要ですが、各Proteaseの切断認識配列の特異性
　という点では、
　　Factor Xa > PreScission Protease > Thrombin
　の順だそうです（Amershamの担当者から直接聞きました）。PreScission Protease
　は8アミノ酸配列を認識することになっていますが、アミノ酸置換があっても切れてしま
　うので、結果的に4アミノ酸配列を認識するFactor Xaの方が配列特異性が高くなる
　そうです。Thrombinの認識はルーズなので、目的タンパクも切断する可能性があります。

２）Factor Xaがカルシウム要求性のproteaseであることは意外と知られていません。
　また、Factor Xaの活性中心はS-S結合しているので、DTTやグルタチオンなどの還元剤
　として働くものがあると活性が阻害されます。という訳で特にGST-fusionならば、
　切断前に透析かPD10などでEDTA, DTT, グルタチオンを除く必要があります。
　Factor XaはGST-fusionの1/100から1/300位の少量を加えるだけでOKで、2 mM
　CaCl2存在下ならon iceでも1 hrからONで完全に切断できます。

３）MBP-fusionはFactor Xaで切るvectorが一般的ですが、NEBが最初に販売したvector
　では、Factor Xaの認識配列の直前がprolineになっていて、その場合Factor Xaは非常に
　切断しにくくなるそうです。最近販売しているvectorでは「こそっと」prolineをglycine（多分）
　に置換しているので、古いvectorで切れないとお困りの方は新しいものに買い替えることを
　お勧めします。

526 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/03 00:03

なかなか良スレなので保守age。

527 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/03 00:50

>>520
「上村さんの雄叫び」
おもろすぎ。

528 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/03 10:45

>>525 Factor Xa値段高過ぎ。

529 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/04 23:07

age

530 ：510：02/02/05 00:15

>>528
>Factor Xa値段高過ぎ。

確かにAmershamで販売しているFactor Xaは値段が高いですが、
NEBや伊藤ハムのFactor Xaはそれほど高くないです。

531 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/07 02:15

トロンビン使ったけど、切れたよ。
見事にGSTが切れてた。
なんでだろ？運がよかったから？

532 ：510：02/02/07 02:36

よかったですね。
トロンビンの使用上の注意点も、525の2)と同様です。
個人的には、切断認識配列の特異性がやや低いので（Amershamのハンドブック
に詳細があります）、多めにトロンビンを入れると目的タンパクも切ってしまう
ことがあるので、あまり好みではありませんが。

目的タンパクだけを単離するのが目的ならば、GST-fusionをグルタチオン-Sepharose
に結合させたまま、トロンビンを加え、遊離してくる切断された目的タンパクを回収
する方法が便利ですよ。GSTが殆ど混入しません。トロンビンはbenzamidine-Sepharose
で除去するのが簡単です。

533 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/07 12:45

>532
GSbeadsに目的タンパク質をくっつけて、トロンビン加えて、
GSTだけを切り離そうとしたが、駄目だったんだけど。
532さんは成功したの？

534 ：510：02/02/07 13:00

>>533

GSbeadsにGST-fusionを結合させた後、20mM Tris-Cl, pH8.0, 150 mM NaClで
よくwashした後、final 2 mM CaCl2とトロンビンを入れて、4℃で数時間
rotationしたら大部分がGSTから切り離されて目的タンパク質を得ることが
できました。

beads中での反応のため、溶液中での反応よりも効率は悪くなります。目的タンパク質を
回収した後、グルタチオンで溶出させると、切断されたGSTと共に、切れなかったGST-
fusionも一部回収されました。

533さんが失敗した可能性としては、525の2)にあるようなFactor Xaやトロンビンの性質
に注意していなかったか、切断されたとたんに目的タンパク質が不溶化した可能性が
考えられます。

535 ：533：02/02/07 13:30

>>534
丁寧な返答どうもありがとうございます。
50mMTris-HCl、150mMNaCl、2.5mMCaCl2のバッファー中で4℃、O/Nで
トロンビンを作用させたのだけどうまくいかなかったんですよ。
しかし、目的タンパク質を含むtotal proteinにトロンビンを入れたら
GSTが切断されうまくいきました。
この理由が分からないんですけど、534さん分かります？

536 ：510：02/02/07 18:41

>>535様

私も似たような経験がありますが、534で書いたように、切断後の目的
タンパク質の不溶化ではないかと思います。GSTの可溶化能はかなり
高いとされています。

「目的タンパク質を含むtotal proteinにトロンビンを入れる」という操作
がよく分からないのですが（他にも様々なタンパク質が混ざっているという
ことですか？）、この場合でも反応後にサンプルが濁っていたように感じ
ませんでしたか？　または、遠心しても切れた目的タンパク質がsupにくる
ことを確認されましたか？

537 ：533：02/02/07 20:17

>>536
total proteinはほかのいろいろなタンパク質が混ざってる画分です。
そこにトロンビンを入れました。遠心して、切れた目的タンパク質が
上清にあるのも確認しました。いまだに、理由が分からないんです
よね。実験的には成功したからOKなんですが、運がよかったのです
かね？536さん長いレスありがとうございました。

538 ：おくづみ公一：02/02/07 21:25

ありがとうございました！

539 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/13 14:27

533>
GST融合タンパクを結合後一度エリュートしてからなら切れるの？
単体結合しながらのトロンビン反応時間は何℃でどれくらいやったの？

540 ：膜にぞっこん：02/02/16 12:37

膜タンパク対する抗体を作ろうと試みています。それで大腸菌でPet系で
発現させています。今回は細胞外のみの領域で発現させたのですが、
不溶化します。この場合、N末にHIstagでつけたのですが、N末ではよくないでしょうか。
C末の方がいいのでしょうか。シグナルペプチドはのぞいた方がいいのでしょうか。どなたか
アドバイスお願いします。

541 ：びたみん：02/02/19 15:27

赤血球をSDS-PAGEのサンプルとして流したいのですが、
超音波処理してもサンプルバッファーに溶けない場合はどういった処理が有効ですか？？

542 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/19 16:18

>>541
（テフロン）ホモゲナイザーとか使ってみれば？

543 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/19 16:35

digitoninを少量くわえるというのは?

544 ：びたみん：02/02/19 17:11

542,543さん、助言ありがとうございます。
界面活性剤を加えてみまして、一応、溶けた状態になりました。

545 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/20 12:13

遅レスでスマソ

>>498
>GroEL発現ベクターって、市販されてるんですか？
　市販されてるかどうか知らないけど
Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin.
J Biol Chem. 1995 Oct 27;270(43):25328-31.
の著者にFAXかメールで頼めば送ってくれるよ！

546 ：498：02/02/21 00:19

ありがとうございまーす。
主なメーカーを調べた限りでは市販はされてないようです。

教えていただいた文献見てみます。>>545

547 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/22 16:08

あげ

548 ： ◆1UpIAw2U ：02/02/22 19:53

あげ

549 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/26 23:53

whole cell extractからタグ付きタンパクだけを
精製する時、皆さんはどういうステップを踏みますか？

550 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 01:06

age

551 ：おしえてください：02/02/27 07:52

牛の脳からタンパクをとろうと思ったら「今は焼却処分のため研究用といえども渡せない」といわれ、凹んでいるタンパク初心者です。

しかも、今の牛臓器はすべて狂牛チェックをうけてから出されるので屠殺後、２日はたってます・・・。

ある筋の情報では、２も日たった牛の臓器のタンパク質はほとんど分解されていて古い牛１ｋｇと新鮮なラットの臓器１匹分は同じくらいだ、とのことですが本当でしょうか？

臓器の違いなどで諸説あるかと思いますが、ご教示願います。

552 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 10:09

＞551
とさつ後２日はちょっとｷｯﾂｲですね。
定量的なことはわからないのですが、
ブタではとさつ後、数時間経った精巣からはRNAをとることができませんでした。
とさつ後、冷凍を頼めれば、解決できると思います。

553 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/27 20:21

>>551
ウシの眼球も手に入らなくなってしまったし、いい迷惑だな。

554 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/05 00:32

学部からポスドクまで使える優良スレですね。
あげておくです。。

555 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/05 01:47

>>551
芝浦臓器にバイクとばした日々を思いだしたよ。
仔牛買ってその場で屠殺処分くらいしか思いつかないな。

556 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/05 02:50

ドナドナ子牛を買ってその場で屠殺ってか？

557 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/05 10:39

てことは膜蛋白質の構造生物学系や光生物学系のラボは大打撃って
こと?

558 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/06 18:42

SDS-PAGE後のゲルからバンド抽出で精製したいのですが、活性を保ちながら抽出できる
何か良い方法がありましたら教えてください。

559 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/06 19:33

眼球・・・視神経・ロドプシン関連やってる方にはいい迷惑ですな。

560 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/06 21:48

今までは吸着していた陽イオン交換カラムに突然吸着しなくなりました。
ｐＨも塩濃度も問題ないのですが・・・イオン交換カラムってそうそう
だめにはならないだろうし・・・しかも疎水性カラムしたあとなので
やたらめったらタンパクがあってオーバーロードしたわけでもなさそう・・・
はぁ・・・カラムコワイよぉ

561 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/07 19:15

>560
ものはなんなんだ？

562 ：＞560：02/03/07 19:45

＞イオン交換カラムってそうそうだめにはならないだろうし・・・
SP-sepharose はともかくphosphoro-cellurose (P11)は
わりと簡単にだめになるよ。

563 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/10 12:24

遅くなりました。御指導有り難うございます＞５５３，５５５
私も死馬裏雑木に通っています。

564 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/10 12:29

イオン交換で塩で溶出させた後、電気泳動でチェックするとき、
高濃度の塩で溶出したフラクションの泳動はどうしてますか？

質問の意味は「２×サンプルバッファーで炊いたら塩が析出するときみなさんどうしてますか？」ということです。

なんかの本で、塩濃度は120mM以内でと、書いてあったのですが、高濃度の塩で、バンドが見えなくなったり、バンドが乱れたりしますか？

厨房で済みません。

565 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/10 13:37

＞５６４
マイクロコンで脱塩してから電気泳動をかければそんなことは
なくなりますよ！

566 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/10 19:27

＞５６４
透析すりゃ　いいわけだけど、
荒技は泳動したあと、塩が少しういてくるところを回収しちゃう
ういてくるってのはちがうか　サンプルよりゲルにはいるのは遅い部分
みてれば　タイミングはわかるはず　こんな手は本命ならつかいません

＞560
陽イオン交換カラムの再生の問題じゃ　　アルコールでも洗ったの？

567 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/10 22:56

>565,566 ありがとうございます
マイクロコンも良いのですが、サンプル数がかなり多いため、経済的な方法を考えています。

５６６さんの荒技についてもう少し詳しく教えていただけますか？泳動した後ってあたりからわかりません。是非教えてください。

568 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/10 23:54

>>564
目的のタンパクが検出できるなら希釈するのがいちばん簡単。
あと、トリクロロ酢酸で沈殿させて塩を除く方法もある。
ただし沈殿をそのままサンプルバッファーに溶かすとｐHが低すぎて泳動が乱れるので
トリスか何かを加えて中和する必要がある。

569 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/11 02:08

>>568
70%エタノールで洗ってからサンプルバッファーを入れると良い。

570 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/11 10:35

TCA precipitationのあと70%EtOH洗浄というのはよさそうな
アイデアですね。

571 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/11 10:49

ちんこしごくとたんぱく質でるよ

572 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/12 00:40

サンプルＢで95℃でボイルしたあと、時間をかけずに（冷めないうちに）ゲルのウェルに強引に流し込むのも手。

573 ：564：02/03/12 00:41

みなさん、貴重なお話有り難うございました。

574 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/12 01:03

>569
アセトンとどっちがいいですか？

575 ：564：02/03/12 06:05

＞569,574
洗ったときのサンプルのロスって無いのですか？

576 ：七誌：02/03/12 08:24

>568 Trisを中和せずに作ったサンプルバッファー使うとよし。

577 ：?m：02/03/12 16:54

＞568
最終濃度5%のTCAでも沈殿しない蛋白質も、たま～にあるんで注意。

＞574、575
アセトン洗浄しかやったことないが、ロスはほとんど気にしていない。
基本的に定量的に回収できると思う。沈殿がアセトン中で舞う位に十分
洗わないとダメだけど（TCA除去が不十分だと、サンプルバッファーを
加えた時に溶液が黄色くなり、泳動パターンも乱れる）。

不溶性のTCA沈殿の洗浄にエタノール70% を使うと、一部のサンプルが
可溶化するような気がするので、アセトン洗浄がベターだと思うが、
どうだろう（モノの本ではアセトン洗浄の説明しか見たことない）。
誰か詳しいヒトいない？

578 ：569：02/03/12 21:27

沈殿が多いときには自分もアセトンを使う。
でもパウダーを吸わないようにするのが苦手なのであんまり使いたくない。

カラム通した後のサンプルで、そのあと単に泳動してCBB、
ウェスタンするぐらいなら沈殿の量はたいしたことないはず。
なので巻き込んでるTCAも少ない。
70%エタノールは最初は単にアセトンのにおいがダメなんでやってみた。
パウダーを吸ってしまう心配をしなくていいので、サンプル数が多いときにも楽。
しかし、エタノールをちゃんと飛ばさないとサンプルがウェルに入らない。

確かにものによってはロスがあるかもしれない。
でも今のところCBBやウェスタンで特に影響があったということは無かった。
ウェスタンやったタンパクは10種類くらいかな。
もちろん全てのサンプルに当てはまるとは思ってない。
しかし、TCA沈殿なんてそう可溶化するものじゃないと思う。

579 ：厨房です。：02/03/13 11:47

ある遺伝子がとられたとき、「○○の酵素とホモロジーが高い」と
報告されて、それがNCBIのデータベースとかにも
「○○酵素のドメインをもつ。」と記載されているものを研究しています。
しかし、実際にこのタンパク質の活性をだれもはかっていなく、
あることから（ホモロジー）報告されている活性と違う活性があることが
わかりました。
こういう事って多いですか？

580 ：でも好き：02/03/13 19:55

きっとまたお世話になる板なのであげさせていただきます。
読んでいるととても勉強になります。（ぺこり）

581 ：泥沼歩兵部隊：02/03/13 21:41

>579
そういうことは時々あります。多くはありませんが。
そして、君はタカラの山を見つけたのかもしれない。
新発見かもしれません。頑張ってください。
ただし、君の発見を成果として世に問うにあたっては
「すでに○○とされている活性とは別の活性があるとは
信じられない。実験的なアーティファクトでは？」という
反応が当然予想されますので、そうした反論を一つ一つ
確実にツブしていけるだけの、しっかりした証明実験を
こころがけましょう！とりあえず、おめでとう！

582 ：579：02/03/13 22:56

>581
最近２チャンネラーになった漏れは、
まずこのスレを端から読ませていただきました。
このスレでよく出てくる泥沼歩兵部隊様からの
メッセージをいただき、
嬉しく思います。
がんばります。
では、結果の報告をお待ちください。

583 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/13 23:36

http://www.human.or.jp/images/cm07.jpg
この生物の名前を教えてください

584 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/14 00:45

ヒトですな。

585 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/14 22:20

そんなことはどうでもよいのだ。
おれも蛋白をがんがん精製するぞ!

586 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/15 02:27

inclusion bodyのリフォールディングに
実際にHSP(GroEL etc)使ったことある人いる？
使うくらいなら収率無視した方がいいのかな？

587 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/15 04:36

age

588 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/18 21:45

大腸菌ではどうしても蛋白取れないので昆虫細胞でとることになりました。
そこで教えていただきたいのですが昆虫細胞でnativeに蛋白発現させる時って
哺乳類みたいにKozak配列に相当するものはわかってないのでしょうか。
なにも考えずにATGから入れたらちゃんと全長発現してくれますか。

589 ：588：02/03/18 22:11

original polyhedrinのATTからフレームをずらし-3にAをいれるってのでいいのかな？
1997年のcurrent protocolに書いてあった。5'UTRは短いほうがいいらしい。
あとはやってみないとわからないだって。

590 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/19 02:56

あの、哺乳類だとATGから入れただけではだめなんでしょうか？
一般に必要なものは発現ベクターの方に入ってるのかと思ってたんですが。

591 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/19 11:17

まあそれで問題ないならそれでいいんじゃない。
先頭のatgにはkozakいれるのが普通かと思うけど。

592 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/19 13:50

マイクロコンを買うお金もないので、今まで透析＋凍結乾燥で脱塩濃縮をやっていた
TCA沈殿で塩が除けるなら今度やってみようかな

593 ：Ｘ：02/03/19 16:44

＞592
TCA沈殿による脱塩は、あくまでもSDS-PAGE用、つまり標的蛋白質が変性しても
構わない場合であって、ネイティブの蛋白質が必要な場合には向かないと思わ
れる。透析＋凍結乾燥が目的ならダメだろ。

594 ：esumi：02/03/19 17:20

http://rumi-music.com/
http://rumi-music.com/
http://rumi-music.com/
http://rumi-music.com/
http://rumi-music.com/
完成してきてる。

595 ：さよなら：02/03/20 00:18

>586

俺はやった事あるよ。
でも、基質も酵素もuMレベルだとせいぜい3倍くらいかな。俺の場合。
もっと高濃度にしたら分からんけどね。
シャペにHisTagつけて、Ni-affinityカラムの中でやってみない？

596 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/20 15:51

GST融合タンパクの後ろにPCRでC末にHisタグ付けようと思うんだけど、スペーサーとか必要ですか？
あと、Hisって６個以上付けてもいいのでしょうか？

597 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/20 16:52

C末タグのベクターのサイトマップを参考にしてはいかが？
Hisが多いベクターを何処かで見た気がするが。。。
ウェスタンの感度と精製度は上がるでしょうね。
3xFLAGのベクターのウリはその辺だった気がする。

うう。。どれも中途半端な答えだ。。
役立たずでスマソ。。

598 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/20 20:24

あまりHisが多すぎるとeluteしなかったりして

599 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/23 18:28

スペーサーは、できるだけつけない方が良いと思う。
理由は、tagをつけやすいコンストラクションより、
できるだけnativeに近い配列を持つものの機能解析を行うほうが大切だから。
後々、いろいろなvectorにつなぐことも予定しているのなら、それとのかねあいを考えた
プライマー設計をした方がよいと思います。

600 ：７７４：02/03/24 01:44

我々人間が牛や豚、鶏などの獣肉を食べる事は間違っている。魚を食べる
事も間違っている。牛や豚、鶏などの動物は我々人間のコンパニオン・
アニマル(共生者)であって、決して食べる対象ではない。肉食は身体に
著しく害を及ぼす。我々人間が完全なベジタリアンになるならば我々の
健康は百パーセント保証されるのである。我々人間は果実や野菜を食べて
生きていくのが最も自然なのである。しかし現実を見ると、我々人間は
当然の事であるが如く、肉を食べ、自ら健康を損ねている。肉食時の便や、
屁は強烈に嫌悪すべき悪臭を放つ。これは肉食そのものに対する我々への
警告であって、肉食はしてはならないということを示唆しているのである。
我々日本人は即刻、肉食を止めてベジタリアンにならなければならない。
古来日本では、仏教の戒めにより肉食を禁じてきた時期があった。しかし
ペリー来航後、明治期の文明開化により我が国には「すき焼き」などの米英
の慣習が伝わった。本格的に肉を食べるようになったのはそれからである。
魚肉食を止めよ。

601 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/24 02:18

今度自分でリコンビナントを作製しようと考えております。
FGFの新しい分子です。以前にPharmaciaの系でGST融合タンパクは
作った経験はありますが、それだけの遺伝子屋です。
そんな私でもできそうな系を教えてください。

602 ：596：02/03/25 15:22

>597-599
アドバイスありがとうございます。
スペーサーつけづに、普通に６Hisでやってみます。
私もHisがいっぱいついたベクターを見た記憶はあるのですが、どこだったかな・・・。
他にHisいっぱい付けた経験のある人いたら教えて下さい。

603 ：泥沼歩兵部隊第3小隊：02/03/27 23:37

>>601中隊長どの

Pharmaciaの融合系は未だに現役で、特にプルダウンなど機能解析
も行うのであれば依然としてよい選択肢の一つであります。
なお、従来よりもタグと目的蛋白質の切り離しが改良された
Precision proteaseのサイトを入れたものなどがよいと思われます。
しかし、NovagenのpET系plasmidもチオレドキシン他の融合
発現系が多く出ており、使用目的によっては他にも選択肢が多い状況と
なっております、Novagenの最新カタログを御入手ください。

なお、本小隊は久しぶりの遺伝子ワークに苦戦中、pGEX-2TへのT-vector
からの載せ換え失敗で戦線後退中。。。泥沼より貴部隊の検討を祈る。。。
オーヴァー

604 ：?A°?a`?D?《：02/03/29 15:09

またお世話になります

605 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/09 23:13

?ﾕ

606 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/11 08:58

Facter?ｨaを使って精製をしているのですが、酵素量を増やしても反応時間の条件決めをっやっても
融合タンパクの量が多く、なかなかピンになってくれません。マニュアルの量に対して
1.5倍量の酵素と6時間の反応系でやっているのですが、どなたか良いアドバイスをお願いします。

607 ：通りすがりのもの：02/04/12 02:51

＞６０６
立体障害で切れないこともあるから、リンカーの長さを調整したら？
あとは、温度を上げたり、弱い変性剤の存在でやってみるのも良いかも。
＞５９６
F１上のアクチンをぶん回すのに、スライドガラスに固定化するためにHisタグが
１０くらいついていたような気が....

608 ：ＦＧＦ中隊長：02/04/12 02:59

泥沼歩兵部隊第3小隊殿

報告ご苦労であった。第３小隊からのＳＯＳ信号にもかかわらず、随分レスをせずにおった件勘弁されよ。
Novagenは試したことはないが、明日是非カタログを見てみようぞ。

第３小隊殿もこの先ご武運があるように祈っておるぞ。

609 ：510：02/04/12 07:39

>>606

525を見て下さい。

610 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/12 09:11

0.1% SDS boilと6M Guanidine HCl、どっちが可溶化能高いですか？
#後者のような気が・・　そんなもんなんですかね？

611 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/15 14:49

PAGE後のゲルから切り出して、一晩浸透してその後アセ沈、トリスで溶解しているんですけど、
活性が圧倒的に落ちます。どの本を読んでも同じようなプロとコールしかないんですが、
何かこれは！というような物があったらご教授下さい。

612 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/29 19:54

age

613 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/29 21:43

現在、発現量の少ないタンパク質を
ヒスタグを付けて発現させて精製しているのですが
ラボに大腸菌の培養器が１台しかないので
１回につき１リットルぐらいしか培養できません
そこで、相談なのですが
ＬＢでない培地（ＴＢや２×ＹＴ）で
タンパクを作ったことのある方はおられますか？
少ない培地で大量に培養する方法を教えてください

614 ：510：02/04/29 23:23

私はLBで培養するのが好みですが、2×YTで培養する方も多いようです。
LBの場合、発現量は下がりますが可溶性が上昇します。
2×YTの場合、可溶性が低下するかわりに発現量が上昇します。
いずれにせよ、25℃にてmid-log phaseで誘導するとよいと思います。

615 ：でも好き：02/04/30 19:05

プロテアーゼを精製中です。
相談なのですが、もしも精製が終わったら学会にだしたいのですが
７月～８月が要旨締め切りの学会で酵素系がだせるところってどこが
ありますか？
うちの大学酵素やっているヒトあんまりいなくて誰にも相談できなくて・・・
どなたか心当たりありましたら教えて下さい！

616 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/30 19:55

ある蛋白質Xがダイマーあるいは、オリゴマーだとします
それを証明する場合みなさんならどうしますか？
教えて下さい
厨房なんですが。

617 ：泥沼歩兵部隊自走榴弾砲小隊：02/04/30 20:21

>>616 空挺部隊小隊へ、これより掩護射撃を行うので目標物の座標を
特定されたし

(1)可溶性の蛋白質の場合で立体構造が球状を仮定できる場合は
いくつかの測定法があります
**動的光散乱
**X線小角散乱
**分析超遠心
**NMRによる解析緩和、cross correlation、gradient echoなど方法数種
**蛍光偏光度解消から見掛の分子量をみつもる
**いちばん原始的にゲルろ過
**透析膜をつかって原始的に。
これら測定法のうち「交換している平衡状態」でも測定できる場合と
むずかしい場合があります。

（2）そういう装置がなくて、原始的でもよいので決定したい場合は
化学的クロスリンクで架橋して、SDS－PAGEでラダーを観察します。
すごく性能のよいマススペクトルで代用することができます。

(3)極端に大きなオリゴマーだったら、電子顕微鏡の１粒子解析で見えることがあります。

(4)膜タンパク質の場合には一分子に蛍光でラベルして、蛍光相関スペクトルを用いるくらいしか現状では有効な方法がありません。

結論はめんどくさい割りにはなかなか決定打がないというのが実状です。
健闘を祈る、オーヴァー

618 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/30 21:17

>>616
サブユニットが SS 結合してれば、
還元非還元の 2 次元で一発なんだけどね。

僕は物理系の測定方法をよく知らないので、
617 さんの書き込みは参考になります。

619 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/01 21:37

616ですが
アドバイスありがとうございました。
ちなみにSSでダイマーの可能性が高いです。
SDS-PAGEを非還元でむかしやりました。

620 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/03 07:16

このスレもでかくなったなあ…

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622 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/05 05:58

過剰発現させたSDS-PAGEで流したタンパクをキサントプロテイン反応で検出できますか？
っていうか、やってみます。
PFAGしか入ってないペプチドなのでひょっとしたらくまCで染まってないような気がして（祈

623 ：生物：02/05/06 18:58

参考にしていた論文に陰イオン交換カラムの開始緩衝液に
アジかナトリウムを加えていたものがありました。
アジカナトリウムってなにを目的に加えるものなのですか？
皆さんの知恵を貸してください！！

624 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/06 19:14

大昔は大抵のbufに防腐剤としてアザイド入れてたが。

625 ：生物：02/05/06 19:41

防腐剤のばあいって開始緩衝液で洗い流すのではないのですか？

626 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/06 20:10

＞622

銀染色ならペプチドでも染色できる。
またはウエスタンブッロトのあと免疫染色はどうですか。

627 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/06 20:14

アジ化ナトリウム
保存中の腐敗防止に0.1％溶液をいれる。普通はなしでやって，カラムを保存するときにいれておく。最近毒物指定になり管理が必要になったのでつかうのが面倒になった。

628 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/06 20:36

>>627
その後改訂されて、
0.1% 以下は毒物指定を解除されているよ。

629 ：622：02/05/10 05:30

とりあえず、SDS-PAGEで流した後のゲルに濃硝酸入れてみました。
しゅわわわわーという反応とともに茶色いガスが・・
今度は希硝酸か硝酸ナトリウムにしときます（笑）

>>626　ありがとうございます。銀染色もやってみました。
その結果、6M Guanidine HClでは可溶化されないためNi-NTAに引っ掛かって
いないらしいのではないか？ということがわかりました。
現在可溶化策を検討中です。シルクプロテインを可溶化できるような試薬を
ご存じないですか？98％ぎ酸？

630 ：生物：02/05/10 20:34

あげておきます

631 ：aiko：02/05/10 22:23

>>シルクプロテインを可溶化できるような試薬を
ご存じないですか？98％ぎ酸？

試したこと無いですが、リチウムブロマイド溶液とかはどうなんでしょうか？
と書きつつ、私もいい試薬を知りたいです。
私もシルクプロテインを可溶化したいのですが、どうすりゃいいのでしょうか？
どなたかしってる方がいらしたらご教授くだい。

632 ：だれかーーーー：02/05/13 22:37

最近何かと話題のシルクプロテインですが、おおまかな分子量を量るのにSDS-pageでいいのでしょうか？
教えてください。

633 ：629：02/05/14 09:43

>>632 とりあえず、
Stepen J. Lombardi and David L. Kaplan
J. Arachnology 18, 297-306 (1990) 結構古いアルね・・

634 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/29 21:29

age

635 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/29 22:55

今、ＰＮＰによる活性測定を行おうとしているのですが、活性測定の
Unitってどうやって算出すればいいのでしょうか？ｐＮＰ活性測定を
したことがある人おしえていただけませんか？

636 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/29 23:24

FLAGタグタンパクを非常にお手軽に精製できるキット
御存じないですか？

637 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/01 10:09

アトプレップ使ったことのあるひと居ませんか？
なぁんかうまく回収できないんですよねー・・・

638 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/01 10:16

>>635
　そういったことは、電気関係の板で聞くのがよろしいかと。

639 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/04 14:36

インクルージョンボディになるときでも、溶けているタンパクの量は一定でしょうか？
それとも、インクルージョンボディーができるときにつられて落ちてしまって、
溶解している目的タンパクの量（濃度）自体が低下してしまうのでしょうか？

640 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/04 23:15

あまり根拠はありませんが、私はどちらかといえば後者を信じています。
inclusion body 生成はco-translationalに起こるのではないでしょうか?
でも、真剣に研究しているグループはそう多くないので、本当かどうか
わかりません。IbpA IbpB (inclusion body binding protein A/B)などで
文献検索すると見付かります。

641 ：639：02/06/05 10:27

>>640 お答えありがとうございます。狭い非常口からみんな一斉に出ようとしたら
後ろからも押されて出口で詰まっちゃった、みたいな感じでしょうかね。。
良く見たら614でも同じ話が出てましたね。
IbpAもちらっと見てみました。（pubmedで20報ぐらい）そのうち、これを過剰
発現するようなBL21系の菌が発売されるんでしょうね。

642 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/05 11:11

培養細胞でタンパク質を発現させようと思っているんですが、
培養細胞発現用のベクターで、
1.ベクターのコンストラクト自体に分泌シグナルがついている
2.N末端側にFLAGやc-mycのタグがフュージョンされている
ものをご存知の方はおられますか？
細胞は、哺乳動物、昆虫どちらでも良いのですが。

643 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/05 14:32

SIGMA p3X-FLAGはタグとシグナルペプチド付きだよ。
でも、こんくらい自分で調べな。

644 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/05 19:05

>>643
ありがとうございます。
invitrogenなどでいろいろ調べているのですが、
分泌シグナルがついているものはあっても
N末端側にタグがあるものってなかなか見つからないんですね。
どうも、タグをwesternなどで検出する際には、
目的とする塩基配列のすべてが翻訳されているかどうかを
確認する意味もあって、
一番おしりのC末端にタグがあることが多いらしいんです。

SIGMAのもの、早速あたってみます。
どうもありがとうございました。

645 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/11 12:45

質問
６Ｍグアニジン塩酸で膜蛋白は抽出できますか？
界面活性剤を使いたくないので。

646 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/11 13:32

タンパク質工学一から学びたいのですが、
良い本がありましたらお願いします。

647 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/11 18:41

＞645
膜タンパク質はケースバイケースで6M Gdnでは抽出できないことのほうが
多いと思います。

648 ：645：02/06/11 19:26

６４７
ありがとうございます。
ギ酸はどうでしょうか。

649 ：AAA：02/06/12 00:49

>648
膜タンパク質の中で、表在性のものは、pHを変えたり、イオン強度を上げたり、
カオトロピックイオンを使ったりして、膜からはずしてやる事が可能ですが、
内在性タンパク質は、基本的に膜構成主成分である脂質の繋がりを断つような
事をしなければ、その後の精製ができません。
つまり、両親媒性の分子で可溶化してやって、脂質も含めたミセル溶液を
作って、そこから目的のタンパク質を含むミセル分子を集めるということ
でしょうね。だから、尿素も、塩酸グアニジンも蟻酸も、可溶化という点で
パスできません。界面活性剤を使いたくないのなら、
（１）有機溶媒で抽出する。
（２）脂質を加えて、膜タンパク質を希釈して、そこで平均ミセルあたり
　　　1分子のタンパク質濃度になるまで希釈して、精製する。
（３）大量発現系を用いて、2次元結晶構造を作る。
今すぐ、思いつく限りは、これくらいでしょうか。

650 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/12 08:45

>>637
アトプレップ使っています。
タンパクが少ないときにしか使いませんが、回収率は80%ほどありました。
たまに、回収率が非常に悪いこともありましたが、
逆染色の試薬を使いまわした･･･などと原因がありました。

脱色をしっかりと行う、ひたすらつぶす、抽出は長めに
が、気を付けポイントです。

651 ：645：02/06/12 21:56

ＡＡＡさん
詳細にありがとうございます。
とりあえず（１）を試してみます。

652 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/13 02:00

厨房なんですが
いまある蛋白質がのホモダイマーであることを証明しようとしているのですが
とりあえずHAとFLAGタグをつけてIP(COS-7で発現させて）してみました。
今度は大腸菌にHisタグのついたものを発現させて精製する予定ですが
ホモダイマーであることは、たぶん確実なのですが、内在性の蛋白質としてホモダイマーを
形成しているかどうかってどうすれば証明できるのでしょうか？

653 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/13 02:02

>>652
免疫沈降。

654 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/13 06:52

age

655 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/13 08:53

>652
君の周りの人はそんなことも教えてくれないの？

656 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/13 09:41

>>652

616と617を読んでみて下さい。
exogenousでなく、endogenousの蛋白質がホモダイマーであることを
厳密に証明することは簡単ではありません。

657 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/13 13:03

656>>>>>>>>>>>>>>>>>653&655

658 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/14 22:43

age

659 ：親切な人：02/06/14 22:49

ヤフーオークションで、凄い人気商品、発見！！！

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660 ：　：02/06/18 10:47

CBBで誘導が見れるのに、Anti-Hisでdetectionできない。
なんでやろー。

661 ：泥沼歩兵部隊：02/06/18 11:38

>>652
652装輪装甲車部隊に伝令。

質問の意図は「excogeneousに導入したHA/FLAGタグつき蛋白質と、
もともとのタグ無のendogeneousの蛋白質がhomo-dimerを形成している
ことを証明したい」ということなのでしょうか?
この場合は厳密に言うとタグあり/タグあり、タグあり／タグ無、
タグ無/タグ無の３種類のダイマーができるはずです。このうち、
本当に厳密にはhomo-dimerではないのですが、「タグあり／タグ無」
の組み合わせのダイマーを検出することで、証明にするというのが
古典的な手段です。

(1)IPして落してくる
(2)適当なケミカルクロスリンカー（一番かんたんなのはホルムアミド。
Pierceのカタログに多種収載)でクロスリンクする
(3)SDS-PAGE
(4)CBBまたは場合によってはwesternで検出して、分子量の違いから
上記タグあり/タグ無ダイマーの存在を証明する。

dimer間にSSがある場合や、低温でSDSーPAGEを試料のボイル無しで流すと
dimerが解離しないで検出できる場合など（稀にそういうタンパクがいます)
は、ケミカルクロスリンクをしないで検出している例もあるようです。

貴部隊の武運を祈る、オーヴァー

662 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/18 14:04

>660
下手だから。

663 ：泥沼歩兵部隊：02/06/18 16:56

しまった!重大な訂正。

(2)ケミカルクロスリンカーのところ。
ホルムアミドでクロスリンクなんてかかりませんね（大汗
「グルタルアルデヒド」です。訂正して下さい。

664 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/19 00:44

His-tagがついてない。

665 ：660：02/06/19 01:18

>>662
確かに下手なんですけど。ヘタヘタしかいわない先輩にはろくなのがいないです。
>>664
シークエンスや予想サイズは合ってるんですけれど。
ベクターの問題なんですかね。

666 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/19 01:30

>>665
1.frameがずれていて全く違うタンパクを発現させている
2.抗体が腐っていて使えない
3.CBBでdetect出来ているのでタンパクは出来ているがwesternの条件があっていない

過去にwesternでバンドが見れたHisタグ付きのタンパクを使って、
westernの条件が間違っていないかのコントロール実験でもしてみたら？
バンドが見れるのであれば、抗体や条件が問題ではない事が分かるので、
タンパク自身に問題があるのかも知れん

667 ：久しぶりの510（=656)：02/06/19 01:48

情報が少ないのでよく分からないのですが、、、

１）Anti-Hisはどこのメーカーのものを使用してますか？　Hisタグに
　対するいい抗体というのはあまり耳にしないです。

２）自分または研究室の同僚が過去に作製し、anti-Hisでの検出にも成功している
　蛋白質をポジコンにしてみてはどうですか？

３）まれにPVDFなどのmembraneへの吸着の悪い蛋白質があり、その場合発色まで
　の間に剥がれてなくなってしまうことがあります。ECL後にmembraneをCBB染色
　して、目的蛋白質が見れることを確認してみて下さい。

４）発現ベクターのシークエンスと、（IPTGによって？）誘導される目的蛋白質の
　サイズが予想通りなら、anti-Hisによる検出にこだわらなくてもいいかと思います。
　（もちろん目的にもよりますが。）　かまわずニッケルカラムで精製してしまっては
　どうでしょうか？

以上参考になれば幸いです。

668 ：660：02/06/20 15:53

>>666
>>667
全く見ず知らずなのに、丁寧に教えていただいて感謝します。
実世界でもみんなに信頼される研究者なんでしょう。
尊敬いたします。

さて、その後ですが・・・
666-1>シークエンスは間違っていないことは確認できました。　
　　　このベクターを使っているのは私一人ですが・・
666-2>使用しているサイズマーカーにHis-tagがくっついているのですが、
　　　それはちゃんと検出できています。
　　　ちなみにDr.Western(ブロッティング用マーカー／オリエンタル酵母)
　　　も検出できています。
666-3>上記の結果を鑑みるに、Westernの問題というよりサンプル調整の問題のようです。

667-1>Anti-Hisはinvitrogenのものを使用しています。
これも使っているのはラボで私一人なのですが・・・
667-2>ご指摘があってからHis-tag fusionタンパクを先輩からもらいました。
　　　ただ、Anti-Hisでdetectできるかは未知数です。
667-3>染めてみました。染めすぎてしまい、脱色中です。
667-4>ニッケルカラムは注文する予定です。どこかお勧めの会社ありますか？
　　　いまのところアマシャム、キアゲン、バイオラッドを比較検討しています。

タンパクを専門にやっているわけではないラボなので苦労しています。
こういう人のことを厨房っていうんですか？

669 ：通りすがりの者：02/06/20 15:58

どなたかおすすめのAnti-His抗体を教えて下さい。
条件は細胞抽出液を泳動したときにウェスタンで検出できることです。

以前、アマシャムのAnti-Hisを使ったことがありますが、全然ダメでした。
HA-ORF-Hisという構成で、Anti-HA抗体だとハレーション起こすくらいだったのに……。
あ、精製タンパクではたしかに検出できました。
でも検出感度はCBBと同じくらいでした……。

670 ：510=667：02/06/20 18:14

１）His-tagのついたサイズマーカーは検出できているのであれば、Westernの問題
　である可能性は低そうですね。Invitrogenのanti-Hisの性質はよく知らないのですが、
　データシートはよく読んでみて下さい。anti-FLAGの場合、M1, M2, M5など複数の
　モノクロがありますが、N末、C末、中間のいずれにFLAG-tagがついていても認識できる
　のはM2だけだったと思います。

２）membraneをCBB染色するときは、ゲルの場合より短時間でOKです。membraneの
　染まり具合を目で確認しながら数分で脱色液に交換するといいです。blockingにBSAや
　skim milkを使用しているでしょうから、backgroundはどうしても出てしまいます。

３）以前の書き込みを見ると分かるかと思いますが、私はGST-fusionが好みですので、
　His-tagタンパクの精製の経験は少ないです。確かQiagenのNi-NTA Agaroseを使った
　と思います。

４）His-tagタンパクを精製する際の注意点としては、
　a) 金属プロテアーゼの阻害のためによく添加するEDTAやEGTAはNiそのものをキレート
　するので加えないこと。
　b) 蛋白精製の際には2-メルカプトエタノールやDTTを加えるのが一般的だが、Niイオン
　を還元してしまうので（カラムが褐色になります）、できるだけ加えない。せいぜい
　0.5 mM DTTくらいまででしょうか。

また何か分からないことがありましたら何なりと。
ただvectorにしろ、anti-Hisにしろ「動いている」ことがラボ内外で確認できている
ものを使った方が苦労は少なかったかも知れませんね。

671 ：660：02/06/21 13:33

アマシャムのHisTrapを注文しました。
お金がかかっているので、プレッシャーです。
510さんの言われていることを注意してやろうと思います。
どなたかこの製品を使われたことありませんか？

「動いている」のを使いたいんですけど、
そこはいろいろありまして・・(・_・、)

672 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/21 21:21

>>669
ホント！
私は安いので、これ使ってるけど、
何種かのHis融合タンパクはちゃんと検出できたよ。
検出するHisの配列にもよるのかな？
ただCOS細胞の抽出液でクロスしたけどね。

673 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/23 16:27

スレ違いで申し訳ないんですが。抗体をドライアイスで送ってもらったのですが
ワークしません。抗体はセーラムチューブに入って紙の箱にはいってました。
セーラムチューブにはパラフィルムがかけてありませんでしたが、
セーラムチューブ内にドライアイスが入り込んで抗体が失活するって
よくあることでしょうか？？
経験のあるかたいらっしゃったら教えてください～。

674 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/26 21:45

失活したのでしょう。

675 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/26 22:21

ポジコンとってみりゃええやん。

676 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/26 23:47

fusionの分子量はどのくらい大きいのを作ったことありますか？
私はこれから250kDaのを作ろうとしていますが・・・大腸菌で。

677 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/26 23:54

GST-HSP110ならちゃんと発現して可溶性画分に回収できた。
トータル140kDaぐらい。

678 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/26 23:56

発現量はどうですか？

679 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/26 23:58

>>676
やめとけ。

680 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/26 23:59

GSTだけと比べて1/20以下かなぁ？＞GST-HSP110

でもグルタチオンビーズで精製したらシングルバンドで部分分解はほとんどなかったよ。

681 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/27 20:32

発現しました。

682 ：：02/06/30 14:44

おすすめタンパク精製キットなにかあります？

683 ：660：02/07/02 13:32

->671
アマシャムのHisTrapでワンバンドになりました～。
とりあえずこのサンプルでWesternやってみます。

684 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/03 03:04

>>660
サンプルのdinature不足ということは考えられませんかね？

685 ：660：02/07/03 12:55

>>684
９５度　５分や１００度　１０分でやりました。
みなさんはどんな条件でやってますか？

それとも、そのあとの氷冷が長すぎるのかな？

686 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/03 13:37

>>685
氷冷したらSDSが析出してアプライしにくくないか？
折れは室温においとくけど。

687 ：510=667：02/07/03 20:05

sample bufferを加えた溶液は100℃近くの高温かon iceのどちらかに
置いておくのがよく、室温に長く置くのはよくないとされています。
大海さんの総説によると、室温ではSDSでも失活しないプロテアーゼがあり、
SDSでunfoldされた他のタンパク質を分解していくからだそうです。

確かに氷冷しておくとアプライしにくいので、私は熱処理したら直ちに
アプライして泳動スタート、残ったサンプルは-80℃にすぐ保存する
ようにしています。

688 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/04 00:26

どいつもこいつもタグばかり
キットも花盛り

689 ：名無しの転写伸長因子：02/07/04 00:29

約３０年前にあったできごと・・・。

学生　「Ｎ取先生、ゲル濾過をかけたら活性がなくなりました。」
Ｎ取先生　「ざまぁ見ろ。」

この学生は現在、教授です。

690 ：686：02/07/04 01:04

>>687
あ、それは知ってる＞長く置くのは良くない
置いててもせいぜい15分だから！
お気遣いthanks。

691 ：大学生：02/07/09 21:40

いきなりですみません。大学のレポートどうしてもわかりません。
誰かわかる人おられませんか？

タンパク質は、折れ畳まれた状態では、その種類毎にそれぞれ固有な形をもつ
一方、異なる種類のタンパク質には、極めて多様な「形」が生じている。これ
は、ポリスチレン等の合成高分子とは違ったタンパク質とゆう生体分子にしか
ない特徴である。
１）この多様な形を生み出している機構を説明せよ。
２）この同一の種類では固有であり、異なる種類のものでは異なっているのは、
　　分子の形以外に、タンパク質のどのような性質かを述べよ。

692 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/09 21:58

>>691
答えは全部かかないよ。

1) 蛋白の構成要素とその種類を考えてみましょう。
2) 蛋白の活性中心の構造と、蛋白の種類について考えてみましょう。
3) エキソンシャッフリングとドメイン構造を考えてみましょう。

と、それくらい書いておけば、いい評価もらえるんじゃん。
設問がちとへんなような気もするが。

693 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/09 22:22

>>689
学生の頃からＮ鳥さんに嫌われてたってこと？
特定やらエラトやらはＮ鳥さんが無理やり押し込んでるんじゃないの？

694 ：大学生：02/07/09 22:32

>>692
ありがとうございます。
もうすこし、これをヒントに調べてみたいと思います。

695 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/13 15:04

F-actinのようなcytoskeletonに結合しているタンパク質で
同時に骨格系でないいくつかの相手とcomplexを作っているタンパク質の
結合相手を共免疫沈降で落として決定したいのですが
共免疫用のlysis bufferでは骨格系は可溶化できないので取ってくることができません。
何か良い方法はないでしょうか？

696 ：カナリヤ：02/07/16 16:47

pETユーザーのみなさんへ
どのpETがタンパク精製でおすすめです？

697 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/16 20:05

>695
無い。
いろいろやるしかない。
誰も出来ないからやる価値あり、だろ。

698 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/16 20:20

pETなんてやめろ。タグはHisTAGぐらいしかないだろ？
HisTAGなんて、ノンスペばっかだし、タンパクの溶解度は下がるし、
ろくなことない。

699 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/16 20:43

pET－GSTはどうよ?

700 ：結果が出ない厨房修士：02/07/17 00:41

１６００Daのペプチド（蛋白質）と塩が混ざった溶液があります。
あなたならどうやってここから蛋白質を精製しますか？

これができたら修士論文完成にリーチがかかります。
だれか助けて下さい（泣）

701 ：>700：02/07/17 00:43

逆相HPLCだな。とりあえず。
カラムかければ一発だよ。

702 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/17 20:11

>>700
脱塩して逆層カラムじゃダメなの？

703 ：702：02/07/17 20:12

うわ、誤変換だ＞逆層
相ね。

704 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/17 21:20

少量ならZipTipがオススメ

705 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/17 21:25

>>130
Glutathion S-transferaseは２量体を形成するのが今までの常識では？

706 ：結果が出ない厨房修士：02/07/19 18:43

>>701
>>702
え？そんなに簡単に脱塩可能？そんな小さな透析膜見当たらん。
ゲル濾過したらどっかいくし・・・。

707 ：702：02/07/19 23:01

え、サイズ排除使えないのか？困ったな。
そんなに薄くて大量なのか・・・

708 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/19 23:10

そのまま逆相にきまっているだろうが。

709 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/19 23:30

>>700
置換用バッファ入れつつcentriconとかcentriprep何度もかけて
...でなんとかならんか？
かなりマイルドな濃縮／置換方法と思ふ

710 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/19 23:32

１６０００だったらな。
1600だんよ。

711 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/19 23:41

両イオン交換のばいおらっどのビーズを素通しする。
製品名忘れた。

712 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/20 00:13

今まで知られているタンパクで
最も大きいサブユニットをもってるやつって
いくつぐらいですか（個数じゃないよ）？
サブユニットで８０万Ｄａ超えることってあります？

713 ：701：02/07/20 01:28

>706
うちらは、とりあえずそーいった小さいペプを精製するときは、
脱円なんか省略でいきなり、えいやーとカラムにロードします。
ただし使ってるカラムはODSとかでHPLCで使うことが前提です。
そげな小さなペプちゃんは、有機化合物を精製するような吸着力
のつよいやつで精製してやってください。タンパク用の逆相カラム
は吸着力が弱めなので、そげなちっこいペプはくっつかんのやないと？

714 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/20 14:19

＞７０６
みりぽあさんから，吸着フィルターが売られてます．
またはトーソーからもカラムがあります．
シリンジにサンプル入れて，アプライするだけ（みりぽあ）．
ただし，ユクーリユクーリよ．
値段と労力ではみりぽあかな？

715 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/20 16:06

だからミリポアのZipTipだっつってんだろ

716 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/20 17:58

>>712
ありますよ。筋蛋白のTitin(conectin)とか。120万Ｄa以上あったはず。
でもたしかそれ以上の蛋白もあったはず。

717 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 00:10

ああ、ザリガニだかホタテだかのなんとかチンって奴ね。
3000kDaくらいだったかな？

718 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 08:13

TCAで沈殿させるとき、deoxycholic acidを入れるプロトコルを見かけたのですが、
これは再溶解を容易にするためですか？

719 ：名無しのLanding Bahn：02/07/21 14:55

>>693
遅レススマソ。その現在教授は保利枯死せんせーじゃないよ。

720 ：結果が出ない厨房修士：02/07/22 03:19

ZipTipっていいんか？

721 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/22 03:20

いいよ。文句なし。高いけど、８０％アセニトTFAで洗って乾燥させたら
結構再利用できる。

722 ：結果が出ない厨房修士：02/07/22 15:55

おし！ためしてみる！

ただなぁ・・・うちの研究室は「ド」貧乏なんだよ・・・。
この前勝手に４２００円のHPLC部品買ったら、会計担当のM1に怒られた。

723 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/22 17:44

http://www.waters.co.jp/html/prod/ccd/oas.html
こっちのC18でもいいかも。SEP-PAKといいます。HPLCの
前処理なんかに使われてます。

724 ：厨：02/07/23 12:00

ウエスタンで困ってます。
抗原は大腸菌発現系で作ってできた抗体。
抗原にはばっちり反応。
目的サンプル（植物）を使うとシグナルなし。
ちなみに目的タンパクのシグナルは100K以上。
量が少ないと思って、硫安くらいはやったのだがだめ。
どう？

725 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/23 12:18

よくあることだ。作り直せ。

726 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/23 13:41

抗体の種類くらい書かないと答えられない。

727 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/23 13:54

>>724
残念だったな。

728 ：厨：02/07/23 14:30

>726
種類とは？
rabbitIgGですが。
普通にgoatAPで検出。
しかし・・。
>725, 727
そういわんでくれ・・。

729 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/23 18:21

だがしかし良くあることだ＞728
だから同じ抗原を3匹くらいに免疫するのが普通。

730 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/23 20:13

抗原部位に糖鎖かリン酸でもついているのではなかろうか?
glyFかけたりendoHかけたり脱リン酸化して悪あがきするのと
つくりなおすのとどっちがましかな。

731 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/24 02:15

protein A beadsで濃縮してみろ。

732 ：厨：02/07/24 08:57

＞７３０
たぶん、就職はないかと。抗原には５０ｋくらいのタンパクを使いました。

＞７３１
ProteinAとaffinity、どっちかで精製やってみるか・・・。
抗血清で検出できないときに、精製して見えるようになった
経験ありますか？

733 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/24 09:59

ない

734 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/24 11:26

>>732
正直、ない。
俺も同じ経験があるが濃縮しようが、希釈倍率変えようが何してもだめだった。

とっとと作り直せ。

735 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/24 13:26

俺もない。
大体、反応しないんだから精製しても濃縮しても無駄。

しかしそれ以前に、目的のサンプル、分解してないだろうな？
植物なんだろ？なんかやな予感がするんだよね。

>>730
抗原に使ったタンパクは修飾されてないだろ。大腸菌発現系なんだから。
そもそもポリクロなんだからそんなのまず関係ないし。
あほな事言いなさんな。

736 ：厨：02/07/24 14:07

>all
みな、ありがとう。
時間がないので、抗体はあきらめます。
in situでRNAの場所くわしく見て投稿します。

737 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/24 18:53

>>735
植物の試料を処理するんじゃん？

738 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/25 00:52

>>736
in situするなら免染試せば？
ウエスタンよりは出ると思うが。

739 ：厨：02/07/25 09:22

＞７３８
判定が難しくないですか？
シグナルがポジティブかどうか。

＞７３５
おそらく分解は大丈夫です。
何となく存在量が微量であると予想されるタンパクです。

740 ：735：02/07/25 21:42

>>739
免染だと特異性が判らんからそれで正解だね。
微量だとウェスタンで綺麗に出ない事も確かにある。
ウェスタンするために部分精製した事あるよ、おれ。

細胞内局在ではなくて組織分布が判れば良いなら、
あなたの思う通り、in situでも良いと思う。

741 ：　：02/07/26 09:05

Anti-Hisのモノクロ（クロンテック）でノンスペいっぱいー。デグレか？
Niカラムにもう一度かけようかなぁ。

742 ：厨：02/07/26 09:31

>735
部分精製は具体的に何ですか？
イオンあるいは疎水クロマト？

私のは活性を測るシステムがないので、精製もできません（鬱）
一時は適当に手動フラコレ（貧乏）で分離して
数フラクションまぜた試料たちに対してウエスタンも考えたのですが・・。

743 ：735：02/07/26 12:08

>>742
自分は、イオン交換にかけて酵素活性のピークを取った。
ウェスタンごときの為にRI使って活性測定かよ、と思った・・・・

744 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/28 13:01

膜蛋白。。。

745 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/04 21:21

最近、膜タンパク質も沢山精製されてきてるね

746 ：　：02/08/08 09:27

>>745
例えば？
ええ論文があったら紹介してケロ。

747 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/08 13:00

まだ論文になってないけどもうすぐじゃない？
アメリカの学会で見た内容だから

748 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/13 21:01

Hisタグ精製後、透析したらアグった
pH、塩濃度をかえて透析してもアグった
elution bufferのまましばらくおいておいてもアグった
精製度が低いとアグるのかな？

749 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/13 21:03

違います。Hisタグだからアグります。

750 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/15 03:44

>>748
分かった？
GSTにしる！！

751 ：748：02/08/16 00:01

N末GSTでは活性がありませんでしたが何か？
とりあえず、大腸菌ライセートをゲル濾過かけてみた
明日にでもHisタグ精製をしてみるか

752 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/17 02:26

どだた？

753 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/17 15:30

>>751
どだたの～？

754 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/17 16:06

profectっていう、たんぱく質を直接細胞に入れる試薬が売られていますが
これってどうなんでしょう？
蛋白を精製して、このprofectを使えば、DNAの発現が難しい遺伝子でも
コンプリメンテーションされるのでしょうか。

755 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/17 21:51

されます

756 ：nana：02/08/17 22:06

試供品もらいなYO

757 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/18 14:10

>>755
蛋白は何を使っているのですか？
どのくらいの純度が必要なのでしょうか。
巨大な蛋白だと、ＧＳＴでは溶けないだろうし、何を使えばよいのでしょうか。

758 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 00:28

大腸菌でダメだったら即Baculoでしょう。
GATEWAYつかいなよかんたんだよ

759 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 01:13

厨房です
初めてバキュロでリコンビナントを取るんですが、バックミドに入れる前に
コンストラクトのチェックをしようと思い、今までは大腸菌でスモールで
発現させて活性チェックしてたんですけど、バキュロの系の場合、やはり
インサートのシークエンスを最初にしなければいけません
シークエンスが完璧で、いざバックミド作って、虫からエクストラクト取った
とき、活性がなかったぞ！って人、います？

760 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 04:25

ざらです

761 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 12:50

>760
ざらってすごい出費ですね

なんかいい事前のチェック方法ってないんですかねー？

762 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 13:29

そうです。手間も時間もむだになります。
だからみんなやりたがらないのです。
でも、それでうまくいったラボだけが、よそよりよいデータだせ
るのです、がんばれ!

763 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/19 14:05

>762
お答えありがとうございました
なんとか運を天にまかせてやってみます
無理だったら大腸菌だなー

764 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 00:25

タンパク精製をはじめから立ち上げなくてはいけなくて、まったくの初心者です。
まわりに相談できる人がいないので、このスレを初めからよんでみましたが、
どうも専門過ぎるようです。いろいろな教科書をよんでみましたが、悩んでいますので
教えてください。

・２量体を形成している分泌タンパクで、40kDaくらい（論文によって違う）
・組織から精製した実験では、一箇所N-グリコシレーションをうけていてS-S結合が数箇所ありそう。
リン酸化もうけている。N末はcleavageされる。
・ほかのラボからでている発現は大腸菌とバキュロが報告されているが、どちらも活性はあるらしい。
相談できる人がいないので、とりあえずバキュロで始めようと思っていますが、
適切と思われるベクターやキットのsuggestionがあれば教えてください。タグや融合たんぱくの
よしあしなど。
ついでに精製方法についてのrecomendationもあればおしえてください（キット名など）
初心者なので、まずキットの内容のいいもので精製までいけたら
と考えています。

765 ：764：02/08/20 17:19

なかなかレスがない・・・。（泣）
追加として、
C末にタグのついているベクターで、おすすめのものがあれば教えて下さい。
質問に不備があるかも。お許し。

766 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 17:52

>>764
報告されているなら論文と同じもの使ったら
わざわざ他のもの使う必要ないと思うけど

＞相談できる人がいないので、とりあえずバキュロで始めようと思っていますが、

お金持ちでうらやましいです

767 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 17:54

レスがなかなかつかないのは、掲示板で答えられる範囲をこえた質問
だからだと思う。
もうちょっとポイントを絞らないと答えにくい。
特にタグの善し悪しなどは教科書をよんだほうがいいよ。

とりあえずでやるなら大腸菌でいいと思うけど。
大腸菌でも活性が報告されているんだし。
お手軽さ、コスト、収量など考えるとなんでバキュロなのか……。

タグの選択は、融合するタンパクとの相性もあるので、
メジャーどころを一通りやってみた方がいいと思う。
まずはHis、GSTぐらいかな。それでだめならMBPか。

768 ：764：02/08/20 20:17

ありがとうございます。
教科書よみます。
文献では大腸菌で発現させた蛋白は活性が低いという他の論文があったので
baculoがいいかなと考えた次第です。
分泌性蛋白でシグナルを含むということはC末にタグをつけるんですよね。

ところでまたまた初心者質問で申し訳ないのですが、
たとえばInvitrogenのBac-to-BacにはN末タグのベクターしかないのですが、
C末タグベクターが必要なときは自作するのですか。
自作はどうすればいいのか教えて下さい。
（質問者が質問の意味をわかっていない典型的な例かもしれませんが）

769 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 21:32

つーか２Chで聞くなよ。
せめてgoogleとかで情報集めてからにしる！

770 ：764：02/08/20 21:45

すみませんでした。
親切なひと、いませんかあ。

771 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/20 23:01

>>770
PCRって知ってるか？

772 ：764：02/08/20 23:25

知ってます。PCRなら。

773 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/21 01:00

complexを取りたいのか？それともtargetの分泌蛋白だけで良いのか？
取ろうとしている蛋白はどのような生物に由来するのか？

774 ：764：02/08/21 01:22

targetの分泌蛋白だけでいいです。
生物は人、マウスのubiqitousな組織由来です。

775 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/21 01:28

論文を信じるならﾊﾞｷｭﾛでHisﾀｸﾞor GSTﾀｸﾞだろうな。精製して活性を調べる
ようなassayでもするんだろう？
GATEWAYのｷｯﾄを使えば簡単だぞ。

776 ：764：02/08/21 08:40

775さん

ありがとうございます。
GATEWAYについて勉強してみます。

またわからないことがあれば教えて下さい。ここは専門のかたが多そうなので
ありがたいことです。

777 ：GATEWAYは：02/08/21 11:43

日本から撤退したのでは・・・？

778 ：gateway：02/08/21 11:48

invitrogenで扱ってます。

779 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/27 09:24

>>469 Shimizu, Norio; Yanase, Takeshi.
Production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli transformants by coexpression of molecular chaperons.
Abstracts of Papers, 224th ACS National Meeting, Boston, MA, United States, August 18-22, 2002 (2002), BIOT-194.

780 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/31 21:28

セルフリーの発現系のキットはどこがおすすめですか？

781 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/01 07:37

promega

782 ：どぴゅ：02/09/01 23:10

ａｇｅ

783 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/03 23:00

初心者なので質問させてください。

抗原作製用に70アミノ酸程度のペプチド（目的蛋白の一部分です）をGST融合蛋白として
大腸菌（BL21)で発現させています。発現はうまくいったのですが、封入体に入ってしまったので
そこから可溶化しようとしています（可溶画分に回収しようとしてIPTG濃度、培養温度を
振ってみましたが可溶化しませんでした）。

サルコシルをつかって可溶化したのですが、GSTセファロースに全くくっついてくれません。
DTT5mM、サルコシル1.5%（PBS中）の条件で４℃、１５分インキュベートしています。

原因としてはどのようなことが考えられるでしょうか。
または、可溶化の方法としておすすめの方法があれば教えてください。
よろしくお願いします。

784 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/03 23:35

>>783
バッチでの反応なら温度を室温にして時間長くしてみれば。
サルコシル可溶性に含まれてる融合タンパクを抗GSTでウエスタンしたら１バンドだった？

785 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 00:45

>>780
セルフリー・・・露酒のRTSなんてどうかしら？

786 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 00:56

だれも777のボケにツっこんであげないのけ？
確か去年日本から撤退したな、gateway

787 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 01:30

それよりも誰か783の勘違いを指摘してやってくれよ。

788 ：783：02/09/04 14:31

早速のレスありがとうございます。
784さん
ウェスタンではちゃんと１バンドでした。サルコシルを入れた後
ソニックをかけすぎるとGSTが変性してしまうという話も聞いたのですが、
そういう可能性も考えられるのでしょうか？

787さん
勘違いとはどのようなことでしょうか。蛋白精製も２ちゃんも初心者なので
わかりません。お手数おかけして申し訳ありませんが、教えていただけると幸いです。

よろしくおねがいします。

789 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 14:43

ザルコシルはSDS並みの変性作用があるから、1.5％ザルコシル存在下では
GSTは変性してグルタチオンビーズには付かない。
ザルコシル量の8倍以上のTritonX100を加えれば、おそらくGSTは巻き戻る。
時間があるなら４度でTBS+0.1%Triton100に透析せよ

790 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 15:29

あとTBS、0.1%TritonX-100の透析でアグリゲーションするなら、最終タンパク質濃度を0.1mg/ml以下に下げるとか
ザルコシルで可溶化したのち30-50％エチレングリコールを含む1xTBS,0.1%TritonX100で透析すればうまくいくかも

791 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 15:31

>>783
ソニケーションはかけないほうがいい。

>>789
アマシャムのマニュアルには1.5％ザルコシルは影響ないと書いてあるが、
影響でるものなのか？
やったことないのでフォローできないスマソ。

792 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 19:17

下のURLに「サルコシルで変性させたGSTのリフォールディング」について解説してあったぞ

http://www.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp/biophys/profile/hiroakih.files/refolding2002.pdf

793 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 22:42

Ｔｒｉｔｏｎって晴海にあるやつですか？
そね１％ってどういうことなのですか？気持ちが１％ことでは…
あと、サルコシルよりも１％Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎによっ９３

794 ：783：02/09/04 23:03

みなさん本当に親切に教えていただいてありがとうございます。

TritonX100は入れていたのですが、8倍以上ですか．．．
使っていた量が少なかったのかもしれません。

早速いろいろ試してみたいと思います。また報告しますね。

795 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 18:44

素人の質問なのですが
どうして膜タンパクの精製は難しいのですか？

796 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/05 19:40

>>795
それは「破りたい」と思ってもなかなか破らせてもらえないからさ。

797 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/06 01:20

>>795
無理やり発現させると構造保てないし、
疎水性高くてアグっちゃうからさ。
巻き戻しの条件設定もムズい。

798 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/06 09:44

>>792 おお、それがうわさの不溶性予想プログラムですな。どれどれ・・
Native protein 99 GST-fusion 96 MBP-fusion 97 Thio-fusion 2
Thio-fusionでもタグ切ったとたんに落ちるということですね。。
>>793 誤爆？ということにしておいてあげよう
>>795 破った後、再構成するのが難しいからだろ？自分の状況を説明してどうする？

799 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/15 14:08

巻き戻しにハマってます。Folding Kitに期待

800 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/15 14:17

やめとけ

801 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/15 17:56

どこで売ってますか？
フォールディングキット

802 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/15 22:50

>>800
そんな酷いこと言わないで下さい!
>>801
Hampton Research 社のFoldIt のことでしょうか? >>792に紹介してありました。

803 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 15:20

タカラのシクロデキストランってどうなの？

804 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 23:05

シャペロンとかって気軽につかえるのかな？
売ってる？
シクロデキストリンにしてもそうだけど、
発現させる系に入れないとダメ？
セルフリー系を使わないといけないのん？

805 ：農NAME：02/09/21 00:01

今、酵素の精製やってます。
カラムクロマト・フラコレ→活性測定→限外ろ過
の繰り返し。カラムの樹脂をとっかえひっかえ・・・。
すげーだるい・・・。

806 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 03:35

金さえあれば。

807 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 20:19

タンパク質の精製について初心者でもわかる本とかありましたら
お願いします。
大学院からタンパク質工学を学ぶ予定です。

808 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/22 00:57

>>804
昔RTSのセミナーに行ったが、グロ系は販売している。
コストが高いが（キットも高い）、細胞系で発現が難しいならいいかもな。
ちなみ大腸菌で発現できるものをセルフリーでやっても同じ様に不溶性だったし、
発現量は大腸菌にかなわなかった。私の例ではね。

っていうか高いよ、これ。

809 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/22 01:00

807さんに便乗なんですけど、
タンパクのさわりかたとか、ほんとに基礎から書いてある本を教えてください。
核酸しかいじったことないです。。

810 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/23 19:46

>>809
>核酸しかいじったことないです
終わってます。逝ってください

811 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/24 09:54

10万×gで遠心した上清に、少しくらいミトコンドリアのタンパク質が
混じることはあるのでしょうか？
ラットの肝臓を使ってるんですけど。
ミトコンドリアプロテアーゼがコンタミしてたら終了なんですけど。
誰かわかるカタいたら教えてください。

812 ：sage：02/09/24 23:07

遠心前のｻﾝﾌﾟﾙﾌﾟﾚﾊﾟﾚｰｼｮﾝに激しく依存するでしょう。
ミトコンが印ﾀｸﾄかどうかとかね。
まぁ、まずﾐﾄｺﾝﾄﾞﾘｱスペシフィックなﾏｰｶｰでﾁｪｯｸだなー

813 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 23:08

なぜ良スレにsageで？

814 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 02:34

>>809
では、あなたの頬にまず触れてみて下さい。
・
・
・
めでたくタンパクにさわれましたね。

815 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 11:53

精製と一言で言っても
酵素活性を測定するため
三次構造を決定するため
と内容によって全く別次元だよな

816 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 13:39

んだね

817 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 18:15

>>808
そうゆうものなんだね。
セルフリーでやればかなりいけるとおもてたよ。

818 ：泥沼歩兵部隊・後方戦闘支援室：02/09/28 21:10

タンパク質物とり戦線、前線にて戦闘中の皆さま、いかがお過ごしですか？秋の学会シーズンを
控え、日々の戦闘もますます激化していることと思います。
さて、泥沼歩兵部隊後方戦闘支援室から、下記の書籍をご紹介させていただきます。
Protein Protocols Handbook
John M. Walker (Editor) (Paperback, 1147 pages - February 2002)
Humana Press; ISBN: 0896039412; 2nd edition (February 2002) 日本円で約15000円
タンパク質の取り扱いに関する良い教科書がないとお嘆きの皆さま、是非ご検討ください。
後方より諸兄らの武運を祈る・・・・オーヴァー

819 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 22:19

あげ

820 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 23:51

in vitro binding assay (pull down assay) やってる人いる？

821 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 23:55

これから始めますが何か？

822 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/29 01:03

IPとCo-IPの違いを説明しる！！

823 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/29 04:27

出会いの有無

824 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/29 14:04

そればっかしです＞820

冷蔵庫にあるcDNAはかたっぱしからpGEXにつないでます。

825 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/29 21:53

ＦＬＡＧＭ２使うときタンパクの開始コドンいりますか？

826 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/29 22:03

実験する前に日本語を勉強し治せ＞825

827 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 00:46

ワラ太

828 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 20:03

セルフリー系、ピュアシステムってどうよ？
精製も可能らしい。
使った人いますか？

829 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 21:15

つかえないね。

830 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 00:32

ワラ犬

831 ：名無しの遺伝子を研究する者：02/10/01 00:42

発現も精製も全く駄目なタンパク質で、一時その研究を諦めていたのですが、
ピュアシステムでうまくいきました。高度に精製する場合には、たとえ高発現
に成功したとしても、多くの場合Hisタグ等のタグが必要ですが、この方法では
それが必要ではありません。融合タンパク質にしなくていいのは、後で除去で
きるとはいっても、やっぱ楽で、気分もいいですよね。
ほかの方法で発現できなくても、セルフリーの再構成系なので成功するこが
多いと提供元では言っているようです。

http://www.postgenome.jp/2002/puresystem/pure_principle.html

832 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 00:42

ワラ丈

833 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 00:44

>>831
なんか、「奇跡のトルマリン・ブレス」の宣伝みたいだぞ

834 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 00:49

>831
おれはセルフリーのシステムでうまくいった試しがないんだが・・・。

835 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 00:52

>>312
君は正しい。
ダラシナイPhDがハビコルうちのラボに助手で来ないか?
香川県だがどうか？

本気なんだが？

836 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 00:59

>>833,834
は外道
セルフリーはキットの値段高いし、うまく合成できないし…。
いいことないな。

>>831
活性はあったのか？

837 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 01:02

>>836
829には同意しないの？

838 ：836：02/10/01 01:10

>>837
だって、ピュアシステム使ったことないしねぇ…

839 ：通りすがり：02/10/01 21:53

>>831
目的の遺伝子の発現に成功するか否かは、転写産物の構造・コドン
ユーセージ・タンパク質の性質・発現系との相性などあって、一概
にはこれがいいというのはないというのが現状でしょう。複数の方法
を試してみるというのが、答えだと思います。セルフリーの系もい
い場合もあるし、逆に悪い場合も同じくらいあるといったところで
しょうか。
一方、発現はソコソコしたけども、精製がうまくいかないというのも、
これまた困ったちゃんで、１年間これで終わった学生さんなんての
も知っています。ピュアシステムというのは試したことはありません
が、Nature Biotechの原著論文を読む限りでは、不要なものにヒスタグ
をつけて除いてしまうという、アベコベの発想で、タンパク質の精製
としてはユニークな試みだと思います。
再構成セルフリー系の強みでしょうね。ホンとに論文のように高発現
して簡単に精製できるのでしょうかね？　どのくらいの確率で上手く
いくのか知りたいです。ほかにやった方います？

840 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 22:23

ﾋﾟｭｱｼｽﾃﾑは他の無細胞系に比べても
合成効率悪いし、高いって聞いてますた。
まあ、金の余ってるﾔｼはﾁｬﾚｿｼﾞしる！
漏れはﾑﾘ…

841 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/02 00:02

>>831　どれくらいとれた？100ug/1万円ぐらい？
細胞毒性が高くてどうしようもないときはcell freeしかないけどさ。

842 ：通りすがり長文ごめんなさい：02/10/02 01:00

>>840
どの系を使うにしても、値段は大事な要素ですね。

　　発現や精製で何ヶ月～１年も苦しむのは学生さんは勉強となるのでいい
としても、一部のお金のある研究室や企業では困り者になってしまいます。
タグなしの純度９０％のタンパク質１００μｇ～１０ｍｇ＆自分の目的の活
性有で、個人的には１件当たり成功報酬１００～３００万円なら、外注した
いところです。業者なら１件あたり２週間から１ヶ月程度で成功か否か最初
の結果がだせるでしょうから、１年も苦しむのなら任せるほうが、確実で本
来の研究もきっと先へ進むというものでしょう。

　　キット化されたバキュロやイーストの発現系やセルフリーの系もライセ
ンス料やなんやら、ん十万は結局必要だったり。キットを用いて成功しても、
大量発現したときのタンパク質の用途が基礎研究目的以外(販売など)ならラ
イセンス料として数千万以上要求されたりします。自分の研究室や、仲の良い
研究室に以前からある程度のノウハウと発現系をもってなければ、発現と精製は
(労力＋かなりの時間)で解決するか、お金で解決するしかないでしょう。
これは発現と精製に限ったことではなく、多くの分野でも当てはまることかも
しれません。或いは、何年先かわかりませんが、技術が進歩すれば、現在の
オリゴヌクレオチドの合成のように、タンパク質の合成と精製も、気軽に外
に頼めるようになるのでしょうか。

843 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/02 01:25

お金持ちですね。
一件あたり300万円・・・はぁ。
基盤研究Bの一年分ですね。

844 ：名無しの遺伝子を研究する者：02/10/02 02:14

>>836
>>841
細胞培養液あたり数１０ng/mlでアッセイできるタンパク質で、この
アッセイ系にのせるためだったので、タンパク質の量としてはμｇ程
度合成してもらえばよく、小スケールのセルフリーでも、とりあえず
の実験には充分な量が合成できました。
値段はさすがに、１００μg/1万円　程は安くはありませんでした。
それでも、類似のタンパク質でMBL等で売っている値段と同じかやや
高い程度で、新規タンパク質をオーダーメードで作ってもらった
と思えば、安いと思える価格でした。もっとも、発現が比較的上手く
いって望みの活性があったから言えることで、失敗すると高くついた
と思ったハズです。
本当に安いか高いかは、いくつもサンプルを依頼してみないとわから
ないことでしょう。
このタンパク質をもっと大量に作って、構造解析や抗体つくりの抗原
として使うなど、タンパク質がまとまって手に入る目処がつけば、攻め
るポイントもまた広がります。

845 ：通りすがりですが、おもわず、立ち止まってみている：02/10/02 02:49

>>843
国立大学の教授の先生なら、年収１千万前後、助手、助教授で
５００－１千万前後、学生の人件費はタダ？というところまで
加味して、数ヶ月を使うなら材料費と技術量をプラスして３００
万円でも外注したいと思う人が一方ではいるかもしれません。
また一方では、公務員の人件費は天から降ってく神聖なもので学
生はタダで働くものだから、３００万なら、研究材料費とすれば
イロイロ他に使い道あるし、半年かけて自分でやるよという先生
もいるでしょう。みなさんはどちら？
企業の研究者なら、この程度なら、外注に出す場合が多いのでしょ
うか？　
それとも、やはり企業・大学に限らず、委託する部分の研究上の
位置づけで、決まることかしらん？

846 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/02 07:37

>844 100ug/1万円なら飛びついたところですた（笑
ATPやアミノ酸を足してやればずっと回せないものかのう・・

847 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/02 13:18

大腸菌の発現用のプラスミドの作成のみを外註するとしたら、いまいくらぐらいなんでしょうか?

848 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/03 23:56

>>847
もう少し情報がほしいです。
一般的に販売されている大腸菌用発現ベクターに
目的の遺伝子を組み込むだけ？
それとも目的遺伝子のクローニングからはじめるの？

849 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/04 00:54

PCR断片は自前というところでどうでしょうか？

850 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/05 20:17

>>845
いま企業では「遺伝子はいじれるけれど蛋白や生化学はさっぱり」という
遺伝子バブル時代の研究者がかなり余ってます。リストラが進んでいる
ところもありますが、まだまだ「遺伝子構築屋さん」の人余り減少は続いて
いるとおもっていいでしょう。そういう人たちは、仕事がなくなることを極
度におそれているので、外注しようという動きを事前に察知しては妨害に
かかるようです(ワラ

851 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/06 00:57

富○死ね死ね死ね死ね死ね

852 ：名無し遺伝子を研究しる：02/10/08 00:26

>>850
このような話よく聞きますね。
cDNAライブラリーの作成, モノクロの作成, タンパク質の精製、組換え体の
発現、バイオマーカーのスクリーニング、動物への反復投与試験（安全性確
認のための）、代謝のデータ、臨床試験....と社内の他の部署に調整して頼
むよりも、外注したほうが、確実で何より結果が早い！　気分もいいですし
ね。という訳で私は外注推進派です。
外部に委託して、いい仕事をしてもらうのも、試験計画書・機密保持契約・
報告書の作成など決して楽ではないのですが、何ヶ月も無駄に費やすくらい
なら、数百万円位なら頼んだほうがマシという製薬会社の方は多いと思いま
す。
他の部署の抵抗にあわないようにするには、自分の部署でコアとなる技術や、
ユニークな物質があることが前提でしょう。抵抗に会いそうなときは、常務
や専務を味方につけるとか、そういったことを他の部署に知らせないといっ
たこともあるでしょう。

853 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/09 21:13

もまいら、簡潔にしる！

854 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/10 00:05

ピュアシステムを使ったことのあるヒトの発言を待ちたいので。age

855 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/10 00:12

だ　か　ら　・　・　・

やめとけって！

856 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/10 00:13

↑だから、宣伝ヤメレ

857 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/10 00:14

ごめん、↑は854に対するコメントです。

858 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/10 00:51

↑厨房？

859 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/10 19:50

しょぼい質問なんですが
unbound protein
ってどういう意味なのでしょうか？
誰か教えてください

860 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/11 01:08

>>859　ここはお前のような新兵が来る戦場ではない。帰ってまず辞書を引け。

861 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/13 23:35

>851
>855
>856
>860
最近この板も、いわゆる常連というか、管理者というか、巣食うやつらの
質が低下して、息苦しくなっているようだな。まともな議論も成り立たない
し、表層だけ、批判だけになっているね。昔はもう少し、まともだったが。
突っ込んだ話ができるようにするのが、あーたらの務め、ちゃうの？

862 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/13 23:43

いかにも商用の宣伝なんで白けたね
。
いちおう2chはみるけど、ほかのタンパク科学業界の人には知り合いがすくない、
ってひともいるから、書いておくけど、最近の受託業界は定価価格設定が高すぎで
す。それと一部の研究室にだけ特別割安価格とか短縮納期とか設定するのもやめた
ほうがいいと思います。
企業の人も、「奨学寄附金と共同研究契約を某大学のラボと結ぶ→そこから受託業
者頼む」というやりかたがよいみたいですね。まあこれはどこの受託でもいっしょ
みたいですけど。

863 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 00:00

受託は高いのが当たり前なんちゃうの？
特にタンパク質関連は。まず人件費が高なるし。
方法論が確立してるオリゴなら
パートのオバちゃんたくさん雇って安できるけどな。

864 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 00:07

それにしてもあからさまな二重価格制度は評判悪いっすね

865 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 00:08

ほんまは高くないんちゃうの？っていうかんじ
でとくに最近企業での派遣研究補助導入での人件費
全体がさがってきてるから、定価設定する時にもっとよく
市場リサーチすればぁ？って感じね

866 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 13:25

>>861
がんがります・・・

867 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 17:39

精製がテーマなのに精製できない（涙
修士卒業できるのかしら？？
粗精製で論文まとめるのに良い例となるペーパーご存じないですか？
ちなみにトリプシン様プロテアーゼです。

868 ：＞867：02/10/14 17:41

大豆トリプシンインヒビターでもaffigel１０に固定化して
一発アフィニティ精製できないのか？

869 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 17:47

やりたい、といったら先生に一括でダメだしされました（涙

870 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 17:50

＞858さん
しかも「もう粗精製でまとめる方向で、一応留年も考えておくように」
とまでいわれちゃいましたよぉ（涙

871 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 18:01

修士で留年は無意味だ、
粗精製でいいから論文にしろ。
博士でテーマを変えるか、就職して精製については忘れろ。

872 ：870ですが：02/10/14 18:05

どなたかタンパク精製に詳しい方いませんか～
メールの相手してくださいませんか～？

＞871さん
ちなみに就職したら化学やさんなのでもうタンパクはやらないんです
せめてもの救いです（涙

873 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 20:00

この板でなら、質問に答えるよ。

874 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 20:03

＞やっぱりこのばんじゃないとダメですよね（苦
普段あんまりＰＣの前にいられない～
しかもメール以外を開いているとチェック厳しいんです（涙

875 ：灯台院生 ◆yeOBWilgtY ：02/10/14 20:03

>>872
マルチかい(=ﾟＡﾟ)！！

876 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 20:05

＞875
ごめんなさぁい
マルチっていうんですね。
調べちゃいました
もともとはこっちにいます

877 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 00:32

タンパク質の精製って業者に依頼できるの？

878 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 09:05

>877
できる。しかし、いくらかかるかは「やってみないとわからない」
といわれた。

プロトコルが決まってりゃある程度予想はできると思うけど、
精製法を確立しながらなら、どんなにかかるかわからんのもあたりまえ。

879 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/18 23:26

そりゃそーだ罠

880 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/18 23:38

マジで何に金を使っていいのかわからんらしい。
政府に発言権のある経済学者が見てるぞ！

【経済】バイオ研究に２兆円投資－政府
http://news2.2ch.net/test/read.cgi/newsplus/1034554434/

政府はバイオ産業を自動車や情報産業に次ぐ中核産業に育成する「バイオ産業立国」の国家戦略の
概要を固めた。2006年度までに研究投資を現在の５倍の約2兆円に増額、日本が弱いバイオの基盤
技術と人材育成などに重点投資する。新薬審査などの規制緩和も進め国際競争力を持つ企業を育てる。
国内企業主導で2010年に25兆円と試算されるバイオ市場を育成、関連産業を含め新たに100万人の
雇用創出を目指す。引用元　　　　　
http://www.nikkei.co.jp/news/main/20021014AT2GI002213102002.html
275 名前：名無しさん＠３周年投稿日：02/10/16 22:28 ID:rXeA5GOc
いまさら遅いと言ってる人に質問。
それでは今、何に金をつぎこむのが良いでしょうか？
278 名前：名無しさん＠３周年投稿日：02/10/16 22:33 ID:Y+SPKaPE
>>275
彼らは批判するしか能の無い口だけ人間なのでまともな答えは返ってきません（ｗ

881 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/18 23:43

現在の5倍でも､米国の2分の1以下だろ｡

882 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/19 12:33

ageage

883 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/19 17:46

884 ：主婦のサークルです。：02/10/19 19:17

ほんの少し刺激を求めてる主婦のサークルを作りました！
私たち主婦が楽しめる安全でちょっとトキメキのある出会を求めて
只今男性会員を募集中です!!　女性会員も募集(^○^)/"

885 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/21 11:49

みなさん生化学会で収穫ありました？

886 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/22 00:04

ない

887 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/22 00:24

メンヘル板＆各板で暴れた姫嬢の悪行を補完しておこう

【警報】姫嬢には気を付けましょう。（名無しで煽る可能性あり。）
・姫いきなり切れて床の個人情報をさらしたうえに
名無しで暴言を吐く。
・床、本気で傷つき泣きながら兄を去る
・自治に対して問題発生したので、自治関連が話題となる
・実質上、自治に関わったコテはエロ、霧、悪意などの大物コテ。
・しかし、急に悪意が去った事で騒ぎになる。
・問題は姫ではないかとの推測レスが続出→次の日そのスレ全体削除、問題となった自分のレス削除
・これはさすがにおかしいと大騒ぎになり、本家メンヘルにまでスレがたつ。
・エロなどの大物コテはアク禁、最後に残ったヘルヨッチーに対する叩きレス、叩きスレがたつ
・ヘルヨッチーをかばうために、悪意が参上するが、ヘルヨッチーと共に追放される
・姫、珈琲その他の一味と結託して暴言吐き散らかしながら住人へ粛正と追放を開始。
あまりのことに住民が９割兄を去る。
ここに姫チャンネル（雑談１）、珈琲チャンネル（雑談２）が実質設置される。

http://www.bbs2.jp/hime/　姫板、たぬきと共同運営（2chで晒されて慌てて閉鎖)
http://choco.2ch.net/test/read.cgi/intro/1029138639/　珈琲スレ
http://www.bbs2.jp/menheru2/ 珈琲が仕切るさぼーるメンヘル板
http://www.bbs2.jp/menheru/ 姫が追放されたさぼーるメンヘル板
http://jbbs.shitaraba.com/sports/3587/ 姫が追放されたさぼーる避難板

888 ：灯台院生 ◆ipJni/6Rlw ：02/10/22 23:04

フジテレビの日！

889 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/23 00:48

いまから始めるとこなんですけど
pET、評判わるいですね。
このスレの存在を知っていれば・・・
うち、お金ないから、もうベクターかえられないかもしんないです

890 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/23 00:59

pETって、そんな悪いか？
まあプラスミド作製にはXL1-Blueでやって、発現はBL21DE3だから煩雑だけど問題ないのでは？
XL1-Blueでプラスミド作製していきなり発現させたいならpQEもある

891 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/23 01:05

pETはCBDかHisタグにかぎります。そんなにわるくないけど？
煩雑にはちがいない。

892 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/23 01:07

pull-downアッセイにはpGEX-2T系が一番！

　　　　　　　と言ってみるtest

893 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/23 10:05

http://www.n-works.com/any-u/

894 ：889：02/10/23 22:49

>890,891
それを聞いてちょっと安心しました
何かあったら、また書き込みます

895 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/27 23:56

↑白紙に戻そう遣唐使

896 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 01:41

卒論修論博論で発表する香具師！！！

897 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 03:17

キナーゼ精製しますたので発表しますが何か？

898 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 11:03

ようやった！

899 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 12:28

890さ、初めからBLでやれば？

900 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/03 01:23

900!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

901 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/03 11:53

>>897
PDだったら笑う

902 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/03 12:53

>>892
何故に？？？
オレは6p2でやろうとしているけど、
2tがいいのか？

903 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/04 12:08

>902
どっちでもいいよ

904 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/05 20:12

>>902-903
プレシジョンの認識配列ちょい長すぎ。hydrophobicだしchargeも
あるんで、artifact要注意。
"simple is best" あげ

905 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/08 23:34

あげ

906 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/09 00:56

ずっと子のスレ見て来ましたが
昆虫細胞（High Five)で安定発現株樹立した人いない？
当方、モノは無血清培地からFPLCで回収してまつ。
樹立までに時間かかったけど、今はらくらくだよ！！
生化学会見てまわったけどそう言うのんはなかったなぁ～
無血清万歳！！！

907 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/09 13:39

>>906
HighFiveってことはバキュロですよね。
あれって、感染したら細胞って死んじゃうんじゃないんですか？

908 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/10 00:25

>>907
だから安定発現株なんだってば・・・
昆虫細胞発現用のベクターをほり込んでるのよ

909 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/10 01:26

メリットは何？いちいち感染させずに済む以外にある？
収量かなり下がるんじゃない？

910 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/10 09:08

>>906
面白そう。
誰だか特定できない程度で伊井からもうちょっと教えて。
論文とかで素手に発表されてるものなんですか？

911 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/13 02:49

>>909
私の精製しているタンパク質は分泌だから培地から回収できる。
細胞が死なないから、プロテアーゼ等の心配も得に無い。
だから精製が楽チン。終了は１．５ｍｇ／Ｌ

>>910
インヴィトロジェンのＨＰ見てごらん

912 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/13 17:45

無細胞系で、E.coli Lysateではなくて、昆虫か哺乳類のってありますか？
http://www.roche-applied-science.com/sis/proteinexpression/の
Rapid Translation Systemだと、いろいろ修飾されないんで・・・。

913 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/14 07:53

age

914 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 01:10

精製とは違うのですが・・・

精製した蛋白をDynaPro測定したとき、
流体力学的半径がSDS-PAGEの結果よりも低い値になってしまいました。
これは、その蛋白は球状ではないと解釈してもよろしいのでしょうか。

教えて君ですみません。

915 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 01:11

>>912
コムギ胚芽の系ならありますよ

916 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 08:03

ageeeeeeeeee!!!!!!!!!!!

917 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 08:56

コムギ胚芽の系って、翻訳後修飾（糖鎖とか？）されるの？
かなり疑問なんだけど。

918 ：912：02/11/20 09:52

>915
それって活性もった酵素とか、膜タンパクとれます？
キットのソースきぼん。
植物系ってベクターどんなのつかうの？

919 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 21:23

>>912
翻訳後修飾なんて細胞によりけりだから、いくら哺乳類由来の翻訳系使ってもダメだろ。

920 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 21:26

ウェスタンやってて、フィルムがＣＢＢ染色みたいに
ノンスペシフィックにいぱーいバンドがでてしまった経験ってないですか？

あれは何が原因なんでしょうか？
メンブレンのブロッキングが長すぎたり短すぎたりしたんでしょうか？

921 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 21:42

一次抗体か二次抗体が変性していて、ノンスペでいろんなタンパクにくっついた

922 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/20 23:46

>>918
膜タンパクって膜にあってこそ機能すると思うのだけど、
それを精製してきてなにをみるの？
取ってきたところで膜がない状態では構造維持してないだろうし
不溶化してるか無理やり伸ばした状態でしょ？

厨房なのでおしえてください。

923 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/21 00:17

>>920
TGU

924 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/21 01:12

>>922
いかにも、よく知ってるやつが知らんぷりして書きました、って文章だな。

925 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/21 01:37

>920 市販のブロッカーを試したら
あと、非タンパク性のブロッカーを少量抗体の液にも混ぜると、ノンスペの結合は、かなり改善されます。

926 ：912：02/11/21 11:52

コムギ胚芽って
http://www.jsps.go.jp/j-rftf/saishu/092-5_j.html
のことね。
膜タンパクはみんな狙ってるから、あんまり教えられないの。
ごめんね。

927 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/21 18:44

>>912
http://www.promega.co.jp/cat/1201001.html

928 ：53：02/11/21 20:44

「（阿佐島さんのところはXnr3がtropicalisとlaevisで違うことを発表してるけどな
『予想じゃレービスと同じになるわけだからな。』てのもハズレてる訳だ」

わかった、わかった。ちがう例もあったね、おめでとう。
俺が言いたかったのは、そんなことじゃないんだよ。
別にカエル学をしたいんじゃないんだから、レービスで分かったことを
トロピカリスでわざわざすることもないってこと。
どうしても上述したようなトロピカリスの利点で解析したいってときに
トロピカリスでやるってことよ。で、その必要を感じる人が少ないってことじゃないの？

「今、laevis屋がzebrafishやmouseやC. elegansも一緒に扱って遺伝学的にlaevisの結果を補足しているのが
て蛙で賄えるようにしたいんだろう。」

これ論外。他の動物でやる意味はお前が考えているようなことではない。

ってことで、zebrafishは低能、研究禁止。

929 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/21 20:46

ん？
スレ違いじゃねぇか？ヴォケ！

930 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/22 18:29

http://freebbs.around.ne.jp/article/p/purif/index.html
↑
クールだね

931 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/26 11:38

N末にシグナル配列を持つタンパクなんですけど、そのまえにタグ付けて
発現させたら、切断されて回収できないなんてことあります？
それともシグナルはN末一番からはじまっていないと、認識されない？
プロセシング受けて、切れるタンパクはC末タグ使わなくちゃいけないのですか？

932 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/26 12:27

>931
確実にプロセシング受けるなら、C末使うべきだよね
だって、そのとき、タグないもん
ふつうはN末とC末の両方の結果を見るんだろうな

933 ：931：02/11/26 13:52

>932
シグナルペプチドが1～15番目だとして、
その前にヒスタグつけたとしても、
シグナルとして機能し、輸送され、切断されるわけですね。
N末末端から始まらなくても。

934 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/26 23:42

>931
やりたいことがよくわからんが・・
シグナルの前にTagつける意味がよくわからん。
シグナルがついた状態のタンパク質がほしいのか？
実験の意図が全く見えないので、もうちゃんと説明しれ。

935 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/27 13:43

>934
ORF全長入れますよね。C末かN末か迷いますが、N末ならプロテアーゼで
切断すれば残りませんよね。でも確実にプロセシングで切れて、N末タグ
使えないなら、C末しかありませんよね。
途中でもシグナル配列があれば切れるのか、
シグナルが1番からはじまっているから切れるのかどっち？

936 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/01 22:49

937 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/03 03:59

ちがうとおもうぞ

938 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/03 08:46

>>937
そのちがうとおもう理由をAAで表現せよ！

939 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/03 11:35

940 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/04 10:36

941 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/08 17:25

942 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 01:23

いきなりHisタグで始まるコンストラクト作っても頭にMetがなくちゃ翻訳されないのではない
かと思うのですが？

943 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 01:43

厨房の考えそうな質問ですね

944 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 11:47

945 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 16:34

>942
ｱﾀﾏﾜﾙｲ

946 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 18:02

わかった。kozakとMetもつければいいんだ。

947 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 22:00

>935
申し訳ないが本当にあなたの日本語がわからない。
どこの途中にシグナルを入れるつもりなのよ？
こんな日本語だと、論文どころじゃないぞ（ｗ
ゼミでもだれもあなたの言ってること理解できてないんじゃないか？

948 ：９４７：02/12/09 22:02

そもそも、ORFの途中に入れてもシグナルが機能するとは
おもえんぞ。
・・・・
今ふと頭をよぎったんだが、これってマレスしちゃいけない？
俺ひょっとしてつれちゃった？

949 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/09 22:56

>>947
たぶん釣りじゃないと思うけど、ORFの途中に入ってるシグナルが機能するかが当人には疑問
なんだと思います。スクリーニングして全長取れたからタグつけて発現しよう、だけどN末端は
シグナルペプチドで15番目のとこで切断されるとモチーフ検索で出てる、どうしよう、という
ことでしょう。

950 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 09:40

951 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 11:45

952 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 21:16

>950は次スレをお願いしまつ

953 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/10 21:45

>>952
950じゃないけど立てました。

次ぎのスレ
タンパク質の精製２
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1039524190/l50

954 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/11 02:06

955 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/11 20:19

956 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/12 15:42

957 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/13 14:12

958 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/13 19:30

959 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/13 21:53

960 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/14 00:12

961 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/14 17:08

962 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/14 18:12

http://search.yahoo.co.jp/bin/search?p=%A5%A2%A5%A4%A5%A2%A5%F3%A5%E1%A5%A4%A5%C7%A5%F3
ココの一番下、すげー面白いYO! 携帯でも見れるよ

963 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/14 20:51

964 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/14 21:31

965 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/14 23:19

ココの一番下、すげー面白いYO! 携帯でも見れるよ

966 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/17 19:15

967 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/18 19:17

968 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/19 17:13

969 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/20 02:37

できたらここ見ながらdat落ちさせてくんない？
http://science.2ch.net/kakolog.html
ここのwait合計が10000になる直前でよろしく。
それならdat落ちしてもすぐhtml化されてまた読めるようになるんで。

このスレとか実験でうまくいかないことスレとかたまに読み返したいんで
よろしこ。

970 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/21 14:41

>969
このスレを自分のPCに保存しようという頭は働かんのか？

971 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/21 20:05

972 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/22 17:07

973 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/22 20:51

974 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/22 23:57

975 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/23 12:55

976 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/23 17:11

977 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/23 20:02

978 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/24 02:48

979 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/24 11:36

980 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/25 17:29