いま実験でうまくいかないことｽﾚｯﾄﾞ

いま、はまっていることをこのｽﾚｯﾄﾞで愚痴ってください

りん酸バッファーの組成を間違って
ちっともpHが合わなかった...
鬱だ氏のう...

カラムに通すと酵素が死ぬ。比活性が１０％ぐらいになってしまうのです。DEAEはそんなことおこらないらしいのに。２回やっていずれも死んでしまいました。酵素を取ろうとしたら培養から１週間もかかります。はああああああああああ。

elution の条件は正しいですか？
案外、カラムから流れ出しているのかもしれません。

吸着条件をもう少し弱くしてみては？

>3
何の酵素で、どんなカラム＆溶出条件でやってるのか書いてみ。

形質転換効率が非常に悪いです。
どうすれば良くなりますかね？
ベクターはpUC19で
4000bpsの挿入断片をSma IとKpn Iで切ったものを
ライゲーションしたものです。

>7
コンピは？

>3
パイロット実験やって至適条件見つけてからすけーるあっぷしよう。弱い酵素の場合特に｡

＞3

CHAPSとかTritonX-100を0.05%ぐらい平衡バッファーに入れておくと
カラムやチューブへの非特異的な吸着が抑えられるかもしれない。
緩衝液に250mM sucroseや10% glycerolを入れておくのもいいかもしれない。
疎水性クロマトグラフィーの場合、疎水的な酵素がカラムに吸着して出てこない
ような場合なら５０−７０％エチレングリコールを含む緩衝液で出てくることがある。

E.coli JM109を使ってます。
他の人の実験でコンピに異常がないことは確かめられてます。

ライゲーションがうまくいっていることは確認してる？
Sma Iのブラントエンドがいかにもくっついていなさそうな気が・・・。

>7,11
実験の手順が分からん。酵素切断後にゲルで確認しているのか？
ベクターはちゃんと切れているやつだろうな。AP処理してあるのか？
挿入断片はゲルからの切り出しか？
そういった、ライゲーションまでの手順をしっかりと書いてみろ。

効率が悪いって事は、コロニーはでてくるわけだよな。
pUCって青白できたっけか？
パソコンのトラブルシューティングと一緒でできるだけ詳しく状況を説明しよう。

ライゲーションはどうやって確認すればいいのでしょうか？
それが分かればかなり助かります。

酵素切断後にゲルでチェックしてます。
ベクターもオッケーです。
挿入断片はゲル抽出したやつです。

ブルーホワイトセレクションしてます。
でもホワイトコロニーのプラスミドを抽出しても
ほとんどがセルフライゲーションです。

手順
ゲノムをSma IとKpn Iで切断しゲル抽出（4000bps)。
Sma IとKpn Iで切断したpUC19と16℃でライゲーション。
その後形質転換。

ベクター内のSmaIとKpnI って

5'-ggtacccggggatc-3'


ダブルダイジェションでは切れないと思うぞ、近すぎる

おお、ほんとだ＞15
KpnI
5'-ggtac|ccggggatc-3'
SmaI
5'-ggtaccc|ggggatc-3'

こりゃきれないわな。
べつの平滑末端に切り替えだな。HincIIに変えてみよう。

東大最凶さん、おっしゃるとおりです。
挿入断片を平滑化してSma Iサイトに
挿入を試みてみます。
ありがとうございました。

それと、ライゲーションの確認はゲルで流すしかないな。
4000bpならpUC(3000bp)を足すわけだからかなりサイズが違って分かりやすいだろう。

それと、ゲノムからなら、別に平滑化してもいいんじゃないか？
SmaIで切ったベクターがあるならインサートを平滑化してしまえば良い。
ベクターをAP処理すれば、セルフライゲーションも減るしな。

>15,16
これってベクター作製時に、Sma�T処理した後にKpn�T処理しても
やっぱ切れないんでしょうか？

New England BioLabのカタログによれば

sample cleavage efficiency
gggtaccc 0% (2hr) 0% (20hr)
ggggtacccc >90% (2hr) >90%(20hr)
gggggtaccccc >90% (2hr) >90%(20hr)

制限酵素認識配列の外側に少なくとも２塩基ないとKpnIで切れないみたい。

>20
勉強になりました。
ありがとうございます。

関係無い者だが、東大最凶を尊敬した。

>22
同意。
15分でデータがでてくると言うことは、どのカタログにどのデータがあるか把握してるんだ。
しかも、New England BioLabって、渋いなぁ.

>23
DNAﾜｰｸを頻繁にやる人にはNEBのカタログは必須だと思うよ。
しかし、最凶さんはのすごさはほかのトピックでのほうがよく分かる。

>24
あ、酵母さんだ！暇な時に過去ログをさがしてみます。勉強になります。

そうか〜。NEBのカタログさがしてこよっと。
かさばるけど、カタログは多い方がいいもんな。
しかし、古くなったカタログの使い道には困るな。
なんかありません、使い道＞皆さん。

sigamaのカタログも使えるぞお。
重石に。
ゲルからメンブレーンにトランスファーするとき。
でも、最近は電気でやることが多くなったなあ。

＞22
確かに。僕も東大最凶さんはなかなかできるなあとかねてから
思っていました。酵母さんもそうだけど優秀だねえ。

優秀なのに、ここにきてるってのは、不遇なんだろうねえ。
みんな、境遇にまけるなよ。
おれもがんばるよ。優秀じゃないけど。わら

イントロン、プロモーター領域のシーケンスをしている
のですが、GCリッチでうまくいきません。Tmの高いプライマー
でやる以外に方法はありますか？

DNA断片を平滑化して形質転換してみたのですが
やっぱりうまくいきません。
みなさんはどのような方法で形質転換されてるのでしょうか？
良ければ具体的に教えてください。

＞30
私はブラントエンドが嫌いなので
インサートの端っこの方を制限酵素で切る際に
平滑末端にならないやつを使っています。
Sma IとかEco RVとかじゃなくて。
それで、インサートもプラスミドも同じ酵素で切って
泳動してゲルから切り出してライゲーションすれば、
セルフライゲーションはしないし、自分の思った方向に入るしいいと思います。

>30
まさかと思うけど、ベクターも平滑末端だよね。Kpn Iで切ったやつじゃないよね。
あと、AP処理はしましたか？ゲルから切り出した後精製段階でロスしてませんか？
DNA断片を平滑化すると、断片のセルフライゲーションも起こるので条件がシビアだよ。
ベクターは全部AP処理しておくのがお勧め。

＞３０

全部ブルーなんですか？ホワイトでるけどスカなの？
プレートしばらく冷やすと薄い青が見やすいよ。

みなさんありがとうございます。
う〜ん、ゲノムから制限酵素で切り出すときに
Sma IとKpn Iがもっとも短く（4000）目的遺伝子を含んでいるので
これで切りたいんです。この後、シーケンスしないといけないし。

で、pUC19ではSma IとKpn Iとで切れません。（東大最凶さん参照）
なので平滑化してやってみました。
pUC19をSma Iで切ってAP処理したものを使ってます。

ブルーもホワイトも出ますが
全体的に数が出てこない。（50〜100コロニー）
ホワイトはスカが多いです。

何か良い方法を教えてください。

＞34
平滑末端のインサートをクローニングするとき、普通の方法でだめなら以下のようにすることがあります。
１）インサート内部になく、かつ平滑末端を生じる制限酵素でpUC19を切る（HincIIなど）
２）ベクター：インサート比を１：１０−２０ぐらいにする。
3）ベクターはAP処理しない。
4）タカラライゲーションキットver2を使い１６度数時間反応。
５）形質転換後、LB/Ampのに生えてきた多数のコロニーをかき集めてまとめてminiprepする
６）HincIIなどで、もう一回切る。（insertのあるcloneは切れない）
７）形質転換して生えてきたコロニーをminiprepしてinsertを確認する。

大量のセルフライゲーションがあっても１個でも欲しいコロニーが生えていればこの方法で取れると思うのですが。

セルフライゲーションでホワイトとブルーが生じるのは,制限酵素で切断後、調製していたDNAにコンタミしていた
ヌクレースによって末端が囓られているのではないでしょうか？XL1-blueなど、高品質のDNAが取れる株を使用するのを
進めます。JM109はminiprepによるDNA調製には適していない(ニックが入りやすい）と聞きます。

ゲノムそのものを分解したもんでないと駄目なの？
ゲノムを鋳型にPCRで増やす、
その際、ぷらいまーの５’末端に適当な制限酵素サイトをつけとく、ってんじゃ駄目なの？

あと、ライゲーションは、16℃オーバーナイトでやったものが駄目でも、
その後4℃で２，３日置いとくと少しはくっつくらしいぞ。

＞35、＞36
レスありがとうございます。
やってみます。
週明けに結果報告します。

>35
そんな方法があるとはしらんかった。オリジナルですか？
でも、コロニーを全部拾ってたら無駄ですね...。

>34
コロニーが50〜100はすくないね。他の実験ではもっとでるわけだよね。
コンピテントセルは買ったもの？それとも自作？

>37
PCRで増やすと正確性に欠けるからじゃないのかね？
それに、PCRかけるならTAクローニングでもいいと思う。
なんだったら、切り出した断片をpfuとかで増やしてクローニングすれば？
pfuじゃTAはできないけどね。

＞３５
コロニーを全部つついてminiprepまでは同意。
その後泳動して目的のバンドを切り出しても一回形質転換は？

ウエスタンで定量しようとしてるのですが、これって信憑性あるのでしょうか？
同じサンプルを流しても結構濃さ変わるのですが、、、。
僕が下手なだけ？

＞39

全面にコロニーが生えたプレートの上に２ｍｌほど10xTEをたらして、ピペッティングで良く洗いとり
まとめてminiprepする、という荒技なのですけど、一応うまくいきます。
TAクローニングシステムをつかわないでventで増やしたPCR産物をクローニングする場合でも活用します。

今、1Kb程度のPCR産物をApaIとNaeIという二つの制限酵素でCutしたい。
しかしそれぞれの制限酵素Bufferの濃度は違っている。
一回一回エタ沈してもいいが、どんどんPCR産物が減って行ってしまいそうでこわい。

Ikb程度のDNA液を高率に濃縮できるカラムを探しています。
誰かいいメーカー教えて下さい。
マイクロコン使ったけど、濃縮効率が悪く、
制限酵素がうまく働いてないみたい。キレがわるい。
やっぱエタ沈なのか。
うむー。

NaeI Bufferがなんかちょっと特殊なんだよね。

GFX使ってます。

S&SのElutip-dがいいよ。
エタ沈するけどMG使うのでロスも気にならない。
サンプルもらってみたら？

＞42

希薄DNA溶液の濃縮には、イソブタノールを入れて振って遠心する操作を数回おこなって
水を減らして２０−３０ulぐらいにします。
心配ならエタチンメイトかグリコーゲンを入れてからエタ沈してます。

みなさんありがとうございます。
参考にさせて頂きます！

トランスフェクトが安定してできません。
細胞数が違うと結構ばらつくものですか？

トランスフェクションの方法は？
付着細胞ですか？
プラスミドの精製方法は？

CsCl超遠心を２回に（自分は古い人間ですから）、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン、リポフェクタミンぐらいしか
やったことないので、分からん。
cos,hela,293,それぞれ違うし、、、、。

超遠心にかけたら目的のタンパク質が消える
悩むこと一週間、すべてチューブに付いていることを知る
チューブをシリコナイズしてもう一回
それでも消える
複合体を取りたいので塩濃度も界面活性剤の濃度も上げるわけにも
いかず現在放置・・・

>38
>pfuじゃTAはできないけどね。

秀潤社の「PCR Tips」の初版p60によると、
”Taqに比してP効率は落ちるものの、Pfuでも十分にTAクローニング可。電気泳動で30-40％の割で1塩基付加されているのを電気泳動にて確認”とある。試したことはないけど。

>50

シリコナイズじゃだめさ。目的の蛋白質がスティッキーなら、ダミーの
蛋白質で浮かせるのが定石でしょ。

チューブは１０mg/mlのＢＳＡ溶液を入れて３０分放置。後、ＢＳＡ溶液
を捨てる。できれば蛋白質液にもＢＳＡをいれたいところだが、どれだけ
入れればいいかはスケールによる。とりあえずは１mg/mlＢＳＡを
試してみそ。

>51
げ、しらんかった。覚えておきます。
役立つなぁ、このスレ。
その本も暇な時に読んでみます。研究室にあったな...。

僕はタンパク質溶液扱う時はピペットのチップに取られるのを恐れて、
一度１％ BSA／PBSを吸ってはいてしてから、吸います。
量の正確さよりもタンパクの吸着の方がこわいので。
昔はシリコナイズしていましたが、BSAのほうが楽でそのうえ効果的みたい。

>40
Westernはサンプル泳動、転写、一次抗体、二次抗体、酵素反応による発色とかなりstepがあるからねえ、一つ一つ丁寧にやらないと再現性むずかしいかもね。至適サンプル量や均一に転写できてるかなどいろいろcheckしてみれば？

＞54
ク○リティのチップは駄目だね。
ソレンソンかポーレックスなら吸着しないよ。
値段も安いし。

＞52、54
試してみます
結果は後日

JM109 って、ゲノムのクローニングには不向きだって聞いたことがあります。
他の菌株由来のコンピを試してみては？

JMは組み替え起こすからな。
DH5,DH5a,NM522なんかどう?

イントロンの最高長ってどれくらいなのですか？
限界長ってあるのでしょうか？

>>29
ワンステップで反応すませちゃう方法がなかったっけ？

>60
Bcl-2のイントロンって長いよ。
割と後ろの方。

染色体とか全然違うローカスにまたがる
トランススプライシングなんかは最長のイントロンでは？

そのような場合はどのように転写されるのですか？
転写複合体が移動するのか、ゲノムの方が近寄ってくれるとか。

チューブをBSA溶液で洗ってみましたが相変わらず大量にチューブに吸着されます
こうなったらリコンビナントの目的タンパク質でチューブを洗ってみるか・・・

＞４０
転写が完全に出来ているか、転写後のゲルを染めて確認（バンドが染まる程度の濃さなら）。
一枚のメンブレンで発色させないと度合いが変わるため言い訳できません。

＞５０
どんな目的なのでしょうか＜遠心
密度勾配で分離しているのか
ペレットダウンさせているのか、、、

>66
グリセロール密度勾配です
カラムを通すという手段もあるにはあるんですが、この調子だと
ビーズに吸着して出てこなそう

>40
transfer後のメンブレンをポンソーで染めてみて大体同じ位たんぱくのってんなーとかはやってたけど・・・。参考にならんね。

>67

バイオラッドのロトフォアとかプレパレーション用SDS-PAGE（あるいはNative-PAGE）で溶出させてから、再生するのではダメ？

>67

バイオラッドのロトフォアとかプレパレーション用SDS-PAGE（あるいはNative-PAGE）で溶出させてから、再生するのではダメ？

古い話で恐縮ですが35の東大最凶さんに質問！
4)のステップの後で形質転換の前にHincIIで切っちゃって、それを大腸菌に入れる
と言うのはどうなのでしょうか？
理屈の上ではインサートが入っているかサイトの壊れているプラスミドだけが取れ
て来ると思うのですが、現実にはDNA量の関係とかから上手く行かないのでしょか？

>69

そういう手もあるんですね
考えてみます

ライブラリーのスクリーニングがうまくいかない。鬱だ子嚢。

>73
詳細奇ボンヌ

FACSのデータ解析で、MIFを使ってやってくれといわれ、よ
く分からないから調べてみるようにといわれているのです
が、いまいち情報にたどり着きません。誰かご存じの方が
いたら処理法を教えてください。

>74
PCRで釣ってきたプローブが短すぎるらしくてハイブリしません。

何塩基あるプローブなのですか？
ラベリングがうまくいってないのかも。
32Pを5’側にkinaseでつけてみては？

>77
プローブは170bpです。ラベリングはアマシャムのキットを使った
ランダムラベルと、プローブ両端のプライマーでPCRを試してみま
した。ラベリング後はG-50カラムでフリーのPを除いてます。
kinaseでラベル、検討してみます。

ウエスタンでポジコンすら発色しなかった・・・
一時抗体の後のwashの時漫画読んでて置き過ぎたのが多分原因。
とりあえずリブロット。

そういえば、抗体が腐らないようにアジ化ナトリウムを
入れていたけど、これはアジ化カリウムで代用できるのだろうか？

＞８０
アジ化ナトリウム、みんな入れてるの？　なんで？　俺、入れてないけど。
だって、こんな不安定な物質、確かに入れた直後は抗菌作用を示すだろうけど、
すぐに分解しちゃうんだぜ？　その後は雑菌も増え放題だよ、活性のある
アジ化ナトリウムを加え続けるのならともかく。

自分もアジ化ナトリウム入れてない。

age

>82
僕は実験室よりも居室やお茶飲み場で使うことのほうがおおいな。

E.coli　BL２１にpET（インサートなし）をいれたコロニーを液培（30度）すると定常期になるまで１２〜２０時間とすごく差がでてしまうんですけどなにが原因なのでしょう？
12時間で本培養できるとおもっていたら全然育たず、今日は徹夜です。

>85
シードカルチャーはちゃんとプラトーに達した奴を
いつも一定量入れてるんだろうな？

まさかコロニーを直接つついて本培養にもっていってるんじゃ
なかろうな。それじゃ誤差が激しいのも当たり前だぞ。

すとらたに続いてTaKaRaまでλgt10生産中止に.......(泣。
時代ですかねぇ.....。

某ボスが「標的遺伝子に違いない」とヤマかけてる(ﾏﾀｶﾖ…)プローブでばーちゃるのざん(でも鎖長でら短い版)。コード領域プローブなんて届かんっちゅーとるに、極めて強くリコメンド。
で、案の定、差どころかシグナルごと皆無.....。これで勘弁してくれればいーんだが....。(泣

もう誰も見てないと思いますけど。
3'-RACEがうまくいって700bp以上のプローブを手に入れました。
これでうまくいくといいなあ。

age

リポソームがうまく作れない。
誰か詳しい人いる？
凍結乾燥品は吸湿しやすいんで、固体では
重さをはかるのが難しい。
でもクロロホルム溶液やメタノール溶液の
ストックを分注してから飛ばして、それを
バッファーに懸濁しても、残っている
有機溶媒が邪魔しているのか、うまく作れて
いないようなかんじ・・・こんなことって
あるのかな？

げ

ココに書いてあることが殆ど理解できない
自分はまだまだという事だな…
ガンバリます。

免疫沈降でひっかからない蛋白は
ウエスタンでポジティブでも、無関係な蛋白だったのかな

スパーサイヤ人にうまくなれない
普通のサイヤ人まではなれました
サイヤ星に月末あたり行ってみるか‥

>>94
無関係とは言いきれないと思う。

>>95
まずは穏やかな心を見につけましょう。

[3:29] ブタは工場の機械のように扱いなさい。 ■▲▼
1 名前： 名無しさん＠１周年 投稿日： 2000/10/22(日) 03:26

ブタが動物であることは忘れて、工場の機械のように扱いなさい。
つまり、機械にも定期的に油をさすように、ブタもスケジュールどおりに処理しなさい。
繁殖期も、工場での組み立てラインの第１段階と思って扱えばよいし、
市場に出す際にも、仕上がった商品を出荷するのと同じように出せばよいのです。
母豚は１個の高価な機械と考えるべきだし、そのようなものとして扱うべきである。
そしてこの機械の役割は、ソーセージ製造機がソーセージをポンプで押し出すように、
子ブタを産み出すことである
http://mentai.2ch.net/test/read.cgi?bbs=food&key=972152791&ls=50

で、その実験はどこがうまくいかないのですか？

プラズモンセンサーで見ろ。

複合体の半減期が短いとか交換反応が速いのかもしらん。

＞９４

>>96
>>99
感謝！
挫けかけてたけど、じっくり調べてみる。

あげます

頑張ります

あげちゃえ

「開封したら注文」って書いてあるのに.....またぁ.....。
祝日＆週末の為威力倍増ですわ。

酵母のX-gal反応アッセイ
酵母のCo-transformation
酵母から金かけずにタンパク抽出
アア･･･どれも何となくうまくいってないような気が、、、

うちではそれに加えて、注文した人がわからない
ことがある。
このネンブタール、誰が注文したんだろう？？

>>105
詳細をどぞ。

>>107 レスありがとうございます。
今一番の悩みは酵母の菌体破砕です。なんせ今まで大腸菌オンリーだった
研究室なもんでして、専用の破砕機はもちろん、方法も全く手探りの状態からでした。

詳細に書くと長くなっちゃいそうなんで省きますが、特に最後の酵母の破砕が
どうもうまくいってないようなんです。方法はガラスビーズとボルテックスを使って
激しく撹拌して破砕する方法で、このあとBindingAssayを行っても殆どタンパク発現
が見られない状態です。もちろんタンパクの発現量が少ないとも考えられますが、
もしかしたら破砕の方法が悪いのか？とも考えられるわけで、ちょっと困った状態になってます。

どなたか特別な機器を使わずに効率よく酵母を破砕する方法をご存じないでしょうか？
大腸菌を破砕するための超音波破砕機ぐらいはありますが、、、

＞109

わたしはビーズビーターを用いて出芽酵母を壊していました。対数増殖期の酵母カルチャーをすばやく冷却して
10％グリセロールを含む破砕緩衝液を菌体容積の１-２倍加え、そのスラリーと同じ容積の目の粗いガラスビーズ
を入れて氷で良く冷やしたビーズビーター中で１０秒破砕、２０秒休止を１０回ぐらいやりました。

対数増殖期にはバッドが細胞からトビ出ているのでそれをガラスビーズが首チョンパして壊す原理なので、増殖速度が
早い時期に細胞をすばやく集菌するのがミソだと聞きました。
コツさえつかめば15ｍｌのプラスチックチューブに菌体、破砕バッファーとガラスビーズを入れて低温室で
ボルテックスしても壊れます。

>109
普通の光顕で、破砕された後の細胞壁が抜け殻みたいに見えます。
一度確認してみては？

レスどうもありがとうございます。
>>110
ビーズビーターって、鉄の棒をサンプルに突っ込んで
超音波をかける、というものではないですよね？新しい機器を
買うお金がないので欲しいけど無理ですねぇ。残念。

対数増殖期に破砕ですか。今までは菌を出来る限りたくさん集めようと、
かなり長い間培養していました(ODは2を超えてました)。OD値はどれぐらいまであげてますか？
一度増殖曲線を書かないとダメですね。

それとチューブとボルテックスを使っての破砕ですけど、低温室内ならば
ずっとボルテックスにかけていてもいいのでしょうか？今は室温で、30秒
ボルテックス、1分on ice を20回繰り返していました。
なんだか聞いてばかりで申し訳ありません。

>>111
見たことはあるのですが、いまいち潰れたかどうかはっきりと分からないんです。
レンズの種類も少なく、あまり高倍率で見ることが出来ないからかも知れないです。

ビーズビーターはアクリルの筒の中にテフロンとかステンレスの羽根が付いていて
ミキサーのように強力なモーターで回るものです。周囲に氷や冷却水で冷やすためのジャケットも
ついています。

失活しにくい酵素の活性を酵母から抽出したいのであれば、50mlファルコンチューブに
菌体、破砕緩衝液、グラスビースを全量10ｍｌぐらい入れて蓋をしてテープで堅くとめます。
50ｍｌビーカーを逆さにしてファルコンチューブにかぶせます。カラム立てとクランプ、
ボルテックスを組み合わせて、ボルテックス上で50ｍｌファルコンチューブが自由回転するように
逆さにしたビーカーをクランプで固定します。

低温室で10分くらいボルテックスをかけておけば、疲れませんし、ほぼ細胞は壊れました。
ボルテックスのゴムの部分はある程度熱くなっていましたが、βガラクトシデースを
測るのには問題なかったです。

久しぶりの書き込みです。
板の雰囲気が変わっててあんまり長居したくないんですが、

>このあとBindingAssayを行っても殆どタンパク発現
>が見られない状態です。もちろんタンパクの発現量が少ないとも考えられますが、
>もしかしたら破砕の方法が悪いのか？

これは、ポジコンをおかなきゃ駄目ですね。
おそらくtwo　hybridをやってるんだと思いますが、
強固に結合する事が分かっているもの、
あるいはAD-X,BD-Yの代わりにGAL4全長を使った時にLacZの活性がどうなのか。
というポジコンは必須です。
コントロール抜きでは何も言えません。

ちなみにうちではガラスビーズを使って壊してます。
細かい実験方法に関しては羊土社から出てる
「酵母による遺伝子実験法」が分かりやすいと思います。
更にいうと、うちではBD側を2μでなく、染色体のTRP1座位に組み込んで
使ってたりするけどまたそれは別の話。

何度もありがとうございます。
ビーカーをカラム立てとかでボルテックスの数センチ上で固定して、
その間にチューブを立てて(置いて？)あとはボルテックスのスイッチ
をオンにして低温室で放置すると言うことでいいのでしょうか？
来週当たり早速試してみます。
それよりビーズビーターいいですね。欲しいなぁ、でも高そう、、、

ちなみに目的タンパクはヒトのレセプターです。失活しやすいかどうかは
分からないですが、、、(^^ゞ

>>114 どうもありがとうございます。
two-hybridはしてないです。
酵母内でヒトのレセプターを発現させるというのがテーマです。
一応Wild株と変異株の両方を破砕してBindingAssayにもって
いってたんですけど、上記のようにあまり思わしくない結果に
なってしまってました(とりあえず値に違いは出てます)。
今は別の高発現のベクターを用いて再度クローニングを行い、
来週当たりに破砕を行う予定です。

うちの研究室ではtwo hybridは酵母じゃなくて大腸菌でしてます。
これって日本じゃ殆どやってないそうですね。
いつも教授が自慢げに言ってます(笑) 本当なんだか。

TAKARAのキット使ってるのに、DirectMutagenesisがうまくいかない。
PCRなんてもう嫌だぁ・・・
けど僕が下手なんだろうな。
練習あるのみ。

>>117
どのキットを使ってるかとか書いてみたら？
練習だけじゃ、どうにもならないこともあるし。
キット添付のコントロールは試してみた？

＞１１５
私はもう酵母使っていないのですが、やはりビーズでないと破砕できないもの
なんですか？　金属の容器に入れて、液体窒素で凍結融解を４〜５回も
繰り返せば、簡単かつマイルドに全細胞抽出液が得られる気がするのですが。

昔私がとっていた蛋白質は衝撃にやたら弱く、ちょっとソニケーションするだけで
ペプチド鎖がちぎれてしまうものだったのですが、液体窒素での凍結融解できれいに
とってくることができたことがありました。

凍結融解とは、凍結してその後室温で放置すればいいんですか？

いえ、液体窒素による一瞬の凍結と、急速な解凍によって
細胞を壊す方法ですから、３０度ぐらいの温水バスで解凍します。
このとき注意しないといけないのは、サンプルの温度が
上がりすぎないようにすることです。氷水なども用意しておきましょう。

「（１）液体窒素で凍結＞（２）３０℃の湯浴でサンプルが融けかけたら、
すかさず氷水につけてサンプルを冷やすことを完全に融解するまで繰り返す。」
これを４〜５回くりかえす。

>115
破砕はされているけど、酵母の強力なプロテアーゼで目的のタンパク質が
ぶち壊れているとかはないですよね

マイルドに壊す場合は、イエダプレスかねぇ？

>>119
ガラスビーズが最前か分からないです。でも参考にしている論文とかでは
大抵ガラスビーズを用いています。

ところで液体窒素での凍結とありますが、-80度のフリーザーで凍らせて
30度で一気に溶かす、というのではダメでしょうか？液体窒素も研究室
にないもんでして･･･ホント貧乏な研究室だなぁ、シミジミ

>>122
一応PMFSとペプスタチンA、DTTは入れています。
でもその可能性もないこともないですね。来週はもう一度、一からきちんと
やっていくつもりです。

人生が上手く逝きません。どうしたらいいでしょうか？

転職しなさい

0.2mlPCRチューブを手袋着用で取り扱ってると静電気が起こり
手袋にわらわらと、くっついてきます。せっかくチューブに
ナンバリングしてもまた並べなおさないといけないし
ある程度試薬や核酸混ぜた後だと中身がこぼれることもあり
かなりうっとーしいです。
きっと皆さんも経験あると思うのですがどうすればいいんですか。
教えてください。

手袋ってどこのよ？
普通そんなことないぞ。

知ってる人かな？＞１２５

>129
こんなやつ山ほどいるだろ>125

＞１１８
レスが遅れてすいません。
「TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit」です。
コントロール反応だけでなく、実際に変異導入もうまくいったこともあります。
ただ、Cysを入れるという作業に入った途端、トンと入らなくなってしまったのです。
やり直してますが、ぜんぜん入らないです。
設計したプライマーが悪いのかも・・・

118だが、私はやったこと無いよ。
コントロールが上手くいっているのにできないとなると、
自作のサンプルやプライマーが怪しいね。
プライマーの配列を確認して、作りなおしてみることを勧めます。
プライマーは今どき高いものでも無いでしょう。

とりあえず、誰か助けてあげて〜

リガンドとレセプターをin vivo(培養細胞)で
covalentに結合させたいんだけど、どういう方法があるか
ご存知の方おられます？
リガンドは糖です。

UVクロスリンク。

結果報告です。
皆さんが教えてくださった方法で、タンパクは抽出できたっぽいです。
ただSDS-PAGEでは発現を確認できませんでしたが、、、やっぱり発現量が
少ないんですかね。次はBindingAssayをしてみる予定です。
これで発現が確認できなかったらまたベクターから再構築だぁ(:_;)

＞１３５というか１０５
vectorは何を使ってるの？
大腸菌と違って、酵母の場合GalでもPAGEでは確認できないこと多いよ。
やっぱ、Westernしなきゃ！

出芽酵母に入れたpYEXからCUP1プロモーターを使って銅で誘導したGST融合タンパク質をルーチンに解析したけど、
グルタチオンビーズでバッチ精製するとCBBで見える、、、、

>>136
ベクターは某企業から頂いたもので、市販はされていないと思います｡

確かにPAGEでは見えないかも、というのは周りの人から言われていました｡
以前TaKaRaのオーレオバシジンを用いた(pAUR224)発現系を試みた時、
Westernを行ったんですけど、どうも上手くいかなかったようです｡
その時、BindingAssayではほんの少しながら発現が確認できたので、
今のベクターでもWesternじゃなくてBindingAssayを行おう、ということです｡

ちゃんとコントロールをとれば、Binding assayだけでも良いかも知れませんが・・・
Westernあった方が、心強いよ。論文書くとき。
うまくいくと良いね。

>>139
ありがとうございます。
そうですね。やっぱデータは多いほうがいいですよね。
実はうちの研究室じゃWesternは殆どやったことが無く、
ノウハウが全くない状態なのです。だから極力避けたいなぁ、
という甘えもありました。一度相方(というか、指導者)に
聞いてみようと思います。

40％しょ糖液を用いて培養液中のウイルスを
超遠心で沈殿させたいんだけど
しょ糖液と培養液の容量の比率はどのくらいが
いいんですか？どなたかご経験がございましたら
教えてください。

よくわからないんだけど、binding assayってIPしてるんじゃないみたいだけど
どうやってるの？
bindingをみるのはtwo hybridじゃないならIPか、BIAcoreぐらいしか思いつかないんだけど・・・

>>142
BindingAssayは目的タンパクのアンタゴニスト(リガンド)にRI標識をしたものを購入し、
それらを混ぜてフィルター濾過します。するとフィルターに吸着した目的タンパクと共に
RI標識したリガンドもフィルターに残るため、フィルターを液シンにかけて放射量を測定し、
そこから発現量を見る、という感じのものです。操作自体は非常に単純です。

タンパクの破砕はとりあえずめどが付いたんですけど、今度は
β-gal活性の測定で躓いてしまっています。

酵母さんがお勧めしてくださった｢酵母による遺伝子実験法｣に載っている
方法で試したのですが、サンプルが全く黄色になってくれません。
プレート上ではX-galで青色に発色しているので、少しは活性があっても
いいと思っているんですけど、、、
おおまかな手順としては

Zバッファー700マイクロ、0.1%SDS50マイクロ、クロロホルム50マイクロ、
サンプル0.1mlを加え、30秒ボルテックス。
0.4%ONPG160マイクロを加え、30度でインキュベート

と、至って単純なんで、操作ミスはあまり考えられず、
かなり困った状態となっています。

>141
なんのウイルスだか知らないけど、常識的な範囲内なら別にいくつでもいいん
じゃないの
違うウイルスだろうけど培養液:30%sucrose:60%sucrose=3:3:1でバンディング
できてるし

関係ないが60%sucroseとかのクッションはひかないの？
普通クッションを引いておいて、層の間をバンディングするものじゃないのかな
そういうウイルスなのかもしれないけど

>145
アドバイスありがとうございます。
仕事の上で生じた疑問だったもので、具体的なウイルス名を
書けないのですが、小型(直径30nmくらい)のDNAウイルスです。
(教科書を見れば何のことかわかるかと思いますが･･･)
抗体(Poly)を作成するための免疫源の調製が主目的です。
超遠心してウイルスをペレットにし、Bufferで再浮遊させて
動物に接種しようと考えています。

私の職場では、1回に処理できる容量の大きいローターは
固定角のものしかないのですが、この場合でも、60%sucrose
のクッションをひくものなのでしょうか。

不勉強ですいません。

免疫染色ではバッチリ染まってるのに、
in situでは曖昧な結果だった。
論文にする時は、免疫染色だけのデータだと
信じて貰えないものですか？
in situだけでJBCとか載ってる論文はあるけど
免疫染色だけでは駄目？

age

>>147
抗体のvalidity がレフェリーに問われます。
1.　WBで単一バンド（precursor とかdegradation が予想される
時は単一でなくてもよい）があること。
2.　抗原（ペプチド）を用いて当該抗体の吸収試験を行う。
組織切片（または細胞）の陽性反応の消失とWBのバンドの消失が確認出来ればオーケー。

もしDIG-ISH なら、湿箱の中で一週間位反応させると奇麗に陽性像が得られることがあります。
あるいは、発色の溶液にpolyvinyl alchol （final l0％）を加えて発色液（BCIP-NBT) に粘度をもたせる。
これで、組織切片上での反応産物の拡散を防げるので、陽性反応が曖昧な場合は有効なことがある。

抗体のvalidity がすでに報告されているものであれば、その論文をたくさん引用しておきましょう。

形態学のquality journal だと上記の基準を満たしていないと、レフェリーが要求してくるでしょう。
面白いのは、いわゆるIF が高い雑誌になるほどこういった基本が論文上では省略される傾向にあります。
でも抗体の性能を把握しておかないと、そのあとの実験結果が怪しいとみなされるので上記の1と2は
routine work だと考えています。1と2がクリア出来れば、ISH のデータは要求されないと思います。
もちろんあったほうが良いですが。

>>146
そのウイルスはウイルス実験プロトコールという本にのっていませんか？
いま扱っているウイルス以外は精製したことないんですけど、ウイルスの精製は
一回何らかの方法でペレットにして、SucroseなりCsClなりの勾配で精製するの
がパターンのようです
ペレットにするだけの粗精製でもウイルスがきれいにとれるものとあまりきれい
にとれないものがあると思うので、粗精製で免疫に使えるかはわかりませんが

固定角とスイングの違いはどうなんでしょうね
沈殿させるだけならどちらでも大差はないように思えるんですが

ウエスタンをするときに低分子量のタンパク質がメンブレンにトランスファー
されにくくて困っています
メタノール濃度を上げようが、SDSを加えようがメンブレンの種類をかえようが
ダメっぽい
トランスファーのバッファーは
Tris-HCl 3g、glycine 14.4g、MeOH 15%
で、45V 30min、90V 60min でトランスファーです
なんとかならんもんでしょうかね

＞151

塩基性タンパク質なら、25mM Tris baseでpH10.3ぐらいでエレクトロトランスファーすることもあるけど、、

>>151
タンパクがメンブレン通り過ぎちゃってたりしませんか？
48mM Tris, 39mM Glycine, 0.037% SDS, 20% MeOHのバッファーで
（1リットルだと5.8g, 2.9g, 10% stockを3.7ml, 400mlです）
メンブレン1cm^2あたり0.8mA、60-70分でちゃんと行ってます。

>>151
153氏と同意見。
メンブランを通りすぎている可能性の方が高そう。
トランスファーされていないと考える根拠は？
トランスファー後のゲルを染色してタンパクが残っていましたか？

>>149　＞ＤＤさん
免疫1000食さんの便乗質問ですみません。
具体的には形態学のquality journal というのは
どういう雑誌でしょうか？

>>155
よそにも書いたけど考えていたのはJCB。
新しいものみつけて、その抗体作って投稿
してみたらよくわかります。

トランスファー後のゲルも染色してみましたが、残っていませんでした
で、メンブレンを染めてみてもモノはないという状態です
153氏のバッファーと時間でやってみます

>147、149
場合によっては、Westernでのsingle band（対象組織とポジコン）と抗原
吸収だけではレフェリーが認めてくれない事があります。
確かに、これらだけでは、対象組織で見ている蛋白が、エピトープ（と分子量）
が似ている別の蛋白質である可能性を否定しきれないのは確かだからです。
我々の昔の例では、これらに加えて、対象組織での抗原の酵素活性をも付けま
したが駄目でした（その活性は多段階の連続反応が同一の酵素によって触媒され
ることが必要なもので、そんな活性をもつ酵素はこれまでに１種類しか見つかっ
ておらず、その酵素以外には存在し得ないというのが常識となっている蛋白であ
るにも拘わらず）。
あのときは、レフェリーはアミノ酸シークエンシングをしろと言ってきました。

そんなに量がとれる蛋白なら、誰も苦労しないよ、まったく。

ということで、（論文をとおすということだけなら）やはり当たったレフェリー
による、といういつもの身も蓋もない結論に落ちつくのではないでしょうか。
大体レフェリーというのは、人の事には好き勝手な事を言ってくるものです。
水準を満たした上でではあるでしょうが、いいレフェリーに当たることを祈りま
しょう。

サザンでありえないバンドが出て困ってます。
サンプルを流してないはずのレーンにくっきりと出ます。
目的の物は見えなくて、でもサンプルを流したレーンでは謎のバンドは薄くなります。
謎のバンドの少し上からはメンブレン一面が真っ黒になります。
下の方は正常に見えます。
同じような目にあった方、いらっしゃいますか？

>>157
メンブレンは何？
トランスファーの方法は？

＞１５８
そうすっと抗体の証明には、その抗体でタンパク集めて精製してアミノ酸配列決めろってことですか？　そんなにやった論文見たことないなあ。雑誌名だけでもキボンです、マジで。
ほとんどの論文は、データノットショウンで抗原で吸収出来た程度なのに・・・。
そんな基準をクリアした抗体なんてうちのラボにあるのかなあ？

>161
PNAS (trackII)です。

age

oligotex dT <super> を使って mRNA の精製を行っています．
最近，試薬 (Elution Buffer, Wash Buffer, TE, 5M NaCl) を作り直したら，
うまく精製できなくなってしまいました．
症状は，rRNA の混入が激しい，mRNA の収率 (得に 2knt 以上のサイズ) が
落ちた，等です．Wash，溶出は 2 回行っています．どなたか，良きアドバイスを
お願いします．

等電点電気泳動からイムノブロットをしたいのですがうまくいってません。
ファルマシアのPAGプレートというできあいのゲルに濾紙乗っけてサンプルしみこませて泳動してます。
問題はトランスファーです。
ゲルにプラスチックシートがくっついてたりゲル濃度が低くて扱いにくく、通常のSDS-PAGEのゲルと同じようにトランスファーできません。
泳動後のゲルに単にメンブレン乗っけておいとくだけという方法もあるようですが・・・。ぜひお勧めのやり方を教えて下さい。

>>131
> ＞１１８
> レスが遅れてすいません。
> 「TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit」です。
> コントロール反応だけでなく、実際に変異導入もうまくいったこともあります。
> ただ、Cysを入れるという作業に入った途端、トンと入らなくなってしまったのです。
> やり直してますが、ぜんぜん入らないです。
> 設計したプライマーが悪いのかも・・・

小生も少し前にin vitro mutagenesisやってたなあ。TaKaRaのMutan express Km使いました。
templateが1kb以下ならほぼ100%うまく行きましたです。

ageついでに、

>>164
oligo dTなのに何故rRNAが混入する？吸着が弱いのでは？
pHが狂ってるんでは？

よそのラボからもらったDNAライブラリーのタイターがあっというまにおちます。
いっしょにおいてる自分で作ったのは問題ありません。
どちらも4℃で保存、ベクターはだめになる方がEMBL4、大丈夫な方はUni-ZAP XRです。
なんでなんでしょう？

>>169
4℃に置くこと自体が間違い。DNAは冷凍庫に入れて保存しましょう。
大事なサンプルは厳重注意です。
劣化していく方はDNase混入してるのかも知れません。

>169
うちはFIX�U使ってるけど、4℃保存であっという間に落ちることは
ないなぁ。増幅したものにはクロロホルムやDMSOを入れるが。
宿主菌には問題ないのだろうか？

わたくし、勘違いしてますか...>169,171

ところで、古いプレートから大腸菌を起こすとAmp入りで増えるのに、
プラスミドが取れ無いのはどういう仕組みなんだろう。
コピー数が減ってるのか？

>>171
自分で作ったのにはクロロホルムを入れてあって、1年以上大丈夫です。
すぐに使わない分はDMSO入れて-80℃にしまってあります。
それなのに、もらってきた奴は2ヶ月でほとんどゼロです。
遺伝子でばりばりやってるラボからのもらいものなので単純ミスはないと思う
のですが。。

>>172
ライブラリーはパッケージしたやつです。ファージの殻に入ってるやつです。
ついでに、Ampプレートにストリークすると生えるのに液体培地では増えない
プラスミドももらいました。

>Ampプレートにストリークすると生えるのに液体培地では増えないプラスミド

ミニプレは液培からじゃないと出来ないと思ってないか？
大腸菌をプレートから掻きとればいい。

>>174
そうやってとれるプラスミドは本物なんでしょうか？
ちゃんとしたのが入ってるなら液体でも生えるだろうと思っていたのですが。。

>>175
昔のプロトコルには液培からでなくプレートからの掻きとりの方法も載ってたみたい。
私はライブラリのAmplifyの時もプレートからの 掻きとりでライブラリDNAとってるし
酵母なんかでも同じようにシングルコロニーを塗りたくったプレートから 掻きとってミニプレしてる。
それ以前にもしかしたら液体培地の抗生物質を間違えて入れてたんじゃない？

あのー凍結切片をキシレン処理しちゃったりすると
免疫染色で染まりにくくなったりしますか？
間違えて脱パラ過程かませたんですけどサッパリ染まらないんです。

>>177
先生か先輩に聞いて怒られなさい（笑

てか、キシレンの除去不十分か抗原の変性かどっちかだろうね。もういっぺん
切片を切った方がはやいと思うぞ。

＞１７８
レスありがとうございます。
上が居ないんで参ってたんですよ。
先生も微妙に専門外だし…
染まらない原因が脱パラであればオッケーなんです。
やり直せば良いわけですし…

>>177　178の可能性に追加すると、

抗原によっては抗原の流出ってのあるよ。
どうせ、キシレン以外にもそのあとアルコールも通して
水かバッファで洗ったんでしょ？キシレンもアルコールも
膜なんかスカスカにするから、特に固定が弱ければ
かなり流出効果も期待できる。

＞１８０さん
重ね重ね有難うございます。

月曜日に免疫染色やり直します。
今度はキチンと染まると良いなぁ…

　Amp を取り込まなくなってるだけ。
　すでにプラスミドは落ちてるから、形質転換からやり直した方が良い。

　液培にすると極端に生えの悪いプラスミドってあるよね。
　某菌RuvB/pET19b とかそうだった。。。

だれか、SCFによるユビキチン化のプロトコール教えて・・。
論文読んでやってもうまくいかない。

>>183

　液培するとききちんと振ってる？
　空気が少ないと生えないよん

　酵素と基質類似体のKdの求め方（スペクトル変化）ってどうするの？

　アミノ基転移酵素とコハク酸。

GFPがうまく見えない、、、、。
ウッズホール研究所で下村夫妻の研究室をいろいろ見せてもらったのが思い出されてくる。

鬱だ、、、。酒に走ろう。

>>184
論文の著者にメールで聞くのか早いよ

＞187
あたしも、あたしも〜〜

>>187
そもそもちゃんと発現してるのかな？
GFPの抗体で染色したら染まります？
また、逆に発現量が多すぎると細胞質全体がdifuseに光る事も多し。
あと、固定標本にして見るときはanti-fader入れたらイカンよ。
それと、GFPってそれほど明るくないから、開口数の大きい明るいレンズで見るべし。

今まで使ってたGFPの蛍光があまりにも弱いし高温で酵母を飼った時など
暗くてしょうがないからE-GFPを試したら高温でもかなりの光り方をしてくれました。
お薦めです。

アドバイスをありがとう

ポジティブコントロールでは少数が光った。
ようするに全体的にinfection効率が低いのが原因だった。
実験やり直します。

羊土社のGFP本でも見直すか。

HeLaにGFP-fusion plasmid入れてるけど
明る過ぎるくらいだが

結局何とfusionしてるかで大きく違ってくるとおもう。
HeLaにいれて光ってもCOSではひかんない奴とかあった。

ジャーカットとかラモスはリポフェクタミンとかでも入りにくいのかねぇ？

あ、あたしラモスなら知ってる。
奥さんが日本人でねえ、日本に帰化したんだよ。

蛋白質のSDS-PAGEを染める用のCYPRO-RED
保存中に沈澱してる見たいなんだけど
つかえるかにゃ？

生きた細胞を標識したい。
Phaseを見たい。
目的の蛋白はGFP融合蛋白なので、
GFPと波長がかぶらないものを探している。
ご存知の方、教えて下さい。

コトランスフェクションすれば良かったんだけど
ミトコンドリアやチューブリンをYFPとかで
標識したりして。

>>198
赤い蛍光色素で細胞内小器官を標識すれば？
目的の融合蛋白の発現部位によって、ミトコンとかゴルジとか
いくつか試せばその融合蛋白の細胞内局在（の変化）を推定する
ぐらいならできる。該当試薬はMolecular Probesなどで
探すのが吉。こういうレスであってる？

>>200
実はそれは考えたんだ。>>199の自己レスがそれ。
YFPはGFPの黄色のやつ。
本当は、
PIやTOPOROみたいな感覚で使えるものが欲しい。
でもこれらを使うと死んじゃうだよね。
もしかしたら世の中に無いのかもしれない。

レスありがとうね。

>もしかしたら世の中に無いのかもしれない。

http://www.probes.com/handbook/sections/1200.html
逝ってらっしゃい。癌ばってね。

>>200 = >>202

わわわっ。スマンです。大感謝です。マジマジ・・

沈んじゃったので上げ。

対抗age

まだ行き詰まっていないのですが、これからタンパクを発現させて精製してみたいと思っています。
GSTかHis-Tagを考えているのですが、他により良い方法があるとか、そういうのがあったらお願
いします。

初BigDyeでシグナル皆無に改心の長ゲルが泣いている....あげ。
PCRやりなおしですわ。

establish したB-cellの周期がうまく揃わないんだけど。
serum starvationじゃーだめなのか？

>>208
ダメってどの程度でしょうか？
cell cycleの同調なんて、SとかG2じゃ50-70％揃ってたら上等では？
微小管壊して良ければG2は結構揃うけど。

age

RNA精製をして，OD260/OD280の値が
何度やり直しても1.3付近になってしまう･･･。
何か原因と対策を！！

>>211
気にせず次のステップに進む、じゃだめか？

多糖のコンタミが多いのでは？＞211

＞２１１
しっかりピペッティングして完全にとかせ。なかなか溶けないぞ。
完全に溶けていないとratioが下がるという話は聞いたことがある。
間違ってもペレットを減圧乾燥しないように。溶けなくて使い物にならなくなるかも。
風乾で十分。場合によっては６５度加熱を１０分ほど。

>>213
PCRかけたサンプルを逆転写した
サンプルなので，多糖はないはずですが・・・。
とりあえず，明け方からがんばります。
また，できなかったらご意見ください。

>>215
＞PCRかけたサンプルを逆転写した
＞サンプルなので，多糖はないはずですが・・・。

逆転写すれば、生成物はDNAのはずだけど

もしかして、ゲルで精製したサンプル？
アガロースっていう多糖がコンタミしているのでは？

>>216
間違えました。
RNAに転写したんです･･･。
そのRNAサンプルの精製の話です。。

具体的には、どういう方法で精製したのですか？

RNA抽出キットですね。

そのキットは、vitroで合成したRNA専用なの？

全然違います。
一般的な，細菌細胞からのRNA抽出キットです。

ついでに一言。
vitroで合成したRNAだったら、フェノクロなしのエタ沈で
十分だと思うけど。
もし、組織や細胞から抽出する為のキットだったら、
タンパクを殺すいろんな試薬（GTCとかフェノール等）が
入っているので、微量のRNAの精製には向かないと思うけど。

もう眠いので帰ります。
実験の成功を祈ってるよ。

成功♪
ありがとう。。
>>214，216
参考にさせていただきました。

GST融合タンパク質が、インクルージョンボデぃになって溶けない。

鬱だ。氏のう

ウエスタンでなんですが、予備実験でうまく行ったのに本番ではきれいなグラフが
書けませんでした。手法、条件等は変えていないんですが・・・
１番問題があるのは細胞破砕・タンパク抽出後の保存であると思われます。
今はただディープフリーザーにほうり込んでるだけですから。

一番いいのは抽出してすぐ流す状態に調整・加熱してSDS化、保存おくことだと思うんですが
やっていらっしゃる方はおられますか？
SDS化は時間さえかければ加熱しなくてもよい、という記述を見たことがあるので
一度加熱してしまえば冷蔵保存でいけるとは思うんですが。

>>224
・培養温度を下げる（〜15℃ぐらいまで）
・IPTG濃度を下げる（〜20μMぐらいまで）
・IPTG添加時期を変える（lag〜early stableの間で何点か）
・２価金属イオン必須のタンパクなら、それを加えてみる
など。
それでもだめなら、His-tagに組み替えて、refoldしなさい。

>>225
きれいなグラフというのがよくわからん。
きれいな泳動像が見られない、ということだとして話を進める。
SDS-PAGEのサンプルバッファー加えてからの保存なら、しょっちゅうやってる。
少なくとも、ほとんどの場合、４℃で２〜３日は大丈夫だ。
というか、それ以上おいといたことがない。
それ以上ほっとく場合は、凍らせてる。自分のサンプルの場合、半年おいても大丈夫だった。

細胞破砕・抽出ということは、可溶性のタンパク（膜タンパクではない）と思われる。
保存中のproteaseによるdegradationが気にかかるところであろう。
degradationは、阻害剤しこたま入れてても結構進むもんだ。
とにかく各ステップの操作を手早くやること。
凍結保存が可能なら、なるべく早く液体窒素か何かで凍らせてしまおう。

＞225-226
アセトンで沈殿させて冷凍保存をよくやっていた。
たった一つの膜蛋白以外には有効だった。

＞２２６さん
お返事どうも有り難うございました．
今までの保存はプロテアーゼ等は一切使用せず、ただ−８６℃に放り込んだだけでした。
分解対策は２週間以内にそのサンプルを使い切るという方法でやってたんです。
今後は抽出直後に調整・ディープフリーザーで凍結保存させていただきます。

グラフというのは、私の実験はタンパクの日周変動なんです。
予備実験では綺麗に変動グラフが２回連続でとれたが今回は上手くいかない、
考えられるとすればサンプルの劣化速度の違いであろうと。そういう意味です。
定量法はＨＲＰ標識２次抗体と紫外線蛍光溶液でやってます。

>>224
シャペロンを共発現させてやるという手もないことはない
うまくいけばもうけもの程度だけど

in vitroでの活性保持用としてGroEL/ESが売られてるけど、使える
ものなんでしょうか？

>>213
多糖はどうやったら除けるんでしょうか？
グリコシダーゼ処理とかですか？

Genomic probeってどう作るの？
コスミドから断片とって制限酵素？
無茶苦茶大きいのだけれど。

簡単な質問と思います。すみません。PCRの設定です。
Hot Start PCR　Kitを使用してバシッと1本170bp程のが欲しくって
色々温度変えてるんですが、ノンスペ300bpくらいの一本がいつも邪魔します。
94-68-72まで上げたんですが　ノンスペのがもっと強くなってしまいました。
時間は45sec-45sec-45secだったのでチョット変えて60-30-60にしても･･
ボスが作成したQ-buffer入りのkitを使ってます。MgCl2は15です。
やっぱりMgCl2の濃度を変えればいいんでしょうか。

>>233　プライマー変えたら？
もしくは、画像取り込んでノンスペのバンドを塗りつぶす。

単純にゲルから切り出してエリューションじゃだめかな。
サブクローニングしてもよし。テンプレートにして再度
PCRしてもいいし。

>>233
テンプレは？それによると思う

>>233
RT-PCRでalternative / genomic DNAだったりして。(違うって)　偽遺伝子やファミリーも無いのに、ですか？

233です。最終的にクローニングじゃなくって
comparative PCRで発現量定量したいんです。
なのでprimer変更は･･･。
テンプレはmRNAから作ってます。
卵巣癌・子宮頚癌の株から無数とってきています。
Caov、Ovca,KLE･･･などなど･･です。
説明になっているでしょうか･･（汗）

骨格筋細胞を効率よく破砕する方法ってありますか？
核を傷つけたくないのです。

>>239
ニワトリ胚の骨格筋以外では難しいと思います。

>>238

>>237のalternative splicingありそう。やっぱサブクローニングしてシーケンス
してみたら。修論追い込み?

>>238
とんちんかんな答えだったらスマソ。
PCRでノンスペのバンドが出る、primerの変更はできない、ということかな？
温度厳しくしてノンスペが消えないようなら、Mg変えてもダメだと思う。
酵素は変えるわけに行かないの？bufの組成は？
自分は大体未知の遺伝子増幅するときは、３〜４種類の酵素とbuf組成変えて、７〜８種類のマトリックス組んで一気に増幅してみてる。
それで少しでも良かった条件で追い込んでいった方が、一つの酵素で条件絞っていくより早い。
で、それでもばっちりもう一本が見えるのなら、alternative splicingとかの可能性を考えた方がいいかもしれない。
241の言うように、とりあずシーケンス取ってみるのも手だ。

238です。
レス下さった皆様ありがとうございました。
今日、ボスが出張から帰ってきたので相談できました。
プライマーの再設定を考えて酵素もZtaqにしてみることになりました。
ちなみに、使用してきた酵素は普通のTaqとHot start用の修飾Taqです。
Hot startに関しては専用のbufでしたので変えられませんでした。
自分の知識の無いのが本当に苦しいですが、また頑張ります。

in situをやろうと思っているんですけど、in situのプローブって何を使っています？
oligoを頼むにしても条件検討厳しそうだし、in vitroでRNAプローブ作るにも乗せか
えめんどくさいのでどうしようか決めかねているんですけど

　

>244
DigラベルのRNAプローブつかってます。
Bluescriptあたりに乗せかえるのくらいチャチャッとやってください。

人の所為にばっかりして自分じゃ何もしようとしないクセにエラソー言ってんじゃねぇぞ


97 名前：名無しゲノムのクローンさん投稿日：2001/02/04(日) 08:17
人の所為にばっかりして自分じゃ何もしようとしないクセにエラソー言ってんじゃねぇぞ


98 名前：名無しゲノムのクローンさん投稿日：2001/02/04(日) 08:17
人の所為にばっかりして自分じゃ何もしようとしないクセにエラソー言ってんじゃねぇぞ


99 名前：名無しゲノムのクローンさん投稿日：2001/02/04(日) 08:17
人の所為にばっかりして自分じゃ何もしようとしないクセにエラソー言ってんじゃねぇぞ


100 名前：名無しゲノムのクローンさん投稿日：2001/02/04(日) 08:17
人の所為にばっかりして自分じゃ何もしようとしないクセにエラソー言ってんじゃねぇぞ


101 名前：名無しゲノムのクローンさん投稿日：2001/02/04(日) 08:17
人の所為にばっかりして自分じゃ何もしようとしないクセにエラソー言ってんじゃねぇぞ


102 名前：名無しゲノムのクローンさん投稿日：2001/02/04(日) 08:17
人の所為にばっかりして自分じゃ何もしようとしないクセにエラソー言ってんじゃねぇぞ


103 名前：名無しゲノムのクローンさん投稿日：2001/02/04(日) 08:17
人の所為にばっかりして自分じゃ何もしようとしないクセにエラソー言ってんじゃねぇぞ

100以下に落ちそうなのでage

荒らし封印age

荒らし封印age

荒らし封印age

切れてます、キャリ夫切れてます！（ｗ

荒らし封印age

荒らし封印age

荒らし封印age

おすすめの１ショットチューブ入りＰＣＲのキットを教えて！
要するにテンプレートとプライマーと水以外はすべて分注してあ
るタイプが希望

酵母ｔｗｏｈｙｂｒｉｄで何回やってもミトコンドリアの遺伝子しか
取れない・・・・

鬱田・・・・

シャペロニンばかりとれました。
一度、ホスホリパーゼCαがとれた、、、、その本性はプロテインジスルフィドイソメラーゼだった（笑

修論の提出、来週の火曜

鬱田氏脳・・・・

age

顕微鏡操作について書かれた実験マニュアルのような本をご存知の方が
いらしたら情報を下さい。
オリンパス、ニコンは使えるのですが、
ZWISSを使うことになり困っています。
この顕微鏡ってよくわかりません。よろしくお願いします。

>>261
内容的にあまり詳しくないと思われますが。書店や図書館で見てみてください。
羊土社「無敵のバイオテクニカルシリーズ　顕微鏡の使い方ノート 光学顕微鏡からCCDカメラまで」
秀潤社「顕微鏡フル活用術イラストレイテッド」
Confocal(Zeiss LSM410)なら解説ページあります。
ttp://j-seitai.kais.kyoto-u.ac.jp/LaboManual/CLSM/CLSM%200.html

あぼーん

>>262
ありがとうございました。助かります。

いつもの倍量でミニプレップしたけどpptが無ひ……　やはりコピー数低いやうだ。
とりあえず植菌して来よう……

ライゲーションしたが、全部ブルーコロニー。
でも全部インサート入ってた。ちょっと嬉しい。
なんかいいことあるかな？

　細胞が目覚めてくれません。
　Jurkatでstable transfectantを作り、それをセルバンカーに−８０℃で１年間保存していたのですが.......。
　またtransfectionからやり直しかと思うとうんざりします。
　セルバンカーじゃ１年の保存は無理なんでしょうか？
　あと、細胞が起きやすくなるような裏技を御存知の方はいらっしゃらないでしょうか？
　初心者なので聞いてばかりで申し訳ないのですが、何かアドバイスがあればお願いします。

＞267

培養細胞を凍結保存するのはやはり液体窒素ぢゃないか？
-80度フリーザーに置いた凍結培養細胞を起こすのは３ヶ月が限度だったよ。

>>267
-80度で１年間経ったHeLaは起きてくれたが、
細胞が大きくならずに培養５日目で大部分が死んだ。
アポトーシスが起きたような感じだった。
液体窒素でないと無理。

というか、ジャーカットやラモスのような免疫系細胞は非常に弱いイメージがある。
普通に液体窒素に凍結保存しても起こすのに気を使う。

┐('〜`；)┌

-80℃でも、ふたの開閉を少なくするなど、きちんと温度管理をしていれば、結構大丈夫だったりするけどね。
セルバンカーで293とCHO一年以上保存しといてちゃんと使えた。
免疫細胞というか、浮遊細胞系は一般に付着細胞系より弱い傾向がある。
解凍後、培地でwashしたものと、washせずにそのまま希釈してフラスコに蒔いたモノを作る。（血球系の細胞は、遠心にかなり弱いモノがある）
培地は少し血清濃度を上げてやる（10％が標準なら、15-20％）。
なるべく濃い密度で蒔いてやる。
あと、trancfectantなら、G418かなんか入れてるんだろうけど、起こすときにはそういうモノを全部抜いてしまう。
そこまでやってだめだったら、transfectant作り直すことですな。（合掌）

-80℃で短期間保存していた場合でも起きが悪く、
一週間ほど増えないこともある。
前から気になっているんだけど、凍結保存の際のDMSO自体
が分化促進に働くときはどうすればいいんだろう。気にしなくて
いいんだろうか？

>>273
DMSOがまずいようなら、グリセロールにするとか、無血清凍結用培地でDMSOを含まないモノを使ってみるのも手。
大方の場合、さらされる時間が短いので、問題になるケースは少ないようだけど。

　みなさん、レスありがとうございます。
　のぞみは薄いようですが、頑張ってみます。

培地をAIM V（らいふてっく）にする。さらにリンパ球系用のsupplementを加える
（T cell hybridoma用のやつ、しぐまとか）。さらにさらにIL-2を入れてみる。
もちろん272さんの方法が前提で。

269＞
じゃーかっとは浮遊掲載帽の中でも強い方です。自分で作った
不死化細胞なんかはも〜っときむずかしいですよ。

方法に「コロニーPCRでシークエンスする」とだけ書かれている.....RIじゃなくてもできるのかな....

妙にケージが劣化してて、ねずみに齧られて逃げ放題……。値段結構するのに。

ポリカーボのケージっておしっこが溜まる所から劣化するよね。

酵母ｔｗｏｈｙｂｒｉｄでトランスフォーメーション効率が悪ぃ・・・・
マジどうにかなんないかな。。

>280
菌体数を上げる(800mlで培養)
PEGを新しい物に代える
DNA濃度を上げる
形質転換前4時間はYPDでプレカルチャー
これくらいかな・・・
以外とPEGが古いと決定的に効率が落ちるからね

>>280,281

>以外とPEGが古いと決定的に効率が落ちるからね
激しく同意。
っていうか、導入に使ってる試薬全部作り直した方がいい。
それから、プレートに蒔く前に予備培養してると思うけど、
その時間を延ばしてやる。
つまらんことだが、これで効率３倍増したことがある。

アドバイス、どうもです。
早速試してみます。

ここらでひとあげ。イースト使いの方結構いらっしゃるんですね。

age

バカみたいなことで恐縮なんですが、
ウェスタンブロットのTransfer（ウェット式）が自分がすると何度やっても、
おかしいのです。（バンドの一部が流れたようになって転写される）
この数カ月試行錯誤繰り替えし、あれが原因か、これが原因かと、
気になる点はすべて押さえたつもりなのに、
今日も失敗(;-;)。このままでは、ウェスタンする度に鬱です(;-;)
なにか、「これやってないんじゃないか？（もしくはこんなこと
やってんじゃねえだろうな？）」ということがあれば、
何でも良いので教えて下さい。お願いします。

>>286
どのように流れて見えるのですか？
バンドの上方に向かって尾を引いてるのかな？

>>287
尾を引いてる・・・といえるかもしれません。
漢字の「口」をゲルに見立てると、本来「日」と
現れるはずのバンドが大げさですが「四」の様になってしまうのです。
メンブレンからゲルが外にはみ出していることもありません。
ゲルとメンブレン間にBufferが入らないようかなり気をつけて
泳動漕にセットしてはいるのですが、結果的には転写中にBufferが隙間に
入り込んでいるのでしょう。
そうなる原因を考えるだけで鬱・・・・(;-;)
思い浮かぶ節がもう尽きてしまって途方に暮れている状態です。

泳動槽は何使ってんの？
BIo-rad?
ゲルより小さいPVF膜使ってもそんなことにはならないけど。
膜の前処理してる？PVF膜の場合だけどね。
膜にバッファーを十分染み込ませたか（PVF膜はメタ処理）？
膜がゲルから浮いてんじゃないのか？
カセッテにしっかりはめ込んでる？
周りでも聞いたことが無いなあ・・四の様か。

>>289はイモビロン膜デス

>>ＲＲさん
有り難うございます。
メンブレンがゲルから浮かないようにして、
バッファーをしみこませた濾紙を重ねています。
もちろん、メンブレンもバッファーにつけ込んでおります。
ＰＶＦ膜ではないので、メタノール処理はありません。
他のスタッフが行うときには起こらないため、
泳動槽には問題ないと思うのです。
やはり、腕の問題なのでしょうか・・・・(TДT)
とりあえず、今度はカセットのかみ合わせを疑ってみます。

転写じゃなくて泳動が上手くいってない可能性は？
サンプルとSDSとをボイルとかで反応させるよね。
一番いいのはスタッフと一緒に実験することでは。

サンプルはLoading bufferと混ぜてヒートブロックに数分放置すれば
良いんだから、大して問題はないはず。
ゲルは自分で作ってんのかな。
自慢じゃないけど俺のウェスタンは綺麗だって言われて、
ラボマニュアルを作らされた（笑
変わった事してないんだけどね。

＞RR
ラボのスメアテストといい、まるでテクニシャンだな（W
グリーンカードちらつかされて、こきつかわれてるのか？

泳動バッファにSDSが入ってないとそんな風になったこと有り。
PAGE自体はきれいに流れてる？

>>294
煽りにマジレスするのも何だけど、「否定」出来マセン。
「逃げないだろう」と思われるとこういう事になるのかと、妙に納得。
国が違ってもその点は同じだ。

>>286
サンプルのpHはどうなんだ？
ちゃんと合わさなきゃダメだよ

>>296
「Rさんが逃げない」と思われているということですか？
というか、逃げるって予告なしに辞めるということでしょうか。
それとも本当にドロンですか？
他のスレッドのレスと関係してるお話かもしれないので、
Rさんのコメントがよくわからないです。すみません。

>>298
通常のポスドクならビザの期限が切れると帰国するけど、
自分はあまり考えないで「ＧＣ（永住権）取りたい」って言った。
ＧＣを取るにはボスの推薦書とか必要なため、
申請中は所属の移動は出来ないしボスの機嫌を損ねたくない。
だから半奴隷デス・・

「ＧＣ要らないから帰国する」って強行帰国すればいいのだろうけど、
研究人生はオワルよね。

あらためてラボのメンバーを見ると、長老格のシニアポスドクは
ＧＣ持ちだった。安く労働力を確保するためにＧＣを餌にしてるのかもな。
「日本の経済状態は悪いから今は帰らない方が良いぞ」とずっと言われて
きたし（笑

まあ、あんまり聞かないで（笑
悩みながらも選択の余地がないんだから。

age

皆さん御意見有り難うございますm(_ _)m
>>292、>>295
サンプルバッファーの青いラインが綺麗にできており、
泳動自体はきちんとできています。
あ、サンプルは摘出した組織にサンプルバッファーを加えて
ホモジナイズする方法で回収しています。
また、同一サンプルで１次抗体別に何枚も泳動する場合も多く、
その際にも転写でトラブルの有るものと無いものとが出るため、
泳動やサンプルのミスとも思えないのです。
泳動バッファーにもＳＤＳ入ってます。
>>297
サンプルについては↑の通りなんですが、
ｐＨ関係は考えたことありませんでした。
最適ｐＨとかあるのでしょうか？詳しく教えていただけますか？
＞ＲＲさん
ゲルは自分で作ってます。
ちょっと変なゲルならば、すぐに見分けられますよね。
また、前述の通りサンプルバッファーのラインや、
プレステインドマーカーの流れ方にも問題ないため、
ゲルでもなさそうです。
綺麗なウェスタン・・・・羨ましい（´Д｀）
海外のラボも大変そうですね。
お体に気を付けて。

明日金曜のおシャカを上司に報告・・・（鬱）

＞286
昔、トランスファーのカセットを輪ゴムで止めたら
綺麗になったりしたよ

なんか、このスレを見ていたら、去年卒業されたＴ先輩を思い出します。
すっごく知識が豊富で、研究室中の人の疑問を一瞬にして解決してしまう方でした。
はぁ〜・・・先輩お元気でやってらっしゃいますか？

スレの要旨と関係ないのでsage

>>298
＞強行帰国すればいいのだろうけど、
＞研究人生はオワルよね。

留学経験のない私にはここがよくわからないのですが、
一度ポスドク契約（？）をすると、その年限は絶対で
途中でラボを移ることも出来ないということですか？
そして、そういう契約違反をあえて実行すると
現ボスの逆鱗に触れて日本でもポジションが得難くなると。
なんだか世程の覚悟がないと海外へ出れないような恐い感じを受けました。

　メンブレンは何を使ってる？いろいろ種類があるけど、ニトロセル
ロース膜が一番。前処理も必要無いし、切り取ってそのまま使用可で
す。タンパクとセルロースは共有結合するそうですから・・・。欠点
として、時間が経つと変色してしまうので、うまくいったら写真撮影
すればいいと思います。お金と時間がかかるならスキャナでも取り込
めますよ。
　泳動の時間はどれくらいで、電流は何アンペア流してる、その時の
電圧は？。電圧が一定にならない時は、抵抗がかかってないのでうま
くいかない。ゲルとメンブレン間に電流が流れにくくなってるので、
セットのやり直しが必要とわかりますよ。
　ゲルとメンブレンを押さえつける時に弱いなら、ろ紙を二枚ずつ両
脇に重ねて押さえつければ、良いかも知れません。
　それでもうまくいかない時。ウェット式のウェスタンブロットは時
間も手間もかかって正直言って大変です。セミドライ型に変更したほ
うが時間も手間もかからず、失敗も少なく、結果も良好になると思い
ます。

>>305
他にもイロイロあってね（笑
まあ、この位にしておいて・・
でもアメリカはいいよ。

泳動はうまくいってるって書いてあるけど、CBB染色や銀染色で確認した方が
いいと思う･･･。サンプルバッファのラインでは当てにならんのでは。

ブロッティングで位置が変わることはそうそうあるもんじゃないので、
まず泳動を疑うべき。
泳動装置の白金線とかに異常はないですか？

またも、皆さん有り難うございます。m(_ _)m

先週の泣きの書き込みは、トランスファー直後、
メンブレンをドキドキしながら取り出したときのことでした。
ゲル中央に流していたプレステインドマーカーの上部が、
ゲルに残ったまま、真ん中より少し上のマーカーが失敗時に見られる
「四」の「ノ」形を呈し、さらに下方は通常に転写されている。
という、改めて「トランスファーが悪いんだよオマエ」と突きつけられた
事態だったのです。（ブロッキングほったらかしで涙ながらに
２ｃｈに向かう自分がよくよく考えると滑稽でした。）

すでに書いていますが、同時に作成し同じサンプルを泳動したゲルでも
無事なものは無事な結果なので、やはりトランスファーを疑うしかないかと・・・。

と、もがきながらも今日こそはと気合いを入れて、上司の監督下にてトランスファー。
上司が気がついたこととしては、「泳動槽に入れるときにはもっと
そぉっとセットしなさい」とのことでした。もしやそれか・・・・。
急ぐときには子供がプールに飛び込むような勢いでセットしたりする事もあったので
因果を否定できません。結果がドキドキものです(-^-)

>>303
＞昔、トランスファーのカセットを輪ゴムで止めたら
＞綺麗になったりしたよ

出来そうだったら試させてください。

>>306
メンブレンはニトロセルロース膜です。
電流は短時間で行うときは500mAで3.5時間ぐらいを目安にしています。

＞ゲルとメンブレンを押さえつける時に弱いなら、ろ紙を二枚ずつ両
＞脇に重ねて押さえつければ、良いかも知れません。

この方法も試させていただきます。

>>308
ＣＢＢ染色して無事なゲルを脱色してトランスファーにかけてみたら、
はっきりしそうなんですが、これって出来ましたっけ？
泳動装置は無事です。
私に特異的な現象なので・・・。(^-^;;

＞ゲル中央に流していたプレステインドマーカーの上部が、
＞ゲルに残ったまま、真ん中より少し上のマーカーが失敗時に見られる
＞「四」の「ノ」形を呈し、さらに下方は通常に転写されている。

うーん・・・
１）トランスファーの電圧、あるいは時間が足りない。
２）パッドに偏りがあるために、均一に密着していない。
３）装置の冷却がマズイ（関係ないとは思うが）
４）バッファが足りない（んなアホな）
５）あるバンドが超伝導を起こし、電流が集中している（うわぁ･･･）

･･･冗談はさておき。
バッファは研究室で大量に作るようにしてますか？
CBBでは転写効率は悪くなるものの、転写自体は可能だったような。
ブロッティングでは、全面に同じ電圧がかかるようにすることが
重要です。想像ですが、極端に抵抗の少なくなるような
金属ゴミか何かが挟まっていたりしてたのでは？

>金属ゴミか何かが挟まっていたりしてたのでは？

ありえそうですね。
意外と空気(泡)がたくさんあったりして

検出後の膜をアミドブラックで丸々染めてみれば、だいたいのことが
分かるような気がする。
案外どでかい泡が入ってることもあるし。

装置のパッドはヘチマタワシ状のものと白綿（？）状のものがあるけ
れど、自分はタワシ状のほうが泡が入りにくい気がします。

あぼーん

とっても基本的なことなんですが、はじめての細胞培養で、
培地に１０％FCSをいれるべきところを、まちがえて９％にしてしまいました。
もちろんいまから補正する方法があるのはわかるのですが、
諸事情によりしにくく、９％でもいいものか悩んでます。
まったく実験初心者でこの１％のちがいがどの程度の影響を細胞におよぼすのが、
昨日から心配です。
どなたかアドバイスいただけたら幸いです。

ちなみに細胞はおこしたての、とある神経系腫瘍細胞です。
別の資料には１５％FCSとかいてあるものもあり、
おこしたて、ということもあり
心配ひとしお、です・・。

NB-○？
データとるんなら条件は厳密に、だけど起こすだけなら
たぶん大丈夫。心配してカキコするくらいならさっさとＭＣ。

>>316さん
さっそく本当にどうもありがとうございます。
ほんとうにほっとしました。
ちなみに神経系というのは微妙にちがうかもしれないですが、Y-@9です。
MCとは培地換えのことですよね。
さっさとMCといってもまずは、
やはり今後のためにもFCSを必要量くわえて１０％にしたほうがいいですよね、、、

あともうひとつ、もしよろしければ、、
FCSはいったん解凍したあと必要量だけとってまた凍らせてもいいのでしょうか？
もしよかったら教えていただけると幸いです。

だめ、とは言いませんが、止めた方がいいでしょうね。
凍結融解は最小限に、としか言いようがありません。

細胞で大事なのは、「条件を極力揃えること」
これを考えていれば、自ずとどうするべきか見えてきませんか？

>>314
あんまり言わない方がいいかもしれんけど、
細胞起こすときには普段より高濃度のＦＣＳを使うのも割と定石。
でも、それをやらないとどう害が出るかと言われると俺も知らない。
おまじないかも知れない。

私のところはFBSですが、融解後分注し、凍結しています。
それを解凍後は冷蔵保存しています。だって、使いたい時に
解凍するのを待っているの面倒なんだもん。だから冷蔵がなく
なる前に解凍する。

ちなみに細胞の種類が違うせいか、そんなに厳密に濃度を
調整したことがないです。約10％にしている。

今日細胞をみてきたところ一応育っているようでした。
みなさんいろいろ親切でとても助かっています。
実験初心者の上、聞ける人もほとんどいなくてほとんどパイオニアの気持ちで
細胞を育てているので、とても助かります。
FCSとFBSってちがうんですか？カタログみたらFCSっていうのはなかったので、
同じものと判断したのですが。C--子牛、B--ウシ、でもFが胎児、
とゆーことは子牛の胎児もウシの胎児も同じ、と自己判断したの私は、
間違っているでしょうか？？

ただしいよ。安心してね。

thanks!

>>321
>FCSとFBSってちがうんですか？
私も６年前に同じ事をきいて、笑われた。

10％とか15%とかって、aboutでいいよ。
私はメスシリンダーで測らないで容器の目盛りで調整しています。
厳密に調整しないといけないなら9.85%とか、
もっとシビアな濃度を指示してあります（実験に使うバッファーはたいがいそう）。
あと、分化しやすい細胞なら20%くらいでけいだいして、
コンフルエントにしないように注意したらいいよ。

血清の話ついでに、みなさん非働化してますか？
一応５５℃３０分やっているけど、おまじないのような気がしてならない
そんなに補体って入っているんでしょうか？

>>325
うちのラボにもやらない人はいる。俺は違うけど。

出荷時非働化済み血清が今は多いんじゃなかったっけ？

in situハイブリでセンスプローブの方が強いシグナルを出してるようで困ってます。
他に同じような経験のある方はいらっしゃいませんか？

＞RR。お前アメリカのどこの大学だ？
　一昔前に柳沢スレ荒らしてたオチケンってお前のことだろ（ﾜﾗ）　　

ヒント

82 名前：RR投稿日：2001/03/10(土) 13:38
>>81
それで海外まで逃げマシタ・・（笑

あのー、全くの素人なので教えてほしいのですが。
10kbpくらいのプラスミドを制限酵素で切ってアガロースゲルで電気泳動したんですが、ストリークしてしまってどうしてもきれいなバンドになってくれないんです。
蛋白質変性剤か何かを加えてから電気泳動すればいいんでしょうか？きれいなバンドにするためのコツみたいなものがあるのでしょうか？お願いします。

＞331

低温室で低電圧でゆっくり一晩かけて流して分離させれせば？

・ＤＮＡが多すぎる
・ＤＮＡが濃すぎる
・電圧が高すぎる
・アガロースが固まりきっていない
・バッファーを再利用している

プラスミドが分解しちゃってんじゃないの？
自分で抽出したプラスミド？
それとも市販の？
コントロールとして切ってないプラスミドを流してる？
制限酵素反応が上手くいってるか？

スメア引いているのはバンドの上？下？

アガロースを固めるときに表面が乾燥して、厚み方向にアガロース濃度にグラージエントができていたとか（藁

>>329
柳沢スレのことは不可抗力だった。
成り行きでああなったとしか言えない。
実名で登場するMYやTSにも問題があると思うが・・

>>337 >>329
あのですねー・・
Ｙ氏スレでのＹ氏本人と思われる人からのレスは、
俺の生涯の宝物なんだけど（笑
だから荒らしてないし、批判なんてとんでもない。

>>331 です。みなさんありがとうございます。
スメアしているのはバンドの上です。全体的に線を引きずったようなパターンに
なってしまいます。それから、ゲルの表面と底（厚み方向）で移動度に差ができ
て（ゲルの断面から見ると斜めの泳動像になってる！）、バンドが薄く広がった
ようになってしまうこともあるんです。切っていないプラスミドやマーカーも上
手く流れません。やはりゲルの作り方が悪いのでしょうか。またがんばります。

初心者です。
リポフェクションのお勧めはありますか。ラボにリポフェクタミンがあるんですが。
既出ならすいません。

応援頼む

http://cocoa.2ch.net/test/read.cgi?bbs=hosp&key=987237759&ls=50

>>341
興味なし。勝手にｙ

>341
うざいから死ね

15 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/14(土) 18:35
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


16 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/14(土) 18:36
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


17 名前：名無しゲノムのクローンさん投稿日：2001/04/15(日) 10:23
さすがに、今回、ばかりは、
この、忍耐強い、おれも、
１１　の、粘着質な、しつこさには、
恐れ入った・・・・
今回は、両者、
痛み分けって、ことで、
この、バトルは、
終了と、言うことに、したい・・・18 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 17:08
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


19 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 17:08
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


20 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 17:08
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


21 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 17:08
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


22 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 17:08
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


23 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 17:08
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


24 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 17:09
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


25 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 17:09
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


26 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 17:09
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


27 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 17:09
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


28 名前：名無しゲノムのクローンさん投稿日：2001/04/15(日) 19:15
あれれ？
まだ、続けちゃうの・・・？
ご冗談でしょ・・・？


29 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 19:18
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


30 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 19:18
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


31 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 19:18
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


32 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 19:18
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


33 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 19:18
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


34 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 19:18
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


35 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 19:18
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


36 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 19:18
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


37 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 19:18
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)


38 名前：キャリ夫信者投稿日：2001/04/15(日) 19:18
あひゃひゃひゃひゃひゃひゃひゃ(･∀･)

あげ

外国のグループにほとんど同じ内容の論文で出し抜かれた・・・・
しかもＪＣＢに・・・

鬱打氏農・・・・・・・

NOをジアミノナフタレンで定量したいんですが
まず、亜硝酸ナトリウムを使った検量線がうまくできません。
全然発色しなかったり、濃度と蛍光が逆相関したり。
Technical Tips Onlineを見たけれど、
遺伝子やタンパク質系の実験手技ばかりで
参考になる情報が見つけられませんでした。
どなたかNOをやっている方はいらっしゃいませんか？

グアニリルシクレースがNO受容体だから、それで定量しろよ

受容体で定量？
cGMPを定量して間接的にNO量を推測するっていうこと？

ライゲーション、バンド精製…。
基礎なのに。鬱だ氏のう…。

>>350
キット使っちゃえ。

＞348
同位体のNOを使ってBinding assay？

ホモかへテロかを見分けるのにISH法というのは使えるんでしょうか？
（数の確認はできますが、その染色体の核型分析できません。特定部位の配列も分かってないので適当な標識したDNA断片でハイブリしないかなと思ってます。またISHはしたことないです）
ドキュソすぎですか？

>>353
何言ってるかワカンネエ

今日、ウエスタンやったら、バンドが期待したところより
ずっと大きいところに出た。
レイ○ボーマーカーでやった３人とも、大きいところに出た。
あのマーカー怪しいんですか？
気をつけるべき条件などあったら教えて下さい。

>>355
期待だろ？
他のタンパク質でも大きいところにでるのならマーカーが変。
きっと目的のものがなんかの修飾を受けてんだよ。
気をつける条件、いろいろあるよ。
泳動パターンを見てから判断するね

3人とも違うタンパクでやったのに､全員が大きく出ました。
レインボーマーカーを使うときには用心した方がいいとか
そういうことがあるかと思ったので。。。。

変異体TNF-αをU937やTHP-1にtransfectしたいのですがうまくいきません。
具体的には、変異体TNFを組み込んだpCXN2を、electroporation法で
transfectし、G418 500ug/mlでselectしています。
G418存在下での培養では、細胞そのものが増えないので、
transfectそのものがうまくいってないと思われます。
この様なとき、次にどのような手段をとれば、electroporationが成功するでしょうか？
今のプラスミド濃度は、20ug/mlです。溶解液は、RPMIまたはPBSでしています。
また、細胞数は5x(10の6乗)個です。
よろしくご教授の程お願いいたします。

>>358
１．トランスフェクション効率が悪い
erectroporation以外の方法を検討する。
vector量を増やしてみる。

２．G418の濃度が高すぎる。
細胞ごとで感度が違うのでよくわからんが
少し濃度を薄めでselectionしてみる。
あと生き残った細胞を見落としているだけかも。

３．TNF-αが問題。
どんなTNF-αミュータントか知らないけどTNF-α受容体の
下流にはASK1があるのでapoptosisが起こっているのかも。
pCNX2自体をよく知らないので的はずれかもしれん。

>>355
756と800を間違えているというオチは？
レインボーマーカーがやばいという話はあまり聞かない。

>>355

一般論として、pre-stainedのマーカーの分子論は当てにならないというけど、
レインボーでやったとき、それほど大きく外れることは無かった気がする。
当然調べてると思いますが、サンプルとマーカーとの間でバッファーを統一してますか？

１行目の分子論は間違い。

卯津田氏能

分子量が正しいです。

全くの初心者です。
dominant negative、constitutively active formnついて教えてください。
まじレスです。

ドミナントネガティブというのは分野によって違うものをさすんだろうケド
私の研究（植物系）では
遺伝子の変異によって優性的になんか悪さをして表現型を出している状態
という意味で使っていたように思う。

dominant negativeとは優性的に活性を阻害すること。

例えばcargoとは結合するけど輸送能を失った輸送タンパクの
ミュータントやリン酸化は受けるけどkinase活性がないため
下流のカスケードを進行させないkinaseのミュータント等の
能力のことをdominant negativeという。

constitutively active formは直訳したままでいい。

あと微妙にスレ違い。

>>1人間関係。

無細胞系の翻訳をやっているのですが、うまくいきません。
mRNAがちゃんととれていることは、確認できています。
濃度の確認もしていますが、PAGEの結果では ネガコンと差がありません。
元のDNAの配列も確認しているしー。
誰かよいアドバイスを下さい。お願いします。

キャップ構造を付加せよ
開始Met付近をKozak配列に至適化せよ
codonのバイアスかがかっていないか確かめよ
cryptic intronがないか確かめよ
ヲメガ配列に最適化したHSP104分子種を導入せよ
polyAはmRNAの安定化に必要である
開始Metの上流に短いORFとか並んでいないか
本来のstop codonの上流に別のstopが生じてmRNAの寿命が短くないか

>>367
何由来の翻訳系？

発芽酵母S100フラクションによるmRNA無細胞翻訳系では60mg/ml以上のタンパク質濃度を達成するところが
高効率タンパク質合成のキモ

367です。

369さん
　小麦胚芽由来です。
　目的タンパクはpETシステムでは十分に発現しています。
　今回、練習のつもりでやってみたのですがうまくいきません。
　ただ、無細胞の方はSP6プロモーターを使っているので
　相性が悪い可能性はあります。

368さん
　キャップ構造の付加はpETで発現が確認されている場合でもいりますか？
　もともとは、菌類由来のタンパクですが大腸菌で安定に発現できています。
　イントロンの問題もないと思うのですが？
　Kozak配列っていうのは何ですか？

　

invitro translation難しいよね。

厨房、逝ってよし！

真核細胞タンパク質翻訳系の勉強を一からやり直したほうがいい。
Kozak配列とS.D.配列の区別、5'-UTRの翻訳効率における重要性について考えろ

Kozak配列くらいは勉強してちょ。

ATG以外の開始コドンというのも希だが、ある。

ATP,TTP,CTPに比べてGTP濃度を下げて、変わりに7mGpppGを入れてSP6で転写。
キャップのあるなしで１０倍は翻訳効率が違う。

in vitro transcriptionではplamidの3'側を制限酵素で切断して5'突出かblunt endにしてあるのか？
RNA polymeraseが転写後にうまくDNAから離れてリサイクルされることも重要

Single cellのRT-PCR
文献的にはうまくいってるみたいだけど、再現性ってどうなんでしょ？

guard cellのsingle cell cDNA libraryってあるらしい（笑

ホイートギャーム系タンパク質invitro翻訳系の場合、使用する35Sにはトランス35Sは不純物が多いので止めろ。
効率が著しく低い。
３５Ｓ−Metの高品質の奴を使え。高価ではあるが背に腹は代えられない。＞367

その先、どうすんだよ？

オレゴングリーンていう色素を使ったことある人いますか？
どんな感じか希望。

>>371
翻訳系のMg+2,k+濃度振ってみたか？キットだと翻訳するタンパク質に
よって至適化せよとか書いてある。RNAは泳動後のゲルをEtBr染色して
みたものか？それでバンドになってれば転写問題なし。当たり前だが。
RT-PCRで見たとかじゃないよな？

アラビを室内で育ててるんですけど、ポットにかびが生えてきました。
無菌で栽培しているんじゃないんで、多少なら文句も言いませんがロゼットが
喰われてます（涙）。なにか対策にいい方法知っているかたいらっしゃいませんか？

Histone H1のリン酸化エイドウパターンおしえて

Histone type III-Sのでいいか？

私はGST-c-Jun(1-135)ばっかりリン酸化しているから、知らない

リン酸化するとあがるのかさがるのか
ふつうはどっち？ふつうというのは、ないのかにゃー。

Ａ型は徒党を組んで国民を操ろうとする。注意せよ！
特に全国民の５％しかいないＡＡ型は偏固で神経質。

Mg+2,k+濃度は振ってません。やってみます。
mRNAは環状のままにしろ、とプロトコールにあるので
断片化はしてません。
が、電気泳動のパターンは出るべき位置に出ています。
mRNAはUVで濃度も確認しており、翻訳系に入れるときに
何倍か濃度を振っています。

実は、昨日やったときバンドらしきものが出たのですが
ほんとに目的物なのかどうか…。

＞380
とれたタンパク質をこれからどうにかするのではなく
in vitro系がうまく立ち上げられるかどうかを見ているところです。
うまくいけば、点変異を入れたものとかを発現させていくつもりですが…。
いまのところ、大量にはとれなさそうなので
どうしていくべきか悩んでいます。

｢メンデルの法則｣が間違っていること
http://www.geocities.co.jp/Technopolis-Mars/3422/mat41.htm

>>389
環状 mRNA ???
転写の鋳型になる DNA がプラスミドのままでいいから環状という意味のまちがいでは？

真核生物由来のcDNAをT7やSP6でinvitro転写するときは、１０年前も現在もpolyAの3'end側を制限酵素で切ってからやれと教わっている。
cDNAの3endにSP6polymeraseのterminatorなり、リボザイムを組み込んでいるのでなければ、予測分子量の位置にRNAのバンドは出ない。

すめった

翻訳のイロハも知らない厨房はどこに逝った？＞367

TA cloningで目的のものをシーケンスしたいのですが、うまくいきません。RT-PCRすると、500bpと200bpのところにバンドがでます。そのうち、200bpのもを読みたいたいのですが、
なかなか拾えません。ブルーホワイトセレクションをしても、完全なホワイトコロニーはほとんどなく、少しブルーがかったコロニーがはえています。一応それを拾ってシーケンスしてみたのですが、
目的のものはなくわけのわからないものでした。何度やりなおしても、白いコロニーがはえてこないのですが、、、。
ブルーがかったホワイトコロニーになるのは、なぜなのでしょうか？　コントロールのDNAもライゲーション、トランスフォーメーションをしてLBプレートにまいていますが、問題ありません。
全く初歩的なことで申し訳ありませんが、どなたか、お時間ある方で結構ですので、お返事いただけませんせしょうか？　よろしくお願いいたします。

>>395
200 bpの方だけゲルから切り出して精製してからligationやってもだめなの？
青っぽい白コロニーはインサート入っててもフレームがあっててlacZの活性が残ってるとか・・・。

＞３９５
何時間培養してるの？
サテライトじゃないの？

>>395
controlがうまく行ってるんなら、試薬の問題ではないな。
polymeraseは何だ？まさかPfuやKODじゃないだろうな。（ｗ
ligationがうまくいかないんなら、
・insertの量を増やす(vector:insert=1:10以上）
・ligationの時間を延ばす（O/N）
ってとこか？もちろんinsertは精製してるよな？
明らかにmixtureなのに、えいやっ、はとりあえずやめといた方が無難だ。
とにかく、PCRで増やせるんなら、どかっと取って使え。
所詮sequenceだけなんだから、スマートな方法なんか考えるな。

>>395
controlがうまく行ってるんなら、試薬の問題ではないな。
polymeraseは何だ？まさかPfuやKODじゃないだろうな。（ｗ
ligationがうまくいかないんなら、
・insertの量を増やす(vector:insert=1:10以上）
・ligationの時間を延ばす（O/N）
ってとこか？もちろんinsertは精製してるよな？
明らかにmixtureなのに、えいやっ、はとりあえずやめといた方が無難だ。
とにかく、PCRで増やせるんなら、どかっと取って使え。
所詮sequenceだけなんだから、スマートな方法なんか考えるな。

>>395
TAクローニングベクターを使うとだなー、なぜか青白いコロニーの方が白いコロニーより当たる場合がおおい。自分は積極的に青白系を攻めることにしているが、大体１００％何か入っているね。結構長いフラグメントで終止コドンがバシバシ入っているのでもこの法則は当てはまる。メカニズムはよくわからんが、インサートが入る前のフラグメントでも少しはb-Gal. αーコンプリメンテーションして活性があるとか？

>>399
そうそう。ちゃんとTaq 使わんとダメだよ。Taq Pol.のPolyA付加っていう、いわば余計な活性を逆利用するシステムなんだからね。

ゲノムを鋳型にしたPCRで、目的遺伝子（1.3kbp）がちょびっとしか増えず、
100bpくらいの短鎖DNAがドバッと増えてくる。
Suprec処理しても短鎖が混じってくるし、
アニーリング温度や鋳型DNA量やprimer濃度をいじっても
目的遺伝子だけ増える条件がみつからない。

primer、だいじょうぶ？

>>401
目的バンド切り出してもう一回PCRかけたら

nestedにしたら？
プライマかえるとか。

>>402-404
ありがとうございます。

ニックトランスレーションがうまくいきません。
誰か教えてください。

FITCラベルdUTPで標識しようとしているのです。

酵素等を混ぜて１６度放置１時間で出来たはずなのに。

何故でしょう？

酵素失活してんじゃないの？

うちのPCRサイクラー、ブロックが凍ってやんの。
パー●ンエルマー逝ってよし！…いや、駄目。（ｗ

ピカチュウがうまくできない　作り方のこつを教えて

ピカチュウがうまくできない　作り方のこつを教えて

＞４０６DNaseI conc. ふるべし。

TA cloningの件ではいろいろとありがとうございました。ちゃんとTaqも使って精製もしています。おっしゃるとおり、どかっと取って青白いコロニーを拾いシーケンスしてみま
す。みなさんお忙しい中、ありがとうございました。

＞414
やってみた。明日結果をみる。アリガト。

MupidでのAgarose電気泳動がうまくいかないことたびたび。
うまくいかない時は、先行するBPBが拡散して流れてしまい、
そうなるとDNA断片もバンドになりません。

>>417
Bufferは何ですか？
TAEでもTBEでも1×だと発熱したりすることがあるので、
うちでは0.5×を使っています。

ゲルにバッファがはいってないとか？エタノールがちゃんと飛んでないとか？

バッファの量は？
ゲルの厚みは均一に作れてる？

>>417
サンプル量が少なすぎてもスメるよ。
すごい薄いゲルにオーバーチャージしたことになるから。

シーケンスのゲルにどうしても気泡が入ります。
3ヶ月前は大丈夫だったのに、ジョンソンガラスクルーでいくら磨いても、脱気の時間を20分にしても駄目です。
気泡が入ったら、そこだけ避けて使えないものでしょうか？
しかも訳分からないことに、ゲルは固まっているけど、そのゲルとガラス板の間に気泡が入ってる感じなのです。なんでこんなことが。
Long Ranger高い…なくなった…

ゲル作成のときに、ゲル板押さえつけすぎてたわんじゃってるんじゃ？
それで緩めたときスペーサーの脇からゲルとガラス板の間に空気が入っ
ただけなら、そのまま使えるよ。

ゲルとガラス板の間に気泡ができただけなら問題ナシでオッケー
ですよー。
私は今まで、気泡ができちゃっても（これは完全にゲル中に）そこ
を外してサンプルをアプライしちゃえば良いかなーと思ってたんで
すが、今日スタッフに「気泡の周囲からゲルが変質するので作り直
すべきだ」と言われました。
これってマジですか？

酵素反応の基質に使っているたんぱく質を某カンパニーから購入しています。
シップメントが最近かわって、ドライアイスを入れてこなくなりました｡
そのせいか、反応が極端に悪くなってしまいました｡
カンパニーは、常温で2週間は安定だというのですが…｡
こういう場合、皆さんどうされますか？

>>424
気泡にある酸素がラジカル化して、ゲルが一様になってないからやり直し。
と、Ｄの人にリテイクさせられていた学部の頃。
本当か、どうかはいまだに謎です。

でも、確かにそんなときはいい結果でないし。

>>424
>>426
＞ゲル中の気泡
気泡の周りから、ゲルが泳動時間という短時間に変質して
泳動不能になるとは考えられません。
アクリルアミドの架橋はある程度安定だったはず。
ラジカル反応も架橋形成後には生じないと思いますが。

自分の経験では気泡の周囲のゲルは泳動時にバンドが
気泡を挟んで「ハ」の字型になりました。
何レーンか離せば大して気にならない程度のゆがみでした。
ABIとか蛍光の自動シークエンサーだとバンドが乱れると
データが取れなくなる場合（多少の修正はできる製品もある）が
ありますが、
ＲＩを使って手動でシークエンスをやるとどんなゲルでも
大抵データになってました。

ゲル作成時、溶けているゲルの注ぎ方が下手くそだったため、
端っこが厚くなりその分、他の部分が薄くなったためのようです。
注ぐゲル溶液の量をちょっと増やして、バッファを0.5×にしてみたら、
クリアな泳動像が得られるようになりました。ありがとうございました。

>>426
>>427
ありがとうございました。
スッキリしましたー。

anti-goatの二次抗体を使うとwestern blottingのバックグラウンドが
異様に高くなる。anti-mouseやanti-rabbitだと問題なくいったのに。
何かanti-goatにはコツがあるのでしょうか？

anti-goatの何抗体かわからんが、二次抗体だけで反応させてみなはれ。
それでバックがでるならpreimmuneの抗体をブロッキングにつかってみ
なはれ。

でなけりゃ一次抗体のヤギに問題あり。

うさぎさんやねずみさんはきれいなところで飼えるけど、
やぎさんやひつじさんをきれいなところで飼うのは難しそう。
ばいきんがいっぱいうようよいるところで飼っていたんじゃないの。
牧場で放し飼いにされてたかもしれんし。
そんなときは、別のやぎさんから作った抗体にするのがいいのでは
（つまり別のロットかメーカーのものを買いなはれ。）

>>431&432
アドバイスありがとう。
一次抗体は汚いバンドの中に少しだけ目的のバンドが濃く
出ているので大丈夫かも。やっぱり二次抗体かなあ。
ちなみにanti-goatはmouse抗体です。

>>431, 432
結局二次抗体に使ったanti-goatのマウス抗体+HRP (酸田久留図)が原因でした。
一次抗体反応後にnormal mouse IgGでブロックしてからやったら、きれいに
なりました。まだ少しバックが出るけど、取り敢ずこれでいけそうです。
ありがとうございました。

age

抗体カラムをつくりたいのですが、具体的にはどうすればいいんでしょう？
変性させたタンパクでもいいでしょうか？

変性させたタンパク？

今ふと思いついたけど、
ぷろていんa絡むに抗体混ぜる、ではだめかな？

抗体って、やっぱり使用用途によって変性させてもいいかどうかって違うの？
変性させたタンパクでつくった抗体って、やっぱり何か問題がある？

＞変性させたタンパクでつくった抗体って、やっぱり何か問題がある？

ほとんど全ての場合、問題ないとおもふ。
絵ぴとーぷになってるのはせいぜい１２〜４個のアミの三でしょ。

時々１次構造上はなれているが、３次元的に集まった複数の部分が得ぴとーぷになることがあるときくが、、

第一、抗原を変性させずに抗体作るのむずかしくないか？

え？普通、蛋白ってネイティブなままとってくるのが王道でないの？＞４４０

>>441
普通、抗体作るときはよけいな蛋白が混じらないようにゲルから切り出して精製しないか

440ではないが、
目的タンパク取ってきた（精製した）時はもちろんネイティブ
と思うよ、なにかしらの活性なりなんなりで取ってきたんだものね。（それとも大腸菌で発現させた物なのかな？）

でも抗体作るときはアジュバンドにするでしょ？そのとき室温でオイルとか界面活性剤とかと混ぜてグジュグジュするので、ほとんどの場合変性しちゃうってことなのでは？

市販の抗体の多くは、てきとーにepitopeになりそうなアミノ酸配列を目的タンパクから拾ってきて、
ペプチド合成なり大腸菌なりでどかっと取ってきたものを、光源として免役してる。
いちおうもとタンパクとの反応性は調べているが、時折とんでもないクロスが出たりするのは
そのせいらしい。
気をつけませう。

市販の抗Hisx6抗体を使っています。
分子量マーカーのカーボニックアンヒドラーゼにビチっと反応します。
なぜでしょうか？

Hisの抗体は、あんまりいいのがない。
どれもなんかしらのクロスが出る。
ま、とりあえず別の会社の抗体ためしてみ。

>>445
カルボニックアンヒドラーゼにHisＸ６背負わせて抗体作ってたりしてね、、。

初心者なんですがNorthernがうまくいきません。
サンプルはC. elegansからIsogenでRNAを抽出し、
Oligotexでさらに抽出したmRNA。

各1ugのmRNAを泳動しエチブロで染色。30分Milli Qで洗ってバンド確認。
GeneScreen PlusというメンブレンにO/Nでtransfer。
翌日メンブレンにUVあててtransfer確認。この時ブロット面からUVあてないと
バンドが見えない。逆だと全然写らない。こういうものですか？

プローブはRNAからRT PCRで作った650bpのfragment。標識はamershamの
AlkPhos Directを使用。CDP-Starを用いて検出。
でも全然バンドが見えません。

ちゃんとprobeが標識されているかどうか、調べる方法ってあるのでしょうか？

>>448
系列希釈してドットブロットつくって検出にかけるんじゃだめかい？

まずはRIでしょ！

関係ないくてスマソだけど、おれも、トータルサザンを AlkPhos Directでやったら、上手くいかなかったり、汚かった。
結局RI に逆戻り。コツいるのかな？あれ

>>449
すいません。系列希釈、ドットブロットの意味が分からないんですが・・

>>450
RIやったことないんですよねー、だからできればcoldで済ませられないものかと。

RIのほうが扱いには気を使うけど初心者向き。

感染騒ぎでマウスが買えない…
自家生産しようと他のとこあたっても在庫なし…　だぼっ

>>452
プローブを100,200,400,800,1600倍とかに薄めたのを1ulくらいずつ適当なメンブ
レンにぽちぽち置いて、乾かしたあと普通に検出にかける。濃度既知のコントロール
が売られてない？

＞４５２AlkPhos Directはハイブリ液に細菌が入ると、そのふぉスファター是がバックになるから
無菌的に調製して凍らせて保存します。CDP-Star もあまり長持ちしない咽小あり。綺麗にいくときはラクチン。

>>454
SLCのB6かい？こっちもけっこう大変。御愁傷様。

>>455
>>456
ありがとうございました。
参考にしてもう一度やってみます。

age

>>457
あと、SLCのラット（SD）は他社（クレア他）に比べて気性がかなり荒いと思うのだが、気のせいか？

あげ

>>460
SLCとCRJ使ったことあるけどあんまり違わんかったよ。
輸送距離とかも関係するかもね。

>>454,457
困りますよねぇ。。。
交配日指定のbalb/cをいつもSLCから買ってたのに、春野生産所の動物が
全部購入中止になってて（泣）

>>460
うーん。私の印象ではSLCのSDラットは他社と比べておとなしいと思った。
そんなものなのでしょう(^^;

今、u937とTHP-1の細胞にpCXN2を使ってtransfectionしています。electroporationとリポフェクションの両方でやっていますが、どうしても入りません。
electroporationでは電圧の条件を240Ｖ〜100Ｖでふってやってみました。あとはG418のselectionの濃度を最初は500ug/mlで初めて、徐々に750ugくらいまであげていますが、途中で死んでしまい上手くいきません。
vectorの相性が悪いのかもしれませんが、モノサイトの細胞に相性の良いvectorが何かありますでしょうか？
それと、特にTHP-1はもともと細胞が弱いのか、ただ飼っているだけでも死んでしまう時さえあるのですが、飼い方に何かコツはありますか？
ご教授のほどよろしくお願いいたします。

>>358
>>464
この二つの状況って異常に似ているのだが、同一人物だろうか？
単に変異体TNF-αが欲しいだけなら、タグを付けて大腸菌にtransfectして蛋白を発現させてから回収するのが確実と思うけど。

>>465
というか、monocyteで変異型TNF-αを発現させて、細胞の機能がどうなるか見たいんでしょ。

いや、それは俺も考えたのだが、TNF-αそのものがmonocyteの機能に関与しているのかどうかと思って。
monocyteというと、TNF-αを産生する方っていうイメージがあるのだが。
ひょっとして、TNF-αがmonocyteの細胞内シグナル伝達に関与するという仮説で実験しているのかなあ。

>>467
なるほどね。
でも、>>358の文章からすると、やっぱりmonocyteでのTNF-αの機能が見たいんじゃないの？
その点、467の仮説は図星かも。
あるいは、細胞内シグナル分子という仮説じゃなくて、膜蛋白として何かするという仮説かもしれんが。
この推測が当たっているとしたら、検索にかけたら358（=464?）の所属が分かるかも。

>>465-468
ワラタ。
やっぱりネットで詳しい情報をさらすのは危険だなー。
２ちゃんだし。
358の場合、IP表示しているのに近いものがあるもんな。
身元が割れるだけじゃなくアイディアまで盗られる恐れがあるから、ある意味それよりも怖いかも。
でも、358の仮説と467や468の仮説が全く違っていたとしたら面白いな。

おれは分かっただれなのか（大ﾜﾗ）

>>471
じゃあ、直接アドバイスしてやれ。
論文になったときにAcknowledgmentにのせてくれるかもしれんぞ。
匿名のアドバイスの場合、"The authors acknowledges the contribution of "2ch" members for their helpful discussion."なんてどうだろ（藁）。

358=464というか、358から引き継ぎました。ここってとっても危険なところだったんですね。いろいろと未熟だったと反省しています。470さん、直接のアドバイスお待ちしています。

＞"2ch" members
やっぱここは"2ch nanashies" だと思うな。

>>471は>>470の間違い。スマソ。

>>473
気付かなかった。何か悔しいけど、同意。

苦労して作ったＧＳＴ蛋白を透析していたら、透析膜がやぶれていた。高価なPierceのカセット式なのに・・ショックだ。

普通に透析ちゅーぶとヲレンヂ色のクランプでやれよ

>>476
俺もクランプのが好きだったんだが、今のラボはカセット式しか使ってないみたい。贅沢な奴らだ。

ゴルァーーーー
ECLでサザンやってて、ここ３日連続失敗して、いろいろと
思案錯誤しまくって、むかつきまくって、
ふとハイブリオーブンに温度計入れてみたら、
表示が５℃も狂ってるじゃねえかよーーーーー！
ハイブリオーブン温度狂いすぎなんだよおおおおおお！
俺の３日間を返せボケーーーーーーー！！！！！！！！

>>478
御愁傷様です。

ハイブリって５度くらいの差が、そんなに極端に出るか？

ものによっては。

私は表示温度は信じないよ。
いつもマイ温度計。
痛い目みたからね。

初心者なんですが…primerを頼んだ会社によって、記載されているTmが違うのは
何故でしょうか？先輩に聞いたら「己の勘を信じろ！！」って…。

計算式が何通りかあるけど、どれも近似式だからね…

塩濃度やMg濃度、pHやglycerol,
DMSO、プライマー濃度によって、どんどん変わるものだからねぇ＞二本鎖DNAメルティング濃度

tyrosine hydroxylase (TH) の免疫染色がうまくいきません。
線条体を染めたいのですが、パラフィン切片(5μm)では染まりません。
論文を見ると多くは凍結切片(40μm)で染色を行っています。
やはり厚さが問題なのでしょうか?
もし経験の有る方がいましたら、ご助言お願いします。

厚さ関係なし。
抗体が失活かプロトコ-ルに問題あり。
THは誰がやっても染まるから。

パラフィン切片で免疫染色？　できなくはないって話だが、ほとんど聞かないぞ。
タンパク質の変性で抗体との反応性が相当落ちるらしい。

テクノビット＠黒岩常祥先生推奨を使え＞切片、免疫染色

読んでおけ
http://messages.yahoo.co.jp/bbs?.mm=GN&action=m&board=1835548&tid=a2a1bfmne0a4o0dbc01bfma4ka4ha4ca4fbana4ia4la4bfa2a1bfbfbcb&sid=1835548&mid=1&type=date&first=1

イオン交換カラムに、夾雑タンパクがべっとりとくっついて、
ほとんどとれません。
何かいい方法ありませんかね〜？

イオン交換カラムの洗浄をHClとNaOHで洗わずにやってた人がいた…

サブクローニングが上手くいきません。コロニーが一つも出ません。
制限酵素で切ってアガロース(TAE)で流してGean Clean kitで精製して、
ﾀｶﾗのligation kit 使った後transformation。

全く同じプロトコール・試薬で前の研究室では失敗したことなかったですが、
研究室が変わってから一度も上手くいきません。
コントロールを使って培地はオッケイであることは確認してます。
PCR産物を同じligation kitを使ってTA cloningをすると上手くいくので、
ligaseの失活ではないと思います。精製のところをQUIAGENのキットに替えてもﾀﾞﾒです。
どこに問題があるのでしょうか？どなたかご助言いただけないでしょうか。

別のフラグメント使ってサブクローニングがうまくいくかどうか確認。
（TAクローニングではなく）
うまくゆくならば、サブクローニングしたフラグメントが大腸菌に悪さしてる
可能性ありなので発現を抑えるようなベクターを使うと良いと思う。

ただ、No insertのクローンも出てこないところはかなりあやしい。
ベクターのDNAがないんじゃない？

>>493
お忙しいところ、ご助言ありがとうございます。今いる研究室は
分子生物の研究室ではなく、他にクローニングすらやっている人
がいないので、他の人に試しにやってもらうこともできず困ってます。

コントロールとして別のベクター、別のフラグメントを使っても
コロニーが全くでません。精製したフラグメント及びベクター
を電気泳動すると、きちんと所定の位置にバンドがでます。
PCR産物は未精製でもちゃんと入るので、制限酵素反応から精製までの
どこかに問題があってligationが上手くいかないのかなと思ってますが、
何か落とし穴のようなものがあるのでしょうか？

>>494 使ってる試薬で大腸菌が死んでるんじゃないかなあ？
培地に抗生物質入れず、トランスフォーメーションせずに
蒔いても出ないのでは？

>>494
泳動チェックのUVでフラグメントがズタボロに切れてるとか・・・
前の研究室と今の研究室で使っているもので違うのは何？
例えば試薬は同じでもUVランプなんかは違うのをつかってるよね？

>>495
さっそく試してみます。

>>496
その点がかなりひっかかってます。実際それが原因でサブクロ上手くいかず
コロニーが１個すら出ないということはありうる話なのでしょうか？
使ってるUVランプは下から照らす方式のフナこシの製品なんですけど。

違うものは、TAE希釈用の水、EtBr、UVランプ、インキュベーター
ぐらいです。このうち上手くいってるTAcloningで使ってないものは、
EtBr、UVランプ、インキュベーター（フラグメント精製用）の３っつ
ぐらいです。

>>495
コントロールではちゃんと生えてくるので、コンピ自体が
死んでる事はないと思います。ligation後のDNA溶液
が原因で死んでいないかどうか、トランスフォーメーション
して抗生物質なしの培地に蒔いてみようかと思います。

Santa Cruzのgoatの抗体を使ってWBし、2次抗体に同じSCのdonkey anti-goat IgG
を使ったらえらくbackgroundが高くなってしまいました。
Catalogを調べると、donkey以外にもmouse anti-goatやrabbit anti-goatの2次
抗体があるようなんですけど、どう違うんでしょうか？

goat serum でブロックしたんじゃないの？

>>500
Blockingは5%スキンミルクです。

ECLでやったのならかなり抗体（HRP標識だと思う）を
リンスで落とさないとBKGが消えなかったことある。
あと抗体なしのコントロールとれば、どこが悪いかわかるんじやないの。

昔々、あるところで外国帰りの教授が新しい研究室をセットアップしました。
教授は短波長のUVランプ(254nm)をつかって実験をやったところ、バンドが
見えるのにサブクローニングは失敗の連続でした。そこで賢い大学院生が
すこし波長の違う(280nmだったか？)を使ってみたところ、何事もないように
実験がうまくいくようになりました。大変めでたい結果になったのですが、
大学院生がみんな教授の言う事を信じなくなってしまいました。おっしまい。
教訓：なるべくDNAにダメージを与えないように長波長のランプを使おう！

>>503
ご教授ありがとうございます。まさに私は今の研究室で
クローニングの系を立ち上げているところなのです！
どうも原因はそれっぽいですね。すぐに確認してみます！

>>480
ECLは43℃以上に長時間おくとラベルが死ぬんだよ！

>503
そんなに差が出るの？
おれは気にせず短波長でやって問題起こってない気がするけ
ど・・・。

＞506
ちがうだろ。
ていうか、UVに当てる時間はなるべく短く。これ基本。
これが守れてリャ短波長でもいい。
へぼい奴は長波長でもダメ。

５０７に全面的に賛成。
初心者には短を使って手際よくさせることから始めてる。

>>503
調べたところ、やはり使用していたランプは254nmでした。
試しに隣の研究室の312nmのを借りて切りだししてみましたところ、
コロニー生えまくり、バリバリ上手くいきました！
御教授に深く感謝いたします。

>>506-508
10秒もUVあててないんですけど、まだまだﾄﾛｲんすかね？
正直、これほどまで差があるとは自分でもびっくりです。

１０秒はとろいだろ。
必要ないときは遮光する（イルミネーターの端に置く）などして、
合計３秒以内くらいに抑えていたが。

あげ

１０秒ではたしかに長い。Digestionの処理をしているようなもんだ。
初心者は、
横に定規をおいて写真を取り、あとはUVをあてないで、
定規で測った位置を切り出すのだよ。

多分教授が自分でやったらちゃんとクローニング出来ると思うぞ。
教授をバカにする前に自分の稚拙さを疑うべし。
２chのみ過ぎだぞ。

>>513
なるほどそうなのですか、みなさん凄腕ですね。
というか、私が今までいた研究室ではみんな結構トロトロ
やってたんで、特に切りだし時間については意識してませんでした。

反面、たかだか7秒の差だったら、長波長を使って
落ち着いてやればいいのではないかという気もしますが。
なんか短波長ですばやくやることのメリットってあるのでしょうか？

ここわりと良い。

ゲルシフトアッセイではまってます。
Santa Cruzの抗体でスーパーシフトしません。

抗体に問題がある可能性もありますが、目的の転写因子を
COS-1細胞につくらせるよりin vitro翻訳の方が
いいのでしょうか？
文献だとみんなTNT(Promega)つかってます。

>>514
だから、一番良いのは長波長でさっさとやる事なんだよ。
長波長だらかってとろとろやってるような奴はもっと高度な実験だと
更に失敗するのよ。
ゲル抽出くらい初歩の初歩。
こんなもん立ち上げてるようなラボにいないほうが良い。

>>516
一応ウエスタンでは使える抗体であることを確認しています？
スーパーシフト用と称して売られている抗体の濃度は普通のウエスタンや
免染用より１桁濃いことが多いのでそのへんの問題かも。
違っていたらすまそ。

maxi-prep（QiagenのQIAfilter Maxi kit使用）がうまくいきません．mini-prepはちゃんとできて，1.5ml LB cultureから2-3ugくらいplasmidがとれるのですが，残りの培養液100ulをLB 100mlにいれて一晩ふやしてからmaxi-prepをするとほとんどとれません（最後のIso沈のあとペレットがほとんどなくて，溶かしても20ugくらいしかありません）．E.Coliはmini-prepしたその日に100ml cultureに入れたもので，ちゃんと増えています．なぜなのでしょうか？

みんながんばれage

CsClでやれ

ホストを変えれ

とれない理由は、プラスミドが落ちてしまっているからです。
E.coliは増えますが、大部分がプラスミドを持たない「空の菌」になってしまってるわけです。
mini-prepをした後の残りの培養液を大量培養しているのが原因です。
アンピシリン耐性マーカーを持つプラスミドでしばしば起きます。
うまく行くときは書かれているように操作してもプラスミドが正常にとれることもあるので、
こうしたやり方を頑にやろうとする人をしばしば見かけますが、よろしく無いですね。
mini-prepを始めるときに、拾ったコロニーをまずマスタープレートに小さく塗って（
つまようじかピペットチップでそっとのせるだけで良いです。）から、液体培地に入れるようにします。
mini-prepして当たりのクローンを同定した後、マスタープレートからmaxi-prepのための液体培養を始めれば
たいていの場合は問題が起ることはありません。
もっと慎重な人はmini-prepの当たりクローンをさらに新しいプレートにストリークして、
シングルコロニーにしてからinoculateしたりします。これは手間がかかる割にはあまり良い方法ではありません。
一番理想的なのはあたりのクローンのマスタープレートから当たりクローンを新しいプレートに塗り付けて半日ほど培養して
菌が増えたところで掻き取って液体培養することです。

なぜこのようなことが起るかというと、培養中に抗生物質が消費されてしまって、
感受性の菌も増殖できるようになるからです。
とくにアンピシリン耐性の場合は、耐性遺伝子のβーラクタマーゼが菌体外へ分泌されるため、
速やかに培養液中からアンピシリンが分解されてしまいます。アンピシリンは菌を殺してしまうわけでは無いので、
濃度が下がってくると感受性菌が増えてしまうのです。さらに悪いことには、プラスミドは
染色体DNAにくらべるとはるかに小さいですが、多コピーで存在しているため、宿主菌にとってかなりの負担になっています。
つまり、プラスミドを持たない菌の方がわずかですが、増殖速度が早くなります。したがって、長時間／多世代の培養を続けると、
菌の集団のほとんどが、感受性菌に置き換わってしまっているのです。

これは、現象の単なる解釈では無く実験事実として簡単にテストすることができます。
失敗したmaxi-prepの希釈系列をLB培地（抗生物質なし）でつくって、
抗生物質ありとなしのプレートにそれぞれまいてみて下さい。
抗生物質無しのプレートに圧倒的に多数のコロニーが形成されるはずです。

次回の実験ではisopropanol沈澱でベッタリと大きなペレットがとれることを
期待しております。
みなさま長くなってしまってすみませんでした。

Qiagenのはそういうことがよく起こる。俺も同じ経験をしている。わかっていることは、プラスミドによること、
どうしてもと言うときにはミニプレップを大量にやるしかないということだ。
また、洗浄液などを全部保存しておいて、泳動してみる必要がある。

>>523
抗生物質が消費されてしまうというのは良く聞く話だけど、それでも説明できないような時もある。
でも、ラージプレップ中に、アンピシリンを追加するのってあまり聞いたことがないのだけど効果的なのかな？

>>523
大変参考になりました．ありがとうございました．

>>523
いい書き込みだ。君はバクテリアの分子遺伝学をきちんと教えるラボの出身だね。
エラそうな書き方で気に触ったらすまんが、ひさしぶりに感心したので。

>>525
523は、ラージプレップの培養液にアンプを追加するってことを
勧めているのではないぞ。よく読んでみれ。培養液への抗生物質の追加は、
pBR系（pUC系にあらず！）のプラスミドを増やす際のクロマイ以外は全く
効果なし！　こんなこたぁ昔は常識だったのじゃがのう・・・（遠い目）

RAP の合成を阻害してプラスミドのコピー数を増やす、、だっけ

だから、ホストを変えれって逝ってんだろ！

>>529
519が523ほど大腸菌の遺伝学に詳しいとは思えない。
ホストのジェノタイプも読めない奴がやみくもにホストを
変えても無駄無駄無駄無駄無駄ァ！

何で勉強できるの？>大腸菌の遺伝学

それは「大腸菌なんてツールだよツール！　トラフォしてプラスミド
増やしてくれればそれでいいのさ！　たかが道具に過ぎない
原核生物をわざわざ研究材料にするなんて時間の無駄だよ！
他に勉強しなきゃきいけないことがいっぱいあるのに、どうして
そんなものの勉強なんてできるのさ！」という意味ですか？

ホストを変えるのが一番。
君も大きくなったらわかるよ。

ある程度はgenotype ぐらい読めないと、BL21株で青白セレクションして、全部真っ青であれー？とかいうまぬけなことやりかねません。あとファージベクターもsuppressor の関係で宿主を選びますから、適当に宿主を選んでいるとひどい目にあいます。このあたりの遺伝学はMolecular Cloning に詳しくのっているからそこで勉強されては？　ツールとはいえ、雑学として大腸菌の遺伝学を憶えるのも楽しいものですよ。

上の文中、「適当に宿主を選んでいると」は「いい加減に宿主を選んでいると」の間違いです。すんません。

>βーラクタマーゼが菌体外へ分泌されるため、
>速やかに培養液中からアンピシリンが分解されてしまいます。
>アンピシリンは菌を殺してしまうわけでは無いので、

なのに、

>ホストを変えるのが一番。

なのはなぜ？Amp感受性の違いを利用すると言うこと？

>>532
それは被害妄想だ(藁

cDNAの単離で全長が取れたと判断する条件はなんでしょうか？

開始コドンと思われるところより上に終始コドンがあるとか。
でも無い場合もあるからねえ。
たくさんとって、ほとんどおんなじ所から転写されてるとか。
ホモログと比べるとか。
じゃない？

プライマーエクステンションして、上流側のUTR長さを推定してから
ゲノミックPCRで転写開始位置周辺配列を読む

>>538 ｵﾘｺﾞｷｬｯﾌﾟを使えば万全です｡

林崎研直伝ですか？＞ヲリゴキャップ

>>538 こざっくに聞いてこい

カルベニシリンって、どうよ？
アンピシリンより高いが．．．

こざっくって何?

真核細胞のmRNAの開始Met付近の塩基配列は、それと相補的な塩基配列がリボゾームRNAに
にある。mRNAの5'付近のキャップ構造やヲメガ配列に結合したリボゾームはmRNAにそって
３'方向に歩いてすきゃにんぐを行いコザック配列を認識して翻訳を開始する。

ｺｻﾞｯｸもそんなに厳密じゃないしなあ

コザック配列を認識するとどうして翻訳が開始されるの？

>518
ありがとうございます。が、抗体は誰かに使い果たされてしまいました。鬱だ。

http://www.promega.com/jp/jp_tech/FAQs/Q&A4.htm#Kozak
コザックか．．．

こざっくのルール

>>544
アンピシリンで大丈夫。
サテライトコロニーなんか出ない。

pGEXを入れた大腸菌はサテライトコロニーなぞ出ないが、pUC18を入れた大腸菌だとサテライトでまくり

同じstrainで？

ここにいるのは夏厨房ばかり

プラスミドによってもコピー数は変わるだろうよ。

アンピシリン、俺はいつも１００uいれているけど、５０ならサテライトでるみたい。

うちはケチなので２５μg/ml あんぴしりん

>>556
別に出ないよ。
培養時間が長すぎるんじゃない？

そうかなぁ。だいたい１２時間ぐらいだと思うけど。

LBagarに　アンピシリンを入れるときに、熱すぎるんぢゃないの？

５６℃だったっけ？ちゃんと冷やしているよ。

単に君がキタナイだけぢゃ？
バクテリア振り撒きながら実験してるんじゃないの？

おーい、キタナイのとサテライトは関係ないと思われ・・・

耐性菌を振り撒けばfalse positiveなコロニーが出るだけ。
非耐性菌はtransformationされなかったの元々いっぱいいる。

進化論を証明することでしょ

大腸菌の（株）にもよるからねえ。
HB101とかＣ６００とかはすごく早く生えるからサテライト出やすいし、
DH5αなんかは遅いので、出にくい。
いずれにしても、直径0.5mmぐらいのコロニーになったら引き上げてる。

早いやつは一晩で1ミリ超えちゃうよね。
JM109が標準だったラボからXL1blueのラボに移ったらコロニーがきれいで感動した。

サテライトは何故出るんですか？

Ampなんかの場合だと、耐性がβ-ラクタマーゼの生産で行われているので、あまり長い時間
寒天培地上で培養していると、死滅した菌体から放出された β-ラクタマーゼが回りのAmpを
ぶちぶち切っていく。
よって、回りでAmpによって生育を抑制されていた大腸菌が、ここぞとばかりに増えてくる。
これがサテライトです。
テトラサイクリンなんかは、耐性のメカニズムが違うので、サテライトは比較的出にくいです。

>>568
どうも、勉強になりました。

あと、
A-tailingさせたものをp-GEMでligationさせて
DH5αにいれてamp培地に蒔いてるのですが
コロニー、青も白もほとんど生えません。
ampとX-galは40μlまいてます。
pBSでも同じ感じでした。
動作が遅いからなのかなあ？

どうぞよろしくお願いします。

pGEM系とか使ったこと無いのでよく解りませんが、菌体が全然生えてこないと言うのだと、
ligationかtransformationを疑った方がいいです。
コンピテントは大丈夫ですか？
ligationのシステムは？

それと、DH5αはかなり生えてくるのが遅いので、JM109の５割り増しの時間培養しましょう。

GST融合タンパク質が精製できません〜！
融合タンパク質がGlutathione Sepharose担体に結合してないようなのデス。
ファルマシアのトラブルシューティングも見てみたのに・・・（T^T）。

PACがとれません。
キアゲンキット使ってるから、50マイクログラムくらい取れるはずなのに
2マイクログラムくらいしかない。どこでロスしているんだろう…

>>571
発現は確認できていますか？
WesternでモノかGSTの抗体で確認できますか？
GST-fusion proteinは可溶性画分に来ていますか？
タンパクが分解を受けてはいませんか？
以上のことがクリアされていたら、ビーズを疑ってみましょう。
できれば別のカラムを用意できると一番良いです。

>>572
どれぐらいの培養量でやっていますか？
PACはかなり取れる量は少ないですよ。
通常のプラスミドで50マイクロ取れるぐらいの条件なら、数マイクロというのは
あながち妙な数字ではありません。
あと、ちょっとメーカーは失念しましたが、キアゲンより効率よく大きなplasmidを
精製するキットがあります。PACを受託している所などに聞いてみてはどうでしょうか？

572>>574
培養量は500mlです。
キットはラージコンストラクト用のもので、プロトコルによると
「PAC、BACなら50マイクログラムくらいはとれる」と書いてあったんですが…。
別のキットも調べてみます。ありがとう。

アクリルアミドのゲルを濾紙に貼り付けて乾燥すると必ずカールして
保存するのにかさばってしまう。平らになるいい方法ありませんか？

＞５７６　って、ちゃんとゲル乾燥機で乾かした奴だよね。
一度濾紙ごとまっすぐにして本の間に挟んでおけばやがてまっすぐになります。

おはよう

two-hybriで、ベイトだけでアクチベートしないかチェックしようとしたら、
ぜんぜん生えてきませんでした。ポジコンも。
システムはMATCH-MAKERで、pCLだけでもはえてきません。
培地はSD/-Try/X-galです。
ちなみに、当方、まったく酵母つかったことありません。
どうしてでしょう？

ラット線条体でのtyrosine hydroxylase(TH)免疫染色が
うまくいきません。
固定液は 4%PF in 0.1M PB、パラフィン包埋した5μm厚の
切片をクエン酸バッファーで処理して染色していますが、
バックグラウンドが高くよくわからない状態です。
どなたか、THの免疫染色をしたことがある方がいらしたら
アドバイスをもらえないでしょうか?

ゲルシフトでＤＮＡと蛋白の結合を確認するとき、特異的なＤＮＡのシークエンスがわかっていないときはどうやって
プローブを決めるの？

>>579
あなたの質問は「車が動きません。なぜでしょうか？」という質問に等しいくらい曖昧すぎる。
今まで何と何をチェックしたのか、きちんと説明すべき。

>>580
クエン酸処理などしなくてもTHはきれいにそまるよ。
真っ白ななかに黒いニューロンが浮かび上がる様は
いつ見てもきれいだ。まるで鍍銀染色かと一瞬わが目を
疑うくらいにきれいだ。ちなみにうちでは二次抗体の
チェックにTH抗体を使っています。どんな条件でやっても
染まるから。

>>485 >>580
二週間無駄にした奴を晒しあげ

>>582
いや，全くの初心者なので．酵母に関しては．
でも，他の刷れで同じ文章で質問したら，ちゃんと
解決法を教えてくれた人がいましたよ．
プロは初心者が失敗しそうなポイントを知ってるんでしょう．
>>584
良く気づきましたね．
まあ他の実験もやってるんだろうから，
そんな悲惨なこと言ってやるなよ．

パラフィン包埋した組織を常温で数日放置してるとか？>>580

>>580
パラフィンでBKGが高いという時点でなにかとんでもないような間違いをしているような気がする。

私も植物でパラフィンほうまいしてますが、うまくいきません　室温にするとすぐに固まっちまう

どなたかE.coliでtwo-hyをやってるひといませんか？

>>589
Stratageneのキットのことけ？

ハイグロマイシンで遺伝子発現細胞を選択するときの初期濃度って
どれくらいにしてる？

>>580
それはね、マウスのモノクロ使ってるでしょ。
マウスのモノクロは決してマウスの抗原とは
反応しないからよ。ばかね。

>>591
レスにならないかもしれませんが、
私はジェネティシン（G418)を使っていますが、細胞によって至適濃度が異なると思います。
Hep**細胞はタフだったので800 ug/mLに設定していました。

うんうん、たしかにＧ４１８は細胞によって全然違うし、かなり高濃度
でも死ななくて選択不可能のもあるような気がする。
うちのラボではpuroをルーチンで使用しているのだけれど、切れが良くて
使いやすい。
ところが、今度手に入れた細胞がハイグロで、濃度に関する
データが無くなってしまっているので困ってるんです。

たいたーちぇっくすれ

＞＞５９１
９６ウェルプレートに300cell/wellの濃度で細胞を播いて縦の列ごとに０〜１ｍｇ/ｍｌ
の濃度で抗生物質を振って挙げて細胞が増えてくるのを待つ。増えてこないぎりぎりより
一つ濃度の高いところでセレクションすればよし。
＞＞５８９
そうです！やったことあります？

>>580
「ラット線条体でのtyrosine hydroxylase(TH)免疫染色」
って書いてあるからラットの抗原っしょ？

>>597
>>580はネタですがな。ネタ。投稿人名見なはれ。
マウスのモノクロが絶対にマウスに反応せんかったら
マウスの研究めちゃやりにくいですやん。（藁
そんなことぜんぜんおまへんで。

>>598
よくみてませんでした。。。（藁
というか今日ショックな結果が。。。。

どうした、ほふ！

げ、600逃してさりげなく悔しい…。
それはともかく、結果あげれあげれ

後輩が長い（１５，６kbp）プラスミドをE.coliにエレポでトランスフォーム
して増やして回収しようとしてるんだけど、（予想していたとおり）
回収率が異常に悪いんだよね。自分がそんなに長いの扱ったこと無いから
アドバイスができないんだけど何か回収率を上げるいい方法無い？

ほふは、Westernで予期せぬところにバンドが現れてショックです。。。藁

それはペンギン君が今日もやれやれと仕事を終えてほっとしたところである

ペンギン君のベイにやってきたＪクン、とある抗体のビンをとりだし、そっくり返りつつ
（これ、Ｊの基本姿勢）

Ｊ：ボクこの抗体買ったんだ

ラベルを見ると抗ヒトCD34抗体である。どうやらAPC（アロフィコシアニンという青い蛍
光色素）をくっつけてあるところが本人の最もアピールしたいところとお見受けしたので

Ｐ：ふーん　それ使ってヒトの骨髄でも解析するの？　APCだから他の抗体と組み合わせや
すいね

Ｊ：ちがう　マウスに使うんだよ

Ｐ：へ？？　それ抗ヒトだよ？？

Ｊ：マウスにも交差反応するかもしれないだろ、もしそうならAPCだからすごく便利なんだ
よ。うちのFACSはFITCとPEの他にあと２種類の色素使えるの知ってるか？

Ｐ：いえあの・・FACSの細かい仕様を注文したのワタクシなんで知らないわけないんすけ
ど・・
　　それにあと２種類ぢゃなくって、正確にはあと３種類使えるんすけど・・

　　いや・・それよりなにより、それモノクローナル抗体だからマウスには反応しないと
・・思う・・んですけど・・

Ｊ：Who knows?!

マウスに交差する場合は、説明書に書いてないか？

マウスにだって自己抗体で発症する自己免疫疾患があるだろ。

>>589
うちの研究室でやってる奴がいるけど、これってかな〜り
マイナーじゃないかね。他がやってるって事自体初耳だ(笑)

抗原が細胞内のだったら、クロスしてもおかしくないんじゃない？

抗体つくらせたが為に、自己免疫疾患にかかって、
毛はぬけ痩せさらばえるマウスをみて「ニヤリ」としないやつは、
解ってないやつだよね。

もうペンギンはどうしようもないですね。
したり顔でデタラメの知識を披露するわ、他人の悪口を書きまくるわ、
HHMI investigators の顔に泥を塗るわで。
こういう人はどうなってるんですかね。

レスをつけてくださいました皆様、どうもありがとうございました。
返答が遅くなってしまいましたことはご容赦ください。

>>583さん 私はABC法を用いて染色しています。580で書いた操作でも
黒質の切片では細胞体がきれいに染色されますが、線条体では
予想される線維性の染色があまり認められない(B.G.に埋もれてしまう)
ため、悩んでいました。

>>586さん 標本はブロックも切片も室温にて保存していますが、
問題でしょうか? 他のタンパクはそれで問題なく染色できたのですが。
どのような問題が生じるのか、出来れば教えてください。

>>587さん 抗体反応中の切片を乾かす様なことはさすがにしていません。
上にも書きましたが黒質のニューロンは染まるので、手技上のミスでは
ないと思います。

>>590さんへ 一次抗体はRbt anti rat (poly)です。
右手で右手を押さえるようなことはしてませんよ(笑)。

583さんのアドバイスに従い、まずはクエン酸バッファ処理なしで
実験しようと思います。

>>606
今お安くなってるからでわ？

＞６１０
目的の反応が出たとこで発色を止めれば？

優良スレさがりすぎage

マウスの抗GFAPモノクロ抗体を探しています。
推薦できるメーカーをご存じの方、お願いします。

>>612さん
目的の反応を発色させようとすると、一緒にB.G.も高くなるのでした。

クエン酸バッファ処理の代わりに0.3% Triton X-100で20分処理
したところ、B.G.が落ちました(皮質錐体細胞や2-4層の反応がなく
なった)。まだ安定して結果が出ていないので、今のところ切片を
切り出してからの時間に注目しているところです。

>>615
DABで発色でしたか？
蛍光ではだめなの？

>>616さん
蛍光は、まだ提案していません。教授に提案して了承を得た後、
二次抗体の調達から始めないといけないのです。
ただ、お金有るかなぁ、私立の貧乏ラボなので。
共焦点は共通機器室にあったかなあ。

>>616さん
DAB発色です。Triton処理標本の場合、発色に18分程度かけています。
かなり長いですね。
クエン酸処理では6分で引き揚げますが、まっ茶色です。
ベストは7分程度と習っています。

THならマウスのモノクロできれいに出るの買ったよ。
それにした方がいいのでは？

3'RACEやってる人いませんか？
ノンスペでまくりでうまくいかないのですが…

λファージからＤＮＡ抽出してますが量が少なくて困ってます。
同じサンプルですが先週抽出したものは多いのですが・・・
どうもＰＥＧいれて遠心後のファージ粒子の沈殿がかなり減ったように
思います。どなたかアドバイスお願いします

>>620
キット使ってるの？
どのキット？
PCRはどこの酵素使ってるの？

>>621
大腸菌の数、増殖スピードとファージのタイターがキモだから、まったく同条件で
ないと安定して取れない。昼間観察しながら増やしてみよう。

算数にチャレンジの第２６９問を参考に。
ttp://kurihara.sansu.org/sansu1-2/index.htm

アミノ化primer使ってsampleをアミノ基でlabellingしたいんですが、
これがどれだけできたのか確認したいんです。
アミノ基を検出または定量できるkitのようなものってない
でしょうか？
そのkit本来の用途がアミノ基検出ではなくても、結果として分かれば
良いんですけども。
どなたかご存知の方いましたら教えて下さい。

あげるYO

発現させる目的でproof readingなPCRをしたいのですが、
みなさんサイクル数はどのくらいに設定していますか？
Pfuをつかって5＋20サイクルで増えてくることは確認できていますが、
もう少し少ない方がいいような話を他スレで聞いて気になっています。

別にKOD plusでサイクル数30で増やしたけど、ミューてーしょんは入ってるクローンは０／４だったよ。。。。

>>626
あくまで主観的な感覚だが、よほどサイクル数を増やさない限りは（＞４０とか）
あまりサイクル数とmutationは相関しないような気がする。
むしろ、酵素の種類と、target sequenceによって、決まりそうだ。

Klett-Summerson photoelectric colorimeterって何？

>>629
えらくまた懐かしい機械出してきたな。
クレットメーターってヤツね。
大腸菌なんかを、枝付きフラスコや試験管で生やして、そのまま測定部に
チューブをつっこんで、吸光度（濁度）を計れる機械だ。
最近は、あんまり使わないなあ。そういえば。

吸光度の濁度で細胞数を調節するって、paperに書いてあったけど、
どういうこと？濁度1.0（例えば）の時の細胞数（CFU）を出したとして
２．０の時の細胞数は検討つくのかな？
恥ずかしい質問ですみません。

>>627-628
ありがとうございます。
とりあえず30でやってみて配列確認してみます。

>>631
つくよ。OD600で測る。

>>633
それじゃあ、対象微生物の増殖曲線をOD600で測りつつ、
CFUで測定していくって感じ？

HL60がうまく増えないんですけど
どうしたらいいでしょう？

>>634
大腸菌しか知らないけど、1OD600が何細胞に相当っていうのがあっ
て、あとは比例計算でやってしまうはず。吸光度2倍なら細胞数2倍っ
てことで。

どっかで直線性が失われるから注意したほうがいいんじゃなかったっけ。

免疫染色でマウスモノクロでマウス切片を染めようとしています。

9.0日胚はきれいに染まりましたが、adultでは内在性のイムノグロブリンと、
２次抗体の抗マウスIgGがクロスしてバックがかなり上がってしまいます（多分）。これから胚からアダルトまでを染めるつもりです。

マウスの免疫系は何日胚、あるいは生後何日くらいから働くのでしょうか？
というか体内のIgGはいつ生産分泌が始まるのでしょうか？

vectorのMOMを使われている方はおられますか？
きれいに出ますか？

なにか少しでも知っている方、よろしくお願いします。

ここをみている方でバキュロウィルスを扱ったことがいる方はおられませんか？
発現量が少なくてとっても困ってるんです。
うまくいかなかったらベクタ−再構築かも・・・

>>639
MOIどれくらいでやってる？
あとSf9とかの細胞どれくらい継代してる？
半年から１年くらいでへたってくるよ。

培養16時間でサテライトがいっぱい出て、白コロニーをいくら突いても目的の物がとれてこないアンピシリンプレートは、やっぱりアンピ
シリンがへたっているんでしょうか。

>>639
細胞をHigh Fiveに変える。
640の言うとおり、MOIを色々変えてみる。
細胞密度を変え、発現の経時変化を、１週間ぐらいまで追ってみる。
培地を変える。
ぐらいかね？すぐ思いつくのって。

>>641
まず、プレート作り直して同じ事やってみろ。話はそれからだ。

みなさんどれくらいの性能のDNAシーケンサーをお使いですか？
うちは3時間で16サンプル読める(800bp)マシンですが...

>>643
ABI310がメイン。
３時間で１サンプル５００bpＸ２台。
それ以上たくさんのサンプルを急ぎで処理する必要があるときは、外注。

６４０さん、６４２さん、アドバイスありがとうございます。
sfは半年から１年でへたるんですか、その徴候としては浮遊したり、増殖率が落ちたりするんですかね。
私の目的のタンパク質の発現量が少ないのは、細胞内に留まってるんです。
本来は分泌タンパクであるだろうはずのものが。

とりあえずMOIをふって試してみます。

　液体培地にバクテリアを植えていざOD測定。
　っとその前に培地に波長スキャンかけて最適波長を見つけなきゃ。
　・・・？？？
　がびーん！　400から700nm間で吸収ピーク無し？
　友達は600nmくらいが良いっていってたのに！

　どうかどなたか助けて下さいませんか。

http://www.f2.dion.ne.jp/~impact14/

>>646
増えてくる前の培地の話？

>>648
ええそうです。経験ありませんか？
普通は前もってスキャンかけるらしいじゃないですか。
私、培養は今回がはじめてなんですよね。

>>649
そのかきかた。
ねたですね。

ネタじゃないですよ！
まじなんですけど・・・

初心者です。
細胞にある遺伝子を強制発現させて、サイトカイン刺激の反応性をみる実験をしたいのですが、
対照として、空のプラスミドベクターを入れた細胞を使って実験している人と
LacZなんかを発現させている人がいます。
どちらが一般的なんでしょうか？初歩的な質問ですみませんが、教えてください。

どちらもです。

>652
LacZはトランスフェクトの効率を標準化するコントロールで、
空ベクターはインサートがなければ反応が起こらないことを
確認するコントロールです。両方いると思います。

>>645
細胞の「へたり」は、細胞の形状に現れることが多いが、見た目全然変わらないのに、
生産性ががくっと落ちてることもある。
実際に発現させて状況を見ることを勧める。

分泌しないと言うことは、モノは作ってるのか？
シグナルペプチドは付いてるか？その配列に。
matureな形では出てこないぞ。

>>652
654の言うとおり、transfection controlとしてLacZベクター、blakとして
からベクターを入れて実験を行い、何回か様子を見て条件を掴んだら、
その後のルーチンワークでは、LacZだけで良いと思う。
ただし、なんかおかしい、と思ったら、スタートにたちかえるべし。

>>649
なぜ600nmなんて中途半端な波長を使うかというと、その辺りが、他のモノによる
邪魔が少ないから。つまり他の吸光が少ないからだ。
いちいち考えてないで、まずは生やして測って見ろ､ｺﾞﾙｱ。

ありがとうございました。空ベクター、LacZとも両方やってみます。

第一の銀染キット、2回に1回くらい失敗するんだけどどうしてでしょう？
やはり染色後の洗い時間が問題なんでしょうか？
一応プロトコルよりも短めでやってるんですけど。。。

>>656
生やして測りました。
ありがとうございました！！

＞＞６５５
　　シグナルペプチドはついてます。
　　他の２種類ではうまく分泌されたのですが、１タイプだけ、よりによって一番重要なものが
　　分泌されないんですよね。
　　ウェスタンで上清とペレットからで確認したら、ペレットの方に大部分が含まれているんです。
　　ベクタ−変える方がはやいかなー

誰か海洋細菌の非選択培地の組成
何種類か知りませんか？（T_T)

652に関連して、私もIRES/NEO vectorを使って、stableに強制発現たいのですが、
この場合、transfection controlとしてLacZベクターは対照として必要ないのでしょうか？
空ベクターのみでいいのでしょうか？やはり両方必要でしょうか？
初心者です。すみませんが、教えてください。

何に海洋細菌使うの？
うちで使っているのは、ZoBell2216E培地かな。
メジャーどころ。

age

基本的ですが、PCRが増えません、、、

>>665
酵素入れ忘れに100カノッサ

>>658＞染色後の洗い時間
これは銀染色の後のことですか？それともＣＢＢ？

一般的に前処理（還元処理）を長めにやると改善します。
あと、振とうの際の温度が低いと染まりにくいので
室温（20℃）で行うと良いよ。冬場は要注意。

>>666
うーん、カノッサの屈辱。
RTがうまくいってなかったみたい。
また、明日やり直すよ。

RNAを抽出してもどうしてもA260/A280が1.5付近です。
なんででしょうか?
このままRT-PCRとかしちゃって大丈夫でしょうか。

>>660
他のタンパクはOKで、その目的タンパクだけが出てこないとなると、実験上の問題ではなく、
そのタンパクの性質のような気がする。はっきりは解らないけど。
だから、ベクター変えただけでは、同じ事になるのでは？
分泌されないと言うのは、細胞内にとどまってるけど可溶性画分にいるのか、
不溶化しちゃってるのかどっちだろう？
可溶化してて、細胞から出てこないんだったら、シグナルだけ他のタンパクと
スワップするとか、とりあえずN末削るなり、Ｃ末縮めるなりして発現させてみるとか。

impact factor がのってるとこ知りませんか？

http://www.nt.sakura.ne.jp/~rose/

>>669
とりあえずやってみて、だめならそこで考えるというのがいいと思います。

>>673
ありがとうございます。実はやってみているんですが
バンドはしっかり出るんですがGAPDHバラバラでいまいち
信用できません。そもそもRT-PCRで定量するのは間違ってるんですか？
それとＲＴ後ってふつうcDNAの再抽出をする
ものなんでしょうか？
そのまま希釈してPCRしちゃってます。

銀染後の洗い時間です。
還元長めで試してみます！

みなさんプライマーの設計ってどうしてますか？
専門のソフト、オンラインサービス、勘に頼る人といろいろありますが・・・
私は今いろんなソフト試していますが結果がまちまちで、
どうしていいものかわかりません。

賢い２ｃｈの人たち！
お薦めのメソッドがあったら紹介してください♪　おねがいします。<(_ _)>

教授との仲がうまくいきません。
どうすればいいですか？

私のブームもRTPCRです。定量って、数値の出るやり方あるの？
毎日PCR三昧。早いところ違うことやりたいな

genomicサザンがうまくいかん・・・・
Tgのチェックしたいんだがシングルコピーが
見えるくらいの精度が必要なため
ばっこんばっこんきっついプローブ使ったが
真っ黒・・・・・・

ドットハイブリやPCRなどいろいろ手はあるんだが・・・・・
助けて〜

なんでこんなところできくの？不思議！

>>678
ポラ写真をスキャナーで取り込んで
NIHimageのマクロを使って定量してます。
stormがあればそれでもいいと思います。

http://www.max.hi-ho.ne.jp/~http/

微生物やっている方、教えて下さい。
液体培地にある桿菌を植えて生やしたんですよ。
2日後、白濁してきたので顕微鏡で観察したんです。
そしたら、みんな長さがまちまちで、中には細長いのも
たくさんいるんですけど。
これってコンタミなんでしょうか？　よくみると、菌が
つながった様にも見えるんですが、つなぎ目とかは無いし。
専門科の方いらっしゃいませんか？

カビ

コロニー作る為に集まってる連中とか？
俺は専門科じゃないから分からないけど
縦につながるものなのか？

>683
培養条件が不適当の可能性あり。
サブクローンして、しっかり培養しなおしてみたら。

>683
Bacillus anthrax

>>683
縦につながったように分裂していく桿菌はいる。
現物の写真などを見ないとなんともいえないが、その際”つなぎ目”のようなものは見えない。
６８６の言うように、シングルコロニー取り直して、再度培養して様子を見たら？

PCR productを制限酵素で消化し、目的のvectorにsubcloningしたいんだけど、
端っこの余分は10 bp位で良いの？その時の余分の配列はどうしてる？

>>689
私はいつも4 baseくらい余分につけてます。
NEBのカタログに、主な制限酵素で、はじっこからどれくらいあれば
切れるか載ってるので、プライマーをつくるとき参考にしてます。

ConAアガロースに翻弄されている・・・
何故か糖たんぱくを吸着してくれる時とくれない時があります。
かなり鬱かも

透析を十分やっているか

>>683
形体変化とかじゃないの？
専門書で桿菌の培養で起こる変化についてよんだことがあるけれど、
結構長くなったりするみたいだよ。
これ、染色して直接計数する時って、一個で数えるんかいな？

やっぱり吸着しないで糖たんぱくがそのまんま流れてる〜〜
なんで〜〜
どなたか使っている方いません？

>690
ありがとう。気付かなかったよ。

GIBCOのGATEWAYでPCR primer に組み替え部位の配列つけて
PCRするやつで上手く行く？入れたいのが4ー5 kb位でORFの
末端の配列の関係であまりprimer が良くないせいか、
はまっちゃったよ。場合によっては、この手の方法は
やめといたほうがいいのかなー。

>>694
bufferの組成は？ConAが逝ってしまう様な条件で流してないか？
Sampleの前処理は？間違っても糖が混在はしてないだろうな。
糖鎖がheteroになってないか？そう言う報告は過去にないか？
流速は？レクチンカラムの類は、かなりゆっくり流さにゃくっつかんぞ。
あと、タンパクが変な風にアグってないか？
とりあえず今思いつくのはそれぐらい。

どなたかGTPaseを購入したことのある人はいませんか？
教授に用意しろといわれたけど、どこも売ってないんです・・・
教授は絶対自分では調べてくれないし、ホトホト困った状態なんです。

>694
糖鎖がハイマンノース型でないと着きにくい。
吸着容量も他のゲルより悪い。
他の方法を考えた方が良い。

　ウェスタンブロットの一次抗体と二次抗体の希釈率の決定法に
混乱してます。新しいメーカーの買ったんですけど。
　一次抗体の希釈系列をとるとき、二次抗体の希釈率はどうする
のですか？
　二次抗体はまずは十分量加えるということで検討するのでしょ
うか？その後に改めて決定された一次抗体の濃度のもとで、改め
て二次抗体の希釈系列をとるという流れで問題無しですか？
　厨房ですいません。教えて下さい。

>>700
なにがしたいんだ、なにが！

説明書どおりにやって問題あるの
だいたい一次×1000二次×2000でしょ

そうなんですか？
初めて使うメーカーのものは一度この様にして希釈率を検討
したほうが無駄が無くなると習いましたので・・・
一次と二次の希釈率の違いはどこから来るのでしょうか？

>>700
そら、一度希釈系列を確認した方がきれいなblotting像は取れるよ。
でも、めんどくさいから、702の言うように、大体１次；500-1000倍、２次；1000-2000倍
でとりあえずやっちゃう。像が出ればそれでOK。出なかったら改めて簡単に検討する。
一次と二次の希釈倍率の差は・・・よく考えてみ。

saponinで細胞に孔あけて，FACSしたことある方いらっしゃいます？
histochemistryで行っている固定，孔開けの条件をそのまま使ってもいいのでしょうか？

age

神経細胞への遺伝子導入ってどうしてますか？
グリアにはよく入るのですが、ニューロンには
入りません。

QIAGENでplamidが増えません。
と、ここまで書くと、っけしろうとが。と声が聞こえてきますが。
いくらがんばっても、このplasmidだけはとれん。
そんなとき、あなたの　フィナルウィポンは？

「くっついていないものでもくっついて見える」免疫沈降の
方法を教えて下さい。

>708
そのプラスミド（確認済み）を大腸菌にトランスフォーム
Single Cloneを拾って1mlのLBに混ぜる。
それをそのままLBプレートにまく(15cm)
次の日プレート上のコロニーを回収。
液体で増えが悪いのでもどうにかなります。
ただし純度が悪いのでキアゲンだけでまずい場合は
超遠心で回収してください。

in situ

710どうも。
ampとかKanの濃度はいじったりします？

>>712
全く一緒でわたしはoKでした。

くそガキ共の情報お待ちしております。
世間を震撼させた事件の犯人を実名で公開しております。
http://topia.yam.com/home/aoiryuyu/pages/index.html

>>679 ハイブリ前に、プローブをssマウスDNA２００マイクログラムと混ぜてノンスペを吸収せよ。

すみません、初心者です。
ある転写因子の発現をウエスタンでみています。
いつもウエスタンをすると本来のバンドのすぐ上に３本うっすらと（でもそれなりにきちんとした）バンドがでていました。
今回細胞にヒートストレスをあたえた後に同じ細胞で同じ抗体をつかってウエスタンをしたところ、
その本来のバンドはほとんどみえず、さきほどのべたその３本のうちの１本だけがはっきりみえていました。
これはリン酸化が考えられますか？
SDSゲルでながしたときに泳動がやや遅れる（分子量が増加？）状態になる場合、
リン酸化のほかにはなにが考えられるのでしょうか？

Qiagen Mega kitでpUC18大量合成２戦２連敗中。。 Ampで死なずに休んでいるだけなのか。。
ところで、みなさんプラスミドは自分で増やすんですか？それとも毎回買うものなんですか？
pUC18 1000ug $150 送料込み。。 買うべしか。。

ふつー自分で増やすよ。つーかQiagen使って失敗ってあんまり
見たこと無いんだけど、何か根本的に操作間違ってない？

培地何mL振ってる？大腸菌ちゃんと増えてる(濁度どのくらい)？
一度プロトコル書いてみ。

718は経験薄。
Qiagenのカラムは、vectorによっては全然とれないことがある。
空でとれても、insertによって全然とれなくなることもある。
そういう時は、塩化セシウム超遠心に切り替えろ。

培養細胞にサイトカインなどを加えるときは一般的に
どのようにしてディシュにくわえるといいんでしょうか？
全体的にうまく行き渡ってないのか反応が安定しないので
困っています。
また培養を始めて最初の２４時間は何もせずにおいて置いた方が
いいんでしょうか？

VoyagerのMALDI-TOFがどうしても上手くいかない。ＡＭＬで練習中ですが
測定ごとに違うスペクトルが出るし…(/_;) サンプル調整が下手なのだと思う
サンプル調製のコツって何かありますか？
どれだけ脱塩しても、マトリックスの結晶がキレイに出来ないし。
早くも自分の限界を感じる…　さすが素人って感じです。

>>716

なんの転写因子ですか？

>>722
たいしてしられていない我がラボでみつけた転写因子です。
ストレス反応と関係があるのでは、と考えられています。

>>717
キアゲン使って１０年になるが、よほど変なconstruction（長すぎる、ligation効率も低い腐れinsertなど）組まない限り、
キアゲンで取る事自体に問題が出ることは滅多にないけど・・・。pUC18でしょ？？？
一度経験したのが、あるロットのカラムが不良品で、全然回収できないと言うことがあった。
これは、うちだけでなく、他の複数のラボで同ロットによる不具合が出たので判明した。
一度、MaxiでもMegaでも何でも良いから、他のロットのカラムでやってみたら？

>>720
濃い物を少量加えるのは避けるべき。一時的に局所濃度が高くなるので。
自分は、大体培地と等量ぐらいになるように調整した溶液を加えるか、いっそのこと全部培地ごと交換してしまう。
細胞をまいて、ディッシュなどに固着するまでは、出来ればそっとして置いた方がいいが、いきなりまくと同時に薬剤加えても、
うまく行く場合もある。
でも、多少無茶しても反応さほどばらばらにはならんと思うが・・・。
細胞の密度や培地の種類、前培養の状態も併せて見直すことを勧める。

>>724さん、ありがとうございます。

　　　　　　　　　720より

今更ながら、ウェスタンで失敗した。
なんか、めんぶれんが全部真っ白に光ってた。
ブロッキング1時間じゃ足りなかったのかなあ。
今までは上手くいっていたのだが・・・

いま、ノザンブロッティングをしています。電気エイドウ後エチブロで染めすぎて
バックがめさくさ高くなってるんですけど、このままトランスファーしてもいいものでしょううか？
だれか教えてください。

>726さん
メンブレン乾かしたんじゃないですか？
ブロッキングはskim milkであれば、1-5％PBSTで30minで十分。
5minブロッキングしたmembrenポンソーでそめてみればわかるよ。
それ以上は、ただの時間稼ぎにしかなってないよ。
1次or 2次抗体の濃度のほうがよっぽど大事だとおもう。

>>721 AMLって何だろ
漏れは逆相→SpinVac乾燥→ﾏﾄﾘｸｰｽ(要時調製)に溶かしてアプライっす

Acute myeloid leukemia (AML)か？
Cysの処理とかしてないと、飛びにくいタンパク質あるからね。
まずはBSAでしょ。

>>727
問題ない。

マラソンRACEではまってます。AP-APでばっか増えてます。ＧＳＰのＴｍは７２度なんだけど。

>727さん
そのノザンの電気泳動って、きっとホルムアミド入ったアガロースゲルだよね。
ホルムアミド入りだと、エチブロで染めたときのバックは、普通のアガロースゲルより高くなるから、それで正しいと思うよ。
そのままトランスファーして問題なし！

733です
間違えた。ホルムアミドでなくてホルマリン

>>729さんと730さん
あ〜、すみません。誰も相手にしてくれないようなので最近見てませんでした。
ＡＭＬはヒトの急性白血病のリンパ球です。ZipTipは使用してますが、いまいちキレイになりません…。
アプライは0.3マイクロmolとかですよね？結局、どれくらいのタンパク量がいいのでしょうか？
今は6〜600f molsくらいでやってます。スポットの広さを考えると、ﾀﾝﾊﾟｸ量よりは、濃度な気がしますが。
マトッリックスはやっぱ毎回調製ですか。貧乏性で使い古しがダメなのかも。全然ダメってことですね…。
マトリックス濃度もどれくらいがいいのかBSAで研究中です。silverStainでしか検出できないくらいの
スポットの変動を解析するには程遠いです。逆相って0.1%TFAとかで本気で洗ってもﾀﾝﾊﾟｸ落ちないですかね…？
バカなんでほんとになにもわかりません。すみません。

何千万もする機械なのに、研究室で誰も使えないからって使わないのはもったいなすぎる…。
だから俺にまかされて、ﾀﾝﾊﾟｸなんてサッパリわからんのに…。

なんか、居れのやりかたと根本的にちがうきがして、的外れかもしれないけど。
BSA200ng-1ugSDS-PAGEで流して切り出して、Trypsinで切って蟻酸/TFAで抽出して、
濃縮して適当量すぽっとしてシグナルはでるンかい？
Maldiは量があればある程良くて、silverレベルでできれば越したことはないが、
silverとはいえ、CBBと100倍感度が違う手法と10倍も変わらない手法があるから、
一概にヒトの言うことを信用してはいけない。BSA10ngでもちゃんときれいに決まる。とかいうんだったら信用するけど。
こんなことでなんか足しになる？

プロテオミクスか？大変やね(漏れはリコンビナントだけ)
ﾏﾄﾘｸｰｽは使いまわすと確実に飛びが悪くなります。
脱塩カラムより逆相の評判がよいです。
逆相はコンスタントに0.1%TFAで、CH3CN濃度を上げてって溶出させてます｡

なるほど。量が多すぎてもダメって業者に聞いてたんで濃度調製に苦戦してました。
silverレベルでも出るってのも曲者ですか。CBBの100倍だからよっぽど微量でもいいとか信じてました。
業者の話の表面しか聞いてなかったのかもしれませんね。"業者の言うSilverStain"も聞かねば。
BSA泳動してどれくらいのスポットまでスペクトルが出るか自分で確かめます。
業者って本当に、本当のことを言ってるのか気になります。ちょっと問い詰めときます…。
φ(｡｡)mﾒﾓﾒﾓ　CH3CN濃度を上げてって溶出　と…

ZipTip使ってます。特に困ったことはないです。
in-gel digestionの後に濃縮をかけていると思いますが、このとき完全に乾かしてしまうとアウトです。極端にペプチドの回収量が落ちます。
とりあえず、BSAとかで一連の作業をやって練習した方がよいのでは。
マトリックスの濃度はいじったことがないのでよくわからんけど、重要なのかなあ。

MALDIは量さえあれば簡単なんですけどねえ。
それから、タンパクによってはCBBと銀染で染まり具合の違うことがよくあります。
CBBではよく染まるけど、銀染では極端に染まりが悪いものとか。
なので銀染はCBBよりも定量的ではないと思ってます（個人的に。みなさんはどうですか？）。
だから銀染レベルでOKのタンパクもあればダメなヤツもあるんじゃないですか。

>716
アセチル化、ユビキチン化が最近の流行かな？
SUMO化もあるけど、Ub化とともにかなり泳動度が変わるのでリン酸か
と思うぐらいであればちがうでしょう。
数KDa変化しているならば、可能性はあるね。
でもそれ、本当にno speではないのね？
heat stressでは、細胞内のタンパク質の量比は大きく変わるから、
ノンすぺも変化するように見えることもあるかもよ。
tiem courseを追って変化すればおもしろいね。
HSP70とかHSFと比較してさ。

>732
ＧＳＰ何種類か合成する事をおすすめします。
APのみで増えてくるのは、AP1 or AP2?
いずれにせよ、cycleまわしすぎでは？70-72の亜にーリングで、
40cycleでは、APのみでそれほどバンドはでてこないでしょ

いまサザンしてるのですが断片が非常に接近しているために区別がつきません
大体200ｂｐと170ｂｐそれに162ｂｐです。アガロースでは限界なのでしょうか？
アクリルゲルで泳動してそれをウエスタンみたく電気的にメンブレンにブロッティング
はできないのでしょうか？
もし出来るとすれば詳しい方法教えてください。

マトリクスの濃度いじって調節するくらいなら、ﾀﾝﾊﾟｸの回収率あげて
タンパク濃度を上げた方がいいってかんじですかね…。
まぁ確かにそっちの方が合理的ですね。とりあえず、SDSでBSAの色んな濃度で泳動して練習します。

大腸菌でIPTG誘導をかけ低温でタンパク質を発現させたいのですが、
hostによってある温度による菌の増えに差はあるのでしょうか？
用いているのはJM109・XL1-Blueなどです。
低温でも増えやすいものがいたら教えて下さい。

＞745
低温でタンパクを作らすのはインクルージョンに
なりやすいから、”ゆっくり低温で合成”させたいのだろう？
菌が低温で増えやすい必要があるのか？
なんのためにODはかって員駄句ションかけるのだ？

ちなみに、タンパクをつくらすのに、遺伝子操作に使うのは菌株は
一般に向いていない。
できれば、BL21、Top10などを使うのがいいのじゃないか？

えらいあほなことをきいているのかもしれませんが、
今BACから約23kbのインサートをPBSに移そうとしているのですが、なかなか入りません。
やっぱりこれぐらい長いのは効率が悪いですか？
どなたか、”俺はこんな長いのをいれたことがある！”というかたおられましたら
その方法を教えて頂けませんでしょうか？

私は最高で27 cmを入れたことがあります。少し痛かったけど。

凄い！まさに馬並みだ！

私は今、測量器の正確さについて、実験しているのですが。
メスシリンダーとホールピペットの精度についての実験なんです。
標準誤差の計算の意味がわかりません。
どなたか教えててください。

>>747
PBSは何に入れていますか？口の広い容器が入れやすいですよ。
煮沸して急冷すると一本鎖になりますよ。

研究室の試薬を切らしても、注文しない奴が多くて困ります。
実験器具も使い放しで、洗ってないし。
いま実験でうまくいかないことって言えば、こんなとこですね。

＞751に一人で受けました。

pBSは2.7Kbpでinsertは23kbp。こりゃはいらんだろ。もちろん理論的にははいるかもしれんけど。
ベクターとインサートの比をいろいろかえてみるか。少しでも大きいベクターに変更するか。
2-3段階で入れるべきでしょうな。

どうも。
四年なんですけど、プロテオーム解析のシステムのたちあげやらされてます。
二次元泳動を説明書見ながら、できるようになるまで、四月からいままで
かかりました。
ひとばしらです。

pBSに入らないこともないよ。ただ、ヒートショック法だと極めて難しいでしょう。
せめてエレクトロポレーションでないと。
そして入ってもサイズがばらばらになる可能性もあります。

＞754
生化学とはそんなものだ。あと２，３年，毎日やれば一人前だ。
電気泳動のノウハウは体で身につけるべし。

>>754
オレは大昔、ラボに遺伝子操作技術を導入するためにMの２年間人柱になったことがある。
結局ごまかしのような論文で切り抜ける羽目になった。
四年なら、まあ１年ぐらいは我慢してやって見ろ。

このスレは気分がなごむなぁ。。。
>>752
大所帯にありがちな事だ。いちいち怒ってもそういう奴は態度を改めないだろうから、
試薬は自分の分を確保しておくとか、どうよ？
>>754
ＤＮＡはマニュアル見れば簡単にできることが多いが、蛋白関連はそうではない。
今のうちに身につけておけば今後困ることは無いだろうから、頑張れ。

つーか、お前らみんなバカだな。
教官がやったこともない実験を4年やマスターにやらせるなんて
狂っている。時間の無駄でしかない。
研究室で誰もやったことがない実験をやるんなら、
まず教官が他の研究室に習いに行って、習得してから、
それを学生に教えるのが常識。
そんな非常識なことをさせる研究室なんて今すぐ辞めるべき。

>>759
逆でしょう。蛋白もできない教官は、即リストラ対象。
そういう意味でも、4年だろうがＭだろうが習得すれば強みになるだろ。

教官がすべての実験教えるの無理でしょう。
もちは餅屋で，他のラボやどこかできる人，その道のプロに習いにいけばいいんです。鍛えられた教官はそうさせてくれるでしょう。

学生は時間の無駄をやればいい。なんでもやってみればいい。
プロになるためには学生のレベルにとどまる必要ないんです。

4年生にもいろいろレベルがあるからね。
具体的にはまっていることかきだしてみ。
それで、教官があかんのか、あんたがあかんのか分かるし。
この板もすこしはすくわれるし。

4年生なら別に構わないよね。大学院に進むのなら特に調べて自分で身に付ける
ことも勉強のうちになる。先生も（人によるが）そういうつもりで指導してい
る人もいるよ。そして生徒の性格をみて方針を決めたりする先生もいる。
でもＭで最後までそういう状態は最悪だね

とりあえず、泳動は再現よくいくようになったとおもいます。
あとはサンプルつくるところでどうするかですね。マウスの内臓をサンプルに
してるんで、どういう状況でマウスをころしちゃうかによってびみょうに
スポットがかわってこないか心配です。サンプルは具体的にいうと肝臓、胃が
主です。全タンパクの解析なんで、分画してなるべくスポットすくなくするように
してます。

>763
Mの二年間もひきつづき二次元やらせたいみたいで・・・。あと、RNAのほうのたちあげも
やらせたいらしいです。おいおい・・・。

>>764
悪いことはいわんから、教授に泣きついてでも、外のラボに出て実験技術を修行してこい。
新しい実験の立ち上げは、実際やってるところで習えば３ヶ月で身に付くことでも、
自分一人で試行錯誤しながらやってると、半年経っても終わらないことがある。
０から始めるのは良い経験にはなるが、時間の短縮も考えておくように。

＞＞728
完全には乾かしていないんですけど、次のステップに移る
ごとに余分なバッファーをろ紙で吸い取りながらはやりま
した。これは関係するのかなあ。

　気になることといえば、二次抗体の賞味期限が2ヶ月程
切れていたことです。この結果ノンスぺが妙に起こるなん
てことはないですか？

濾紙ですいとるとな？抗体反応は基本的には10％-20％希釈されても、
結果に差し仕えないはず。
つまり、いくら持ち込みのバッファーがあったとて抗体溶液の倍量になることはなかろうて。
dishじょうでも、はいぶりバッグないでも、とにかくメンブレンは塗れた状態でいるのが一番大事。
乾いたらとれなくなるタンパク質があるからね。へたしたら一時抗体メンブレン上に塗りたくっているのと同じなわけだ。
二次抗体の期限が切れていれば、HRP?がしっかつして、いままでよりも多く抗体をいれないと発色が見られないと言う可能性はないとはいえないけど、
一番最初にブロッキングしているのだから、
期限が切れているからと言って真っ白（真っ黒）になることはないでしょ。
よく状況を知らないから、おせっかいかもしれないけど、
blokingおよび抗体反応時には、skim milk を1-5％いれる。（BSAはあまりきかない。）
ことをお勧めする。

>>767
あああん、オレはBSA派だよお。（涙
skim milkだと、blockが強力すぎて、検出されるバンドが薄くなることもあるんだよお。
昔はBlock Ace使ってたけど、予算が少なくなって使えないんだよお。（涙涙

>>へたしたら一時抗体メンブレン上に塗りたくっているのと同じなわけだ

失礼。あまりイメージが湧かないのだが？

>>765
それが、、、四年にそとださせるわけにはいかないとかいわれました。笑

>>770
４年生の間は、実験、研究になれること、考え方を学ぶことが第一で、
そんなに大きな成果は教授も期待してないと思う。
だから、とりあえず指導教官の言うように動きつつ、周りの研究室の仲間から
色々情報を貰って、今後の計画を建てればいいと思う。
外に出たり、と言うのはＭに行ってからでいいでしょう。
最初からあんまりいろんな違う話聞くと混乱するだろうし。

新しい実験の立ち上げって大変ですよね
うちの先生は友達少ないのとプライドありすぎてて
人に頼むのが嫌いなのとで
習いに行くことができなかったために
大変な思いをしてます

>>769 一時抗体をつけた後、良くあらい切れていないのに乾かすと一次抗体がメンブレン上から
はがれなくなりますよね。（抗体にもよるけど）
メンブレン全体に一次抗体がついた状態になります。真っ黒にはならんとしても、
ざらざらとしたバックグラウンドになります。
＞768　もちろん。精製抗体ではPBSTのみで反応することよくあります。
ただ、バックが高いというトラブルなので。
まずは特異的なバンドを出す方がせんけつかと。

ペプチド抗体のときとかBSAとリンクさせるばあいがあるもあるし、
こんな時は、もちろんBSAが有効にきまってるし、ホント抗体による。
ミルクは入れないで越したことはない。
言ってることがかわってたらすまん。後ろは振り返らないたちじゃ

いくらかコントロールをとりました。
抗原無し、一次抗体無しでも真っ白。
ブロッキング時間増やしても真っ白。
洗浄回数および時間増やしても真っ白。
二次抗体無しなら光らずです。
二次抗体が悪いのでしょうか。ブロッキングしてもくっついちゃう
のかなあ。おれのも賞味期限切れだったし。
もしくはブロッキング溶液にコンタミしたバクテリアがアルフォス
作ったとか？でも洗浄してるしなあ。
わかりません！！

二次抗体の反応条件は？
室温一時間、1％milk PBST ?
経験上、goat系はbackが高いきがするけど。

DIBCOの培地のDMEM（フェノールレッドなし）のパウダーの製品が販売中止に。液体で売っているのは、
組成が違う。組成が違ってもいいのでしょうか？
あれしかない製品が何で販売中止になるねん！！！！

GIBCOの間違えです。

反応条件は、室温一時間、TBSTです。
ヤギさんの抗体ですが、新品の時は
うまくいったんですよ。
古いのが原因なら買い替えってことで
解決するのですが。

効果がないかもしれないけど、二次抗体希釈溶液を遠心してから使う。
主に、てんてんが出る場合にやる方法だけど。
しかし。やぎさんにはSkim milkをいれるべきでしょう。
真っ黒になるのはきしゃくするよりも、反応液にmilkが定番だとおもいますが。

>>776
カタログを確認していないのでどれぐらい組成が違うのか解らないが、
基本的に、DMEMと名前が付いているぐらいに組成に共通性があるなら、
さほど問題はないと思われる。
ただし、やはり違う培地に変える訳なので、一応馴化措置は行うこと。

ヤギさんで困ったことになってる人って
結構いるような気がするのは私だけ？

age

E.coli BL21(DE3)つかってpETでタンパク作ろうとしてるんですがIPTG入れる前からタンパクが、かなり出来ちゃっているようです。こんなことあるんでしょうか？

>783
ATPase活性があるのか？

>783
よくあるとある学会で聞きました。
誘導かけるよりもそのまま培養し続けた方が
収量が上がっていいこともあるそうです。

glucoseを入れればリークは無くなるが、
誘導かけるときに除く必要あり。

>>783
発現のシステム上、どうしてもリークはおきてくる。
で、それを減らす為に、T7lac promoterを載せたベクターもある。
それでも、わずかには漏れるみたいだけどね。

site direct mutagenesisがぜんぜんうまくいきません。
X-galのserectionでもwhite colonyが少ないし、
sequencingをしても目的のＤＮＡがとれません。
何度もやりなおしているんですが、何が原因かいまいちわかりません。
せめてwhite colonyが多くとれる方法をどなたか助言していただけませんか？

>>788
それって、ベクターとインサートのligationがうまく行ってないだけなのでは・・・
インサートをしこたま（ベクターの１００倍量ぐらい）使う、ligaseを変える
サイトを変える、そもそもベクターとインサートがちゃんとしてるか疑ってみるなど。

>>788

STRATAGENEのキット使っているけど失敗したことないぞ。
primer量固定で、vector量をふる。
濃度で率が随分変わるよ。
あとちいさいvectorでやるほうがよく生える。
キットにポジコンついてなかった？

phosphataseかけたら、ウエスタンのバンドがどっか逝っちゃった。
かなり鬱。
protease inhibitorも入れてるのに・・・ｩｩｩ

791＞
リン酸か型特異抗体じゃないだろうな。

>>1
健康管理と自己管理がうまくいきません。

DIGシステム（RNAプローブ）でノーザンブロットをやっています。
どうしてもバックが露光時間数分で真っ黒になってしまいます。
しかし、RNAを直接メンブレンにドットした場合は奇麗に検出されます。
つまり、アガロースゲルから転写すると、その部分全体が真っ黒になるというわけです。
だれか、バックが黒くならないようにアドバイスをください。

確実にコロニーPCRがうまくいく方法を知りたいのですが。
コロニーPCRで電子レンジを使うとうまくいくと聞いたことがあるのですが、
だれかご存知ないでしょうか？

コロニーPCRがうまくいかない場合、とりあえず、
菌体の持ち込み量を減らす。
大抵これでうまくいく。

>>789-790
助言ありがとうございました。
またいろいろ試してみて報告したいと思います。

還元型コバルトミオグロビンの生成。
２週間同じことの繰り返し・・・。

>>795
796が言ってる通りだと思います。
コロニーに触ったか触らないか、
というか、コロニーが有るか無いか、
の限界に挑戦してみて下さい。

誰かTAKARAのMutan- super express -Kmを使ったことがある人いますか？
PCR productを流しも目的のバンドが見えないいいいい

２％以上のアガロースゲルからコームを抜くのがうまく行かない・・

菌体量なんか関係ない。
AmpliTaqを使ってみろ。
100%うまくいくから。

>>794
Pを使った方がいいのでは？
DIGをつかうメリットはなんですか？

>801
水、bufferの中でぬきなさい。ってこれは実験か？

DNAシーケンスがうまくいかない.

７月くらいからずっとはまってる。
ゲル板はちゃんとできてるし、プラスミドも1ug/laneはあるのに。
サイクルシーケンスが一番怪しいけど、コツが解らないです。

４ヶ月もはまってるなんてバカすぎ。
今すぐ外注しろ。

>>805
・Templateの量を500ng以下に減らす
・反応系に1〜5％ぐらいDMSOを入れる
・逆向きのprimerで読んでみる
それだけやってダメなら、806の言うとおり、とっとと外注しろ。

>>803
RIが使えないので、仕方なくノンRIでやっています。

これ794の続きです。誰かアドバイスをください。

>>806
>>807
5回に１回くらいの割合で出来ないんです。
見事に全バンドが見えなかったりします。微妙に成功する上、
大量に読まなくちゃいけないんで、外注許可が出ないんですよ。

Templateは大丈夫ですか？
PEG沈をきっちりやる。RNAがコンタミすると読めないことが多い。
タンパクのコンタミはそんなに気にしなくていい。
あとはプライマーの変更ぐらいか。

>794
メンブレン変えてみれば？　S&Sのナイトランお勧めだよん　アマシャムはお勧めしない　あとSSCやめてSSCP使った方がいい

elutionがうまくいきません。

失敬。elutionがうまくいきません。
３７℃でＯ／Ｎ、その後フェノクロで沈殿させて
アガロースゲルでながしても回収できません。
コツを教えてください。

〉812
助言ありがとうございました。
ブロッティングも洗浄もすべてSSCをやめてSSCPでやってみます。
ところでどうしてSSCPの方がいいのですか？

あれ？SSCPって何ですか？SSPEとは違うのですか？

>>794
泳動後バッファ中でホルムアルデヒド抜いてやったらどうでしょ。

>811
プラスミド取りしなおして、急光度計で測定した結果、
やはりTemplateの純度が問題のようであることが分かりました。(純度90%ほど)
KitにRNAseが含まれているので、RNAのコンタミはないとは思うのですが…。
週末にシーケンスしなおすので今結果待ちです。
色々助言ありがとうございました。

>>818
その純度90％ってどうやって導き出したの？
不純物の10％は何？

cycle sequenceで1ugはいれすぎだろ。kitによるかもしれんが、primerのpeakばかりになってるんじゃないか？
もしかしてprimer peakがないとかいうんじゃないだろうな。EtOHでなくしんてんだったら1/5の確立っちゅうのもわからんでないか。

>817
どのようなバッファ中で、どのようにしてホルムアルデヒドを抜いたら良いのでしょうか？

手動エドマン法でタンパクのＮ末を読もうとしてます。
ＨＰＬＣでピークが何個も出るのは
サンプルの精製が不充分なのでしょうか？
それとも技術に問題があるのでしょうか？
だとしたらどこに注意すればいいですか？
Ｎ末が修飾されてることはないと思います。

>822
江戸マン分解とはそんな物です。次のサイクルと比べどのピークが
特異的に増加したかを目で見ながらアミノ酸を決めていく。というのが正直なところ。
10サイクル20サイクルとサイクル数が多くなれば熟練の心眼が必要となってきます。
もちろんサンプルが汚ければピークはひどい物ですし、分解産物も問題があります。
ＰＶＤＦにブロットし特異的なバンドのみを切り出せばその問題は
解消されるはず。

>818
今日、construct２個（合計6 kb）を読んだぞ。
もちろん外柱。
オレがやったのは、plasmidとprimerを混ぜるだけ。
せいぜい３０分ってところだ。

>823
助言ありがとうございます。
元来そういうものなんですね。
僕のような駆け出しの未熟者がきれいにピークを出そうとしたのが、
そもそも間違ってるわけか。
もう一度サンプルのチェックから始めて
眼力を磨いてがんばります。

>816
SSPEが正しい
メンブレンとハイブリ液の界面のことはよくわからん
pHや塩濃度などが少し違うだけで結果はかなり違う
ブロットの後でメンブレンは絶対に乾かさないこと
プレハイをO/Nでやるのもいいかも

質問する人はせめて、使っている機器、キット、簡潔なプロトコルぐらいは書きましょう。
そのラボでは普通の事が、外からみたら少数派だったこともありますし。

>>818
「シークエンス」とかいわれても、どのキットを使っているか、
テンプレートはどう精製したのか、反応の条件、
反応後にどのような条件で精製しているのか、そもそも、
シークエンサーは何なのか、それくらいは書きましょう。
簡潔に書き出してみたらどうでしょう。

追い込まれて焦っているのは判りますが、
できるだけ詳しく書いた方が、解決に繋がります。

純度90%って何でしょうか？RNAより、ゲノムの混入を疑いますが。
電気泳動ぐらいしてみましょうね。

それと、手間ですが、しばらくキット付属のポジコンも一緒に反応させて見たらどうでしょう。

今　PCRがうまくいかない、非常に困っています。
僕はアミノ酸塩基配列から、degenerated primerを設計したが、
PCRをかけると非常に多くバンドを出てきて、どれが目的バンドかは判明できない。
それを切り出して、サザンハイブリダイゼーションをやったら、
やはり、うまくいかなかった。どうすれば、いいでしょうか。　primerは原因だと思いますが、

>828
degenerated primerにはイノシン（I）を使うとうまくいく。
１回目のPCRで沢山のバンドが出るなら、続いてNested PCR をやる。

>いま、はまっていること

2ちゃんねる

あたしも！

＞828
829に激しく同意
ついでに、すべ手のバンドを切り出して、
4cuttterの酵素できる部死。＆TAしてシークエンス
力技をみせつけろ！！
バンドの合計と元のバンドの長さが会わなかったら、ヘテロなバンド
だから沢山調べる部死

degenerate-PCR、私はバンドが出なくて苦しんでいます。
annealの温度調節、反応液の組成の調節、PCR産物をTemplateにして
再度PCRを行う以外にどんな工夫がありますか？

あと、縮重度って、どれぐらいに抑えるべきでしょうか。
1000以下に抑えろと書いてあるプロトコルもあれば、
64以下に抑えろと、私の標的では無理っぽいこと書いてあるプロトコルもあります。
イノシン使いまくればいいのでしょうか？

＞828
degenerate-PCRはバンドが出ればその後は比較的スムーズに行くと
聞いたことがあります。がんばってください。
ただ、読んだ塩基配列、sense鎖がsense、antisense両方に働いていたりはしないですよね？

>827
>「シークエンス」とかいわれても、どのキットを使っているか、
>テンプレートはどう精製したのか、反応の条件、
>反応後にどのような条件で精製しているのか、そもそも、
>シークエンサーは何なのか、それくらいは書きましょう。

確かにおっしゃるとおりです。配慮足らずすみませんでした。

TemplateはpGEM-TVecterにつないだものをDH10Bに感染させ、
PharmaciaBiotechのFlexiPrepKitで精製したものを使っていました。
Primerはアロカ製M13蛍光primerを使い、
#1 98C,210sec
#2 (95C,15sec-50C,20sec-72,90sec)*21cycle
#3 (95C,15sec-72C90sec)*13cycle
#4 4C,infinite
でCycleSequenceを行いました。
シーケンサーはで41cmのゲル板を使っています。

また、DNAの純度はの吸光度計による自動解析(うろ覚えですが240nm,260nm,280nm,320nmを測定。)で
でdsDNAの純度をコンピューターで自動計算して出したものです。
不勉強なため詳しい計算方法は詳しくわかりませんが、
DNAの吸収波長から、単純にタンパク等の吸収分を差し引いて純度を出しているらしいです。


>818（シーケンス結果報告）
いただいた情報を元にさらに精製過程を増やして行ったところきれいなバンドが得られました。
具体的には、上記の方法で精製したTemplateをさらにフェノクロ処理、IPA沈、EtOH沈*2行ってから用いました。
フェノクロ処理のとき水層に白濁がかなりみられたので、やはりTemplateにタンパク等の不純物が多く混じっていたのではないかと考えています。
研究室内ではフェノクロ処理、IPA沈、EtOH沈等やらなくてもバンドがはっきりと見えている人もいるので
原因が不明でしたが、腕が未熟だったということで今は納得しています。

レスをくれた方々、ありがとうございました。

今，ノザンハイブリダイゼーションをしています。,
mRNA３マイクログラムをHybond-Nに転写してリボソームRNAがメンブレンに転写されていることは確認しました。
そして，50%ホルムアミド,SSPE存在下で４２度ハイブリを２０時間しました。
つぎに，washを2*SSC，0.1%SDS５０度３０分を３回。
0.1*SSC,0.1%SDS６５度１５分washしました。
イメージグプレートに２４時間露光しました。
ところが，バンドがなかったです。
RNAマーカーとリボソームRNAのバンドが電気えいどうの結果と同じようにでていました。
これはバックグラウンドとおもいます。
プローブの長さは1.6kbあり，RT-PCRでは３０サイクルでバンドが見えたので，
ノザンでもでて来ると思ったのですが，うまくいきません。
なにか，いい解決方法があれば教えて貰えないでしょうか。

プローブ長すぎ。
それから、プローブちゃんと精製してる？

コピーガードキャンセラー、あります↓
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DVD やスカパー、レンタルビデオ、セルビデオのコピーガード
を無視して、ダビングが出来る様になります。

購入を希望する方は、入札をするか、
直接、メールを下さい。

宜しくお願い致します。

初めて書き込みます。
vectorをカットして泳動・バンド切り出しをする作業で
いまいち収量がよくありません。
なにか良い方法を教えてください。
ちなみに方法は透析バックです。

＞＞838 名前：新人
スピン絡むを買うのが一番手っ取り早いが、予算がそれをゆるさないのですか？
ガラスビーズを自分で自作すると言う手もあるが、透析は回収率がわるいものでしょう。

838さんへ
タカラのエコチップがいいよ。
らくちん。

835
プローブにラベルが入っていないのでは？

Quiagen のQuiaquick gel extraction kit もいいよ。

>835
PCRで増えるからって、ノザンで見えるとは限らないと思うん
だけど・・・。

MupidでRNAを電気泳動したとき、泳動パターンがはっきりしないことがあり困ってます。

一見、degradationしてそうに見えるけど、とどまるはずのrRNAの分離が非常に悪く
てだらだら流れて、ゲルの中ほどでスメアになっている感じ。
同じサンプルで他の時に泳動した写真ではくっきりとrRNA等のバンドが確認できている
から泳動に失敗しているだけで、RNA自身は問題がないはずなのだけど・・・

上手くいかないときには、普段青色のローディングバッファー（BPB入りグリセロール）
が黄色に変色していることがあるあります。
RNAの変性はGlyoxalとDMSOを入れて50℃一時間で行い、10mM リン酸バッファーで
1.2% アガロースゲルを用いて泳動。その後、ゲルを50mM NaOH溶液 20分間、
0.3M 酢酸カリウム溶液 10分間浸して染色、写真撮影。

dyeが黄色に変色するのはバッファーのpHが変動してしまっているからでしょうか。
しかし、なぜpHが変動してしまうのでしょうか。
（そしてpHの変動とRNAの流れ方との相関は？）
Mupid以外では失敗しません（ノーザン用の大泳動槽）

同じ研究室で私ともう一人だけが同じ症状を起こすことがあり、他の人はそういう
経験はほとんどないようです。
たかが電気泳動、されど電気泳動。なぜ失敗するのかは彼らは分からない。
どうすればきれいにRNAを泳動できるのでしょうか（泣）

指導している学生がとんまです。何とかならないですか？

あのね、ミューピッ度はバッファー量が少なすぎるのさ。の残ゲルのバッファーはそんなに緩衝能ないんだよ。それだけ。

>846
すみませんがもう少し詳しい説明をお願いします。
10mM リン酸バッファーはそもそもあまりバッファーとしての緩衝能力を期待できないという
ことですか。
で、mupidはバッファーの量が少なすぎるということはリン酸バッファーをmupidの容器の
縁ぎりぎりまで入れればRNAの泳動状態は改善されるということでしょうか。

（大泳動槽でRNAを泳動するときは問題ない。これは電圧を低くしてゆっくり時間をかけて
流すからかと思っていたが、バッファーの量も関係があったのか…なるほど）

＞845
どうとんまですか。要詳細

横から失礼しますが、私は
RNAの電気泳動のときにサンプルバッファーが
濃い青色だったらOK
薄い緑色になったら失敗する事が有るという話を
聞いたことがあります。
ちょっと関係あると思うんですが、何が原因なんでしょうか？

RNA実験出来ないアホどもMOPSのpHちゃんと測ってんのかこら！！

>850
サンプルバッファーと混ぜた時点での話をしているので
MOPSとは関係なし。
サンプルバッファーはいつも同じモノを使っていると
してだよ。

アホに説明できるならしてあげてよ。
アホだからわかりやすくね。

==2==C==H======================================================

　　　　　　　　　２ちゃんねるのお勧めな話題と
　　　　　ネットでの面白い出来事を配送したいと思ってます。。。

===============================読者数：81300人　発行日：2001/11/22

どもども、ひろゆきですー。
日本生命の削除依頼公開スレッドを用意しましたのでお知らせしますー。

http://news.2ch.net/test/read.cgi/newsplus/1004597354/

「仮処分の決定と削除依頼とは違うじゃーん」とか「ひろゆきって粘着？」なんて声もありますが、
大きなお世話ですー。。。(￣ー￣)ニヤリ

おいらのことを訴えようなんて考えてる方々は、よーく考えた方がいいですよー。
２CHは削除しようとあがけばあがくほど被害が拡大する仕組みになっているんですー。
(￣ー￣)ニヤリ

おいらは２CHやってても全然儲からないけど、削除してもらう為においらにひれ伏す連中を
見ると、なんだか凄い権力者になったような気がして気持ちいいんですー。
今までの悲惨な人生（ドテチン時代）を忘れさせてくれるくらい気持ちいいんですー。
でも、裁判所なんかにいく奴はちょっと気に入らないな、、、
そういう奴は哀れな日本生命のように懲らしめてやりますんで、皆さんも気をつけた方が
いいですよー。。。(￣ー￣)ニヤリ

んじゃ！

ミューピッドやめれば？

俺はミューピッドで全く問題なく発現レベル低い遺伝子検出してるけどなあ
サンプルダイが嫌なら入れなきゃ言いじゃん（泳動度知りたければわきに流すとか）

そういえば昔いた学生でプラスミド流してもきれいなバンドだせん奴がいたなあ
結果が不安定なのは間違いなく手技の問題だよ

RNAって1時間も変性させるんだっけ？
65度10分→氷中で急冷、でいいんじゃなかった？
急冷している？
>>850
グリオキサール法でMOPS使うんか？
それはそうと、ミューピッドならホルムアルデヒド変性ゲルの方がいいんじゃない？

>853
サンプルダイが悪いというわけではなくて、ダイの変色はあくまで何かの（バッファー
のpHが変動したとかの）指標として現れてきているのだと思います。

手技の問題…やはりそうですか…しかし、どこがどう悪いのか全然分からん。。。
次回RNAの泳動をするときはミューピッドの容器になみなみとバッファーを入れてやって
みます。

そういえば、ミューピッドでRNAを泳動し終えたときってバッファーは熱くなっている
ものですか？
氷を入れた発泡スチロールの箱の中にミューピッドを入れて泳動し、途中でバッファーを
新しいものと交換してさらに泳動を続ける、というのを試してみたときは、くっきりと
バンドが見えていました。でも、普通ここまでやらなくてもきれいに見えるものですよね。

単純に変性や泳動のときにRNAがdegradationしてしまっているのかなあ。

RNAって1時間も変性させるんだっけ？
>65度10分→氷中で急冷、でいいんじゃなかった？
>急冷している？
はい、65℃１時間の後に急冷してます。
そういえば確かにcDNAプローブを合成するときは単純に65℃10分→急冷
で行っています。研究室の標準プロトコールのグリオキサールによる
変性の場合は65℃１時間なのです。もっと短い方がRNAの分解の心配をしなくて
いいかもしれませんね。

>グリオキサール法でMOPS使うんか？
入れていません。Glyoxal, DMSO,リン酸buffer, DEPC waterとRNAだけです。

>ミューピッドならホルムアルデヒド変性ゲルの方がいいんじゃない？
先生の方針で、ホルムアルデヒド変性ゲルは扱いが難しいというか健康に
悪いから、普通のリン酸バッファーで作ったただのゲルで泳動してから
EtBr染色・写真撮影すべしと決まっているのです…
大抵のプロトコールではホルムアルデヒド変性ゲルを使っていますね.

ミニげるなら50Vで3時間くらいだよねえ？
緩衝能が落ちているのなら、（泳動速度がだんだん遅くなる）
マイナス側とプラス側のバランスが崩れているので、注射筒かなんかで
両側のバッファーをまぜて均一にするといい、と聞いたことが有る。
なみなみではなくても、少し多めにいれたほうがいいかも。
>先生の方針で、ホルムアルデヒド変性ゲルは扱いが難しいというか健康に悪いから、
そういや閉め切った室内でやっていて、入ってきたやつに
「おまえ死ぬぞ」て言われたことが有る。
目が痛くなるくらいだったようだけど、麻痺しちゃってたのね。

こんにちは。質問があるのですが、よろしくおねがいします。

clontech retroviral cDNA library (human leukocyte)を使って
発現クローニングをしています。
具体的には、ライブラリーをコードするウイルスをEcoPack2-293に
作らせて、NIH3T3に感染させています。
この方法で、ゲノムにライブラリーcDNAがインテグレートされます。

スクリーニングの後、陽性細胞からゲノムPCRで
インサートを解析します。

このため予備実験としてEGFPを同様の方法でインテグレートさせた
NIH3T3でゲノムPCRを行いました。
プライマーは付属のpLIB5'およびpLIB3'です。
しかし200bp程度の断片が増幅され、
目的の800bpあたりのバンドは増幅されませんでした。
今いろいろ条件検討しているところですが、
まだうまくいっていません。

clontech様のtechnical supportからは、PCRの詳細な条件は提供されていないとのことです。
困っております。

このキットを使って同様の手法を用いている方、
いらっしゃいましたら
PCRの条件をお教えいただけると幸いです。

失礼いたしました。お返事お待ちしています。

ドットブロッティングしてCDP-Starで発光させると、随分発光
にムラがあるのですが。お月様のように。
メンブレンの上の抗原は、均一にのっているはずなんですけど。
こんな経験ありませんか？

こんにちは。

858、に書き込んだ点についてですが。
九州のいずこかのラボの方がうまくいっているらしいとのお話を
学術の方から伺いました。
しかし、これ以上は守秘義務があるため教えていただけませんでした。

九州のいずこかの方、ぜひ詳しいお話を伺いたいのですが。。。

九州で現在研究なさっている方々、
自分のラボで、となりのラボで、
clontech retroviral expression libraryを使っている方、いらっしゃいませんか？
NIH3T3に導入したEGFPをpLIB primerで増幅した方は？

失礼いたしました、お返事お待ちしています。
それでは。

EGFP で細胞が光って見えたらそれでいいんじゃないの？

こんばんは、質問があります。経験者のアドバイスがほしいです。
サザンハイブリダイゼーションはうまく行かない。
最初はプローブが精製されていないと思ったんですが、
キットを買って来て、やりましたが、また、だめでした。
今度、ゲノムDNAを制限酵素でうまく切断していないではないかで、
思うようになったが、こっちのやり方としては、精製したゲノムDNAを
EcoR�T、pst�T、BamH�Tでそれぞれ、処理し、電気泳動したところ、ちゃんと
切断したように見えますが、これでサザンすると、シグナルが出でこない。
2種類制限酵素でゲノムを処理したことがないが、やるべきですか。
また、サザンハイブリダイゼーションするとき、注意する点があれば、教えて下さい。
お願いします。

化学発光量を定量したいんですよ。

>>860
業者に聞きなって。

>８６２　プローブの標識度は計りましたか？切断したゲノムDNA は、EtBr染色で反復配列のバンドが見えてますか？ブロット後のゲルを再染色して、DNA がメンブレンに転写されたか確認しましたか？
ゲルからメンブレンをはがしたとき、2xSSC 中で手袋で軽くぬぐってゲルかすを除きましたか？ハイブリ液が少なすぎるとムラになります。
プローブに反復配列が含まれてたら、Cot1 DNA でプローブを１時間プレハイブリすると、バックグラウンドが下がります。
こんなとこかな。

こんにちは。858に書き込ませていただいた者です。
861、と864、の書き込みを下さった方、ありがとうございます。

861、についてですが。
おっしゃる通り、EGFPで細胞が光れば、インフェクション（感染）は
うまくいっていると判断できます。
その後、発現クローニングで陽性になった細胞のインサートを
PCRで増幅してシーケンスすることによって、解析したいと考えています。

864、についてですが、業者（この場合はメーカーさん）に
嫌がられる程しつこく聞いているのですが、
明確な答えがまだ得られません。
担当者は、3人変わったし、、、人ごとに言うことが違うし、、、（泣）

genomicPCRの条件なんて自分で振って見つけろ、
もしくはそんなキット最初から使うな。
私が他人だったら、こんな自分にこう言いたい（謎）

御助言お待ちしております、失礼致しました。

学生で初めての実験なんですが、形質転換したプラスミドから
タンパク質を発現させよる実験なんですが、
ＩＰＴＧを含んだものと含まないもの両方ともが電気泳動で
同じバンドパターンを示してしまったのですが、
原因をおしえてください。

>>867
タンパクが発現していない。もしくは発現量が極端に低い。以上。

ないざいせいのたんぱく質が発言していることを免沈してウエスタンしただけで
見えたバンドが目的のたんぱく質だといえますか？（バンドの位置はだいたい予想
どおりなのですが）
また、マウスの細胞に一過性発現させて下流にシグナルを伝えるぐらい過剰発現
させる方法はありますか？（２９３T細胞のように）

>>869
そのタンパクに対して、複数の抗体を用いてウエスタンかけて、同じバンドが染まってくるようなら、
まず間違いないと思って良いだろう。
もしくは、棉賃で使った抗体が、その細胞の抽出液中にクロスする物がないことが
証明できれば、それでもいいんじゃないか？
あと、過剰発現は、NIH3T3なんかだったら、普通にリポフェクションかけただけでも
結構シグナル出るぐらいの発現はするぞ。物にもよるが。

>869
NIH3T3は、CMVの働きが弱いからプロモーターを考える。非常に少量でも細胞への影響があるものと、
いっぱい発現してもgain of functionにならない物があるから、物によると思いますが。

>>871
失礼！vectorやpromoterの事を全然書いてなかった。
フォローありがとう。

>870
レス有り難うございます
新規のタンパク質でつかえる抗体がほとんどない場合は？
また、抗体が他のタンパクとクロスしないことはどのように
証明できるのですか？教えて下さい
また、NIH3T3でなくMEFでも大丈夫ですか？

>871
レス有り難うございます
ベクターはpME18Sなのですがそれでも大丈夫でしょうか？

1123に質問させていただいた者です。
レスありがとうございました＞839,840,842さん
再びゲルからのバンドの抽出についてですが・・
vectorを作るときは確かにスピンカラム等のkit
で良いと思うのですが、細胞に導入するvectorの
調整の場合は大量に回収したいので、kitですと
効率、経済的な問題が生じると思います。この点から
透析バックを使用しているのですが、あまり満足
していません。
これは？という方法がありましたらお願いします。

>>873
免沈出来るんなら、抗体カラム作って回収して、ブロッティングでもして、N末読んでみたら？

>>874
良くわかんないんだけど、切った後のinsertなりなんなりを直接細胞につっこむつもりなの？

低融点アガロースで切り出して、フェノクロとかじゃだめなの？

>>867
大腸菌何？

874に質問しました新人です。
＞875
レス、有り難うございます。おっしゃる通り、フラグメントを
細胞に導入するつもりです。泳動、切り出しまではよいのですが
フェノクロ、エタ沈すると計算の３分の１程しか回収されていません。
フェノクロ以降が問題と思い、調べていたらmolecular cloningなどにフェノールが酸性だとDNAの親水性が低下するとかいてあったので、使っている
フェノールのpHを測ったのですが、中性でした。
他に原因らしい点が思い浮かびません。・・レスお願いします。

>>877
フェノクロ、室温でやっている？
冷却すると収量が低下するよ。

＞878
！そうなんですか？知りませんでした。レス、ありがとうございます。
収量が劇的に上がることはないと思いますが次回からそうしてみます。
でもそれでもだめだったら悩むなあ・・。うーん。透析バックは素人
にはEtbr+DNAの回収過程がみえるから安心だったのになあ・・。

モノクロ（ふつーにマウスでつくる）って、はまったりしなければ、
どのくらいの時間で出来ますか？3ヶ月くらいでしょか？

できたハイブリドーマを腹水で増やす場合、一匹で抗体どのくらいできますか？
（ほんとは力価がもんだいだけど、、、だいたいのmg数をおしえていただければと、、、）

モノクロってぽりくろにくらべて結合力のよわい抗体がとれやすいってほんとですか？
抗体いっぱいとって免珍して共珍物のN松読みたいので、免珍できないとつらい。
経験談ぼしゅうです。

ではでは。

>>880
タンパクの純度とか、抗体価の上がり具合とかにもよるけど、おおむね３〜４ヶ月ってとこじゃないか？
取れる量は、物によるけど、１匹あたり数ｍｇIgGってとこだろ。
モノクロがポリクロより弱い、と言うか、エピトープが一カ所しかないので、タンパク１分子あたり
ひとつの抗体しか結合できないよな？
ポリクロの場合は、うまくすれば複数の抗体が結合できるから、ウェスタンなんかの検出感度は上がる。
それに、非常に結合の強い抗体が混じって出来る可能性もなきにしもあらず、ということだ。
免沈やるとなると、特異性の高い抗体がいいだろうから、モノクロと言うことになるんだけど、
ウェスタンには使えるが、免賃は全然ダメ、と言う抗体もあるので要注意。
複数のエピトープで作成することを勧める。

あああ…。RNA電気泳動のゲル、ブロットしようとしたら破壊しちゃったよ…。
なんとかつないでHybondにブロットしようとしているけど…。
使えるのでしょうか…。しかもRNAのサンプルもう残っていないよ…。

>>880
タグくっつけてプルダウンにしとけって。
そっちの方がずっと楽だよ。
2次スクリーニング、まともにIPなんぞでやってたら大変じゃ。
検出をWB以外でやるならまだマシだけどさ。

あとね、ハイブリドーマの大量培養の方がたくさん取れるよ。
時間かかるけどね（免疫から始めて４−６ヶ月）。

Macで NIHImageを使って、DNAドットブロッティングの発光量をデジタル化
（定量化）したいんですけど。
　いろんなメーカーからCCDカメラと解析ソフトのセットが数百万で出てます
けど、スキャナーとNIHImageで十分ですよね？
　やっている方いらっしゃいませんか？

>>882
サザンならできたよー。
ＲＮＡも面ぶれんにくっついちゃえばRNaseはしんぱいしなくていい。

>>862
日本語をもっと勉強してからきてください。
>>877
ゲル抽出すると１/３くらいになるのは日常茶飯事ではないですか？

880です。881,883さん、どうも。

複数のエピトープで作製、ってことは、
部分リコンビナントを抗原にしてモノクロ作ればいいってことかな。
full lengthを3つに切って、それぞれのモノクロ作ろうとおもってるけど
どうでしょ？
full lengthを認識しなかったら悲しいが、、、。

タグつけてプルダウン、できたらいいなと思ってたんだけど、
うーん、できるのかな。
これ（落としてくるもの）ってほとんどの細胞に発現してる。
そこにadditiveにタグ付きのを強制発現させると、
タグ付きとタグ無しが共存することになるんだよね。
タグ付きのものにうまく取りたい奴がくっついてきてくれるといいんだけど。
いけるかな？そんなのやってみないと分からないか。やる価値はあるかも。

スクリーニングをIPでやってたら確かに死にそうだ。
WBでスクリーニングして
その中にIP出来る奴が混じってたらいいなと思ってたんだけど。

ハイブリドーマの大量培養ってのはあの
回転培養器をCO2インキュベーターにつっこむタイプのやつ？
高くて、うちにはないから敬遠してたんだけど、、、。
たくさんとれるって1匹分の腹水に比べてどのくらい？

>>884
写真上で発光がサチュレートしてなければ大丈夫だよ
どーせ有効数字2桁くらいの話なんだから気にすんな
一度検量線を引いてみたら？

>>887
量的には腹水の方が圧倒的に採れると思うけどな、オレは。
普通培養上清中の抗体濃度は10-20μｇ程度、腹水中には10mg程度は含まれる。
一匹から5-10mlは採れるし、精製も簡単。コスト安いし。
大体マウスにプリスタン射ってから1ヶ月で細胞を打てる。
細胞射ってから1-2週間で腹水を採れる。参考まで。

>>884
イメージアナライザーで解析したのと、X線フィルムをスキャナで
取り込んだのとで、対して差がなかったし、いいんじゃないの？
むしろ、スキャナで取り込んだものの方が綺麗だった気がする。

>>887
おおお、亀レスｽﾏｿ。
抗体の量は、>>889の言うとおり、腹水から取った方が、一般にたくさん取れる。
培養上清は、同じ量取ろうと思ったら、大量に培養しなきゃならんので、面倒だしコストもかかる。
業者に腹水化を注文するのが、一番楽で低コストです。
エピト−プに関しては、色々考え方があるが、タンパク切って、と言うのも確かに一つの手だ。
どっちかというと、リコンビナントで取った方が楽だとは思うが。
後のスクリーニングとか考えるとね。

>>884
888も書いてるとおり厳密でなくていいなら使えるんだけど。
スキャナは直線性がよくない。さらに見映えを良くするために濃度補正とか
輪郭強調処理とか勝手にかましてくれる。設定でそういうの全部オフにして、
さらに検量線を書いて、それから使わないとウソの数字が出てしまうよ。

>>889
そう？
私がやっている限り、２Ｌの培養で数十mgはかたいよ。
腹水って汚いから精製が面倒臭そうで毛嫌いしてる。
精製簡単なら今度は腹水にしよっかな。
大量培養の方が確かに費用はかかるけどさ。
簡単にきれいなモノ取れるから好きなの。

デンシトメーターなら確実かな？

誰かBACクローン（というかlow copyででかいプラスミド）を高い収量で回収できる方法をご存じの方、教えてください。
大腸菌のstrainは何がいいとか、プラスミドの精製はどのキットがいいとか、何でも。

PCRがうまくいかないんですが、誰かヒントをください。

ずっとPCRやってなさい>896

>>896
少しは状況を書け。
テンプレート、プライマー、目的断片の長さ、
反応条件、PCRした後何がしたいのか、現在の状況、
その他諸々、全部推理してヒント出せっていうのかｺﾞﾗｧ

>>896
チェック項目
１）ｄＮＴＰ（結構へたりやすい）
２）バッファー（析出はないですか？）
３）プライマー（ＰＡＧＥ流してみる。ものによってつぶれやすいものあり）
４）発表されている配列に基づいている場合、もとの配列とのミスマッチの
可能性。（種差など）
以上、よくある話ですが、意外と本には書いてないので、老婆心ながら

>>895
漏れが使ったのは、危亞幻のBAC用キット
500mlの培養から取るやつで、
終了はDNase処理すると10-20ng/400μl
処理しなければ、約10倍取れる
ただし、BacのゲノムがたくさんコンタミしてるがPCR(5Kbp)はできるよ！！
まあしかし何だな
大量に取るのは難しいと思われ。
1このバクテリアに1コピーしか入ってないし
管理が悪いとすぐに脱落するし
要は、ニックが気になんなきゃ
10-50L位大量培養して、アルカリ/SDS方で取れば
セシウムで回してもBacのゲノムと取り分けるのは無髄と思われ

すみません、初心者です。教えてください。
制限酵素処理したゲノムDNA断片をゲルから抽出して、
プロメガのTA-cloningキットを使って、形質転換し、コロニー・ハイブリダイゼーション
して、目的DNA断片を見つけ出す。　この方法は、うまく行きますか。教えて下さい。お願いします。

うまくいきますか。

初めまして。
分かる人がいれば教えてください。
エレクトロポレーションの時に火花が散ります。
DH10Bのcompetent cell（自家製：10%glycerolで洗いを数回繰り返す）で0.1cmのキュベットを使い、2.5ｋV・200Ω・25μFDで行っています。
塩濃度以外に何か原因は考えられますか？

>>902
わははははあああああ！！火花散らしてる奴ハケーン！！
っていうか、気を付けないと死ぬよ！
原因はね、たぶん、キュウベットがぬれてるからだよ。
電圧かける前に氷にさしとくじゃん。
よくキムワイプかなんかで拭いてからやれば多分大丈夫だよ！

>>901
プロメガのTA-cloningキットがいかなるものか知らないが、
TA-cloningという名前である以上は、
制限酵素処理したDNA断片をクローニングするのには
かなーり不適切であると思うんだけどね。

ていうか、そんなことくらいで質問しに来る君だったら、
うまくいきません。
断言します。
うまくいきません。

’ミニカン’ってなにぃ？？

ところで、このスレは後継スレどうするよ？
そろそろ考えないと。

stratageneの'XL-10 GOLD Ultracompetent cell'を
使っている人いますか？
カタログには20−30倍のtransformationの効率と書いてありますが
本当ですか？

>>903
死ぬのは大腸菌か？
両方か？

>>903
俺は別に丁寧に拭いたりしないけど、火花なんか出たことないぞ？
つーか、構造的によっぽど水が入らないと漏電しないんじゃない？？
BIおRadだけど。

901さんへ。

もう一度教科書読みましょう。

>>907
XL-10 GOLD Ultracompetentもつかいましたが、個人的にはGibco STBL2を
最後の切り札的に使ってます。１０の９乗は出るので、ケミカルでもかなり
よいです。リピート構造のあるコンストラクトもらくらく。

海泥由来の菌の単離がうまくいかない……。
コロニーから単離して電顕で見たら
３種類くらいコンタミしてるのもある……。
もう一度コロニーにして単離しないと……。
平板にわさわさ生えてる菌を
どうやってコロニー状態にしよう。

>912
適当に掻きとって、ひたすら希釈して、
プレートにワンコロニーしか生えてこない状態にすれば。

>>904 >>910
平滑末端の制限酵素を使って、ゲノムDNAを処理し、ゲルから精製してから、Aテール
附加させ、ライゲーションすれば、クローニングができる。
おめえら知らないくせに、うるさくいうんじゃなぇー

>>914
なんでそんな面倒くさいことするのさ。
平滑末端ならSmaIサイトにでもいれればいいじゃん。
効率は悪いかもしれないけど。

>>901
実験の目的が今ひとつ把握できていませんが、既存のゲノム断片を
クローニングされたいのでしょうか？
その場合、配列がわかっているのならＰＣＲも一考されたらどうでしょう。
また、繰り返しクローニングする予定のあるものであれば、いっそうのこと
ライブラリーを作っては。ファージにしておけばスクリーニングは幾分
楽になります。（コロニーハイブリ比）
９１５さんの方法を使われるのであれば、InVitrogen Zero-bluntが
サブクローニング効率を上げるのに役に立つかもしれません。

>>916
有難うございます。
サザンハイブリダゼーションして、得られたシグナルから、
制限酵素処理したゲノムDNA電気泳動ゲルに相同するところを
切り出してクローニングしよう思ってます。塩基配列はまったくわかりません。
初心者なので、よく使われている方法を教えて下さい。お願いします。

>>917
サザンで使った制限酵素と同じサイトのベクターにゲルから
切り出したDNAをつないでライブラリーとすればいいんだよ。
後はコロニーハイブリでスクリーニング。
効率が悪いようならファージライブラリーの方がいいかもしれんが、
最近の高効率コンピテンとセルを使えばプラスミドでも大丈夫かもしれない。

誰か教えて下さい。
‐20℃で1ヶ月保存したトランスフォーメーション液は
また使えますか。　お願いします。
　

>>919
使えますよ。ただし効率はがた落ち。
貴重なサンプルを使う場合はお勧めできない。

>>913
理屈はわかってるんだけど、
一発でコロニーを作らせたいから悩んでる。
どのくらいの菌をどのくらい希釈すればいいか……
時間も、大量にまくための培地をつくる金もない（涙

>>921
1/10ずつ希釈していって、そこにつまようじをつけて、
同一のプレートにストリークしていけ。
そうすれば、プレート一枚で、かなりのレンジで希釈できるだろ。

>>915
意外かもしれないけど、
ライゲーション効率はSmaIで平滑末端のほうが、
TAクローニングよりよっぽど良いんだよ。

>>901
ほどバカな奴を見たことがあるか？
おれは無い。

>>924
>>901には爆笑した。

>>908
死ぬのは人間です。
大腸菌は、1/100位は生き延びるでしょう。
>>909
俺もBioRadだけど、火花散るよ。
散らしたときはそりゃーショックさ。しばらく放心状態。
もちろん、コロニーも生えない。
氷に付けて火花散る人は、
たぶん、氷に水はってるんだよ。
その方がすぐよく冷えるでしょ？
でも、拭かないと、たまに火花。

>>922
なるほど！！！
ありがとー。すげ助かった。

>>927
実際にやったこと無いけどね（笑）
でも、ファージだと、この方法で、
一枚のプレートに希釈液をたらしていってタイター測ってるから、
たぶんコロニーでも大丈夫だよ。

みんな>>901をそんなにバカに寸なよ!
彼は金はあっても時間がないんだ!
金をかければ時間を節約できる好例じゃないか!

>>929
でも、あの方法じゃあ、時間を節約できないよ。

>>930
撒いてみてコロニーにならなかったから
もう一度挑戦っていう時間が
節約できるんだったらそれでいいす。

>926
溶液に塩が混じってるんじゃないの？

塩が混じっていたら、１００％火花散るよ。

>>926
俺はキュベットを氷の上で冷やすときに、サランラップしいてる。
少し冷えが悪いけど、トランスフォーメーションの効率はそんなに変わらん。
なにより火花が散らんくなっただけでも精神的に大分良い。

あと、キュベットの上部のほうに菌液がついてると火花が散りやすい。
なんでかよう分からんけど。経験上はそうなってる。

896さんではないですがPCRがうまくいきません。

血液（血球細胞）からゲノムを抽出してPCRでスクリーニングをかけているのですが、
電気泳動するとスメアしています。
Mg濃度、酵素濃度、テンプレートの濃度、
アニール温度に伸長時間、サイクル数もいじってみたけど全部ダメ。
それならとプライマー買い替えたんですがそれでも・・・。
899さんの項目もチェックしたのですが、
何も増えないならまだしもスメアになる理由がわからないんです。

使っているのはABIのPCR9700、ポリメラーゼはAmpliTaqGoldです。

>>934
nestedでかけてみた？

>>934
スメアーになる・・・非特異的に何か増えてる
touch down かnested PCRをすれば特異性は上がる
プライマーを変える・・・Tｍ60-64度GC45-55%30mer前後、上げたいとこの配列をよく確認しないと知らぬ間にリピート配列、etcを踏んでいることがある
細かいことだが、俺の経験からいえば、
Mg濃度はさほど変化をあたえんが、
テンプレートの濃度とTEの持ち込みは重要
多くてもテンプレートは100ng以下でTEは1μl以下/50μlの系
TEが多いとうまくいかなくなる。
4Kbp以上ならCool（4度）
4Kbp以下なら Hot（90度）
で1-2分間加熱、冷却中にサンプルを乗せる
denatuer を94℃1分から98度15-20秒に変更
TaKaRaのLA-Taqがいいぞ増えは良くないが
PCR条件は緩くてもちゃんと上がる。

>>934
予想される断片長を書いた方が良いと思う。
それと、泳動結果は予想と比べてどうなってるの？
スメアーは低分子側だけ？高分子側にも？

>>934
PCR tubeが、ぴったりと穴にはまってない。
なはははは。

折角のよいスレなので、950踏んだ人、新スレ作成ｷﾎﾞﾝ。

みなさん素早いレスありがとうございます。

>>935さん
nestedはかけましたが、スメアーの状態はさらに悪化します。
nested前のテンプレートになにか調整するなどの工夫は必要でしょうか？

>>936さん
貴重なご意見ありがとうございます。
さっそくいろいろ試してみることにします。
確かにMg濃度はスメアーの濃さしか変りませんでした。
プライマーのデザインも考え直してみます。

>>937さん
ご指摘ありがとうございます。
1Kbp程の目的遺伝子内にプライマーを4つ作って、
500bp→300bp（nested）と増やしてスクリーニングしています。
スメアーの中に目的断片が見えたときもあるのですが、
もう一度同条件でやったらスメアーだけと、再現性がとれません。
スメアーは全体になっているときもありましたが、
最近は低分子側（1kbp以下）に見られます。

>>938さん
う〜ん、さすがにしっかりとはめてはいるんですが。

ちなみに基本敵なPCR条件は以下のように行っています。
95℃、10min→（94℃、1min→55℃、1min→72℃、2min）×60サイクル
→72℃、7min→4℃

今晩は。みなさんのご意見をお聞きしたいです。

培養細胞に遺伝子導入して選択培地でコロニーを
形成させた後、プレートにサブクローニングする
と上手く細胞が立ち上がって来ません。
コロニーピックアップをペニシリンカップ法ではなく
ピペットで掻き取って行っています。
その物理的な剥離がいけないのでしょうか？？
レスポンスお願いします。

>>940
60サイクルは多すぎでしょう。

>>940
500ベース増やすのに72℃2分も長すぎな印象です。
Taqなら1分でじゅうぶん。

>>940
サイクル数が多いとスメアになりやすいです。
サイクル数を増やすよりはnestedでもう一回PCRしたほうがよいです。

>>941
サブクローン時に、細胞が定着するまで薬剤を抜いてみてはいかが？
細胞が明記されていないので一概に言えませんが、サブクローン時に
薬剤耐性遺伝子が一時的にオフになっていることが考えられます。
ただし、定着次第薬剤を戻さないと、発現プロモーターがメチル化を
受けて、目的遺伝子の発現も低下する可能性があり要注意。

大きいインサート(４〜６Ｋ）を組み込んだプラスミドをトランスフォーメーション
させた場合って、小さいサイズ(1.3Ｋ）のインサートを組み込んだ場合より大腸菌の
生育は悪くなるんでしょうか？
培地はLBを使っています。

946さんへ
大きいやつは少し効率が悪いです。
あとゲルから切り出すときにあまり紫外線をあてるのもよくないといううわさですが。
お金に余裕があれば、いい市販のコンピテントセルを使われては如何ですか？

>>934
酵素量が多いんでない？酵素減らしてみては。
あと、別な酵素でやってみたら。

すいません教えてください。
香辛料、特にコショウやシナモンからDNAを抽出しているのですが、
260/280できれいなDNAが取れません。またPCRをしても阻害のせいか、
増幅しません。どうしたらいいのでしょう？
適切な方法かkitがないでそうか？

＞945
ご意見ありがとうございます。
現時点でたくさんのコロニーが立ち上がってきていない
ので次の打ち込みをするときにそうしてみます。

少量（数百ぐらい）の細胞からゲノムDNAを抽出してPCRしようとしていますが、効率よくDNAを抽出出来る方法を誰か知りませんか？

>>951
どうしても抽出の必要がありますか？
直接PK/SDSバッファーからPCRできるはずです。
Single-cellのPCRなんかではそうしてるはずです。
（PK/SDSそれぞれの濃度を低めに調整するんだと思います）
今ちょうどいいお手本が見つからないので、また追記します。

Single-cellなんてできるの？すげー

>>940
俺の基本
94℃、2min→（94℃、30sec→52℃、30sec→72℃、2min）×30サイクル
→72℃、10min→4℃

変性の時間が長すぎる。taqがどんどん失火津する
兄ーるは45℃くらいでもやってみては？

>>940さん
当方、マウス組織からゲノム抽出を行っているＢ４です。

少し前まであなたと全く同じような状況でした。
ある日を境にして、目的のバンドが得られなくなりました。
いろんな条件を変えても、いつもスメアになってしまって…
同じ条件でも再現性がなく、２か月間悩みました。
そこで、同じデザインのprimerを新しく注文したところ、うまくいくようになりました。

精神的に大変でしょうけど、がんばってください。

GST-fusionで結合させるタンパクを5アミノ酸削ったら、途端に発現ゼロ・・・
さらに５アミノ酸削ってやると、今度はバンバン発現した。
でも最初の方の５アミノ酸が結構データの肝だったりするのに（鬱）

>>949
いまどうやってコショウからとってるの？
キットなら、キアゲンとかにあるけど。
polysaccarideが多いんだろ。
PCRの際はテンプレートを少なくした方が良く増える場合が多い。