▼今実験でうまくいかないこと▼パート7▼

1 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/04(土) 18:18:41

いま実験でうまくいかないことスレッドです。
グチからアドバイスまで幅広く語り合いましょう。

★過去スレ★
　いま実験でうまくいかないことｽﾚｯﾄﾞ
　　http://cheese.2ch.net/life/kako/967/967541407.html
　▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
　　http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/
　▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼
　　http://science2.2ch.net/life/kako/1026/10263/1026312578.html
　▼今実験でうまくいかないこと▼パート4▼
　　http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1093050850/
　▼今実験でうまくいかないこと▼パート5▼
　　http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1121097197/
　▼今実験で上手くいかない事を質問するスレ▼ part6
　　http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1146716446/

☆主な関連スレ☆
　◆生物学専門家への質問はここに書き込めPart22◆
　　http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1162375329/
　◆2ch高校生のための生物質問板　7時間目◆
　　http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1161079191/
　質問に対して小学生でもわかる回答をするスレの３
　　http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1145937037/
　タンパク質の精製３
　　http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1104733094/

2 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/05(日) 10:18:22

新調したばかりの靴に、E.coli零したorz

3 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/05(日) 12:26:36

オスバン部隊　出動！

4 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/05(日) 19:33:44

>>2

(･∀･)つ http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1048661187/l50
｛実験｝悲しいとき～

5 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/08(水) 00:03:25

どうも。前スレでRT-PCR生成物を発現ベクターにクローニングできずに困っていてここで
相談させて頂き、 pCR-Blunt II-TOPO を勧めていただいた者です。

お陰様でcDNAのTOPOクローニングはできたのですが、切り出して発現ベクターに入れると、
制限酵素２種類使っているのに、おかしな配列を伴って逆向きに入ったものだけが生き残り
ます（拾ったコロニーについて）。

培地には抗生物質の他に1%グルコースを入れています。
大腸菌はNovaBlueの他にHB101株を使ってみました。
プライマーも再合成したものを使っています（長さを短くしました）。

なにか他に策はありませんでしょうか。

形質転換の後、向きが分かるようなコロニーPCRでスクリーニングしまくれば数撃てば当たり
ますでしょうか。。

ちなみに目的蛋白質は、ほ乳類の分泌蛋白質で、シグナル配列を除去した領域に対応するcDNAに
制限酵素配列を付けて増幅し、pETベクターの大腸菌用のシグナル配列を付けようとしています。
また、分泌後、他の蛋白質と複合体を作って１つの機能を持ちます。相手方はペリプラスムに
安定して発現しています。

6 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/08(水) 02:23:11

プラスミドに入れたDNAのシーケンスで、プラスミドの標準的な
プライマー（インサート配列を挟むフォワードとリバース）の片方
ではきれいに読めるのに、もう片方はぐちゃぐちゃで全く読めない
んですが、どんな原因が考えられますか？

7 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/08(水) 08:47:24

漏れも同じ問題が…

8 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/08(水) 08:59:37

>>6
プラスミドの濃度が最適値から外れている。

9 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/08(水) 09:14:06

ナメクジのパッチクランプ

10 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/08(水) 09:29:35

>>5
培養は全て30℃にする。

11 ：5：2006/11/08(水) 11:20:47

>>10
ありがとうございます。
ライゲーション・形質転換後のSOC培養以降、全て30℃ですね。
やってみます。

30℃だと、SOC培地、LBプレート（+ Glc, Kan）の培養時間はどのくらい長くなるでしょう？

12 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/08(水) 15:02:00

>>6 プライマーがアニールしそうな配列がインサートにある。
3' 9merが相同で読めない経験あり。

13 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/08(水) 22:33:10

スレ違いだと思うがどうしても納得いかんので聞いて欲しい

「吸光度の単位はnm（ナノメートル）だよｗ」って自信満々のパートナーに見下す感じで言われた。
これ間違ってますよね？

14 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/08(水) 23:10:14

無名数じゃね?

15 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/08(水) 23:27:55

Arbitrary Unit

16 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/08(水) 23:49:59

>>13
そりゃ「そのｻﾝﾌﾟﾙがその吸光度を示した時の波長」だな。
吸光度は無次元数じゃろ？

・・・正直あまり自信ないです、ﾊｲ。

17 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/09(木) 01:00:59

培養に関しての疑問なんだけど、高密度培養による産生物収率の向上の原因って何？

18 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/09(木) 03:34:20

nm = nautical mile (海里)

19 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/09(木) 20:07:23

ABIの310でPOP6のままジーンスキャンやってるんだけどなかなかうまく行きません。
モジュールの設定とかどうすればいいか知ってる人いますか？

20 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/09(木) 21:18:19

>>13
http://www.youtube.com/watch?v=0umpeN2uJbY

21 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/09(木) 21:54:11

吸光度：

光路長一定のとき、ある波長と等しいエネルギーを持った光子が
試料中に吸収される比率。単位は無次元（[J/J]）。

吸収された光子のエネルギーは、分子の振動や化学反応などに
利用された後、長波長の電磁波として放出されるため、
通常の吸光度計では検出できない。

22 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/10(金) 14:52:57

>12
サンクス。
調べてみたら、シーケンス用にメーカーが売ってるプライマーでも、
意外にアニールしそうな別の配列があるもんですね（しかもベクター部分！）。

23 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/13(月) 13:22:02

おまいら、ディスポのチャコールマスクって、どっち向きにはめてる？
漏れは黒い面が口の方になるように当ててるけど、先輩は「それだと口が黒くなる」
と言って白い面が口になるようにはめてます。
そうすると見た目がかなりかっこわるく見えるんだけど。。黒くなったこともないし。

24 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/13(月) 22:08:32

てゆーか
防塵マスクってひらべったくないだろ

25 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/14(火) 01:13:10

>>23
http://www.hagitec.co.jp/hagiten/as/as8/as1303.htm#2
☆使用上の注意：装着する際は、黒い面を外側に白い面を顔側に装着してください。

26 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/14(火) 04:41:54

２０ｂｐ程度のオリゴを細胞内に導入する実験をしているのですが、エレクトロポレーションだと細胞が死んでしまったりして
うまくいきません。
できるだけ効率よく核内まで導入する方法って何でしょうか？

27 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/14(火) 18:45:09

酵素のpH依存性を調べるために
酸性フォスファターゼでp-ニトロフェニルリン酸を加水分解したいんですが

実験書には、基質液に塩化マグネシウムを入れるように書いてあるのです。
これって入れる必要性が無いと思うのです･･･
皆様の御意見をお聞かせください

28 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/14(火) 20:24:44

>>27
じゃあ入れなければ良いじゃん

29 ：27：2006/11/14(火) 21:45:31

>>28
分かりました...orz
どうもすみませんでした

30 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/14(火) 23:27:13

>>27
なぜ、必要ないと思った？

31 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/15(水) 01:03:35

スレ違いだったらごめぬなさい。
ゼミで教授にEカドヘリン消失を介さない上皮間葉移行（epithelial to mesenchymal transition）は存在するのか調査を任命されました。
つまり、Eカドヘリンを発現していない上皮細胞は存在するのか？
EMT後にもEカドヘリンを発現している間葉系細胞はあるのか？
そんな報告があるのでしょうか？
自分では探しきれず、誰か詳しいヒト教えてくさい！！

32 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/15(水) 01:14:46

>>31
こんなところで人に頼っているのを教授が見たら泣くぞ

33 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/15(水) 08:17:50

ｦﾏｲ､ＰＣの前から離れるときはURL履歴を消しとけwwwww

34 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/16(木) 00:15:03

>>31
>ゼミで教授にEカドヘリン消失を介さない上皮間葉移行（epithelial to mesenchymal transition）は
>存在するのか調査を任命されました。

おまい、これでここで質問ってのはなしだわ・・・

35 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/16(木) 21:38:39

クローニングベクターに入った遺伝子を、制限酵素で切り出してゲル精製、
発現用のベクターに入れようとしています。

なぜか、とれたプラスミドはもとのサブクローンしたDNAのままでした。

何故なんでしょう？？

36 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/17(金) 00:47:10

制限酵素の切れ残りがコンタミしたんじゃねーの？
スーパーコイルの出てくる位置とインサートの位置は十分離れてるのか？
クローニングベクターと発現ベクターの耐性遺伝子は別？
カネあるならGatewayにするとつなぎかえの悩みはなくなる
マジおすすめ

37 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/17(金) 01:48:14

俺だったらインサート切らずにベクターのみ切る酵素でさらに切ってみるだろうな

38 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/17(金) 07:38:43

>>34
なんだ　知らないのか・・・ププｗｗｗ

39 ：31：2006/11/17(金) 10:37:10

>>32, 33, 34
そうすね
やっぱり自分で探してみまっす
厳しいお言葉産休

40 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/17(金) 14:04:07

ここにはカメの専門家はいらっしゃいますか？

臨床家なのですが、今度ひょんなことから
ミドリガメをsacrifyして血液検査(PCR)をすることになりました。
ミドリガメからの採血の方法をご存知の方がいらっしゃいましたら
教えていただけないでしょうか。

41 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/17(金) 14:10:24

>>35
情報不足。
(1)クローニングベクターのサイズ(bp)と、
　その切り出しに使用した制限酵素の名前とゲル精製後のサイズ
(2)発現用ベクターのサイズと、
　その切り出しに使用した制限酵素の名前ととゲル精製後のサイズ

これを教えれ。
とくに(1)の切り出しにひとつの制限酵素を使用した場合や
ふたつの制限酵素を使用した場合でもXbaIとSpeIなど
compatible endsとなる酵素対を使用した場合は
そのようにself ligationを起こす可能性が高くなるので、
mol比を1:3～1:5くらいにするなど、注意が必要。

42 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/17(金) 14:23:20

>>40
この板にいるのかな。獣医さんの領域だよね。。

43 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/17(金) 16:43:01

制限酵素配列付きのプライマーでPCRした生成物をTOPOクローニングしたんですけど、
とれたものは、TOPOクローニングサイトではなく、まるで普通に切り貼りしたかのよ
うに制限酵素部位にインサートが入ったものだった、なんてことってありますか？

44 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/17(金) 16:51:48

俺は聞いたことも体験したこともない。
あと考えてみたことも無い。シーケンス確認したらそうなってたの?

45 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/17(金) 19:51:05

>>43
PCRの鋳型か何かがにプラスミドがコンタミしてたっていうオチじゃなくて？

46 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/17(金) 20:11:30

Gatewayを使っています。
DESTベクターで哺乳動物細胞に目的遺伝子を発現させて機能解析をしようと思ってるんですが、
遺伝子導入の際のmock controlは何を用いればいいんでしょう？
最初は空ベクターにすべきかと思ったんですが、そうするとベクターがある程度の量必要になり
ますが、インサートを持ってないDESTベクターは大腸菌では増やせませんよね？

47 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 00:00:51

現在ウェスタンによってあるタンパク質の増減を見ています
しかし抗体が良くないのか４℃ O/NしてABC染色してやっと見れるかどうかという感じです

それでもちゃんと見れるならまだいいのですが、ポジコンでもバンドの位置が微妙にずれたり変なノンスペが目的バンドより濃く出たり普通はリン酸化の影響でダブレットで出るはずの目的バンドがシングルバンドで出たりともう無茶苦茶です
ポジコンには以前に多めに調製した細胞破砕液を小分けして使っているのでサンプル自体は同じでゲルの濃度等も同じです

このような現象の起こる原因及び対処法があれば教えてくださいお願いします

48 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 00:08:43

>>43
そんなはずあるわけないだろ。誰かのいたずらか>>45の言うとおりだ。

49 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 00:17:22

>>46
お前のラボではDESTベクターは使い切ったら新たに購入してるのか？
金持ってるんだなｗ

50 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 01:42:52

うちなんかdestination vectorはみんな手作りだぜ。

51 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 04:26:08

InvitrogenのpcDNA3.1/zeoベクターにインサートいれようとしてるんですが、
このときフレームを考えて設計しないといけないんでしょうか？
GSTベクターのようにフレームを合わせるのはこのベクターの場合ない？
またコザック配列を含ませろと書いてあったんだけど、どんな配列をどのように含ませるの？

52 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 08:07:24

悪いことは言わないから、まず分子生物の基礎から勉強しろ。

53 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 09:14:51

>>51
必要ないよ。

KOZAKは。。。。
ど忘れしたな。GCCACC(ATG)G (ATGはスタートコドン)だったかな？
間違っていたらどなたかフォローたのんます。

54 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 09:23:17

おしいな
ATGの5'側はAがたくさん並んでてｰ3あたりにC/Aが正解

55 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 14:34:00

おれは今まで50種類くらい（長さは２００－２０００aa）作ったけど、
>>53の配列(GCCACCATG)で発現しなかったことないよ。
コンセンサスには入ってるけど、ATGの後のＧは経験的にはいらないと
思ってる。

56 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 21:18:31

来月からBACのショットガンシークエンスを始める予定ですが、
目標は何倍くらい読めばいいのでしょうか。

57 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 21:41:49

うへー時代はそこまで来ているのか。
にちゃんでショットガンシークエンス計画立てるようなやつがでてくるとは。
ttp://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=1355857&rev=1
ここでは2-10倍と言ってるが。

58 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/18(土) 23:39:36

>>49
＞お前のラボではDESTベクターは使い切ったら新たに購入してるのか？
＞金持ってるんだなｗ

え・・・マジで使い切るたびに購入してましたが・・・。
あれって増やせるんですか？
増やせないと思ってたので・・・。
どうやって増やしたらいいんですか？
普通に何かの大腸菌に入れて振盪培養？
抗生物質は何を？

ちなみに、お金は余ってます。

59 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/19(日) 01:51:30

destなんて、6μ程度で4～5万で買えるじゃん？

60 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/19(日) 02:35:47

シーケンスがうまくいきません

61 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/19(日) 03:13:32

お客様の中にエスパーの方はいらっしゃいますか?

62 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/19(日) 03:33:30

>>60
君が下手
組成ミス
プライマー設計が怪しい
鋳型精製が汚い
機械の中の人の機嫌が悪い

63 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/19(日) 07:36:10

>>58
じゃあどうやってvector作ると考えていたのか？
まあいいよ、マニュアルさえ読まず、
原理を理解していないような奴は、
国民の税金を無駄にinvitrogenに渡しておいてくれ。
いや俺はおそらく君と違う国にいるから。

と言いたいが、この業界を一緒くたに批判されて被害を被るのもなんだし、
ttp://www.invitrogen.co.jp/catalogue/invitrogen/C7510-03_001.shtml
こいつを買うのだ。
どうせこれ買ってもコンピ手作りはしないだろうが。
説明するとR12サイトに挟まれた所にあるccdBという遺伝子は、
普通の大腸菌を殺すが、この特殊なストレインはccdBに耐性で、
だから増えるという事だ。
もちろん暇があったらccdBが何をコードしていて、
このストレインがなぜ耐性なのか、知っておいてもそんはないかもしれん。

64 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/19(日) 08:17:28

こういう先輩の下に付けたら幸せだったなぁ。。。

65 ：51：2006/11/19(日) 14:05:19

>>53
>>54
>>55 サンクス
自分なりに調べてみたら、GCCACCATGGが必要とか、ACCATGGとか、CACCATGGとかでてるんだけどどれが正解？
>>53, >>55が言うようにGCCACCATGGが一番基本どおりなの？
ところでもひとつ、目的タンパクの前にコザック配列をつけるということだけど、コザック配列直後に目的タンパク配列を入れるの？
それか気持ち何塩基か余計に付けた後？
それともコザック配列中のATGと目的タンパクのATGは一緒にするの（Gも付けないといけないのにそれはないよね）？

66 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/19(日) 17:30:37

>>63
親切だな、お前ｗ
>>58のラボは金があるのはいいけど、助手も大学院生もポスドクもそろって
マニュアルも読まずに実験してるのか？
代理店やinvitrogenの営業は何も言ってこなかったの？
黙って入荷し続けたその代理店と取引するのはやめた方がいいと思うｗ

67 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/19(日) 17:33:41

>>65
目的タンパクのATGをそのまま使えばＯＫ
未知のものや膜タンパク質はＮ末端に変な配列ごちゃごちゃ
つけたり、アミノ酸変えたりしない方がいい。
ATGのあとのＧはアミノ酸が変わるときはつけていない。
問題発生したことはないよ。

68 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/19(日) 20:25:53

エチブロが怖いです

69 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/19(日) 23:45:06

>>63
＞説明するとR12サイトに挟まれた所にあるccdBという遺伝子は、
＞普通の大腸菌を殺すが、この特殊なストレインはccdBに耐性で、
＞だから増えるという事だ。
おぉ！こんなモノがあろうとは！
ﾃﾗｱﾘｶﾞﾀｽ（´・ω・｀）ﾉ
早速買ってみます。

>>66
＞>>58のラボは金があるのはいいけど、助手も大学院生もポスドクもそろって
＞マニュアルも読まずに実験してるのか？
＞代理店やinvitrogenの営業は何も言ってこなかったの？
いわゆるMolecularの実験やってるのは俺ぐらいなので。。
マニュアルは必要な箇所だけ拾い読みしてました。
代理店は何も。。

70 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/20(月) 03:16:21

>>68
ぶっちゃけ、手についてもきれいに洗えばおｋ
気になるなら、ゴム手お勧め

71 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/20(月) 15:33:49

>>69
悪いこといわないから代理店を変えろ
ふざけるな、変えるぞとごねるだけでも何かいいことがあるかもｗ

72 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/20(月) 21:48:54

>>70
手袋つけてるから平気でエチブロに触る
　　　　　　　　　↓
そのままドアノブや機器やらを触る

っていう感じでうちの研究室では明らかに逆効果なんだが

73 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/20(月) 22:20:49

発光バクテリアの培養が上手くいかないよ(ﾉД｀)
なんでだろう？もう３回くらいやってるのに全部駄目。
雑菌に負けてしまったんだろうか。

74 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/20(月) 23:06:46

↑
これは質問なのか、それとも独白か？

75 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/21(火) 04:40:12

>>72
エチブロ専用のゴム手か、使い捨ての手袋にするといい。
エツブロ触った後は、即廃棄

76 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/21(火) 09:21:39

>>73　発光バクテリアってなんだろ？
海ホタルとかそうだっけ？

77 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/21(火) 09:32:30

>>74
出来ればアドバイスを頂きたいです
>>76
イカの体表面に付着しているバクテリアのことです。
イカが夜光るのはその発光バクテリアのおかげなんだそうな。

培養するとペトリ皿の中で他の雑菌に負けて死滅してるorz

78 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/21(火) 10:48:52

素人？
あるいはここには海洋微生物専門家は少ないと知っての愚痴か。
まずは単離からだろうね。

79 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/21(火) 11:08:16

>>77
培地は何種類か試したのか？

80 ：51：2006/11/22(水) 02:14:59

>>67
つまりは配列のあたまにGCCACCをただくっつければいいということですな。
ありがとう

81 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 15:27:49

突っ込んだ遺伝子を発現させようと、
BL21(DE3)pLysのグリセロールストックから起こして培養したけど菌が増えないorz
これって、リゾチームのせいでグリセロールストックは厳禁？
それともグリセロール20%じゃいかんのか。う～ん

82 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 17:23:41

83 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 18:38:44

>>81
本来なら増えるだろ。
抗生物質の種類間違ったとかじゃなくて?

84 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 19:04:27

エタ沈がとてつもなく苦手です
昨日もロスしました
制限酵素処理したあと酵素を熱で失活させればエタ沈しなくてそのまま
トランスフェクションしても大丈夫ですか？
やっぱりやった方がいい？

85 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 19:07:47

>>83
プレートのアンピシリンがダメになってて、変なコロニー拾ったかも知れません。
もう一度試してみます。

86 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 19:32:56

>>84
それはトランスフェクションが上手くいかない理由としてエタ沈だと考えているの？
その他のミスとかはまず無いということか？
>>83の言うような抗生剤を間違えているとか
そもそもプラスミドが無いとか
その辺の確認はしているの？

87 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 19:57:25

>>86
はい、プラスミドの有無と抗生剤の確認はしました。

88 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 20:05:32

>>86
>>84ですが、エタ沈の前後でABS280ががた落ちするんです。
μｇオーダーあるはずなのに。。

89 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 20:47:29

>>85
もう一度試してみるという選択は間違ってないと思うけど、
プレートからコロニーをピックアップして、振盪培養するとき、
アンピシリン入りの培地使ってないの?

90 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 20:57:40

http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/bnsikato/protocol/b10.html
この方法で一周PCRして、3塩基を置換しようとしています。
PCR後、泳動して確認すると、元のプラスミドよりも少し大きい位置にバンドが現れました。
置換後でも塩基長は同じになるはずなので、同じ位置に出ると思っていたのですが、これって反応がうまくいっていないのでしょうか?
それとも、テンプレートのプラスミドは大腸菌から抽出したものなので、PCR産物の環状DNAとコイルの仕方が違ったりするのでしょうか?

91 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 21:29:11

>>90
PCR産物のプラスミドのバンドは何本？

仰せの通り　元とPCR産物にある微妙な構造の違いで
バンド位置が変わったり
或いは複数のバンドが見られることがある様なので
まだ試していなければですが
何かしらの制限酵素で鎖状にしてから
一度コントロールと流してみて下さい。

92 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 21:44:36

>>91
複数の置換変異体を作ろうとしているのですが、いくつかの変異体では、
かなり低分子量側にうっすらバンドがもう一本見えるものがありました。
ただし、メインのバンドはすべての変異体に共通した位置に出ていて、
ちょっと当たりっぽいかなと思っています。

とりあえず次の段階の形質転換と平行して制限酵素処理もしてみようと思います。

93 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 21:50:42

>>88
キャリアーを使えば？
キャリアーの自作が面倒だったらNIPPON Geneの「エタチンメイト」使うとか。

94 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 22:27:16

>>90
同じ鋳型から繰り返し複製することはＰＣＲとは言わない。

95 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 22:30:21

>88
沈殿後に乾固させるじゃん？
あれ時間かけすぎるとDNAガチガチになって溶媒に溶けなくなるYO

または溶解用のTEにDNaseがコンタミ…はないかさすがに
うっかりDNase活性殺してないRNaseをTEに溶かして使ってたとか
（↑まさかと思うだろうが、俺はやった）

低レベルな回答ですんません

96 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/22(水) 22:30:30

>>84
フェノールorフェノール・クロロホルム抽出＋エタ沈は必要でしょ。
エタ沈は大胆にデカンテーションで上清を捨てた後、軽く遠心して
チューブに残った50ul程の上清を、ペレットを吸わないようにピペット
チップで除くというのが最強。

97 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/23(木) 00:27:50

二次元電気泳動→PVDF膜にブロット→免疫染色→スポットを切り出す→抗体をストリップ→メンブレン上で消化してTOF-MSで同定

っていう感じの実験をしたいのですが可能ですか？
ストリップをちゃんとやらないと抗体等の混入が心配ですがどうでしょう

98 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/23(木) 00:31:54

免疫染色の時点でブロッキングに使用するスキムミルクやBSAが、、、

99 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/23(木) 00:40:06

>>97
なんでそんな面倒なことするのか分からない。immune precipitationか抗体カラムつくって一発だし、
どうしても2次元電気泳動したいならその後にもできるし。

100 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/23(木) 00:51:58

>>98
それが一番心配な点なんですが有機溶媒やらで丁寧に洗ったら何とかなりませんかね？

>>99
もちろんIPと抗体カラムは試しましたが
「目的タンパク質がごく少量しか存在しない」＆「抗体価が弱い」
というダブルパンチで上手くいきませんでした

101 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/23(木) 03:34:24

発現系次第だが収量を増やす努力も同時平行で行うこともお勧めする。

102 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/23(木) 23:52:29

BluscriptのEcoRIとBamHIをラーゲーションし、
その後大腸菌にトランスフォームした場合、
Bluescriptのダイマーを形成し、大腸菌の中で複製していくと考えていいのでしょうか？

103 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 00:31:43

>>102
日本語でおk

104 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 00:36:58

いや、日本語的にはまあまあだと思う。

105 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 00:37:39

いや、意味不明。

106 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 00:40:21

そのくらい読み取ってやれよ。うちの学生なんてもっとヒドいけど、何とか対処してやってるぞ。

107 ：102：2006/11/24(金) 00:42:55

Bluescript is linealized with EcoRI and BamHI,
and the resultant DNA is done ligation,
and then transformed into E.coli.
In that case, the plasmid, as a dimer, is replicated in E.coli?

108 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 00:46:19

惜しい！

109 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 00:47:44

日本語で意味不明だったところが英語でもダメ。

110 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 00:57:04

そういうのが取れたことはないから、現実問題としては「まず無い」と言っていいと思うけど、
プラスミドの複製という観点で何か不都合あるかな。
全体が巨大なinverted repeatで不安定だろうけど、それは複製の問題とは別だもんな。

111 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 00:57:12

>>102
なにが目的でどんなことを知りたいのかわからない。
まずBluscriptのEcoRIサイトとBamHIサイトはライゲーションしない。
DNAってダイマーを形成するの？

112 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 01:03:04

EcoRI-EcoRI、BamHI-BamHIでライゲーションされた２倍のサイズの産物が
大腸菌内で安定に複製されるかって質問でしょ。

113 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 01:13:13

oriが二カ所あるプラスミドは安定して増えない

114 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 01:16:04

＞１１０
ご回答ありがとうございました。
＞１１１
ライゲーション時に、ベクターのみのコントロールを取る事があると思いますが、
その理由をきちんと抑えておきたかったので。
＞１１２
そういうことです。
＞１１３
ありがとうございます。

115 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 01:33:16

＞１０９
１１３の日本語を英語に訳してみてよ。明日の正午までに。
君のすばらしい英語の回答を、ノートに書き込んでおくよ。

116 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 09:02:18

>>115
極端に長い inverted repeat のある配列は、大腸菌では増えない
ようです。プラスミドが逆向きにつながると約3kbの inverted
repeat になってしまうので、増えません。プラスミドがタンデムに
つながったダイマーなら普通に複製できます。指定された>>113の
英訳ではないが、
So plasmids with two ori sequences can be stably maintained
in E. coli.

最初の質問では、EcoRI と BamHI で二重切断したものを
ligation したのか、EcoRI で切ったものと BamHI で切ったものを
ligationしたのかがわかるように書かないといけないよ。

EcoRI digest and BamHI digest of pBluescript were
ligated, and then the ligation products were introduced
into E. coli. Is the resultant dimer molecule of
pBluescript replicates in E. coli?

117 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 09:23:34

can → cannot かな？

118 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 22:48:45

>>117
pBR、pUC、pBluescript などのColE1系のプラスミドなら can。
F因子などのstringentなプラスミドならcannot。

119 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/24(金) 22:56:08

ナメクジのパッチクランプ

120 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/25(土) 10:52:09

パッチクランプについて詳しく教えてください

121 ：１０２：2006/11/27(月) 06:49:05

>116, 118
Wow! Thanks a lot.
Brilliant!

122 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/27(月) 12:31:15

>>119=>>120?
ナメクジでうまくいってないのか？そうなのか？えれーえ難しそうだけど、エレガンスのペーパーならあるっぽいよ。
哺乳類の脳神経のvivo-patchってのも出来るそうだし。

123 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/30(木) 10:16:23

国内でPhi-NX Cellを提供してるラボってありますか？
nolan-labに直接だとMTAがめんどくさい・・

124 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/30(木) 22:10:16

実験の副手やってる院生が嫌いです･･･

「お前ここはＯＯしたほうがいいに決まってんだろ！」
「な？　あ？　そうだろ？」
「それならなんでお前今ＸＸしたん？？」
「こうしたほうがいいだろ？　おい？　な？」

実験中は胃が痛くなります。
私の実験が下手だというのもあるでしょうが、これは耐えられません。
どうすればいいでしょうか

125 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/11/30(木) 22:28:52

>>124
俺はしがない助手だが
いまどき親しくも無い学生をオマエ呼ばわりしただけで
アカハラ認定ですよ。
学生にはみんな敬語で丁寧に話してます。

上司に相談すべし。

上司が取り合ってくれなかったら、
あなたが強くなるしかないでしょう。
ある程度のストレス耐性がないと仕事なんてやっていけませんからね。
自分が向上していくチャンスと考えて前向きに行きましょう。

126 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/01(金) 01:58:50

最近の顕微鏡に附属のソフトを使えば、
簡単に緑と赤と・・をmergeすることが可能ですが、
まだお持ちでない方もいるかと存じます。
そこで、Photoshopを使ってFITCとRhodamineをmergeする方法を
アップしました。
この方法で以下のようなmerge画像が得られます。
http://133.95.84.77/~sheel/merge/example.jpg

「Photoshopを使ってFITCとRhodamineをmergeする方法」
http://133.95.84.77/~sheel/merge/howtomerge.pdf

以下のURLからFITCイメージとRhodamineイメージの例を
ダウンロード可能で、これを使用して実際にmergeの練習ができます。
http://133.95.84.77/~sheel/merge/exampleimages.zip

merge結果が以下の画像となります。
http://133.95.84.77/~sheel/merge/merge.jpg

127 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/01(金) 10:36:13

Windowsで動くフリーのプライマー作製ソフトってありますか？

128 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/01(金) 17:19:52

>>124
ぬるぽ。
最近の若い子って免疫ないのね。
うちのラボなんか教授が機嫌悪い時は口きいてくんなかったり
モノ飛んでくるのは当たり前ですよｗｗｗ
基本的に（相手が横柄でも）教わってる、という立場としては
それを是としたほうが良いと個人的に思います。
ただ、よほど嫌なら>>125の言ってるように教授に相談してみる
と良いでしょう。

>>127
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

129 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/01(金) 21:49:19

>>124
「ここはＯＯしたほうが」「それならなんで」「こうしたほうがいいだろ」
にちゃんと反論できるようになれば立場は変わる。
それが出来ないならおとなしくしてなさい。
これは実験が上手いとか下手とかいう問題じゃない。

130 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/01(金) 23:27:10

>>124
そういう奴はむかつくがちゃんと教えてくれるだけマシと思え

>>127
http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm

131 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/02(土) 04:33:16

>>124
そういうのはな
「はぁ、そうだったんですか。気づきませんでした。勉強不足ですみません。
　ありがとうございます。他に気をつけるべきことはありますか？」
くらい聞いてちょうど良いんだよ。

教えてもらえるだけありがたいと思えｗｗｗｗ

で、もし反論出来るだけの根拠があるなら
「確かに○○も一つの手とは思いますが、私は～～の根拠に基づき、XXをしました。
　もし不備があるのでしたら、原理説明をお願いします」
くらい言え。ただし、君の知識が毛頭ないのに、注意されたくないだけとか言うくだらない
自尊心からくるだけの反抗なら、下手に出とけ。

132 ：124：2006/12/02(土) 17:04:57

スレ違いなのにお答えくだすった皆さんありがとうございます。

いろいろあったけど、私は元気でした

133 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/02(土) 17:23:04

魔女宅オチかよ・・・・・

134 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/03(日) 08:55:00

過去形か。

あの世から乙

135 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/03(日) 10:31:37

>>126
http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1036510268
こちらへ...

136 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/04(月) 18:17:05

基本的な質問で申し訳ないのですが，2mm四方程度のマウス組織から（一応これらの組織の
数は10個程度までは増やせそうです）RNA抽出して、アレイに持っていきたいのですがなか
なか収量が稼げません。一応TorizolやRneasy等は試してみたのですが。。。

一応可能であれば、one-cycleでやるため1-5μg程度は必要で、two-cycle（10-100ng）も
考えています。どちらにせよ100ng以上ほしいのですが。。。何か良いアイディアありますか？

137 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/05(火) 11:10:07

そもそもその体積の組織標本に含まれる以上のRNAはとれないが、
その辺は押さえているのだろうか？
いや詳しくは知らんが。

138 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/05(火) 20:03:54

以前、カメの採血方法を質問したものです。
今回、カメの採血に成功しました。
単純にカメの後ろ足を1cmほど切って、
ポタポタ法で採血しました。
その後はsacrifyしますた。

以上、報告まで。

139 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/05(火) 20:10:09

>>138
そんなこといちいち報告すんなやボケ！
あー胸糞悪い！

140 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/06(水) 10:06:42

>>139
なにファビョってんの？

141 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/06(水) 10:57:14

どうせSacrifyするなら、暖冬して逆さ釣り。そん時に頚動脈や頚静脈とか当たりつけておいて次はカニュレーションに挑戦

142 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/06(水) 23:22:21

まな板の上に乗っけてね
甲羅にお湯かけて
首がニューと伸びてきたところを
こう
包丁ですぱーんと
あと
ちっちゃなグラスに血を採ってからね
焼酎で薄めてお出しします

143 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/06(水) 23:27:38

>>142
それは実験じゃなくて調理という。

144 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/07(木) 02:14:52

どうも。現スレ >>5 です。

お陰様で30℃培養でpETに目的の遺伝子を正しい方向に挿入することが出来ました。
有り難うございました。

抗生物質耐性遺伝子以外は同じプラスミド両方で実験をしてみて、コロニーの当たりの
確率を見て思ったのですが、毒性の高い遺伝子は KanR のプラスミドよりも AmpR の
プラスミドに入りやすいということはありますか？

あと、私は、他の仕事の合間にやってて遅くなったのですが（言い訳ｗ）、皆さん、
発現系ってだいたいどのくらいの時間で構築できるものなのですか？

145 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/07(木) 23:34:36

>>144
＞毒性の高い遺伝子は KanR のプラスミドよりも AmpR のプラスミドに入りやすいということはありますか？
そんなの聞いたことないけどなあ
他のベクターの特性じゃない？

＞発現系ってだいたいどのくらいの時間で構築できるものなのですか？
cDNAから釣ってくるところから始める場合は２～３週間ぐらいかな
まあ、サイズとか制限酵素サイトとかにもよるけど

146 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/08(金) 03:15:19

カナマイの濃度下げると取れることは確かにあった。

147 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/08(金) 22:13:21

T7とかSP6とかのRNApolymeraseでin vitro transcriptionすると、必ずバンドが二本出るんだが、
あれってなんなの？

148 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/08(金) 23:13:58

転写産物＋鋳型

149 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/08(金) 23:24:20

ンなわけねえだろカス
二次構造だよ

150 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/08(金) 23:28:33

サイズの小さなコロニーを選んでピックアップするとインサート当たりが良かったことがある。

151 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/09(土) 00:28:40

俺もそれは聞いたことがある
インサートが入ってる分だけ負担が大きい(？)からだとか

ただ、小さいのはサテライトの可能性もある

152 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/09(土) 00:39:01

LB plateじゃなくてM9 plateを使うとインサートのあたりが増えることがあるよ

153 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/09(土) 13:31:23

逆に大きい方が当たったりする事もあるらしいがな、
抗生物質の効きが弱い時は。

154 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/09(土) 13:56:13

>>152原理はどう説明つける？
いや証明しなくてもいいのだよ、
それなりに納得のいく説明なら。

155 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/09(土) 17:53:35

誰か、NEB社のGPS-M Mutagenesis System（トランスポゾンを飛ばすやつ）を使って、
ゲノムライブラリーに変異を導入した人いませんか？
全く変異が入らず、早1ヶ月。
このキットで成功した人がいたら、いろいろ聞きたいんですが、
よろしくお願いします。

156 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/09(土) 17:56:30

>>154
経験則に原理説明ってのは、非科学的だな。

157 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/10(日) 10:10:44

>>156 何を言っているやら。
ある面白い現象を見つけた何度か再現をとる、
そして再現性がみられるなら原理の仮説を立て、
仮説を検証できる実験系を構築し実験をし、
その結果から仮説が正しいかどうか考える。
サイエンスそのものだろ。

別に証明しなくていいっていってるさ、それは時間も金もかかる。
本業でなければそんな手間はかけれない。
でもなぜそうなるのか、仮説を立てるのは暇な時間にできること。
ちょっとした気晴らしみたいなもんだ。
それをここに書きこんでくれたら、
みんなであーでもないこーでもないとヨタ話ができる。

158 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/10(日) 12:50:19

あるタンパクのリン酸化部位の同定を目指しています。
そこでGST融合タンパク質を作成し、それを基質にしてKinase assay を行いました。
その融合タンパク質の全てのリン酸化可能な残基に変異を導入したにもかかわらず、
リン酸化されてしまいます。GSTがリン酸化されている可能性はありますか。
ほかに何か原因があるのでしょうか。どなたか経験のあるかたアドバイスください。

159 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/10(日) 12:56:46

リン酸化されたと結論したその実験の詳細を述べるべき。

160 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/10(日) 12:58:56

pGEXの空べくたーから発現させたGSTがリン酸化されることはよくある

Hisｘ６タグベクターに移せ

pQE９がお勧め

161 ：158：2006/12/10(日) 14:05:19

もう少し詳しく述べると、
目的タンパク質の部分配列35アミノ酸をGSTに付加しGSHビーズでタンパクを
精製しました。それを32P-ATP 存在下に細胞ライセートと混和し30度30分
インキュベートした後PAGEで展開しオートラしました。
ネガコンのGSTのバンドは検出されませんが、目的タンパクの野生型、変異型
ともに同程度の強さのバンドが検出されました。変異型は全てのSer,Thrを
Alaに変えてあります。Y はありません。
タンパクまたはペプチドの融合でGSTのリン酸化が促されるということはあるのでしょうか。

また、短い断片なのでGSTをタグに泳動で確認したいのですが、Hisで発現させると
Kinase assayはPhospho-celluloseを使ってスポットの検出になるのでしょうか。
よろしくお願いします。

162 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/10(日) 23:25:59

０分はどうかな

163 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/11(月) 07:43:28

Ｎａｔｉｖｅ－Ｐａｇｅ
発現させたタンパク質を変性させないで電気泳動するなんてどう？
非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥでもいいと思う。
同一ゲルでサンプルの処理方法を変えて流してみるというのも面白そうだね。
ＰＡＧＥで展開されたそうだがどのようなＰＡＧＥだったのかがわからないから何ともだけど。

164 ：158：2006/12/11(月) 09:53:32

>>163
少し分りにくいので教えてほしいのですが
泳動の条件を変えることでどのような結果が期待されるのでしょうか？

ちなみに、サンプルは数回ビーズを洗浄した後に
サンプルバッファーを加え還元条件でボイルしました。
電気泳動は１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥです。
クマシーで染色後、ろ紙上で乾燥させてからオートラです。

165 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/11(月) 10:08:32

GSTだけだと内在性キナーゼの親和性が低くてGST自体のSer/Thr側鎖も基質にならんけど、
Ser/Thrを潰したpseudo基質配列を融合したGSTの場合、内在性キナーゼとpseudo基質ペプチド
強く結合したんで、そのキナーゼが手近にあるGST自体のSer/Thrを無理矢理リン酸化したんだろうか。

166 ：158：2006/12/11(月) 11:17:52

ご意見ありがとうございます。
キナーゼの特異性はそんなものなのでしょうか？
それと、もしご存知なら教えてもらいたいのですが、
キナーゼ結合部位とそのリン酸化部位は近くかほぼ同じと
私も認識していますが、どれくらいの範囲なのでしょうか。不勉強ですみません。
BamH1を使ったのでそれがコードするSerが10アミノ酸ほど上流にあります。
これを潰してみようと思いますが、だめなら手を変えてみます。

すでに結構な時間を費やしたのでＧＳＴを捨てるのはおしいのですが、仕方ありません．．．
なにかアイデアがあればよろしくお願いします。

167 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/12(火) 11:06:07

俺は詳しくないのであまり真に受けないでほしいが、
>>160が経験者のようでよくあるとのこと、
彼のHisにしろ、というのはもっとも良さそうなアドバイスに見える。

あるいは可能性は低いがGSTフュージョンに結合する、
似たようなサイズのものが検出されているとか。
これを検証するにはライセートとP32ATPのみでリン酸化反応をし、
カイネースインヒビターいれてから、
あるいは酵素が働かない低温にしてから、
GSTフュージョンを混ぜるというのはどうか。

168 ：158：2006/12/12(火) 12:07:24

実際にいくつかの非特異的なバンドも見られますから、似たようなサイズのものを見ている
可能性は否定できませんね。いろいろコントロールをたててまたやってみます。
タグを換えるのも前向きに考えます。

169 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/12(火) 14:51:50

MAPK系を動かす受容体シグナルを入れようと思い、EGFRを過剰発現させたところ、
リガンドを添加していないのにMAPKが活性化してしまいました。
EGFRはどうやら局所濃度依存的に活性化されてしまうらしいのですが（1）、このせい
でしょうか？
だとすると、何かもっといい受容体はありませんか？
過剰発現してもまったく影響がなくて、リガンドを与えた途端にドラスティックにMAPK
が動き出すような。
できれば膜一回貫通型がいいです。

（1） Cell. 2006 Jun 16;125(6):1137-49

170 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/12(火) 15:22:50

PMAでもぶっかけたら？

171 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/12(火) 16:10:11

>>170
いやー、訳あって、膜を介する受容体シグナルでないとまずいんです。
EGFなら一番有名だからOKかな～と軽く考えていたんですが。。

172 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/12(火) 19:40:27

>>169
培地の血清は抜いたよね？

173 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/12(火) 20:38:44

インスリン受容体でもあかんのけ？>>171

174 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/12(火) 20:47:26

>>172
Yes, of course！

>>173
インシュリン受容体ってバックグラウンド低いですか？
だったらいい感じですが。

175 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/12(火) 23:11:29

>>174
大気中のヴィスファチンが結合するのでバックは決して低くないって
シモピーズが言っていたぞｗ

176 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/12(火) 23:26:41

過剰発現する必要はあるのか？

177 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/13(水) 10:07:21

おはようございます。

>>175
ヴィスファチンってなんだか分からなかったのでググってみましたが・・・
大気中・・・！？

>>176
それが、あるんです。。
詳しくは実験のコンセプトを口外できないので言えないんですが。

とりあえず、FGFRかTGFβRあたりでやってみようかと思ってます。
免疫系の受容体なんかもいいですかね？

178 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/13(水) 12:03:58

そんな研究はアーティファクトを報告するだけじゃないのか？

179 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/13(水) 13:52:42

>>178
生理現象を明らかにする研究ではなく、技術開発なんです。
もちろんアーティファクトはあっては困るんですけど。

180 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/13(水) 22:48:39

エタ沈用に
エタノールと酢酸ナトリウムをあらかじめ混ぜて保存しとくのってOK?
なんか害ある？

181 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/13(水) 23:26:38

>>180
エタ沈の原理を勉強してから出直して来い

182 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/13(水) 23:43:02

>>180
okだったはず。俺もやってるし

183 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/13(水) 23:47:41

酢酸ナトリウムが沈殿しないか？

184 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/13(水) 23:54:39

酢酸エチルができそうな気がしないか？

185 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/14(木) 00:17:34

俺も気になる
説得力のある答えきぼんぬ

186 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/14(木) 00:18:38

ナメクジの実験がことごとく再現できない

187 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/14(木) 00:31:36

粘着してるね。で、主犯は誰なの？

188 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/14(木) 00:38:29

まずは偉そうな>>181に答えて欲しいね。

189 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/15(金) 03:16:11

>>180
混ぜとくってのは普通だけど、それで放置はどうか知らん。
一日くらいなら大丈夫な気はするが、作り置き放置プレーは保証できない

190 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/15(金) 15:40:19

>>180
まーあれだ。
特に問題なさそうな気がするんだが、結局のところ

　　　お　前　が　人　柱　に　な　れ

ってことだな。
結果ﾚﾎﾟよろしこ。

191 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/15(金) 16:46:21

ネットでしらべたけど、イソプロとNaOAc混ぜると沈殿するけどエタノールの時は大丈夫らしいね
でも昨日プレミックス作ってシーケンスサンプルエタチンしたけど、フリーのdNTPに比べてシグナルのピークが弱かったんだが、、、、
1000bまでは読めてたけど、、、

192 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/15(金) 17:01:19

まぁその都度混ぜた方が無難ではあるよね

193 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/15(金) 17:21:27

プロフ見てくれた？プロフの写真からメッセージ下さいね
http://kurabujp3.nobody.jp/

194 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 00:25:19

というわけでさらしあげとく

>>181
>>181
>>181
>>181
>>181
>>181
>>181

195 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 00:52:25

初級の分子生物学実験の話題になるととても偉そうに痛いこと書き込む
奴が現れるよね。

196 ：182：2006/12/16(土) 01:59:25

>>191
イソプロは駄目なのか！
今まで普通に使ってて、沈殿も見たこと無いけど･･･。
明日、沈殿してるかしっかり確認してみよっと。

結局塩無しのエタノールもよく使うから、
混ぜてても場所とるだけで、あまり意味ないんだよな。
塩の量の計算もめんどくさいし、エタ沈するときにも
入れる量の計算が微妙だし･･･

197 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 09:29:18

塩入れなくても結構沈殿するからね
多少はﾛｽってるかもね

198 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 12:10:32

相違や最近はほとんどエタ沈してない。
ミニプレで磯プロ賃だから塩なんか半年ぐらい入れてないや。

199 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 12:18:23

もうすぐ卒論提出のおれに質問させてください。

おれは精巣を解離して、特定の細胞だけを極細のピペットで一個ずつ何百個か回収して、
その細胞で特異的に発現しとる遺伝子を見つけたいなって思ってる学部４年です。

それで、回収してきた細胞を固定して切片にしてＨＥ染色して、精巣の組織切片
と比較した上でちゃんと目当ての細胞だけを集めたってことを示す必要があると
思うんです。

でも細胞をシングルで（または数十個まとめて）固定すると収縮してしまって、
組織切片での像とかなり変わってしまうので困ってます。
回収した細胞を低融点ゲル（pH、浸透圧ともに調整済）に入れて、冷やして
固めてそれを固定→切片というふうにやってます。
固定液を色々変えてみたのですが、いい切片像は得られませんでした。

できる限り組織切片での像と同じような像をシングルの細胞でも得られるように
する為に、何かいい方法はないでしょうか。

200 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 12:31:05

>>199
血球細胞の回収に使うサイトスピンっていう遠心機を使って
スライドグラスに回収した細胞を貼り付けて染色しなさい。
免疫とか血液をやっているラボなら必ずあるから、探して借りなさい。
切片でやっている限りはきれいなデータにはならないよ。

201 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 12:42:51

>>200
レスありがとございます。サイトスピンですか、調べてみます。
その方法で染色したとして、何と比較すればいいのでしょうか。
組織切片に似たような像にはならないですよね？？

202 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 12:46:32

>>201
精巣の細胞だから核の形で分かるだろ。
これは切片だろうが回収した細胞だろうが基本的に変わらん。

203 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 12:47:00

俺はHE染色像でやる必要性がいまいちわからない。
HE染色以外にその周辺にある細胞と区別する方法が、
全然ないのだろうか？
モノクロとかとれていないのか？

204 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 13:11:55

>>202
確かに細胞懸濁液の状態でも核の形態から、たぶんこれが目当ての細胞だろうとわかるのですが、
確たる証拠が要るのではないかと考えています。
これまでに精巣構成細胞の同定は精巣の組織切片上でしか行われておらず、細胞懸濁液での
同定は例がありません（たぶん・・・）。ボスに見てもらっても、細胞の大きさ、核の形態
から言って「たぶん」間違いないだろうとは言われるのですが、ほんとうに間違いないのか
が気になるんです。

>>203
モノクロというとモノクローナル抗体ってことですか(知識なくてすいません。。）？
現在はまだ見つかっていないです。僕も分子マーカーがあればと思ったんですが、
ないのでやはり組織切片像に似せるしかないかなと思っています。

>>203

205 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 13:49:12

へー、精巣ってそんなレベルだったんだ。
すげー意外。

206 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 13:53:49

組織上での鑑別ではHE染色のみでやってるの？免疫染色ではなくても、
色々な染色法による染色性の違いなんかはないのかな。

207 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 13:55:03

>>205　はっきり言ってやれよ。もっと調べろ、と。

208 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 14:01:59

>>207
1970年代のような錯覚を覚えたｗ

209 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 14:07:20

なにそれ？

210 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 15:12:35

精巣の細胞って、歳暮細胞か？支持細胞だとしたらLeidig細胞かSerotri細胞か？
いずれにしても、マーカーが無いとはとても思えないなｗ

211 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 16:53:03

>>206
これまでHE染色のみでした。染色法を変えることは考えていなかったので、
ほかの染色法についてもしらべてみます。ありがとです。

>>210
第一精原細胞です。もしかしてマーカーあるんでしょうか。
調べ方が足りなかったかもです。すいませんもっと調べてみます。

212 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/16(土) 19:49:27

レプトテンとかザイゴテンかな

213 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/17(日) 16:11:54

214 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/18(月) 15:21:41

色々なタンパク（リン酸化タンパク含む）のウェスタンに使えるブロッキング剤を
探しているんですが、市販品でお薦めありますか？
今みたところこういうのがあるようなんですが、いいですかね？
http://www.funakoshi.co.jp/h_news/0410/041025_PCCs.php

215 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/18(月) 17:56:04

>>214
たっけー！
研究室お金持ちならいんじゃね？

216 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/19(火) 00:31:12

>>214
成分無調製豆乳

217 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/26(火) 16:45:04

制限酵素配列付きプライマーでのRT-PCRで取ってきた遺伝子がデータベースと違う部分が
ある上に、使う予定だったレアな制限酵素配列付きになっていました。

・ポイントミューテーションで予定外の制限酵素サイト潰す
・別の制限酵素サイト使ってPCRから

などが思いつきますが、どっちが楽でしょう？
また、ほかにもっと良い方法ありますか？

218 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/26(火) 17:15:10

>>217
TOPOクローニング

219 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/26(火) 19:09:17

オリゴ注文

220 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/26(火) 19:09:48

pcrの

221 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/27(水) 00:16:29

>>220
なんだそれ
気になるじゃねぇかｗ

222 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/28(木) 15:04:47

>>217
俺も最近はTOPOとGatewayばっか。
制限酵素なんて久しく使ってねえな。

223 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/29(金) 18:00:05

96welフォーマットで、均一で簡便にある程度質のいい、
プラスミドを抽出できるキットはなにかありませんか？
今使ってるpurelinkはムラがあるんだけど、培養方法が悪いのかな

224 ：223：2006/12/29(金) 18:36:04

ムラってのは、プレートの左か右が、ごそっとシーケンスで読めない
泳動してないからプラスミドがとれてないのかどうかしらんが
培養はTB培地、タイテックの水平偏心運動で1000rpmで16時間くらい
これは培養のせいなのかキットのせいなのか

225 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/29(金) 22:30:40

ここで聴くよりまず泳動しろよ、な。

226 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/30(土) 00:25:38

>>225
知らないんなら発言しなくていいよカスｗｗｗｗ

227 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/30(土) 00:39:07

カスはテメエだろが。
プラスミドが取れてるかどうかで、
可能性の範疇が全然違うことも分からんのか。

人には向き不向きがあるんだってことが、今日よーく分かったよｗ

228 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/12/30(土) 01:02:33

やったことがある人ならその辺も含めてわかるよ
知らないことにまで口だそうとするなよ低脳ｗｗｗ

229 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/04(木) 11:39:05

>217 亀レスだが
まず内部の制限酵素サイトが運良くメチル化で切れない状況になってないか調べる
駄目ならクローニングに使ったベクターのMCSの酵素が使えないか調べる
それでも駄目なら元々使いたかった酵素の2箇所の内側で切れる酵素を使って
インサート断片を二つに分けて次に入れたいベクターと3ピースライゲーション

230 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/06(土) 06:22:33

(質問1)
細菌からDNAを抽出するときの
100度で熱抽出のプロトコールを教えていただけませんか？
また、熱抽出するメリットやデメリットも
よかったら教えていただけますと幸いです。
(PCRのかかり具合が良い、など)

(質問2)
血液を
proteinaseK+lysisBufferで一晩放置後にフェノクロしてイソプロ抽出
してみましたけどなんか純度が悪いのかPCRがうまくかかりません。
血液からDNAを抽出するときって、キット以外の正攻法としては
どんなのがありますか？

231 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/06(土) 06:33:52

全血はあかん
遠心分離して血球だけにしてやってみ
それでもだめなら
ヘパリン入れて静置して白血球だけ取り分けて
やってみ

232 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/06(土) 10:55:45

学校で、豚の目と、鶏の脳の解剖したせいで、お肉があまり美味しく頂けなくなった。
目に剃刀を入れたときに出る液体や、頭蓋骨を外すときの音、豚さんと鶏さんの匂いがフラッシュバックする……

233 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/06(土) 11:36:08

>>228
わかるよ、じゃねえよカスｗ
シークエンスも満足に出来ねぇクズのくせによｗ

234 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/06(土) 12:25:59

>230 アルカリ法とBoil prepでプラスミド抽出する場合の比較かな？
Boil Prepの利点
・試薬が安価かつ1.5mlチューブで培養からDNA保存まで兼用できて経済的
・操作工程が短く楽チンで速い。まとめて作業するのに向くので手作業でも48サンプルとか余裕。

デメリット
・若干DNAが汚い（ABIのシーケンスキットはそのままでは
反応がかからないので、以下とは別の変法も作った）

PCRに関してはColony PCRでもおｋだし、DNAを十分薄めればかかると思う
漏れが常用してるプロトコルはこんな感じ
1) 1.5mlチューブでLB1.0mlでO/N culture(12h以上)
2) 遠心して培地をアスピレーターで吸って捨てる
3) 100μl STET + 10μlリゾチームでVoltex（完全に懸濁させる）して一呼吸
4) 35秒煮えたぎる熱湯の中につけて引き出す
5) 軽く2回程度shake(ゲノムDNAを軽く切断してペレットをコンパクトに)
6) 10分間最高速(14krpm程度?)で遠心
7) ペレットをつまようじにくっつけて除く
8) 110μl イソプロを加えて良く混ぜて一呼吸
9) 10分間最高速で遠心
10) 液をアスピレーターで吸って捨てる
11) 70%エタノール500μlを入れペレットとチューブ全体をwash
12) 5分間最高速で遠心
13) 液をアスピレーターで吸って捨てる
14) 乾燥後、40μl TE/RNaseに溶かして完了
試薬など ttp://cancer.ucsd.edu/howelllab/Mini%20Prep%20by%20Boiling.html

235 ：230：2007/01/06(土) 17:08:46

>>231
ありがとうございます。
全血はダメなんですね・・・。
なんかめんどくさいのでやっぱりキットでやってみます。
>>234
ありがとうございます。
アルカリ法しか知らなかったのですが、
論文読んでると熱抽出とか書いてあって単にラクチンかな、
と思ったので・・・。
プロトコルまでいただいて感謝です！
やってみます。

236 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/06(土) 21:49:03

最近の学生はプロトコールブック一つ読まないで
ネットの掲示板で質問するのか・・・・・

237 ：230：2007/01/08(月) 11:21:51

>>236
プロトコールブックっていうのがあるのですか？
上記のDNA熱抽出が載っている本があったら教えろや、カスが。

238 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 11:45:50

>>236
　
ま、ゆとり教育世代は＿＿揃いだから仕方ないんじゃない？ｗｗｗ

239 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 12:48:51

えー？>>237って本当に>>230？
もしそうならちょっと良くないよなって自分でも思うでしょう。
こういう人っていて当然なの？>>教員の方
それならやっぱり院にいる人ってちょっとへん。

240 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 13:17:58

なにいってんの？
最近の学生は年上にため口聞いたり掃除当番すっぽかしたりするような奴ばっかりだよw

241 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 13:31:30

うーむ。やっぱ一万人計画はダメだな。
教えてもらう人にカスとか、信じられん。

242 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 13:48:59

皆様釣りはスルーで。＜カス

243 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 15:37:48

ところで細菌培養のときに培地に均等に塗るためのあの先が三角形みたいになってるガラスのバーってなんていうんだっけか？

244 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 16:05:00

先が三角形みたいになってるガラスのバー
だろ

245 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 16:16:06

>>244
おいおい、嘘教えるなよｗ

正解は「上手く塗布できる棒」、通称「うまい棒」だよ

246 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 16:46:55

すぷれっだー
自作するんだよ

247 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 17:38:31

コンラージ棒って呼ぶ人もいるでよ

248 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 21:41:40

コンラージ棒、略して「こん棒」

249 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/08(月) 23:09:34

俺は自分の如意棒で塗ってるけどな。

250 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/09(火) 02:22:34

>>249
まき終わったらちゃんと火であぶって滅菌しとけよｗ

251 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/09(火) 12:13:21

>>249-250
弁当噴いたwwwwwww

252 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/09(火) 12:49:28

>>249
当然エタノールに漬けるんだよな？

253 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/09(火) 14:27:09

>>249
それはなんていう性病の検査なんですか？

254 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/09(火) 20:32:49

「のびろ、如意棒ォーーーーッッッッ！！　・・・・・・・ダメだ、のびねえ」

255 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/09(火) 21:04:58

>>252

ヘネシー・フェラ？
ナポレオン・フェラ？
VSOP・フェラ？

256 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/09(火) 23:18:06

>>255
男なら「まむし焼酎」

257 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 04:15:14

サザンのメンブレン（ナイロン）をリプローブしたいと思っています。
皆さん推薦のプロトコールありませんか？

258 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 04:19:47

PCRしろ

259 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 08:56:05

誰か、selectionするときのG418濃度教えてくれ
使ってる細胞はHela
kill curve作るのめんどくせえ

260 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 20:44:56

>>257
そんくらい自分で調べろｶｽ

261 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 21:36:28

マルチクローニングサイトの下流にccdBがくっついてて、セルフしたやつは
ccdBが発現して菌が死ぬというTAベクター（pCR-4 invitrogen）を使ってPCR産物を
そのベクターにインサートしたんだが、セルフが結構ある。。。orz

同じ経験あるひといる？？　ライゲーションの時に何塩基か削れてフレームシフト
しちゃったのか？？

262 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 21:40:25

>>261
なんでそんなベクター選んだの

263 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 21:46:48

>>262
GATEWAYも使ってない貧乏時代遅れラボのやつは恥書くから書き込まないほうがいいよｗ

264 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 21:50:35

シーケンスした？
プライマーダイマーとか短い断片が入ってんじゃねえ？

265 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 21:56:22

>>263
（´･∀･`）ﾍｰ
さぞかし貴方は最先端の研究をやってるんでしょうね。
どうせ俺は極貧ラボのヤル気の無いM2ですよ・・・orz

266 ：262：2007/01/10(水) 22:57:10

>>262
うちのラボにはＴベクターこれしかなかったんだよ、、

>>264
明日やる予定！　確かにダイまーの可能性はあるよなあ。ｻﾝｸｽ！

267 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 23:02:16

コロピーやって５ul位の液（100ngくらいのDNA量）を精製してシーケンスするための
良い精製キットある？
溶出量が多いと薄すぎでそのままシーケンスできないんじゃないかとおもうが、
コロピーの反応量増やさずに、良いほうほうがあったらおしえてちょ

268 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 23:18:25

これで決まりだと思いますよ。
ttp://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=574

269 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 23:18:49

>>267
Milliporeのやつ。
名前は忘れた。

270 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 23:23:42

>>268
これいいね。
でも塩が心配なんだが、BigDye ver3.1でABI3100

271 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 23:23:53

>>268
それって、クローニング前のPCR産物の精製に使うとヤバそうな気がするんだけど・・・

272 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 23:24:53

途中で送信しちゃった

>>268

塩が心配なんだが、BigDye ver3.1でABI3100 POP7で１０００ｂｐくらいは読める？

273 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/10(水) 23:28:57

>>271
シーケンス用って書いてあるじゃねえか。

274 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 00:16:24

>262
コンピにLaqI過剰発現株を使ってないか？
DH5αとかなら良いんだが、XL10Gold、JM109、JM110とかみたいに
LaqI^qの株ではLaqプロモーターでccdBの発現がブロックされるから、
どうしてもそういった菌を使うときはIPTGを塗らないといけない。

なお、laqIは通常の株でも多少は持っているためか、変異のためか、空プラスミドの菌は、
インサートの入ってるコロニーより生育の悪いコロニーとして出てくる

漏れはTAクローニングはうまくいったためしが無いのでKOD polymeraseで
回数ぶん回してPCR-Bluntにいれてるんだが、TAクローニングで聞く話としては
ケチってTベクターを薄めて保存->凍結再融解し過ぎ->Tが外れる
というのはあるな。あと、プライマー設計次第ではAハングになりにくいとか、
手際が悪くてAが外れるとか。周りでもうまく行ってるかどうかによる罠。

275 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 05:48:45

>>268
ＰＣＲ反応液１０μｌあたり０．１μｌでおＫ
BigDye ver3.1でABI3100 POP7でいいとこ９００ｂｐぐらいか

276 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 12:24:56

>>275
thanks
もう一つ質問
ローディングバッファーははいってると駄目だよな？

277 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 19:37:50

制限酵素のオマケについてくるようなローディングバッファはダメ
教科書通りのローディングバッファもダメ
酵素反応を阻害しないローディングバッファを自作しろ

278 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 21:47:43

PCR反応に一緒に入れられるローディングダイ（バッファーじゃないだろ？）ならＯＫ

279 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 21:58:51

そういえばうちの修士にも、試薬は何でもバッファーって呼んでる奴がいる。

280 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 22:24:41

>>279
ｳﾁにもいる。どうやら
「溶液」＝「バッファー」
だと思ってるっぽい・・・
面白いから放置してるけど。

281 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 22:30:38

"loading buffer" の検索結果約 769,000 件
"loading dye" の検索結果約 180,000 件

282 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 22:47:42

世の中、馬鹿の方が多いってことかｗ

283 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 22:58:14

"loading buffer" の検索結果のうち日本語のページ約 663 件
"loading dye" の検索結果のうち日本語のページ約 302 件

"loading buffer" の検索結果約 769,000 件
"loading dye" の検索結果約 180,000 件

"loading buffer" の日本語のページ率＝０．０８％
"loading dye" の日本語のページ率＝０．１６％

ということで、溶液をバッファーと呼ぶのを勘違いだと思ってるのは、
辞書で直訳して英語を勉強したバカだ
ということです。

284 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:19:43

はぁ？ｗ
多数決で正解が決まるなら、サイエンスは必要ないだろ。
そもそもこの世の中、利口な奴より馬鹿が多いのは当たり前じゃないのか？

緩衝作用のない溶液のどこがバッファーだって言うんだよ？ｗ

285 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:27:02

まあそう言うな。
ゆとり世代がネットで検索ができるようになっただけでも良しとしようよ。

286 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:31:52

>>284
統計はサイエンスじゃないとでも？w

287 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:32:01

約 663 件、約 302 件って物言いだけで、こいつがどういうレベルかは十分わかるだろｗ

288 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:33:13

>>286
誰がそんなこと言ってるんだよ、このカスめがｗ

289 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:33:22

>>284
それに割合で物語ってるのに多数決ってｗ
中学くらいの数学勉強しなおしたほうがいいと思うよ

"loading buffer" の日本語のページ率＝０．０８％
"loading dye" の日本語のページ率＝０．１６％

290 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:33:46

溶液はもちろんbufferじゃないけど、例えばDNA用のだとEDTA入っているし、bufferといって
差し支えないだろうな。その辺分かってればいいんじゃない？系によって違うけどそもそも
電気泳動だからpH変わってしまうのは問題だしね。

291 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:34:18

>>287
googleからコピペしただけですよ？低脳ｗ
検索エンジンくらい使い方覚えろよｗ

292 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:34:27

>>286
そのデータは、馬鹿が利口より多いってことを統計的に示してますよ、確かにね。

293 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:35:27

ただでさえ初歩的な質問と答えばかりのスレッドなのに、そんな
くだらないことでもめてさらにレベルを低下させるのはやめろｗ

294 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:36:36

>>291
日本語の「約」ってのがどういう使い方をすべき言葉か、
お得意のGoogleで確かめてみてはどうか？ｗ

295 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:40:07

>>294
googleってのは、検索結果に偶然性があって、同じ時間に同じ検索単語検索しても、
結果の数がわずかに変わるときがあるから、
「約」を必ずつけているのであるから、何の問題もありませんが？

論破されまくりですね。あなたｗ

296 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:40:09

このスレを見ている人はこんなスレも見ています。(ver 0.20)
一緒に行く友達がいない人同士で食べ放題に行くオフ [定期OFF]

友達がいないからぐぐって面白いこと言ってるの？
それとも友達がいないからくだらないことに突っ込み入れてえらそうにしてるの？

297 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:42:42

>>296

おいおい、、、
それって自分の履歴を表示するだましソフトだけど、
本気で言ってる？

298 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:42:43

>>295
論破したつもり、と日記にでも書いとけｗ

299 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:44:05

で、緩衝能を期待していないのにバッファーって、英語とか日本語とかの問題なのか？

300 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:45:08

>それって自分の履歴を表示するだましソフトだけど、
>本気で言ってる？
www

301 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:45:18

2chなんかで必死に論破するより、一報でも多くﾍﾟｰﾊﾟｰ書いた方が良いですよ？

302 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:48:29

どうやらくだらないことにつっこんで偉そうにしてる方が友達いないみたい
だね。

303 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:48:36

全くだ。ただし、論文のMaterials and Methodsにはloading bufferとか書かない方が良い気がする。

304 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:55:32

なんとentrezでも"loading buffer"40にたいして"loading dye"37でした

305 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/11(木) 23:59:28

今北産業だが>>283は、緩衝液かどうかとは無関係に実験に使う試薬溶液を
バッファーと呼ぶことは正当だって言いたいのか？まさかそうなのか？
いくらなんでも、そんなことはナンセンスだろ。たとえGoogleの検索結果がどうであれ。

306 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/12(金) 00:01:04

>>304
世の中にはloadingに使われる緩衝液だってあるよ。
それと、緩衝能のないloading dyeをloading bufferと呼ぶこととは別問題だよ。

307 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/12(金) 00:29:22

激しくどうでもいい

308 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/12(金) 02:53:14

"gel loading buffer"を商品名にしてるメーカーが
いくつかあるようだな
インビトロとかさ死熊有怒立地とかさ。
だから商品名や登録商標やその略号が一般名を駆逐しつつある
例ってことでいいんじゃない？
loading buffer = ホッチキス
loading dye = ステイプラー
ってことで・・・

藻前らだってギルソン純正品じゃなくてもピペットマンって
呼ぶし，グライナーの微量遠心チューブのことも「エッペン」
と呼ぶだろ？小型簡易型卓上遠心機はどこのメーカーの品でも
「チビタン」でいいだろ？
＃ところでうちでは15mlと50mlのコニカルチューブは両方とも
「ファルコン」って呼ぶんだが、それでいいのか？

309 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/12(金) 08:37:35

俺はいつも「あの青いの」って言ってる

310 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/12(金) 21:09:05

というわけで２ｃｈが閉鎖しそうです

311 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/15(月) 12:16:23

ageさせてください。
3.5kbのcDNAをクローニングしたくて、種々の都合上でN末1.7kbとC末2.0kbに分けて
サブクローニング。このN末とC末のフラグメントを連結したいが制限酵素サイトがない。
N末とC末の重なりしろは200bp。

教授は制限酵素使わず２つのフラグメントをプライマーなしでPCRかけると連結する
（重なり部分でrecombinationみたく）というが、やってみても上手くいかない。

質問はこのストラテジーは普通に出来るものなのか？と、
もし出来るなら気をつけるポイントを教えて欲しいです。

312 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/15(月) 12:27:17

もうちょっと工夫したPCRがあるよ
PCR fusionで検索しろ

313 ：311：2007/01/15(月) 12:35:42

>>312
即レスありがとう。でももう少しヒントを。。。

314 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/15(月) 12:40:31

ﾋﾝﾄ.google

315 ：博多っ子：2007/01/15(月) 12:54:41

唐突ですみません。
亜鉛（ZnCl2）で阻害されるプロテアーゼってありますか？
どなたか教えてください。

316 ：311：2007/01/15(月) 13:33:47

作業入ったから席空けてたけど、ぐぐったら線虫の遺伝子に
GFPをPCRでくっつけたpaperまで辿り着いたわ。今から読む。
thx!! >>312, >>314

317 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/15(月) 16:26:01

ちゃんと調べたみたいだから教えてあげると，
http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/3001.html
ここの方法が一番簡単だよ

318 ：311：2007/01/15(月) 20:31:14

やーありがとう。のりしろを挟んだ部分のPCRでバンド確認できた。
普通のPCRにテンプレート２つ入れるだけで良かったんだね。簡単すぎてビビった。
最初出なかった理由はサイクル数低かったのと、教授の指示したステップはむしろ
不要だったことかな。でも本当は全長取らなくちゃいけないので待ちぼうけです。
釣りバカ見たかったな…。

>>317
使えそうなサイト。さんきゅ☆

319 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/15(月) 22:52:20

もうやったのかよっ

320 ：博多っ子：2007/01/16(火) 00:30:41

亜鉛（ZnCl2）で活性が阻害されるプロテアーゼって知ってますか？
どなたか教えてください。

321 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/16(火) 01:00:32

はぁ？聞こえんな

322 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/16(火) 02:32:54

>>321
うはっ！

323 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/16(火) 13:41:26

Znをキレート剤で奪うと活性が阻害されるプロテアーゼの間違いじゃなくて？

324 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 13:28:03

自分は卒研発表会を目前に控えた学部４年生です。

約１年間自分なりにがんばってきたんですが、この時期になっても卒研で出せるような
データが出ませんでした。ここ２ヶ月ぐらいはホント鼻血が噴出すぐらい必死でやった
んですが、ダメでした。で、そんな自分を見かねたのか、今日研究室のボスから今まで
自分がやってた実験を代わりにやってやる的なことを言われました。
ボスが代わりにやったからといって満足のいくデータが出るという保障はないのですが、
もし仮にデータが出たとすると、卒研発表会ではそのデータを使ったプレゼンをすることになります。
でも自分としては、他人に（ボスに）やってもらって出たデータを、さも自分がやりました
というような発表はしたくないのです。
こんな考え方は幼稚でしょうか？自己満足でしかないんでしょうか？

325 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 13:52:27

卒研なんて、研究の背景、問題点、手法、今後について
をきちんと話せれば八割できたもんだろ。
実際にやったことはうまく行ったりいかなかったりする。
ダメだったときはその原因を推測して、改良する方法を考えたり、
別の手法を使ったりする予定、としたらいい。

あ、さも自分がやったようにいうというのはダメね。
自分もやったけどうまく行かず、誰々がしたらこうなって、
ちがいはどこがどうで、と説明する。
実験やっている時よく横で見せてもらい。

326 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 14:00:02

>>324
俺も全然データでないよ。
お互いベストを尽くそう。
>>325
私も参考になりました。ありがとうございます。

327 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 15:05:22

卒研なんて、論文にならないようなどうでもよいデータでＯＫでしょ？
それすら出せないって、言葉悪いけど、あなたによっぽど問題があるんだと思うよ。（まあ研究にかなり向いてないってこと）

ボスがやってくれるっていってるんなら、やってもらえばよいと思う。
ボスも心配なんだよ。

328 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 16:19:22

まぁその可能性もあるが、そもそも達成不可能なテーマだったという可能性もある。
とはいえ、ボスがやったらあっさりできちゃった、というなら話は別だけど。

329 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 18:49:27

乳鉢ってオートクレーブ可能？
可能ならアルミに包んだ方が良い？

330 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 20:07:27

>>328
そこですわ
ボスがやったらあっさり

331 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 20:18:11

>>329

可能です
乾熱滅菌も大丈夫

332 ：329：2007/01/18(木) 21:23:31

>>331
ありがとう。

333 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 22:28:03

>>330
おまw

334 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 23:04:25

嫌みいうつもりじゃないけど、ここで聞かなくてもわかるだろうに。
乳鉢がどうやって作られたか知っていたら。

335 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 23:08:44

>>334
乳鉢の作り方…。
や、やはり豊満な乳を持つ女子の胸で型を取ったりするのか…？（｀・ω・´）ｺﾞｸﾘ

336 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 23:12:38

ボスがやったら
あっさりＤＮＡとれた
ボスがやったら
あっさりＰＣＲ増えた
ボスがやったら
あっさりシーケンスできた
ボスがやったら
あっさりコネクトできた
ボスがやったら
あっさりコンセンサスの向きがそろった
ボスがやったら
あっさりアライメントできた
ボスがやったら
あっさりＡＭＯＶＡ解析できた
ボスがやったら
あっさり論文書けた

337 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/18(木) 23:28:12

ボスがやったら
あっさり有意差が出たｗ

338 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/19(金) 00:49:22

ボスがやったら
あっさりネットワークが構築できた

339 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/19(金) 01:35:22

ボスがやったら
欲しいバンドが思いのままに出るようになった。

340 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/19(金) 01:40:51

ある抗体に対する抗原を組織から同定する場合

2D電気泳動×1枚→PVDF膜でウェスタン→メンブレンのスポットを切り出し

2D電気泳動×2枚→片方をウェスタンし片方を銀染色→ウェスタンに対応する位置をゲルから切り出し

という2つの方法が考えられますがどちらが楽でしょうか？

341 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/19(金) 02:00:14

物取りなんていまどきやる奴の気が知れない
任期が切れるぞ

342 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/19(金) 11:53:06

●キャシャーン造ろうぜ！人造人間キャシャーン。あと「ほしのあき」を
１０万人！全国の風俗店に着払いで発送してください。

343 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/19(金) 15:53:52

論文とかでウェスタンのところで
「１レーンあたり何マイクログラムのタンパクを
SDS-PAGEする」って書いてあるのですがどのように
調べてるのでしょうか。

344 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/19(金) 16:07:53

普通に定量したんじゃないの？

345 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/19(金) 23:17:38

>>341
手を広げすぎたので、いまは物取り（ラボで）と公募書類書き（自宅で）しかやることがないんです。

346 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/20(土) 06:18:18

●２ｃｈやってるじゃん

347 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/20(土) 15:38:03

>>343
まさか、お前のラボには分**度*も置いてないのかっ！（敢えて伏字

348 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/20(土) 16:43:33

分度器のことかー！！

って冗談は置いといて、地方の貧乏ラボなら置いてない事もあるだろ
(うちの隣のラボとか。いっつも借りに来てUzee)

349 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/20(土) 16:47:40

ブラッドフォードのことを念頭に。
どうせBSAとかでスタンダードとるんだから、
一連のBSA希釈と一緒にサンプルとったら簡易測定は出来そうだな。

350 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/20(土) 17:25:35

>>348
そうなのか・・・だったら、うちの大学は恵まれているんだな・・・
ソレなんて、一人一台あるし・・・

もしかして、ＮＭＲが置いてないとか、X線解析機とか、スパコンとか全くない大学とかもあるんかな・・・

351 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/20(土) 22:57:27

大学レベルは知らんが研究室レベルでなら変でもない。

352 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/21(日) 13:27:17

●分度器でほしのあき測ったけど？どの角度の事？俺の研究室じゃこれ以上
無理よ。

353 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/21(日) 15:43:37

>>350
私大ならある方が珍しい
地国でもない場合はない

まあ、分子生物学において必要不可欠なものじゃないし

354 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/21(日) 15:58:10

しかし一人一台はさすがに多いな

355 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/21(日) 16:08:17

置く場所がねーよw
俺は地方の国立だけど、研究室ごとに1,2個だな。

356 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/21(日) 16:11:34

ＮＭＲが１人１台？すげー

横浜？

357 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/21(日) 16:20:04

NMRの話じゃねえだろw

分度器の話だろ、常識的に考えて。

358 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/21(日) 16:40:05

NMRを一人一台か･･･

どれだけ大きな研究室なんだ

359 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/21(日) 17:51:24

分度器が１人１個か…

どこの小学校だろう？

360 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/21(日) 20:04:35

●もう駄目だぁ。俺には何処の角度かわかんねぇ...ほしのあき発送するね。
みんなで計ってね。実験失敗あるよ...ＮＭＲって何？

361 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/21(日) 22:31:13

ICD-10 F80.0

362 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/22(月) 16:00:51

普通のcDNAライブラリー作成って、
今の時代でもラムダZAPIIのGigapackGoldIIIがベストなの？
それからmRNA精製はOligotex?

363 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/22(月) 16:08:32

http://dblog.jp/RExCHAN/

364 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/22(月) 17:11:44

電気泳動の画像をPhotoshopで補正したいと思います。
レーンが乱れてる（スマイリング＋ゲル全体のゆがみ）んですが、
どうやって補正すればいいでしょう？

365 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/22(月) 20:11:23

ゲル濾過で分子量の推定をしようと、以前書いた検量線に照らし合わせたら、
出るはずの位置と全く別の位置に出て困っています。
具体的には分子量4,000のタンパクが、分子量10,000前後に出ます。
ちなみに多量体にはなりそうもないタンパクです。

検量線を書いた条件との違いは、KCl濃度を2Mに変更した点くらいしか思いつきません。
先輩は塩濃度がゲル濾過の溶出に影響を与えるとは聞いたことがないそうです。
ただし、非常識な塩濃度なので、そういうこともあるのかなと。

塩濃度が非常に高いと、こういうことってありますか?

366 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/22(月) 20:33:47

溶液条件が同じ状態で検量線引かな…

367 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/23(火) 15:26:30

>>366
了解しました。
どうもありがとうございました。

368 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/25(木) 00:17:54

タンパクの染色について質問です
SDS-PAGEの後、一度全タンパク質を染色→脱色してそのゲルでウェスタンを行いたいのですが、この場合はどのような染色法が使えるのでしょうか？
予算や感度の問題などありますのでいくつか挙げてくれれば幸いです

369 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/25(木) 00:24:50

>>368
目的は？膜に移してからならポンソーSで染められるよ。普通にウエスタンに使える。
てか、スレ違いだろう？

370 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/25(木) 22:05:30

TAクローニングしたら同じ領域が欠失したプラスミドしか取れてこなかった。
やる気あるのか、大腸菌め！

371 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/26(金) 01:55:52

>>370
ヒント：ダイレクトシーケンス

372 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/26(金) 23:43:51

だいぶ前にこの前のスレで
誰かが金属製？のウォーターバスに繁殖してる茶色のミズカビの駆除法を質問していたと思います

自分も似たような問題があります
20リットル以上に上る水をいちいち取り替えてカビを除去するのは大変なので
メチレンブルー、トルエン１滴、十円玉とかいろいろ方法があった最後のほうに
ある薬剤を投入するのがよいというレスがあったみたいですが
それがなんなのか・・・dat落ちしてしまいgoogleでも検索できません

どなたかご存じの方お答え下さればありがたいです

373 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/26(金) 23:45:05

塩酸です

374 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/27(土) 13:08:00

出来るのから試したら？

375 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/27(土) 19:48:19

フェノール類の排水基準：　5mg/L（下水道法）、1mg/L（特定事業場）

トルエン１滴：50mg
ウォーターバスの水量：10L

このまま流したら排水基準オーバーだよ。

ttp://www.okayama-u.ac.jp/user/ace/haisui/system/haisuikijyun.htm

376 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/27(土) 20:26:03

>>372　これかな？
>>903
WAK-chemie
MEdical GmbH
っていうドイツの会社の。
高いけど効果は抜群。

377 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/27(土) 21:58:37

ハイター最強

378 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/27(土) 22:56:34

確かに、トルエンは効くけど、環境には良くないね。

次亜塩素酸の方がマシかもね。

379 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/27(土) 23:01:32

そもそもなぜカビを除去しなければいけないのか
観葉植物の一緒と思って共存すればよいのでは？

380 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/27(土) 23:10:56

ぬがー、4年目にして初めてRNA分解された
帰りに変なおっさんにいちゃもんつけられるしホント今日はついてない日だ

381 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/27(土) 23:18:15

培養室のインキュベーターのカビはちょっと気持ち悪いぞ。

コンタミした事はないが・・・・。

382 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/27(土) 23:35:43

うちの研究室なんか廃液ビーカーやシンクの壁とかでカビが大繁殖

細胞つかってないからコンタミしてるかどうか分からんが喘息持ちには辛いぜ

383 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/28(日) 00:00:47

廃液はビーカーよりメディウムびんとかの方が良いと思う。

384 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/28(日) 13:11:02

>>382
カビが生えるなんて生易しい廃液だね。

385 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/28(日) 13:59:56

そのカビで、有害な物質を浄化する特許が取れるかもしれない。土方からのわらしべ長者は
近い！

386 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/28(日) 14:15:21

後のナウシカである。

387 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/28(日) 14:29:40

うちの研究室の廃液はこんな感じかな。
全部混ぜてるみたい。

アジ化ナトリウム
クロロホルム
フェノール
メタノール
ドデシル硫酸ナトリウム
ホルムアルデヒド
メルカプトエタノール
グアニジンチオシアネート
エチジウムブロマイド
アンピシリン
テトラサイクリン
クロラムフェニコール
シクロヘキシミド
ペニシリン
リファンピシン

388 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/28(日) 15:33:20

抗生物質って廃液として処理しないと駄目なの?

389 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/28(日) 16:21:14

法的にはどうだか知らないが耐性菌を無用に増やさないためのマナー

390 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/28(日) 16:44:29

>>389
やっぱそうなのか。
俺は研究室に入りたてのころそんなことを思っていたが、すっかりそんな純粋な気持ちを忘れ去ってしまったorz

391 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/29(月) 20:38:41

>>390
取り敢えず、全部オートクレーブ掛けてみれば？

392 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/29(月) 22:21:46

カナマイシンとかちゃんと失活するかな。あれ大目に入れればオートクレーブ可ってきいたことある。

393 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/30(火) 00:15:16

大腸菌のタンパク発現で封入体を調製してるんですが

破砕→界面活性剤で不要タンパクを可溶化→超遠→ペレット(封入体)回収

という流れで、最後のペレット回収でペレットが超遠心管にへばりついて取れません

ボルテックスでは全く無力で、超音波かけたら取れるかもしれませんが超遠心管に超音波をかけるのは気が引けてしまいやっていません
結局いつもはスパチュラで掻き取って回収してるのですがそれだと面倒くさいしスパチュラにへばりついてロスする分もあるしであまりいい方法とは思えません

皆さんはどのような方法で回収しているのでしょうか、ご教授お願いします

394 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/30(火) 00:18:22

ホモジェナイザーなる道具を使ってる。
というか封入体なら超遠心でなくても1万Gあれば十分沈殿にいくと思うけれど。
そっちならボルテックスとかで十分懸濁出来るはず。

395 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/30(火) 00:28:04

超音波で遠心管にたいしてそこまでダメージないだろ

396 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/30(火) 00:52:33

すばやい回答どうもです

>>394
プロトコル本に2万5千Gとあったのでずっとそれでやってました
とりあえず何Gぐらいで落ちるか調べてみたいと思います

>>395
超音波かけても大丈夫と思いますが万が一が怖いのでちょっと遠慮します

397 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/30(火) 20:08:11

96wellで細胞を培養したいと思っています。
培養中に無菌的にwashをするステップが何度かあるのですが、
おすすめの容器やマニホールドなどはありませんか？
また、上記は接着細胞で考えているのですが、浮遊細胞でも
同じようなことをしたい場合、どういった容器が使えるでしょう？

398 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/30(火) 21:14:56

>>396
超遠心のときかかる力と超音波でかかる力と、どっちが大きいと思ってる？

399 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/30(火) 22:12:49

力の質が違う
不安がっているならやらなくて正解です
失敗しても責任取ってくれませんからね
ここの書き込み者は

400 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/31(水) 00:00:24

超音波かけないで解決するならそれでいいだろうに

401 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/31(水) 09:37:08

バッファー入れて氷上で半日放置すれば柔らかくなるよ。

402 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/31(水) 09:45:56

>>399
失敗しねーよ
６年間超音波で破砕してるが、一度も遠心管が砕け散ったこと
なんてない。
１０年続けりゃ砕ける日も来るかもしれないが。

403 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/31(水) 10:15:27

気を取り直して次の話題へ
↓

404 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/31(水) 13:31:39

あのー、>>397は…

405 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/01/31(水) 23:18:24

気を取り直して次の話題へ
↓

406 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/01(木) 16:52:21

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407 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/01(木) 23:08:31

実験大好き私

408 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/07(水) 04:16:34

ところで皆さん、細胞を遠心するときってどれくらいの速度でまわしてます？
普通の遠心機だとＧの表示は無いので回転数で決めますよね？

409 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/07(水) 10:50:08

>>408
計算するんだよ。

一度、1500 rpmくらいで回してみ？
保証はせんけど、そんなもんでとりあえず、挑戦。

410 ：408：2007/02/07(水) 11:42:27

どうも。
実験を始めて１５年ほどになりますが、その間ずっと１５００～１８００で回してきました。
もちろんHeLaなどのごく普通の丈夫系な細胞の場合です。
他の細胞の場合は「細胞による」、例えばES細胞だと１０００に落としたり。

ところが最近来たラボの人に「哺乳類の細胞は１０００で回すのが常識なんだよﾌﾟ」
なんていわれたのでちょっとムカつくというか驚くというか。
「細胞によるんだよ。」って言っても聞く耳持たず。
ひょっとしたら俺が知らなかっただけなのか？とも考えて質問したということです。

411 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/07(水) 14:55:00

ま、細胞が元気のまま回収できればいいんだし、喧嘩しないで・・・。

412 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/07(水) 21:35:39

遠心機のローター半径と、細胞の平均密度と、細胞懸濁液の粘性係数が必要

413 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/07(水) 22:02:58

面白いやつだな、ロータの半径とか無関係に1000rpmでまわす意味を聞いてみたら？

414 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/07(水) 22:21:43

何のために論文やプロトコル集で
（数字）×g
って表記してるのか分かってるんだろうか、ソイツ・・・

415 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/07(水) 23:32:05

ところで、この×ってどう入力してる？

416 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/07(水) 23:40:50

「さ」のところのxだな。小文字で。てか、それ以外にあるかな？全角文字とか御法度だよ。

417 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/08(木) 00:29:50

ワードだとさ
プルダウンメニューから
挿入→記号と特殊文字ってあるだろ

418 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/08(木) 00:34:03

>>413
いちいち考えるのが面倒だから、培養室においてある同じような
大きさの遠心機で細胞を落とすときは1000rpmでいい。

419 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/08(木) 00:40:13

いちいち考えなくても、一度考えれば十分だよｗ

420 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/08(木) 01:34:10

それを言うなら一度やってみて大丈夫ならそれでいいということになる。

421 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/09(金) 01:04:54

ちょっと聞きたいのだけれど
サンプルを免疫沈降後に凍結保存ってできる？

422 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/09(金) 01:26:39

>>421
ものによりけり

423 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/09(金) 04:10:42

>>421
何に使うかも大きいね。
ただ単にウェスタンしたいだけならSDSローディングバッファー放り込んでおくと長い間安定だよ。

424 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/09(金) 14:15:34

デュアルルシフェラーゼアッセイで、レポーターアッセイに使うホタルルシフェラーゼと
レファレンスとしてのウミシイタケルシフェラーゼ（phRL-TK）を用いています。
MAPK経路でレポーターが発現する系なんですが、EGFで刺激すると、レファレンスの
ウミシイタケルシフェラーゼの発現も増加してしまい、RLUが思ったよりかせげません。
よいアイデアはありませんか？

425 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/11(日) 00:41:06

実験でうまくいかないというわけではありませんが、ぜひ皆様の知恵をお貸し下さい

いま二次元ウェスタンを行っているのですが、泳動してブロッティングする前に泳動状況を確認するためタンパク質の染色を行いたいと思うことがしばしばあります
ブロッティング後にCBB染色という手は予算の都合上ニトロセルロース膜しか使えないので出来ず、同じく高いキットも買えません
同じサンプルを2つ流すという手もあるのですがこれも予算の都合に加えサンプルが貴重なのでこれも出来ません
染色は出来ればCBB以上の感度が欲しいですがブロッティング効率を優先したいところです

注文が多くて難しいと思いますが貧乏研究室の学生に愛の手を差し伸べてください

426 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/11(日) 00:47:03

>>425
感度はそれほど高くないけど、ポンソーSは駄目？
CBBに少し劣るくらいだけど。

427 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/11(日) 00:47:52

感度は低いがポンソーで染めるのは良くやるよね。

428 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/11(日) 00:48:27

あ、カブったｗ

429 ：425：2007/02/11(日) 01:02:14

>>426-427
回答ありがとうございます
ポンソーは試した事がないですが、元々流してるタンパク量が少ないのでCBB以下の感度ではキツイです
正直CBBでもメジャーなスポットがポツンポツンと見える程度であまり良くないです

430 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/11(日) 01:25:57

1/4くらいを別に流すとか。

431 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/11(日) 13:40:56

pvdfってそんなに高いの？

432 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/12(月) 22:01:38

培養液のO.D.値の測定について質問です。
論文やプロトコール本等に通常書かれているO.D.値は、
光路長10mmキュベットを用いて測定された値なのでしょうか？
Φ18mm試験管等の異なる光路長で測定した値は、
やはり異なるのでしょうか？

433 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/12(月) 22:11:36

>>432
実験の原理も知らん馬鹿学生はさっさと学校やめて就職しろ

434 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/12(月) 23:02:04

>>433
おまえ、自分の人生が終わってるからって、未来ある若者を
不幸に引きずり込むなや。

435 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/12(月) 23:05:12

何か良く読むと釣りにも見えるが...

疑問に思ったら、実験、実験。

436 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/12(月) 23:29:13

>>433
吸光度は光路長と濃度に比例するんで、変わってしまいますよね？
論文等に書かれている値は10mmと取っていいのでしょうか？

>>434
すでに明るい未来は無いので大丈夫です！

>>434
確かに実験した方が早いですね。
ただ、同じ光路長でも違う機械で測定すると、結構違ったり…
これは機器の個体差なのか、ぶっ壊れてるのか…
少なくとも機器の保守はひどい状況です。

437 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/12(月) 23:33:59

細胞やコロイドのような散乱が入ると、受光部とセルの距離、フォトマルの構成で見かけの吸光度は変わる。
測定する物質が均質な溶液で純粋に特定波長の吸収のみで、散乱がないなら、
機械を変えても吸光度同じ建前。

438 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/13(火) 00:12:55

>>436
慣習的に光路長10mmの値で表すことになっている。
それから、細かいことを言えばO.D.≠吸光度。
>>437さんが書いてるように、O.D.は散乱等を含み得る値。

439 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/13(火) 01:13:13

>>437-438
ありがとうございます。やっぱり10mmだったんですね。
研究室に入ってから、何も考えずにΦ18mm試験管でばかり測ってたんですが、
どおりで論文等に出てくる菌数よりも少ないわけですね。
今度から10mmで測っていこうと思います。
しかし、うちの研究室はボスも含めて駄目だ…
誰もそんなこと気にしないし、ボスはΦ18mm試験管でO.D.と菌数測って、
やけに少ないなーなんて言ってるし…

440 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/13(火) 01:58:32

18mmの試験管で検量線引いたのなら、18mmの試験管の値を使ったら？

441 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/13(火) 02:06:43

その機械は1cmの値に換算しないの？

442 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/13(火) 02:36:01

>>440
18mm試験管のO.D.値に対する10mmのO.D.を測定しておいて、
場合によって10mm値、18mm→10mm変換値を使い分けます。

>>441
換算しないです。超アナログですし･･･
この間換えランプを注文したら2個で1ﾏｿ以上･･･

ところで、皆さんは10mmキュベットに移した菌液は、
そのまま捨ててしまうのでしょうか？
もったいない気もしますが、無菌にするのも難しそうですし。

443 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/13(火) 16:56:22

>>439
＞誰もそんなこと気にしないし、ボスはΦ18mm試験管でO.D.と菌数測って、
＞やけに少ないなーなんて言ってるし…

18mmで測ったら「やけに多いなー」にならないか？

444 ：あだち：2007/02/13(火) 17:15:41

　「勝手メール」失礼します。

　　■□■□■□■□■　　「疲れに勝つ！」　 ■□■□■□■□■　　　　　　　　　　

　　　　　肉体の疲れは「時」が解決してくれます。　よくたべてよく眠ることです。
　　　　しかし、魂の疲労はその効果をだし得ません。
　
　　　　　　　　　　　魂の元気回復はただ単純法則に従うこと！

　　　　　　人を元気づける者は、自分も元気をもらえる、という法則です。

　　　　　この法則に従うと「あなたは新たなる力を得、ワシのように翼をはっての
　　　　ぼることができる。走っても疲れることなく、歩いても弱ることはない」
　
　　　　　人のからだには、生体リズムというものがあります。生きる喜びをもつ者
　　　　には、生きる力が与えられ、全てを悪く考える人には、悪いリズムが連な
　　　　っていきます。

　　　　　さて、生体リズムをどうとり入れるかです。きつい時に人に手を差しのば
　　　　すと、走っても疲れる事はありません。やってみる事です。

　　　　＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　安達三郎

あなたも「新約聖書」ローマ人への手紙・７章をどうぞ、生きる「力」が与えられます。　　　

445 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/13(火) 19:47:44

>>424
(・∀・)人(・∀・)

私も同じことで詰まりました。Firefly、Renillaがそろってactivate
あるいはsuppressされて、ratioをとると…orz
internalのベクターにp(h)RL-nullを試してみましたか？私の時はそれで少しは
マシになった記憶があります。ただやっぱり多少はRenillaの方も影響を受けるので
あくまでもTKとかSV40よりマシ、という程度ですが。。。
やはりベクターのバックボーンに転写因子が結合して、ある程度影響が出るんだろうか
(だからnullでも光るんだろうけど)、と漫然と考えてましたが。

くわしい人アイディアplz

446 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/13(火) 23:23:12

竹石圭佑…中国で生まれ名古屋で育つ20歳。小学生を狙う強姦魔

447 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/13(火) 23:51:40

>>443
O.D.に対して菌数が少ないと言う意味です。
O.D.が同じなら光路長の長い18mmの方がより薄いはずです。

448 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/14(水) 00:05:32

なんていうか、
A=ωｃLという公式ひとつ覚えていれば、こんなめんどうにはならなかったのにな。

449 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/14(水) 02:20:21

コレットメーターの試験管は直径が１８ｍｍというだけで
光路長がすべての光路にわたって一定なわけではないのだ。
そんな簡単にはいかんよ。

450 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/14(水) 02:23:35

なるほど。勉強になる。

451 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/14(水) 03:09:41

>>445
これって同じDNAを導入してるんだから、割らなくてもいいってことには
ならないのかな。そんなに導入効率ぶれないんじゃない？

452 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/14(水) 05:52:49

便乗ですが
コンピテントセルを作るとき
ＯＤ６００計れと言われて
０．４で止めて集菌して作ったんですが
ブランクに水を使ってたことに気がつきました
ＳＯＢをブランクにして計り直したら
ー０．１ぐらいに出たんですが
作っちゃったコンピは使えますか？
ていうかＯＤがマイナスってありですか？

453 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/14(水) 07:11:19

>>452
実際に菌を培養した培地と、ブランクに使った培地が違うとしか
考えられない。（培養中に多少は培地自体のODが変化するとは
思いますが。）

菌があったのなら、コンピテンシーは低くなるけれど、使えなくは
ないのでは。培養開始時のODを決めたら、後は時間で決めても
いいと書こうと思ったけど、最初のODも測れそうにないなあ・・・。

454 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/14(水) 09:33:46

>>452
ここで聞くより、定量したプラスミドをTFして一晩待った方が早いと思うｗ

455 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/14(水) 10:26:16

O.D.の0.1ぐらいは培養時間を30分ずらしただけで平気で変わるから、問題ない

456 ：｢!wrestler｣：2007/02/14(水) 15:44:01

なはたゃたま。

457 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/21(水) 17:51:35

ラボの大掃除をしていたら、大昔のデシケータが出てきました。
中身はもうどうでもいいので捨てようと思ったんですが、蓋がびくともしません。
どうやって開ければいいでしょう。。。

458 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/21(水) 21:00:11

お湯に浸す、しばらく置く

459 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/22(木) 06:37:56

屋上から投げ落とす

460 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/22(木) 09:27:01

あて切り

461 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/22(木) 11:52:03

みね打ち

462 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/22(木) 13:36:50

SOSUI以外で膜貫通領域わかるサイトってどこかありませんか？
先日コンストラクションでSOSUI使って貫通領域調べて、そこを削って
プラスミド作ったんですけど、目的のタンパクが何故か分泌されないんです。

463 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/22(木) 14:51:12

TMHMMてのがある
ttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/　とか
ttp://www.pdc.kth.se/~hakanv/prodiv-tmhmm/　とか
上は今落ちてるぽいが

てか膜貫通領域を切除して分泌されるというのは普通の現象なのか？
そもそもタンパク質の発現は確認しているの？

464 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/22(木) 17:18:48

プレセニリン？

465 ：462：2007/02/22(木) 18:25:33

>>463
㌧クス。早速使わせていただきます。
シグナル配列あるのでおそらく分泌されるかとは思うのですが。
SOSUIでサーチした膜内領域以下を削ったものを作ったのですが、
supとcell lysateの両方WBしたら、lysateサンプルだけにバンドが。
そこでシグナル配列を別のものに入れ替えてみても結局lysate
サンプルにしかバンドなす。
仕方ないからそこから3AAずつ、最大9AAまで削ってもsupには目的の
タンパクが発現せず。
といった状況なのです。。

466 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/22(木) 20:54:00

廃牛乳を使ってメタン発酵をしているのですが
水素と二酸化炭素は出来ているのですがメタンがなかなか出来ない
です。

467 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/23(金) 22:35:20

>>466
ﾌｰﾝ（ ´_ゝ｀）で？

468 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/24(土) 01:03:23

>>467
廃牛乳をもっとください

469 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/24(土) 01:22:10

>468
母乳くれんかの方が新聞とかで脚光を浴びるよ。

470 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/24(土) 05:57:12

材料のＣ/Ｎ比が低いからかもね

５０℃ぐらいで反応できないか？

471 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/24(土) 13:44:14

>>465
本来ライソソームにあるタンパク質で分泌されないものだった、とかいうオチはなし？

472 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/24(土) 15:18:48

　自分のことではないのですが、友人を諫める為のアドバイスをお願いします。

　友人はdifferencial display法で、ある臓器に発現する新規遺伝子を取ってきたのですが、RT-PCRしたところ4つのバンドが見えてきました。

　僕としては、それはただのPCRのミスだと思うのですが、友人はintron retention(スプライシングが状況に応じて変わる？)だと言って聞きません。
　ゲル抽出してそれをシークエンスにかけたりなんたりやってる見たいです。シークエンスを見ると、エキソンがスプライスされたりめちゃくちゃです。

　ちなみにnorthern-blottingではブロード状に見えました。抗体を作ってタンパクを発現させればintron retentionっていうのが正しいかどうか分かるのでしょうけど、そんなにお金を使われると困ります。

　簡単にPCRのミスが起こっているかどうかを確かめる方法ってないでしょうか？

473 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/24(土) 16:03:20

友人の言ってる事の方が正しいと思うが
まあ、正しいかどうかと面白いかどうかは別だが
（それから今時DDってw）

474 ：472：2007/02/24(土) 20:24:01

>473
客観的に見てそうなのですかね？う～ん。

>（それから今時DDってw）
マイクロアレイの一つや二つをやってみたいとは思ってるんですけど、うちの伝統みたいで^^;

475 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/25(日) 23:47:37

それよりdifferencialって…

476 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/26(月) 12:11:07

院生が簡単なサブクローニングできないからと、gatewayを導入するのは安易すぎますよね

477 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/26(月) 12:24:55

まだｹﾞﾄｳｪｲを使ってないの？仕事の効率悪そうだな。

478 ：476：2007/02/26(月) 12:26:30

TOPO使ってもクローニングできない、と泣く院生がいるうちはまだ無理ですw

479 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/26(月) 12:44:53

４７２
ただのオルタナティブスプライシングでしょう。
ヒジョーによくあること。

それ以前に今時DDって、ほんとに目的臓器に特異性はあったのかの確認は大丈夫か？

480 ：472：2007/02/26(月) 23:31:01

>ただのオルタナティブスプライシングでしょう。
>ヒジョーによくあること。
けっこう珍しいことだと思ってました。みんなクローニングの時に無視してるんですかね？

>それ以前に今時DDって、ほんとに目的臓器に特異性はあったのかの確認は大丈夫か？
一応は臓器別RT-PCRで調べてる見たいです。なんというか貧乏はツライ…

481 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 15:53:01

Applied BioのBig Dye Terminator精製キットって，
どんくらいケチれる？
seq反応5ulでやってんだけど

482 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 16:46:20

３２倍希釈

483 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 17:03:44

精製キットな
シーケンス反応じゃなくて
今売り出し中の

484 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 17:11:31

Sephadex（DNAグレード）をTBEで膨らませて、懸濁液200uLをフィルターチップに入れて2000g, 1分

485 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 17:21:54

>>483
チラシで見たけど粘性高そうだね

486 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 17:38:09

精製キット
分注操作３回＋ボルテックス３０分＋遠心２分

ゲルろ過
ゲル分注１回＋遠心１分＋反応液分注１回＋遠心１分

487 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 17:49:07

精製キット　
　正規の分量で１サンプル２５０円
　４分の１スケールで１サンプル６２．５円

ゲルろ過
　Sephadex 200uL(80mg）３０円
　フィルターチップ１本１０円
　1X TBE　120uL ０．０５円
　合計４０．０５円

488 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 19:21:03

精製キット，ボルテックス30分かよw
ゲル濾過なんてやってられるか？
96well plate対応してんのか？あ？

489 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 20:59:40

エタ沈したらええやん

490 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 21:23:30

なんどエタ枕させても、DNAが亡くなった！と騒ぐうちの院生はどうしたらいい、、、、、orz

491 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 21:31:43

キャリアを使わせたら？
ＬＰＡなら安いし、室温・即時でエタ沈できるよ。

492 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 22:01:06

ゲルろ過＞PEG沈＞イソプロパノール沈＞エタ沈

493 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 22:48:48

何の順番？

494 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 23:36:53

>>491
その解決策は間違ってるだろ

495 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/04(日) 23:56:11

そいつのためを思うなら間違ってる。
自分の時間が大事ならいいんじゃない？

496 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/05(月) 01:14:06

0.5M NaCl/70%EtOHで、すべての核酸が沈殿すると思ってるなら、
一生エタ沈やってればいいよ。

497 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/05(月) 07:08:38

実用上問題ないし安価なので一生エタ沈やっていこうと思う

498 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/05(月) 19:20:00

>>492
PEGの方がロス少ないのか？

499 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/05(月) 22:19:45

AGPC法でRNA抽出やってるんだが、細胞溶解後のクロロホルム添加を
間違えてイソプロピルアルコールいれちゃった。
これって、取り返しつく？

500 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/05(月) 22:39:17

>>499
あきらめて帰って寝ろ。

501 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/05(月) 22:45:26

やーだー　やーだー

502 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/06(火) 00:47:57

>>499
分かった。
じゃあ今夜は俺と朝まで踊ろう！

503 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/06(火) 03:01:17

>>499
正直微妙。

504 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/06(火) 21:32:46

ウンコからＲＮＡって取れる？
糞便検査用のウイルスＲＮＡをとるキットとかあるけど、
OD260nm/280nmで、本当に１．８以上に精製できる？

オリジナルのカクテルを色々造ってるんだけど、
どうしても１．３以上に精製できない。

505 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/08(木) 02:25:18

>>504
まずサンプルの段階で吟味すべき

可愛いあの子のウンコなら…

506 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/08(木) 02:59:41

1週間くらい前から抗生物質飲まないとまずいらしいぞ

507 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/10(土) 15:09:43

相談させてくれ orz

区論テックのSMART Kitでもって微量RNAからｃDNAを合成・増幅して得たｃDNA溶液から
まだデータバンクに登録されてない遺伝子をPCRで検出したんです。

んでまずはその全長を取ろうと思うんだがうまくいかないんです。
前述のキットでは両末端にアダプター配列を持ったｃDNAが合成・増幅されるんだが、
そのアダプター配列が同じだから、５'レース、３'レースができない
（全ての遺伝子が増幅される）んです。　何かいい案はないでしょうか。

508 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/10(土) 15:41:49

ジーンレーサーで合成しなおせバカ

509 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/10(土) 15:56:08

>>508
ジーンレーサーではｃDNAの増幅がうまくいかなかったんです。

510 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/10(土) 17:06:01

そのキットを知らない人には何がしたいのかわからないな。
まあ知っている人にだけ聞いているのだろうから俺はお呼びでないか。

511 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/10(土) 17:19:34

>>509
増幅しなきゃいいだろ？アホか？
それとも増幅がうまく行かないってのはRACE PCRがうまく行かなかったって事か？
もしくはSMARTのやつからライブラリーでも作れよ

>>510
知らないんなら黙ってろよカスw

512 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/10(土) 18:52:36

この季節にMSやってると静電気のせいでエッペンにホコリ等が入って困ります
誰かいい対処法を知らないでしょうか？

513 ：ＭＵ：2007/03/10(土) 18:54:12

ぼくのホームページにきてください
とってもおもしろいよ、掲示板もあるよ、楽しめるよ
絶対来てね、来ない人はだいきらい
http://www.geocities.jp/mu1ee2r/
http://www.geocities.jp/mu1ee2r/
http://www.geocities.jp/mu1ee2r/

これがけいじばんだよ
http://www.eonet.ne.jp/~muhp/mumu/index.html
ファンクラブにも入ってね

514 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/10(土) 19:17:18

ゲノム読め、ばか

515 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/10(土) 23:24:50

>>512
全員裸体でラボに来る
マジでお勧め

516 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/11(日) 00:36:05

>>515
MSの意味も分からん薄ら馬鹿が質問に答えるな
ケラチンがコンタミしまくるだろヴォケ

517 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/11(日) 00:54:19

？
ラボに来るまでに風で綺麗になってるけど？
俺んとこはみんなそうしてるが、、、

518 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/11(日) 02:04:44

ボケるにも最低限の知識が必要だなｗ
痛すぎるぜ

519 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/11(日) 06:44:02

>>512
ＭＳてなに？

520 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/11(日) 06:53:49

MSってクリーンルームでやるもんじゃないのか？
俺のところはそうしてるが

521 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/11(日) 10:14:18

>>520
そうでもないぜ。

522 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/11(日) 21:58:57

>>519
Mad Scientist

523 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/11(日) 22:57:04

>>520
クリーンルームでも多少のホコリは立つぜ

524 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/13(火) 04:12:45

>512
加湿器買え

525 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/16(金) 02:08:25

>>524 がいいこと言った

っぽいけどやったことないからわかんないや。

526 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/21(水) 05:33:58

オリゴＤＮＡを細胞内に導入しようとしてるのですが
その方法として「オリゴフェクタミン」か「リポフェクタミン２０００」のどちらかがベストだと思っています。
両方使ったことある方いますか？

527 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/21(水) 06:01:11

リン酸カルシウムしかやったことないから分からん

528 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/21(水) 07:28:58

自作してるの？
ちゃんと入る？

529 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/21(水) 08:07:59

２９３とかＣＯＳとかＨｅｌａにはすぽすぽ入るよ

530 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/21(水) 08:57:14

invitrogenとか、SiRNA用とかオリゴ用とかやたらと目的によって細分化されているけど
結局どれを使っても同じな気も

531 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/21(水) 10:27:37

あぶらの組成をいろいろ振ってみて、ほんの数％効率が変わっただけで
○×用と称して売り出しているようにおれには思える。

532 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/24(土) 21:46:39

うまくいかないわけではないんですが、Templiphiってどこまでケチれますか？
希釈して使っている人とかいたら教えてください（希釈率と希釈に用いる溶液）。

533 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/03/25(日) 04:52:00

50 mM Tris-HCl
10 mM (NH4)2SO4
10 mM MgCl2
4 mM Dithiothreitol
pH 7.5 @ 25°C
というのが
http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0269.asp
に出てたが

534 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/17(火) 08:19:59

(PCRがなんかいやってもうまくいかん。もうだめぽ

535 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/17(火) 08:36:00

>>534
何のPCR？
手を尽くしても全く上手くいかないPCRなんて滅多にないよ。

536 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/17(火) 20:03:45

統計で悩んでいます。
教科書やネットを見ても、「対応のある」とか「繰り返し」とか、抽象的すぎてなんのことやら
さっぱり分かりません。
具体的には今、こういう状況です。

１．ラットを4群に分け、各群10匹ずつ割り振る。
２．各群に、ドラッグＡ、ドラッグＢ、ドラッグＣ、溶媒のみ、を3週間投与する。
３．ラットを殺し、末梢血細胞の表面抗原をFACSで測り、陽性細胞の割合（％）を出す。
　（注・ドラッグによっては、10匹中数匹がすでに死んでしまっていることがある）
４．各ドラッグ処理群とコントロール群の平均値に差があるかどうかを知りたい。

Student's tではダメ、って言われてしまって。
Scheffeの一元配置でいいのかな？
それとも、各群あたり10匹（とは限らないけど）使ってる、っていうのは、「繰り返しのある二元
配置」にあたるの？
全然分かりません。
教えてｴﾛｲ人。。

537 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/19(木) 12:16:42

そういえば統計スレどこ行った？
あれは良スレだった

538 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/19(木) 12:19:17

あった。寸前だったのであげておいた

生物学での統計学スレ
http://science6.2ch.net/test/read.cgi/life/1127772845/

539 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/19(木) 12:48:56

76,7年前にJNに載ったBDNFの論文、適用できないのに意図的に差が出る統計方法
使って有意差出してた。筆頭著者が自慢げに公言してた。バカだこいつ、と思ったのを
思い出したよ。

540 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/19(木) 14:54:20

統計は自分も弱くて力になれないが。
・・・溶媒も投与しない対照群が要るんではないかと思うんだが。

541 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/21(土) 18:34:01

コロニーPCRに関して。
今日コロニーPCR（菌を懸濁した滅菌水をボイルして遠心した上清をtemplateにする方法）
を30サイクルでやったんだが、ポジコンがうっすら出てるかなーってくらいのバンドの薄さで、
他はバンド見えなかった。前やったときは同サイクルでポジコンでドカンとバンドが
見えたから、これは予想外の結果だた。

で、前回（バンドでた）と今回（バンドでない）で操作において違うところを考えたんだが、
今回は前回よりも滅菌水に入れる菌の量を増やしてたんだが、これが原因で増幅されなくなる
こととかあるん？　ダイレクトころPだったら菌は入れすぎるとダメって聞くが、この方法でも
菌入れすぎると良くないのか？？　
あと、前回は採菌をクリスタルチップでやったが、今回は爪楊枝でやった。

542 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/21(土) 18:39:19

ダイレクトコロニーPCRでも失敗はしないだろ
PCRの10xバッファーがMgマイナスだったとかそういう失敗はないのか

543 ：541：2007/04/21(土) 19:03:23

>>542
Mgははいってる。前回バンドでた時と試薬類は同じやつ使ってるたし、Primerも
反応液の組成も同じ。まじなんで出なかったのかわからぬ。。。

とりあえずプライマー類がへたってる可能性を考えて、これからプラスミドをTempに
PCRしてみようかと思うが。。。

544 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/21(土) 19:05:32

爪楊枝はものによっては邪魔することあるよ。
でもダイレクトじゃないなら持込は少ないよね、今回の場合。

545 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/21(土) 21:17:58

滅菌水にTweenでも入れとけば。

546 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/21(土) 21:58:39

普通にミニプレップじゃだめなのか...

547 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/22(日) 00:21:23

酵素代や時間と手間を比較するとｺﾛﾆｰPCRが勝ち

548 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/22(日) 03:48:01

・DNA抽出->PCR->DGGE->PCR->シークエンシング
・DNA抽出->制限酵素処理->ライゲーション->大腸菌で増幅->コロニーPCR->シークエンシング

DGGEはアクリルアミドと変性剤（尿素、ホルムアミド）だけでできるのに、なんで普及してないんだろう。
古典的な方法だと、ベクターと制限酵素とライゲーションキットとコンピーテントセルと
培地（ＳＯＣ，ＬＢ，Ｂｒｏｔｈ，抗生剤）が必要でしょ。時間もかかる。

原核生物が研究対象なら、大腸菌の一個のコロニーが一種類の遺伝子しかもってないなんて
思い込めないはずだけど。

549 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/22(日) 06:35:18

> 菌を懸濁した滅菌水をボイルして遠心した上清を

なんちゅーめんどくさいことを.....

細い白金線でコロニーつついてそのまま反応液にちょん
白金線の長さをちょうどPCRプレートの深さに切りそろえておけば
先っちょがちゃんと液につかってるか見なくてもいいし

550 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/22(日) 06:48:39

ＰＣＲ反応後、未反応のプライマーとdNTPをのぞく方法を教えてくれ

ｺﾛﾆｰPCR産物でシーケンス読みたい

551 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/22(日) 07:24:06

>>541
その方法、大腸菌と酵母でやったことあるけどオレもそんな感じの結果だった。
明らかにダイレクトの方がよかった。なぜかは知らん。
>>549の言うとおりやってみなはれ。オレは爪楊枝で十分だと思う。

>>550
精製用のスピンカラム使うなり、低融点アガロースから切り出すなり…？
いやいやまさかそんな質問じゃないと思うから、もう少し詳しく書いてください。

552 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/22(日) 07:40:42

エタ沈とかPEG沈でプライマーを除けないですか？

553 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/22(日) 08:21:21

>>552
PEG沈は大丈夫。ただしPCRもtotal 200ulくらい用意しなきゃ。
あと知ってると思うけど、沈降しやすさは長さ（分子量）に大きく依存する。
多分1500か2000bpsが最低限じゃない？　1000bps切るときつそう。

554 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/22(日) 12:12:17

>>550
PEG沈とかゲル濾過とか面倒でしょ。プライマーとdNTPだけ分解しちゃえばＯＫだよ。
ttp://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=574

555 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/22(日) 13:33:23

しかも標準の１／１０か１／２０ぐらい入れとけばいいし

556 ：PCR産物のプライマーを除去：2007/04/22(日) 14:47:15

>PEG6000+NaClでよろしいでしょうか？
>また濃度はどれくらいが目安でしょうか？
http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=1383427
手元のプロトコールでは
PEG8000（6000でも可）0.6 vol.の20% PEG/2.5M NaCl（常備ストック溶液の40% PEGと5 M NaClを1:1でまぜる）を加え混合、
0-4 Cで30分以上静置、Max speed, 4 Cで10分遠心、沈殿を70% EtOHでリンスです。

557 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/22(日) 16:00:09

>555
５５４のことか？
1/10希釈って。

558 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/22(日) 16:22:59

> PEG沈は大丈夫。ただしPCRもtotal 200ulくらい用意しなきゃ

なんちゅーもったいないことを.....

反応系は10〜15ul
>>554
のを標準の１／２０入れる
アガロースで流してみて
バンドが濃いときは１ulがシークエンス１回分
これでおｋ

559 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/23(月) 10:49:28

>541
> 菌入れすぎると良くないのか？？　
そう。あんま突っ込むとｲｸﾅｲ

560 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/26(木) 02:54:34

プライマーぶっこわす試薬に
えきそさっぷちゅうのがあったと思う。
酢酸アンモニウム（ammonium acetate）でエタ沈する方法でいけないのかな？
短いDNAは沈みにくい塩類って説明がモレクロにあるはず。
水を吸いやすい試薬だから、試薬棚でビチョビチョの粉になってる。
PCR産物読むなら、普通に切り出すのが考えるより早い気がするけど。
きあじぇんのやつなら30minくらいでテンプレできるし。

俺は30 ulくらいにコロニーつついてボイル、遠心1min、sup 1ulをテンプにして
95C5m-(95C30s-55C30s-72CXs)x30-4C∞にしとる。
普通にかかる。ぽりめれーすはEx Taq。
もっと安くて同じくらいかかりが良いタックん教えてくれ。
塩類とかが邪魔せんようにゴミの希釈考えてこんなことしとるよ。
扱ってる菌がマニアックで大腸菌の培地とは違うので。
かからんかったら、フルに生えたCul 1ulでおなしことする。
テンプレートはダイレクトでなくても十分あるはず。
それでもだめなら、ミニプレしたやつでかける＆制限酵素で切って確認。
ここまでやってもダメなら、消しゴムツールとか使ってうっすらバンド作る。
ころぴーかるぴーのどっちかでなんとかなるよ。当たりもすぐストックできるし。

561 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/26(木) 21:04:34

相変わらずバカばっかりだなここは

562 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/26(木) 23:37:10

で？どうしたらいいの？

563 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/26(木) 23:45:54

コロピー後のシーケンスなんかそのままPCR産物をテンプレートにしてBigDye　ｖ３で読めば読めるよ
ExoSap　1/20とかでOKとかいいながら、３０分無駄使いして喜んでるバカ
０でいいのにｗｗｗｗｗ

564 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/26(木) 23:54:18

松岡徹参議院議員（民主党・比例区選出）が北朝鮮の核保有を賞賛した
チュチェ思想研究会全国連絡会主催のフォーラムに参加

http://news21.2ch.net/test/read.cgi/news4plus/1176890707/
http://www1.korea-np.co.jp/sinboj/j-2007/01/0701j0418-00001.htm

565 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/27(金) 09:32:01

>>563
ピペドは初歩的なモレキュラーの話になると燃えるんだね

566 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/27(金) 09:49:16

>>563
さすがにそりゃ無理だろ。
シーケンスに使うプライマーの濃度＜＜PCRに使うプライマーの濃度だから。

567 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/27(金) 10:47:31

ダイターミネーターの話だろw

568 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/27(金) 11:47:21

>>566
未だにダイプライマーか？
PCRにつかうプライマーって、全部そのまま残ってるとでも?w

569 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/27(金) 12:51:31

>>566ではないけれど、PCR産物からはｾﾝｽとｱﾝﾁが両方carry overされるから、
もしﾌﾟﾗｲﾏｰが十分に消費されてなかった場合、dye terminator方式だと影響が
結構あると思うぞ。

570 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/27(金) 15:53:18

>>569
ぐだぐだ言ってねえでやってみろよ
最高にきれいだから
今までExoSAP ITちまちま分注してた奴，乙wwwww

571 ：570：2007/04/27(金) 15:55:55

PCR用プライマーとシーケンス用プライマーが違う場合でも問題無しだよw

572 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/27(金) 19:59:10

↑なんかコイツ、いわゆるツンデレなんじゃね？

573 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/27(金) 22:15:53

ＥｘｏＳａｐが効いてないときの波形の特徴
全般的にダブルピーク
フォワードで読んだのに部分的にまたはほとんどリバースの波形
これらは残存プライマーの影響
このほか
残存ｄＮＴＰの影響としてコンプレッションやピークのずれなどがあるはずだが
波形の汚さに隠れていると思われる

574 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/27(金) 23:20:09

PCR産物のシーケンスのためのテンプレート調整なら切り出して終わりだけどな。俺は。
ABI3100くらいのやつでやれば楽勝じゃね？

575 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/27(金) 23:27:46

９６サンプルでも切り出すのか？ｗ

576 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/28(土) 02:09:17

>>567
根本的に分かってないバカ？
ダイターミネーターだからヤバいんだろ？

>>568
たとえ残ってるプライマーが５％だとしたってマズいだろが？

>>571
プライマーが違ってるかどうかなんて、この場合は無関係だよ。

PCRのプライマーのTmとシークエンシングのプライマーのTmの違いで
たまたま上手くいくことはあったとしても、それが一般化できるようなものじゃないって本気で分かんないの？
ピペ土としても三流以下って、ある意味すがすがしいねｗ

577 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/28(土) 12:55:58

ま、きっと完全にoptimizeされた実験しかしたことない厨房なんだろｗｗｗ
　
その系ではﾌﾟﾗｲﾏｰがほぼ完全に消費されるのでそのままsequence出来るのかも知れないｗｗｗ

578 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/28(土) 13:22:45

シークエンスすると、いつもアデニンとチミンのバンドが薄くて、
グアニンとシトシンのバンドがやたらと濃くなって、解析不能になります。
シークエンス反応に何か問題があるのでしょうか？
反応後のゲルろ過は必ずやってます。

579 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/28(土) 17:44:06

>>577
そんなに興奮しなくてもいいんじゃないの？

580 ：570：2007/04/28(土) 18:08:56

>>576
やってみれば解るよ
問題等全く無し
せっかく教えてあげてんのに逆切れか？w

581 ：570：2007/04/28(土) 18:21:29

PCR用のプライマー濃度は濃くて0.5uM
5%のこったとして，0.025uM
PCR液1ulを5ulのシーケンス反応のテンプレートに使ったとして0.005uM

シーケンス用のプライマー濃度は0.16uM
その差32倍だが，1/32のピークが悪影響ありますかね？w

582 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/28(土) 20:35:47

そんなに必死にならなくてもいいよ

583 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/29(日) 14:34:48

ふと思ったのだが、ﾌﾟﾗｲﾏｰの95％が消費されるなんてことが本当に起こりうるのだろうか？
　
50％消費された時点でﾌﾟﾗｲﾏｰとPCR産物の濃度が同じになる、とすれば、95℃で変性させたとしても
その後ｱﾆｰﾘﾝｸﾞやextensionで温度が下がった時にたかだか20-30ｂのﾌﾟﾗｲﾏｰとｱﾆｰﾙするよりも、より
広範囲でｱﾆｰﾙするPCR産物の相補鎖の方が熱力学的に安定な筈、つまり、ある程度時間が経てば
相補鎖同士でｱﾆｰﾙしてる分子の割合が高くなって、新なPCR産物の生成速度はこの頃にはかなり
落ちてplateauに達する、だから定量PCRなんてのが必要なんだろうが、それは何％のﾌﾟﾗｲﾏｰが消費
された時点なのか？
　
誰か知ってる人いる？

584 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/29(日) 14:40:23

何か文章が変になったな
　
「新なPCR産物の生成速度はこの頃にはかなり落ちてて、やがてplateauに達する」
　
だ。

585 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/04/30(月) 19:55:25

シークエンサーの性能によるんじゃね。

定量的なデータは、定量的な結論（つまり数式）を生むけど、
定性的な結論に変換するためには、しきい値とか最大値とかの基準が予め
設定されてないとダメだよ。

586 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/01(火) 10:36:08

なぁ、５'、３’両末端がアビジン標識されたPCR産物を、ライゲーション→菌にぶち込む
ってできるかね？？　アビジンついてっから無理かね？

587 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/04(金) 07:52:28

普通にＴＡベクターとライゲーションさせてみればよい
効率はすごく悪いはずだが

588 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/04(金) 13:37:00

末端就職はやめたら？

589 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/07(月) 04:34:52

cDNAをテンプレートに欲しい配列を数個のパーツに分け、クローニングしているのですが上手くいきません。
プライマーのATは60℃に設計しており、94℃20秒、60℃20秒、72℃55秒の35サイクルでPCRしています。
しかし目的バンド付近にもそれらしいバンドが見られるのですが、それ以外のバンドが特に増幅されてしまいます。
どういった方法でやれば、目的バンドがキレイに出せるでしょうか？
質問内容がわかりにくくてすみません。

590 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/07(月) 08:14:35

プライマーの長さを言え

591 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/07(月) 09:35:19

Ampriconのサイズも言え

592 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/07(月) 14:02:27

３サイズも言え

593 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/07(月) 15:13:35

銀行口座と暗証番号もついでに

594 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/07(月) 19:21:36

Ampliqon使え

595 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/07(月) 20:25:20

>>589

> プライマーのATは60℃に設計しており
Tm値のことか？annearing temp.の目安はTm-5～+5

バックは無く、エクストラバンドが見えるだけならannearing temp.を上げる。
変成やアニーリングの時間を伸ばしてみると改善するかも。
鋳型がGC-richなら変成を95℃にすると良い場合もある（Polymeraseが早くへたるけど）。

まあ、目的のバンドが見えるなら切り出せばOK。

あと、クローニングの場合は発現量が低いのでなければサイクル数は30以下が望ましい。
エラーの頻度が増える。

596 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/07(月) 21:26:00

低レベルな質問に低レベルな答えが来ましたｗｗｗｗ

597 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/07(月) 23:46:16

プライマーは20塩基、ampliconは870bpです。

598 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/08(火) 09:38:19

プライマー25merくらいにするか、
一番確実なのはnest PCRだな
あとはググレカス

599 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/09(水) 10:23:17

プライマーを長くすれば一発で走りそうな希ガス

600 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/09(水) 10:45:27

Tmの計算値から５度くらい下げてPCRのアニール温度を設定するんでまいか？
1M NaCl存在下でのメルティング温度の推定式を普通は使うし。

601 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/09(水) 10:49:37

他人がもうすでに答えていることを繰り返すバカとか
役に立たない一般論を書くバカによってこのスレは支えられています

602 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/09(水) 11:11:55

こんなところで聞かずにTOYOBOやプロメガなどのホームページや
「本当に増えるPCR」あたりを読んだ方がいろいろなことが身につくと
思う。
だいたいなんのために指導教官がいるんだと小一時間問いつめたいｗ

603 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/09(水) 11:19:29

プライマーとcDNAを渡されて、一回だけPCRやって
「増えませ～ん！もうこのじっけんやりたくな－い！」

とほざく馬鹿が多すぎる。
温度、時間、Mg濃度条件の検討とか、プライマー配列と標的遺伝子配列を自分で確認するとか考えろ。

604 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/09(水) 17:09:20

グラジェント使ったことなし
標準バッファ以外使わない
いくつかの「代表的な」プロファイルを決め打ちで試す
産物長に応じてエクステンション時間をいじる
酵素の種類と量は変えてみる

あとはひたすら
>> プライマー配列と標的遺伝子配列を自分で確認
だけで１５年間やってきた俺が来ましたよ

そんないい加減なのでも
２００ベースぐらいの不完全パリンドロームとかリボソームも増えてるので
>> 温度、時間、Mg濃度条件の検討とか
本気でやってるやつを見ると眉につばを付けてしまう

605 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/09(水) 19:37:44

ゲノムサイズが小さい生物種なら何でも増えるよ
シロイヌナズナとか
増やせない奴は相当ヤバい

606 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/09(水) 21:00:25

臨床サンプルから、病原性のある菌やウイルスを一度に全部増やして、
クローニングしたいのですが、どんな方法がおすすめですか？

テキトーにＰＣＲやると、滅茶苦茶に変なバンドが出るし、
このスレで言われてるnestedとかhotstartとかやっても
あんまりバンドが減りません。

プライマー設計はNCBIのconserved domainsのデータを参考にして、
フォーワード・リバースとも、アミノ酸で7個以上完全に一致する領域を使ってます。

バンドが絶対にシュードクローンでないことを証明できる方法があれば良いのですが、
制限酵素で切ったりするだけで、間接的な証明になるんでしょうか。

607 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/09(水) 21:48:11

一度に全部増やすのに制限酵素できったりとかっていう意味がわからない
一度に全部増やすんならいろんなバンドが出て当然では？
PCRの特異性を増やしたいということなら、
degenerateにするのはprimer末端の３アミノ酸だけにして残りのアミノ酸は一つの代表的な配列にしてみろ

608 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/09(水) 23:39:16

RFLPとかのパターンで、シュードクローンと本物の違いが区別できるとかできないとか。
実際のところよくわかりません。

結局、完全なユニバーサルプライマーを使うのを諦めて、
アミノ酸配列をずらしたプライマーセットをいくつもそろえて、別々にＰＣＲにかけるのが
確実ということですね。ありがとうございました。

609 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/10(木) 02:02:05

テキトー、とか書かれると本当にテキトーにやってるみたいで怖い

610 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/10(木) 08:43:55

サイクル数？
亜ニール温度？

611 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/10(木) 09:59:56

メタゲノム解析かいな
予想分子量以外のバンドは全て無視すれ。

612 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/10(木) 10:53:38

抗体の可変部領域のcDNAを取りたいときって、5'-RACEすればいいわけ？

613 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/10(木) 12:55:04

普通のRT-PCRで十分

614 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/10(木) 13:14:21

自作PCRバッファー１２種類と、グラジエントを組み合わせれば、
たいてい一発でバンドが出る条件が見つかるよ。

９６ウェル最高。

615 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/10(木) 14:16:28

ある遺伝子の発現検出をのRT-PCRでおこなったところ
（DNAase処理有り。RTはoligo dTによる。）2つのバンドが
検出されました。両方ともシーケンスしたところ短い方のバンドは
長い方のバンドの1部分が欠落していることが分かりました（78bp）。
これはいわゆる選択的スプライシングだと考えてもいいのでしょうか？
それとも別の可能性もあるのでしょうか？
RT-PCRを始めたばかりであまり知識がないので誰か分かる人がいたら
おしえてくださいm(__)m。

616 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/10(木) 15:29:59

その内大学入試センター試験で出るんだろうな。組換えDNAの文章題とかw
生物実験の倫理問題とかw　なんだかなあ。

617 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/10(木) 16:13:56

>>615

GT-AG ruleで切れてりゃそうだな

よくあること

618 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/10(木) 18:53:19

>>613
でも「抗体可変部」の遺伝子なので、普通のRT-PCRをしようにも5'側のプライマーが
設計できないんですけど。。
3'側は定常部なので問題ないんですが。

619 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/10(木) 23:01:52

ヒント：抗体ライブラリー

620 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/11(金) 01:04:00

>>619
？
取りたい抗体はハイブリドーマのcDNAなんですけど。。

621 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/11(金) 09:18:00

抗体ライブラリーを作るときはどうやってるのか調べてみればってことじゃ？

622 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/11(金) 09:56:02

VDJリコンビネーションが起きるといってもIgG自体が分泌蛋白質なんだから
N末にはシグナルペプチドその他あって、そういう保存領域はcDNAの5'-側にあるから
普通は可変領域に隣接するN末C末の保存された領域を読めば5'-,3'-プライマーの作製には不自由しないでまいか？

623 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/11(金) 11:24:16

>>622
あれ？そうだっけ？
一つ一つのＶ領域の上流にプロモータとシグナル配列があったような希ガス。
やっぱり地道に５’－ＲＡＣＥが確実じゃないかなぁ。
よく分からんけど。

624 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/11(金) 13:10:17

理科けんにお任せください。

625 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/11(金) 14:23:41

>>617

ありがとうございます。確かにGTで始まりAGでおわっています。
ということは、長いバンドのほうはタンパクに翻訳される
ことはないということなのでしょうか。

626 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/11(金) 14:49:24

>>625
翻訳されますが，，，，

627 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/11(金) 14:51:03

ちょっと補足すると、
長い方もちゃんとORFがあるなら翻訳されてる
ないならhnRNAだな

628 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/11(金) 19:21:01

>>627
ありがとうございます☆もう少し勉強しますm(__)m。
ということはやはり部分配列だけでは、タンパクをコードしているかどうかは
確定できないわけですか...
oligo dTで逆転写してもhnRNAを拾ってくる可能性はあるでしょうか？

629 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/15(火) 16:56:08

>>628
部分配列だけでも、inframeでスプライスされてるようなら翻訳される。
hnRNAが増えることはまずないから安心しろ
ただ、イントロンにプライマー設計して無理矢理増やせばOligodTで逆転写したって増える。

630 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/15(火) 18:17:05

>>629
どうもありがとうございましたm(__)m
大変勉強になりました！

631 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/24(木) 00:55:48

アトポス死ね

632 ：形質転換体が育ちません：2007/05/24(木) 18:53:27

BL21で、シャペロン発現下、枯草菌の転写因子を精製しようと考えています。
まずシャペロンをTF。
次の日Hisタグ-転写因子発現用のプラスミドをTF。
そして次の日コロニーをいくつもつついてLBに植菌。
すると、育つときと育たないときがあります。
20分培養してもOD=0.007→0.008とかです。
抗生物質は間違えていません。
形質転換体の数も100、200出ています。
だれかアドバイスをお願いします。

633 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/24(木) 23:18:46

植菌して20分足らずで培地が濁ったらすげーよな

634 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/25(金) 02:36:39

固体培地で一晩待ってやっと生えてきたコロニーを液体培地に入れて
20分で
"うわ、育ってくれないYO!!!" って思ったのかｗ
もしかしたら生えるかもしれないから１日くらいほっといてみろ。
そういういい加減さがピロリの例のような発見を生み出すかもしれないだろ。

635 ：形質転換体が育ちません：2007/05/25(金) 12:06:39

>633
>634
失礼しました。

初めは0.001（10倍希釈の値）で、
2時間ほど培養して0.007とかで、
対数期に入ったと思われるんですが、
20分しても0.008という意味でした。
その後5時間培養しても0.013とかで頭打ちになってしまいます。。。

>もしかしたら生えるかもしれないから１日くらいほっといてみろ。

もし生えたとしても定常期なので発現実験には使えませんよね？

636 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/25(金) 13:42:53

何故　定常期になるのか考えてみたことある？

637 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/25(金) 20:21:25

シャペロンのプラスミドとHisタグ-転写因子発現用のプラスミドがiｎcompatibleだとか？

638 ：形質転換体が育ちません：2007/05/25(金) 22:14:30

>637
incompatibleですか…。
たぶんないとは思います。
過去に別のHis-転写因子とシャペロンでやったことがあるのですが、
1回目はやはりだめで（この場合は生育が止まるのではなく
生育がとっても遅かったです）、
もう一度シャペロン→転写因子プラスミドのTFからやり直すと
今度は普通に育ってくれました（対数期に入ってからは20分で2倍に）

639 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/25(金) 22:52:40

定常期になるならとりあえず時間かければ増えることの証明になるのでovernightで放置などは試してみたら？
それでも増えなければ全く別な問題が潜んでいるとわかるわけだし、増えたら培養時間をもっと長く見積もって調べたらいい。

あと誘導時間（タイミング）はタンパク質で割と違うよ。
定常期で良好に発現する場合もある。
例外が多々あるのがこの分野の面白いところだと思う。

640 ：形質転換体が育ちません：2007/05/26(土) 17:58:15

>639
もう一度やり直したら出来たということが引っかかっているんですよね…。
レスありがとうございます。
over night試してみたいと思います。

641 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/05/27(日) 20:25:03

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アトポス死ねアトポス死ねアトポス死ねアトポス死ねアトポス死ねアトポス死ね
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アトポス死ねアトポス死ねアトポス死ねアトポス死ねアトポス死ねアトポス死ね

642 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/01(金) 20:23:20

アラインメントってどうやって作ってる？
boxとかshadeとかつけれてきれいな奴が作りたいんだけど
出来ればMacで

643 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/02(土) 13:01:12

clustalxとembossでやってる

644 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/03(日) 14:20:36

細胞の栄養条件とかストレス条件を変えてから、蛋白質を抽出して、
あるプロテインキナーゼを免疫沈降してから、そのキナーゼの活性を測定しようと思うんですが、
免疫沈降時に、そのキナーゼの活性が抑制されたりするんではないかと考えております。
処理Aと処理Bの細胞抽出液の免疫沈降されたキナーゼ活性を比較して、
処理Bのときにそのキナーゼ活性が上昇していたら、
そのキナーゼは処理Bのときに処理Aのときより活性化していると結論していいんでしょうか？
それとも経験上、キナーゼ活性は免疫沈降で抑制されたりしないのかな？
おろかな子羊に、エライ人おしえて。

645 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/03(日) 14:51:53

ノンスペシフィックな内在性脱リン酸化酵素や、内在性プロテアーゼの影響を考えてみたら
どうなのよ。免疫沈降の場合、サブユニット分子や活性化因子を共枕できるとは限らないから、
そういう影響かもしれない。

酵素活性を抑制するモノクローナル抗体がたまにあるけど、ポリクロ抗体で免疫沈降実験するなら
抗体による標的酵素の阻害効果は無視しても大丈夫だと思う。

646 ：644：2007/06/03(日) 19:10:52

そうですか、酵素活性を阻害する抗体のほうが特殊ですか。
免疫沈降はありしたことが無いので経験談はために成ります。

647 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/07(木) 22:28:50

いま、東洋紡のSfi IとNot Iを良く使うんですが、如何せん切れが悪くてなかなか難儀しています。
なかなか切れないので、結局酵素をムダに消費してしまう事になるんですが、冷静に計算するほどに、
恐ろしく予算が削られており、血の気の引く日々です。

Fermentasのがまあまあ安くて、性能もそこそこと言う話を聞いたのですが、タカラとロシュも気になります。
OMEな気もするんですが、何処から買うのが一番コストパフォーマンスのいい実験が出来るでしょうか・・・

先輩方のご意見をお聞かせください。

648 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/07(木) 22:45:04

NEB

649 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/07(木) 23:02:54

タカラって今３割引だっけ。

HバッファとトリトンとBSA入れるとスパッと切れると思うけど。

650 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/07(木) 23:32:01

それはDNAの品質に問題がある気がするけど。その質問の前に考えることがあるんじゃない？

そのDNAは何？plasmid？ゲノム？

精製方法は？

反応系の詳細は？

まあ、答えられても答える気はないけどね。

651 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/08(金) 00:19:49

SfiIはtetramerでactiveなので２つの標的配列を同時にくわえ込んで切る。
だから反応液中のDNA濃度をあまり低くしない方が良く切れるよ。

652 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/08(金) 01:16:27

こういうことに詳しい５０前後の指導教官が一番使えないよねｗｗｗｗ

653 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/08(金) 02:50:34

>>648-651
回答ありがとうございます。

654 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/08(金) 07:09:40

なんでうちのラボは俺以外だれもクローニングできないんだ？

655 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/08(金) 09:54:27

>>652
知らないほうが偉いんだ？
それ何ていうゆとり？

656 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/08(金) 22:36:33

>>655
よくいるんだよ
目的より手法にこだわる奴がねｗ
あ、お前のこと？ｗｗｗｗｗｗｗｗ

657 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/08(金) 23:00:07

＞SfiIはtetramerでactiveなので２つの標的配列を同時にくわえ込んで切る。

すげえ発見だ。感動した。

658 ：おーろろろろーん：2007/06/09(土) 00:38:20

やばいやばい　どなたか化学がネ申な方

原核生物および真核生物のDNA合成、RNA合成、
たんぱく質合成の反応速度

を教えてくませんか？検索してみたけど全く
見つからないです。。。

659 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/09(土) 06:58:04

スレ違い

660 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/09(土) 14:41:58

>>658

それぞれ　
「DNA　複製速度　塩基」
「RNA　転写速度　塩基」
「タンパク　翻訳速度　残基」
でググれ。
　
少なくとも真核生物については直ぐに見付かるはずだ。
原核生物についてはよく調べればみつかるかも。
ちなみに
1000bp/sec
10b/sec
（原）45peptide/sec （真）4peptide/sec
だそうだ。このくらいは直ぐに見付かったぞｗ

661 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/09(土) 15:39:13

>>656
だからと言って、手法を疎かにしてる一流の研究者ってのは見たことがないんだが、どうしてだろね？

662 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/09(土) 16:22:19

そうか？
PIになってからは部下任せのいい加減な奴が多いぞｗ

663 ：狂蔭：2007/06/09(土) 16:31:12

学生がクローニングも発現解析もWBもできないので、みんな自分でやってますがなにか？

664 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/09(土) 17:18:27

SfiIの話はこれかな？
ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=PubMed&cmd=Retrieve&list_uids=7752226

665 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/10(日) 15:14:16

すみません、初歩的な質問です。

Linearにして9.8Kbのﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞをuncutの状態で泳動したのですが、12-13kb辺り（ﾏｰｶｰが10kbまでありませんので不確かですが）にMainのBand（Super coil?)が見えます。さらに上の方にｻﾃﾗｲﾄのBand(Open circular?)も確認できます。

こんなことってありますでしょうか？

閉環状ﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞって、この場合8-9kb辺りにでると思っていましたが・・・

666 ：665：2007/06/10(日) 15:50:27

誤：ﾏｰｶｰが10kbまでありません

正：ﾏｰｶｰが10kbまでしかありません

でした。訂正します。

667 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/12(火) 19:18:22

なんかさっきから来てるミリポアの修理工の態度がすげー悪い。
はなっからこっちがメンテしてないと決め付けてやがる。
うるっせー、しとるわい。
んで、結構でかいユニットごと交換しろといい、それを交換したら、
「ほーら抵抗上がった、やっぱりメンテしてないからだ」
みたいな態度とりやがる。
そのくせ、すぐまた抵抗が下がってきたとかで、また修理再開。
二人でだらだらとくっちゃべりながらまだ作業してやがる。
水をだーっとこぼしたかと思うと、うちの雑巾を勝手に使って拭いてる。
雑巾ぐらい持ってこい。
あ、今「パキッ」って音がして「うわ、わ、わ」とか言ってる。
ふざけやがって。

668 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/12(火) 19:45:44

複数のユニットがダメになってるみたいです。

669 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/13(水) 02:06:39

ミリポアって独占企業だよね。高い金ふんだくりまくって
類似商品でてこいやー

670 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/13(水) 10:41:41

PCR産物のクローニングのさいに、プライマーに制限酵素サイトを付けておいて、PCR産物を制限酵素で切断して
からアガロース電気泳動してそれから切り出し精製していました。

プライマーや短いDNA断片は酢酸アンモニウムを使ったエタ沈やPEG枕で除けると聞いたのですが、
この方法なら電気泳動せずに、制限酵素で切断したものをそのまま酢酸アンモニウム・エタ沈やPEG沈澱操作すれば
そのままベクターへのライゲーションに用いてもいいのでしょうか。

671 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/13(水) 21:17:53

今時gatewayどころかカラムも使わないってどこの貧乏３流ラボだよｗｗｗｗｗ

672 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/13(水) 23:08:18

てか、サブクローニングが目的なら別に普通のエタ沈で十分だよ（それすら必要ないという立場もある）。
>>671は金を無駄遣いすんのだけが目的か？

673 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 08:06:01

サブクローニングw

674 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 09:43:45

QiagenのPCR purification kit使え。
10分で終わるぞ。＞670

675 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 11:32:42

うちの指導教員は「キットなど使うのは研究者として堕落してる！」とマヂ顔で言いますw

676 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 11:56:40

アホだな。

677 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 12:20:35

マジ、アホだな。

でもきっと貧乏の強がりだからちょっとだけ同情する。

678 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 15:10:10

最近は試薬をバラで買うより、キットのままの方が安い、という逆転現象がある。

ExTaqよりGoTaqの方が安いとか

679 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 15:14:08

そりゃ酵素が違うからだろ
ホントにお前理系か？

680 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 19:37:14

エタチンするときの５Ｍ塩化ナトリウムのｐＨって、正確に７．００に合わせないとダメですか？
合わせないとｐＨ４ぐらいだから心配で。

バッファーに放り込んだら関係ないんでしょうか。

681 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 21:48:38

>>680
どんな水使ってんだよw

682 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 21:48:45

緩衝能無いから合わせたって無駄。
空気中の二酸化炭素吸ってあっという間に酸性になる。

683 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 22:02:01

>>681
DEPC処理水です。

>>682
やっぱりそうなんですか。塩化ナトリウムの濃度が濃くても、
バッファーが緩衝してくれるんでしょうね。

684 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 22:52:31

いつの時代のモレキュラーバイオロジストだよｗ

685 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 22:55:47

>683
PCR反応液とかならバッファー含んでるからNaClだと溶液のpHに緩衝される。
塩溶液に緩衝作用が欲しいんなら酢酸ナトリウムでも使え。
単体なら塩基性を示すはず。
RNA用なら酢酸でｐHを調整しろ

686 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 23:24:51

なので、最近は酢酸ナトリウム・イソプロパノールばかり使ってます。

５Ｍ塩化ナトリウムがｐＨ４ぐらいでも、水素イオン濃度じたいは、
１０ｍＭのトリスで緩衝されるぐらい低いんでしょうね。

687 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 23:33:25

ビスファチン論文取り下げ勧告だそうな

688 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 23:39:43

それって、今実験でうまくいかないことなのか？

689 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/14(木) 23:41:27

＞５Ｍ塩化ナトリウムがｐＨ４ぐらいでも、水素イオン濃度じたいは、
＞１０ｍＭのトリスで緩衝されるぐらい低いんでしょうね。

よく見直すと変な表現ですね。。
塩化ナトリウムがほぼ中性で緩衝作用をほとんど持たないから、
炭酸イオンとかの不純物の影響をモロに受けて、水素イオン濃度が変わってしまう
ということでした。

690 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/15(金) 00:50:16

ビスファチン論文取り下げ勧告のソースは？？

691 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/15(金) 02:23:28

新聞も読んでないなんてさすがピペット土方ｗ

692 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/15(金) 08:18:37

>>670
Taqの活性を除かないと行けないと思ってたけど、気にしなくても
いいのか。

693 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 00:00:42

２０年前の生物学の会話だな

694 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 00:34:46

フェノクロ抽出エタ沈するに決まってるだろ、このボケ

695 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 00:43:35

プライマーにGCクランプつけて、変性剤勾配ゲルで分離して、分離したバンドを回収したらクローニング終了。
1kb以内なら、１レーンごとに20～30個のバンドに分離できる。
シャーレ１枚分がゲル１レーンに相当し、ベクターもコンピテントセルも要らないから、コストが１０分の１に。

696 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 13:08:44

日本語でＯＫ

697 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 13:31:22

DNA抽出（RNA抽出→cDNA作成）→
PCR→
エタ沈→
制限酵素処理→
アガロース電気泳動→
ライゲーション（ＴＡベクター）→
コンピーテントセルに導入→
培養（カラーセレクション用プレート作成）→
コロニー回収

こんなの面倒臭すぎるだろう。

DNA抽出（RNA抽出→cDNA作成）→
PCR→
DGGE→
ゲル回収

せっかくPCRやってるのに、大腸菌で増やしたりして、意味不明だ。
メチレーションも起きる。
2kb以上のDGGEは難しいから、YACクローンとかにする場合は理解できるけど。

698 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 13:41:15

>>697
　
そのフラグメントをベクターに最終的に入れて使う人間が大部分だと思うので、
喪前さんの言い分は　“極めて少数派”　の人間についてのみ成り立つなｗｗｗ

699 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 13:43:24

慣れとか熟練とか材料の違いがあるのに、実験がうまく逝かない理由を他人のせいに…

アホですか

700 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 13:47:05

>>698
普段はダイレクトシークエンスで配列を読むのに使ってる。
ライゲーションだけ最後にやっても、コストは半分以下だと思うよ。

701 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 14:04:06

>>700
　
ligationしたものを結局はコンピタントセルで増幅せなｲｶﾝとしたら大して変らんだろ？ｗｗｗ
　
おまけに最近のhigh fideltyのpolymeraseを使えばほぼ配列は間違いないから
sequenceに出すのはせいぜい一つか二つでその重要性は低下してるしなｗｗｗ

702 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 14:25:51

そういえば、high fidelityなのをクローニング用のプライマーに使うと、
プライマーが分解しちゃうんだったね。

703 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 14:34:15

相変わらず初歩のモレキュラーについては熱く語りたくなるみたいだな

704 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 15:40:46

ま、その程度のことすら知らん素人にゃ言われたかねえよな。

705 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/16(土) 16:13:26

さすがピペット土方。

706 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/17(日) 01:53:21

>>694
フェノクロではTaqは失活しないらしいけど、エタ沈してるから別に
問題ないか。

707 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/17(日) 09:08:08

ＰＣＲが増えない！と騒ぐ奴はＲＮＡ調整やcＤＮＡ合成をまずチェックしろ

708 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/20(水) 06:53:34

化粧した姿を本物と見るのは俺だけかもな

709 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/22(金) 07:33:38

ClontechのMatchMakerを使ってYeast two-hybridで新規のタンパク質（X）と既知のタンパク質（A）の相互作用を狙い撃ちで確認しています。

AがbaitでXがpreyの時は相互作用が見られたのですが、その逆の組み合わせで相互作用が見られません。
こうした状況で、これ以上の解析を進めるのは危険でしょうか？一般に、baitとpreyを入れ替えて相互作用が確認されないとダメというものなのですか？

710 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/22(金) 07:58:19

相互作用したからって何だって言うの？

711 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/22(金) 08:05:12

>>710
そういう本質的なこと（Y2Hの限界とか、相互作用検定の意義とか）は言いっこなしでお願いします・・・
本当だったら、私たちの分野としては結構おもしろいので。

712 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/22(金) 09:42:14

baitとpreyをひっくり返してnegativeだからダメということではないよ。
別の方法で相互作用を確認するというのは当然やっておくべきだけど。

713 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/06/22(金) 10:33:46

>>712
ありがとうございます！
さっそく、pull-downをやってみます。m(__)m

714 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/22(日) 16:20:47

あんげ

715 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/22(日) 16:29:55

ネガティブなデータは伏せておくんだよ。基本だろw

716 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/22(日) 17:54:32

>>713
ねらい打ちで任意のものを二つ結合させるなんて簡単だぞｗ

717 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/22(日) 18:20:13

全てのタンパク質ペアには何らかのアフィニティはあるだろうからね。

718 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/23(月) 14:25:10

ISH用プローブ合成の際、サブクローニングしたベクターを、
３’突出末端を形成する制限酵素で処理したものを
鋳型にすると、なんでうまくプローブが合成されないのでしょうか？

719 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/23(月) 14:59:05

実際問題、問題ない
使いやすい酵素でやってる

720 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/23(月) 17:34:47

RNA polymeraseが外れにくくなるからだよ
ってか今の時代、PCRで増やした物をテンプレートにするだろ

721 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/23(月) 17:50:23

TOPO Blunting ligation用のベクターにPCRで増幅したDNAが
どうしても入らないんだけど、insert/vector比とかマニュアルにない
ligationの条件とかあったら教えて下さい。

722 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/23(月) 18:21:00

TOPOが死んでんじゃない？
新しいの買えば一発で入るよ

723 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/23(月) 19:03:24

PCR断片がA突出だったりはしないよな。
コロニーが生えないとか青コロニーばっかりとかもうちょっと詳しく

724 ：位相差顕微鏡：2007/07/25(水) 04:43:37

位相差顕微鏡で菌糸を観察しようと思うのですが
白癬菌のいる皮膚の残骸をどのように処置して
スライドガラスに乗せればいいですか？

お教えください。

725 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/25(水) 10:23:14

古いTOPOと新しいTOPOでびっくりするくらいセルフの数が変わるよ。
俺も買い替えをお勧めする。

726 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/27(金) 02:18:38

>>724
セロテープとかじゃなかった？

727 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/27(金) 19:13:29

ウェスタンブロットはいい、心が洗われる

728 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/27(金) 22:37:10

今TBSTで洗ってるこれはお前の心だったのか。

729 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/27(金) 22:44:16

TBS-母乳ブロッキング？

730 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/27(金) 23:02:24

なんだ。サザンだったらブロッキング剤を分けてあげようと思っていたのに。

731 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/27(金) 23:08:21

アイリッシュミルク？

732 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/27(金) 23:17:16

ペプチド合成でアルギニンがくっつかねーんだよーー！！ボケー！！

733 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/28(土) 10:39:09

コビトさんのせい

734 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/28(土) 13:13:32

どなたかアドバイスお願いします。
SignalPというサービスを利用して、シグナルペプチドの切断予想部位を
確認しようとしているのですが、【HMM】と【NN】という
二種類が表示されてよくわかりません。。。
ご存知のかたいらっしゃいませんか？

735 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/08/01(水) 14:19:17

組織の初心者です。
Free-floating in situ hybridization
とは、通常のin situとどう違うのでしょうか？
この手法はどういう組織の場合に有効なのでしょうか？

736 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/08/02(木) 12:03:57

これがほしい
http://may.2chan.net/b/src/1186023354944.jpg

737 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/08/06(月) 16:37:47

>>734
それは占い師の宗派です。どちらを信じるかはあなた次第。

738 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/08/29(水) 11:15:03

いまSingle cell RT-PCRをやってるんだが、1つわからんことがあるので教えて下しあ。
ほとんどのsingle cell RT-PCRのプロトコールには、RTのときgene specific primerを
使え、と書いてあるのだがどうしてか教えてください。なんでOligo-dtとかランダムじゃ
いかんのだろうか。。。

739 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/08/29(水) 13:07:25

飯台の山羊に聞けよ
変異の入れ方まで教えてくれるぜ。

740 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/08/30(木) 00:36:17

コンタミを入れずに実験する自信があるなら、ランダムでやってみろ。

741 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/08/30(木) 08:18:48

>>740
gene specific primerを使っても、その遺伝子のmRNAがどこからか
コンタミしたら意味ないよな？

742 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/08/30(木) 08:26:23

そうだね
ようするにSingle cel RT-PCRの結果なんか信用できないんだから
やるな
ってことだな

743 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/08/30(木) 11:20:07

>>742
ちょ・・・・

744 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/08/30(木) 12:23:22

>>742
その信用できないところを利用して言いたい放題いってるのが山羊だって言ってるだろが。

745 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/02(日) 19:58:07

だれか解離定数(Kd)の求め方をまとめた本 or サイト知りませんか。
in vitroでdirect interactionはみれるんですがスキャッチャードプロットが
よく分からんのです orz

746 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/04(火) 19:43:19

質問させてください。

ある検定法を開発するために、1つのフォワードプライマーと2つのリバースプライマー（下図）を使って
PCRを行い、AGEで2本のバンドを得たいのですが、そのときのプライマー濃度はどのようにするのが最適でしょうか？

　図）　DNA　　　　 -------------------
　　　　プライマー　　→　　　　←　　　←

テンプレートととなるDNAがあまり精製されていないものなので、なるべく効率よく増幅させないと、目的か達成できません。

経験のある方、よろしくお願いします。

747 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/04(火) 19:53:11

素直にnested-PCRにしなさい

748 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/04(火) 20:01:34

>747
条件検討も仕事のうちだろ。
1回分しかサンプルないわけじゃないんだろうから、PCR酵素の至適プライマー濃度内で何通りか組み合わせてやるしかないような。
その条件からだけじゃ俺はなんとも言えれんな

749 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/05(水) 07:33:12

>>747-748
的外れなつっこみに対して的外れな指摘だなw

750 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/05(水) 15:45:35

ぎゃあ、間違えた。
>748は>746にたいしてだ。これは恥ずい

751 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/06(木) 01:16:12

これぐらいの失敗がなんだって謂うんだ！w
http://cgi.2chan.net/f/src/1189003834012.jpg

752 ：学生：2007/09/08(土) 00:38:09

Miniprep用にsingle colonyから増やした5ml程度の大腸菌＋培地は4℃でどの程度持ちますか？
（Maxi-prep用に）。最高でどのくらいなんだろう？

753 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/08(土) 13:57:57

1mlで十分
液体で保存したことはない
スピンダウンしてペレットにして-20に突っ込んどき
何に使うか知らないが切って確かめるだけなら何年でも持つだろう

754 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/08(土) 14:02:08

ああmaxiかあれって数百mlだっけ?
何にせよ遠心して水捨てて体積減らして置けば扱い易かろ
maxi用っていうけどそれを何に使うのさってなもんや三度笠

755 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/08(土) 23:08:43

>746
マウスのgenotypingに使ってる条件だが、短い断片が600bp、
長い断片が800bpで、短い方がかなり増えやすい。
長い方はおまけ程度に増える。多分短い方をもっと薄めると
ヘテロ個体で1:1に近づいていくと思う。

NEB Taq付属のThermopol Buffer 30μｌ
Takara NTP(確か2.5mMだっけ) 24μl
invitrogenのプライマー（確か100mM）で
共通のプライマー(27mer)　1μl
長い方のプライマー(27mer) 1μl
短い方のプライマー(27mer)　0.67μl
------------------------------
うｐto　300μl　->65℃で濁るまで放置し、ﾌﾟﾗｲﾏｰﾀﾞｲﾏｰ解消。
これにNEB Taqを3μl入れて30μlずつ分注。
尻尾ProK上清をイエローチップ先端にちょっびっと（0.2μｌ程度？）取り、
以下のサイクルで回す。
1) 94℃ 2分
2) 94℃ 20秒
3) 68℃ 1分30秒
4) GOTO 2) REP 39
5) 4℃ forever

756 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/08(土) 23:18:51

> invitrogenのプライマー（確か100mM）で
×100mM
○100μM　だった

757 ：学生：2007/09/09(日) 08:13:55

>>753,4
シングルコロニー > miniprep用 5ml > 一部miniprep > 制限酵素 > シークエンス
で配列が大丈夫なら、miniprepの液体培地を100mlで培養します

758 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/09(日) 09:54:55

>>757
コロニーから植菌すればいいじゃん。

759 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/09(日) 12:55:32

>757
なんか要領が悪いな。それとも貧しいラボなのか？
制限酵素で断片確認するくらいなら、コロニーPCRしてインサートチェックしてから植菌する。
PCRがよくかかるならダイレクトシーケンスだってできる。

760 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/09(日) 13:35:00

どっちだっていいだろｗ

761 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/09(日) 17:00:02

うーんこれはさすがにどっちでもよくね

762 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 19:41:34

ＤＮＡシークエンスがうまく読めない・・・．
トラブルシューティング見るとＴＥバッファ使うなって書いてあるんだけど
それって致命的？プライマもテンプレもＴＥで溶解してるんですけど・・・．

763 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 20:47:19

TE使ってるけど問題ないな。
精製度じゃね？

764 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 21:00:55

読み取り波形がどんな感じかわかれば、原因を推測しやすいと思う。
TEのほうはプライマーを溶かしてるTE程度じゃ影響ないな。
水の変わりにTEでmixtureつくったら駄目だろうけど

765 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 21:22:34

＞７６３,４
ですよなぁ．致命的じゃないよな，普通に考えて．
精製は，テンプレはアルカリ法でＰＥＧチンまでしたります．
プライマは市販ので一応普通のＰＣＲではくっついて増幅するのを確認したります
波形は小さい上に重なりまくり．
ＰＣＲ通した後のをエタチンで精製してたけど
どうしても失敗しちゃうから，ロスだと思ってカラム精製に変えたのです．
でもダメ・・・．
なんか成功するはずの実験で何回も失敗するとやる気失せるよね・・・．

766 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 21:29:17

pENTR?

767 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 21:35:13

＞７６６
ｐＵＣ１８す．ちなみにプライマーはＭ4とＲＶす．

768 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 22:32:34

>>765
試しにRNaseかけてみ

769 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 22:44:33

RNase処理もしてあるんですよ・・・
もう一度かけ直したほうがいいのかなぁ．

教授は『ＰＣＲかけるとき，ちゃんと願掛けしたか？』
などとのんきなことをおっしゃってます・・・．
そんなんでうまくいくなら，ＰＣＲに土下座でもなんでもしてやるっつの！！
と，愚痴をこぼさせてください．

770 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 22:53:04

なんならキアゲンカラム使ってみそ
使用後塩水で洗えば何度でも再利用おＫ

771 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 23:09:09

あれって再利用可能なんだ．知らなかった・・・．
ただ，うちの教授様は精製にカラムを使うのは遺伝子屋のプライドが云々と．
まあ要するに，そんな金がないってことなんでしょうけど．
俺も悔しいんでできればカラム使わずにいきたいっす．
でも，どうしても無理なら仕方ないか・・・．こんなとこで時間とってらんないしな．

772 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 23:09:38

超遠心のスウィングローターのバケットに入れるオープントップの
チューブには、どの高さまでサンプルいれていますか？

773 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/11(火) 23:56:43

波形が重なっているってことは、二つ以上のクローンが混じっている
可能性はないですか？

774 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/12(水) 00:22:48

＞７７３
んん？クローン？？この場合のクローンとはどうゆうことを意味してますか？
すみません，頭悪くて・・・．

ちなみにみなさん，シークエンスの際のテンプレとプライマの濃度いくつくらいでやってますか？
俺はテンプレ２５０ng,プライマは1.6ｐmolなんですけど．
もっと濃度をあげてみるべきですかね？
それともそこはいじらず，やっぱり精製を検討してみるべきか・・・

775 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/12(水) 00:31:12

773さんが言いたかったのは、
2種類以上のplasmidがまじっていることはないのか？ということですよ。

今まで、ほかのplasmidでは、seq読めてたわけですよね？
そしたら精製をチェックするのがいいのでは？
あとはprimerを変えてみるとか。

776 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/12(水) 00:52:27

とりあえず、ポジコンやってみた方が早道かもしれん。
配列によって精製に差が出るとも思えないから、サンプルとプライマーを別のものに変えてやってみたらいいんじゃない？
そうすりゃ少なくとも試薬と精製に問題ないことはわかるし

777 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/12(水) 04:12:16

テンプレートが原因と仮定するが、
シーケンスごとき純度より量のほうが大事だお。
PEG沈なんかしなくても読めるぞ。
かえって回収効率悪くて漏れは嫌いだ。

ﾐﾆﾌﾟﾚしたDNAをRNaseA digestした奴をエタ沈で十分。
RNaseなんか多少持ち込んでも構わんよ。
フェノールは持ち込んだらいけないが。
世の中にはシーケンス用にもっと手抜きしたプロトコルもある。

あと、両側のプライマーが駄目なら多分違うと思うけど、
pUC18てM13の一塩基脱落した奴がいっぱい出回ってるから、
NEBのカタログで確認した方がいいお。プライマーの位置次第では全く読めない。

778 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/12(水) 08:33:27

＞７７３,５
なるほど２種類以上ですか．考えてなかったなぁ．
ただ，値自体が小さいから増幅してないのでは？って読んでるんですよね．
自分でやるのは初なんですが，他の人の実験ではうまくいってるんでやはり精製ですかね．

＞７７６
ポジコンか．急がばまわれですかね．
みんな簡単にしてるからシークエンスごときコントロールなんて
などと思っていた私は非科学的な甘い考えでしたな・・・

＞７７７
ルーチンでＰＥＧチンしちゃってたからなぁ．
プロトコールもいじってみよう．
プライマーと地図ももう一回自分の目で確認しなおしてみます．

フェノール持ち込んじゃいけないってのは知ってるんですが，他になんか混ざっちゃいけないのあります？
最終段階はＰＥＧしてエタチン，残留ＰＥＧのせいってこともあるのでは？と今思った．

そしてみなさん，ありがとう．今日も，もう一回精製から頑張ってみますよ！

779 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/12(水) 08:41:50

＞他になんか混ざっちゃいけないのあります？

RNA, SDS

780 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/12(水) 09:45:27

＞他になんか混ざっちゃいけないのあります？

邪念、捏造とか捏造とか捏造とか

781 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/12(水) 19:41:17

漏れが遠い昔(B4のとき)に何度やってもシーケンスが読めないことがあった。ありとあらゆる試薬を変えてもだめだった。
一ヶ月くらい悩んでいたが、ある時、ある事に気がついて(思い出して)、それから上手くいくようになった。
それは実験が終わる毎にシーケンサーの電源を切っていた事だった。

782 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/12(水) 19:53:35

＞７７９
そいつらは多分混ざってないと思うんだよなぁ・・・．もっかい処理をしっかりやってみますけどね．

＞７８０
今日も失敗したから混ぜようと思ったけど，おかげで踏みとどまった．ありがとう．

＞７８１
それは大丈夫ですね．常につけっぱですよ．

明日先生監修の元やることになりました・・・．なさけねぇ・・・．

783 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/13(木) 10:31:24

すみません。おしえてください。免疫染色の本を読んでいて、非特異的なシグナルが確認される場合、１次抗体が作られた種の非働化血清を２%程度加えてブロッキングすると
良いと書いていました。通常は２次抗体が作られた種（例えばgoatでつくられたanti-rabbit IgGの場合は２%goat searumで１次抗体処理前にすると思うのですが...）だと思うのですが、
単なる記述ミスなのでしょうか？

784 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/13(木) 13:21:27

１次抗体に標識してあるのならそれでおk

785 ：タコ：2007/09/14(金) 16:06:37

すみません、教えて下さい。
細胞のscafoldとなるゲルと、細胞とを分離するための説明文書に
「Centrifuge at low speed for five minutes. Discard supernatant」
とあるのですが、
何回転以下もしくは何G以下が「low speed」といえるのでしょう？

786 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/14(金) 16:18:48

500rpmもしくは1000 x g

787 ：タコ：2007/09/14(金) 16:36:13

ありがとうございました！

788 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/18(火) 14:07:56

細胞をNaOHで溶解させるときに、均一にならずに一部固体になってしまいます。
均一な溶解液にするにはどのようにしたらよいでしょうか？今は0.5NのNaOHを
使用しています。溶解するNaOH量はあまり増やしたくありません。

789 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/19(水) 20:30:43

>>784
ご返答ありがとうございます！確かにそうですね。ちなみに、自作で作った抗体に蛍光やビオチンを自分で標識したり
することは可能でしょうか？知っていたらおしえてくださいm(__)m

790 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/20(木) 07:22:34

おはようございます。
みなさんに質問です。
プルダウンアッセイに使用できるタグはGSTじゃないとだめですか？
FLAGタグ、HAタグではあまりうまくいかないのでしょうか？

791 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/20(木) 07:47:21

プルダウン用のタグはGST、FLAG、HA、myc、T7などなんでもいけます

GSTタグについては試料の内在性グルタチオンが多いときは抗体でプルダウンします

792 ：790：2007/09/20(木) 08:20:41

>791
ありがとうございます！
ネットで調べるとGSTかヒスチジンタグとしか出てこないので
この２つしか使えないものだとてっきり。
ご丁寧にありがとうございました！

793 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/20(木) 08:30:27

・レヂン代をケチれる
・PD後に抗体が混じらない

794 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/20(木) 08:30:36

>>789
ググれば出てくるだろうけど、ほれ。
ttp://www.scientistsolutions.com/t3359-Antibody+Conjugation+Protocol.html

ま、自前の抗体なら２次抗体使って検出した方が楽だし確実だと思うけど。

795 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/20(木) 12:07:11

RNAを２時間程度持ち運びたいときはどうすればいいですか？

796 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/20(木) 12:53:54

エタ沈状態で室温。
溶かしてあるならドライアイス詰めの箱。
まあ２時間ぐらいなら氷詰めでも大丈夫だと思う。

797 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/20(木) 23:04:34

RNAは言われているほど分解しやすいものじゃない気がするけどね。

798 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/20(木) 23:10:26

>>797
その油断が死を招く

799 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/20(木) 23:12:51

精製度が低いサンプルを水に溶かして室温に置くと、あっという間に消えます。

800 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/20(木) 23:18:29

なんと。

801 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/23(日) 14:18:54

エライ人、
シロイヌナズナのBACクローンの入手の方法を
おすえてください。

802 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/25(火) 08:17:31

誰かアドバイスをお願いします。
ウイルスにGFP expression cassetteを組み込んで、ポジウイルスのPlaque purificationを行っているのですが、どうしてもwild typeがコンタミしてしまいます。
wild typeの方が早く複製するのでは？と思っているのですが、確実に分ける良い方法があれば教えていただけますか？
これまでにAgarose overlayとEnd dilutionを試しましたが、いつの間にか全てwildになってしまいます。よろしくです。

803 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/25(火) 21:06:18

タンパク質を電気泳動する場合に移動方向及び移動度に影響を及ぼす要因ってなんですか？

804 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/25(火) 21:55:06

分子量や荷電状態。

805 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/09/25(火) 23:11:23

＞803　タンパク質のコンフォメーション

806 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/10/10(水) 16:05:50

今まで採血と言うとヘパリンを使っていたのですが、うちの先生が今度からEDTAを使いたいといわはって、EDTAだとどのくらいの濃度のものを準備したら良いか調べなくてはなりません。しかし、手持ちの資料とかみても、真空採血管を使うとしかなくて、
5mlのシリンジ＋注射針で採血する時とかはどのくらいの濃度のを使うとか見つかりませんでした。
どなたかご存知の人教えていただけませんでしょうか。
よろしくおねがいします。

807 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/10/10(水) 20:28:15

>>806
http://www.srl.info/srlinfo/kensa_ref_CD/yoki/yoki06.htm

808 ：806：2007/10/11(木) 09:02:49

>>807
ありがとうございました。

ACD-Bっていう抗凝固剤については何か情報はありませんでしょうか？
モレキュラークローニングという本には
citric acid 0.48g
sodium citrate 1.32g
glucose 1.47g
水で100mlに
と書いてありました。
citric acidはクエン酸一水和物、sodium citrateは3水和物なら実験室にあります。
グルコースはカタログを見たら何種類かありますが、D-(+)-glucoseで良いのでしょうか？

ご存知の方がおられましたら教えて下さい。よろしくお願いします。

809 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/10/12(金) 06:00:27

>802
そのウイルスで挿入遺伝子が抜け落ちる報告ってあります？
俺も外来遺伝子を組み込んだウイルス作ってたけど、
俺のウイルスでは「wild typeがコンタミ」はあり得ないので、どうやら違うウイルスのようだ。
wild typeがコンタミって、どういう方法なんだろう？もうちょっと方法を詳しく言ってもらわないとアドバイスできない。

810 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/10/21(日) 21:57:25

mycタグつけてIPしてるんだけど、いまいち落ちが悪い。
抗体はシグマ社のanti-myc agarose使ってるんだけど、抗体が
適してないって可能性はある？
発現自体はラボにあったピアス社の抗体を使って確認してるんだけど、
問題ないんだよなぁ。

811 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/10/21(日) 22:13:56

mycタグはあまり親和性が強くない。3つ繋げると吉
トリプルFLAGタグをおすすめ。

812 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/10/21(日) 22:17:57

>>810
うちはシグマでバッチリだよ。トリプルだけど。
落とそうとしているタンパク質の特殊事情なんじゃない？

813 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/10/21(日) 22:29:12

透析したら前まであった酵素活性が
全部なくなっちゃった・・・

814 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/14(水) 14:17:32

ハイブリドーマからtotal RNAを抽出し、これを基に抗体の可変部遺伝子を5'-RACEで取りました。
プライマーはH鎖、L（k）鎖ともに定常部領域で作製しました。
で、それぞれ10クローンほどシークエンスしてみたら、VH、Vkともに2種類の抗体遺伝子が。
あれえ～？
抗体産生ハイブリドーマって、1種類の抗体遺伝子しか発現してないはずですよね？
このままだと、元の抗体タンパク質を再現するのに4通りの組み合わせを試さなきゃいけない、って
ことでしょうかね？
何かうまい方法はあるでしょうか？
そして、原因に心当たりはありませんか？
ちなみに、H鎖とk鎖の2種類の遺伝子をそれぞれVH1/VH2とVk1/Vk2と表すならば、
VH1：VH2＝６：４、Vk1：Vk2＝８：２でした。

815 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/14(水) 14:23:23

>>814ですが、とりあえず自分なりに考えている原因としては、

1）ハイブリドーマが実は2種類コンタミしている

2）テンプレートのRNAにgenomic DNAがコンタミしている

3）対立遺伝子排除？

ぐらいかと思っています。
一応ハイブリドーマはATCCから買ったやつなので1）はないと思いたいのですが、もし
そうだったら再度クローニングすればいい、ってことでしょうか。
2）だと、5'-RACEで得られたPCR産物の大きさがcDNAのそれと同一だったことの説明
が付かないように思います。
3）はよく分かりません。対立遺伝子って、再構成が止まってmRNAの発現も止まってる
ものだと思っていたのですが、違うのでしょうか。。
アドバイスお願いいたします。

816 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/15(木) 15:32:05

抗体精製のために抗原カラムを
作ろうとしています。
このカラムに流す抗原量ってどれくらいだとうまくいきますか？
ちなみに、GEのNHS-activatedを使う予定でいます

817 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/15(木) 15:39:02

マニュアル読めよ・・・。

818 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/16(金) 12:35:03

NdeI切れNEEEeeee!!!!
誰かこつか何か知らないか？

819 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/11/26(月) 21:55:07

Ｌバッファの酵素は切れにくいな
ＤＮＡ溶液からの塩の持ち越しに弱いから
ってNdeＩはＨばっふぁじゃないかｺﾞﾗｧ

820 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/20(木) 08:42:04

>>809
レスありがとうございます。
同じく、外来遺伝子が抜け落ちたのかと思ってPCR&SQしてみたんですが、やはりwildタイプでした。
セレクションが楽な遺伝子を使えれば良かったのですが、後で局在を見たいのでGFPを使っています。

相同性組み換え（効率は数%）でGFPカセットを入れたため、組み換え後はどうしてもwildとrecombinantのミックスになってしまいます。

発想を変えてGFP posiの細胞をcell sortしてみたところ、割合が改善されたような気がします。

821 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/20(木) 17:24:16

PCRを時間が無かったため途中で止めたんですが、
何かしら悪影響はあるのでしょうか？

822 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/20(木) 18:00:29

はぁ？ゆとり教育はこれだから....

823 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/20(木) 21:59:57

止めずに４℃保存で良いんじゃない。
シークエンシング反応とか、クローニングとか多型解析とかでは４℃で放っておくとダメらしいけど。

824 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/20(木) 22:22:02

ゆとり同士は会話がつながるんだなｗ

825 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/21(金) 06:39:17

ありがとうございます。今、コロピが上手くいかなくて何回も頑張ってるので、有り難いです。

826 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/21(金) 08:40:35

>>821
>>823
>>825

何？この会話
誰か翻訳してくれw

827 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/22(土) 01:40:01

PCRかける時間がないって

くだらない
研究やめろよさっさと

828 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/22(土) 09:17:52

PCRって、サーマルサイクラーがないと大変だな。

829 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/22(土) 20:41:51

実際に昔　３温度のお湯にちゃぷちゃぷ漬けたＰＣＲをやってたって人が
今は教授って年代だよな

関係ないけどキア●ンから英文の年末年始挨拶メール来た
こんなの去年来なかったような・・・

830 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/22(土) 23:00:27

キーエンスのメールは助成金情報かいててまだ使える

831 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/23(日) 10:47:00

>829
漏れその油浴行ったり来たりするタイプの奴使ったことあるぞ。
当時はかなり値が張ったらしいが。

832 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/23(日) 22:32:51

>>831
いくつですか？
自分36ですが、学生の頃はもう機械でしたよ
まだ高価でそんなに普及はしていませんでしたが・・・

833 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/27(木) 18:21:04

すいません　質問です。
ＲＮＡ抽出のために臓器を破砕する必要がでてきました。
この程度のホモジナイザーであれば、凍結組織の破砕は可能でしょうか？
http://www.tech-jam.com/scientific_research_equipment/homogenizer/KN3318820.phtml
教授に頼み込んでクライオプレス入れてもらった方が後々良いのかなぁ・・・金ないんだよなぁ

834 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/27(木) 18:36:28

乳鉢でも買ってろ

835 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/28(金) 07:09:00

>>833
凍らせた組織をハンマーで砕くのがおススメ
台の部分が高いかも（液体窒素で冷やして使う、クライオプレスと同じ奴？）

836 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 18:37:46

すみません。教えてくださいm(＿)m。
一般的に濃度の薄いDNA溶液は、ブタノールで濃縮してエタ沈しますが、
ブタノールで沈殿までさせてしまって７エタで洗うっていうのじゃ
やっぱりダメなのでしょうか？

837 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 18:45:33

クロスコンタミを嫌うなら、ビーズ破砕がお勧め。
微生物扱う人は、たいていビーズ法で抽出する。
クロスコンタミを気にしないなら、乳鉢の中で液体窒素に浸しながらゴリゴリやるだけ。

でかい組織を扱うときはハンマーが必要だね。
オートクレーブした袋に凍結組織を詰めて、上から叩いて細かい破片にする。
大きな組織だと、どの部分の破片を拾ったかで結果が違ってきそうだけどｗ

838 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 19:02:03

dsRNAで処理すると dsRNAの領域だけ発現量が増えているんですがこんなことあるんでしょうか？
脊索動物なんですが
ちなみにdTプライマーで逆転写してるのでdsRNAが増幅するはずはないです
未知のメカニズム？

839 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 19:28:49

意味がわかりませんｗｗｗ

840 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 19:51:30

少し省略しすぎましたw
ある生物にdsRNAを打ち込んで表現型を見るような実験をしています
まずは予備実験としてリアルタイムPCRで目的の遺伝子の発現量が減少しているかを確認しているのですが
dsRNAの中に含まれる領域で作製したプライマーでは逆に発現量が増えていました
一方dSRNAの配列の外で作製したプライマーでは減少していました
少しずらしたプライマーも複数作って再現性を確認しているので間違いないのですが
dsRNAの配列が生体内で増幅するようなメカニズムはあるのでしょうか？

841 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 20:22:59

打ち込むdsRNAの外側の配列を含めてPCRやらないと、
打ち込んだdsRNAを検出しているだけになるのでは。

842 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 20:32:47

ちなみにテンプレートはdTプライマーで用意していますのでRDRPが仮にあっても増幅する機構は説明できません
複数の遺伝子で確認しています

843 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 20:35:25

dsRNAがcDNAに変換される理由がわかりません
ちなみに予備実験でdsRNAを逆転写してみましたが
PCRでは何も増幅してきませんでした

844 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 20:45:18

脊索動物に生息していた微生物がポリ(A)ポリメラーゼで
ポリA配列を付加した？

845 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 20:54:07

自分もpolyAポリメラーゼの可能性を考えていました
440さんが微生物だと考える理由は？
内在性のものかなとも思ったのですが
両端にあるdsRNAプロモーター配列にポリAシグナルが混入している可能性も考えています
果たして二本鎖にPOLYAを付加するのかも疑問ですが

846 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 20:54:48

間違えた
844さんだ

847 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 20:56:45

この生物にdsRNAを安定化させるメカニズムがあったら面白いんですが

848 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 23:19:10

テンプレートのDNAがコンタミって落ちだろｗｗｗｗ

849 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 23:27:09

逆転写のときに途中で止まった奴がｄｓに兄ーるして逆転者

850 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/29(土) 23:58:44

いやテンプレートはdnase処理してるし
そもそもdsRNAもヌクレアーゼ処理済
複数の遺伝子で再現性が取れてるんだが
こんなことはありえるんだろうか
たしかに逆転写産物がプライマーとしてはたらいている可能性は否定できないが
予備実験でトータルRNA＋dsRNAをチューブ内で混ぜてdTで逆転写してもその領域の増幅に寄与しないから不思議

851 ：845：2007/12/30(日) 00:00:49

このデータを解釈する限り細胞でなんらかのプロセシングが起こっていると予想される

852 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/30(日) 04:41:58

ポリAがついたのかもな？

853 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/30(日) 12:40:48

だったら、ランダムプライマーを用いたコントロール実験のデータとか、
dsRNAの外側にある標的RNAの配列を含んだ長めのプライマーセットを使った
リアルタイムPCRのデータとかがないと証明できない。

少しずらしたプライマーというか、かなりずらしたプライマーでやらないと
リアルタイムPCRでのdsRNAのコンタミがないことを証明できない。
サイクル数が長すぎて変なものを増幅していないのかも気になる。

854 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/30(日) 16:08:44

ランダムについては実験中
リアルタイムPCRの特性上 300塩基以上とかあまり長いものは無理だからしてない．
下流上流いろいろなところに作ったけど
この領域だけ増幅してる

855 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/30(日) 23:15:24

2kbのインサートと5kbのベクターを2種類の制限酵素で切ってライゲーションして
トランスフォームしているんですが上手くいきません

ゲル出しの時、UVを使っている（貧乏＆慣習でこれしか使えない上に波長もよく分からない）んですが、
これによるライゲーション効率への影響を今疑っています。

よく長時間のUV照射でピリミジンダイマーによる阻害が起こるといいますが
どの程度の時間で、UV照射によるライゲーション効率への影響が出てくるものなのでしょうか？
（少しでも駄目か？）

みなさんの見解を教えてください

856 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/30(日) 23:46:26

波長は重要

857 ：845：2007/12/30(日) 23:48:07

ポリAの付加って核内で起こるよな？
ポリA付加かは疑問だなあ

858 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/30(日) 23:52:36

>>855
普段ゲルの写真撮ってるUVの波長じゃダメだお
波長を切り替えられるやつ使えばおk

859 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/12/31(月) 00:00:29

>>856 >>858
レスありがとうございます。
波長は切り替えられない型なんですが波長はどこからどこまでぐらいがゲルだしに向いてるんですか？

860 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/05(土) 23:55:03

>>859
254はアウト、365ならおｋかな？？
ってか切り出しゲルと確認ゲルを分けろよ。
同じゲルに確認用に微量流すwellと切り出しように流すwellを用意して泳動後に切断。
確認用ゲルでバンドの位置を確認したら同じ切り出しゲルの同じ位置を切り出す。
これならUV暴露しなくてもサンプル取れるだろ。

861 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/06(日) 01:14:30

切り出しが目的で微量のバンドでないなら、UV当てなくても目でバンドが見える染色剤使えば？
Gel Indicatorとかしか知らないけど。UV浴びなくて済む。

862 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/06(日) 09:07:13

何も切り出す間ずっとスイッチを入れておく必要はない。
一瞬UV当ててバンドの位置を確認してスイッチオフ。
そして切り出す。わからなくなったらまた一瞬だけスイッチオン。
254のみしかなくても普通にライゲーションくらいできる。

863 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/06(日) 12:10:52

写真をゲルサイズと合わせておいて、切り出しの時に重ねる

864 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/06(日) 13:07:10

うん
確認用と切り出し用に分けるよりも
ちょいちょいとＵＶ当てては切る
というのをお勧めするよ

確認用にはちょっとだけ
切り出し用にどっさりアプライ
というのは人情だけど
これだと泳動位置がよくずれるし

865 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/06(日) 15:57:15

それでRFLPとかのバンドを切りだそうとして、いつも苦戦している。
カッターで切り離すとわけがわからなくなるので、パスツールとかしか使わない。

866 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/07(月) 13:59:25

254で切り出して何回もやってるけど
そのあとｼｰｸｴﾝｼﾝｸﾞして確認するがﾐｭｰﾃｰｼｮﾝ入ったことなんてないよ

867 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/07(月) 14:31:00

まあ切り出しのUVをさっとやるってのはUV灯長持ちさせるためのお作法だわなw

868 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 19:55:17

どなたか教えて下さい。
PCRのプライマーが分解してしまっているかどうかを確認する方法なんてありますか？

869 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 20:05:14

確認する前に買いなおせや
確認に使う試薬の方が高いわ

870 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 20:12:55

20%ゲルでPAGE

871 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 20:42:16

>>869
確かに。一本千円しない罠。

872 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 20:43:00

１本１万円はするだろ。どんな安物使ってんだ？

873 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 21:31:24

20%ゲルでPAGEやっても、試薬代は200円もかからないよ。
12レーン流せば、1プライマーあたり１６．７円。

プライマーが高いなら、自分で確認することを勧める。
オリゴ屋を儲けさせても意味がない。

874 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:00:59

お前の時間はそんなに安っちいのか？ｗｗｗ

875 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:24:44

原因もわからないままプライマー注文しなおして、イライラしながら数日待つよりは、
さっさとゲルに流しちゃった方がマシ。

オリゴ屋にPAGE精製頼んだら、１本で５０００円取られるよ。
１２本なら６万円。

876 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:35:06

ゲルに流して予想より短い→再注文
ゲルに流して予想と同じ→合成ミス？→再注文

はいさようなら

自分でPAGEするのと業者にPAGE精製頼むのは同義語かね？
低学歴君ｗｗｗｗｗｗｗ

877 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:39:53

>>868
分解したかどうかって話でしょ。

878 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:40:17

>>871
その激安オリゴ屋さんどこ？

>>875
分解してるのではないかと疑うからにはそれなりの理由があるんだろう。
分解してるんじゃないかと疑って、わざわざオリゴ屋にプライマー送って
確認お願いしたり、PAGE精製を頼む奴はいないだろ。
これは変だと思ったときに合成を頼めば３０００円で１，２日待てば
いいだけ。

879 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:45:34

> 872 名前：名無しゲノムのクローンさん[sage] 投稿日：2008/01/08(火) 20:43:00
> １本１万円はするだろ。どんな安物使ってんだ？

どこのインフレーションだよｗｗｗ

880 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:46:06

>>876
ひょっとして東大や京大の出身じゃないのに生物板に張り付いてる？

>>878
スモールスケールなら１本２００円か。

>>868は100mer以上とか多重標識とかで、高価なプライマーだから
分解を気にしてるのかとおもた。

881 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:47:45

100mer以上を20%PAGEで分解チェックするってすごい目の解像度ですねｗ

882 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:49:23

100merなら１２％ぐらいで良いのでは。

883 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:51:20

100mer以上でPCRｗ

884 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:51:35

>>880
その激安オリゴ屋、煽りじゃなくマジでどこ？
どこも一塩基あたり５０円は切らないのかと思っていた。

885 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:53:20

>>883
やることあるよ。クローニングとか。

886 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:53:36

4mer200円です

887 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:57:50

ちなみにイン○トロジェンで購入したプライマーをTEに溶かして使いました。
乾燥体の時は何時間か室温に出てましたが溶解後はすぐに冷凍保存しました。
それでDNaseが混入するってなかなかないですよね。
お金が豊富にあればいいんですが、残り少ないので何か確認できる方法があるかなと思いまして。

888 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:58:15

平然とおかしなことを答える奴もいれば、煽るポイントがずれてる
奴も混ざっている。
ピペドの闇は深いなｗ

889 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 22:59:36

>>887
プライマーも自由に買えないようなら研究の仕方を考えたほうが良いと思うよ

890 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 23:03:09

>>887
残り少ないなら新しく注文しろｗ

891 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 23:03:59

とりあえず一杯おごるから落ち着けよおまえら
http://up2.viploader.net/upphp/src/vlphp118598.jpg

892 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 23:04:29

>>890
>>890
>>890

893 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/08(火) 23:24:40

>>884
学内でやってないの？
オリゴの合成機があれば１本２００円以下でできるよ。

894 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/09(水) 03:44:25

887 名前：名無しゲノムのクローンさん投稿日：2008/01/08(火) 22:57:50
ちなみにイン○トロジェンで購入したプライマーをTEに溶かして使いました。

このあたりに問題があるように希ガス
うちでは水で薄めているよ
EDTAがＰＣＲのバッファと喧嘩するから

895 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/09(水) 08:58:34

>>893
灯台では聞いたことがない

896 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/12(土) 01:48:58

>>894
どんだけﾌﾟライマーいれるんだよｗｗｗ
そんな問題じゃない

897 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/12(土) 11:59:57

いま直径２５マイクロくらいの細胞に顕微注入やってるんだが、どうしても針がつまる。
なんとか針を詰まらせない方法はないですか？

898 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/13(日) 23:57:36

あげ

899 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/14(月) 05:57:58

遠心してジョウセイを取るかマイクロフィルターでこせ

900 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/17(木) 11:25:00

>>868
そもそも、なんで「分解」って思ったのさ？
単にPCRが失敗しただけ？

901 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/22(火) 16:04:16

http://www.uploda.org/uporg1213371.jpg.html
上の方にあるゴミバンドが何度やってもでる・・・

サンプルバッファーだけ流しても出るし
それが悪いんだろうと作り替えても出る。
10Kの限外ろ過通してもでるしなんだこりゃ・・・

ボスになんとかしろって言われてる(´･ω･`)

902 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/22(火) 19:01:43

ボスもここ見てるから気をつけろよ

903 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/23(水) 04:27:25

Σ(ﾟДﾟ；≡；ﾟдﾟ)
サンプルバッファーの成分を単品ずつ（沈めるためグリセリンは入れる）流していったら
メルカプトエタノールのレーンだけバンドが出た。
こいつか・・・

新しいの使って作り替えてみるぜ。

904 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/28(月) 14:40:21

新しいのに変えても出るー・・・
もうわからん＞＜

905 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/28(月) 15:13:14

2-MEは電気泳動用のを使っちゃいなよ

906 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/29(火) 22:42:04

泳動用とかあるんだー

銀染について調べてたら、
ここのトラブルシューティングにもろこれっぽいことが書かれてた。
http://www.shiyaku-daiichi.jp/support/elt/pdf/sec_3.pdf
ケラチンかもしれないし手袋はめて注意してやってはみるけど
バンドというにも変な感じだし毎回出るってのも・・・
2-ME抜いたらでないし2-MEっぽいんだよなあ。

明日発表スライド提出ってのになにやってんのか分からなくなってきたよ。
ここまでしてやらせる意味あるのかなあ・・・

907 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/29(火) 23:10:49

ケラチンみたいな不溶性のタンパクが泳動用の試薬のどれかにコンタミしてるんじゃない？
ジスルフィド結合を切ってやらないとうまく流れないから見えないだけで．

908 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/29(火) 23:23:44

>>907が正解だ。2-ME入れるとゲルに入るようになってバンドが見える。

909 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/29(火) 23:44:32

こういう話もあった。
ttp://science6.2ch.net/test/read.cgi/life/1027110406/19-22

910 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/30(水) 02:07:58

ありがとう(ﾉД`)
ゲル作成の試薬とかは作り直さなくても良いかな？
トリシン系なんですごい手間で・・・
スライドも作らんといけんし泳動バッファー作り直して
手袋はめて再チャレンジしてみる。

サンプルバッファーは他の研究室から借りたりして
試薬変えまくったけどだめだった(´･ω･`)

911 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/30(水) 07:41:11

>>910
既製のゲルで条件に合うのはないの？

912 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/31(木) 06:29:54

既製ゲルはおそらく買わせてくれないｗ
結局作業はさっきやりましたー
銀染だから結局検出されちゃったりして、とどきどき。

913 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/31(木) 21:51:12

東大京大以外は出禁だったのか・・・

914 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/02/01(金) 08:55:06

シングルストランドのＤＮＡを処理しようと思っています。マング豆酵素とＳ１ヌクレアーゼ
どちらも同じような活性をもっているようですがどちらのほうがお勧めですか？

915 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/02/01(金) 15:01:14

グライナーの大量でも1延期20円だろ？
定価ベースだと日本イージーティーが最安値のはず
俺は翌日派だから因美だが

916 ：912：2008/02/13(水) 17:05:21

手袋はめてやったら大丈夫だった！
遅れましたがレスくれたみなさんに感謝＞＜
はやく修論まとめて解放されたいなー

917 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/02/13(水) 23:44:21

oriCプラスミドを構築中：
大腸菌とグラム陽性菌間のシャトルベクターを作製中
グラム陽性菌のoriCと思われる部分をPCRし大腸菌vectorにLigationするも
部分的に削れたものしかinsertされず困っています。
なにかコツなどはあるのでしょうか？

918 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/02/15(金) 00:43:38

>>917
どのように削れているのか？端っこだけか？

919 ：917：2008/02/16(土) 01:53:02

自分の扱っている菌ではoriは明らかになっておらず
近縁種の情報を元にクローニングを試みています。

全長約800bpのうち5'側の約400bpが削れたものが一つ取れました。
しかし、この領域だけではoriとしては機能しないようでした。
大抵の場合はinsertなしのプラスミドしかとれてきません。
topoシリーズのvectorも使用してみましたが、insertありのものは
未だに取れていません。

oriCプラスミドとは、このように構築しにくいのが普通なのか
それとも手技が悪いのか判別がつかず諦め切れない現状です。

920 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/01(土) 10:28:01

最近久しぶりにPAGEやってて、
チューブに5ulサンプル入れて、100℃、10分放置したら蒸発。
どうしたらいいんだっけ？忘れた。

921 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/01(土) 13:00:19

>>920
液量少なすぎ。ﾎﾞｲﾙ時間長すぎ。

922 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/01(土) 16:21:18

118 ：Nanashi_et_al.：2007/01/03(水) 05:55:23
博士取得、ﾎﾟｽ毒、助手、助教授となって感じること

自分にとってこの実験ができなければドロップアウト、
このデータが出なければセミナーで袋叩き、学位が取れなければのたれ死に、
とかプレッシャーを感じてスキルを磨いてきたのに
いまどきの学生どもは簡単な実験ができなくても恥と思わないし、
失敗は何でも人のせいにしやがる

120 ：Nanashi_et_al.：2007/01/03(水) 08:35:34
>>118
研究そのものが価値が無いとされる時代だからしょうがない。
あなたのとこの学生も、別に研究で生きようなんて思ってないよ。

121 ：Nanashi_et_al.：2007/01/03(水) 10:39:39
>>120
そうだよな、学位とった方が野垂れ死にする確率高いだろう。
中途退学してどっかの企業に潜り込めた方が、再起出来る確率高くないか？

923 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/01(土) 18:44:52

>>921
もう少し精密な議論をすると、
PCRチューブなら96分処理を結構するのでｻｰﾓｻｲｸﾗｰ
（トップも加熱する）もので防げるというのは？
普通どう処理している？
オイルとか。

924 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/01(土) 19:58:36

>>920
ボイルしなくてもいいと思うよ

925 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/04(火) 14:57:52

>>923
10ul×5分なら蒸発しないんじゃね？

926 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/05(水) 06:22:33

何回やらせても院生はクローニングできない
PCRの太いバンドが見えるのにエタ沈したり、制限酵素できったり、アガロース電気泳動から切り出し精製できないとか、トラフォメでコロニーがまったくでないとか、一つもインサートがないとか

教員がやると二日で終わるのに

927 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/05(水) 06:45:20

> 制限酵素できったり、アガロース電気泳動から切り出し精製できないとか
こんなことやってるうちにどんどん効率が落ちるよ
宵越しの実験はしないのがPCRクローニングのコツ

> 教員がやると二日で終わるのに
２日で終わらすから２日でできるのだ

928 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/05(水) 07:04:40

できない子はＴＯＰＯでもGATEWAYでも失敗するしＷ

929 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/05(水) 08:59:47

漏れKODで殖やしたPCR産物を普通にSmaＩサイトにライゲーションしてクローニングできてるから
キットなんか使わないし

930 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/05(水) 12:46:06

またレベルの低い自慢話が始まったな

931 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/05(水) 13:30:41

>>926
単に指導力不足でした
ありがとうございました

932 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/06(木) 20:52:33

Fランク私大の生命科学科か？

933 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/09(日) 11:30:30

site directed mutagenesis （PCR）後にエレポで
大腸菌にトランスフォームしてますが、コロニーがほとんど生えません。
生えてもネガティブ（変異していない）クローンばかり。
ケミカルコンピテントの方がいいのでしょうか？

934 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/09(日) 11:33:01

らいげーしょんがおかしい

935 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/09(日) 12:27:55

ポジコンなしかよ。

936 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/10(月) 08:43:46

>934
site directed mutagenesisやったこと無いバカは書き込むなよ

937 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/10(月) 16:32:15

>>933
今からPCRテンプレートのプラスミドをエレポして帰れ。で明日報告しる。
そのプラスミドで濃度を振ってコンピのタイターを出せればさらによし。

>>936
まったくだ

938 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/10(月) 21:33:30

どうやって１本鎖にしてんの？
向きは？

939 ：34：2008/03/11(火) 04:47:49

一周ＰＣＲでセルフライゲーションでないのか？

940 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/11(火) 05:13:52

逆向きに入っててプライマーがくっついてなくて
コンタミした２本鎖がトラホメしてる

に１０００めけ

941 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/11(火) 05:17:30

> 大腸菌にトランスフォームしてますが、コロニーがほとんど生えません。
-> コンタミした２本鎖がトラホメしてる
> 生えてもネガティブ（変異していない）クローンばかり。
-> 逆向きに入っててプライマーがくっついてなくて

942 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/11(火) 08:38:24

stratageneかinvitrogenのマニュアル通りやれば馬鹿でも出来るぞ
塩濃度が高くてエレポがうまくいかないか
テンプレートプラスミドの濃度が悪いか
PCRのサイクルがおかしいかのどれかだろ

ケミカルでやってみろ

943 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/11(火) 09:17:48

プライマーはstratageneのサイトでデザインし、反応はKODplus＋５％ＤＭＳＯ
これ最強

944 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/13(木) 08:06:08

大腸菌の膜表面に発現したトランスポーターを抽出したいんだけど
できるだけ安価な方法ってないかな

945 ：933：2008/03/13(木) 09:02:35

いろいろありがとうございました。
ケミカルコンピでやったら成功しました！
mutagenesis PCRをかける前のプラスミドはエレポでもうまくいきました。
なぜmutagenesis PCR後はエレポだとうまくいかないのか（謎）
取り急ぎ報告まで。

やっぱりケミカルコンピを使っている人が多いのかな。。。
脱塩しなくていいのでこの場合はやりやすいかなと思いました。

946 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/14(金) 23:32:25

脱塩したりパルスかけたりしてる間に、
ライゲーションしてるわけじゃないからバラバラになるんじゃね？

947 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/18(火) 18:51:34

タンパクに 6xHis タグつけたものを哺乳類細胞(HEK293)に分泌させて、上清を
QIAGEN の Ni-NTA ビーズにくっつけて精製するっていう実験をやっています。

小スケール(10mlぐらい)だとビーズにくっついてくれるんですが、1L ぐらい流すと
途中からなぜかサンプルが流れ出てきます。途中まではくっついてるみたいなんですが。
誰か解決策を教えてくれませんか？

948 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/18(火) 19:17:09

上清を一度、硫安塩析するかして濃縮してからカラムにかけろ
培地の中の低分子がHisタグタンパク質とNi-NTAビーズの結合に競合するのかもしらん

949 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/20(木) 13:07:31

冷凍してある脳の神経細胞組織から脂質を抽出したいんだが、
どうやれば良いか分からないから教えて欲しいんだ
普通は乳鉢に液体窒素と組織を一緒に入れて砕くと思うが、今ラボに丁度いい乳鉢が無いんだ

どうすれば組織をパウダー状に出来るだろうか？
良いアイディアをクレクレ

緊急だからageる事を許してくれ＞＜

950 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/20(木) 13:25:20

乳鉢買えよ。注文して１週間で解決するぞ。

951 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/20(木) 13:30:13

>>950
急ぎの用なんですよ＞＜

952 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/20(木) 13:46:54

隣のラボから借りろ

953 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/20(木) 14:32:29

>>952
今日は

・・・祝日・・・orz

954 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/20(木) 19:13:34

ゴールデンハンマーを使う

955 ：947：2008/03/20(木) 22:30:12

>>948
ありがとうございます。
培地が原因かどうか確かめてみます。

956 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/27(木) 17:56:27

いま細胞にインジェクションする系を立ち上げてるところで、
インジェクション用の圧力媒体にフロリナートを使うか、流動パラフィンを
使うかで迷ってます。いまいちこの二つの違いがわからないのですが、
それぞれの長所と短所を教えていただけませんでしょうか。

957 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/03/28(金) 12:15:59

age

958 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/04/17(木) 14:15:53

カエルの血液から血小板を濃縮して得たい。
血液遠心じゃなぜか赤血球のそう（沈澱）と血漿しか文革されない。
人の場合、血漿と赤血球の層の間に白血球＋血小板が来てることから、
その辺をとってみても赤血球ばっかりしかない。
まじでまいった。たすけてくんろー

959 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/05/23(金) 20:32:12

>>958
カエルにかぎらず血球分離の基本を勉強すべし。

960 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/05/25(日) 09:29:44

CO2インキュベーターのボンベが空になってたんで取り替えたらなんか不調です。
扉を開閉するとCO2が２％くらいまではあがるんだけど、その後じわじわ下がってきて０％まで落ちちゃう
なんでや～～～～っ(;_;)

とりあえずHEPES培地に足しといたけど、週末だし誰もいないしどうしたらいいんだ！

961 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/09(月) 05:45:38

DNAを制限酵素で切った後、サザンはイブリダイゼーションを行っているのですが、
どうもうまくバンドがでません。メンブレンにはきちんとDNAが移っているようですが、
それ以降の操作で注意すべきところはありますか？

962 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/09(月) 08:12:57

プローブがまずいんでないか？

963 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/09(月) 12:33:54

プローブにしている箇所が40bpぐらいしかないもので、
PCRで増やしてプローブ作製ということができず（標識されにくいため）、
配列はわかっているので、そこを業者に頼んで5’ビオチン標識してもらい
プローブを作製しています。

プローブは私も気になっていたのですが、例えば5' GATCGATCGATC3'
の配列に対するプローブを作るとき、プローブの配列は
5'GATCGATCGATC3'になると考えているのですが、本当にこれで
あっているのでしょうか？何か相補鎖なのに左に5'の状態で業者に
頼んだので、どうにも不安というか、これで相補鎖になっているのかと思ってしまいます。

964 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/09(月) 14:25:15

なんでこいつはたとえでパリンドロームを出すんだ？
狂ってんじゃないの？

965 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/09(月) 14:32:03

サザンなのに相補鎖とかそうでないとか考える必要があるのか？
5-3の向きを3-5で注文したら駄目だとは思うが。

966 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/09(月) 21:10:55

ひんと：ゆとり

967 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/12(木) 21:52:08

キアゲンのDNeasy　Blood　Tissue　Kitで動物の肉からDNA抽出しています
最後は滅菌水でDNAを溶出させています。収量をはかろうと、分光光度計（ナノドロップ）を
使っていますが、波長幅がめちゃくちゃで、はかれません（２６０nmが吸収極大になるような
測定結果が得られません。吸収極大でなくてもそこでピークと認識できるような波形でないです）

このキットのプロトコルでは、分光光度計で収量を測定するには、それを妨害するような
物質も、抽出しているのでしょうか（その後、エタノール沈殿処理等で精製すれば
測定できるのでしょうか）。それとも私が下手なのでしょうか

968 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/12(木) 22:29:09

溶出後のpHは大丈夫？
TEじゃないのはなんで？

969 ：967：2008/06/12(木) 23:29:45

>968　レスありがとうございます。PCRでは目的バンドは出ます。
pHは測定したことがありません。
TEでない理由は、
（１）TE中のEDTAが、PCR時にMgを捕まえて、DNA合成酵素の働きを
弱めるため、用いない。
（２）長期間保存するDNAではなく、かつ2、3回しか、抽出後用いないので、
EDTAで、Mgを捕まえて、DNA分解酵素の働きを弱める必要はないだろう

ということで、憂慮すべき事項が　（１）＞（２）とラボでなり、滅菌水で溶出しています。

上の方でも似たカキコミがあったと思いますが、PCR20～25uLの系で、DNA合成酵素
付属のMg入りバッファーを1倍濃度になるように加え、プライマー（TE溶液）2uL、
鋳型DNA（TE溶液）4～5uLの場合、TE中のEDTAがDNA合成酵素を弱める恐れは
ありますでしょうか。

実際やってみて、PCRがうまく行かないなら、Mgを増やした方がよいでしょうか

希釈前のDNA合成酵素付属のMg入りバッファーのMg濃度は15mMです。

970 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/13(金) 00:20:09

カラム抽出はRNA用以外は低pHだと溶出効率が低かったと思う。
多分マニュアルにも書いてあるはず。

吸光度測定もpHが7-8程度じゃないと安定して図れないはず。
EDTAが駄目ならＴｒｉｓ-HClでpHだけでもあわせといたほうがいい。

ＰＣＲはMg増やすのもありだと思うけどとりあえずやってみたら？

971 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/13(金) 11:41:25

>>969
0.1TEを進める。
このレベルなら、影響する実験がかなり限られるし。
まあ、PCR程度なら分解してもそんなに問題ないから、水でもいいんでない？

分光光度計はわからんが、一度濃度が分かってるサンプルで測ってみたら？
測り方が悪いのか、サンプルが悪いのか分かると思う。
それと、取説にその辺のことは書かれてないの？

972 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/13(金) 22:50:48

>>969
TEにはEDTAが1mM
これを反応系に入れるとfinal　0.2mMくらい

PCR系はTakaraのを見てみるとfinal　1mM

確かに考えてはしまいますが、自分は、これくらいは許容範囲かと思ってやってしまいます。
Mg2+を増やすと言っても1.2倍？
反応系容量を増やして、TE持ち込みを相対的に減らすと言うものありかと。

ナノドロップの特性ではないですが、pHが中性域でないと吸光度がうまく計れない、
という噂は聞いたことがあります。

「DNeasy　Blood　Tissue　Kit」
は使ったことないですが、いま取り説web版をざっと見たら
「純水製造装置で製造された脱イオン水にはpHの低い
ものがあり、DNA収量が低下することがある。水で
溶出する場合は、水のpHが7.0 以下でないことを確
認する。」
とあるので、溶出バッファーAEが、Kitでミソの部分かもしれませんね。
（実験室のプロトコールは尊重すべきだとは思いますが

乱文失礼

973 ：967：2008/06/17(火) 10:11:48

皆様れすありがとうございました。pH8～9程度の緩衝液で
溶出させて見ます。
>972　様　ありがとうございました。おっしゃるとおり、説明書p.22に
その旨の記載がありました。バッファーAEはEDTA濃度が半分な
pH9のTEバッファーなようです。

説明書をもっと読むこととします。ありがとうございました。

974 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/17(火) 10:45:53

10 mM Tris-HClで溶出が正解だとおも。主な理由二つは既に心ある方が説明して下さってる。
Qiagenのミニプレキットなんかの添付溶出液は10 mM Trisだけだったりするじょ。
吸光の結果から察するにDNAの溶出がうまく行ってなくてDNA/タンパク比がえらいことになってるような気がするなあ。
収量少なくてもタンパクが混じってても、PCRに使うだけならまあいいっていやぁ大丈夫なんですがねぇ。

それ以外には遠心したサンプルからカスを吸い上げないように注意するのと、洗浄液のエタノールがとんじゃってないか気をつけるくらいしか思いつかないや。

975 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/22(日) 12:01:20

ゲル撮影装置について教えてください
CCDカメラによる撮影装置を買おうと思います。
ただ予算制約上、東洋紡のFAS３とかは無理です
トランスイルミネーターに黒四角の箱を乗っけて
デジカメで撮るタイプにしようと思うのですが（１０万円前後）、
使い勝手はどうでしょうか。経験者のかたアドバイスお願いします
・ピント合わせが面倒
・デジカメの小さい画面でしか泳動像が確認できない
　（像を確認してから、カメラセットすればOK?）
・画質がしょぼい
等お願いします。
エチブロやsybrreen染色のを撮る予定です（後者メイン）

976 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/06/22(日) 12:11:39

ttp://www.tech-jam.com/items/kn3360895.phtml
たとえばこのような感じです

977 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/07/10(木) 19:08:55

DNS法で還元糖の定量をしています。

グルコースを標準物質として検量線を作成して、サンプルの還元糖の濃度を
求めているのですが、濃度がマイナスになってしまうことがあります。

アドバイスお願いします。

978 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/07/10(木) 23:49:57

　　　 ,,,,┯,,,,　
　　彡(･) (･)ミ　
　　彡　д　ミ_　
⊂彡,, 　 ,,,　　ﾐ⊃
　　彡　 ,,,,　　ﾐ
　　彡_ﾐ　ミ_ミ

ケダマンがあらわれた！！
「>>975 はもうちょっと考えてから質問しろ。
・デジカメだったらオートフォーカスだろう。
・７００万画素の画像が小さいのか？
・画質もデジカメ次第
もちろん、フィルターはエチブロ用とサイバー用ついてるよな？」

979 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/07/11(金) 11:42:33

バンドが明るければ、オートフォーカスで撮れるけど、
暗いとマニュアルで合わせないといけないと思う。
ちょっとイイデジカメなら、マイモード（カスタムプリセット）
があるけど、安いものにはついていないので、毎回マニュアルで
ピント合わせが必要になるかも・・・・。
１０万円前後のものにについているフィルターはゼラチン（今は
アセテートかな）フィルターか、ケンコーフィルターで、UV管が
写ると思う。

980 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/08/17(日) 22:12:36

分光光度計でのDNA吸光度（A269/A280）について教えてください
1.7-1.9が良く精製されたものだ、と聞きますが、私が測定したところ
（シリカメンブレンによる抽出キット。RNaseA・タンパク質分解酵素k加える工程あり）
2.5を超えてしまいました。筋肉細胞からですが、DNA量が多かったり、
もしくは、たんぱく質量が少ないとこのような数字が出るのでしょうか。

210-310nmのスペクトルで、変に260が飛び出てたり、280がへこんでたり
というのはありませんでした。また、抽出DNAを電気泳動したところ、
23kbpより長いところにこいバンドがありました。
（抽出DNA中ではミトコンドリアDNAは鎖上でしょうか、●状でしょうか）

981 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/08/31(日) 12:51:44

>>980
2.0を大きく超えるのは糖鎖の混入じゃなかったっけ？