▼今実験でうまくいかないこと▼パート5▼

いま実験でうまくいかないことスレッドです。
グチからアドバイスまで幅広く語り合いましょう。

★過去スレ★

いま実験でうまくいかないことｽﾚｯﾄﾞ
http://cheese.2ch.net/life/kako/967/967541407.html
▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/
▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼
http://science2.2ch.net/life/kako/1026/10263/1026312578.html
▼今実験でうまくいかないこと▼パート4▼
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1093050850/

☆主な関連スレ☆

◆生物学専門家への質問はここに書き込めPart15◆
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1116773294/
◆2ch高校生のための生物質問板　3時間目◆
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1115527096/
質問に対して小学生でも分かる説明をレスするスレ
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1108460479/
タンパク質の精製３
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1104733094/

>>970=1
激しく乙!!
アンタ男気あんな。ホレたよ (*´Д｀*)

ｽﾏｿ
sageちゃったのでもういっちょパピコ
>>1　乙!!（もういっちょう言っておこう

前スレが議論の途中で1000レスになっちゃったね。
パート５があったんだ。
アゲます。

だから
いやん
つったのに

早漏気味に立てたから
重複スレが勃っちゃったぢゃないか
ヽ（｀Д´）ﾉ

こっちが本スレですよage

で，，，
だな

前スレで
フェノクロはきちんと遠心しろということだったけど
本当？

その昔
ハイパービンボーラボにいたときのこと
フェノクロはチビタン１０分でやっていたが
大丈夫だったよ
ちなみにｒｆｃは１５０００*ｇの１分２０秒分

なぁ、エチブロ染色したゲルってどう廃棄すればいいか教えてもらえませんか？
今までは普通の燃えるゴミで出してたんですけど…
なんか他の研究室では集めてどうにかしてるとか聞いちゃって不安で不安で

>>8
そのまま廃棄は日本では禁止。
ちゃんと濾過処理してください。

ゲルをろ過するんかい。

>>9 脳内禁止かよ

>>9
ゲルをゲルろ過するんかいｗ
詳細よろ。

>>7
別にフェノが水層から取り除ければ問題はない。
残ると非常に困るからきっちりと遠心するのが万国共通だと思うぞ。
別にビンボーラボだからといって遠心時間を長くしても大して変化は
ないと思うけどな。電気代も払えないんだっつうんなら別だが、そこまで
して実験すんなとは言いたくなる。事故のもとだ。

>>10,12
そちらはどう処理してます？

萌えるゴミとして捨てる

俺の場合、助手の先生に萌えているわけだがｗｗｗ
もうね、大事にしてもらってますｗｗｗ

エチブロはハイターと混ぜて排水溝へデカント

色気のある後輩に気を取られて悩んでいます．

>>13
可燃ゴミとして捨ててる。
ゲルでしょ？バッファーじゃなくて。

>>16
ハイター禁止
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1118469739/l50

ハイターは毒性がupするらしいね。
きっちりフィルターかけましょう。

>>8
普通の燃えるごみってのは本当に普通の燃える一般ごみか？
実験用可燃ごみじゃなくてか？
つぅか一般用に出してﾀﾝならアンタの研究室停止喰らうぞ。

>20
>つぅか一般用に出してﾀﾝならアンタの研究室停止喰らうぞ。
世間知らずな奴がいるよ、プッ
どんな文書にも、「エチブロ」を一般ゴミで捨ててはいけない
なんて書いていないんだけど。
チミは妄想の中では、どういう法律が制定されているんだい？
チミの妄想レベルはグリーンピースと同レベルだナｗ

くれぐれも、奴らみたいに暴力には走るなヨｗ
いきなり射殺されたら、こまっちゃうｗ

>>21
エチブロは、日本じゃそのまま捨ててはいけなかったはず。
そのまま捨ててもお咎め無しなのは、アメリカとかのラボじゃないの？

>>11でも既に脳内禁止と･･･

>>22 ここにも脳内禁止が･･･

で、リアルではどうなんだよ！

>>25
いや、リアルでダメなはず。

リアルでは
規制はない
はず

劇物及び毒物取締法の別表にはリストアップされていない
水質汚濁防止法にかかる政令には排出基準は示されていない
土壌汚染対策法にかかる有害物質ではない

以降エチブロの話はこのスレで禁止ね。　エチブロって実験か？

サイトトラップ上手くいってるラボある？

人生が上手くいきません

どうしたらよかですか？

人生って実験か？　以降人生の話禁止ね。

すまんが、少し聞いて欲しい。
レトロウイルスの作成するのに、すごいことにGag/polプラスミド
く手に入れたい。ウイルスベクターとエンベロープはあるんだが、
gag/pol はどうやったら手に入りますか？
宝があるみたいだが、自分で増やすのはちよっと、、、。といわれてしまった。（だめとは言われなかった）。
使ってみてもいいのかな。切実です。

>>31

万物の創造主の壮大で気まぐれな大規模網羅的ハイスループット実験です＞人生色々

>>27
排水溝に直でてんぷら油を捨てるくらい良くない。
明文化して規制はされてないけど、常識としてはダメって言うレベル。

他に言い直せば、道で煙草吸って、ポイ捨てするくらいいけない行為。

テトラサイクリンとかカナマイシンを
入れた大腸菌などの培地、オートクレーブした後どうしている？
下水とかに流すと、耐性菌を増やす原因になるから、環境に放出は
だめ、といわれたが・・・・

いくら抗生物質でもオートクレーブやブリーチ処理したら大丈夫やね。

＞耐性菌を増やす原因になる
これ本当？

P1系の大腸菌なら、多分下水で条件が良ければ生きていけるかも知んないけど、
薬剤耐性形質はプラスミドで持ってるから、耐性発現不要の場合はプラスミドが無くなっちまうよ。
だから、無問題。

でも、確りオートクレーブに掛けて殺すのが原則。
守らんと、停止処分。

そうじゃなくって、
菌は死んでも耐性遺伝子は残るということでしょ。
それがナチュラルコンピテンスで取り込まれて、
まかり間違って広まったらどうするの？って話。
可能性はあるけど、それを言ったら何もできなくなる。
オートクレーブ後の菌使って、
PCRかけたらどうなるんだろね。
増えちゃったりして^^;

今どきアンピシリンでもないだろうがな。

>>39
いや、取り込めない・

つーか、自然にある DNaseで分解されちまうだろ。

でもウンチや肥料中の微生物フロラや元になった食材や植物材料を推定
するためPCRやれるぢゃん。

DNAはけっこう強いよ。

PCRはかかるかもしれないけど、直鎖になってるから、機能しないんでは？
と考えるがどうだろう。

下水とかにいる菌が耐性持つのが問題になってたら、
もっと対策とってるだろ。

だから大丈夫。といってみる・・・

DNA/RNAの混合水溶液を加熱処理してRNAを選択的に壊したいのですが、
文献で加熱時間と分解されるRNA量を記載しているものがあれば、御紹介
頂けませんか？

RNAseじゃだめなん？

RNase使わずに済む方が良いので……
（フェノクロせんで済むし、最低限のサンプルをPCRチューブに
　入れてサーマルサイクラに乗せるだけで済むから……）

素直にRNAse使うのがベスト。

PEG沈は？

>>48
PCRすんならRNase使えば？

ほんで、もしかしてフェノクロ('A`)ﾏﾝﾄﾞｸｾとか考えて質問してるなら、
ここでこの質問は終わりね。

>>51
フェノクロは別にマンドクサくないですけどね。
むしろ、酵素反応が（99%は分解してくれると信じることが出来ても）
100%だと信じられないので他の手段を、と考えているのですが。

>>52
RNaseは100%逃げられない。

いんや
tRNAとかきつい２次構造のは
結構残ることがある

RNAってアルカリで分解しなかったっけ

するよ。

タンパクのイオン交換クロマトを初めてやってるんすけど、
カラムから出てきません。カラムの中でアグってるのでしょうか？

塩濃度をきっちり上げましょう。
大体２Mまでグラジエントかければ大丈夫だと思う。
あとカラムから出てこないって言ってるけど、なんでカラムの中に
たんぱく質が残っているのか分かったの？
タンパクがすでに流出している可能性だってあるんじゃない？

カラムに捕まっていないんじゃないか？
バッファーｐHを下げたり　上げたり　サンプル塩濃度を下げるのも重要かと

法

アガロースゲルから核酸を抽出するカラムみたいに、
アクリルアミドのゲルから核酸（RNA）を抽出できる
カラムってありませんか？
ギルバートバッファーでオーバーナイトするの面倒くさい。

すみません，教えてください
１個の大腸菌内のプラスミドをさらに大量に増幅させる薬品ってなかったでしょうか？
名前をど忘れしてしまいました．

クロラムフェニコールでアンプリフィケーションかけることか？
あれはpBRなんかには有効だけど、高コピーのpUCやpBluescriptにやっても
あんまり効果ないよ。

>>61
切り取り→キッチリすり潰し→TE５０度（忘れたがそれくらい）/１ｈ→遠心→TE/rt/30〜1h→
遠心→kitもしくはcolumnで精製
でいけるハズ。
温度とか時間はかなり適当に今日は書いてるけど今度ノートみたらまた書き込むよ。
ｵﾎﾞｴﾃﾀﾗﾅｰ('A`)

素直に培養ってのが一番早いんじゃ・・・

>>61
Roche Applied Science のNAPIマニュアルか、
QIAGENのWWWサイトに何かあるかもよ。

RNAseのコンタミを疑ってるんですが、RNAseがコンタミした場合、RNAサンプルの濃度を測定するとどうなるのですか？
さきほど測定したら1000ng/μl程度だったのですが、これはRNAは壊れていないと判断しても良いのでしょうか？

リアルタイムPCRなんですが、今まで特異的産物しかできなかったプライマーだったのに、突然プライマーダイマーのみ生じるようになりました。水やプライマーを作り変えても効果は見られず…。どなたか原因がわかれば教えていただけませんか？

>>67
RNaseを壊すってのはどうやってます？
というかRNA調整するさいにRNase入らないように気をつけましょう。

>>68
リアルタイムでどうやってプライマーダイマーだと分かったんですか？
ゲル流して確認したんだったら、RNA調整の段階を疑うか、温度を上げて見るとか・・・
あと、遮光してなかったんだったら、チミンダイマーできてそれが悪さしたとか。
いずれにしろ新しいプライマー買うのが良いかもしれませんね。

>>67
経験上なので確かではないけど、同一の方法で精製した壊れてない
RNAの吸光度と比較すると、260/280の値が若干上がる。

だけど普通は電気泳動だろうなぁ。

リン酸カルシウム法って、room 15minとかあるけど、１−２minでいいって診たことあるがどうなんでしょう？

>>69
RNaseを完全不活性化する条件においたら、他の物質もおじゃんになるワナ？

>>71
細胞へのトラフォでその短時間処理は聞いたことないが・・・・
いまはリポフェクトアミンとかが主流のような希ガス

そこで天草ですよ。

>>73
>>71はDNAとリン酸カルシウムの共沈殿形成のためのインキュベーション時間のことでしょ。

どっちにせよ1minとかは早すぎだと思うのだが・・・

効率悪くなって困るんならキッチリ時間かけてやったほうが良くﾈ？

>>73
それ、高いから・・・

(´・ω・)　と、細胞が専門外の俺が言ってみる。

そういや、リン酸Caやリポ以外に、エテクトロがあったよね。

---

1minは流石に短いと思われ。
全く無理って事は無いだろうけど、焦って失敗したほうが時間がかかる希ガス

>>77
細胞に遺伝子導入しないと結果でないような研究室はどこでも
今ではリポフェクトアミン使ってると思うぞ。
高いが効率良いし結果も良い。
お試しあれ

>>66
ありが�d。
キアゲンにはアクリルアミドゲルからのDNA抽出キットがあって、
RNAにも使えるかどうかメール出しました。
「よく分かりません」という返事でした。
ロシュについても見てみます。

>>71でつ。今、原書を確認しました。
羊土社の必ずうまくいく遺伝子導入うんたらかんたらでつ。
P84のレトロウイルスの項、メモ部分。リン酸Caのページではないです。

今高校で実験してるのですがイモリの再生実験は何ヶ月ぐらいかかるんでしょうか?
あとどんなことをしたら実のある実験になるでしょうか?
発表まであと一ヶ月と１３日ありますがその間でどうにかなるものでしょうか？
お願いします困ってるんです教えてください

>>81
真面目な話、切断箇所を色々変えたサンプルを複数用意し、
実験は並行で行う事を勧める。また、同じ条件も複数並行で進められると吉。

あと、何か化学物質による何ちゃらとかも同時並行でやると、吉。

くだらん質問だが、教えて欲しい。２９３T細胞でレトロウイルス作る時、
中には、最初LTRも、gag-polも、envも無い。という事は、増殖能の高さを
利用しているだけなのでしょうか？もっと増殖能が高い細胞で、transfectionしやすい
細胞があればOKってことですか？

>>83
増殖能力というよりも、
めちゃめちゃtransfectionしやすい細胞だから使っている
んだと思う。
ただなぜそうなのかはわからん。
誰か知っている人はいるかな？

ありがとうございます
わかりました

電気泳動→トランスファーで、
トランスファー後のメンブレンにいつも一番上のマーカー
（２００ｋＤａ付近の）が全く写りません。

セミドライトランスファーの時間を３０分から３５分、４０分と
長くしても全く変化ないですし、逆に下のマーカーが
オーバートランスファーになってしまうくらいです。

一般に高分子は転写されにくいという事ですが、
自分だけ特に見えないように思えます。
他の人と同じようにやってるつもりなのに。

原因がわかる方、よろしければ教えてもらえませんでしょうか。

>>86
今どんな条件でやってるのかしらんけど
バッファーのSDSの量を変えてみるとか、ゲルの濃度薄くするとかやってみたら？
あとトランスファーの時間を30分から40分ってあんま意味なさそう。
どうせだったら熱に注意しながら60minとか90minとか思い切って変えてみるべき。

>>86
そりゃ、均一には行かんぜよ。
高分子側がよく移るようにすれば、低分子側はもう逝っちゃってるね。
特に自分のだけ、ってことは無いぞよ。

「博士を取るか？、潰れてくたばるか？ここが正念場だっ！」と毎日狂ったように実験に打ち込んでいた時期が私にもありました（AA

>>86
200kDaをセミドライで効率よく転写するのは大変だと思うよ。。
>>87の条件を検討しても上手くいかなかったら、
いっそ、セミドライを諦めてウエット式にしてみるのも手かもね。
あと、CAPS bufferの系も試してみても面白いかも。

セミドライ式とタンク式とどう違いますか？
おれはタンク式が好きだけど、好きな理由は特に無い。

>>91
長所：セミドライの方がバッファー少なくて済む。低分子量だと転写が速い。
短所：>>90の言うように高分子量は移りにくい。といってもp300を転写させたこともあるけど。

>>86
3MMペーパーは何枚重ねてる？長時間転写してるとフィルターにしみ込んだバッファー組成も変化してくるから、少し多めに重ねた方がいいかも。

温度上昇するとトリスの緩衝能が低下したりしてまずくないですか？＞セミドライ

アブラセミドライ
クマセミドライ
ニイニイセミドライ
ヒグラシドライ
ツクツクオーシドライ
アサヒスーパードライ

ハンマーヘッドシャーク・ドライ

SELDIって何？MALDIの田中幸一さんノーベル賞と違うの？

実験
(>_<)先輩の24分の一の速さですっ
もっと速く器用になりたいでつ

助教授の先生は、僕の48倍のスピードで仕事をこなします
(T_T)
速く成りたいでつ

MALDI：Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
SELDI：Similar Electron of Laser Desorption/Ionizatin
つまり電子類似体を飛ばしてその分子を決める技法。
Nopel Awardくらいは取れるんじゃね？

>>97
つまりお前は実験していないって事だろ？ｗ

>>94
さりげに、この板の住人には分からなそうなドライ法が二つ混じってるなｗ
ということで「オジサンドライ」も加えてやってくれ。

電子類じたいを飛ばしてる？本当ですか？どの論文に、雑誌に載ってますか？

>>97
お前がアホみたいに遅いのでなければ
その先輩とか助教授の先生は人間じゃねえ。
3倍とかならともかく24倍とかってなんだ。
きっと背中にチャックがついてて、中には超精密機械とか入ってるんだ、うんうん。

>>102
アホみたいに遅くない実験でも、
助教授の先生は成果を出すのが６倍です。

なんといっても、やり方が、違うんです。

何の実験かは秘密ですが、
あくまで仮にの話しですが、僕はただのピペット万だけど
先生は、エッペンドルフの８連のピペット万を使うから
などの理由からです。

お前らやっぱあほの集まりだな？もっと勉強しろ、腐れども

>>103
ならお前も8連使えよｗ

トランスファーネタがあったので便乗させてくれ。将来の教授候補様ども。

サザンで、〜100kb亭緒までのDNAをHybond-N+にトランスファーしようと
してるんだが、メンブランにトランスファーされる時とされない時がある。
こういう経験ってない？　あったなら体験談と改善法キボス。

こっちのコンディションは、0.5xTBEゲルでPFGE（パルスフィールド泳動）
で分離したDNAを、塩酸処理（0.25M HCl）30min、変性処理（1.5N NaOH、
0.5M NaCl）30min、ブロッティングはスタンダードの下から上へ、
0.4N NaOHで12時間程度。重しはシグマの無駄に分厚いカタログを乗っけてる。
翌日見ると、バッファーはカタログまで到達するほど、キムタオルは濡れ濡れ。
んで、ぺったんこになったゲルをEtBr染色するとDNAがゲルに残ってる時と
残ってない時がある。

改善してくれた殿方、奥方には漏れなくAknowledgementに掲載予定。よろ☆

サザンか　( -o-)y-..oO○
なつかすぃ

バッファの濃度とか忘れたけど
アルカリブロッティングではなかったな（20xSSC）
あと
台に砥石みたいな多孔質の石を使ってた

パルスフィールドじゃなかったけど
ノンカットの高分子ゲノムDNAもほぼ転写されてた

　　　∧,,∧
　　（　 ･ω･）
　 ＿|　⊃／(＿＿_
／　└-(＿＿＿_／
‾‾‾‾‾‾‾

　 ＜⌒／ヽ-、_＿_
／＜_/＿＿＿＿／　　

>>105仮にの話しですすめると、改良された方法だとミスるんだよな（汗

８連は使えるよｗ


まあ、下手なんだよorz
(ToT)

>>109
何がどうやったら下手に扱えるのか分からないんだが

まぁアレだ。
取り扱い説明書を一日二回くらい読めば上手くなるんじゃね？

>>106 それは重石が重すぎるに３万クレディール。
トランスファーはアガロースが薄くなってからはほとんど進まない。
ペーパータオルがふらつかない程度の重さがあればオケ。

アガロースゲルからのキットを使ったDNAの回収がうまくいきません。

キアゲンのカラムのキットとビーズに吸着させるQIAX、
それからバイオジーンのキットを使って、
1-10kbのバンドを何度も拾ったけど、回収率は十分の一以下だった。

キットの溶液にゲルが溶けているのもちゃんと確認したし、
電気泳動せずに同じキットを使って精製すると
５割から７割回収できることを確認しているので、
キットの操作の問題ではない。

原因がさっぱりわからず困っています。

先輩に一回やってもらったら？

ゲル回収の収率ってそんなもんさ．
吸光度で測定できることのほうがマレ．

>>112
吸着させるときのpHと溶出させるときのpHは大事だよ。
その辺気をつけてマニュアル読み返してみなされ。
あと長めのDNAは付きやすく剥がれにくいので、
65Cで溶出させると回収が若干よくなる。

でも7-80%で回収したいなら透析チューブに入れて電気泳動で出すのが一番。
めんどくさいけど素人でも効率よく回収できる。

> 電気泳動せずに同じキットを使って精製すると
> ５割から７割回収できることを確認しているので、

回収率悪くない？それはさておき

2種類のキットで独立に回収してるのに10分の1以下というのは
操作方法が悪いか、根本的に勘違いしてるのではないだろうか。

>>116
だからそれはpHがズレてるんだよ。
「電気泳動しない時は回収悪くない」のだから、
後はゲルから持ち込みのバッファーしかない。

キアゲンのQIAEXのマニュアルには「溶液の色が黄色でない時は NaOAc(pH5.3)でpHを合わせろ」
と書いてある筈。

皆さん有難うございます。

>>113
例のごとく、分子生物学を立ち上げたばかりのラボなので、近くに詳しい人がいないのです。

>>114
そんなもんなんですか???!!!

>>115　>>117
pHは確認しています。
pHがずれてると溶液が紫に変わるのですよね。
ちゃんと黄色のままです。念のためにKOAcなんかを入れてもだめでした。

>>116
普通は8割とか9割くらいなんでしょうか？
何か根本的な勘違い・・・ちょっと考えて見ます。

>>112
濃縮しようとしてエタチンとかすると、ゲルかすに絡み付いてTEに
溶けなくなっている、とか。

ゲルから切り出すとダメだってことに再現性があるなら、
そのステップをいちいちチェックしてみたら？
ＵＶのかけ過ぎって可能性もあるんじゃない？

>>118
じゃあ透析チューブにゲル入れて電気泳動で出す方法にしたら？
何かがおかしいけど、>>112の情報からでは判断できない。

まあ皆さんが必死なところ悪いんですが。

本気で２chでアドバイスをもらおうとしている時点で終わりですよね。w

>>122
高校生・大学生ならともかく、これが院生やラボで働いてる人なら、
正直この道は諦めた方がいい気がする。

最近は、偏差値の高い国立出でも使えん奴多いしね。
偏差値のあんまり高くない理系私立のほうが数十倍良い仕事したり、良い発見したりする奴が多い。

驕り高ぶってラボ内で質問したりせず、ネットでヘルプ発してる時点で俺は終わりと思ってるが。

またまた有難うございます。感謝です。
>>119
キットなのでエタチンは全く行ってないです。
ゲルはバッファーで完全に溶かして何度も洗浄してますので、
残っている可能性は低いです。

>>120
泳動は0.6〜1.5%アガロースをMupidで流しています。
ゲルはGTGアガロース、染色と切り出しはMupid Blueで行っています。
以前にエチブロで染めた時も、クリスタルバイオレットで染めた時も
同じような結果でした。ゲルから漏れてるのかなあ。

>>121
時間があれば透析チューブは今度試してみようと思います。
かなり技術と手間と時間が必要だと聞いていますが、どうなんでしょう？

>>122
終わっているどころか、まだ始まってもいませんよ。

ゲルの容量の見積もりが甘くて、NaI濃度が足りないとか？
多めに入れてコストを別にすれば悪いことはないから、そうしたら？

卒研生、院生がキットを使う等、軟弱だ。
DNA断片の切り出し精製などアガロース切片をパラフィルムで挟んで潰して染み出た液をフェノール／クロロフォルム抽出すればよろし。
mini,prep.もRNA抽出も全て自作試薬でするもんだ。

アガロースやポリアクリルアミド以外で、DNA断片がすぐ回収できるような
電気泳動用ゲルはないの？

まさか制限酵素で切った時にそれぞれのバンドのDNA量を計算せずに
全体の重さで計算してないだろうね。

プライマーがもっといろんな種類がほしいです。

私は植物系なんですけど、参考までに皆さんが使っているプライマーについて教えていただけませんか？

アクチン、ユビキチンなんかの基本的なもので結構ですので。

ゲル回収キットの溶解液は案外DNAとくっついてくるよ
溶出後　フェノクロ　エタ沈すべし
エタ沈だけだとへんなもやもやが出てくる

>>130
まあ回収後何に使うかによるけどね。
ライゲーションくらいだったら別にする必要ない。

説明の上手な>>112の言う事を解釈すると
恐らくゲルが多すぎ．キットにもよるけど
ゲルの持ち込み量が多すぎると回収率が
著しく下がる．東洋紡のマグネット使う奴は
あんまりゲルの量は関係なかった．
キアゲンは結構センシティブ．
プロメガはその中間くらい．
エッペンドルフはプロメガと同じくらい．
って感じだったけどお前らはどうよ？

>112
QIAEX2は日常的に使ってます。
自験例では、取扱説明書に準じた操作を行って0.3〜7kbの範囲のDNAの精製を
しましたが、Agaroseからの切り出しでは、7kb近い方のバンドの切り出しでも、
50%程度のyieldを得ています。(短い方はもっとyield良いです)
＃yieldの推計はOD260値で行いました

ちなみに、ゲルは SIGMA Agarose Low EEO で、エチブロ入りの
TAEバッファに漬けて流しています。

QIAEX2なら、
　ゲルの固さに応じて黄色のバッファの量や水を合わせているのか
　ゲルが溶けきるまで温めて・ボルテックスしているのか
　黄色バッファでの「二度目の洗い」を忘れていないか
を伺いたいです。

>112
鷲は電気泳動する前のDNAの純度を疑っちょる。
アルカリ-SDSでとったプラスミドはRNase処理をしても、
急高度で濃度の定量はできんぎょ。
PEG朕までするとかなりましだが。

要するに急高度を当てにせず、
電気泳動する前のDNA（ストックしてある奴）を数段階に希釈したレーンと、
ゲル抽後のDNA全量を流すレーンを作って
エチブロで染めろってこった。

今夜もありがとうございます。

>>123
やっぱり終わってますか・・・・・orz　お言葉、肝にめいじます。
ラボ内やラボ外の親しい人に分子生物学に明るい人がいないもので・・・
ラボ外のあまり親しくない自称分子生物学に明るい人に相談したところ、
「ダメなときは何してもだめだね。休暇をとれば？」との有難いお言葉をいただきました。

>>125
ゲル溶解バッファーはマニュアルより多めに入れているんですよ。

>>124
すみません。軟弱者で。「軟弱者！」ってセーラさんの台詞でしたっけ？

>>127
すぐに回収と言えば、ミリポアかどこかが1回の遠心だけでDNA回収するキットを出していると聞いたことがあります。

>>128
さすがにそれはないです。

>>129
オンラインジャーナルを読んで、方法に書いてある配列をコピー＆ペーストで注文。

続きです。

>>130-131
と言うことは、やはりキットを使わないでフェノクロ　エタ沈した方が早いかもということですか？
でも私の場合、ライゲーションだけなので大丈夫かな？

>>132
ゲルの持ち込み量が多い時には、バッファー量を増やしてもダメですか？

>>133
ご指摘の点はかなり気をつけて実践しております。

>>134
今まで吸光度でやっておりました。
軟弱者なのでキットで大量抽出していますので、大丈夫だとは思いますが、
今度ご指摘のように確認してみようと思います。

今までバンドで測定したことがありませんで、そういった確認をしておりませんでした。
確かに吸光度はあてにならないかもしれませんよね。

ゲルってすぐ敗れたり台形になったりするんですが
皆さん何を気をつけていますか？

＞キットなのでエタチンは全く行ってないです。
＞ゲルはバッファーで完全に溶かして何度も洗浄してますので、
＞残っている可能性は低いです。

DNAもきれいさっぱり洗い流してそう。


＞泳動は0.6〜1.5%アガロースをMupidで流しています。
＞ゲルはGTGアガロース、染色と切り出しはMupid Blueで行っています。

もしかしてTBE使ってない？NaI融解時あたためてる？

＞時間があれば透析チューブは今度試してみようと思います。
＞かなり技術と手間と時間が必要だと聞いていますが、どうなんでしょう？

そうでもないよ。


素人はキット使えば手軽で簡単確実だと思いがちだけどさあ、
理屈わからないでキット使うとドツボにはまるって言う好例だよね。
自前の試薬でやってみ。難しくもなんともないし、効率もいいから。
ただし、リクツをちゃんと理解してないとおなじことだが。

これでgatewayが普及したらどんな馬鹿な質問が来るのだろうか、、、、、

ゲルのＦｉｘって何？

>>136
ビーズで取るのはもう止めたら？
透析チューブを切ってオートクレーブして水で洗えばもう使えるから。
で、中にゲルスライスいれて、適当なバッファーで満たして、両端をクリップで止めて、
泳動槽で１５分流して、UVでゲルからDNAが出てるのを確認したら、溶液をエッペンに移して、
フェノクロして、エタ沈で回収率８０％〜９０％はいく。

ビーズで条件検討したり2chに書き込んでる回答待ってる間にできるよ。

>>112
迷わずシープラークGTGを使った方が楽だよ。
温度だけで解けるし、そもそも回収しなくてもゲル中で酵素反応できるし。

>>142
それも素人向きだな。
精製するにはフェノクロ何回もやらなきゃならんが、
確実になにがしかの量は回収できる。

普通のアガロースゲルでDNAを流してゲル切片をパラフィルムで挟んで押しつぶして
フェノールクロロフォルム抽出しる。これが一番簡単だ。

2DGEのでかいアクリルアミドゲルを作るとゲルの上に
柔らかくて粘着な層ができてしまうのだが
これは要するに重合が不完全なわけ？

質問です。どうしてフェノクロ抽出がいるの？

DNA抽出・・・

スピンカラム式で問題ないはずだが？ゲル抽出なしでリカバリ5割は低い。ロスってる。
PCR産物のように大量のDNAが得られるのであればミリポアのUltrafreeDA。
遠心10分でクローニングに必要な量は十分に得られる。

キット使ってうまくできませんとかいうやつは大抵添付プロトコルを読んでいないか、
読んでいても実験手順のところだけ。トラブルシューティングすらできない。
特に放置プレイ得意なラボの場合、原因がもっと根本のことが多い。
ひどい場合には水にDNaseがコンタミしたり、
我流で編み出したのか知らんがとんでもない実験手法をしていることもある。

変性剤勾配付きのゲルでDNAの泳動をやる予定なのですが、
バンドの蛍光強度からDNA量を定量することは可能ですか？

二本鎖DNAの定量ルーラーは、変性剤勾配ゲルでは利用できなさそうなので
通常のPAGEと平行して実験すべきか迷っています・・・

>>112
147を読み、まさかとは思いましたが、確認：

　洗い用のバッファ、使用前にエタノールを加えましたよね？

例外：Stratageneのマニュアル

こいつだけは信用しない。

皆様、厳しいお言葉ありがとうございます。

>>138　　>>136
TBEは使ってません。TAEです。プロトコールどおり温めています。
透析チューブはラボにないので週明けに注文ですね。

皆さんのアドバイスされた点に気をつけながら、
もう一回キットを使ってみて、それでもダメなら、透析チューブやフェノクロを試してみます。
ありがとうございました。

>>142-143
やはりフェノクロが確実ですか。
フェノクロ使うと、何も知らないボスから「臭い！」とか「廃液が・・・」とか嫌味いわれるんですよね。
でもしょうがないですよね。そんなのには負けていられない。

>>147
リカバリ五割は確かにロスってますよね。
バンドの濃さではなく吸光度で量っているのも原因かも知れませんが、
根本的なところをもう一度チェックしてみます。

>>149
さすがに、エタノールは完璧加えています。ボトルにもチェック入れています。

半分回収できたらいいんでないの？

あの．．．ライゲーションでしょ。何でそんなに手間かけるの？
ゲルをつぶして浸み出した液を0.5ulも取ってそのままライゲーションに使えばいいでないの。
普通に数百個はコロニー生えてくるよ。

定量性がない。よって使えない。

数字で表せないものはサイエンスではない。

>>153
だいたいコンピのふえが悪いんだよ。途中のステップどんなにがんばってもコンピのふえが悪ければコロニーは生えず当たりにも当たらない。
コンピの増えは保存の温度が全て。　作るときに駄目なのは論外。

>>148
DGGEの事ですか?
事前に吸光度測定などで濃度が分かっているDNA（E. coliとかでoｋ）を
違うレーンに流して、染色後のバンドの輝度の比をとれば定量できそうだけど…
素人の考えなので自信はありません。

>>155 コンピのふえ？ 神部の笛みたいなもんか？？
形質転換効率のことなら、それと分かるように書いて欲しいな。

>>156
E. coliのDNAも変性して分離しませんか？
分離の仕方がわかってるなら、検量線を作れるかも知れないけど。
変性しなさそうなDNAを使えれば良いのかな。
でも、プラスミドDNAは蛍光強度の発光効率が直鎖DNAとちがうし・・・

>>158
16Sr DNAの可変領域�BをPCRで増やしてからDGGEすると良いらしいですよ。
そうすれば、バンドは1本になるらしいです。
ってか、PubMedでDGGE関連の論文けっこう出てるんで、参考にする事を
お勧めします。（Mayer et alとか）

マニアックな解答ありがとうございます。
ようするに極端にGCリッチな二本鎖DNAをマーカーにすれば良いのかな。

PubMedで探しましたがMayerという人のDGGEの論文が見当たらないので、
とりあえず、Muyzer et al.の論文からプロトコルの発展を辿ってみます。

>>160,161
ウーン、自分が指導教官だったら濃度のわかってるプラスミドを適当なエンザイムで切って直鎖にして、
量を振って流せ、と言うかな。

厳密には>>159の言う通りなのかも知れないけど、所詮大雑把に濃度知りたいだけだし。
あまりキチッとやってると今度は時間が足りなくなる。

あげ

とりあえず、GCリッチな二本鎖DNAのPCR産物を
カラムで精製して、吸光度を測って定量マーカーにしてみます。
素人に丁寧に解説頂きまして誠にありがとうございました。

>164
定量マーカーって、、、、dsDNAでメチャ厳密にするわけでもなければ、
NEBのラダー使ったらどうですか？
ラダーの各バンドの質量もカタログに書かれてますし。

変性勾配ゲルだからdsとssの両方のバンドが出ちゃうので困るって話でしょ。

WBのマーカーは何がおすすめですか?
抗体は一次がAnti-HisG、二次がAnti-Mouse IgG HRPです。
買って1ヶ月しか経っていないのに、magicxpが40kDaのバンドしか見えません。

precision markerでいいと思う

>>167
ポンソーSで染める

すごく基本的なことなんだけど、SDS−PAGEってめんどくさくない？
手がびしゃびしゃ？になるし、端のウエルはつぶれて変な形になるし、
まっすぐに泳動した試しがありません。
使っている泳動装置のモジュールが変形しているのか、ゲルが悪いのか？
皆さんどこのメーカーの装置使っていますか？自分はbioradなんだけど。

手がびしゃびしゃって何よ

Goalden finger？

>>170
簡単。君の作るゲルの質が悪い。

>>170　できあえのゲルを買ってみては？　大企業ではそうしてるらしいが...

共沈するはずの蛋白がしません。
大変…

堀江ですが、買ってきてるよ。ready-made gel。
マニュアル見たら、板を押さえる時にモジュールを下に
押すよう書いてあったけどやってなかったな。そのせいかな？
みんな作ってるんですね。

レディメイドゲルを使っていて、まっすぐ泳動できないなんて・・・
それは腕が悪いとしか言いようがない。

腕というより、その装置ひどすぎないか？
SDS-PAGEでそんなに問題があるなんて、考えられない

>>178
SDS-PAGEの泳動装置なんて、至極単純な構造じゃん。
アレで上手くいかないってのは、下手糞以外に理由がない。

正直、オ�hﾉﾚな。この道諦めて、営業リーマンになった方が良いんじゃね？

SDSPAGEまっすぐ流れないのはタンパクの載せ過ぎと違うの？
あとはサンプルの塩濃度が異常に高いとか、電圧高すぎとか、
泳動バッファーの組成間違えてるとか。

腕って言われてもな。
装置変えてみますね。ＤＮＡならいつもきれいに泳動するし。
結構簡単な操作ということがわかって良かった。

＞＞１７９　何故に社会人扱いなんだよ？

ゲル板を前後にドップリとSDS-PAGE泳動バッファーに浸かるタイプはゲル板の横から
微妙に電流が漏れて末広がりになることがある。陽極側のバッファーはゲルの下端に
ちょっとだけ浸すぐらいのバッファー量で済ますのが吉。

>>181
実験がうまくいかないのを腕のせいにする奴は
努力不足。お前が絶対にきれいに泳動したいのならば
気にせずいろいろ試して見れ。俺は期限切れのゲルを使って
小さいバンドがビローンって広がったことがあったけど
（>>182見たいな感じ？）新しいゲルにしたら直った。
後、空いたレーンはサンプルバッファで埋めると吉。

>>183
いや、絶対に腕の問題だ。
努力不足以前に、あらゆる条件を試すと言う事自体に気付かないのも、腕が悪い証拠。

SDS-PAGEでこれでは・・・使えねぇな。181って。

ある遺伝子を持った微生物を、環境中から全部釣り上げる目的で
ディジェネレートプライマーを使ったPCRをやろうとしています。

でも、ホモロジー検索をさんざんやっても保存的配列がほとんど見つからないので、
プライマーが短すぎてTmの値を上げることができません。

こういう場合には、PCR以外の方法を使うのが普通なんでしょうか？

>>186
検索の付近で既にミスってる気がする

>>185
だよな。
181はさっさとこの道を諦めたほうがいい。

きっと、理系に最初から向いてなかったに違いない。

>>186
サザンで1次スクリーニングしたらどう？

>>186
ある遺伝子のアミノ酸配列を、NCBIのサイトからごっそりとダウンロードして、
ClustalXでマルチプルアラインメントを実行しました。

私が対象としている遺伝子は、変異のスピードが速いのか、保存的な配列が
アミノ酸で5つ以上続く部分は見つからず、プライマーも短くなってしまいます。

>>189
サザンでディジェネレートプローブですか？

自己レスしてしましました、すいません。

>>187
ある遺伝子のアミノ酸配列を、NCBIのサイトからごっそりとダウンロードして、
ClustalXでマルチプルアラインメントを実行しました。

私が対象としている遺伝子は、変異のスピードが速いのか、保存的な配列が
アミノ酸で5つ以上続く部分は見つからず、プライマーも短くなってしまいます。

>>189
サザンでディジェネレートプローブですか？

>>191
また、厄介なものを標的に置いたね・・・

それじゃ、一筋縄じゃいかんのちゃうか？
ターゲットサンプルの遺伝子情報を揃えて、自分で解析にかけたら？

>>191
塩基配列で相同性どのくらいでしょう？

面倒なら、Tm気にせずディジェネレートプライマーでPCRしてみたらどうでしょう。
まずは緩い条件で。

サザンの場合、全長で考えられるので、対応できる可能性あるのではないかと思いました。
環境中ってのも曲者ですね。

>>185=188
そうかも知れんが、おまえらも性格悪いな。

>> 努力不足以前に、あらゆる条件を試すと言う事自体に気付かないのも、
>> 腕が悪い証拠。
結局おまえの言う腕ってなんだよ？
182や183が言っているのも腕の一種？それとも知見？

>>196
試してみようという所まで考えが働かないのは、オ�hル。

>196
能力、あるいは才能といってもいい。
実験科学に向いてないよ。君。

まぢPCRができなくてD4で中退したバカがいた

しかも宮廷大

>>196
大学入りなおしたら？
文転しろよ。理系にいる価値ないんじゃないか？

流れを無視して突然質問させて下さい。
ゲノムPCRをやろうとしています。
プライマーの設計の説明でよくBlastで特異性を確認とありますが、
具体的にはどれくらい特異的な配列にすれば良いんでしょ。
20個位試しに検索してみると、E Valueだとかは1-4程度のもBACクローンとかで拾ってきています。

後半意味がわからんよ

>>192
ターゲットサンプルは環境中のいわゆるcommunity DNAなので、
未知の株がたくさん含まれていると思われます。
とりあえず、全ゲノムが解析されてる株の遺伝子情報を揃えて
解析し直して見ます。

>>193
相同性は低いと思いますが、Blastで確認してみます。
いまはLightCyclerを使って、非常に緩い条件から試しています。

>>194
とても長くて、ラベルされてて、ディジェネレートなプローブを使うのですか。
面白そうですね。

>>203
プライマーの配列が決めにくいなら、
Adaptor-PCRやってみるとか…
金かかるけど。

>>201
特異的な種（あるいは株）のDNA(RNA)を増幅するためのプライマーなのか、
特定の遺伝子を持つすべての種（あるいは株）を検出するためのプライマーなのか、
実験の目的によってプライマーの設計方針も変わってくると思います。

もし特異的な１種類の株を検出するためのプライマーだったら、
4^n（nは塩基長）が、全生物のすべての株の数を超えると考えられる数になるように
選ぶのが理想的だと考えられます。
n=20のとき、4^20=１兆1000億
n=30のとき、4^30=１１５京

なので、20〜30ntぐらいのプライマーが設計できるならば
PCRはほぼ成功すると思われます。

>>204
Adaptor-PCRは初耳です。
詳しく調べてみたいと思います。
ありがとうございます。

Adaptor-PCR、多分ダメだわ…目的が違う気がする。
スレ汚しスマソ。

>>203
ディジェネレートではなくて、塩基配列の相同性があれば単純に1種類のDNAもしくはRNAをプローブにすれば
良いのではないでしょうか。この場合のテンプレートはコンセンサスがとれていて、手に入れやすい生物となりま
すが。環境DNAとなると、まず目的の配列の有無を検出しないと、不安じゃないですか？
その後の展開は、ショットガンでライブラリ作って、コロニーハイブリダイゼーションで選抜し、シークエンスとか。

ちょこちょこ相違点があって保存領域が連続していないけど、全体で見ると相同性がある場合の話なのですが。

いまはやりの培養困難バクテリアの研究か？

>>208
あ、やっぱりそれが王道なんですね。
PCRで攻め切れなかったら、そちらに変更します。

>>209
結果的にそういう内容も含まれてくるかと・・・

6kbくらいのgenomic DNAをplatinum Pfx polymeraseで
増幅しようとしていますが、条件をふったりprimerを変えたりしても
うまくPCRがかかってくれません。
もうすぐplatinum Pfxを使い切るので、次は別の酵素を試そうと思いますが
おすすめの酵素はないでしょうか？
Ex-taqだとPCRかかるのですが、できればhigh fidelityの酵素を使いたいです。
あと、Pyrobestは購入できないようです。（今アメリカにいます）

KODplusとかLATaqは数キロbpでも逝くぞ。

KODて6kb行く？LAは大丈夫だけど。

オレなんてＴベクターにクローニングするの失敗しまくり。
何でうまくいかないのか、よくＴベクターを見てみたらＴから始まる
まったく別もののベクターだった。

という面白くないおち

>>215
俺もTベクター使ってどうもPCR産物入らんと思って、
よく考えてみるとKOD使ってた、という凡ミスしたことがある。

>>212
伸長時間を
2倍にしてみて下さい

>>212
Pfx=KOD
あれはいかんですぜ
エクステンションが長すぎるとバンドが消えます
とにかくトリッキーな酵素です
オリジナル発売元の東洋紡でもロングPCR用ではないと言ってます

King Of DNA

>>214, >>218
KODならそうだろうけど、KOD plus ならLong PCRも可能だよ。
KOD plus なら6kbくらいは普通に増やしてる。
個人的な経験では、platinum PfxよりはLong PCRに向いてると思う。

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みなさんアドバイスありがとうございます。
Platinum Pfxは伸長時間を２倍にしてもかからなかったです。
LA-taqは結構mutationが入るので、Phusion DNA polymerase
というのをためしたところ、無事PCRがかかりました。
このpolymerase、伸長時間が15-30sec/minと短いのもいいです。

これからsubcloningしてsequenceしてみます。
ちゃんとblunt end用のvectorは準備してるので大丈夫です（笑）

あた

タカラから新しくでたhigh fidelityの酵素が、宣伝文句では全てにおいて
EX Taqよりも性能よさそうだったし値段もほとんどかわらないので乗り換えてみたのですが
ベクターにクローニングしようと思ったら問題発見！産物がブラントエンドというオチでした。
今TAクローニングのキット(プロメガ Teasy)しかないのですがどうするのがいいか教えてください。

1.タカラのオススメの平滑末端用のクローニングキットを買う。(なんかやたら高い・・・）
2.Taqを加えてAつけさせてから今あるキットでクローニングする。(最初からTaqでPCRすればええやん・・・）
3.安い平滑末端のベクターだけ買って今あるクローニングキットのligaseとバッファーを
　流用する。（同じようにPCR産物直接いれてちゃんとできるか不安）

3ができれば3がいいのですが大丈夫でしょうか。

>224
お前の腕とラボの金次第で選択肢が変わる。

PCR産物の内部にSma IやEcoR V、Pvu II、SnaB Iのサイトが無いのであれば、
ベクターの平滑末端サイトを切って平滑末端のPCR産物を加えてライゲーションする。
形質転換してから、プレートに撒いて出て来た全コロニーを掻き取りミニプレップ、
それを平滑末端サイトと同じ制限酵素で切って、もう一度形質転換。

もう一回TaqでPCRするのが一番早そうだけど。。

rTaq入れて最後のエクステンションだけすれば。

>>224
３はあかんよ
プライマー
リン酸化してないやろ

２は実際にやったことある
ＰＣＲ産物（KOD-dash）を
フェノクロ
エタ沈
dNTPのかわりにdATP終濃度0.2mM入れて
Taqで30分エクステンション
pGEM-Tにライゲーション

ふつうののTAクローニングよりも
短いプライマーオリゴマーが
入ることが多かった

１もやったことある
効率はとてもよい
でも
プライマーオリゴマーや
ターゲットとプライマーがタンデムになったのが
たくさん取れてくる
ゲルから切り出すと
効率もよくてニセモノもほとんど出ないが
面倒

＞226
おまい頭良いなw

大腸菌について極めるタイラーズ

>>231
すまん。誤爆しますた・・・。
>>224 おわびに（なるかな？）
例えばBSSKベクターのEcoRVサイトに入れてはいかがですか。
EcoRVカットのベクターは脱リン酸化なしです。PCR fragmentを精製後、ベクター量に対し約６倍量入れてligation。
blue-white selectionでwhiteを数個つつくと9割くらいの確率で入っています。
タンデムに入ることはほとんどありませんが、念のためCut checkしてほしいぽ。
これが一番時間がかからない気がするぽ。

実験成功祈願
http://zip.2chan.net/6/src/1126833476161.jpg?

>>229

ベクター側の5末端側がリン酸化されていれば、プライマーの5末端のリン酸化はなくてもかまわない。

EcoR�T切断部位の
GAATTC
CTTAAG
は、5'3'の向きは関係ないですよね?

>>230
それ嫌みだろ？
俺も>>226は頭いいw、と思った。

８文字認識だかのbluntの酵素で１cutしたvectorと、
その制限酵素の存在下でligationさせるってのが
Stratageneにあったと思う。self-ligationされても
また切れて、最後はほとんどinsert入りになるという
トリック。

SrfIとpCR-script使うヤツね。７，８万円くらいだっけ，あのキット。

>>224

昔、KODのPCR産物をクローニングしようと思ったが、
入れたいベクターに適当な制限酵素部位がなかったので、

ベクターのAｍｐとoriを含む領域を、
KODでリン酸化なしのプライマーを使って増やす
↓
リン酸化プライマー使用して、目的のPCR産物をKODで増やす。
↓
両方をゲル抽出してライゲーションした。

理論的にはうまくいくはずなんだが、
取れてきたのはセルフライゲーション産物ばかりだった。

結局、インビトロジェンのTOPOを使うことになったが・・・・・。

俺は最近はプライマーに制限酵素サイト入れるようになった。安くなったし。

>>224
229に補足。
2.でやるときにdenatureのステップはしないように。
72度30分だけね。
dATPがなければ、dNTPsでもうまく行く。

以上、蛇足ｽﾏｿ。

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少ない細胞数、（数個から1000個くらいの間）でｃDNAからRT-PCRしたいんだが、キアゲンの
Fast　Lane以外にいいのがありますか？
もしくはFast　Laneの使用感想あればお聞きしたいのですが。

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>>243
それで素直にやっちゃえば？

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IRESって、ほにゅーるい以外でも効果的に使えんのかな？
魚とかカエルとかのトランスジェニックではどうなん？

>>247
というか、IRES-GFPとかのベクターってちゃんと緑の蛍光出る？
Cos1とかにtransfectionしても全然見えないし。
でも、ベクターに入れたものは発現してるから、
なんだかよくわからんがそのまま使ってるが。

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こんにちは。
わたしはいま某大学院で院生をしています。
Alkphos Direct Direct kitを用いたtail DNAからの
サザンハイブリダイゼーションについて教えていただきたいのです。

現在、トランスジェニックマウスのgenotypingのためにサザンハイブリダイゼーションを行いたいと考えておりますが、
バンドのシグナルがまったく得られません。
これまでに何度も行っておりましたが失敗したことはありませんでした。

分からないのは、当該部分の遺伝子を含むBACプラスミド（190kb）をミニプレップによって得たのち、
同じプローブ・同じ方法を用いてサザンを行ってみると非常にきれいにバンドが見られるのです。。
ただBACプラスミドの場合でも、5mｌ cultureからのアルカリプレップ法で得たプラスミドの全量を流して
ようやくシグナルを得ることができましたので、やはりDNA量が十分でないのかと考え、
サンプル量を5倍量まで増やしてみましたが同じです。
近傍の異なった部位でのプローブをさらに２つ試してみましたが結果は同じでした。
ゲノムDNAとBACプラスミドからのDNAとのあいだになにかちがいがあるのでしょうか。
以下のようなサザンハイブリダイゼーションを行っております。

・DNAは１ｃｍのマウスtailより抽出。lysis後、フェノール抽出・エタノール沈殿により50ul TEに溶かし、
そのうちの5, 10, 25, 40ulの各DNA量を試しました。
・X染色体上にある遺伝子の一部をプローブとし（400bp、GC contents 39%）としています。
・マウスtail DNAをXho1で切っています（塩濃度は50ｍM未満）。
wild typeで内因性の13．2ｋｂのバンドが検出できると思われます。
・電気泳動後のゲルを0.4N NaOHに30分インキュベートし、
アマシャムHybond-N+（positive charge nylon membrane)にブロッティング。
・プローブ作製・ハイブリはすべてカタログのプロトコールに行い、
ハイブリ温度は50℃と55℃、18時間インキュベート。
・プローブ量もカタログ通りに100ng/mlとしております。
・シグナルはnon specificバンドすら現れず、長く露光すると単にレーンそのものが黒くなるだけです。

何かよいサジェスチョンあるいは解決法があればお教え願えますでしょうか。
よろしくお願い申し上げます。

Alkphos Directはホ乳類のgenomic Southernには感度が足りないと思うけど。
BACのサイズとマウスのゲノムサイズの比から、ターゲットのコピー数の比が
計算できるでしょ。まずはサンプル量５倍ってときの比を計算してみなよ。

XhoIはCpGメチル化の影響を受けるとか？

お返事ありがとうございます。
でもいままで他のトランスジェニックのラインではいつもしっかりシグナルが出てた
ので...。
（Xho1以外の数種類の酵素も確かめました。）
教えていただければありがたいのですが、

・ＲＩと、Ａｌｋｐｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔとでは、感度にどれくらいの差があるので
しょうか？
・プローブのデザインによって、感度はそれほどダイナミックに差があるのでしょう
か。
・よいプローブをデザインしたいときのこつは？

聞いてばかりで申し訳ありませんが、よろしくお願いします。

alphosはＲＩ並に感度が高い
プローブがループになったりダイマーになったらまずい
Ｗｅｂなどで支援ツールがあるから利用してけろ

トランスジェニック出来ていないとか

IRS-2遺伝子のG1057Dの多型を調べようと思ってプライマーを注文したわけだが、
PCRのバンドがでない。配列を読み直しても、参考にした論文と注文したプライマーは同じ。

アニーリング温度もいろいろ変えてみたが、、、、。

プライマー変えてみれ

> 254さん
> Ｗｅｂなどで支援ツールがあるから利用してけろ

お恥ずかしいですが、教えてください。。。

こういう場合の
ポジコンになるような遺伝子何かないの？

トランスジェニックできてるかどうかはＰＣＲで

>>254
ほんとか？
私は何度か試したが感度悪すぎでだめだったので、RIに戻した。
単に私が下手なだけかも知れんが、いずれにせよもう二度と使う気はない。

>>254, 260
プローブによっては、本当にRIなみにいい感度でシグナルでたよ。
でも出ないやつはほんとに出なかった。

プローブデザインのためのWebサイト、ぜひ教えて。

基本的なことで恐縮ですがご助言下さい。
巨大プラスミド抽出（アルカリSDS)後の電気泳動像で、プラスミドDNAと混入した染色体DNA断片とを肉眼的に見分ける方法はありますか？

柔らかいゲルで低温で低電圧で時間をかけて泳動するしかないんでは？
パルスフィールドなら余裕で分離しそうに思うが、どうよ？

>>263
即レスありがとうございます。
野外分離株のプラスミドプロファイルをスクリーニング的にチェックしたいのでまずは簡便法で行いたいのです。
そこで実際に泳動像を見てプラスミドＤＮＡと染色体ＤＮＡとを見分けたいのですが・・・

染色体ＤＮＡ断片は263の最初の方法でスメア化していくと理解すれば良いのでしょうか？

そのプラスミドを切らないrare cutterで切る前後で比較。

http://science4.2ch.net/test/read.cgi/rikei/1126630608/MENU
逮捕ｷﾀｰ！

>>265
ありがとうございます、勉強になります。

>250
Hybond-N+は最近購入しましたか？
ウチも数カ月前に新しいロールを購入したら、
とたんにシグナルが出なくなった（RIラベル）。
メーカーに電話したら、製品は変わっていないが（これはウソ）、
N+はRI用では無いとぬかしやがった。
RI用にはXLとかいうバージョンができていて、
これを使ったら以前のN+に使っていたプロトコールでうまく行った。
数年前にもだまって製品内容を変えるという前科があるので、
今回も変えたにちがいない。
どう変えたのかわからないが、
いまのN+は0.4N-NaOHだけではブロッティングできない。
ブロッティング後UVクロスリンクをしてみたが、ほとんど違いはなかった。
メンブレンを疑え。

>>268
それひどいね。

>>269
ありがとう。共感してもらえるだけで嬉しい。

無駄にした時間を返せと言いたい。
あと、プローブをまず疑ったので、ラベリングのキットを
新しくしてみたりもした。
急にN+はRI用じゃないと言われても、ずーーーっと使ってましたから。
わずかに残っている古いロットは、全然問題ないですから。
メンブレン以外は全て同じ条件で（ハイブリ・ウオッシュは
同じチューブの中で）サザンをして、全然違う結果が出ている
イメージをメーカーに送ったが、「製品は変わってません」。
普段温厚なボスが"stupid company"とバカにしていた。
頭に来るだけじゃなくて、こんなメーカーだと、
次にいつまた製品内容が予告もなしに変わるかと心配で、
XLの今のロールが終わる前に、別のメーカーのメンブレンを
探すつもりだ。

>>268
貴重な情報ありがとう。自分もゲノムサザンはじめたところだったので助かる。

しかし、手元にあるHybond-N+のinstructionによると、
Radioactiveを使ったサザンのおすすめ度は、Hybond-XLは+++, Hybond-N+は++と
なってるんだが・・・・
実は不良ロットだったのに、担当者が適当な説明したんじゃ？
不良ロットのHybond-Pのせいで、全然ウエスタンができなくなって
はまってた人を昔見たことあるよ。

>>268
メーカー名のヒントｷﾎﾞﾝ

1Mピルビン酸溶液作ってオートクレーブしたら
溶液がうすい黄色になっているんだけど何これ？

免疫沈降のネガティブコントロールについて教えてください。

サンプルはマウスで、ヤギ由来の抗体とビーズを使って免疫沈降します。
この場合のネガティブコントロールは、「マウスIgG＋ビーズ」ではなくて、
「ヤギIgG＋ビーズ」でよいのでしょうか？

もし、サンプルはマウスで、マウス由来の抗体とビーズを使って免疫沈降する
場合はどのようにすればよいのでしょうか？

初歩的な質問ですがよろしくお願いします。

>274
特異的ヤギ抗体で免沈されたものが、
本当に特異的な相互作用によるものなのか、
ヤギ抗体を用いたときに出るバックグラウンドなのか、を
区別するための実験なのだからネガコンはヤギ抗体だと思うが。

後半の質問も以上の理由から、マウス。

>>275
ご返答ありがとうございます。

質問の後半の場合で、同じアイソタイプのマウスIgG2aとビーズで
ネガティブコントロールしましたが、マウスサンプルとこのマウスIgG2aが
非特異的にくっつきあい、ネガティブコントロールができません。
マウスIgG2a以外に使用できるものはありますでしょうか？

>マウスサンプルとこのマウスIgG2aが非特異的にくっつきあい
お前の免沈がダメってことじゃないのか・・・？

ノーザンでプローブの剥離を行おうと思うのですが、経験がありませんので質問さ
せてください。既出でしたらすいません。

普段ノーザンを行う際はハイブリまではRNaseフリーで行っているのですが、プ
ローブの洗浄以降は滅菌のみした試薬で行っていて（特にRNaseフリーは気にし
ていません）、問題なく検出できています。

実験条件は
メンブレン：Hybond N+(Amersham)
ハイブリバッファー：Ultrahyb(Ambion)
検出：CDP-Star(Roche)
プローブ：DIGラベルしたRNAプローブ
です。

ここから質問なのですが、検出後にプローブの剥離を行う場合にはプローブの洗
浄以降も全てRNaseフリーで行わなくてはならないのでしょうか？

手を抜くなと言われそうですが、もしその気遣いが不要でしたら教えて頂きたい
のです。

プローブの剥離法はRoche社のカタログ通り、
50%ホルムアミド、5%SDS、50mM Tris(pH9.5)で80℃、60分x2の洗浄を行おうと思
っています。この方法に関してもおすすめ・注意点等ありましたら教えていただ
けるとありがたいです。

よろしくお願いします。

スレ違いだが、明らかに結果がでそうもない卒論テーマを教授に与えられたorz。

>>279
卒論なんてそんなもんだ。
結果でても出なくても卒業できるしな。
ガンガレ

>>278 RNaseフリーという言葉で何を指しているのかにもよりますが、
オートクレーブ、手袋等の通常の取扱いをしていれば問題ありません。

>>279
学部生の分際で！
って教授に怒られるぞｗ
ポジティブシンキングでどうしたらいけそうか？
と、
どうしたら不可能と証明できるか？
の２点を考えて実験したらいいよ。
注意点）２個目は裏でコソコソ考えること。

>>279
結果が出そうもないにもいろいろあると思うけど。
１）壮大過ぎて卒研の１年じゃ無理
２）方針が間違ってて、このままじゃ無理
どっち？

いわゆるポジティブシンキングって、
「若い頃の苦労は買ってでもせよって言うから、
無駄な実験を一所懸命やることも人間修行だ」
って考えようってことじゃないの。

今実験し終わったんですが、自分の出した一連の結果がつまらなすぎて論文を書く気が減少しています。
どうすればいいでしょうか？

長く放置すればするほどますますつまらなくなるから、
一日も早くケリをつけるつもりでさっさと書く。

うおおおおおおおー
とりあえず日曜に書くか。
と、テンションあげてみる。

まずはビール買ってきます。

ここは、分子生物only？

自分はマウス(30-40g)の総頸動脈(直径0.2-0.3mm)にカニュレーションして血
圧を測定していますが、血圧が安定しません。５分程度は安定。どうやら、
血液が固まってしまうようです。ちなみにヘパリンは使用してまふ。
何か解決策はないですか？

>>285
結果がつまんなくても一応結果が出てるんならいいんじゃないの？
書く気あるなし関係なくとりあえず書いとけ
いずれ本当にいい結果が出た時の練習になると思えばいい。

タンパク質の膜貫通部位予測についての質問です。
いくつかの予測プログラム（SOSUIとかTMHMM2とか）で
可溶性タンパク質という結果が得られたのですが、実際にGFPやエピトープ
タグをつけて細胞で発現させると膜タンパクであることが示唆されました。
N末、C末の両方で試してみましたが、同様の結果でした。
いくつか欠失変異体を作製したところ、C末に膜貫通部位があるとの
結果が得られました。再度その領域よりN末側を除いた100アミノ酸
位を予測プログラムにかけると、膜貫通部位があるという結果が
でました。
このように、タンパク質の一部だけを用いて二次構造を予測しても
構わないものなのでしょうか。

予測プログラムにもよるけど、トポロジーも考慮したものならダメ

見かけの分子量10kDa以下のポリペプチドをSDS-PAGEで分離、精製するには
何かコツなどありますか？CBB染色している間に、ゲルから漏出してしまい
そうなんですけど。

ゲル濃度

>>292
Tricine-SDS でググって見てはいかがでしょうか？

後方より貴君の武運を祈る　OVER

ウエスタンで、NBT/BCIPで検出してるんですが、検出後
メンブレンの転写されていない面に擦ったような汚れが出るんです。
ブロッキング以降は表裏は同様に扱ってるはずですので、
必ず転写されてない面に出るということは、ブロッティングの段階で
汚してしまったのかと思いました。
しかし、メンブレンもろ紙も絶対に触らないように、手袋をして
ピンセットで丁寧に扱ったつもりでも、たまに上記のような汚れが出ます。
どなたかこのようなトラブルに見舞われたことはありませんか？

メンブレンをウォッシュする過程で容器との間で擦れたんでは？
転写されている面はいつも上向きでしょ？

>>296
いや、ウォッシュの時は表裏は気にしていないんですよね･･･

>>297
反省しろ！

２ちゃんだから「しる」と書いてほすぃ

>>297
反省しる！

>>297
反省しる！

今実験やってて怖くなったのでスレ違いかも知れませんが質問させていただきます。
ただいまimmunoblotting中なのですが、転写後にもたついてしまい
メンブレンに乾燥した白い部分ができてしまいました。

これから一次抗体、二次抗体と反応させる上で支障は出てくるのでしょうか?

>302
夜遅くまでおつかれさん !

支障がないっていえばウソになると思う。
ただ、乾いた部分以外に影響は無いだろうから
どのあたりがそういう状態になったかを考慮して
データを解釈すればいいんじゃないの?

RNase protection assayをやりたいんですが、プロトコールによると
リボプローブをRIでラベルするのに、 [a-32P]UTPを用いているんですが
CTPでは駄目なのでしょうか？
ラボに、 [a-32P]CTPは既にあり、わざわざオーダーしなくても
いいので、こちらを使いたいのですが・・・

>>303
ありがとうございます。
初めてのブロッティングだったので･･･

>>304
UTP使った方が良いと思うけどなぁ。

それってRNAなの？

普通のらぼにあるのはdCTPだけどな
CTPがあるんだったらUTPじゃなくても問題ないだろ
そもそもCTPってどっから買えるの？

RNAだからウラシルって意味じゃねーの？

>>309
どういう意味だよ、それ。

>>303
今更ながら結果報告。
TBS−スキムミルクで一晩ブロッキングしたら
界面活性剤のおかげでホワイトスポットが綺麗に消えてました。
お騒がせしましたです。ﾊｲ

大腸菌のelectroporationについて教えてください。
3回に2回くらいの割合で火花が飛んでしまうんです。
正しく電流が流れていないし危険ということなのですが，改善する方法がわかりません。
キュベットは氷上で冷やしてますが，パルス前によく拭いてるつもりです。
・電圧が高すぎる
・液量が多すぎる
くらいしか思いつきません。条件は以下です。

自作のDH10B electrocompetent + DNA (total 50-100ul)
1mmのディスポキュベット
BIO-RADのGene Pulserで2.5kV, 200Ω, 25uF

DNAの塩濃度は大丈夫なはずです。
静かにパルス終了した場合，pUC19 1ugあたり1×10^9の効率は出るので
competentはまあまあだと思います。

アドバイスよろしくお願いします。既出だったらすみません・・・

>DNAの塩濃度は大丈夫なはずです。
DNA溶液の塩濃度は絶対問題ありません！
と言えるようになってからもう一度来なさい。

自作のDH10Bを洗った水orHEPESはミリQでつくってるかな？

>>313
ガラスビーズで抽出したyeastのプラスミド（フェノール2回抽出，エタノール沈殿後）
と
Yeastのコロニーを50ulの1mM HEPES-10%グリセロールに懸濁したもの，DNA溶液というより菌体液
です。どこまでやれば「絶対」と言い切れるかわかりません。ごめんなさい。
>>314
HEPES，グリセロールともに超純水でつくっています。というか手元にある試薬はすべてミリQです。

>自作のDH10B electrocompetent + DNA (total 50-100ul)
DNA溶液を50-100 ulも入れている？
それとも大腸菌とあわせてその容量？
もし前者ならエタ沈程度の脱塩だと塩濃度が高くなるかも。
あと、DNAの濃度はどれくらい？

>312
液量が多すぎるのか。
液量が普通くらいだと、セルの隙間に泡が残ってたりするとアークするが、
ちゃんと振って液おっことしてからパルスかけなおすとうまくいく。

イーストってRNA無駄に多く含んでそう。単純に量を減らしてやったら。

>>316, >>317, >>318
皆様ありがとうございます。

Yeast入れるときは総液量がどうしても多くなるんです。
DNAの場合はせいぜい5ulまでしか入れていません。
DNA濃度は0.15ug/ulくらいですが，ガラスビーズ破砕なのでゲノムをかなり含んでいると思います。

いままでyeastはコロニーかきとって直接HEPESに懸濁し，40-50ul入れていましたが
いったん液体培養で振ってHEPESで洗ってからCompetent 50ul + yeast 20ulのtotal 70ulにして，
1.5kVでパルスかけたら静かにかかりました。
今日Ampプレート見たらコロニーもたった3つですが生えてました。
もう少し条件検討してみます。

基本的なことで申し訳ありませんが，1mmキュベットでは液量50ulくらいに抑えるのは
常識ですか？

>312
昔は出芽酵母バリバリだったので、ノートを見直してみた。

↓2ml程度のOver Night CultureをHarvest
↓100ul STET Bufferを加え、ビーズを液面まで加える
↓Vortex 5min
↓フェノクロを200ul加えてVortex 5min
↓1300rpmで5min
↓上清1ulを使ってエレクトロポレーション

上清をエタ沈すると却って塩濃度が高くなりすぎるのでは?
形質転換の良いコンピ使ってるなら、上清量は思い切って減らしたらどう?

健闘を祈る !!

ゴメン
1300rpmで5min→13000rpmで5minです

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Takaraの制限酵素を使う前に言っておくッ！
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　おれは今Takaraのクオリティーをほんのちょっぴりだが体験した
　　　　　　　　　　　　　　　　　　い…いや…体験したというよりはまったく理解を超えていたのだが……
　　　　　　　　 ,. -‐'''''""¨¨¨ヽ
　　　　 　 　 (.＿＿_,,,... -ｧァﾌ|　　　　　　　　　　あ…ありのまま 今　起こった事を話すぜ！
　 　 　 　 　 |i i|　 　 }!　}} /／|
　　　　 　 　 |l､{　 　j}　/,,ｨ//｜　　　　　　　『おれはHaeIIIで大事なサンプルを切っていたと
　　　　　　　 i|:!ヾ､_ﾉ／ u {:}//ﾍ　　　　　　　　思ったらいつのまにかHaeIIで切っていた』
　　　　　　　 |ﾘ u' }　 ,ﾉ　_,!V,ﾊ |
　　 　 　 ／´fト､_{ﾙ{,ィ'ｅﾗ　, ﾀ人　　　　　　　　な…　何を言ってるのか　わからねーと思うが
　　　　 /' 　 ヾ|宀| {´,)⌒`/ |<ヽﾄiゝ　　　　　　　　おれも何をされたのかわからなかった…
　　　　,ﾞ　 ／ )ヽ iLﾚ 　u' |　| ヾｌﾄﾊ〉
　　 　 |／_／　 ﾊ !ニ⊇　'／:} 　V:::::ヽ　　　　　　　　頭がどうにかなりそうだった…
　　　 /／ 二二二7'T'' ／u'　__ /:::::::/｀ヽ
　　　/'´r　-―一ｧ‐ﾞＴ´　'"´ ／::::／-‐ 　＼　　　　催眠術だとか超スピードだとか
　　 / // 　 广¨´ 　/'　　 ／:::::／´￣｀ヽ ⌒ヽ　　　　そんなチャチなもんじゃあ　断じてねえ
　　ﾉ ' /　 ノ:::::`ー-､___／:::::／/ 　 　 　 ヽ　　}
_／｀丶　/::::::::::::::::::::::::::￣`ー-{:::...　　　 　　　ｲ　 もっと恐ろしいものの片鱗を味わったぜ…

酵素のふたにはHaeIIIって書いてあったけど横のラベルはHaeIIでした…。

ﾜﾛｽwwご愁傷様ｗｗ

>>322
ご愁傷様ｗ

ヲレ、Bgl IIとBgl Iを間違えたことある

orz

再現性

私は、ウエスタンブロッティング初心者です。

１次抗体や２次抗体をＰＶＤＦ膜にアプライする時、
所属している研究室では、スキムミルク／ＴＢＳ液でこれら抗体を希釈して
いるのですが、市販の教科書や試薬に添付しているマニュアルでは、
ＴＢＳ−ＴやＰＢＳ−Ｔで抗体を希釈してアプライするように書いてある
ものがあります。

どちらのほうが有利なのでしょうか。また、みなさんはどちらをお使いですか。
ご教授のほどよろしくお願いします。

スキムミルク/TBS溶液は4度保存すると、白い澱が沈殿する。

>>327
抗体によりけり。
スキムミルク/TBSのほうがバンドがきれいになることもある。
漏れはメンブレンのブロッキングに使ったスキムミルク/TBSを
使って抗体を希釈してる。

実験実習で、ある研究室に出入りしています。
基本的な質問ですが、DNAのフェノクロ（PCI）抽出、あるいはクロロホルム（CIA)抽出で、イソアミルアルコールの作用はなんですか？
たとえばもしいれなかった場合、DNA量や純度はどうなるのでしょうか？

自分で調べるなり出入りしてる研究室の人間に聞くなりしろよ
宿題は自分ですませましょうね

>>330
入れずにやって見ればわかるお。
なんでもチャレンジが大切。

入れずにやってみても
なんも変わらんのだが

変わらないと思ったなら、変わらないと書けば良い。
それで自分の宿題で都合が悪いと思ったなら、真剣に問題と向き合うと良いよ。

ここは宿題を聞く場所じゃないんだｗ

イソアミルアルコールって食品添加物じゃなかったっけか。
なんかぐぐるとわかったような気がする。

って甘過ぎ？

　　　　 ∧＿∧
　　　　( ´･ω･`) 　　 　∧＿∧
　　　 ／ 　　　 ＼　 　（　　　　）何言ってんだこいつ　
.＿＿|　|　　　 .|　|＿　/ 　　 　 ヽ
||＼　￣￣￣￣　　 ／ .|　　　|　|
||＼..∧＿∧　 　　(⌒＼|_＿./ ./
||.　 （ 　　　）　　　　 ~＼___＿_ノ|　　 ∧＿∧
　　/　　　ヽ　氏ねよ 　　 　 ＼| 　 （　　　　）　
　　|　　　　　ヽ　　　 　　　　　　　＼/ 　　　 ヽ. ｵﾏｴ馬鹿だろ
　　|　　　　|ヽ、二⌒) 　　　　 　　／ .|　　　|　|
　　.|　　　　ヽ　＼∧＿∧　　　 (⌒＼|_＿./　/

Molecular Cloningに出てるよ。
以前、この板で同じ話題が出たこともある。

　　　　 ∧＿∧
　　　　( ´･ω･`) 　　 　∧＿∧
　　　 ／ 　　　 ＼　 　（　　　　）何言ってんだこいつ　
.＿＿|　|　　　 .|　|＿　/ 　　 　 ヽ
||＼　￣￣￣￣　　 ／ .|　　　|　|
||＼..∧＿∧　 　　(⌒＼|_＿./ ./
||.　 （ 　　　）　　　　 ~＼___＿_ノ|　　 ∧＿∧
　　/　　　ヽ　氏ねよ 　　 　 ＼| 　 （　　　　）　
　　|　　　　　ヽ　　　 　　　　　　　＼/ 　　　 ヽ. 知ったかぶりか?
　　|　　　　|ヽ、二⌒) 　　　　 　　／ .|　　　|　|
　　.|　　　　ヽ　＼∧＿∧　　　 (⌒＼|_＿./　/

バカの一つ覚えって言葉が頭に浮かぶのをおし留めることができない。

バカの一つ覚えって言葉が頭に浮かぶのをおし留めることができない。
バカの一つ覚えって言葉が頭に浮かぶのをおし留めることができない。
バカの一つ覚えって言葉が頭に浮かぶのをおし留めることができない。
バカの一つ覚えって言葉が頭に浮かぶのをおし留めることができない。
バカの一つ覚えって言葉が頭に浮かぶのをおし留めることができない。
バカの一つ覚えって言葉が頭に浮かぶのをおし留めることができない。
バカの一つ覚えって言葉が頭に浮かぶのをおし留めることができない。

ﾃﾗﾜﾛｽw

ﾃﾗﾜﾛｽw
ﾃﾗﾜﾛｽw
ﾃﾗﾜﾛｽw
ﾃﾗﾜﾛｽw
ﾃﾗﾜﾛｽw
ﾃﾗﾜﾛｽw
ﾃﾗﾜﾛｽw
ﾃﾗﾜﾛｽw

ﾃﾗﾜﾛｽw

何このｽﾚ…

今実験がうまくいかない人のスレ。

オレのこと？

漏れかも知れない

>>1-347
キモい

おれイソアミルアルコールのにおいが嫌いだから入れてない

( ･ω･)ﾓﾆｭ?

( ･ω･)ﾓﾆｭ? ( ･ω･)ﾓﾆｭ? ( ･ω･)ﾓﾆｭ?

>>320
大変遅くなりましたが報告です。
結局，yeastの菌体を直接competent cellに混ぜるのは
成功率が低くて効率も悪いのでやめました。
教えていただいた方法で上清1ulを加えて，1.5kV, 200Ω, 25uFでエレクトロポレーションかけると
スパークもせず，だいたい100〜1000cfuのオーダーで大腸菌に回収できました。

サブクローニングとシーケンスが大変ですががんばります。
教えていただいた皆様，本当にありがとうございました。

>312
気にはなっていたので上手くいったようで何よりです。

HPLCのカラムに関して質問です。
タカラの順相カラム
http://bio.takara.co.jp/catalog/Catalog_d.asp?C_ID=C0628
に逆装用100ｍM酢酸／トリエチルアミンｐH4.7−0.075％１−ブタノール
を通してしまいました。
その後、間違いに気づき６５％アセトニトリルを含む1%酢酸／トリエチルアミンｐH7.3を通しましたが、
カラムの部分で詰り？が起こっているらしく、圧力が通常の2-3倍になってしまい
ガードカラムの継ぎ目からバッファーが漏れる状態です。

原因としては違うバッファーを通したことによる充填材の変性、ゴミ詰りなどが考えられますが、
この状況において変性することはありえるのでしょうか?(シリカゲル)
よろしくお願いします。

質問です。
全長900bp程度の長さで、途中にGC rich な配列があるモノをRT-PCR でクローニングしたところ、途中のGC rich な配列が削られた、約400bpのモノがとれてきました。
GC rich 配列の前後に５塩基の同じ配列があり、その間が抜けてる状態です。マウスEST でblast サーチしてもひっかかってきませんし、スプライシングを受ける部位でもないようです
また、PCR 溶液にDMSO を入れることによって完全長のものをとることもできました。
この短い配列のモノは、実際にあるのでしょうか。それともPCR ミスでしょうか。ノーザンで確認しようとも考えているのですが、抜けている部分があまりにもGC rich なため、プローブとして使えないような気もするのです。
RNase protection assay で確認できますでしょうか。似たような経験をされた方がおられるようでしたら、ご教授ください。

基本的なことの悩みなのですがよろしくお願いします。
マウスリンパ球の回収についてです。
ロスを究極に小さくする方法をご教授いただきたいのですがどのようにすればよろしいのでしょうか。

詳細：
エーテル麻酔下のマウスの下大動脈からヘパリン採血して
リンホセパールに重層、遠心　までは問題なくできていると思います。
いざリンパ球層を回収しようとするのですが
欲張って採ろうとすると血小板まで採って凝集してしまい、
それを防ごうとするとリンパ球を必要量（10^7 cells)得られません。
使うマウスの個体数を増やせばいいのだと思うのですが、
現在の研究室の環境によりマウスは1匹のみ使用です。
ちなみに毎回ほとんど1匹あたり
ヘパリン0.3mL＋抹消血1.5mLの量まで得ることができています。

どうかよろしくお願いします。

>>352
ゲルが圧で死んだ希ガス。
もうダメなんジャマイカ？

>>353-354
ボスに教授いただいたほうが良い希ガス。

>>354
研究室の環境を変えてマウスを増やす。

>>355
そんなに圧はかけてなかったんですけどねぇ･･･
逆向きにバッファー流したりして復活させようと色々やりましたが、
3分くらいは順調に流れてその後何かが詰まった様に全く流れずに強制終了･･･
何かが詰まっているとしか思えない挙動です。(ガードカラム通したのに･･･)

明らかに自分が高価なカラムに止めを刺した状態のため先生と顔を合わせるのが辛い･･･

>>357
気にすんな。やっちまったときは泣きながら謝ればそれで良いさ。
カラムは糞高くても、消耗品なんだ。俺の学校の教授ですら、カラムを壊した経験はあるらしい。

俺も、あんたも人間なんだ。ヒューマンエラーは、仕方がない。
一度やっちまった失敗を、もうやらなければ良いだけの話。
その罪悪感を乗り越えるんだ。

>>353
今思いついた。
多分、　(GC rich)-(目的配列)　の配列になってると思われ。
これを更に加工して　(任意配列 none-GC rich)-(GC richi)-(目的配列)　にしてみては如何？
何となく正規の5' RACE法での不都合に似てるような状況だからと考えたけど、
コレで出来んかったらｽﾏﾅｻｽ。小生、二回生二年生ゆえ、あまり経験がない。

>>358
ありがとう。他の研究室の仲間にも壊したんじゃなく、寿命で壊れたって励まされてる。
実際、結構な回数使ってたみたい。
微かにだが間違えて流速2.0ｍｌ/minでやってしまったのが原因か？
とりあえず先生は未練残して原因究明してるんで、年内の復活はないと言われた。

まぁおかげでHPLCの構造がちょこっと理解できたｗ

>>354
PBじゃないとダメなの?

>>353
他人の取ったクローンをサブクローニングするとき似たようなことがありました。
自分の場合全長が伸びれば良かったのでDMSO入れて対処しました。
GC richのところでループが出来て、ポリメラーゼがそこをすっ飛ばして増幅したんだと思います。
RNase protection assayで確認出来るとは思います。

ご回答ありがとうございます。

>>356
やはりそれしかないでしょうか。
今のところ8×10^6個ほど採れてます。

>>360
はい。研究対象が白血病T細胞株とB細胞株なので、末梢血がいいです。
一応脾臓でも回収を試したのですが、脾臓でさえ末梢血の場合の
3倍程度でした（脾臓は末梢血の10倍個ほどあると聞いています）。
そこで操作そのものが問題なのかと思いました。

353で質問した者です。
358さん、361さん、ありがとうございました。
やはりそういう経験をされた方がいらっしゃるのですね。
短いモノを細胞に放り込んだらfunctional だったので、もしや、とも思ったのですが。
全長のモノでとりあえず仕事して、その合間にRPA で確認してみます。
あればメッケ物だ、くらいに考えておきます。
いろいろありがとうございました。

今
マウス脳を4％PFAで環流固定して4日間w浸漬固定してるんだけど
ニューロンマーカーのNeuNが核に出ません。

核を認識する抗体なのに変です。

指導教官に4日間wは過固定なのではないか？と言っても聞いてくれません。
どーすればいいんでしょうか？

いま、ウエスタンブロッティングをやっているのですが、
ＥＣＬで発光させてＸ線フィルムで撮影すると、ときどき、
バックグラウンドに大きなしみ（影）のようなものが生じて困っています。

メンブレンのメタノール処理の時間やブロッティングバッファに漬ける時間、
ブロッキングのときに振とうさせるなどをいろいろ組み合わせて検証しているの
ですが、いまいち、何が原因なのか、明確に特定できていません。
もちろん、メンブレンはピンセットで注意深く扱っているつもりです。

なにか、ご存知の方おられませんか？

オマエらの苦しんでいるのを読んで正直思うけど
研究は頭も身体も酷使しないとなー。そして阪大、
東大、理研の糞捏造は腹が立つ。どれだけの若い
院生が「誘惑」されまともな研究が出来ないカス
をつくってしまうかと思うと。
竹、下、仲もだぞ。駒やゲンやタイラーズの個人の
責任じゃないぞ。
スレ違い、スマソ。

大腸菌の内膜外膜がうまく分離できんとです……がくしorz

>>366
苦しんでるの判るのなら
まず指導教官の納得のさせ方を教えてください。

組織専門の人3人（全員アカポス持ち）に聞いてみんな同じ答えが返ってくるんですよ。
それは『過固定』だって。

組織があまり専門じゃない指導教官の自分万歳プロトコールに従わざる得なくて困ってます。
教官…『氷晶』知りませんでした…そんな人に固定悪いとか言われても困ります。

>>368
指導教官の納得のさせ方・・・。
世の中には色んな人がいるから何とも言えんけど、
とりあえず自分なりにやって結果出すしかないんじゃない？

きちんとコントロールとなりうる実験もして、
科学的にそのプロトコールが良い方法ではないことを示した上で、
それでもなお、プロトコールに従わなかったといって怒り出したり、
プロトコールの改善に関してディスカッションすらしてくれないようなら、
そんな指導者についていく必要ないと思うけど？

まあ、君の立場もあるだろうし、それ以上は何ともいえないけど・・・。
ラボ内にその指導教員より立場が上な、ものわかりのいい人はいないの？
または、一人で研究を進める立場にあるポスドクや博士課程の先輩とかさ・・・。

>>368
ちなみに話を読む限りは「過固定」である可能性が強いけど、
（脳はやったこと無いので詳しくはわかりませんが・・・）
抗体で染色する前に一度強力に賦活化してみたら、抗原が露出して染まるかもしれんよ。

過去にそのプロトコールで出たらしいです。

でも今回抗体のロットが違うので過去のデータは当てになりません。
（メーカーにロット間の違いの説明願いを出したら『ソレは恥ずかしい事だ。まず自分の力を疑いなさい』と言われますた）

問題のプロトコールは
１：４％PFA環流固定
２：４％PFA浸漬固定（何日でもOK。1ヶ月でもOK）
３：30％スクロース置換（1日じゃないと駄目）
４：ドライアイスパウダーでそのまま凍結固定（コンパウンド無し）
　　↑　
この方法は米では普通にあるのでソレほどおかしくないです。
５：20μ厚凍結切片（Aｂｓコート付きスライド）
６：免染前に切片を４％PFAで10分間再固定
　　　↑
←コレは何の意味があるんでしょう？

PFA作成時にDWを60度以上にすると駄目だそうです。
（本当は60度以上にしないと架橋が解けません　勿論沸騰は言語道断です）
濁ったPFAを疑問なく使っていました。

なんか投げたくなってきますたよ。ハハハハハハハ…

>>365
現像液に入れた時に反応ムラがあるとバックに影が出ます。現像するとき振ってください。
同じメンブレンで短時間感光したものとその後長時間感光したもので同じ影が出る場合
反応試薬にムラがある可能性があります。均一に塗りつけてください。
あと、あなた以外の人がフィルムを適当に扱ってる可能性もあります。

>>371
>６：免染前に切片を４％PFAで10分間再固定
組織固定で固定し切れなかった組織内部を固定するためにやります。
特に大型組織の時や観察対象がsolubleなモノの時にやることがあります。
再固定の有無程度なら、教官に確認しなくても出来ると思うのでこっそり試してみてください。
浸漬固定の段階から過固定だと思っているなら、内緒でPFAの濃度下げてみてください。
外見上は絶対ばれません。2％くらいです。

それと固定後の処理も重要かと思います。
370さんの言う様にまず各種賦活法をやってみてください。
あと、抗体の希釈倍率と反応温度（4℃、RT、37℃）、反応時間（2ｈ〜overnight）は条件振ってみたほうが良いです。
免染に限らず内緒でコントロール取りや条件振りはしたほうが良いと思われます。

抗体のロットによるあたりはずれはよくある話なのでなんとも言えませんが
死んでないかだけwesternでチェックしたほうが良いかと思います。
がんばってください。

>>366
そこでNIBSTの出番ですよ。
あそこはマジで中の人が凄いらしい。

話に聞くだけなら、俺の通う某国立大のラボよりよっぽどいいと思うわ。
生徒の羨ましい限りの優遇が、俺には信じられんわけでもあるが。

学校選びも重要だよな。国立のブランドに飛びついたけど、一番見るべきは中の人やと思うわ。
国公立とかで、なんとか的権威とかついたら、先ず確実に生徒を食い物にする悪魔だと思ったほうがええど。
俺も食われつつある一人だから。

>>371
抗体のロットが違うと、まったく染まらなくなることは良くある。
ただ、メーカーに聞くのは全然恥ずかしくないと思うけど？
そのためのカスタマーサービスだしね。
こんな掲示板で聞く方が一般的にはよっぽど恥ずかしい・・・。
マーカーとして抗体染色しているみたいだけど、
マーカーの抗体なら他にやっているラボがあるだろうし、
そこから使えると解っている抗体（出来たらプロトコールも）をもらってくるのが手っ取り早いと思う。
もしかしたらそれすらも恥ずかしいことなのかな？

プロトコールは特に問題が無いみたいだけど、
４％PFA浸漬固定が何日でもOKなら一晩程度にしてみたら？
スクロース置換は、１０％、２０％、３０％と順番にやっているけど、まあ大した違いじゃないだろう。
スクロース置換の時間は１日というよりは、３０％スクロースの中で沈んでくるまでが目安かな？

切片にした後に再固定するのはやったことないしわからないけど、
すでに固定されたサンプルなら余り意味が無いと思われます。
染まらないのであれば、染色前に抗原の賦活化した方がいいと思うけどね。
マイルドなものなら賦活化用のバッファーや塩酸を使うとか、
強力にやりたいならオートクレーブ、電子レンジ、電気ポットなどを使ったりもします。

最後のPFAに関する疑問は良く解らんのだけど、
PFAを溶かすときはNaOHなどでアルカリ性にして溶かすんじゃないの？
あと、うちではPBSに溶かしているけどDWなの？
基本的に要時調製だけど、４℃で１週間は十分もつし、
２０％のPFAを作っておいて４℃に保存し、使う時に４％に希釈して使ってます。
経験上１ヶ月ぐらいはそれで大丈夫。

>>372
凍結切片なので賦活化はトリッキーだと思います。
パラフィンの場合抗体データシートにクエン酸buferでの電子レンジ賦活化が進めてありました。

ちょっと内緒で塩酸処理でもしてみたいと思います。

>>374
PFAについてなんですが
理想を言うと直前に作成するのが最も良いです。

保存する場合は高濃度（例えば20％）で作成し凍結するのが良いと思います。
（もちろん作成後濾紙でこして下さい。完全に溶解して無いとperfusionの時毛細血管を詰まらせます。

PBSに溶解する場合では４％程度ならNaOHを滴下しなくても熱をかける程度で大丈夫です。

溶解した状態ではDW　PBSともに1週間以内に使い切った方が良いと思います。

>>375
内緒でするのは良いけど、とりあえず実験ノートはきちんと記載して残しておけよｗ

>>373
それは長浜バイオのことかー！

スレ違いだけど

>>373
教官陣相当酷いんだが。老碍と業績無しだらけだし。
まあ金はタカラ他から出てるんだろうが
あんなとこいってもその後の保障が無いと思うんだが

365です。

>>372
アドバイスありがとうございます。
参考にしたいと思います。

>>379
見た限り、あの学校は伸びるよ。

>>379
世界的権威とか言うのは、大概生徒を食い潰して生き残ってきた輩。
権威の肩書きでデーンと胡坐かいてるやつは、最先端なんて理解できてないぞ。

>>382
それを言っちゃオシマイよ。
帝大系なんて所詮は単なるブランド。そんな事はみんな知ってる。

遺伝子導入用にアデノウィルスを作製しているのですが濃いウイルス液を調整する
ことができていません。
293でうまく増幅するコツみたいなものをご存知の方は教えていただけますでしょうか？
よろしくお願いします。

>>384
ヒント：本嫁

モノの本には、しっかり書いてるぞい

はじめまして。
私も今、ライゲーション出来なくてすっっっごく困ってます！！
pMOS Blueキットっていうの使ってやってるんですけど。
まったく形質転換してもコロニーが生えてこないんです・・・
何ででしょうか・・・・何か良い方法教えて下さい！！

>>386
俺らはエスパーじゃないからそれだけの情報じゃわからん
情報を小出しにするな

>>386
ぶりっ子るな。
的確に説明しろ。

キットについている（であろう）コントロールを使ってもダメ？

本当に素人な質問で申し訳ありませんが、
教えていただけたらありがたいです。
（スレ違いでしたらスルーなさってください）
中学の理科の実験で、たまねぎの核を染める時つかった
酢酸カーミン溶液が皮膚についてしまった場合、
どのくらいの期間とれないのでしょう…。
たしか細胞が染められてしまうので、いくら洗ってもその時には
赤紫色が取れなかったと思うのですが、
一週間くらいで消えるものなのでしょうか？

390の質問をしたものです。
場違いな質問をしてしまい申しわけありませんでした。
高校生質問スレッドで質問してみます。
失礼致しました。

>>384
High titerのウイルスを得るには293の培養の仕方が最も重要。
やはり本嫁。

つまらない質問ですいません。
5%アクリルマミドーウレアゲルをゲルドライヤーで乾燥中に
バリバリに亀裂が入るんですが、ウレアゲルの場合、
水か何かで浸透して、ウレア抜きをしないと駄目なんでしたっけ？

>>393
７％酢酸、１０％メタノールとか。

いま、細胞培養をやっています。細胞培養は超初心者です。
培養期間中に細胞を薬剤で刺激して、培養液を回収し、培養液中の分泌物を
解析するという操作をやっているのですが、その刺激する薬剤を加えると
細胞がディッシュからはがれてしまいます。

ディッシュからはがれてしまうと、細胞量あたりの分泌物の量を定量する
ことが困難になってしまいます。何とかならないでしょうか？

細胞は、コーティングなしのディッシュに液体培地を加えて培養しています。
よろしくお願いします。

>>395
回収した培地にミリポアのフィルターかければいいじゃないの。
シリンジにつけられるやつ。出入りの業者さんに聞いてごらん。

ヒト肥満細胞であるLAD2細胞に対してプラスミド（EGF, beta-GAL等）の
トランスフェクションを試みてます。
LF, LF2000, FuGEN6, ArrestIn, その他数種のreagentを試してますが、どうしてもうまくいきません。どれだけうまくいてもポジティブなものは１％以下です。ちなみにHEK293では50-70%くらいはうまくいくんですが・・・。
どなたか、同じ細胞でトランスフェクションうまくいっている方いませんか？？もしいらっしゃったら、是非コツを教えてくださいませんでしょうか？お願いいたします。
なお、諸般の理由から、出来ればウイルス・ベクターは使用したくないんですが・・・。

>>390
酢酸カーミンなんて無害に等しい。
無視しる。毎日ちゃんと飯食って風呂に入ってれば、適当に抜けてくる。


>>397
その辺は、気合で。
場当たり的に頑張るのが、研究者。

エレポとか

>>397 お金があるなら天草使え。

もはや気合いまけしてる自分がいるかも、です・・・。
またエレポの機械は自分が懇意にしていただいている同じ校舎内ではどこの研究室にもありません、。
あと、すんません。「天草を使え」の意味が分っかりませ〜ん？
もしかして、transfection enhancerの類の様なものを使え、という意味でしょうかね？
是非詳しいお話をお聞きしたいdeath。
ちなみにボクのボスは湯田だからでしょうが、かなりのしぶちんで、しょうじきお金はあまりつかえません。
なにしろ、使用しているreagentsもほとんど他の研究室からもらったり借りたりしているものですし。

>>397
リンカル試した？？古典的な方法って、意外に馬鹿にできないよ。
神経系のprimary cultureでも余裕で入るよ。多少の改良が必要だけど。

がんがれ！

天草四郎時貞　じゃなくって、amaxa。いろんな細胞に良く入る、けど高い。
ttp://www.amaxa.com/

突然変異体の原因遺伝子の特定ってどうすればいいの？
全ゲノムDNAのシーケンスなんてほぼ無理だし。
一応、SDS-PAGEでバンドの違いは確認してます。

もうちょっと具体的に言ってくれないと何とも答えられんね．

何が原因か分かっていないからなにも出来ないんだよ。
まず、自分がやっていることと起きている事を把握し理解するところから始めよう。

大腸菌のたんぱく質を哺乳類細胞に発現させるようにいわれました。
とりあえずＣＭＶプロモーターのベクターに組み込んでみましたが、うまく発現しません。
先輩によれば、大腸菌と哺乳類では塩基に好みがあるから、うまく発現しない事がある、ということと
大腸菌遺伝子にポリＡの配列があるとそこで蛋白になるときにとまってしまうことがある、ということでした。
実際どんなものなんでしょう

コドンユーセージ

>>407
>ということでした。
ってことは自分では調べてないのか？とりあえずこれ読め。
ttp://www.nig.ac.jp/museum/evolution/F/index-kodon.html

コドンを変えるとか苦手なのを補うベクターを使うとか

>>409
もちろん自分でもしらべましたが、そこまで能力が無いというか。
408さん409さんありがとうございます

>>407
全然分からん。
先ず、何の細胞に入れるのか。
ナニで入れるのか。
入れる対象の詳しい情報。
発現させたいタンパクの名前。
発現させる期間。

自分でリカイできていない事は、壁にぶち当たった時どうやっても先には進めない。
勉強するんだ。

>>407
細胞への導入法がリポフェクタミンとか使った一過性か、アデノ使った安定的なものか、とか
発現させたいタンパク質が分泌型か細胞質型か膜タンパクかとか
使ってる細胞の名前、自前の場合は由来など
表に出していい範囲で教えてもらえるともらえるアドバイスの数も増えると思われます。

FLAGとかHAとかtagをつけて、導入自体がちゃんとなされてるか調べましたか？
いろいろ原因が考えられるときは1つずつチェックしてみてください。
がんばってください。

最近さ、制限酵素処理っつー初歩も良いトコな事象が上手くいかないのよ。
インサートチェックで適当にEcoRIとかでプラスミド切るとさ、漏れなく
DNAがスメったような感じになるのよ。初歩も初歩で申し訳ないんだが、
こんな事でつまずいた事ないので解決法がわからないのよ。
こんな経験したことある。こうやって解決した。こんなのが原因じゃない？
とか何でも良いんでレスポンス求む。
ちなみに試薬（水、制限酵素、バッファー）はオールリフレッシュ済み。
こうなるとじゃあプラスミドの取り方が悪いんじゃない？とかになるんだけど
それまでプラスミドごとき普通に取れて普通に切れたのさ。何ででしょうか？

補足

DNAの保存はすべてTEでつ。DWではないっつ。
切らないでプラスミド流した場合はしっかりシングルバンド出すので
制限酵素処理したらスメると考えて間違いなさそう。おながいしまつ。

>>412
ありがとうございます。
細胞への導入は一過性で十分です。細胞はＨｅＬａなどのヒトの不死化細胞を使っています。
エレクトロポレーションで行いました。
発現の確認はＨＡタグの免疫染色とウェスタンでやりましたが、いずれも発現無し。もちろんコントロール（ヒトの蛋白）
はちゃんと発現しています。
今はリポフェクタミンを使って再実験しているところです。うまくいかなければ
教えてもらったコドンユセージの改変なども行っていきたいです。

まさかとは思うけど
ヒートブロック（orインキュベータ）が壊れてへんな温度になってるとか・・・

プラスミドを一旦フェノクロエタ沈してから切る。

切らないでプラスミド流した場合はしっかりシングルバンド出す
-切らずにプラスミドを流したらバンドは３本でるのでは？

TEに、DNaseがコンタミンしているケースがある。
この場合、37oCにincubate するだけで、スメアになる。
だから、EcoRIがコンタミンしているのか、TEがコンタミンしている
のかをまず調べろ！

目的のプラスミドin TE EcoRIなし
目的のプラスミドin TE EcoRIあり
Quiagenかなにかで取ったプラスミド　in TE　EcoRIあり
をincubateして流して、どのプレップでスメアが起きるのかチェック

>>415
プラスミドを増やす大腸菌株変えなかった？
>>419
DNaseはMg++要求性だからTE中じゃ切れないよ。
制限酵素用バッファーを加えてincubateすれ。

研究室に変な人はいませんか？　変な人ばかりですか。　それでは制限酵素は切れませんよ。w

>>364
過固定だね、それ。
環流固定したあととりあえずすぐに染めてみればいいのに。

で、染まりました！って結果を持っていく。

どうしても固定のプロとコールを変えられないなら、
電子レンジで抗原性の賦活化だな。

>>371
ＰＦＡを溶かす時にpH合わせてる？
弱アルカリ性にしないと溶けないよ？
濁ったままってのはまずいでしょ。

６の再固定は、切片がスライドからはがれないようにするため。
しかし、スライドにゼラチンコートとかしてないなら無意味だと思うが。

現在、DNA断片をつくり、各断片についてPCRで増幅をかけようとしているのですが、上手くいきません。
計算した所、どうやら増幅をかけても出てこない断片は80bp程度なんですが、ここまで小さいと、流石に増えづらいんでしょうか。
使用ポリメーラーゼはrTaqです。こいつでは、やっぱり厳しいんでしょうか。

ゲルの濃度が薄くて、プライマーダイマーと80bpが区別できないとかじゃないよね？

＞DNaseはMg++要求性だからTE中じゃ切れないよ。

教科書的にはそうだが、実際にMg++を入れないで
DNaseだけで反応させてみろ、
あーらびっくりDNAがなくなってしまうからＷ

>424
80bpならプライマーとしてFWD鎖とREV鎖を外注してそれをアニーリングさせたら?

\15000x2程度かな?

>>426
ここで問題になってるのは微量のコンタミのDNaseの話じゃなかったっけ？

>>247 たかっ！！

>>413
最後の手段として、他の人にお願いして切ってもらったらどう？

>>425
ゲル濃度は、アガで2%にしています。
一応、こんなもんなら半分まで流せば大丈夫だろうと思ったんですが、上手くいきま
せんでした。
２度ミスるのもなんだしと言う事で、鋳型をいれない対照サンプルも作って流したん
で、
区別できていないわけではありません。

>>427
プライマーに一工夫ですか。しかし、プライマーはコレで出来るはずだと、偉い人が
言うもんで、
なかなか外注は難しそうです。

---
次回、また鋳型のサンプルを調製し直して、半定量PCRにでもかけて、比較して見ま
す。

アガ2％って濃すぎじゃね？

↑何とか言ってやって下さいよ

5％ゲルを延々電気泳動してミューピッ土を煮立たせた俺様が来ましたよ

質問させてください。
プラスミドのDNAシーケンスを依頼して解析不能で帰ってきたら
何がいけないんですかね？
純度ですか？PCRではガッツリバンド出てるんですけど、、、

じゃそのPCR産物解析依頼してみなはれ

４３５さん
プラスミドのPCRはそのPCRかけた溶液の電気泳動写真
にプラスミドのバンドとPCR産物のバンドでませんか？
そのPCR産物はバンドひとつですが、プラスミドのバンドがあるんです。
それでも解析できるんですか？
素人ですいません。

プラスミドが入ってても大丈夫だけどプライマーはヤバイから、ゲルから切り出すかカラムで精製。

ありがとうございます！試してみます。

もうひとつだけきかせてください。
なぜプラスミドのシーケンスはよめないんですかね？

>>436
>そのPCR産物はバンドひとつですが、プラスミドのバンドがあるんです。

テンプレとなるプラスミドの濃度が高すぎのような気がするけど…
シークエンス読むときも、テンプレ濃度が高すぎると読めないよ。

わかりましたー
ありがとうございまーす。

というかシークエンスのテンプレートの濃度を合わせるのが重要ということを
ラボの中で教えてもらえないラボというのはいかがなものか。

２chで不特定多数から情報を得て行った実験というのはいかがなものか。

PCR産物なら全て3'末端A突出だと勘違いしている学生は意外と多いw

シーケンス外注って高いんでしょう。ちゃんと調整してから出さないと
税金の無駄遣いだよん。

AとBというタンパク質の共沈実験を行ってるんですが、
片方のA側からのみしか落ちないんですよね。

Aは、細胞質から核など様々なところに局在しているタンパク質で、
Bは特定の部位にしかほとんど存在しないタンパク質です。
普通に考えたらB側からIPしたほうが共沈がみやすい
ように思うのですが･･･

抗体や細胞溶解液の組成の問題なのか、A側からCoIPされたBが
ノンスペなのかわからず、困ってます。

抗体のエピトープ確認した？
不明だったら複数の抗体で試してみ．
それでもダメだったら，リコンビナントでpull-down.

>444
AとBが結合したとき、Bのエピトープへの抗体結合が
Aによって邪魔されている

などという場合が考えられる。

>>407なんですが、大腸菌の蛋白質をヒトの細胞に発現させようとしてうまくいかないのですが、
ＩＦで確認したところ、１００個の細胞のうち１〜２個にだけ強く発現させることができつようになりました。
ところが、ほとんどの細胞には全く発現していません。
発現の方法をエレクトロポレーションやfugene6でやってみましたが、どれも同じ結果です。
細胞はHeLaです。

私なりに考えてみると、もし電子の配列が哺乳類に向かないものだったら全く発現しないか、
しても微量だと思います。１００個に一個でも強く発現しているということは他の原因と考えています。
これって正しいのでしょうか。

とりあえず他のベクターや細胞でやってみようと思いますが、他に原因は考えられるでしょうか

>>447
100個に1個って，それアーチファクトなんじゃないの？
IRES-GFPかなんかで入ってることだけは
確認した方がいいんじゃない？
入ってるんだったら，mRNAの発現を確認する．

ウイルスベクターなら100％入るはずだけどね...

>>448
コントロールはちゃんととっていて、再現性もあるので違うと思います。
ウィルスベクターも考えているのですが、トランジエントの場合は却って普通のベクターのほうが
良かったりする気がしています。

>>447
プロモーターが悪い。圧制汁

>>450
ありがとうございます
ベクターはＰＣＤＮＡ３ですので、ＨｅＬａでちゃんと発現すると思います。

pcDNA3.1 zeo(+)か？
サイトメガロウイルスエンハンサーとプロモーターだわなぁ。
んー・・・
他にEF系に乗せ変えとかして、アッセイしてみたら？

あと、エレクト止めればもっと入りが良いんじゃね？

ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰの息づかいを感じていれば、事前に気配があったはずだ（by 毎日新聞）

>>453
ﾃﾗﾜﾛｽ

>>452
HelaにCMVプロモーターだったら，普通，発現するじゃない？
細胞との相性じゃなくて，cDNAの違いでプロモーターの選択が
必要な場合があるの？

たしかにＥＦ系は気になるなぁ。

>>455
何事も、試す価値はあるのでは？

>>452
ＰＣＤＮＡなんですが、３．１じゃなくて３です。
でもＣＭＶプロモーターなんで同じだと思います。
３．１に切り替えようかと思いながらも、使い慣れた３をずっと使っています。

半角英数じゃないのが怪しいなぁ・・・

あきらめることも大切よ。
前に進みなさい。

>>447
まあ、いろいろ考えられるぞー。
どうしてもその原因を探るのが大切なら、
ためしに、Proteasome阻害剤で、6時間ほど処理してみたら。

あけおめ。今年も実験がうまくいきますように。age

あぼーん

age

今年こそはうまくいきますように・・・

液体窒素の中に落としてしまたケーンを助ける良い方法があれば教えてください。

ほっとけば液体窒素蒸発するだろ

タンクの中身を一度全部出す。
短時間なら発泡スチロールだろうがバケツだろうが構わんから
液体窒素はそこに入れておけ。

↑換気のいいところでね

現在学部での研究をしているものですが、
先日、指導教官の内容に疑問を感じました。
いろいろ調べては見たものの、分からなく皆様の意見を聞きたく
この板に質問させていただきます。

内容は生態学分野の生物の分布に関してです。
分布は「集中・ランダム・一様」の３つ大別できますが、
次の場合のランダム分布をとるときの期待値を知りたいのです。

１０００個の営巣資源があったとして、１つの営巣資源に営巣できる種は３種までです。
また、同種が１つの営巣資源に２巣以上営巣することはありません。
このとき「営巣なし・１種のみ営巣・２種のみ営巣・３種のみ営巣」がランダムに分布するときの期待値が分かりません。

どうしても計算には営巣総数（１０００個の営巣資源に営巣した総数）が必要だと思うのですが、
指導教官は必要ないと言い張ります。

どうか手助けお願いいたします。

>>470
「何で必要だと思うのか」という事を指導教官に説明してみた？

営巣総数が必要な理由でしょうか？
それは説明しましたが、今回の趣旨とは違うとのこと…
もしかしたら指導教官が違うことを言っていることに気づいていない可能背もありますし、
私の勉強不足の可能性もあります。
ただ、どちらかは私には分かりませんでした。

アデノウイルスを精製しています。
ですが、力価の高いウイルスがとれません。

HEK293に感染後三日で細胞がふくらんではがれてきたので、
細胞を回収後に液体窒素-37Cの三回繰り返しで破砕し、遠心で上清を得ました。
精製はCsCl超遠心ではなく、V*rapure社のウイルス精製キットを使ってます。

ウイルス粒子数を吸光度で測定すると10^12/mlほどとれているのですが、
力価を測定するとpfuが10^9/mlほどで、感染能を保有しているウイルスは
全体の1/1000で使い物になりません。

精製kitに問題があるのではないかと疑っています。
超遠心機が近くになく、kitを使っているのですが、誰か他によい
ウイルス精製kitをご存じありませんか？
それともV*rapure社のkitで精製できているひといたら教えてください。

kit使わずに自力でやってみたら良いやん。

V*rapure社のkitは精製時のtiterが高い場合はまず問題がないんですが、低い時はだめ。
数回amplificationをかけると力価があがるのでそれから精製する。
力価は実際のターゲット細胞で測定することをすすめる。

virus粒子数＞pfuとなります。だいたい1pfu＝100粒子ぐらい。
それにしても一桁すくないな。

フォロー感謝します。

kit使わずとなると、超遠心CsCl以外で方法はないでしょうか？
とりあえず、あと何回か増幅を繰り返して再トライしてみます。
動物に使用したいので、このままだと高い力価で用いようとすると
ウイルスの細胞毒性の影響が強く出てしまうのが心配です。

試験体のヒトが２１歳オスだけうまく動かない
除外したーい

植物病原細菌からのプラスミド抽出後の濃縮がなんどやってもうまくいかず、
濃縮の段階でなくなってしまします。
どうしたらよいでしょうか？？
詳しい方教えてください！　濃縮には0.3M sodium acetate と エタノールを使っています。

免疫沈降法って、細胞を溶解自体での細胞内の結合を保持した状態で
IPされてくるのでしょうか？それともIPの操作中に新たに結合して
coIPされることも多いのでしょうか?

↑細胞を溶解した時点での、です

抗体はlysateに後から入れて、これはIPの操作中に新たに結合するのに、
lysate中のタンパク質同士は新たには結合しない理由を教えてください。

>>477
変なキット使うよりもCsClが一番簡単じゃないか？
超遠心がないのか？ｗ

>それともIPの操作中に新たに結合してcoIPされることも多いのでしょうか?
これは「あぐらせて落とす」という高等テクニックだ。
これを狙ってできるようになると君も免沈マスター。
狙わずにやって喜んでる論文が多数あるようだがｗ

>>484
それは具体的にどのような工夫をしているのでしょうか？

>>479
とりあえず，大腸菌のプラスミドで練習．

免疫染色をしているのですが、メタノール固定とPFA固定で
ある細胞内小器官が染まったり、染まらなかったりして、
どちらの結果を信用していいのか困っています。どちらの固定法が
いいかどうかは、抗体との相性や、経験的なものによるのでしょうか？

age

486
大腸菌では何度も練習してうまく抽出できたんです〜(>_<)

>>489
ここで聞いてみたら？
↓
http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1137672704/

>>489
濃縮前，つまり 抽出してすぐの薄い溶液の中には
プラスミドはあるのでしょうか？
とりあえず，吸光度測定と電気泳動で，プラスミドの存在を確認してみて下さい．
もし，電気泳動ではっきりしたバンドが見られれば，濃縮過程でロスしていることに
なりますし，もし，電気泳動でバンドが無い あるいは スメアなバンドがある場合
には，自分が取れていると思っていたものは，実は何も無かった あるいは
ゲノムDNAであったと考えられます．
ついでに，濃縮前のDNA溶液を鋳型にして，プラスミドに相補的なプライマーで
PCRして，プラスミド上の配列が増幅されるかどうかを見ることでも，確認は
可能です．

もし，プラスミドの存在が確認できた場合は，途中でロスしていることになりますので，
濃縮方法を変える必要があります．エタ沈による濃縮では，DNAが
あまりに希薄な場合は，遠心しても沈殿を生じません．ですから，
シリカカラムに吸着させて，水で溶出する方法か，透析により濃縮する方法を
勧めます．

>>487
深く考えずに自分に都合のいい方を使う。
答えはKOができるまで誰にもわからない。

>>491
濃縮前の溶液は、電気泳動で確認したところはっきりバンドが見られましたので
その時点では抽出できているものと思われます。

濃縮方法を変えてもう一度やってみます！！
丁寧なアドバイスをいただきましてありがとうございました(o^-^o)

>>487
可能であれば、染まったり染まらなかったりする細胞小器官を精製してウエスタンで確認して、
より信頼性の高い結果を採用することをお勧めします。

Promegaのキットを使用した中量抽出がうまくいきません。
DNAを捕らえる白カラムに溶液を通すときに詰まってしまい、
溶液が下に落ちません。
考えられる原因は何でしょうか。

再懸濁が足りていない、Cell Lysisでの混合が足りない、など…。

>>494
おれの経験上、そういうふうにいろいろやって確認して納得しても
間違ってるものは間違ってるｗ

>>490
中和の際の混和が足りない．

>>495
培養液の容量が多すぎる。

>>492>>494
遅れましたがレスありがとうございます。
その小器官というのは中心体なのですが、論文等読むと
ほとんどメタノールで固定しているんですよね
精製してウエスタンはやってみるつもりです。

radio ligand binding assayでG-50カラムでタンパク質+リガンド（同位体でラベリング）
とフリーのリガンドを分離し、前者をシンチレーションカウンターで読んでいます。
えらい再現性が悪いのですが、何かいいテクありませんか？

>>499
シグマのγチューブリンのモノクロか？
確かメタノール固定しないと染まらないぞ。
自分で作った抗体なら、タグつけたときの局在と比べてもいい。
中心体にいくものはあぐることも多いけど、きれいに中心体に
いくのも結構ある。

外注するか テクニシャン雇う

>>500

標識リガンドを結合したタンパク質を円形フィルターに吸着させるアッセイ系ではいかんのか？

>>503
もっちと詳しく教えて？それって早い、再現性あがる、高い　っていう
理解で宜しいのでしょうか。フィルターの選び方とか選択肢多い？

プロモーター配列ってどってさがすか？

>>505
In Silico

rTaqで増幅したフラグメントを
EcoRVやSma1などのblunt end cut したベクターに
無理やりライゲーションすることって可能ですか？
効率はどれくらい悪くなるのでしょうか？

>>507

そのままでは絶対に入らない。
PCR産物をklenowかT4DNApolymeraseで平滑末端化しる。

まあ
絶対に入らないこともない罠

プライマーの５末がＧでない
ファイナルエクステンションなし
ベクター脱リン酸化なし
ベクター：インサート＝１：１００

これでぽつりぽつりかな



てか
>>508のように平滑化しただけでは
５末がリン酸化されてないから
ほとんど改善しないよ

ちゃんとリン酸化汁

>>509
ベクターがリン酸化されてるから508で問題ないのでは？

ライゲーションキットで一晩置いて、そのあともういっかい制限酵素で
切る。


自分ならPCRプライマーから作り直すが...

>508-509
thx! bluntします…

>>510
セルフが出まくって死を見るなり
ベクターは脱リン酸化
インサート側をリン酸化
これが基本なり

>>513
基本なりって・・・わかってないね。

508のやり方で断片をリン酸化しようがしまいが、ベクターいじらなければかわらんだろ。
509でベクターの脱リン酸に言及し無い時点で510の突っ込みがきたんだろが。

513よりも511のほうが遥かにローコスト。

>>511さん、
もう少し詳しくお願いします。

ウズラの骨髄細胞がうまくとれない
なんかいい方法ない？

>>503
もちっと。　くわすく。

でも俺511の方法で二週間以上はまったことあるから

みんなそれぞれ成功例が違うんだな。

>>499
中心体かよ！！
微小管はメタノール固定じゃないときれいに固定されない事が多いから
そのせいじゃないのか？

>>518

そうか？
ベクターをEcoRVかsmaIで切ってVentかKODのPCR産物を混ぜてライゲーションと形質転換。
俺はプレート上に沢山のコロニーが生えてからそれをかき集めて
ミニプレップしてEcoRVかSmaIで切っても一度形質転換する。

はずれたことない。

現在プラスミドを２つ構築しようとしているのですが、プラスミドが大きく、何度試みてもうまくいきません。
どなたかアドバイスをお願いします。

一つ目のプラスミド
ベクター：7kbp（BamH�T Sal�Tで処理後、ゲルで抽出）
インサート：4kbp（PCR後、 BamH�T Xho�Tで処理し、ゲルで抽出）
二つ目のプラスミド
ベクター：9kbp（Nco�T Xho�Tで処理後、ゲルで抽出）
インサート：1.5kbp（PCR後、 Nco�T Xho�Tで処理し、ゲルで抽出）

T4リガーゼで16℃、オーバーナイトでライゲーション後、エタ沈し、
エレクトロポレーションによって形質転換（コンピテントセル：DH5a、コンピテンシー＞10^8)

上手くいかないって、どうなってるの？
コロニーが出ないの？出るけど空ベクターなの？出るけど謎の小さいプラスミドなの？
それによって対処が違うよ。

>523
基本、コロニーが出ないです。
出たとしても空ベクターです。

>>518
バカだねぇ

>524
インサートに問題ありそうだね。
ＴＡベクターに一旦入れてから、その制限酵素で切り出して、それをインサートにしてみたらどうだろうか。

>524
いや、待てよ。　そのベクター、何のベクターだ？　ウイルス系？

>522
もちろん、抽出後は泳動して量を確かめてるんだよね？
つーか、いちいちPCR産物をcutした後にゲル抽出ってする物なの？
俺そんなことしたことないけど、はずしたことないよ

コロニーが出ないってことを考えるとUVの当てすぎっていう可能性も高くないか？
インサートだけに問題があるならワンカットしかできなかったやつがセルフでライゲーションされて出てくるはずだし

初歩的な実験になると書き込みが増えるような・・・。

>528
量は電気泳動で確かめています。
ゲル抽出の際にはUVが当たらないように工夫して行っています。

>526


>527
もらい物のベクターなので由来は分からないです・・・

良くある指摘だろうけど繰り返しますよ、許してね。
PCRのプライマーに仕込んだ制限酵素サイトの外側に余分にヌクレオチド付けてますか？

>528
量は電気泳動で確かめています。
ゲル抽出の際にはUVが当たらないように工夫して行っています。

>526
変異が入らないようにKODでPCRしているのでTAクローニングできないです。

>527
スミマセン。もらい物のベクターなので由来は分からないです・・・

>531
4bpずつ付けています。

>>522
一つ確認だが、エレポにしては、えらくコンピテンしー低くないか？

>>522
534ですが、あとPCR断片の制限酵素処理は何時間しましたか？
基本的な事だけど、念のため教えてください。

>522
に加えて疑問なんだけど、プラスミドが大きいとエレポだと入りにくいとか、
塩化カルシウムの方がいいとかないの？？

俺はライゲーションの際に電気泳動のバンドの濃さ（DNA量）で見て、適当に混ぜてるけど、モル比を計算してライゲーションさせた方がいいの？？

>535
37℃で2時間反応させました。

インサート断片の切れが気になるなら
一旦小さいクローニングベクターにでも
入れて切り直す．

大っきいベクターの場合，キットによるゲル抽出
が不完全になる場合があるので，後でフェノクロ
で洗う．

で，13kbのサブクローニングが改善したことがある．
ちなみに，大腸菌との相性もあるような気がするが，
定かではない．

>>537
レスどうも。今家にいるので調べられないけど、PCR断片の末端サイトは2時間反応で切れそう？
例えばNEBのカタログで確認してみて。NcoIとかSalIってだいじょうぶだっけ？

ベクターはちゃんとした物なのか？　由来とか知らんってどういうことだ？
ベクターだけで形質転換してみろよ。　コロニーはたくさん出るか？

>540
作製した研究室に問い合わせたところ分からないって言われたんです・・・
転換効率は下がるもののちゃんとコロニーはたくさん出ます。

>539
小さいベクターpKF3には入るので、切れてるとは思います。

538の言う通り、平行してサブクローンしてみたら？
BSSKのEcoRVにサブクローンしてみたら？PCR fragmentをベクター量の10倍程度
ligationにつっこむ。blue/whiteでセレクションして、whiteを何個かつつけば入ってると思うよ。

>541
そんな適当で、じゃあそのベクターのＭＣＳは本当に正しいのか？確認したのか？

>542
こりゃあんた、そのデカい怪しいベクターに問題ありそうだな。

>>539
SalIはちょっとやらしそうだけど、4-bpあれば大丈夫そう。他はＯＫ。
ttp://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_linearized_vector.asp

ベクター側、サルは危険だよ。　ほんと切れにくいよ。
バムだけで入れて、向きぐらいは根性で決めろよ。

>>540
転換効率は下がるもののっていうのが気になるんだけど。。
というのも、コンピの形質転換効率が10の8乗だよね。これって問題のベクターでの効率
じゃないでしょ。よくわからないこのベクターのみで形質転換効率自体を下げてしまうなら、
さらに低い効率になるんじゃない？なので、コンピの形質転換効率を上げれば？エレポだと
10の10乗くらい余裕でできるよ。

>>546
サンクス。
>>547
君の言う通りだ。簡単なサイトを使いにこした事はない。
>>545
怪しいベクターの構造（pAやプロモーターやoli）から推測できないかな？

しかし、そんな効率でたった数個しか出てこないようなコロニー、怖くて使えんだろ。

>>522

思い切ってプレートの薬剤の濃度を1/3~1/5程度にして蒔いてみる。
エレポ直後の培養を３〜５時間したものも同時にやってみる。

Sal/Xhoは昔からイマイチだと言われておる．

>548
スミマセン。説明が不十分でした。
ベクターのみで10^8です。

>544
BamH�TとSal�Tでそれぞれ切って切れてるのは確認しました。

抗生物質は何？
プレートに蒔く前に、抗生物質ナシの培地でちゃんと培養してる？

PCR産物がpKF3にちゃんと入ったんだったら、そこから切り出して使う。
vectorの切り出しはやめて、制限酵素処理後CIP処理だけにする。
（長いDNA断片は、ゲル抽出時にダメージをうけやすい）

>554
アンピシリンです。
ちゃんと30分間培養しています。

皆さんのアドバイスを参考にして今週もう一度やってみます。
ありがとうございました。
結果は来週にでも報告させていただきます

受託の方がコスト安だろｗ　ここまできたら。

ベクターのコピー数にもよるけど、アンピシリンの濃度を40ug/ml位にしてみたら？

WISH用のサンプルを固定する時に使用する、4%PFAの調製についてお尋ねです。
自分はずっと１×PBSに溶かしていましたが、共同研究者が水に溶かしたもので
固定してました。まだそれで実験は進めていないのですが、水でも問題ないんですかねー？
pHは合わせてたハズですが・・

>559
そりゃＰＢＳやphosphate bufferに入れてるぐらいだからpHが大切なんだろうね。
水でｐＨ合わせてたはず・・・ってどういうことだよｗ

>>560
やっぱり変だろ？
自信ありげに言ってたから何も言えんかったんだよ。随分年上だしな。

べつにどちらでもうまくいくよ

>>559
水に溶かして、ファイナルで１ｘＰＢＳになるようにすれば問題ない。
１２％で作って１．５ＸＰＢＳで３倍希釈とか。

実験ではないのですが，
アイオワ大学のDSHBから抗体を買われたことのある方いらっしゃいますか？
webページを見ても細かいことがよくわかりません。
いきなりorder formとcompliance formをFAXで送りつけてしまえばいいのだろうか‥‥

ここを見ろ，とかでもよいので情報を求めます。

D：Duch wife-type
S：Special
H：Hard gei
B：Bombardment

↑
×　Hard gei
◯　Hard gay

もっとがんばりましょう

なぜかFuGENE6で３回連続でtransfect失敗

それは、下手だから。

plasmidにPCR断片cloningできたなら、目的のvectorにsubcloningでいいじゃん。

同じタンパクのサンプルを二つのミニゲルでSDS-PAGEし、一つはWesternに一つはSilverStainingすると仮定する。
バンドが二つあって、SDS-PAGEでは一つしか見えず、WesternBlottingでは両方見える。SDS-PAGEは半定量的に
バンドの見た目の濃さ、とタンパク濃度の相関幅が広い。
一方WBはもし微量でも、タンパクが存在すれば、黒いバンドが出てくる。さて、この場合の線形性、あるいは
検出可能濃度域っていうのはどの程度のものでしょうか。
また、SDS-PAGEで見えたバンドと見えなかったバンド（WBでのみ見えたもの）の比率はどの程度と考えられるでしょうか。
1:10とは思えない。1:100くらいに想像する。1:1000ならWBでも見えないかな？

タバコをふかしながら検出限界を考えた。
タンパク質濃度 0.1mg/mlだったして、5ul SDS-PAGEアプライ。0.5ugサンプル。
Bio-Rad silver staining, CBBより30-50 fold sensitive.
CBBが 10ng 検出限界だとすると、Silverは200pg。
WBは大体10pgだとする。　WBで見えて、Silverで見えないのなら、濃度は100pg位かも知れない。
500ng アプライして、0.1ngなら、WBでやっと見えたバンドは、0.02%。WBってそんなにすごいのか？
それとも、メンソールスリムを吸いすぎた俺は考え違いしているののか？

あー、そういえば、SilverStainigの謡い文句の10pgってよく考えたら二次抗体のことかな。
いい加減に考えていたかもしれない。10pgの二次抗体は、どの位の量の目的タンパクに結合するのか。
ぼくの考えでは、等量のモル濃度で考えてはいけなそうだけど、もしそうなら結局目的タンパク質の検出量も10pgになってしまうのかしら
ん。なかなか考えがまとまらないから、今日はここで
終わり。終
了。

つまんね

>>572
一行目が。　
検出限界の内容は正しいのか？

>>572
あ
い
ぼ
ん
終
了

トリップ違うし少し無理があるな

元になる情報が曖昧なら、いくら考えるまねしても何も
出てこないだろ

>>576
それって検出限界の話？　それとも加護ちゃんの、あっ！

>俺は考え違いしているののか？　　　だって。

FuGENE6でも入りにくい細胞があるとは言え
３回も連続して失敗できるなんて別の才能だな。

質問です。よろしくお願いします。

表面が親水性のマグネティックビーズをBSAでコートしたいのですが、
BSAがうまくくっついてくれません。BSAはlyophilizedタイプのもので
水によく溶けます。

確かに、表面が親水性だとタンパク質はくっつきにくいのでは
と思うのですが。混ぜるときは、界面活性剤や塩が入ったバッファーの
方がただの水よりよいのでしょうか？

>579
くっついたかどうかは、どうやって判断してるの？

>>580
hot SDSバッファーで回収して、ゲルに流して、ウェスタンしてみます。

CMVプロモータは、細胞周期に依存するのですか？
ほ乳類培養細胞のstableクローンで、tagの抗体による染色像を、セミナーで見たのですが、均一ではなかったのです。
突然すみませんが、よろしくお願いします。

てｓｔ

質問です。
オートピペッターのチップやエッペンドルフチューブをRNaseフリー化
するとき、オートクレーブではだめなのでしょうか？

私の研究チーム内では、オートクレーブでOKということになっているの
ですが、ある機会に他の研究チームの技術員の方にそのことを話したら、
それではだめだといわれました。

本当のところはどうなのでしょうか？みなさんはどうされていますか？
よろしくお願いします。

３−ホスホグリセルアルデヒドと１、３−ジヒドロキシアセトンリン酸の間で起こる異性化をケトーエノール互変異性の概念で説明してください。。

>>584
ゆでても大丈夫な酵素だからなぁ
121℃ならいいような気もするが...

ピペットマンの箱やチューブの入ったビーカーをオートクレーブバックに
詰めて、中にDEPCを数滴垂らしてオートクレーブすればいいんでないか？

FuGENEで遺伝子が入らなくなったときは、細胞を起こしなおすべし。それで解決。
ずっと実験をやっているとなぜかわからんがたまにそうなるときがある。

>>584
始めからRNase Freeのﾁｯﾌﾟ（ラック入り）やﾁｭｰﾌﾞを買った方が早いのでは？
金かかるし、ﾎﾝﾄにRNase Freeなのか分からんけどね。

>584
コンタミの一番の原因は、人の汗や唾液だろ？
要は、手で詰めたチップは危険が常に伴うということだ。
機械で詰められた（プレパック？）やつをＡＣすればいいんじゃない？
あとはピペッティング操作の時はずっと息を止めるｗ

>582
依存しない。　染色が下手糞だったのでしょう。

>>590
他の実験に使うRNAaseの混入の方が遙かに強力だという説も・・・。

mini-prepキットのSol.1にものすごい量のRNaseAが添加されてるから、それが
エアロゾルになって悲惨したり、その廃液がシンクに付着してんだと思うよ。

>>584
むしろオートクレーブすらしなくていい
上にも書いてる人がいるがRNaseコンタミの主因が人間の汗等から
だから、工場で機械的に作られたチップは袋詰めになって届いた
段階ですでにほぼRNaseフリーと考えていい
むしろその後でオートクレーブするためにチップ詰めの作業の段階
でコンタミする方がよっぽど怖い
以上を踏まえた正しいチップの使い方は、まずチップの入った袋
にピペットマンの先が入るくらいの穴を開けて、使うときはその
穴からピペットマンを突っ込んで中でチップをつける
これで気軽にRNaseフリーを確立できると同時に、わずらわしい
チップ詰めからも解放される




って何かの本に書いてあった

>>584
オートクレーブではRNaseは不活化されません。



って何かの本に書いてあったよ。

どの時点で壊れるかって意識すると、たいていサンプル採取時点で
決まってるような気もする。

>>584
RNaseはなかなか丈夫な酵素でして、何の手順も踏まずにオートクレーブをかけた程度では、話になりません。
当然、乾式で適当に加熱しても、この酵素は完全には失活しません。だから、なかなか手強いのです。

そちらの研究チームではOKとなっているようですが、多分偉い人が諦めてしまっているのでしょう。

確か、除去方法には5パタンほど、過去の論文などで呈されていたはずです。
　　・180℃で8ｈ over
　　・クロロホルム洗浄
　　・0.1% DEPCで37℃ 2h漬け置き。DEPC処理水しっかり濯いだ後、100℃ 15min heatか121℃ 15min オートクレーブ。
　　・洗剤で洗浄後 95% EtOHで乾燥。3% H2O2でRT 10min。DEPC処理水で完全に濯ぐ。
　　・0.1N NaOH /0.1% EDTAに漬けてover night。その後、DEPC処理水で完全に濯ぐ。

まぁ、チップを詰め積めする時は、新品活清潔な使い捨ての手袋と、マスクを着用し、汗をかいている場合は確り拭いて、
それでも暑ければ部屋の温度を下げて、作業を行う。当然、RNaseがコンタミするとマズい作業中も、同様の措置を取りましょう。

584です。
たくさんのお返事ありがとうございます。m(_ _)m
とても参考になりそうです。RNaseは、なかなか手ごわい酵素と
いうことがよく分かりました。

植物でのくろまちんの免沈のコントロールには何使っていますか？
K4とかK9？

超音波処理などでガタガタになったＤＮＡの末端を
きれいにして、blunt endのベクターに入れれるようにするにはどうしたらいいですかね？

T4 DPaseでbluntingというのが伝統的。Molecular Cloningなんかのgenomic libraryの構築法を嫁。
でも、今ならTaqで埋め/削ってTA cloningかな。

>>600
やったことないけど下のどちらかで処理すれば平滑末端にはなる

・T4-DNAポリメラーゼ
5'突出はDNA合成で埋め、3'突出は分解する酵素

・S1ヌクレアーゼ
1本鎖部分のみを分解する酵素

TAクローニングと平滑末端同士のクローニングってどっちの方が効率いいんですか？
普通に考えたらTAクローニングの方が良さげですが中には平滑末端の方がいいと書いてある場合もありまして困ってます

>>603
スキルがあればどちらも変わらないよ。
心配ならどっちもやればいいじゃない。手間もかからないでしょう。

>>597
Ambionのホームページではオートクレーブすればほぼ安全と書いてるよ。
RNaseがオートクレーブしても死なないというのは迷信らしい。
ttp://www.ambion.co.jp/techlib/tb/tb_178.html

あるグラム陰性菌の染色体に遺伝子を組み込みたいのですが、組み込むＤＮＡ断片
の分解が心配です。これを防ぐためにはどうすればいいでしょうか。
ＰＣＲで増幅したリニア断片なら大丈夫だと聞いたことがあるのですが
その根拠はなんでしょうか。

>>588
先輩に継代の余りを分けて貰いました。
これでうまく行ったら起こしなおします。
直接指導してもらっている先輩が起こしなおさなくていいって強硬に言うもので。
助手に相談したら、助手についてる先輩の細胞を分けて貰ってやってみるように
アドバイスもらいました。

>605

オートクレーブではないが、漏れはいつも１００oC　２０分煮沸して
から使っているよ。DNase殺しの目的で。

何を？チップを？

植物の組織を１２１度、２０分オートクレーブすれば、植物中のRNaseは失活しますか？
ついでにRNAとDNAも分解されますか？

核酸はかなり加水分解されるだろうね。

>>605
オートクレーブ単発長期で失活してくれるのは、RNaseではなく、DNase。
これは、常識。

>602
THX.

超音波処理でガタガタになった末端について、もう少し教えてください。
核酸は、-(燐)-(糖)-(燐)-(糖)- でつながってますよね？
これを物理的に破壊すると、必ずしも3'末端が(糖)-OHとは限りませんよね？
だとすると、polymerase活性による埋めは生じないのではないでしょうか？
とすると、１本鎖ヌクレアーゼでやるのがベストでしょうか？
両端が3'突出だった場合、削られた結果、3'末端はOHになり、
相補鎖側の5'末端は(燐)とは限らないので、ベクターへの挿入は困難ですよね？

図で書きますね。
□：正常なヌクレオチド
■：壊れたヌクレオチド（PやOHが無い）　 とします。

切断面が３’突出の場合、
5-□□□□■
3-□■

S1 nuclease, T4 polymerase　ともに
5-□□-OH
3-□■

となりますよね？

切断面が５’突出の場合、
5-□■
3-□□□□■

S1 nucleaseだと
5-□■
3-□□-P　　　　　　と、平滑になりますが

T4 polymeaseだと
5-□■
3-□□□□■ 　　平滑末端化、無理？

連続処理でこういうのは可能でしょうか？

５’突出の場合、
5-□■
3-□□□□■
↓
S1 nuclease
5-□■
3-□□-P
↓
T4 polymease
5-□□-OH ←exoとpolによる置換
3-□□-P

あと、下の■も　なんとか□にしたいのですが、可能でしょうか？

5-□□-OH
3-□■

polishし切れないendが残るのは仕方がないんじゃない。８割方回収できれば良しってところでしょ。
ttp://jbpc.mbl.edu/GenomesCourse/media/200510051900-morrison.pdf

>618
そうか…　完璧は難しいかね。
BAL32ってたぶんBAL31の間違いだよね。
nuclease→T4 Pol.→PNKでやってみるか…

実験中
　
　　　ルパンなんて一般人の知識知らん。　


　　　　　　　　　　　スレ汚してごめん、ちょっと書かしてネ　　　　　

実験中
　
　　　ルパンなんて一般人の知識知らん。　


　　　　　　　　　　　スレ汚してごめん、ちょっと書かしてネ　　　　　

>>619
TA-cloningを使ったこんなのも。肝心のところはref参照だが。
ttp://www.promega.com/pnotes/73/8235_26/8235_26.pdf

>622
マンビンだと1本鎖部分にＧＣがあると切ってくれないから、平滑化は不完全かもしれないらしい。
Ｓ１だと全部消化してくれるらしいが、ニック部分で切断もするらしい。
だから、音波破壊でニックが入っていると、そこでちょん切れてしまうかもしれんので、怖い。
マンビンとＳ１、どっちがいいんだろうね？
関係ないが、上記の実験者4人が全員８：２分けの髪型は偶然？

blantではベクターとインサートの濃度あわせがずれてると
入りにくいorタンデムで入ってしまう

TAだとインサート多すぎてもタンデムになりにくい

質問です。
哺乳類用のプロモーター(CMV etc)を持つけど、
大腸菌用のプロモーター(T3 etc)を持たない、
プラスミドに組み込んだ遺伝子は、
大腸菌では、全く発現しないのでしょうか？

しない

いや、する。

ほとんどしない。

>>582
> CMVプロモータは、細胞周期に依存するのですか？
> ほ乳類培養細胞のstableクローンで、tagの抗体による染色像を、セミナーで見たのですが、均一ではなかったのです。
> 突然すみませんが、よろしくお願いします。

ハゲシク亀レスですが。。。
それは本当にCMVプロモータに起因する現象なのですか？
細胞周期に依存して分解されるタンパクだとそういう見え方になると思いますよ。
サイクリン関連とか。

>>627>>628
ヒント：RBS

>625
ほとんどしない。
プロモーター配列違うし、もし転写されてもRBSがなければ翻訳されない。
でも挿入配列によってはまったくサブクローニングできないことがあるから、
場合によっては目的ORFが発現するとは限らんがリークは起こってるんだろうな、と思う。

PCRがうまくできません。
というのは増えないわけではなく、増えないはずのネガコンも増えてしまうのです。
配列を調べてみても、くっつくところはないのに…なぜでしょうか？
非特異的ではなく、特異的に増えています。
温度は
94℃30s
55℃30s
72℃1m
でやっています。
原因として何が考えられるでしょうか？
どなたか知恵をお貸しください、よろしくお願いします。

試薬のコンタミ

テンプレート無しでもバンドがでた？

５５度温度低すぎ。
ちゃんとプライマーを組んで６２度くらいでやれ。

>>632
とりあえずﾃﾝﾌﾟﾚｰﾄ以外の試薬（水も含めて）を
全部新しくしてみては？

そのまえに
ネガコンだけでやってみることをお勧めする
それも１本だけとかケチなこと言わずに
いつもの本数で（９６本ならさすがに４８本ぐらいにするけど）

試薬を新しくするのはそれからでも遅くない

試薬のコンタミで増えるぐらいというのはよっぽどのことで
それならラボ中でコンタミ騒ぎが続出してるはず

機械も疑ってみろ。

サイクルを減らす

PCRって、疑い出したらキリがないよね…

一番最初に疑うのは、同じラボにいる奴らだよ。
君が家に帰っている間に、君の試薬に○○とか○○してるかもね。

滅菌した純水を使う

滅菌したチップを使う

プライマーの設計を見直す
・・・非特異的産物とは、テンプレートに依存しない産物のことだから、
　　 何回繰り返しても同じ位置にダイマーが出ることはある

クリーンベンチの中で、氷上で十分に冷やしながら調整を行う

サイクル数を減らす
・・・通常のTaqで３５サイクル以上やってはいけない

アニーリング温度を上げる（可能なら）

日本語が変なので修正

プライマーの設計を見直す
・・・非特異的産物とは、テンプレート中のターゲット遺伝子以外の産物のことだから、
　　 何回繰り返しても同じ位置にプライマーダイマーなどが出ることはある

>>633
テンプなしではバンドは出ません。

>>634
先輩から５５℃と教わったのですが…。

>>635
試薬は毎回違うものなので問題ないかと。
（違う試薬で同じ結果）

>>636
ネガコンは３本ですが、少ないでしょうか？
48はさすがに多いです…。

>>637
研究室のものなので厳しいですがやってみます。
しかし他のサンプルでは出来たので機械の可能性は低いです。

>>638
35サイクルは多いでしょうか？

>>643
６０℃いじょうにすれば大抵うまくいきます

>>643
>先輩から５５℃と教わったのですが…。
教わったから、という姿勢がまずおかしい。プライマーのTm値は？
644のアドバイスも変だろ。大抵って何だよ。機械も対象も違うだろうに。

「ネガコン」って何使ってるの？
本当にくっつくところは無いのか？実はそこを勘違いしてただけではないのか？

アニーリング温度はフォーワードが３９度で、リバースが５２度です。
フォーワードのディジェネラシーは８１９２で、リバースが４０９６です。
長さはフォーワードが１０２ｂｐでイノシンが８個入ってます。リバースは４１ｂｐでイノシンが３個入ってます。

>>647
めちゃくちゃだな。
とりあえず、アニーリング温度とTm違うのだけど、Tm-5度を普通アニーリング温度にしているが、


いや、そんなことどうでも良くて、Tm値が違いすぎる。それをそろえてもう一度トライ。
つまり、もう一度プライマー設計からだね。


アニーリング度が39度って？てか、もっと根本的な問題かも。

644 >645
いや機種の違いを超えてprimerをTm 60℃以上に設計しなおせば
かなりrobustにうまく行きますよ

step downにしたら？

だいたいのことは小手先で解決しようとせず最初（プライマーの設計）からやり直す方が良かんべ。

>>643
ごめん、テンプなしとネガコンって違うの？
もしかしてRT-PCR？

いや、疑っている人が近くにいると実験がうまくいかないんだよ

基本的なことになるとレスが増えますねｗ
>>632の人気に嫉妬ｗｗｗ

刺激がうまく入らない後輩に
「細胞は絶対大丈夫だから」
と言い張り続けて、結局起こし直すまで後輩に無駄に実験続けさせたダメ院生が来ましたよ

>>655
なんて困った先輩なんだｗ

新しく研究室に入ってきた後輩の女の子を
「ちゃんと指導しますから！」
と言って、手篭めてからは暗室でエッチしまくってた現国立大助手の俺が来ましたよ。

アホ院生のたまり場はここですか？

キモ童貞が実験してんじゃねーよ！　ｶｴﾚ!!

G1期で同調させるであろう薬剤でHeLa細胞を同調させようとしています。
薬剤を24時間、48時間作用させフローサイトメトリーでDNA定量した結果、
G1期は減り、S期は増え、G2/M期は減りました。
ヒストグラムを見ると、G1期の部分からS期の終わりにかけて
緩やかなカーブを描いているのが印象的でした。

完全にG1期で同調させるにはどうすればよいのでしょうか。
いま検討していることは２回同調させる、薬剤濃度を上げることですが、
他にヒントなどございましたら、ご教授いただきたく、書き込みました。
どうぞよろしくお願いします。

因みに解析ソフトはModFitです。

そもそも「G1期で同調させるであろう薬剤」って何？
いやむしろ「させるであろう」って表現は何？

>>661
ありがとうございます。
ある薬剤数種をスクリーニングしている過程で
見つかった薬剤なのです。patent絡みなので
薬剤名等は伏せさせてください。申し訳ありません。
「G1期で同調させるであろう」の理由にRbのリン酸化
レベルが低下したことが挙げられます。

Tm値の調べ方がよく分かりません。
何だか何種類もあるみたいで。
何かの計算式に入れたら３９℃になりました。有り得ない。

ネガコンについてはコロニーからPCRすると出なくなりました。
プラスミドの溶液0.5μlを鋳型にするとバンドが出るのですが。
ちなみに大きさは狙った大きさと同じです。

なぜゆえ？

Tm値の計算方法の参考にしたまい
http://www.genosys.jp/whatsnew/tm/tm_syosail.html

Tm値は塩濃度やBufferのその他条件によって色々変わるぞ！

>663
そのバンドをシークエンスしたら？　ベクターの一部だったりして。
extension timeを大きさに揃えてたら、同じ大きさのノンスペバンドは出やすいわな。

特定のＤＮＡ配列にくっつく蛋白ってどうやって同定するのですか？
例えばＣＨＩＰだったら特定の蛋白から特定のＤＮＡ配列しかわかりませんよね？

そういう考え方自体がズレていることに早く気づきな

>>667
お前優しいな

最近の大学の教育レベルってこんなもんなん？

だって大学院拡充世代がポスドクやってんだろwww
バカの連鎖は止まらない。

にしたって、>>666は実験・研究以前の話だろ。

>>666は転写因子のこと言ってるんじゃ？

>>666
そのDNA配列を担体にアフィニティークロマトってのが一般的

One-hybridは‥‥
ダメですかそうですか。

Y1Hはめんどくさい

結局、>>667-671が意味不明な件について

>>676
お前一人で小一時間考えてみてくれ

うちの嫁は潔癖症。かなり重症。
よく言われるような電車のつり革も持てないタイプ。
実家での鍋は絶対にキャンセル（別に俺の親と仲が悪いわけじゃない、自分の親でも
同じ鍋は嫌だそうだ）

で、キスするまで付き合って3年かかった。
ｷｽからｾｯｸﾙまではそう時間はかからなかったが、やっぱり潔癖、いわゆるﾏｸﾞﾛ。
色々と不便なことも多いが、俺が嫉妬心が強いので潔癖な嫁は助かる。
浮気のハードルがかなり高いからな。安心感あるし。知らん奴としゃべるのも苦手だから。
で、そんなことはいーんだが、結婚5年たってもﾌｪﾗしてくれないので、この前、溜まりかねて延々と説得した。

「キスできるのにチンコをくわえられないのはおかしいだろ？　チンコそのものが嫌なら仕方がないと諦めも付
くが、オマエはﾁﾝｺは嫌いじゃないじゃん？　ｼｮﾝﾍﾞﾝするところだから咥えられないと言うが、たった今、風呂に
入ったばかりのこの清潔ﾁﾝｺの何処にｼｮﾝﾍﾞﾝが付いてんだ？　ｷｽが出切るなら咥えられるはずだ。口なんて
痰が絡んでたりする喉の玄関だぞ？鼻水とも繋がってんだぞ？　ｵﾏｴは痰や鼻水の少しは口に入れてるはず
なのに、何故洗ったばかりのﾁﾝｺが嫌なんだ！こっちの方がずっと清潔だろうが！」・・と。

後日、嫁はキスもさせてくれなくなった。

RT-PCR等のためにUVでRNAの定量をしているのですが、
同じサンプルでも、別の日に定量すると大きく異なる値
を示すことが続いていて、悩んでいます。異なるサンプル
間の大小の傾向は、いちおう、一致しています。

同じラボの先輩に聞いても、「よくあること」といって
流されてしまいますが、私はとても気になります。
他のラボではどうなのでしょうか？よくあるのでしょうか？

>679
先輩はムルアカ？

ということは>>679のラボはアフリカにある、と。

>>679
実際のODはどれくらいになる？
あと、RNAが立体構造を取っている可能性は？
熱処理>急冷で改善するかもよ。

>>679
RNAは水に溶けにくいから溶け残りがあるのではないかと
冷蔵庫から出した後に60℃、10分ぐらい熱をかけてみたら？
あと、単純にどんどん分解されているって可能性もある
RNAは-80℃でも3〜4ヶ月で半分ぐらい分解する

>>679
よくあること、ならUV計が不安定なのかも。０点はいつも正確ですか。

RNAを薄めるときに水使ってない？
TEとか使わないとpHによって核酸のOD値が変わるので要注意。
(280/260の比が変わる）

そもそも、ＲＴ−ＰＣＲでそんなにガチガチに量を揃える必要性があるのか？
だいたいでいけよ。　結果とそれに対する自信がすべて。　自分がＯＫなら投稿ＯＫ！

そゆことやってると、「自己の研究成果を主観的に見過ぎ、やや過大な自己評価をしている傾向が見られる」って言われちゃうゾ！

適当に細胞数や組織重量を合わせておいてとりあえず
cDNAを作ってしまって、あとはリアルタイムPCRでつ。
いちいちOD計っている暇があったらさっさとcDNAにしてしまうのが大事でつ。

差が出てから、細かく考えたらいいんだよ。

>>687
こんなところで飯台山羊さんが活躍しているとは驚きました。
>>689
差が出たからといって「主観的に見過ぎ」ないように気をつけて下さい。

最近、プラスミド内部のインサート前後をシーケンスして、インサートを
確認する作業をはじめました。

いままで、２回のシーケンスをして、５サンプルの処理経験をしたの
ですが、そのうち２サンプルはまったく読めまず、１サンプルは、
確認対象の部分は読めたのですが、S/N比が非常に小さくなりました。
また、残りのサンプルも、同じ日に泳動した人と比べて、やや読み取り
可能な部分が短い（２割ぐらい）ような気がします。

他の人と同じようにやっているつもりなのですが、原因がよく分かり
ません。経験が浅いとこんなものなのでしょうか？

>691
インサートの有無はどうやって確認したの？
テンプレートはどうやって精製したの？
ちゃんとマニュアルどおりにシークエンス反応した？

この板で毎度同じ質問が出ているので、組み換えDNAのテクニックで基本なので覚えてください。

シークエンスはテンプレートのDNA量が一番大事。
ライゲーションはコンピタントセルの導入効率が一番大事。

>693
コンピタントってｗｗｗ　あんた、６０年代生まれだろ？

>ライゲーションはコンピタントセルの導入効率が一番大事。

これ、全く同意できん。

>>695
同じく全く同意できん。

形質転換の効率よりも、
どうしたら当たりのプラスミドの割合を増やせるか考えた方が遥かに良い。

691です。
>>692
インサートの有無は、増やした大腸菌を該当するプライマーを使い、
ダイレクトPCRし、さらに、プラスミドをmini-prepし、制限酵素反応
し、確認しました。

テンプレートは上記方法でインサートが確認された大腸菌株について、
スケールアップ培養をして、キアゲンフィルター＆チップで精製しました。

シーケンス用のプロトコルは、同じ研究室の人が使用しているプロトコル
を用いています。シーケンス用のPCRの組成は、下のとおりです。

bigdye 4μl
5xbuffer 4μl
primer 1μl(3.2pm)
template(今回はplasmid 5.7kbpでした) 0.5μl(今回は2〜3μg/μlでした)
滅菌MilliQ水 10.5μl
これらを混合し、94℃ホットスタートでPCRしました。
PCR産物精製時には、酢酸Naを使ったエタ沈を行っています。エタ沈
のときは、EDTAを用いていません。途中の遠心時間は、ABI推奨の
プロトコルの1/2に短縮しています。

>>697
明らかにテンプレートが濃いよ。１μｇ以下500ng以上じゃないと絶対駄目。
大体そこだけだよ。

まあ２chで聞くもんじゃないよ。ｗ694-696の無駄なレスを見たらわかるだろ。ｗｗｗ

すごいでかいスケールで反応しているんだな。
１サンプルにbigdye 4μlって贅沢だね。
まあ、それはいいとして、キアゲン精製後のプラスミドの確認はしてないの？
あと、反応後のエタチンで塩が残っていると波形がかなり乱れるよ。

それと、シグナルが弱いとか、長く読めないといった場合は、
シークエンサー自体のキャピラリーやポリマーがヘタっている可能性がある。
もししていないのであれば、一度ポリマー、バッファー、キャピラリーを交換することをお勧めする。

>>698
個人的には、明らかにって言うほど多いとも思わないのだが・・・。
（20μℓの系でやったことないから判らないけど。）

テンプレートが多すぎると、反応が長く伸びずに短いDNAが沢山できる傾向にある気がする。
読み取り可能な部分が短いのなら、テンプレートを>>698の言うように、
減らしてみるのも良いかも知れない。
テンプレートDNAの濃度だって、正確に測れている保証はないわけだろ？

691です。
>>698
>>700
テンプレートの濃度は、濃度が一定以上あればいいと思っていたの
ですが、よくないのですね。次は濃度を減らして、がんばってみます。

>>699
キアゲン精製後のプラスミドは、ゲルで電気泳動して確認したことが
あります。よく、プラスミドのバンドの上方にスメアが見られますが、
制限酵素処理をするとスメアがなくなるので、プラスミドのダイマー等
なのだと思います。

シーケンサー自体は、他の人が長く読めているので、多分大丈夫だと
思います。

bigdye 4μlの系は大きすぎるのでしょうか？別の研究室の人からも、
贅沢だといわれました。

エタ珍が悪いな。明らかに。
塩が残りすぎているに100万点。
1サンプルで良いから、いつもうまく行ってる人に頼んでエタ珍やってもらったら？
そのサンプルだけうまく行けば確定

＞bigdye 4μlの系は大きすぎるのでしょうか？別の研究室の人からも、
＞贅沢だといわれました。

贅沢かどうかは、君のボスや先輩に聞いてみたら？
潤沢な資金があるのなら、別に構わないと思うけど？

うちは、週に数百サンプルとかシーケンスするから、
コストは最低限に抑えるようにしている（コストを抑えることに命賭けている時期があった）。
君の4分の１以下でやっているよ。
プラスミドが必要なのではなくシークエンスのデータが欲しいだけだから、
もちろんキアゲンなんていう贅沢ブランド品も使わないし、
そもそもミニプレなんかもしない。

>>702
一番確実なのは、G50とかのカラムを通すのがいい。
シークエンスの反応液を少し水で薄めて、カラムを通して未反応DNAを除去。
熱処理とか専用のバッファに溶かさなくても、なぜかそのままきれいに読めるぞ！

>>697
>読み取り可能な部分が短い（２割ぐらい）
について詳しく。
波形はどうなってる？最初の部分だけ無茶苦茶濃いシグナルが出ているなら
698さんの言うようにテンプレート濃すぎで蛍光ターミネータが不足してるに１００万点。

あとは>>434-443 でも読んで。

>>705
確かに、最初の30〜70塩基の部分に、大きくて読み取り不可能な波が数個
来ています。研究室の人にこの理由を聞いたところ、「プライマーのせいで
最初の方はガタガタして読めない、いつもこうなるのだ」と教わりましたが、
テンプレートが濃すぎるためなんですね。

>>706
いつもそうです。最初から読めるなんてあり得ません

>>697
なんか間違ってるけど。5xbufferって普通のTaqとか制限酵素の
バッファと違って、薄め液のことだから、そんなに入れたらだめだよ。
BigDyeは2.5xのbufferがそのまま入ってるから、BigDyeをケチるときに
かわりに使うもの。いちど他の人のプロトコールみせてもらいなさい。

初歩的な質問だと急に盛り上がるこのスレ

難しいor専門的すぎると分かる人が少なくなるからな
当然といえば当然だろう

>>708の言うとおり、20ulのスケールにBigDyeを4ul入れたら、5xbufferいらないんじゃ？

初歩的な質問ですみません。免疫沈降をするときって、全体のvolumeが小さい方が効率いいものなのでしょうか？
素人的には、A+B=ABの反応で、[AB]=K[A][B]となるため、最終産物の量は、volumeに反比例すると思うのですが。どなたかご教授ください。

>>707
もちろん最初から読めるのはありえないけど、
シークエンサー（ABIのね）の解析装置は、きちんと波の出来ているところを認識して、
そこからデータ解析をするようになっているから、
プライマーの末端からすぐのところは、シグナルはあっても波形は切り取られていると思うけど？
あと、本当にきれいに反応が出来ていれば、プライマー末端から15〜20bpぐらいからなら余裕で読める。
だから、30〜70bpあたりにでかいスパイクシグナルが入るのは別の理由。
反応がきちんと長く伸びているのであれば、バッファーやポリマーを新しく変えると
ゴミシグナルがとれて改善する事があるよ。

貧乏ならしかたないが、同じ機能の機械をラボで複数運用しておく必要を身にしみたorz

見た目正常な機械が故障してたのに、そのまま使って実験の失敗を腕や試薬ロットやサンプルのせいにして長い事悩んでいた。

>>701
>次は濃度を減らして、がんばってみます。

ちゃんと吸光度はかりましょうね。

>>701　そうじゃなくって、5xbuffer入れ過ぎだって。
ttp://gene.yamaguchi-u.ac.jp/kenkyuusien/seq.html

マウス胚のWISHのために、取り出した10.5日胚を4パラに浸けたまま
忘れちゃったんだけど、メタノールに移さないまま１ヶ月くらいたって
しまっても問題なかったっけ？
WISHの場合、過固定されると何かまずい？

精度が落ちるんじゃなかったっけ？

>>717
もちろん４℃で保存されてたんだよね？
大丈夫かどうかの保証はしないけど、きっとひどい事にはならないと思うから、
とりあえずやってみ？　何かしらの傾向は見れるよ。
２週間なら俺もおきっぱにした事があるけど、大丈夫だった。
O/Nの固定と特に変わらなかったよ。

発色感度は悪くなるけど、発色時間を長くすればほとんど同じ結果になるよ。

しかし25年勤め上げた俺をﾘｽﾄﾗかよ。

冗談じゃねえよ。挙句の果てにｼｮﾎﾞｲ住宅財形、元本保証もねえのに利息は相殺ってどういうことだよ？　独身中年を舐めてんじゃねえよ。
最後だからって前から気になってた新人OLﾈﾁﾈﾁ虐めて泣かしてやったぜ。
ついでにそれとなくｵｯﾊﾟｲも触ったしな。せいせいしたよ。
陰で俺のこと「ｷﾓｲ油ﾅﾏｺ」とかわけわかんねえあだ名つけてたの知ってんだよ。畜生。
なんだよ？「略してｷﾓｺｗ」ってよ。お前らの私用ﾒｰﾙ全部見てんだよ俺はよ。

若い奴同士でｾｯｸｽをｴﾝｼﾞｮｲとかしやがってよ。
昨日もやったのかよ。一昨日もやったのかよ。糞どもが。
で、失業保険。なんだよ？14万ってよ。舐めてんのかよ役立たずどもがよ。
明日からどうしたらいいんだよ？

財形崩して300万。風俗で借金300万。変なﾄｺで帳尻合わせてんじゃねえよ。
まあ借金ないだけましだけどな。田舎の高校卒業して25年。40過ぎてﾌﾟﾗﾏｲｾﾞﾛ。
なんだったんだよ？俺の人生はよ。
痴漢もしたよ。下着もﾊﾟｸった。ｲﾀ電が度を越して警察呼ばれたこともあったさ。
でも俺は基本線、善良な労働者だったんだよ。

これが日本かよ？日出ずる国のﾌﾟﾛﾚﾀﾘｱｰﾄの末路がこれかよ？
俺は悪くねえ。悪いのはお前らだ。

>721
ｷﾓｺ、乙。

>>718-720
サンクス　
4℃に置いたままです。
取りあえずやってみる気になりました。

免疫系研究者です。先月からラボを移ってきました。
今回ウェスタンブロットであるタンパクのリン酸化を調べようと思っています。
しかし今のラボはウェスタンをやっておらず、適切なcell lysis bufferがありません。
簡単にできるバッファの組成を教えてもらえませんか。

またタンパク調整、SDS-PAGE、ウェスタンブロットのピットフォール等が
かかれたページなどもご紹介いただけると幸いです。

自分で「研究者」と名乗るくらいなら
羊土社の「できる〜〜」シリーズでもお調べになったほうがお早いかと存じますが

>>725
研究生の間違いだろw

GFPが発現しすぎてピッカピカ♪

>>724
ヒント：モノの本に書いてある


俺、単なる三流学生だけど、流石に組成教えろとか言う質問はせんよ？
そういう質問するのは、研究者とは言わんでしょ。

>>725は優しいなｗ
出版社までご案内とはｗｗｗｗｗｗｗｗ

て言うか、ここに組成を書いてやったとして、それを信じて使うのか、>>724は？

lycate bufferの組成なんて細胞種や目的物質によって全く違うことすら分かってなさそうだ。

キミら>>724いじりすぎｗ
とりあえずNP40かTween使わせておけばいいじゃん。
てことで自称研究者ちゃんの相手は終了ｗ

　　　　　　r　‐､
　　　　　　| ○ | 　　　　　　　　r‐‐､
　　　　　_,;ﾄ - ｲ、　　　　　　∧l☆│∧ 　良い子の諸君！
　　　 （⌒`　　　 ⌒ヽ　　　/,､,,ﾄ.-ｲ/,､ l 　女性から見た男性のパターンは
　　　　|ヽ　 ~~⌒γ⌒）　　r'⌒　｀!´ `⌒） 　・顔が良くて中身も良い
　　　│　ヽー―'^ー-'　（ ⌒γ⌒~~　/　| 　・顔は良いが中身が悪い
　　　│　　〉　　　 |│　　|｀ー^ｰ― r'　| 　・顔が悪い
　　　│　/───|　|　　|/　| 　l　　ﾄ､ |
　　　|　 irｰ-､ ｰ　,}　|　　　 / 　　　　i 　　この３パターンしかないぞ！　諦めろ！
　　　| /　　　｀X´　ヽ 　　 / 　 入　　|

>>733
ペンタ！

５分おきくらいに立て続けに母からのメールが来た

一通目
題名：なし
本文：お元気ですか？お母さんの電話番号がかわったので教えます。

二通目
題名：なし
本文：さっきのメールはお母さんからです

三通目
題名：なし
本文：お母さんというのはあなたのお母さんのことです

>>735
それ・・・実は養ｓ（ｒｙ


目的
　君と君のお母さんとのDNAを比較してみる

問題です。この目的を果たすには、どのような実験手法を取ればいいでしょうか。
必要な時間と、簡単な手順、それとかかるだろうと思われる費用も述べよ。

手法
　　母親と自分のmtDNAのﾌﾟﾛﾀｲﾌﾟを比較

それぞれの体細胞をサンプルとして取り、細胞培養する。
次にフェノクロ・エタ沈・PCR。
適当な酵素を使って切ったら電気泳動でバンドを比べる。

進化生態系で、分子に携わってない僕がパッと思いつくのはこんな感じでしょうか。
時間と費用はわからないわけですが。

テクノビット樹脂切片を伸展するときに，うまく延ばす方法あります？
丸まったりして嫌

>>737
75点

ｋｔｋｒ
ﾊﾌﾟﾛﾀｲﾌﾟに着目ってとこは悪くないわけですな
解答例は概ねどんな感じになるんですか？

近親交配でのF1比率でも見てみるか？ｗｗｗ

最近ココリコの遠藤に似たカレシができた。
でも体はもっとひきしまった感じで背は175cmくらい。
きっかけは街でみかけてすっごくキュートだったからおもわず声をかけたの。
すると思いがけず会話がはずんで携帯の番号交換しちゃった。
何度か電話で話してなんか、すっごく合ってるなって思ってた。

５回目のデートでキスして７回目のデートで胸をさわられた。
「だ、だめ」
もちろん初めてじゃないんだけど、車の中だったしそれにちっちゃい声で「でか、、、」て聞こえたからすごく恥ずかしくなった。
腕で隠そうとするとよけい強調されてたみたいで「うわっ」とか聞こえる。
だから本気で恥ずかしくなっちゃって俺

ワッフルワッフル

>>742
アッー！

細胞に紫外線をあててDNA障害を加える実験をしようとしています。
論文には1J/cm2加える、と書いてあるのですがどうやって計算したらよいのか
わかりません。
紫外線照射装置と細胞の距離とか時間をどうやって計算したらよいのでしょうか

>>745

ストラタジーンのUVクロスリンカーだと扉の横にエネルギー密度がデジタル表示で見える
平面光源の場合、面のエネルギー密度は距離によらないで一定。

>>746
YV光源はフナコシの
http://www.funakoshi.co.jp/catalog/instrument/device/1d/4/38951617.php
なんですけど、これも平面光源なんですか？
クロスリンカー欲しいけど高くて買えない・・

最近、異動でラボを変わりました。
前のラボでは、チューブに入ったプラスミドやプライマーを手で暖めて溶かしていたのですが、
今のラボでは、それらをOn Iceで溶かさなくてはいけないと言われました。
体温で暖めて溶かしてはいけなかったのでしょうか？

プラスミドやプライマーがキレイなものなら問題ありません。

手で暖めて溶けきる直前に氷上に戻すなぁ

濃いDNAって氷中で数時間かかっても溶けないことない？

>>748
ヒートブロックで50℃とかでも問題なし
ストックじゃなくて分注したやつなら気にしなくてもいいだろ

あつものに懲りる前から
なますを吹く

on ice で溶かすなという理屈を聞かせて欲しい。

これまでのところ、「on ice で溶かすな」と主張してる奴は誰一人いないのだが、いったい誰に尋ねてるんだ？

まあでも、そのラボで「そうしろ」って言うのならば悪い事
は言わんからおとなしく従った方がいいかと
ラボ変わったばかりで変に目をつけられたら嫌だろ？
で、どうしても早く溶かしたい時だけコソッと手で温めると

あのなあ、前から言おうと思ってたんだけどよ、
よくいるだろ、アートかぶれのバカ女ってのがよ！
何だか知らねェけどよ、美大出だかデザイン専門学校出だかの気取ったブスがよ！
服装もパリだか何だかを意識したようなヘンな格好しやがってよ、タコが！
好きな映画は「ベティ・ブルー」「SEXと嘘とビデオテープ」 だと！？
ざけんなよ、ムードで物を言うなってんだ！
ちゃんと理解して気に入って言ってんのならいいが、
どうせカッコつけて言ってんだろ？　このオカメ面がよ！
大体テメェ、東洋人丸出しの外見で、ナ〜ニがヨーロッパだよ！？
エエッ！？　ヨーロッパってツラかよ、オイ！
どのツラ下げてヨーロッパだってんだ？　ブスがよ！
テメェ、家で1人にときは「笑っていいとも！」見ながら屁こいてるくせによ！　知ってるんだぞ、コラ！
何だよ、その妙なニット帽は！　雪降ってねェぞ！！
何ィ！？吉野家や松屋ではメシ喰った事ないだと！？
女性雑誌に載ってるようなシャレたナウい店で喰うだとォ！？
ざけんな！　お前のジャパニーズ胃袋はな！　そんなお上品な代物は受け付けねェって言ってるぞ！
お前の胃袋に合うのは牛丼とカレーだっての！　喰え、タコ！
いいか！？　どうお前がライフスタイルをパリっぽく見せようと無い知恵絞って取り繕ってもな、
お前のDNAにはニッポンの風土、特色がキッチリと刻まれてるんだよ！
お前がいくら白人のマネごとをしようと、お前のニッポンDNAは永久に続くんだよ！
何代あとになってもな！
お前には凱旋門より雷門、セーヌ川より多摩川、
エッフェル塔より通天閣、シャンゼリゼ通りよりアメ横がピッタリ来るんだよ。
よ〜く憶えよけ！　ブサイクが！
おい、それからな、鼻毛出てるぞ！　切っとけよ、パリジェンヌ！

ワッフルワッフル

前の彼女は胸の谷間にチューブ挟んで溶かしてたぞ。
両手が空くから便利だそうだ。
ちなみにFカップ

>759
妄想乙。　エロゲは共通ＰＣに入れるなよ。

クロムゼラチンコートのスライドガラスって加熱したら融けてサヨナラしますか？

>>761
まあ、ゼラチンだし。

制限酵素サイト付きのプライマーを設計していると眠くなります。
一発で設計が完了する無料ソフトはありませんか？

>763
女テクにやらせろや。

>>760
妄想として処理したい気持ちだけは分かってやるよ。
おまいはチンコと袋の間にでもチューブ挟んで溶かしてろ

Tama菌がコンタミするぞw

>>763
そんなん自分で組めば良いやん。

　膳配列を与える→特異配列検索→候補挙げ→候補選択
→候補配列前後30bp読み込み→相補鎖提示→長さ・使用温度決定
→プライマー配列提示→前後加工→データ化→注文

これくらい出来んで、研究者を語るなよ？
ここまで自作出来て、やっと一人前。

>691さん
その後、うまくいきましたでしょうか？
私もある日突然シークエンスがうまくいかなくなり、無限地獄です。
初心に戻り〈？）Ｑ社のminiprep kit を用いてさらにBigDye推奨のスピンカラム
まで使ったのに全くピークが出ません。
plasmidは260/280が1.9だし泳動でも綺麗だったので問題ないと思うのですが・・・

>698さん
１μｇ以下500ngだとうまくいくのでしょうか？
BigDye v3.1 のプロトコルだと100-300ng推奨とあって、それを信じてやっています。
みなさまアドバイスお願い致します

>>768

サーマルサイクラーを疑え、ピエゾ素子は前ぶれなく死ぬことがある。

スマソ、ペリチェ素子だ。

エプソンとキヤノンの闘いがここで見られるとはｗ

>>768

１μｇ以下500ngなんて、普通のプラスミド相手では濃すぎ。
BAC読む時の濃さだよ・・。
100-300ngくらいだときれいに読めるけど、もっと少なくても大丈夫。
templateもそこまできれいじゃないくても問題なし。
こちらは粗精製のものも問題なく読めてる。
だから、別のところに問題があるんじゃないか？

>772
ありがとうございます
そうなんですよね、実は今､付属のコントロールを試してみたのですが
完璧に綺麗に読めてしまいました。
ということはやっぱりなにかサンプルか・・・
そういうわけで、ペリチェ素子は問題なさそうです。　>770
普通にT7 primerでアニール50度で増えないってあるんだろうか？？？
実験室には魔物が住んでる？

増えないとき
1.試薬を疑う-プライマーが死んでるとか
2.配列を考える-GCリッチによるワナが発生してないか
3.機器を疑う-壊れてないか
4.自分を疑う-最悪他人に頼む

業者に頼めよ、カス学生。
おめーらがそうやって酵素を消費するからジリ貧になるんだよ、クソがよぉ。

>>773
あなたがどういうレベルの人かは知らないが、
もし卒研生がそういう事で悩んでたら俺はそのPlasmidに
本当にT7primer付いてるか確かめさせる
ていうかM13とかT3とか他のprimerがあれば試してみては

>>775
ものすごい矛盾

GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C T7 22-mer Stratagene
TA ATA CGA CTC ACT ATA GGG T7 Promega

5' TGA GCG CGC GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CGA 3' pBluescriptII SK
5' TTA TCG AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA 3' pCDNA3

StratageneのでpCDNA3 が読めるわけない一例。

正直、5'末端なら一塩基ぐらい違ってても全く問題ないかと

ここまで書いて良いのかわからないのですが、
primer, plasmid ともpr社製のものでして・・・
クローニング〜シークエンスまでの初心者用楽々セットです。
pGEM-T 簡単（の英語）です。
なので確実に配列はあるかと。
T7 SP6でインサートチェックもできましたし。
インサートがGCリッチかもしれませんが、最初のシグナルすら無いんですよ。
あぁ、他の人に頼むってのが最適・最速な手段かもですね・・・
金曜日の夜に皆様ありがとうございました

SP6でも読めないの？

http://image.blog.livedoor.jp/warata2ki/imgs/9/9/99995795.gif

すみません、これですか？

763さんではありませんが、
今、制限酵素サイト付きのプライマーを設計しています。
あらかじめ目標として定めたplasmid内の領域をnested PCRで
抽出しようとしています。

制限酵素サイト付きのプライマーを設計するのは初めてだったので、
ラボの先輩にいろいろ聞きながら設計しています。
その先輩に、プライマーを
5' 余分な数bp + 制限酵素サイト + 特異的配列 3'
これらを合計して20〜23merになるように設計するようにと言われました。
しかし、一部書籍には、特異的配列の長さを十分とり、合計して30mer前後
にするというような内容が書いてありました。

どちらが正しいのでしょうか？皆さんはどうされていますか？
よろしくおねがいします。

合計30merは欲しいな。
5'-糊しろ3mer＋制限酵素サイト6mer＋標的特異的配列21mer-3'でもう30merだ。

標的配列をにらんで制限酵素認識配列と糊しろの配列もうまく一致するよう並べると
1-2bp違いで重なるかもしらんからそうすれば23merに納めることもできる。

>>782
その先輩はPCRが上手くいかないと相談に行くと即座に
「プライマー変えればいいんじゃない？」
とアドバイスする困ったさんだと見た

782です。

>>783
やっぱ、30merぐらいは要りますよね。

>>784
ええ、そのとおりです。

>>782=785
考え方の順番がおかしい。
問題はTm値がいくつのプライマーを作れば良いかであり、長さはその結果に過ぎない。
GC rich な配列で 783さんの言うような工夫をすれば23merに納めることも出来るだろうし、
そういう手段が取れなくてAT richな配列だったら30merでも足りない。

Tmは大体５５℃にするといいよ。５８とか６０くらいにすると後で自分が困ることになるよ。

イモリの現行背深部を四つ移植して
頭が五つ…にならないんですが

Taq系じゃない酵素にはバッファーの塩濃度が薄いため計算よりも
実際のTm値が低くなるものもあるし、最悪DMSOを混ぜるとかって手も
あるからそこまで「Tm値は55℃まで」って拘らなくても良い

一番重要なのはFwとRvで±3℃以内ぐらいに揃えること

782です。

>>786
確かに、Tm値も大事だと思います。
ただ、特異的配列の長さが十分でないと、非特異的バンドが
増えてしまうのではないか？と心配をしているのです。
どうでしょうか？

↑
nested PCRって書いてあるだろ禿

>>787
困ることって何でしょう？
私はいつも高めに設定してるのですが。2stepでやれれば早く終わりますし。

782です。

>>791
すみません。勘違いしていました。「nested」は余計でした。
修行しなおします。

鋳型にプラスミドだけ入ってるなら非特異的増幅とか気にしなくても
いけるんじゃないかしら。

環状なら一カ所切ってからかけるとかくらいかな。

プラスミドの安定性を調べる目的である細菌に導入したんですが、薬剤プレートでは
２回ぐらい植え継いでもはっきりコロニーが現れるのに、液体培養では全く増えて
きません。薬剤マーカーはテトラサイクリンです。何事がおこっているのでしょうか。同じ
ような経験をした人はいますか？

>>795
なに使ったのか言ってくれんとなんも分からん。

遮光していなかったのでテトラサイクリンが分解されてしまったとみた。

>>797
問題ねーよ。嘘を垂れ流すな。

問題あるだろ。プレートが暴露された状態で何週間も経った古いものなら

薄くしてみたら

>>799
そんなヘマする馬鹿は居ない。

>>801
世の中信じられないほど色んなバカがいるみたいだよ。

形質転換したらアンピシリンＬＢ

常にこれだと信じてコンストラクトのできない子

ＷＢ初心者です。
ＷＢでマルチ転写ができるキットがあるけど、単独でやったときに変なスポットが出なければ
一次抗体を混ぜてやっちゃいけないでしょうか？
あるいは、一次抗体を処理して洗浄、別の一次抗体処理して二次抗体をかけるとか・・・

>>801
可能性のことをいってるわけで、読解力0ですか？

>804

分子量が違うなら混ぜてやっても分かるだろうが
最初は別々にやってアーティファクトを確認した方が良い。

>>803
PCR産物には必ずA末端が付く

そう信じてKODで必死にTAクローニングする子

>806
了解で〜す♪できたら定量的にやりたいです。

>795
やべぇ、俺も全く同じ症状。やはりTetつかってる。

protocolを見ていたら、
MicrotiterPlateに細胞を入れて、500xg で1min　遠心すると
かいてありました。　Microtiter plateの遠心機など周りも持っていないのですが、
これって、20分、静置していたのと同じようなものですかね。

CellularELISAをしていて、TiterPlateに細胞を入れて、遠心後に
上澄みを取るという操作なのですが。　あと、Titerplateの表面って
どういう処理をしていてタンパクや細胞を固定化しているんですか。
単に静電的に処理していると聞いたことがあるんだけど。

>>805
そんな可能性を考慮しなければならない奴が居るラボは、カスだ。

>>811
ラボが、じゃなくて学生が、っていってあげてよ。
何も考えない学生って最近多いから、配属されるに当たっても何も考えず、
何となくでくるやつが多い。

院生とかならありえないけどね。

>>795
同じ様な経験をしたし、解決もした。
誰も気がつかずコメントしていないようだが、800（この人はちょっと意地が悪い？）が正解だと思う。
ワシがその時何を考えたかというと、プレートと液体培地では、同じ分量の薬剤を加えた場合、実効濃度に差が出るはずだということ。プレートに薬剤を加える場合、液体培地よりも温度が高い時点で加えているはずなので、温度の影響で液体培地より分解されるはず。
795の菌株は、額面よりも低い値のプレートのTc濃度では増殖できても、額面通りの液体培地のTc濃度では増殖できなかった可能性が高い。液体培地のTc濃度を薄めるべし。

>>813
なるほど、言われてみればその通り
ただ、どちらかというとプレートの濃度を濃くする方向に行くべきでは

>>813
自分は分子に携わってないんですけど、Tc濃度が高いと生きられない菌だから薄めるべきだ、という解釈でいいですか？

いろいろアドバイス有難うございます。Tcはそんなに分解されやすいものでしょうか？
液体培養時は特に遮光せずそのまま振っています。ちなみに濃度は50μg/mlとやや
濃い目です。

>>813
ははは、意地悪ですかね。

ちなみにプラスミド構築でも当たりだけどうしても拾えないときとかも
薄めたり、薬剤無しのプレインキュベーションを数時間してみたりする。
この話を前の方でもしてるんだけどなかなかやらないね、みんな。

TcはMgで効かなくなるから、水道水とかでプレート作るとだめだとか
あるけど、そもそもプラスミドの安定性の実験なんだから、濃度くらい
いろいろ試すことにすぐに気がつかなきゃ。

あげ

>>817
じゃあ
今までＳＯＢにTet入れて振ってたのは...

どなたかダブルチミジンブロック法について詳しい論文や書籍をご存知ありませんか？

>819
しっかり殺してたんだよｗ

あのー、マイクロタイタープレートを1min　500g
くらいで遠心する必要があるんだけど、
別の方法ない？　しつこくてすいません

>822
ヒモ付けてブンブン回せよ。　ダイソーで材料揃えたらできるだろ？
無理なら専用ローター買え。自腹で。

実験したいけど道具そろえるお金ない…

どっかから研究費取ってくる？ｗ

実験初心者です。0.5M EDTA pH8.0 50mlを作るときのことですが…。
5Nの水酸化ナトリウムを入れすぎてpH8.1ぐらいになってしまったので、
11Nの塩酸を数滴入れてpHを8.0まで戻しました。

塩酸を入れてもよかったのでしょうか？実験でこのEDTA溶液を使うと、
何らかの影響が出るでしょうか？　参考書では、水酸化ナトリウムだけで
pHを調節しているみたいなので。

無問題

何の実験に使うかによって変わるに決まってるだろアホ
いくら実験初心者でも質問する時の常識ぐらいわきまえろ
というかそんなもん研究室の先輩に聞け

EDTAと水を加えて60ml作ればよかったのに

ややこしくしちゃヤダ

むしろ「中性付近での0.1の違いなど誤差の範囲」が正解では

↑
上の意見に3000ｴｯﾍﾟﾝ

　　　　　 ,r;;;;ﾐﾐﾐﾐﾐﾐヽ,,_
　　　　,i':rﾐﾐﾐﾐﾐﾐﾐﾐﾐﾐﾐﾐ`ﾐ;;,
　　　　彡　　　　　　　ﾐ ﾐ;;;i
　　　　彡　,,,,,、　,,,,､､　ﾐ;;;!
　　 　 ,ゞi"￣ ﾌ‐!￣~~|-ゞ,
　　 　ヾi `ー‐'､ ,ゝ--､' 〉;r'
　　　　`,|　 / "ii" ヽ　　|ﾉ
　　　　　't　←―→ ）/ｲ
　　　　 　 ヽ、　　_,／ λ、
　　　　_,,ノ|､　￣／/／/ ＼、
_,,..r''''" 　 |　＼`'／　 /　　　￣`''ー
　　　　　 |　 ／＼　 /
　　　　　 |／）::::/＼/
　　　　　 | ,r":::ヽ　/
　　　　　 |i´:::::::::| /

　　ポーション高杉【P.Takasugi】
　　　(2006〜　　　日本)

pHの0.1ぐらい
何かの検定に使うぐらいの
pHメーターでないと
正確に計れないよ

誤差のうち

＞＞８２３
お前、いやなやつだな。友達少なそう。

>>823
いや、どういう立場でそういう発言になるのかわかりませんが、
別ラボで借りれるので解決しました。
ダイソーは米国にないからいけないんですけどね。

すみません。ちょっとお尋ねします。ランダムプライムでプローブを作る時に、
直鎖状のＤＮＡ断片が必要になりますが、プラスミドから切り出して精製して
も、適当なプライマーを使ったＰＣＲ産物から始めても全く同じですよね？
ＰＣＲ産物をＤＩＧで標識しようとしたのですが、全くプローブが作れません
でした。どうしてなんでしょうか。何か注意すべきことってあるんですか？
よろしくお願いします。

昔、500bp以下の断片では効率的にラベリングされないと聞いたことがある

>>837
もちろん精製してから標識反応してるのよね

>>837
各段階ごとにサンプルを取り出して、検査実験してみそ。

質問です。
今日、大腸菌のグリセロールストックを作るときに、落下細菌のコンタミ防止の
ためのガスバーナー点火を行わずに作業しました。影響はあるでしょうか？
また、皆さんはどのくらい落下細菌に注意を払っていますか？

グリセロールストックみたいに、分注後に培養のステップを伴わない場合は、バーナーなど一切不要。
て言うか、バーナー焚いててもちっとも無菌操作になってない奴大杉。

拝火教って言うんだよ

あんまりええ加減にやってると
次に起こしてくるときに
いちいち
ストリークせなあかんようになるで

>>841
余程極悪な環境じゃなけりゃ、大丈夫だけど、オススメできない。

今後はしっかり火を拝み、火の元で行うこと。

基本的に問題ない。
気になるならストリークすればいいだけなので、たいした問題じゃないよ。

落下細菌が入るったって、最悪一匹とか二匹（匹って言わないか？）だろ。
そんなもんのために火を焚くなんて、宗教上の理由以外に考えられない。

そんなことより、ストックを起こすときは当然シングルコロニーアイソレーションは
必要でしょうが。気にするところ間違ってるよ。

最近のシークエンスセンターでは64倍希釈が標準とかってどっかのサイトに書いてあったけど、これって本当？
反応ボリューム5ulぐらいにしても64倍って厳しすぎないか？

シーケンサーも高感度になってるし

おれんとこは１６倍だな

ABIの9800はFAST サーマルサイクラーということですが、
ホントに早いのでしょうか？　使ったことある人教えてね。

近所のラボの人がセミドライ式３Vオーバーナイトでブロッティングしてました。
これの方がバンドがきれいに出るといっていましたが、英語で話しているので微妙なところがわかりません。
ウェット式でも電圧を下げてオーバーナイトで出来ますか？やったことある人います？
バイオ実験イラストレイテッドには、電圧ｘ時間のことが少し書かれていたのですが。

自分の経験は、昨日ウェット式で20V12時間でやったところバンドが全く出ませんでした。

>>852
分からない時は、先ず本を読む。
マニュアルがどこかにあるでしょ？最初はそれを熟読してから。

>852
ウェットのほうがオーバーナイトは本職じゃないの?
バイオラドの装置のマニュアルにはオーバーナイトのプロトコルもあった気がする。
(HPからマニュアルはダウンロードできるはず)
セミドライではいくら電圧低くても朝になったらメンブレン乾いてないか?

>>853
おっしゃるとおりです。
まず成書やマニュアルを熟読すべきでした。
手元に教科書を置いてやっていましたが、読んだつもりで理解が足りませんでした。
>>854
手元にバイオラドのマニュアルがあったのをすっかり忘れていました。
読んでみると30Vオーバーナイトが推奨されており、つまり私の条件もそんなに見当違いではなかったようです。
CBBで目的とする分子量付近のタンパクがゲルにたくさん残っていたので、
トランスファーの問題と踏んでいるのですが、もしかすると電極を間違えたのかもしれません。

ストリッピングして抗体の濃度を変えて撮像し、だめならもう一度流してみます。

>>855
結果報告です。
ブロッティング時につかうコードの不備を発見しました。
気づいてよかった。。。

エイプリルフール

ウェスタンのデータを捏造したいのですが、お勧めのペンを教えて下さい

>>857
残念、今日はまだ３月だ
少なくとも２ちゃんねるでは

(･∀･)つ Photoshop

>>851
漏れも使ったことないけど，たしか専用チューブがいるんじゃなかったっけ？
ABI純正消耗品は大して品質がいいわけでもないのに高すぎ。

すごい基本的な質問ですいません
マウスを使った動物実験をこの春から始めることになったのですが
今まで扱ったことが無いので上手く扱えません
とりあえず基本の尾静脈採血と腹腔内投与の練習をしているのですが
採血の時、血液の出が悪かったり　注射のときマウスが動いたりで上手くいきません
何か気を付ける事やコツなどがあったらご教授お願いします。

>>862
腹腔内投与はともかく、尾静脈採血の時はエーテル麻酔でもすれば？
まぁ、とにかくたくさん練習することだね。

>>862
コツはない。練習とセンス。
出来ない奴は、本当にどれだけ頑張っても出来ない。

>>863-864
ありがとうございます
センスは無いですがとりあえず練習がんばってみます

>>865
「自分にはセンスが無い」というのは
成功した者の何倍もの努力をしてそれでも報われなかった人だけが
口にすることを許される言葉である。

「とりあえず」「がんばってみる」なんて態度だと動物愛護団体に討たれるぞ。

>>866
すいません軽率でした
自分の実験一つ一つに生き物の生き死にが掛かっている
その事を肝に銘じて行きます

ありがとうございました

>>866
当事者じゃない俺も感動した
ﾏｼﾞで頑張ろう

>>867
もし動物実験が上手になりたかったら、実験の時だけ非道になりなさい。
マウスに上手く刺せないのは、少しでも可哀想とか思ってるから。
握りつぶすぐらいの感覚でモノの様にしっかりと掴み、躊躇い無くブッサリと刺してやる。
それが上手くなるコツ。

終わったあとは、ネズミさんごめんなさいと、心の中で思ってあげなされ。
その小さな命の上に、きっとその研究が報われることを誓うのです。
ネズミ一匹ですら、その命を無駄にしないためにも。

>>869
わかりました
むしろそうやって手早く終わらせる方が
マウスの苦痛も少ないでしょうしね

今日、初めて自分の実験用のマウスが届きます
皆さんのアドバイスを肝に銘じて実験に励みます
ありがとうございました

質問。
グルタミンの1M程度のストック溶液が作りたいんだけど、
溶けません。市販されている200mMが限界なの？

質問。
グルタミンの1M程度のストック溶液が作りたいんだけど、
溶けません。市販されている200mMが限界なの？

今までの感動的な流れをぶった切る糞レスｗ

８０ｂｐのＤＮＡを流してるのに、いっつも１００ｂｐのとこにバンドが出ます。
１２０ｖ、１２０ｍｉｎでやってます。
アガロース、無理矢理溶かして１０％のを作りました。
何がいけないのでしょうか。。
てか、ＰＡＧＥで核酸のゲル抽できますか？？

>>874
>８０ｂｐのＤＮＡを流してるのに、いっつも１００ｂｐのとこにバンドが出ます。
詳細が分からないのでなんともいえませんが、様々な理由でそういうことはあり得ます。

>ＰＡＧＥで核酸のゲル抽できますか？？
出来ます。

ま、がんばれば何とかなるレベルなのでもう少しがんばりましょう。

10%のアガロースゲルを作る方がすごい。

ようかん
よりも硬そう

タピオカ
わらび餅
水ようかん
ういろう
ナタデココ
ようかん　← 今ここ
鏡餅

＞アガロース、無理矢理溶かして１０％のを作りました。

お前大丈夫か？100bpを区別するならばlaw melting agar 3％で十分。

>>874 ８０ｂｐのＤＮＡを流してるのに、いっつも１００ｂｐのとこにバンドが出ます

制限酵素処理後ならフェノクロ抽出してエタチンしてから流してみましょう。
PCR産物なら脱塩・フェノクロ抽出・エタチンして精製してから泳動してみましょう。
泳動前にゲルのウェルを良く掃除しましょう。
オーバーロードは避けましょう。

denatureした直後？それとも酵素で切り出した直後？
denatureしてないなら絡まってるかもしれないから、5分程度denatureしてみれば？

>874
PAGEでゲル抽とか言ってるってことは、当初は10%アガロースからゲル抽しようとしたのか？
DNA cellならできそうだが、スピンカラムなどは到底使えない
というより本当に10%なんて作ったのか？もったいないｗ
120 Vで120 minも泳動してれば、室温泳動ならものすごい高温になりそうだし。

ようかんは洋館でよう噛んで食べましょう。

キャピラリーで泳動してバンドをフラクションコレクタで採取すれば良いのでは。

アガロースのウェルって、どうやって掃除するんだろう？
DNAでもdenatureして流すことあるの？

PlasmidとかならDenatureするとばんどが正確になるけどね。
80と100の違いは分からん。

うえるを掃除するならピペットとバッファーで洗う
コームを掃除するなら過酸化水素か？

>>886
嘘つくなよ！

EtBr後染めにしたらいいよ。
アプライしたＤＮＡ量が多いとＥｔｂｒの影響うけやすいからね。

切り出してライゲーションとかに使いたいならdenatureしちゃいかんだろ

かつてはバリバリ信号が強かったサザンですが、だんだん弱ってきて
とうとうまったくなくなってしまいました。
原因がわからないのですが、ありえるとすればプローブの劣化です。

プローブって、凍結融解繰り返してるとあっという間に劣化することってありますか？

アイソトープラベルならディケイに伴って平均鎖長が短くなるからでは？

しかし、本当に80と100の違いをえいどうだけで確認する事に意味があるんだろうか？
その気になれば制限酵素で切ったり、シーケンスしたり色々手があるから、
時間のロスを考えたら冗談だったんじゃないか？

null mouseって、Knockoutなのに遺伝子が発現したりするの？
設計によっては、翻訳でつまづく仕組みにしてあったりするのかな（5'から少しだけ転写とか）？

というのは、Knockoutなのにリアルタイムでおもいっきり発現が確認されたんですが？
それってあることなの？

お前さん、文献には載ってないのかぇ

どこが潰れてて、
どこを検出しようとしてるのか
描いてみたら？

>>890
今期四回生の子かな？
まず、君の言うそれは何で出来ているか考えてみよう。
で、そのそれが分解される条件を考えてみよう。
分かった時点で、その質問が恥ずかしい質問だってことに気付くはず。

リン酸化タンパクをウェスタンブロットで検出しようと試みていますが、
コントロール実験で満足いく結果が得られません。
脱リン酸化阻害剤をつかって細胞からタンパクを抽出しました。
タンパクは30ugほどを流し、ゲルのランニングとトランスファーは問題ないようです。
（ゲルのCBB染色等により）
一次抗体の濃度はデータシートと論文を参照しています。
あとはどんなところがピットフォールになりえますか。

ウェスタンをウェットでやってるんですが、ある日を境にトランスファーが終わったらゲルがしわくちゃに変形するようになって、バンドがめちゃくちゃになってしまうんです。特に条件は変えていません。ちなみにゲルは自作です。
熱の問題とか、バッファーの濃度がおかしいのかとか色々考えているんですが、なかなか解決しません。ラボでウェスタンをやってるのは自分一人なので困ってます。同じような経験のある方いらっしゃいませんか？

ほんと基本的な話ですいません。もう一ヶ月結果がでてません・・・

>>897
実験対象のソレの特性を、もっと調べてから挑戦すべし。

>>898
君が下手だから。

＞ラボでウェスタンをやってるのは自分一人

どんなラボだｗ

マジレスすると熱の可能性が高そう
泳動中に電流・電圧を時々チェックしてみては

神経系の細胞でlipoの移入効率が低いので、レンチウイルスの系を
初めて導入したのですが、感染効率は高いのですが、発現量が低くて困っています。
CMVのpromoterにEGFPを繋いだウイルスを作り感染させたのですが、
lipofectamin 2000で同じplasmidを入れたときの３分の１から５分の１くらいです。
一細胞当たりに導入されるcopy数が少ないからなのでしょうか、
レンチって一般的にこういうものなのでしょうか？
adenoの場合はもう少し高かったような気がします。

他のスレでも質問したけど・・・

タンパク質ぶっかけ実験(NGF、BDNFなどの神経栄養因子)してるやつさ、
そのタンパク質が壊れてできたアミノ酸(Gly,Gluなど)のコンタミの影響ってどう評価してんの？？？

>>897

通常のイムノブロットに使用するスキムミルクは燐酸化タンパク質を含むので、
抗リン酸化ペプチド抗体を使用するときはBSAかゼラチンを使え、と習ったことがある。

>>898
ゲルの濃度が薄いと、ゲルがシワシワになることが多い希ガス。
アクリルアミド溶液を作り直してみればどうだろう。

ブロッティング溶液を良く冷やせ。

今更ですが、
>>874
です。
目的のバンドに20bpほどのREsiteがついているのをすっかり忘れてました。

というわけで100bpのところにバンドが出て当然でした。
本当に申し訳ありません。
そして、ありがとうございました。。

そういうオチかい・・

昔タンパクの精製で「実際の分子量よりだいぶ大きい、何じゃこりゃ」って騒いでたが結局GSTタグだったって奴を思い出した

>>898
ある日を境に作り替えた試薬が怪しい、と普通なら考えるけど、
ウエスタン経験浅いからよくわからん。

>>898
ちゃんとゲルとかブロッティングバッファで置換してる？

GST pull down assayがうまくいきません。
35Sメチオニンラベルした蛋白質をin vitro translationにより作成し、
その産物10μｌとGST蛋白質2μgを混ぜて1時間rotationさせています。
その際のBufferは50mM HEPES(pH7.5) 150mM NaCl 0.1% NP40 5mM EDTA
1mM DTTを使っています。

ある蛋白質どうしの結合をoverexpressionのIPで確認し、その蛋白質が
in vitroで直接相互作用するか、およびその結合部位を決めようと思ったのですが、
pull down assayを行うと、異なる二つの部位で結合するという考えにくい結果に
なったり、条件変えるとまったく結合が見られなかったりしています。
結合する部位はpull downされ、そうでない部位はされないというクリアな結果が
なかなか得られず、そもそも2つの蛋白質が本当に結合しているかどうかもわかりません。
GST蛋白質の量、Bufferの塩濃度や界面活性剤の量など変えるべきパラメーター
が多いのですがRIや試薬も高価ですので、たくさんの条件検討を行うわけもいかず・・・。

＞そもそも2つの蛋白質が本当に結合しているかどうかもわかりません。

まずそれを確かめてからにしろよ

>>912
OverexpressionのIPの系では、ネガコンと比べても再現性よくcoIPされた
ので、今回pull down assayで結合を見ようとしたのです。
それと、全長のGST蛋白質が可溶化しなかったので、
4つの部位にわけて作成しました。

>>898です。アドバイス色々ありがとうございます。

明日もう一回やってみます。

>>899
おっしゃるとおりです。また勉強してみます。
>>903
一度試してみます。私も聞いたことがあります。
ありがとうございました。

質問です。

今度実験でCzapek-dox培地を使いたいのですが、
どうしても沈殿などの不溶性成分が出てきてしまい困っています。

組成は
Sucrose 30.00 g
NaNO3 3.00 g
MgSO4 x 7 H2O 0.50 g
KCl 0.50 g
FeSO4 x 7 H2O 0.01 g
K2HPO4 1.00 g
Agar 13.00 g
Distilled water 1000.00 ml

本などでは組成が書いてあるだけであり、オートクレーブするだけらしいのですが･･･

ネットで色々見たものも試してみました。
・少量のDWで混ぜながらボイル。
・ｐH６くらいに調製。など

本物を見たことがないので分からないのですが、知っている方どうか御教授願います。

>>916
アホだろ。一遍死ね。

一緒に混ぜて過熱すると化学反応するものがある。

>>916
Mgは大体白くなるからオートクレーブ後に入れるね。フィルターしてね。
Agarがあるし、固まる前に入れるのは難しいね。ｗ　温度高いとやっぱ白くなるし。

>>911
RIがもったいなかったら、GST側ではない方のタンパクを293細胞で発現させて、
それをpull-downのbufferでlysisした後、GST タンパクとco-IPやってみたら？
これだと安上がりになるし、直接的な結合でない場合、複合体になって
細胞中では存在するので、GST タンパクと共沈するかもよ、
この辺で思う存分条件検討した後、RI実験に進めばストレスがなくなるはず。

すいません質問です。
すでに完成されたcDNAをコンピテントセルにトランスフォーメーションして、生えたコロニーからピックするときコロニーが近すぎて２つ以上ピックしてしまうことがあるのですが問題ないでしょうか？

おそらく問題ないが、まともな研究者はそんなことしない。

>921
ｃDNAをコンピテントセルにトランスフォーメーションとか言ってる時点でまともじゃない。
セル「を」トランスフォーメーションするのだから。

学生とまともな研究者を一緒にしたらまともな研究者に申し訳ない

>>922

きっと
transformation　=　transfectionなのだろう。

>>917-918
ありがとう。
やっぱりMｇ後入れが正解なのか･･･

どの調理表見ても混ぜ混ぜしてオートクレーブとしか書いてなくて･･･
とりあえずそれでやってみる。

>>925
俺は全部別々におーとくーれぶして10×のバッファを無菌で作り松
そいつをストックソリューションとして保存
そんで水とアガーを混ぜたやつをおーとくれーぶして
そいつに10×を10分の一量入れ末

>>926
面倒だけどそれが一番確実そうですね。
参考になりました。

∩＿＿＿∩　　　　　　　　　　 　 ∩＿＿＿∩
　　 |ノ　　　 　　ヽ　　　 　　　　　　　 |ノ　　　 　　ヽ
　　/　　(ﾟ)　　　(ﾟ) |　　　　　　　　　 /　　(ﾟ)　　　(ﾟ) |
　 |　　　　( _●_)　 ミ　　　　　　　　 |　　　　( _●_)　 ミ　　あ〜たし♪
　彡､　　　|∪|　　､｀￣￣ヽ　　　 ／彡､　　　|∪|　　ミ
/　＿＿　 ヽノ　　　Y￣)　 |　　 (　 (/　　　　 ヽノ＿ 　|　　　　　　　さくらんぼ〜♪
(＿＿＿）　　　　　　 Y＿ノ　　　 ヽ/　　　　　(＿＿＿ノ
　　　　　＼　　　　　　|　　　　　　　|　　　　　　/
　　　　　　|　　／＼　＼　　　　　／　／＼　　|
　　　　　　|　/　　　 )　 )　　　　(　 (　　　 ヽ　|
　　　　　　∪　　　 （　 ＼　　　／　 )　　　　∪
　　　　　　　　　　　 ＼＿)　　(＿／

＞1.　○東京大学　Tokyo univ 4.56
＞2.　○京都大学　Kyoto univ 4.44
＞3.　○大阪大学　Osaka univ 4.36
＞4.　○東京工業大Tokyo institute of technology 4.32
＞5.　○東北大学　Tohoku univ 4.31
＞6.　○名古屋大　Nagoya univ 4.28
＞7.　○九州大学　Kyushu univ 4.20
＞8.　○一橋大学　hitotsubashi univ 4.10
＞9.　○神戸大学　Kobe univ 4.01
＞10. ○北海道大　Hokkaido univ　4.00
＞11. ○横浜国大　Yokohama national univ 3.89
＞12. ○広島大学　Hiroshima univ 3.86
＞13. ○筑波大学　Tsukuba univ 3.80
＞14. ○名古屋工大Nagoya institute of technology 3.76
＞15. ●慶応義塾大Keio univ 3.75
＞16. ●早稲田大　Waseda univ 3.70
＞17. ○九州工大　Kyushu institute of technology 3.65
＞18. ○金沢大学　Kanazawa univ 3.64
＞19. ○東京農工大Tokyo univ of agriculture & technology 3.62
＞20. ○お茶の水女子大Ochanomizu univ 3.60
＞21. ○岡山大学　Okayama univ 3.58
＞22. ●東京理科大Science univ of tokyo 3.55
＞23. ●中央大学　Chuo univ 3.48

＞上記は、アメリカの大学を最も的確に格付けしたものとして評価が高く、
＞最高の権威を誇ってい“ Gourman Report ”(ゴーマン・レポート)の
＞スコアによる日本のベスト３０大学のランキングである。
＞大学の学生援護システム、管理体制および組織、図書館の質、
＞授業内容の水準と質、など十八項目を評価基準としている。

13 東京大学
31 京都大学
35 大阪大学
72 東北大学
97 名古屋大学
115 九州大学
142 北海道大学
159（独）科学技術振興機構
167 東京工業大学
170（独） 理化学研究所
199（独）産業技術総合研究所
222 筑波大学
266 広島大学
289（独）自然科学研究機構
296 千葉大学
304 慶應義塾大学
343 神戸大学
361 岡山大学
369 熊本大学
371 金沢大学

・小学生がけったサッカーボールが盆栽を傷つけたとして、盆栽リース業者が男の子と
　両親を相手取り、およそ1100万円の損害賠償を求める訴えを起こしました。

　訴えを起こしたのは、岡山市の盆栽リース会社です。この会社を経営する71歳の男性は
　自宅の庭で盆栽を育てています。
　訴状によると、去年3月、当時8歳の小学生の男の子がけったサッカーボールがケヤキの
　盆栽に当たり、枝2本などが折れました。男性は、この盆栽を32年も育てていて、近く
　インターネットのオークションに開始価格1000万円で出品する予定でした。去年11月、
　簡易裁判所に調停を申し立てましたが、成立せず、男の子と両親に対し、およそ1100万円の
　賠償を求める訴えを起こしました。原告の男性は、日頃から、道路でサッカーをしないよう
　注意していたということです。
　http://headlines.yahoo.co.jp/videonews/ann/20060418/20060418-00000030-ann-soci.html
　※既に記事は削除されています。

※前：http://news19.2ch.net/test/read.cgi/newsplus/1145444920/