タンパク質の精製３

タンパク質の精製についての情報交換をするスレ

前スレ
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1039524190/
前々スレ
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/982464137/

前スレが落ちていたので立てました。
今年も頑張って精製していきましょう！

>>1
乙

培養細胞上清由来の蛋白質を分画し、個々の蛋白質をそれぞれ多量に得たいと思っています。
和研薬のプロメテウスやATTOのプレップフォレーシスの使用を検討しているのですが、
これらの機器の性能について、実際に使っている人の感想を知りたいです。
また、プロメテウスやプレップフォレーシス以外で、蛋白質の分取に適した機器は
無いものでしょうか？

質問すます。
精製後プロテインのバンドをとったら、分子量のでかいバンドがでますた。
普通こういうのはどうやってどのタンパク質かを知りますか。
ゲルを切り取って、トリプシン処理の後、枡？
それともアミノ酸シークエンス？
タンパク質がDBにのっていなかったらどうしようか、
枡は高いのか、アミノ酸のシークエンスとどっちがいいのか、
教えて下さい。

俺だったらシーケンスするかな
　俺のは未知だから全長遺伝子とってようやく少し特徴が見えてきた

>5
シーケンスが確実と思うが、N末端がブロックされている可能性もある。
貴重なサンプルを無駄にしたくないのなら、
シーケンサーとマスの両方を使うのが良いのでは？

もしPVDF膜転写後のサンプルをつかうんだったら
染色／脱色に使う溶液に、氷酢酸を使わないほうが良いかと。
N末端部がアセチル化してしまうかもしれんから。

では、がんがってくらさい。成功をいのってます。

>>5,6　ありがとうごじます。も少し教えて下すい。
・本なんかではPVDF膜が一般なのですが、Nitrocelluroseは可能でしょうか。
・未知タンパクであることは、どのように知ったのでしょうか。
幾つか取ったフラグメントをDBで検索して（BLASTでしょうか）、
見たのでしょうか。タンパク質が２量体であることは考えましたか？
・未知であることを知ったときの感想は？ｷﾀｰｰｰｰですか？
・MSをどこぞに依頼するとどの位お金が取られるのでしょうか。
・MSでは全Peptideが取れないと聞きましたが、今は機器の性能向上に
向上しているでしょうか。回収率は何％？

とりあえず、N末端のブロックは無視してMS&シークエンスしてみるのかな？

>>6
スタンダードな方法と思いますが、
HPLCカラム精製を行った後に、
一気にMSに持っていきます。

MSは７，８万だったけかなぁ

MSで全ペプチドが取れないって何のことを言ってるの？

>>11
あーいやー、私バイオ初心者なんですが、
ゲル内トリプシン処理でうまくペプチドがゲル内から遊離しない場合がある
MALDIでイオン化されないペプチドが考えられる。トリプシン自体の自己
分解があるの３点がすべてのペプチドが取れるわけではない、ということです。

また質問してしまうけど、多量体ってどうよ？１次元から２次元で
重なったバンドを分けるとモノマーの確率が高くなると思うんですが、
１次元の場合の成功率はどんなものでしょうか。

>5
ニトロセルロースはだめっしょ
未知であることはデータベースで確認　ある程度ホモロジーがあるタンパクは存在するが
普通に考えて違うタンパクだった
BLAST検索って工夫しないと引っかからないとき多いよ
N末ブロックされていたらAc-DAP(Takara)使いな
うまくやればラダーシーケンスもできるかも

俺がPVDFでプロテインシーケンスするときは
DTT還元後SDS-PAGE, Blotting
染色、脱色(50%MeOH)
PBS中でピリジルエチル化　洗浄(50%MeOH)
100% アセニト洗浄　乾燥
こんな感じでやれば試料のロスが少ない
アセニトはCBBが除けて脱水もできる、　やらなくてもいい

やはりアルキル化はやったほうがいいよ
ピークが全然違うから　

>>12
量がたくさんあることよりも純度がポイントでPAGEやる前にいくらかでも精製できればかなりの確立でタンパク同定できると思う。
MSは多くのペプチド断片配列の総和から元のタンパクを同定するので、
出る結果としては例えば、
Aタンパクのペプチド３００個
Bタンパクのペプチド10個
Cタンパクのペプチド2個
ていう風になって
じゃあAだろうな、って分かって以降の確認実験に進んでいくわけです。
なので、BやCのｺﾝﾀﾐを少なくできれば取れるペプチド数が少なくてもいいわけだし、
ｺﾝﾀﾐが多ければA由来のペプチド数がBやCを遥かに凌駕しないとわけ分からない結果になるんです。

したがって僕は回収量を気にするよりも軽く分画するなりして少しでも綺麗にすることをお勧めしたいですね。

ちなみに精製って分子量や等電点だけでなく
疎水性やアフィニティなんかでもできることがあるので
お忘れなく

>>13-15
レスがついて良かった、ありがとうごじます。
精製はアフィニティを最初にやったYO!

吸収見たらなんか26まで取れたんだけど、
RNaseやDNase使うことってある？

おまいら、Amiconとかって使い捨てですか？
何回くらい使い回せる？

>5
何言ってるか分かりにくいです。
精製にDNase使ったこと有るかという意味だったらあります。

>17
やぶれるちょっと手前まで。

>>18
Rnaseの活性って20度近辺だと思うんだけど、
精製は4度でいつもやっています。Rnaseはちゃんとはたくかな？
プロトコルとっかにあったら嬉しいのですけど。
260nmの吸収が減ることをきぼん。

まじめに質問しているのならばちゃんとした文章で書いてくれ。
あんたの文章、ほとんど意味不明。理解できん。

>>20
そのくらい読めるだろ。>>20は頭が悪いだけ。

>>21
読めるんなら５の文章を正しい日本語に訳してくれ。

俺も>>19の意味がわからん。
4度で何かを精製してるときにRNaseを効かせたいんだな？
それで何のプロトコルが必要なのよ？
260nmの九州が減るのを希望してるみたいだけど
わけがわからん。
っていうことで>>21の発現が５６サブー。

それと基本的な疑問なんだがRNAって分解すると
260nmの値って下がるんか？

>>23も漢字が間違っているじゃないか。)w
日本語も変だし。

じょじょに日本語勉強のお時間になって来たな。
おれは２３の文章はだいたい読めて理解できるよ。漢字も想像できるし。
>５６サブー
ってのだけがわからんけど、２ちゃん用語ですか。

それに比べて５の文章はほとんど理解できないので、もう一度書き直すか２１に正しい文章に翻訳してもらえ。

Ni-NTAをregenerationして使ってみたら全然タンパク引っ付いてない。ショック、明日メーカーに電話しなくっちゃ！

26さん
私、regenerationした担体を何度使ったか分からないですが毎回再生できてましたよ。。
キアゲンのマニュアルにのっとっていたんですが。

>>26
俺もキアゲンのプロトコールでやったよ。だいたい1時間くらいかけて全部通したんだけど早すぎ？

私の場合はオープンカラムにNi-NTAを1 ml充填してNi-NTAカラムを作製していました。
HPLCにつないでいたわけではないので26さんがどのような状態で担体を再生したか分かりませんが
私はニッケルがrechargeされているかどうかが不安だったので、硫酸ニッケルでrechargeさせるときに通すだけではなく、長時間放置していました。
1時間では終わらなかったおぼえがありますね〜。

>>29
俺もオープンで1ml充填してカラム作ってました。有用な情報ありがとうございます。早速明日ためしてみます。もしかしたら可溶化に使ったSDS(0.5%)のinteractionが原因かもしれないんですけど。

やっぱりSDSが原因でした。先生がやれって言ったからやってみたんだけど・・・。こんなんじゃだめだなorz

先生がやれって言ったからやってみた　だって。僕いくつ？

>>32
先生に命令されて1度やってみるのは、
別の意味で大事なステップだと思う。

>>5 周辺の人へ…
タンパクのバンドの同定は
MS/MSが一番でしょ。

>>33
ごますり野郎か、いやな感じ。

教官に指示された方法と自分が正しいと思う方法とを両方やるんだよ。
どっちが成功してもうまいところに落ち着くからね。

あまりにもアフォな指示を出す教官だったら上の方法で卒業までやり過ごしたあと
見限ってさようならする。これがうまい身の処し方だなあ。

>34は偽者です
>35
アドバイスありがとうございます。これからはそうしようかと思います。普段はそんなに変じゃないんですけどね。なぜか最近の指示が変なんですよ。次は0.1%SDS可溶化しろっていうし(SDSのCMCは0.2%くらいだったはず
)

でも、やっぱり先生のいうことだから従わなくてはいけないですよね。
私は学生なんだし。

>>35
禿同。

>>36
Ni-NTAのマニュアルにはSDSはお勧めできなくて、
0.3%までならOKかも…ってある。
そもそも…、
何の精製してるか知りませんが、
SDS可溶化なんかしてていいのかも気になります。

先生が何かどこかでうまくいきそうな情報を仕入れてきた
んじゃないかとおもいますけど？
SDSのかわりにサルコシル(N-lauroyl sarcosinate)も平行
して試すのはどうですか？
でもって可溶化したあと、シクロデキストリンでdetergentを
洗い流すという技が一昔前のトレンドでしたけど。
サルコシルとか巻き戻しとかのキーワードで検索するのもいい
かもしれません

>>37=36
なんか主体性が随分ない学生だな。

30 ：生化学師団蛋白精製大隊最先任軍曹 ：2001/02/20(火) 06:34
＞２９

あらゆるプロトコルがキット化され、女子中学生がPCRでもサザンでも
シークエンスでもできるようになってしまった現代の分子生物学。
俺たちが青春を捧げた研究も、いずれコギャルがケータイ片手に
ブラウズできるようになってしまうのか？

だが心配はいらない。唯一マニュアル化できない漢（おとこ）の戦場が、
蛋白質精製という無法地帯に残されている。敵（蛋白質）が変われば
武器（精製法）も変わる、過去の知識などあてにはならない、やってみなけりゃ
わからない、先にタマ取ったもん勝ち、情け無用のキリングフィールドにようこそ。

それでは新米兵士の君に、生き残るための教練書を哨戒、違った、紹介しよう。
「Protein Analysis and Purification」 　Ian M. Rosenberg, Birkhauser
「Guide to Protein Purification」 Murray P. Deutscher, Academic Press
「Protein Purification Methods」 E.L.V. Harris and S. Angel, IRL Press
「蛋白質・酵素の基礎実験法」　堀尾武一、南江堂　＜ちょっと時代遅れだけど。
あと、Amersham Pharmaciaが出しているクロマト関係の小冊子には全て
目を通しておけ。

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/081763665X/
Protein Analysis and Purification: Benchtop Techniques
Ian M. Rosenberg (著) ペーパーバック版
U.S. 定価： $76.95
価格： ￥10,359
出版社: Springer Verlag ; ISBN: 081763665X ; (1996/11/01)

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0817637176/
同 ハードカバー版
U.K. 定価： £120.00
価格： ￥24,989
出版社: Springer Verlag ; ISBN: 0817637176 ;

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0122135857/
Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology
(Methods in Enzymology Series, Vol 182)
Murray P. Deutscher (著)
価格：￥10,173　現在、在庫切れです。
出版社: Academic Pr ; ISBN: 0122135857 ; 182 巻 (1990/03/01)

http://www.amazon.com/exec/obidos/ASIN/019963002X/
Protein Purification Methods by E. Lynn Harris, S. Angal
Availability: Out of Print--Limited Availability
Publisher: Irl Pr; ASIN: 019963002X; (December 1996)

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/4524401237/
蛋白質・酵素の基礎実験法
堀尾 武一 (編集)
価格：￥8,544
出版社: 南江堂 ; ISBN: 4524401237 ; 改訂第2版 版 (1994/11)

Amersham Pharmacia Technical Literature Database
http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/literature_intro

34 ：ＨＤＤ理論 ：2001/02/20(火) 13:03
あとね。
英語の本ですけどAcademic Press社、N.C. Price編集
Protein LAB-FAX ISBN 0-12-564710-7
はコンパクトだけどいろんなことが書いてあってお薦めだよ。
＞３０
漢と書いておとこと読む、その心意気に乾杯

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0125647107/
Proteins Labfax (Labfax Series)
N. C. Price (著)
U.K. 定価： £56.95
価格： ￥12,293
出版社: Academic Pr ; ISBN: 0125647107 ; (1995/12/21)

349 ：名無しゲノムのクローンさん ：2001/08/17(金) 18:56
どうも、横レスです.
僕はタンパク質工学に興味がある学生です.
大学院からタンパク質を学びたいと思っています.
今の講座はバイオしかやらないので、essensialとcellなどの教科書は読んでいますが、
タンパク質工学に関する本は読んでません.
タンパク質工学に関する入門テキストのようなものがありましたら
教えてください。厨房でした


350 ：名無しゲノムのクローンさん ：2001/08/21(火) 16:03
古典的名著
タンパク質工学の物理・化学的基礎　江口至洋　共立出版

あと
蛋白質機能の分子論　濱口浩三　学会出版センター

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/432005377X/
タンパク質工学の物理・化学的基礎
江口 至洋 (著)
この本は現在お取り扱いできません。
出版社: 共立出版 ; ISBN: 432005377X ; (1991/05)

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/4762236179/
蛋白質機能の分子論
浜口 浩三 (著)
価格：￥3,400
出版社: 学会出版センター ; ISBN: 4762236179 ; 改訂版 版 (1990/02)

425 ：名無しゲノムのクローンさん ：01/10/15 16:02
横レスすいませんが、タンパク質工学を学ぶ上で参考になる本があったら、
ぜひお願いします。独学で学ぶ予定です。


426 ：泥沼歩兵部隊 ：01/10/15 18:56
古典的名著　江口至洋　「タンパク質工学の物理化学的基礎」
共立出版

これはいい本なのですが絶版になってどこでも手に入りません
もってる先輩で使ってないヒトから言い値で買う価値のある本
です。古本屋でみかけたら即ゲット

蛋白質機能の分子論　濱口浩三　学会出版センター
これも古い本ですが入門にはよいと思います。

蛋白質のフォールディング　原理・機構・応用
RHペイン　シュプリンガーフェアラーク東京
最近ではタンパク質工学そのものへの興味よりも
フォールディング機構に切り口のある本によい本が
あると思います。お勧めです。もう何冊か、最近出て
いるフォールディング関係の日本語の本もいちどご覧ください。

最後に今年の8月の蛋白質核酸酵素の増刊
「新世紀における蛋白質科学の進展」ですが、玉石混交と
いってしまうには玉のほうが多い、日本の蛋白質科学も
レベルが高くなったなあと思わせる本だと思います。特に
若い人たちの書いているところがどれも粒ぞろいに面白
いです。入門には向きませんし、構造生物学が大分はいっ
てますが一応お薦めしておきます。

http://www.springer-tokyo.co.jp/content/isbn4-431-70953-3.html
タンパク質のフォールディング　第2版
R.H. Pain　著
崎山 文夫　監訳　河田 康志／桑島 邦博　訳
B5　並製　410頁　本体 6,000円＋税　
ISBN 4-431-70953-3
CコードC3045　　発売日　2002年10月11日

http://kyoritsu-pub.topica.ne.jp/pne/pne01z.html#shinten
新世紀における蛋白質科学の進展
中村春木・森川耿右・鈴木紘一・三浦謹一郎　編
392ページ／定価7,035円（本体6,700円）
ISBN 4-320-05588-8
『蛋白質 核酸 酵素』増刊号を書籍に改装

818 ：泥沼歩兵部隊・後方戦闘支援室 ：02/09/28 21:10
タンパク質物とり戦線、前線にて戦闘中の皆さま、いかがお過ごしですか？秋の学会シーズンを
控え、日々の戦闘もますます激化していることと思います。
さて、泥沼歩兵部隊後方戦闘支援室から、下記の書籍をご紹介させていただきます。
Protein Protocols Handbook
John M. Walker (Editor) (Paperback, 1147 pages - February 2002)
Humana Press; ISBN: 0896039412; 2nd edition (February 2002) 日本円で約15000円
タンパク質の取り扱いに関する良い教科書がないとお嘆きの皆さま、是非ご検討ください。
後方より諸兄らの武運を祈る・・・・オーヴァー

http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0896039412/

http://www.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp/biophys/profile/hiroakih.files/refolding2002.pdf
蛋白質の（試験管内）巻き戻し法における最近の話題

http://www.virus.kyoto-u.ac.jp/Lab/MolGen/opinion_frame.html
上村さんの雄叫び＠京都大学ウイルス研究所・上村研究室

37は偽者です。
>38.39
またまたアドバイスありがとうございます。現時点ではたんぱく質の活性がなくても構わないからとにかく精製しようというプランなのでSDSでもだいじょうぶなんですよ。
明日はこっそり非イオン性の界面活性剤を試してみようかと思います。試薬が高いから少しびびっちゃいますけど

Niカラム溶出後のフラクションを透析したらあぐった・・・・。薄めてから
透析するといいって聞いたことあるんだけどほんとなんかね？うそくせえ・・・・。

>53
急速希釈法じゃないの？　1mlくらいのサンプルを1リットルくらいのバッファーに
即効で加えたらいいのでは？

俺はアルギニンリフォールディングしているよ
0.4Mくらいまで2日くらいかけてゆっくり透析　それ以上濃度を下げると
アグリゲーションする　Niカラム使えないのが痛い

53さん、私は0.5 mg/ml程度でアグリましたね、モノによって変わってくるでしょうけど。
それ以来、0.2 mg/mlくらいの濃度にして透析してますよ。
それでうまくいってますね〜。

54、55さん　ありがとうごぜえます：；　がんばってみまつ

すみません
研究室の最近使われた形跡のないHPLC用カラム(東ソーのTSK-gel G3000SWXL)
を使おうとしているんですが、カラムの耐圧をどなたかご存じないですか？
書類のたぐいは見あたらず、ホームページの資料にもないようだったので。。。
それから洗うときや保存するとき20%エタノールは使っていいのでしょうか？
おねがいします。

メーカーに電話して資料送ってもらえ。

ゲルろ過カラムだろうから2MPa　できれば1Mくらいがいいはず
保存は20%エタでいいけど　今使っているバッファーと反応して不溶性物質ができないのを確認したほうがいいよ
心配だったら１N水酸化ナトリウムで洗ってちょ
平衡化は数時間やったほうがいいよ

どうも。
結局知人に聞きました。
普通1MPaで使っているとのこと（ガードカラム分除く）。

ちなみにエタノール系と塩を含むバッファーを交換するときは間に真水洗いをいれてまつ。
あと、シリカが溶けるのが心配なのでTSKgelについてはNaOHは使わないことにしています。

質問させてください。
低ｐＨのバッファー条件でアフィニティークロマトグラフィーを使ってリコンビナント
蛋白質を精製できないか考えているんですがどなたか情報をお持ちではないですか。
アフィニティークロマトグラフィーを使う場合今までだいたいＨｉｓタグ使ってきたん
ですが諸事情によりＨｉｓタグが使えない低めのｐＨを使うことになりそうだからです。
ＧＳＴその他のタグについても調べてみたんですが低いｐＨで使った例が見当たらなかった
もので。どなたかその辺りの経験をお持ちの方情報お願い致します。

GSTとグルタチオンの結合はpHに影響される。

アマシャムによれば6.5〜8.0だな。

その諸事情が何かによって方針が変わるなあ

スレ違いは承知で・・・
SDS-PAGE条件でほどけないタンパク質間の相互作用ってありますか？
あきらかにフュージョンした状態でバンドがあって、
LC-MS/MSで二つタンパクが同定されます。。。
なんででしょ。

ユビキチン化

>>64

例えばバクテリアアルカリフォスファターゼのZn結合タンパク質の2量体は非常に安定なので
サンプルバッファーを加えて50-60度ぐらいでは解離しない。

EDTAを加えて95度5分以上しないと単量体にならない。

SDS+還元剤+boil も万能じゃないよ
多量体形成したら上のほうにバンドが出る場合もそんなに少なくはない

64です
ありがとうございます。
分子量からして多量体ではなくて二種類のタンパク質が
1:1で結合しているように思います。
ユビキチン化はあるタンパク質にユビキチンが結合して分解なんかがすすむって奴ですよね？
これも異なる二種のタンパク質の複合体を形成しているようなので、
ちょっと違いそうですね。
う〜ん。。。
SDS-PAGE条件は67さんがおっしゃる条件でboilも5分程度してるのですが。。。

>>68は>>66や>>67のコメントの意味が分かってないみたいだね。
どちらもSDS dyeでboilしても結合が解離しないタンパク質だってあるよって言ってるんでしょ。

>64
もともと2量体の大きさのタンパクでMSの操作が悪いとか。
MSは違うピークが出ることもありうる

>61
我慢して陽イオン交換カラムを使いなさい

共有結合でないなら、6M尿素入りのアクリルアミドゲルで泳動したら
どうなのよ？解離しないか？>>68

＞70
MALDIじゃないっす。
SDS-PAGEからLC-MS/MSなんで質量分析から質量の情報はでないっす。
＞69
そうですね。逆にそこが興味深いんですが。
細胞膜ではくっついてて、
異なるオルガネラではそれが乖離してるんですよ。
ただ結合がほどけない相互作用ってほんと、
どんなんでしょうね。
単純なダイマー化とかでもほぐれないことがあるとはしらなかったす。
ありがとうございます。
参考にさせていただきます。
あふぃにてぃーでもやるかな。

疎水性の高いタンパク質の場合、SDS dyeを入れてboilするとアグって泳動度が変わったりゲルに入らなくなったりするのがあるよ。
SDS dyeを入れたらboilしないで37℃でインキュベートすると改善することがある。

>71
ゲル中にウレアを混ぜるってことですか？
runningバッファーにまぜるってことですか？
＞73
37℃オーバーナイトくらいっすかね。
膜タンパクやってるんでseparationゲルにひっかかるのが多くて困ってました。
興味深いです。
やってみます。

膜貫通領域を沢山持ったトランスポーターなんかでよくあるよ。
37℃ 15分か30分でやってる。

えっ！？
そんなに短いんですか？
逆に今までの泳動像がかわっちゃいそうですね？

さぁ･･･タンパク質によるだろうからね。
予想分子量に泳動されないときなんかには良く効くみたい。

ですよね。
ターゲットがあるなら考えていいかもって感じですね。
ある程度網羅でやってるんで、
ひとつのツールとしてやるのが良いかなと思いました。

質問させてください。
あるタンパク質をGSTフュージョンで発現させて、
GSTrap FFによるアフィニティクロマトグラフィーでの精製を試みてます。
このときに、目的のタンパク質だけが素通って、GSTと別々になって出てきたんですが、
原因などわかる方がいたら教えていただきたいです。
大腸菌は低張バッファーとリゾチームで処理した後、
１％CHAPSでタンパク質を可溶化しています。
色々試しましたが、もう万策尽きた感じです。どうか情報お願いします。

endogenousなプロテアーゼでGSTと目的タンパク質の間が切断されてんでないの？

目的タンパク質のN末を少し削ってpGEXのMCSに入れると改善する場合がある。

ヲレの場合、目的遺伝子の5'側にpBlueScript MCS由来の長めのリンカー
付で発現ベクターにしたら、ブチブチ切れたけど、ORFのATG近傍で詰めて繋げたら、改善して融合タンパク質が全長で発現するようになった。

>80
そうだったら、精製にプロテアーゼインヒビターとかいれとけば
改善するんじゃない？
GST

ゴメソ
末尾のGSTはけし忘れです

アンケート
よく使う発現ベクター教えてよ

pET 3a

pGEX4T-1

pGEX は 6P だな

pSEX69だな

>87
発現系作って論文書いたらその名前にするのね

つまらん

そんなもん3コスリ半で可能

やったー、結晶がでますた！！！！

塩ですた

酒石酸あたり

Mass Spectrometryでシークエンスしたいんですが、
Massのサンプルに塩、detergentなどが入っているとよくないそうなのです。
サンプルはやはり逆層クロマトなどをして塩を取り除いてからの方がいいですか？

まずはＹＥＳと言っておこう。

>94
金に余裕があるならZipTipを薦める

メーカー忘れたけどZipTipのぱくりでもっと安い
チップ型微量逆相がでてたとおもうぞ
フナコシかビーエムのカタログで見たような

初めて免疫沈降します。血漿をサンプルとしたいのですが、
この方法は一般的に、組織（細胞）に含まれている
抗原に対して行われているようです（？）、血漿は試料として用いられるものなのでしょうか？
宜しくお願いします。

血漿でも血清でも普通にできるよ
アルブミン・IgGなんかの割合が多いせいでバックグラウンドが
上がりやすいけど、血中に含まれるタンパクが欲しいんならやるしかないっしょ

脱塩（限界ろ過）で困ってます。アミコンやマイクロコンをつかっています。
タンパクが膜にくっつくためか脱塩時に半分以上ロスします。
何か良い方法はないでしょうか。
PD-10とかのほうが良いのでしょうかね・・

BSAでブロッキング

まあ言うとおり脱塩カラムのほうがいいでしょうな

個人的にはCentriPrepタイプの、膜内外の圧力差を利用したやつ
(液が内側で上がってくやつ)が好きだけど(別メーカーで小さいのがあったね)、
極微量だとそうもいかないか

ZipTip操作で空気を入れないようピペット出し入れというのがかなり面倒なんですが慣れるしかないですかね。
どこかに便利グッズってないものかしら。

>>101
精製してるのにBSAが混入するとまずくない？

サンプル中に尿素（7Mくらい）が入っていたら目的物がカラムに
吸着するのはまず無理でしょうか？イオン交換やアフィニティーを
考えているのですが。透析が大変なのでできるだけ省略したいのです。
疎水性相互作用ではどうでしょう？

疎水性とアフィニティーは無理。
イオン交換と、ひょっとしたらハイドロキシアパタイトは行ける
金属キレートもいける

非常にあぐる蛋白の精製で、タグアフィニティーの後に一発イオン交換かませてポリッシュしたいんだけど、1M NaCl入りのバッファーに使ってるサンプルをmonoQかmonoSでポリッシュできるっすか？
素人質問でスマソ。

>>64
SDS-PAGEはあくまで分子量で分けてるだけ。
大きさが同じ（に見える）蛋白質が２つ以上あっただけでは？
2DEで展開したら別れるのでは？

>>100
限外濾過のとき、溶液の回収は濃縮液を回収しているだけでは？
膜に吸着している部分も多いが、見えないくらいの液滴が集めれば結構な量で存在している。
適当なbufferで膜、容器を洗いこめば少なくとも半分しか回収されないということはないはず。
ぎりぎりまで濃縮→溶液回収→bufferで洗い込み→再度濃縮→溶液回収
の繰り返しで相当回収できるし、溶液量も大きくならない。

もともとの溶液量がわからんが、アマシャムのNAPシリーズで溶媒交換もありかと。
手間を惜しまなければ回収率はあまり気にしなくてすむ。（テクニックはいらんから）

はげしくあげええええええええええええええええ

>105
ハイアパならいける。
タンパクがCaサイトにつけば７Ｍの塩酸グアニジンでもいける。

生化学初心者です。
SDS-PAGEを行うために可溶化されたサンプル(SDS、BPB含む)は、
どのようにタンパク濃度を定量すればよいのでしょうか？？
lowry法やBCA法のキットではBPBにより吸光度が読めないのでは
ないかと心配しています。
宜しくお願いします。

>>111
濃度既知のBSAと一緒に流してバンド強度を比較してみたら？

＞112　レスありがとうございます。

質問の仕方が悪くて申し訳ありません。
サンプルのアプライ量を検討するために、
流す前にタンパク濃度(μｇ/μl)を知りたいのです。

　

色素混ぜる前に測りゃ問題ないんだろうと思うけど
答えになってないんだろうなあ(レポートか？

紫外部とかはどう？試してみたら？

しつこくて申し訳ありません・・・SDS-PAGE教科書に
「可溶化後、必要ならばアプライする前にタンパク定量し、至適な
量のタンパクを流す・・・」と
ありますが、私にとっては可溶化した時点で一般的にはBPBも入ると
思っているので、どのように定量しろというのかが分からないのです。
一般的に皆さんはどのようにSDS-PAGEをおこなっているのでしょうか？

なるほど。
ふつうはTBSみたいなマイルドな緩衝液に
溶かしている状態の試料のことを可溶化といいます。
TBS + 1%SDSでもよいです。
ですがSDSが入るとUVで定量はできません。

SDS存在下で蛋白質を定量するなら、Lowry法
とかMicroBCA法とか、蛋白質を発色させる試薬で
定量するのが一般的です。

ですが、>>112の方法の方が確実ですね。
つまりSDS-PAGEは二枚流すのです。
一つは分析用、一つはタンパク質の定量用。
慣れてくると分析用のPAGEの余ったレーンをつかって
定量ができるようになります。

>116 ありがとうございます、大変参考になりました。
　　　2枚のゲルやってみます！

その方法に加えて、1×サンプルバッファー（without BPB)を
溶媒としてＢＣＡで測りその後、２×サンプルバッファー（ＢＰＢ含む）
で完全に可溶化→アプライしてみようかと今思いました。
（完全に可溶化できていなくても定量できるのか疑問ですが・・）

SDSやその他界面活性剤が入ってるとタンパク質定量が精確にできないことが
多いのでその辺調べるなり予備実験するなりしてやって下さいね。
この辺は常識と思いますが、、、

おすすめ本　protein labfax　手に入るといいのですけどね

>117

2MEが入ってたらBCA無理だったような…。2MEもぬいてね。
SDS Sample Bufferに溶かしたWhole Cell Lysateなんかは、
一度TCA沈殿して、BCAなりで定量。

>>111
そもそもプロセスが違うよ。
あるタンパク質サンプル溶液が先ずあって、タンパク質定量する。
次に、タンパク質濃度から計算してサンプルを極一部とり、
同量の２×サンプルバッファー混ぜる
→最終的に１×サンプルバッファー中にタンパク質サンプル。
というのが一番ベーシック。

サンプルが既にSDS, BPB, 2ME と混ざっている時点でタンパク定量を考えるな。

111の「可溶化」って言葉がみょ〜に引っかかるんだが、サンプルは何？
solubilize しなきゃいけないの？
lyse とか suspend って意味のような気がするんだけど。

guest

疎水性カラムにタンパク質サンプルを吸着させましたが、100% B bufferでも溶出してこず、くっついたままみたいです。(Flow through, Wash, Eluteには出ていない）。
A buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.5, 1.2M (NH4)2SO4で吸着,B buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.5で、liner gradientをかけたあと100 %B bufferで流し続けました。
とりあえずはタンパクサンプルをカラムから回収したいのですがどうすればいいでしょうか？

50%エチレングリコール入りBバッファーを試してみそ。

SDS-PAGEのアプライ量はいつも勘だな
普通計算するもんなの？

>>125
目的によるでしょ

蛋白質を精製する際大腸菌での発現系として用いる場合、目的の蛋白質にシグナルペプチドや大腸菌の輸送系に認識されるようなペプチド領域を付けてやると目的の蛋白質が菌体外に分泌されて精製が簡便になるなどという方法はありますか？
もしくはKitとしてすでに発売されていますか？私は見たことありません（＞＜）

人権擁護法＝言葉狩り＝2ちゃん書き込み規制

　 Λ＿Λ 　 　／￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
　<=( ´∀｀) ＜ 　生粋の日本人である僕が人権擁護法で差別と叫ぶ。
　（　　　　） 　│　それで目障りな２ちゃんねらーの野郎を訴えて
　｜ ｜　|　　│　裁判でぶっ飛ばしてやるニ・・・ぞ！
　〈＿フ__フ　　＼＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

この法律には「差別的言動禁止規定」が含まれている。
外国人犯罪やハンナン食肉偽装事件を批判する正当な言論は２ちゃんねるにある。
これは、その２ちゃんの書き込みした人を次々に罰する法律だ。
在日外国人などがヒステリーを起こして「差別だ」として叫ぶと、
書き込んだ人をもう好き勝手に弾圧できるようになる。

第三条　何人も、他人に対し、次に掲げる行為その他の人権侵害をしてはならない。
　 二 　人種等の共通の属性を有する不特定多数の者に対して当該属性を理由として
前項第一号に規定する不当な差別的取扱いをする意思を広告、
掲示その他これらに類する方法で公然と表示する 行為
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
↑これ「２ちゃんねるでの在日外国人批判書き込み」という意味


　みんなの2chがカスどもに取り上げられようとしています。
　力を合わせて敵をやっつけよう　みんなの力が必要です。
　お願いします。　頼みます。張ってください。
http://news19.2ch.net/test/read.cgi/newsplus/1109169724/l50

そういえば
なんかこれのコピペ見たな。
ずっと無視していたけどなんかヤバイ予感

>127

あるよ。
trxAタグで、雄もティック・ショックとか。
...原理不明...誰かフォローして。

ペリプラズム逝こうシグナルいくつかあるし、
ペリのタンパクも、浸透圧使って放出できる。
...trxAタグも、ペリに逝くのかなぁ...

>>127
大腸菌で菌外に放出される系はありません。
130さんのコメントの通り、ペリプラズムまで行くものは幾つかあります。
ノバジェンのカタログでも見て下さい。
また、酵母だったら細胞外に放出される系はあります。
インビトロジェンだったかな。

>>127
>>130
>>131
大腸菌で菌外に放出されると動作が保証されている
シグナルペプチドはありませんが、外来蛋白質を
たとえばアルカリホスファターゼなどのシグナルで
分泌されると3割くらいはペリプラでとまらないで
菌体外までいっちゃいましますよ
ペリプラで泊まってくれたほうが回収楽なんだけどなあ
2L限外濾過とか、うざくって　；＿；
TRXはペリプラで泊まることが多いです
でも大きい蛋白は菌体内でとまっちゃいます

>>132
2L限外濾過はすごいね
塩析とか吸着濃縮でなんとかならないの？

>>132
その分泌シグナルのシーケンスの情報（論文とか）を教えて頂けますか？
ペリプラの系の３倍強の培養をすれば目的量取れるのかな。

しりたい

この本ってどう？

新・タンパク質精製法　理論と実際
ロバート　Ｋ．スコープス／著　塚田欣司／訳
シュプリンガー・フェアラーク東京

値段が4791円で手ごろで読みやすい感じなんだけど

ピアス社の免疫沈降キットについて、使用後の泳動バンドは
抗体と目的のタンパクとが架橋されたものとして検出されるの
でしょうか（抗体のぶん高分子量のバンドがでる？）？

>>134
さがすとそれなりに論文はあるけど
このへんでどうよ？
ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=11922762
ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=8206380

精製する目的タンパク質がプロテアソームのターゲットの場合、インヒビターを
バッファーに加える以外に何か良い方法は無いでしょうか？プロテアソーム阻害剤は
非常に高価なので代案があれば本当に助かります。

>>139
指キチン科されてるの？
だと、EDTAでいいような気が…

>>136
昔、読破したことがある。
いい本だと思うよ。
カラムの原理とか知りたければ、ファルマシアにカタログもらえ。
あれはいい本だった。

>>141
ファルマシア（今アマシャムか）のカタログ昔はただだったみたい
だけどいま有料だよ

>>140
指キチン蚊されてるかどうかは分からないですが、４℃で透析中にも分解を受け困ってます。
ＥＤＴＡはプロテアソーム活性測定キットにも含まれていると思うのですが、効果あるでしょうか？

>>143
指キチン系は4℃では働かないから、指キチン分解とは違うんじゃない？
ただのプロテアーゼ分解では？

なんかフッ素の化合物でATPaseの阻害剤なかったっけ？
それいれたらプロテアソーム系とまるんじゃなかったっけ？

返答ありがとうございます。
プロテアーゼ分解も疑ってみます。現在はシグマのProtease Inhibitor Cocktailを
使用していますが、さらに検討してみます。
ただ、in vitroではプロテアソーム阻害剤であるMG115やMG132で目的タンパク質
の分解は抑制されるので、湯引きチン系でないかと考えていました。
フッ素化合物についても調べてみます。

>>145
pervanadateのことかな？

SDS-PAGEでバンドが予想よりも大きく出てしまいました。
ゲルろ過から推測すると予想の位置にピークが現れるので
タンパク自体がおかしいとは思わないんですが、
SDS-PAGEで大体の分子量が会わないとめんどくさいなーと思いまして。
どうにかなる方法をしりませんか？
というより、どうしてこうなるんでしょう？

よくあることだ。いちいち文句を言う奴もいない。

フォトショで改竄しろよ

組織から分子量50KDa程度の転写因子を抽出するつもりです。
過去の文献ではsample bufferのbaseがHEPESとTrisの２種類あるのですが、
違いはなんなのでしょうか？
あと、ついでなのですが・NP-40, triton-X, SDSの違いについてもお願いします。

>>148
タンパクの塩基性が強い場合、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで流れにくくなることがある。
つまり、分子量が大きい目にでることがあるってこと。

>152　どういう理由？　リン酸化修飾のように
酸性タンパクの移動が遅くなるのはわかるんだが。

リン酸化でバンドがシフトするのは酸性だからじゃないだろ

>>151
HEPESとTris、違いはないような…。
培養細胞とかに、HEPESがよく使われる
印象が個人的にある…。

NP-40とTritonは非イオン性のdetergent。
SDSはタンパクの構造壊したりしますが、非イオン性はマイルド。
NP-40よりTritonX100の方が少し強い
印象が個人的にある…。

>>155
わーい、レスどうもありがとうございます。
Trisを使う理由はpHの安定度(>PBS)を求めていると思うのですが、
HEPESにも何かメリットがあるんでしょうか？
でも、Trisと差が無いなら、慣れているのでTrisを使います。

あと、Westernで予定と異なる位置（高分子の方）にバンドが見えます。
現在のtriton(0.5%)⇒SDS(1-2%程度？)に変えると分子が予定の位置に移行する可能性ってありますか？
それとdetergent濃度を高くした場合、どういう変化が実感できますか？
感覚的な話で構わないので参考にさせて下さい。

今までがRNA主体の実験で、コンタミだけ気をつけていれば結構簡単に行ったんですが、
どうもタンパク実験は経験が少ないことが原因で、その調整の機微が良くわかりません。
インターネットでもそういう感覚的なことは余り書かれてないんですよね。
（そんなのばっかり書かれても困るんですが・・）

>151
あんまり詳しくないですが、Trisは温度変化によってpHが変わり
やすいからじゃないの？Hepesはそんなことないと思う。Hepesの方が
その分高いけど。あとTrisには細胞毒性があると言われている。

Thanks

>120
私は2MEやDTTはICH2CONH2でつぶしてから問題なくBCA定量してます。
96穴プレート中50mM ICH2CONH2 10-30 microLにサンプル2uL加え、
37Cで30-60分処理後、BCA溶液を加えてBSAとサンプルバッファー対照で測定します。
えらい遅いレスですみません。

アマシャムのGSTを切るprescission proteaseって推奨切断条件のNaCl濃度150mMなんだが、
もっと濃度あげても(0.5-1Mくらいに)切れるか知っている人います？
intactのサンプルの可溶化に塩濃度必要なので、、、。

切れるんじゃねーの？

っていうか、そんなの人に聞く時間があったら、
実験したほーが早い。

酵母から組み換えタンパクを精製するときってプロテアーゼ阻害剤は何を使えば
いいですか？とりあえずPMSFはいれてますが。

EDTAとかもどうぞ。
市販の阻害剤セットもあるよ。

ささいな質問ですが。
数mlの吸着系のオープンカラムにサンプルをかけるとき、
連続してサンプルを流していくのと、１カラムボリュームずつ流して
いくのでは吸着効率に差がでますか？
溶出バッファーを流すときでは流し方で溶出効率に差が出るというのを
きいたことがあります。

気にせずガンガン流してる。
どうせリコンビナントだし(自虐)

気にせずに流しているがめちゃめちゃゆっくり流すよう
こころがけている
いわゆるDEAD-SLOWちゅうやつ

昔いたプロテイオス信者はまだ元気かな？

透析以外のバッファー交換の方法でいい方法ありませんか？
液量が多いときに使いたいのです。

>168
大規模限外ろ過
遠心機でスピンダウンするようなのはダメね

低温室でクロマトするのと室温でクロマトするのでは
流速とタンパク質の分解以外でどこが違ってきますか？

>168
バッチ法で　イオン交換
もしくはブチルトヨパールとか
1リットルくらいだったらイオン交換でもいけるよ

カラムってどこのメーカーのがいいんですか？
まあ安いのが一番なんですが

タンパクを抽出する時に、抽出bufferに入れるタンパク質分解酵素阻害剤ってみなさんは何を使ってますか？
私はpefablockを使おうと思っているのですが、これは何mM入れればよいのでしょう？

>>168

サンプル容量の4-5倍の容積のゲル濾過カラムなら脱塩は問題ない。

>>168
>>174
直径５ｃｍｘ１ｍ位の巨大脱塩カラムを使っている人たまにいるよね。
直径１０ｃｍ超の大物はまだ見たことないけど。

大容量脱塩なら透析か限外ろ過がいいとおもうよ
塩析したあと疎水クロマトも考えたほうがよい

透析はサンプルが多いときはさらに大量のバッファーが
必要だから厳しいかと。

容量が大きいのに、ゲル濾過や透析なんて問題外！
限外ろ過は収量悪いし、共存物ですぐ詰まし、大容量にはとても使えない。

やすっちい疎水カラムを、疎水性が弱い順にタンデムにつないでみぃ！
スモールスケールになるし、精製も進むし、脱塩もできるはずだ。

と、何の塩なのか、塩濃度もvolumeも共存物の量・質も目的物の等電点も疎水性も知らずに言ってみよう。
（この辺がわかれば次の手が浮かぶはずだ）

タンパク質をメンブレンにドットプロットして抗体で検出したいのですが，
どなたか良い方法をご存じないでしょうか？

スクリーニングに用いるので，サンプルはwhole cellを溶解したものになります。

何が聞きたいのかわからん。
「良い方法」って何と比較してだよ。
人に聞く前にまず自分で調べて手を動かせやｳﾞｫｹ。

>>179
Dot-ELISAだろうな。

>179
十分良い方法だと思います　どんどんやりなさい

>179
タンパク質をメンブレンにドットプロットして抗体で検出って、自分で方法書いてんじゃん。
がんがんやりなさい

>>181-183
どうもです。

説明が全然足りませんでしたねorz
お聞きしたかった事は，サンプルの調整法です。
whole cellを使うので何らかの方法で，細胞を破壊しなくてはなりません。
手に入ったdot blotのプロトコルは全部，精製したタンパクを使うもので，
果たしてSDSやTritonX100を使ったlysateをそのまま使えるのだろうか？
という疑問があったのです。

今日 whole cellを１）SDS bufferでlyse 2) 1% TritonX100でlyse
3)懸濁液をFreeze/Thawして遠心した上澄みでdot blotをしてみたのですが
３）だけがポジティブでした。
お騒がせしました〜

もりもりやっていきます

sonicやフレンチプレスでやったらどう？

>>184
PVDF膜？疎水結合で結合してるから界面活性剤入りだと
タンパク質落ちてると思う。だから3）だけがpositiveだったのでは？

アマシャムのHitrap NHS-activated を使用していた方はいらっしゃいますか？
抗体をカップリングしようとしているのですがうまく行きません。
コツがあれば教えていただけないでしょうか？
カップリングバッファーのpHは7.5のものを使っています。
よろしくお願いします。

既製品としてはどこのメーカーも扱っていない放射性同位体低分子化合物はどこか受注生産してくれるものなのでしょうか？

＞１８８
セティ　あたってみな

バッファー成分をリン酸Bにしてみそ
>>187

>>190
プロトコルに従って炭酸Bを使っておりました。
試してみますね。ありがとうございます。＾＾

His-TagタンパクがどうしてもNi-NTAにくっついてくれず、FTに出てしまいます。どうしてでしょうか？また、どうしたらいいでしょうか？

>>192
ディネーチャーさせる。
シーケンスを読む。
場所を変える。
俺はプライマー設計間違えて
C末にプロリンタグができてしまったけど、
なぜか収量悪いながらも精製できてしまった・・・

俺の玉は毎日作ってる

>193
Natureの状態で取りたいんですが・・・・・。

Natureの状態？

>>192
タグがタンパクの内部に隠れとるんでないの。
193の言うように場所変えろ。
タグは目印と割り切って普通に精製するのもあり。

GST融合蛋白質の特徴と長所、短所
アフィニティークロマトグラフィーの特徴
ミクロソーム画分に糖蛋白質が濃縮される理由

教えてください。

宿題は自分でやれ

タンパク発現時のairationってそんなに大事？羽付使ったらうまくいってどんぐらい発現量アップするんかいね？

よく先生達が言ってるんですが、『ひとくい』ってどういうことなんですか？
なんだかいまいちわからずにいます。

人間を食糧とするってことだよ。人類最大のタブーだ。

>>201
なんでその先生達に尋ねないんだね？
聞くは一時の恥、聞かぬは一生の恥、ですよ。

そこで人肉食学専攻の漏れ様の登場ですよ

人喰い、非特異、火得意、日と杭

>>192
>> His-TagタンパクがどうしてもNi-NTAにくっついてくれず、FTに出てしまいます。どうしてでしょうか？また、どうしたらいいでしょうか？
（１）His-tagがついているかどうかを確認する。
　　　変成状態でNi-NTAにかける　又は、Hisタグの抗体でWestern
（２）ついていなかったら、プロセッシングを受けている可能性が高いので、場所を変える。
（３）ついていたら、構造的にリガンドに相互作用しにくい場所にあるわけだから、
　　　リンカーをのばしたり、N末、Ｃ末を代えたりする。あるいは、薄い濃度の
　　　変成剤を使用してもよい（条件検討が難しい）。

>>201
『ノンスペ』ってことだよ

案外、流速が早いとかイミダゾールの入れすぎってことはない？
ポンプは使っていますか？

タンパク質精製の方法をご教授お願い致します。
概要でいいのでお願い致します。
私は頭の悪い高卒です。すみません(>_<)

>206
どうしても変成させないで取りたいのですが、Lysis buffer のpHをかえる、またはImidazoleの濃度を変える。
4℃で吸着させているのを、室温にしてみる。
吸着時間をオーバーナイトにする。

こういったことは効果があるのでしょうか？

>>210
横槍ですまぬが、変性条件で取れないものを非変性条件で取れるはずがないと
206は言っているのだよ。206が言ったことを試しましたか？
その報告をしない限り206からレスは来ないと思われるよ。

>>209
いろいろあるからなあ。
概要だったら

クロマトに掛けて分画を取る

って感じ?

すいません、質問させてください。。
塩基性蛋白質をnative-PAGEで分離する場合、Buffer組成はどのようにすればいいのでしょうか？？
できれば濃縮ゲルと分離ゲルの二層系で行いたいのですが。。

そのまま電極だけひっくり返せば？？でもそれだと濃縮ができないですよね。。
分離ゲルのpHをあげて、電極はそのままで流せばいいのでしょうか。。？？

等電点にするかアフィニティつかえば？

>211
すいません。
変成条件では取れました。Westernで確認済み。

抗体作成の際の質問です。
ある蛋白質をHisタグで精製して
500mMimidazole/PBSで溶出しようとしています。
このときこの溶出物をそのままウサギなどに免疫して大丈夫でしょうか
本当は透析したほうが良いのでしょうが、、。

age

>216
うちは250mMまでならOKってことで、PBSで希釈して打ってるよ。

>>218
どうもありがとうございます.
ググって調べると
http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=951
のようにureaとか、sdsの情報はあるのですが、、imidazoleに関してはそういう情報無かったので
当方も希釈して打ってみます。

pGEX-2TとBL-21用いて、GSTタグをつけたタンパクを発現させています。
インダクションをしたサンプルを、ウエスタンして、抗GST抗体を用いて染めてみたところ、
予想される泳動位置付近の前後10〜15kDaに複数の強いシグナルのバンドがでました。
これらのバンドはIPTGによりインダクションされているようで、カラムで精製しても残ります。
シングルバンドにならないのは、何が原因なのでしょうか？
どなたか教えてください。

予想されるものより上のバンド・・・・シャペロンタンパク質？
予想されるものより下のバンド・・・・モノの分解物？

保守上げ

あがってないやんｗ

>>220　大きいほうのは、サイズによっては>>221の言うとおり
GroEL（５７ｋＤくらい）がへばりついてる可能性がある。市販のGroESまぜて消えるかもよ。
小さいほうは、これまた>>221言うとおり分解物の可能性が１つ。
低温キープとプロテアーゼインヒビターに気を遣って、量が変わるか見てみると良い。
あと、Ｎ末に近い位置にＭｅｔがあるときなどに
本来の開始コドンのＭｅｔでなくそこから転写がはじまってしまうことがある。
pGEX-2TってＮ末にＧＳＴだったっけか？ならその可能性はないか。

漏れも修士の頃にＧＳＴフュージョンで苦労して、
組み換えタンパクそのものは実験につかえんかったけど抗原として使って、
できあがった抗体がやけに性能よかったことがあるなぁ。なつかしい。
>>220がんばれ。

>>221
>>224
レスありがとうございます。

>>組み換えタンパクそのものは実験につかえんかったけど抗原として使って、
できあがった抗体がやけに性能よかったことがあるなぁ。

発現させたタンパクは抗原として用いる予定なので、希望が見えてきました。
ウサギさんには申し訳ないけど、近いうちに注射して見たいと思います。
何としても免疫染色まで進みたいっす。

O.D.が１を上回っててもタンパク発現ちまつか？

microheterogeneityっぽいのに当たりました。
まだ理由は分かっていません。
・リン酸化の（程度の）違い
・N-末端不揃い
・糖鎖
などが考えられると思うのですが、それぞれ分離する方法ってあるでしょうか？

質問です！
Lysis bufferってなんでもいいの？どんな種類があるの？

福沢諭吉　「脱亜論」(明治18年)

　日本の不幸は中国と朝鮮だ。
この二国の人々も日本人と同じく漢字文化圏に属し、同じ古典を共有しているが、
もともと人種的に異なるのか、教育に差があるのか、 日本との精神的隔たりはあまりにも大きい。
情報がこれほど早く行き来する時代にあって、近代文明や国際法について知りながら、
過去に拘り続ける中国・朝鮮の精神は千年前と違わない。
国際的な紛争の場面でも「悪いのはお前の方だ」と開き直って恥じることもない。
もはや、この二国が国際的な常識を身につけることを期待してはならない。

「東アジア共同体」の一員として その繁栄に与ってくれるなどという幻想は捨てるべきである。
日本は、大陸や半島との関係を絶ち、 欧米と共に進まなければならない。
ただ隣国だからという理由だけで特別な感情を持って接してはならない。
この二国に対しても、国際的な常識に従い、国際法に則って接すればよい。
悪友の悪事を見逃す者は、共に悪名を逃れ得ない。
私は気持ちにおいては「東アジア」の悪友と絶交するものである。

原文
http://www.chukai.ne.jp/~masago/datuaron.html

たんぱく質の発現につまづいて困っているんですが･･･

あるたんぱく質（約130ｋDa）をｐET28aに組み込んでBL-21で発現→HisTag精製
したいのですが、目的のたんぱく質が発現しません。
条件を色々試したのですが同様に発現はされてませんでした（発現温度を低く設定、
IPTG濃度、低温精製など・・・）。
ちなみにこのたんぱく質自体は酵素活性を持っていることは分かっているので大腸
菌に対して毒性を持っている可能性があるのかもしれません････
なんとか大腸菌で大量に発現させたいのでが・・・

どなたかこういった状況に陥った人がいれば打開策を教えて下さいm(__)m
よろしくお願いします。

>>230
ホストがＢＬ２１では永遠に無理

私も230さんと同じような状態で困ってます
231さん何故ですか？

BL21DE3でないといかんな。
あとBL21DE3Lysにしておけ、リゾチームは低レベルで発現しているT7RNAポリメラーゼの
活性を抑えるのでIPTG添加前の目的単膜質のリーキーな発現を抑制する。

>>231, 233
あっ、すみません。言葉足らずでした
BL21（DE3)とBL21（DE3)ｐLysSを両方使ってだめでしたorz
コドンが合っていることも確認はしたのですが・・・・

大腸菌系ではダメなたんぱく質とかなんでしょうか・・・分からんorz

GloESなんかを共発現させるベクターとかを使ったら大丈夫ですかね？

バキュロかピチアでやれ

>>234
沈殿画分にも発現がまったく(毛ほども）見られない？
His-TagまたはT7-tag（もしついていれば）に対して
のウェスタンでも確認できない？
インダクションのタイミングをかえてみた？

>>230
大きいタンパク質だね。

＞発現温度を低く設定、
インダクション後に温度を下げるのは可溶化のため（インクルージョンボディーに行かないようにするため）だ。
低温だと発現のスピードが遅くなるだろ。
発現しないときに温度を下げては逆効果だろう。

＞IPTG濃度
効果がある場合も、ない場合もある。らしい。

＞低温精製など・・・
本当に発現していないのだったら、精製も何もあったもんじゃないだろう。

＞菌に対して毒性を持っている可能性
毒性があったら、すぐにわかるよ。

＞ｐLysS
あんさんの場合は、やめた方がよいナ。


あんさんの言ってるのは、クマシーでバンドが見えんってことだろ。
>>236さんも書いてるけど、ウエスタンか何かで確認してみ。
ウエスタンでも見えなかったら、、、

分解が早いタンパク質をHisタグで精製したときは、2mM IPTGで30分誘導してただちに
遠心回収、液体窒素、それからグアニジン塩酸入りlysis bufferで壊して
遠心、上清をNiカラムで回収した。その後、SDS-PAGEで切り出し精製。
1000ml培養して最終標品0.1mgぐらいしか回収できなかったが抗原としては十分だった。

E.coli細胞内で分解が早いタンパク質はけっこう多い。

単純に発現量を上げるのなら、MMIやH15を使うのが私は好きだ。可溶化条件はその後だからね。

>>239
くわしく！

>>230
もし毒性が原因なら活性中心を潰した変異体なら出てくるハズ。

BL21DE3 の代わりにOrigami2DE3に変えてみたら　結構いいかもよ
培地や温度条件も結構効く

>>235-242
アドバイスありがとうございます。

ウェスタンではなくて銀染色で一度染めてみることにします。
（ウェスタンに使う抗体がないもので・・・orz）
ところで、クマシーで染まらないたんぱくとかってあるのですか？
今までクマシーで染まらないとかなかったもので・・・・

>>237さん
素人質問ですが、毒性が原因ならすぐに分かるというのは
クローニングしたときにコロニーすら生えないということでしょうか？

なんか知らないことばっか出てきた。。。orz

ある程度タンパクの量が多くないとクマシーでは染まらない

糖鎖がめちゃんこ付いたタンパク質はCBBで染まりにくいかもしらん。

大腸菌使っているって書いてんだから糖鎖修飾は考えない方がいいんじゃね？

>>242
オリガミってなんか生育遅いし蛋白発現量もすくなくない？
俺的には最後の手段のさらにさいごのほう

234 から >>230 ＝ >>234 ＝ >>243 へ。

１）「クマシーでバンドが見えん」ってことはタンパク質が「クマシーで染まらない」ってことぢゃなくて、
目的のタンパク質の発現がバクテリアのタンパク質と同じ程度かそれ以下しかなく、
誘導前と誘導後のSDS-PAGEのクマシー染色像をみても、本当に発現しているかどうかがわからないこと。
だから、銀染しても無意味。
ウエスタンかなにかで特異的に見分けなきゃ。

普通だったらブッ太いバンドになるだろうが、タンパク質によっては微量にしか発現しない場合もあるヨン。

２）毒性について。
クローニング中はタンパク質が発現してないから毒性はないだろう。
本当に毒性があれば、誘導をかけた途端にバクテリアの増殖が止まるか、死ぬよ。
これは本当にすぐにわかる。

ちなみにオレはpLysSなんか使わなくてもリーキーな発現を経験したことがない。

大腸菌株でタンパク質発現→破砕→グルタチオンアフィニティクロマトグラフィ
までの実験をやっているのですが
精製サンプルをＳＤＳーＰＡＧＥで流してみると
精製サンプルがデグってしょうがありません
問題はいろいろあるんですがまず初めに
精製前のサンプルから既に分解が起こってるようなのですが
先達が成功しているプロトコール通りの吸光度・培養時間も守り
温度が原因かと１８℃あたりで長時間振ってみてもうまくいきません
目的タンパクが発現〜ハーベストまでに分解してるなら
インダクションに問題があると思うのですが
なにかアドバイスあったらお願いします

>>249
破菌までに問題があるかどうかはタイムコースをとって目的たんぱくが分解されているのか
どうかを見るヨロシ
破砕した後のバッファーにインヒビター入れてるんですかい？
入れてないなら入れるヨロシ
あと、低温精製は厳密にね

タグをGSTからマルトース結合タンパク質に変えただけで、degradationも無く
単一バンドになった例もあるから、Hisタグ、MBPタグ、チオレドキシンとかいろいろトライしたら？
カルモジュリンカラムで精製する方法とか。

いきなりですみませんが、ウサギから得た抗体を抗原を使って精製した後に、
免疫沈降を行いたいと思っているのですが、評判のいいキット類ってありますか？

>247
origami2(DE3)はkan感受性になり　異様に生育が早い
タンパク発現も良好　rosetta-gami2は遅い　発現量も少なめ

>>250
>>251
ありがとうございます　参考にします

247
>>253
情報サンクス　この業界日進月歩だから楽しいな。試してみるよ。

>254

同じ抗体でIP＆Westernをしたいと解釈して良いのか？

策1.　普通にIP。で、Westernの一次抗体は予めビオチンでラベルしておく（易）
策2.　抗体カラムをつくる。（ちょっとマンドクセ）ピアスのSEIZE Xとかのキットだ。
ww.funakoshi.co.jp/h_news/0506/050627_PCCs.php
抗体の配向性を保持しつつ固相化できるのがウリだが、自作も可能だ。
ちなみにDSSは-NH末端やKなどのアミノ基と結合するから、
抗体によっては結合が無くなったりするから、
そんときは板の住人に聞いてみると良いだろう。

すまん、まちがえた
>>252
だった。

すいません板違いかとは思いますが…

おまいらＧＦＰの発色機構教えてもらえませんかm(__)mどうしてもわからないんです。。

さげ

>>258
クロンテックのマニュアル落として嫁。

>256
ありがとうございました。今から実験やるので参考にします!

精製ではなく除タンパクの質問です。
申し訳ないが、教えてください。

糖の入った水溶液をＨＰＬＣで測定するのですが、教授から前処理は
スルホサリチル酸を加えて除タンパクをしろといわれました。
このスルホサリチル酸とは、硫安のような化学的作用があるのでしょうか？
初めて使う試薬なので、よく分からないのです。。。
教えてください。

まずは教授に聞けよ

>>262
除タンパク処理にはそのほかに
TCA沈殿という方法とフェノール処理という方法が一般的です。
スルホサリチル酸はこの二つをあわせたような感じとかんがえれば
よいと思います。

Hisタグ蛋白質の精製についての質問です。
Niアフィニティーゲル（レジン）を用いて目的タンパクを
回収して、イミダゾールで溶出した後、イミダゾールを除去したいのですが、
安価な除去カラム、もしくは別にお勧めの方法があれば教えてください。

>>265
http://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=61
俺はこれ使ってる。楽に脱塩できるよ。

>>265
濃縮カラムで濃縮→フローを捨てて欲しいbuffer加えて再び濃縮→濃縮+脱塩できてる。（°Д°)ｳﾏｧ

HiTrapは液量が多い場合濃縮しなきゃいかんけど
比べたら透析よりも便利だなあ

今ってリフォールディング以外で透析することって珍しくないかい？

濃縮だって7mLとかを一回でやれるカラム発売されてるし

>269
確かにそうかもしれん。昔は100 mL程度のサンプルを透析膜で
脱塩／緩衝液の置換、さらには濃縮も透析膜一本でやっていたんだが。
つい一ヶ月前に透析膜をウチのラボで頼んだんだが、業者に珍しがられたわい。
「いやぁ。まだ使っているセンセェいるんですねぇ」と。

DNAの切り出し精製を透析チューブでやってますが何か？

＞＞２６７
濃縮カラムにAmiconの限外濾過カラムはいけますか？

>>272
タンパクが捕まるんなら大丈夫。GO!!

>>270
しかし透析はいろんな技術を加えると使える技術であることは確かなんですよねぇ。
最近じゃヌクレオソーム再構成とかを透析使ってやってたりするし。

今じゃ、もしかするとウレア使ってのリフォールディング法なんて知らない学生がいるやもしれんなぁ。。。

>>273
ありがとう！検討してみます。

>>264
遅レスですが、ありがとうございます。
ＴＣＡ＋フェノールみたいな感じなのですか。

>>274
それはどうだろう？
大腸菌発現系で封入体確定したタンパク質の精製だったら、
学生さんでも知っているんじゃないかな？

ウチでは封入体タンパク質のリフォールディングは
ArgやGSH/GSSG、PEG、Ureaなどを用いた緩衝液を数種類準備して
Rapid dilutionで条件を検討してるよ。
アフォかヴァカかと思うかもしれんが、活性を保ちつつ消耗作業を避けて
モノを多くとる為には条件検討は避けられないからね。

シクロデキストリンとか使ったことある人いる？

>>278
Cyclodextrinのう。
こいつはタンパク質表面にくっついているGuHClやSDSを奪うんだっけ？
疎水性相互作用に関連するとBBRCのレポを読んで、条件検討のとき
5mMの濃度で単独および0.5M Argに対する併用効果を見たが、
効果はDextrin ＜ Arg ≦ Arg+Dexだったな。
まぁ、CHCl3で夾雑物排除後にGu-HClで溶かしてBradfordで蛋白定量と
SDS-PAGE展開して見た程度だから少々の誤差はあるが。

タンパクを1mMIPTGで誘導→6時間培養したヤツをSDSでやったんですけど、
バンドがあるにはあるが、発現量異様に少ないんですけど・・・・思い切り大量培養→回収がんばる!!
しかないですかね？


何か良い打開策あったら教えてください。お願いします。

基礎的な逆質問。
6時間の誘導は適切なの？温度は？
タイムコースをとった上で6時間培養が適切だったのならば仕方ないよね。
培地組成を変更して菌体数を稼ぐか、大量培養でGoするくらいしか策はないよねぇ。
たしか、類似の内容がこの板の過去で議論されてた筈。

こちらはpETマニュアルに書いてある通りの方法(1 mM IPTG、37℃で1-1.5時間の誘導）
でしっかり発現タンパク質が確認出来たよ。
といっても、5 mm幅のレーンで1 mm程度の太さしか無かったけどね（しかも薄い）。
でも、SDS-PAGEではしょぼしょぼのバンドだったのが、同じサンプル量を
アプライしたWesternではバンドモッコリ＆誘導前後の差異が確認できて勘当しますた。

262に続いて除タンパクについての質問なんですが
こちらは過塩素酸で行うということになりました。

サンプルの血液が非常に微量で中和の判定方法が難しいのではないか。
はて、どの割合で過塩素酸を加えればいいんんだろう。

本を探しても載ってないなぁ、というとこなのですが、これは少しづつ加えるしか
ないですか？

>>282
割合について。
タンパクのサンプル1/10量の70%過塩素酸を加えてMix、遠心を10-15分。
DNAのフェノクロのような感覚で行えば良いでしょう。

詳細は指導教官に仰ぐと良いと思いますが、「ソースは２ちゃんで…」というと
小一時間rw)なことになるかもしれませんので.
Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention Vol. 8, 507-512
マテメソの組織からの蛋白と核酸抽出方法をソースにあげればよいでしょう。
では良い一日を。

たんぱく質の精製に関して質問（ ノ゜Д゜）

あるたんぱく質の精製なんですけど、不溶性画分に行くことが分かっています。
なので、不溶性画分を0.5%Triton/TH洗浄溶液で3度洗浄した後、その沈殿を
ウレア8Mを加えて攪拌後、rt/1h靜置しておき、遠心して上澄みと沈殿をSDSした所
何故か、まだ沈殿の方にタンパク質が存在しております。（・∀・?

8Mウレアは室温に保温しておいたﾔﾂを使っているのですが、これが問題なのでしょうか？
何かこうやったらinclusion bodyから取り出せるよ、という知恵があればご教授ください。
よろしくお願いします。

>284
最初に不溶性画分を分離するときに、遠心をきつくやりすぎないようにする。
細胞壁や核酸のようなタンパクを巻き込んでしまうものは酵素で消化しておく。
8 Mウレアを加えたら、物理的によく懸濁する。
それでもだめだったら疎水性相互作用でアグってるのでもうだめ。

早速のお返事�d
＞細胞壁や核酸のようなタンパクを巻き込んでしまうものは酵素で消化
この部分の酵素とはDNaseでしょうか？
たしかに不溶性画分にウレア加えて放置したあとの溶液はドロドロなんです。
もしかして、精製不能でしょうか・・・・

>284 、286
粘度が高い理由は核酸の混入と思われます。
それから0.5% Triton-X100濃度は適正なのでしょうか？
こちらは2.5%(v/v)でNaCl 0.5Mを含む
20 mM Tris-HCl, pH 7.4(4℃のとき)でやっています。

それから284さんのタンパク質は2 M程度のUreaに耐性を示すようですね。
だったら、それを逆手に取ってUrea洗浄をお勧めします。
2 M Urea溶液で洗浄を数回します。そうすると核酸やら他のタンパク質がカットされ
目的タンパク質はいつも沈殿します。そうやってPureなインクルージョンボディを稼ぎ、
クロマトワークを減らすのも良いのでは？

あと、目的タンパク質にシステインの架橋がいくつもあるのならば10 mM DTT
ジチオトレイトールで還元させてやると良いでしょう。
ちなみに当方の蛋白もDTT無しでは6 M Gu-HClに不溶です。
当方はUrea洗浄→6 M Gu-HCl（塩酸グアニジン）, 10 mM DTTで溶解させてます。

>>287さん
激しくお返事�d

0.5% Triton-X100濃度に関しては以前成功したのでこの濃度を使っていただけで、深い意味は
ありません。モット高い濃度でやってみます。
Urea洗浄というのは思いつきませんでした。確かにUrea耐性は結構強いようなので、これをまず
試してみようと思います。ありがとうございました

>288
知ってるとは思いますが、CHCl3（クロロホルム）を使う技もあります。
プラスミド抽出につかう要領でクロロホルムを用いて中間層をゲットする方法です。
もとは電気泳動のサンプル濃縮だったのですが、Triton-XやUrea洗浄にも応用可能です。
書き込みが長くなる恐れがあるので、リクエストくだされば書き込みます。

混乱させてしまったらゴメンナサイ。

>>289
クロホルを使ってのタンパク回収情報禿げしくキボンヌです!!
ただ疑問なのはフェノールを使わなくてもタンパクって変性するものなのでしょうか？
また核酸なんかと絡まっているたんぱく質をフェノールだけでゲットできるとか・・・？

精製して巻き戻しもしなければならないし時間もないという切迫した状況なので、
退役水平さん、どうぞよろしくお願いします。

＞核酸なんかと絡まっているたんぱく質をフェノールだけでゲット
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↑
　　　　　　　　　　　　　　　　　フェノールでなくてクロホルですorz

>288
いわゆるタンパク質の有機溶媒沈殿（お手軽だけど蛋白変性は否定出来ない）です。
モッコリとした白いタンパク質中間層の状態は蛋白表面の水分子が
奪われた状態と見なして良い、すなわち変性状態と解釈しております。

やりかたは簡単。Total Volの1/10-1/5相当のCHCl3をぶち込んで
お手てでシェイクし、遠心後に中間層を集めます。
で、もう一度D.W.を加えてシェイク＆遠心。最後はアセトンで下層CHCl3を溶かす＆
タンパク質を沈殿させるだけです。

当方のやり方を示します。まずは菌体を集めた後に
1.　20 mM Tris-HCl, pH7.4(4℃)で懸濁。で、total volumeを見積もる。
2.　Total volumeの1/10量の5 M NaClを入れる（final 0.5 M）。
3.　最終濃度0.2 mg/mLとなるようにリゾチーム投下。On ice 60-90min放置
4.　Total volumeの1/10量の25% Triton-X100投下(final approx 2.5%)。
5.　On ice 30 min放置
6.　20,000 x gで遠心分離。ここで、どろどろの物質（核酸）が上清に*。
7.　沈殿物もなにやらどろどろしていると思う。
8.　気にせず2M Urea, 0.5M NaClを含むTrisでよくよく懸濁。
9.　20,000 x gで遠心分離。上清をとる*。沈殿を集める。
10.　まぁだどろどろしてると思う。
11.　気にせず0.5M NaClを含むTrisでよくよく懸濁。（Total1.2 mL/1.5 mLチューブ）
12.　Total Volの0.2 mLのCHCl3を加え、遠心。
13.　上清を捨てる。中間層＆下層（CHCl3）にD.W.を1.5 mLの目盛までUP。
14.　遠心し、上清を捨てる。中間層＆下層（CHCl3）にアセトンを1.0-1.2 mLの目盛までUP。
15.　良く撹拌。CHCl3がAcetoneに溶解するのが分かる筈。
16.　遠心して沈殿ゲット。

最後に：*で示した上清はSDS-PAGE&Westernのときのサンプルとして用います。
各行程の結果を占う為に役立つ筈。こいつらもCHCl3で蛋白抽出しておくのが良いでしょう。

長レスすまんね。

>>292
詳細なプロトコールありがとうございます。
早速明日にでも試してみようと思います。
UreaやGlu-HCl以外にもこんなInclusion　Bodyからの取り出し方が
あったとは知りませんでした。


まだまだ勉強不足を痛感・・・・○|￣|＿

あほな質問ですが、精製したIgG(ウサギ)のSDS-PAGE（還元状態)での
分子量知っているかた教えてください。今５０キロに単一バンドがきれいに見えているんですが
誰か同じようなことやった人いませんかー？

>293
あ、わすれていた。Ureaが多いとCHCl3でUrea析出が見られます。
D.W.洗浄を忘れないで下さい。

CHCl3を用いる方法は市民権を得られていないので、
従来の方法より有効であることをお示しになることが不可欠です。

御指導を仰ぐ先生への説明はもとより、なにより貴方ご自身の知識と自信に
繋がることでしょう。

質問です。

膜タンパクの精製をやっています。
カラム精製で外れてしまった複合体のコア部分と周辺サブユニットを再構成させたいんですけど、
やはりDetergentがあるせいか通常の方法（透析膜で脱塩しながら）では上手くいきません。

どなたか良い方法ご存知で無いでしょうか？

ホイミの呪文って、いつつかえばいいんですか？

巻き戻しにはベホマズンくらい協力じゃないとだめ

>>297-298
っ【ザオラル】

大腸菌を使ったタンパク質発現。
いくつかのvector, host, 温度,IPTG濃度を試しましたが、発現しません。
他に何か振るファクターはあるでしょうか。
もしくはよいvector,hostを教えていただけないでしょうか？

当然シーケンスは確認してあります。1500bp。500aa。

>>300
in vitroのキットでもどうでしょう？

あと499A.A.ではないでしょうか

>300
温度、時間、IPTG濃度、Host、ベクターの全てを振ってもだめなら
T7系の発現系ではなくコールド系ベクターはどう？
TAKARAで確かキャンペーンしていたから買い時かも。

こちらも300さんと同じような兆候を示すタンパク質があり、
TAKARAのコールド系に切り替えます。
このタンパク質、645アミノ酸残基でCysが21個で1つのドメインに集中し、
推定pIが9.8で糖鎖無しの、見るからに厄介そうな輩です。

>>296
タンパク質濃度が薄いとサブユニット再構築は上手くいかないよ。酵素／基質のES比を例に想い出してみて。
あと、見落としがちなのがEDTAなどのキレート剤やNaCl濃度。
もしコア部とサブユニットをそれぞれ単離精製できるのならば、ビアコアで結合を確かめてみたら？

簡単にビアコアとは言えど、金チップに結合させるのに結構苦労するような気がするがなぁ･･･

質問なんですが。。。。

上の不溶性画分からのたんぱく質精製読んでて不思議に思ったんですけど、
ＳＤＳなどの強い界面活性剤使って変性させるとか、それでも無理ならさらに
熱をかけて完全に変性させるとかって方法はダメなんでしょうか？
そんでもって、上にあるようなたんぱく質濃縮法とかでＳＤＳなんかを取り除いて
カラムで精製。。。みたいな。

どうせ、後にリフォールディングさせるならかなり強い変性剤でやってしまえば
簡単なような気がするんですが・・・
素人質問で申し訳ないですが教えて下さいm(__)m

>>305
熱変性は耐熱性菌由来蛋白の精製なんかで使うことがあるらしい。
うちのラボで扱ってる蛋白も熱に強いものは加熱して精製できるものがある。

ただ目的の蛋白を熱変性させてその後refoldってのはどうだろう。
理論上は可能だろうけど、ゆで卵を生卵に戻すようなもんだからな…
強い変性剤については簡単に除去できるならいいけど、SDSなんかは透析程度じゃ抜けないだろうね。
でも目の付け所はいいんじゃない。

>305
リフォールディングがそんなに万能なら苦労しない。
一時期新しいリフォールディング法を模索したがうまくいかなそうだった。
そもそも昔のRNaseなんかでAnfinsenのドグマが成り立つなんて言ってたが
複合体として他と相互作用する分子なんて、単独の状態の最安定構造と
実際に複合体を形成している構造が違うはず。
こうなると単純なリフォールディングは意味無し。

>252, 294
還元状態で約25 kDa（軽鎖）+約55 kDa（重鎖）
非還元で150 kDa程度のはず？

>305,306
SDS除去は(CHCl3/MeOH/D.W.=1:4:3 v/v)によるPhase separation&
MeOH沈殿が有効。Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, 344-349

>307
禿同。だから抗体作製のみに大腸菌系を用いることもある。ケースバイケースだよね。

The Protein Purification Facility
ttp://www.ls.huji.ac.il/~purification/index.html

最近このサイト見つけたんだけど結構有名なのかな？
タンパク質の精製はもちろん発現から関連情報まで幅広くカバーしてるから
初心者はもちろんタンパク質の扱いに慣れてる人でも結構役立つように
思うんですが。
あと各社から出ているマニュアルがダウンロードできるんですが、それに
混じってアマシャムが売ってるタンパク質精製の各ハンドブックのＰＤＦ
もダウンロードできるんだけどいいのかなあ（もちろん英語版だけ）？
自分はハンドブック全部ダウンロードしちゃったけど。

CNBr-sepharoseにリガンドを結合して、アフィニティーカラムを作ろうと
しているんですが、sepharoseにリガンドが結合しているのか確認する目的で、
sepharoseを一部とって、SDS-PAGE-BUfferを入れて、ボイルした後、
PAGE-Gelに流しても、リガンドがさっぱり見えないのですが、
これって、もしかしたら一端、リガンドが共有結合してしまえば、
いくらぐつぐつ、煮ても、溶出しないってことなのでしょうか？
リガンドがどれくらい結合しているかをモニターする方法って
あるんでしょうか？

>>310

おひおひ、当たり前だろ。
通常は、吸着前のbuffer中のタンパク濃度、
吸着後のbuffer中のタンパク濃度を測定して推測するだろ。

>>310
君は底なしの馬鹿だな。

>310
釣り？

分子量マーカーって高いよね。
自作している人っている？

してますが、なにか？
市販品も持ってるけどね。

>>315
手持ちの精製済みタンパクを混ぜるだけ?
汎用的な自作マーカーってある？

ttp://66.102.7.104/search?q=cache:89_jcO4iOTIJ:www.ktokai-u.ac.jp/~nougaku/Bio/araki/page.htm+&hl=ja&start=1&lr=lang_ja
ここにあるのと同じ感じで作ってる
だいたい一回作ると2-3年は持つ。昔は市販品なんて買えなかった。

最近は市販品も安くなったけどねぇ

>>317
ありがとう！

誰か他に自作マーカー作ってる人いたら、教えて

質問なんですが、、、、
Ｇタンパクみたいな7回膜貫通型受容体の膜タンパクの融解法だれかしりませんか〜
western blotするのに色々な融解法を試したのですが
全然上手くいかなくて、いい方法知ってる人いたら教えてください

>>319

バカ。三量体G蛋白質は７回膜貫通型受容体と結合して活性化されるんだ。
G蛋白質は表在性膜蛋白質、７回膜貫通型受容体は内在性膜蛋白質だ。
前者は弱い界面活性剤で水溶性になる。後者はTriton-X100とかデオキシコール酸とか
膜リン脂質を可溶化する条件できるような強めの界面活性剤でないと無理。

>>318
指先ちょろっと切ってやったら色素入りのが出てくるけど？
いい具合にラダーになってくれる。

Triton-X100とかデオキシコール酸とか膜リン脂質を可溶化する条件の
できるだけ詳しい量とか濃度とかわかりますか？

RIPAバッファーと同じ組成でいいんぢゃねぇか？
>TritonX-100、デオキシコール酸の濃度。

RIPA： 1 % [w/w] Nonidet P-40, 0.5 % [w/v] sodium deoxycholate,
0.1 % SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, ,,,

ありがとうございます。それとなんどもすみません。
この組成で、融解法って超音波や凍結融解をすればいいのですか？？どんな方法を使ってますか？？

ピペッチングで簡単に分散させたあと、氷中で冷やしながら小さなスタラーバーを回して
20-30分mixしたら？その後、10万xgで30分遠心して上清画分を使う。

わかりました。1度その方法で試してみます。いろいろありがとうございます。

ＷＢなら普通にＳＤＳ入りバッファで溶かせよ。

アフィニティ・カラムから８Ｍのureaを使って溶出して、
各フラクションをSDS-Pageで展開して、タンパクのバンドを、
proteomic analysisにかけようとしています。
アフィニティ・カラムから溶出したフラクションは、TCA沈殿などで
濃縮してPageにloadするものなのでしょうか？
そのままのっけるにはボリュームが多いのです。

AGE

>>828
濃度が十分あれば一部をそのままロード
そのままロードしてタンパク量が足りないのなら濃縮してロード

うへぇ、とんでもないﾛﾝｸﾞﾊﾟｽ
>>330は>>328ね

>>828期待age

>濃度が十分あれば一部をそのままロード
そのままロードしてタンパク量が足りないのなら濃縮してロード

いえ、そのままのっけるには、ボリュームが大きすぎるので、濃縮を考えているのですが、
で、8M ureaの溶出液を直接, TCA沈殿してもいいのでしょうか？
それとも透析して、Ureaを除去するべきか？
あるいは違う濃縮法を選ぶのか？
という質問なんです。

とりあえず、８ＭのＵｒｅａを使って溶出という時点で理解不能。
ＮｉカラムなのかＧＳＴからむなのか何のアフィニティーか分からないとアドバイスできんぞぇ

んで、一度もＳＤＳすらやっていないのに書き込まない方が良いだろう。
いくらこちらがアドバイスしても君が濃縮濃縮言っている時点で会話にならん。
ちなみに８Ｍureaで溶出したと言っているが、本当にそんな条件で溶出したとして
SDS流すと、塩濃度の濃さからまともにPAGEできんと思うがな。


ということで、勝手にやってみれば〜〜('A`)

>>328　は、思うに…、
エサのタンパクでアフィニティーカラムを作って、
それに結合するものを回収してみた。
あわよくばMS/MSとかで面白いもの同定することを夢想中。
…なのかなぁ？

だとしたら濃縮せずに出来るだけたくさんloadでつね。
1枚のGelに全サンプルのっけようとしない。
濃縮でおいしいものどっか行くかも…。
Ureaは気にしない。
バンド薄かったら、スケールアップして再アフィニティー。

＞SDS流すと、塩濃度の濃さからまともにPAGEできんと思うがな。

ハア？Ｗ
あんまり度素人のいうことを当てにするなＷ
まず、8M Ureaの溶出液を透析して、その後、
アセトンか、何かで濃縮してPAGEに流してみればいい。

>>328
SDS-PAGEのとき、Ureaサンプルであれば電気泳動展開のときに影響は特に及ぼしません。
実際に「Urea-SDS-PAGE」というものがあり、15 kDa以下のペプチドの分離に効力を発揮します。
通常のSDS-PAGEに比してシャープな分離能が魅力です。

それから、Ureaサンプルをそのまんまボイルするとタンパク質のカルバミド化が生じ、その結果PMF解析に
影響を及ぼす危険性があります。還元状態で展開するのであれば、R/T、10 mM DTTで
30分程マターリと還元することが肝要です。

濃縮はゴールデンスタンダードと思われる方法でトライするべきです。
やってみなければ何も分かりませんし、329-335の皆様もアドバイスの
しようがありません。

３２８は何故うれあで溶出するのか？

BL21とかJM109でHistagタンパク発現させてHistag抗体でウエスタンしたとき、
４５ｋ付近にバンドでません？発現タンパク質じゃない　たぶん大腸菌由来の

偶然見つけたんですけど、おもしろいスレですね。
そこで質問させていただきたいんですけど、自然食品で最もタンパク質摂取
できる食品はなんだと思いますか？

肉

卵が良い。

yeast extractが良い。

食品成分データベースで、タンパク質含量が特に多い物を調べると、
肉類/ぶた/[その他]/ゼラチン(87.6%)
卵類/(鶏卵類)/卵白/乾燥卵白(86.5%)
乳類/(その他)/カゼイン(86.2%)
魚介類/(さめ類)/ふかひれ(83.9%)
豆類/だいず/[その他]/大豆たんぱく/分離大豆たんぱく (79.1%)
魚介類/(かつお類)/加工品/かつお節 (77.1%)
魚介類/(いわし類)/たたみいわし (75.1%)

>>340

タンパク質重量の他に、必須アミノ酸含量とかアミノ酸量バランスも重要で
過剰なアミノ酸摂取は通風とか腎臓に負担がかかったり代謝異常が起こりそうだが。

水分の重量比はばかにならないので
スキムミルク
乾燥卵白
干し肉

筋トレしてるんですけどプロテイン買うのはもったいないんで、タンパク質は
納豆で摂取してるんですけど、どうですか？納豆にもけっこうタンパク質入ってる
と思うんですけど、どうですか？

>347
ウエイトトレ板にいくといいよ。

生物板のみなさんの見地からみてどうですか？

>349
生物板の見地ではおよそないのだが、
プロテインを買ったほうが、タンパク質量あたりの単価が安い。
納豆はアミノ酸の偏りがあるし。

なんか精製されたサプリメントばっかり摂ってると良くないような気もする
納豆いいじゃないか。ミネラルとかビタミンも摂れるし。

納豆菌ってオートクレーブじゃ死なないらしいな

ttp://www.uploda.org/file/uporg177463.jpg
（´・ω・） ｶﾜｲｿｽ

>>353のデスクトップ画像に見覚えのある方、山田ウイルスに感染しています。
山田ウイルスに関する詳細と駆除方法は下記サイトを参照して下さい。
ttp://www3.atwiki.jp/yamada/

また下記スレに来ていただければ、駆除のお手伝いをします。
夏も終盤（´・ω・） ｶﾜｲｿｽ 山田ヲチスレ 160
http://tmp5.2ch.net/test/read.cgi/download/1124785717/

ttp://www.uploda.org/file/uporg177463.jpg
　　　　　　　↑
ワードの文書ファイル……　　~$folding.doc
ﾃﾞｽｸﾄｯﾌﾟのｼｮｰﾄｶｯﾄ………　　Laboratory

（´・ω・） ｶﾜｲｿｽ

ttp://www.uploda.org/file/uporg177489.jpg
ttp://www.uploda.org/file/uporg177498.jpg

ウイルスバスターやNortonではほとんど検出されない新種かも
（´・ω・） ｶﾜｲｿｽ

だれか凸かけてやって下さい
下手すりゃ実験内容も分かってしまいますがな（´・ω・）ｶﾜｲｿｽ

>>352
生菌はもちろん、胞子も死にますよ？

（´・ω・） ｶﾜｲｿｽ

教えてください！
あるタンパクを発現できなくてこまっています。
ものはpETにつながっていてシーケンス済み。
発現したタンパクは１５Kぐらいになるはず。BL21(DE3)pLysSコンピに形質転換。
Amp入り２×YT　３７℃で培養。OD=0.4ぐらいでInduction。IPTGは0.4mMです。
Inductionかけてから３時間　３７℃で回収しています。
何種類か同じやり方でやってたけど、なぜだか今やっているのだけ発現しない。
なにか気づいたことあれば教えて下さい

どこまでトラッキングできてんの？
RNA発現みてる？
フレームは？配列確認した？

全部確認済みです。
ボスは一概にここが悪いとか言えないといってたくらい。
なぜなのかわからんのですわ。
inductionしてSDS−PAGEしたら発現してるか普通はわかりますよね？
けど、わからなくでも発現してることってありますかね？
前に一度そういうのあったから・・・まぐれだと思うけど。

染色法変えて見たら？
で、RNAの発現まで確認できてんのに染色されないってこと？
WBしてみれば〜

封入体になっているのでは？
WBのときに確認してけろ

まれにちゃんとやっても発現しないことがある
トランスフォームからやり直すとよいかも

>inductionしてSDS−PAGEしたら発現してるか普通はわかりますよね？

すべてわかるわけではありません。
キレイに見るならWBがベストでしょうね。

て言うか、CBB染色で見えないくらい発現が低いことなんてよくあるだろが。

３６０です。
文献などではInclusion bodyにいくとなっています。
だから超音波処理してPAGEしたんですけど、それでもそれらしきものなくて・・・
WBしてみます。

オレの経験だと、
inclusion bodies に行く奴は発現量が高い奴が多くてウエスタンするまでもなくCBBで見える。
っちゅうか、
whole extract 流してウエスタンしなきゃ見えん奴の場合、不溶性画分に行っている奴ってinclusion bodies 形成しているんかな？

オレだったらpLys をまず止めてみる。pLysって発現をサプレスしてるでしょ。

RNA発現の確認なんてしないな。

ダメだったら最初に戻るというのも１つ。
元cDNAからpETへのサブクローニングを自分でやったのなら、インサートが入っているコロニーをもう１つ２つ保存してるでしょ。
そいつらのシーケンシングとタンパク質発現チェックをするかな。
もしくはサブクローニングまで戻るか。
もしここまで戻るなら、他のコンストラクトも同時に作ってみる。
例えばＣ末ヒスタグをやってたならば、Ｎ末ヒスタグも同時進行で作るとか。

手っ取り早いのは、コンストラクトをかえたり、ホストをかえたりすることだと思うよ。

>368
詳しいお話ありがとうございます。
いろいろ検討の余地はありそうですね。頑張ります

>Amp入り２×YT　３７℃で培養。OD=0.4ぐらいでInduction。IPTGは0.4mMです。
Inductionかけてから３時間　３７℃で回収しています。

室温でONで振ってみたら？　３７℃で分解が起きやすいのかもしれない。
つうか、２−３ｍｌの培養でインダクションかけて、それを
SDS-PAGEbufferで煮て、５分の一くらい流して、westernしてみたら？
His6タグの抗体使って少しでも誘導されていなければ、
コンストラクションか、plasmidのdeletionとか疑った方がいい。

>ものはpETにつながっていてシーケンス済み。
>発現したタンパクは１５Kぐらいになるはず。BL21(DE3)pLysSコンピに形質転換。
>Amp入り２×YT　３７℃で培養。OD=0.4ぐらいでInduction。IPTGは0.4mMです。
>Inductionかけてから３時間　３７℃で回収しています。

発現に時間がかかるとか、すぐに分解してしまう「レアもの」だとか。
プロテアーゼインヒビターを入れてみほ。
あとは、低温培養かなー。
15-20℃とかで培養してみると、
低温で安定なタンパク質だと結構発現したりするもんだぜ。
だけど、すぐに壊れちゃう可能性あるから、氷冷で迅速に。

分解しやすい10kDaぐらいのHisx6タグ付きペプチドを精製したことがある。
2mMIPTGで45分、37℃で誘導、ただちに短時間で遠心集菌して6Mグアニジン塩酸入り破砕緩衝液を
加えて急いで超音波破砕。1万xg遠心１０分、上清をそのままニッケルカラムで精製。
500ml,2xYTで培養して最終精製標品は200μgぐらいだった。

普通の破砕緩衝液だと菌を壊して精製操作しているあいだにどんどん分解して
いたらしくてほとんど回収できなかった。

今使っているSDS-PAGEの装置、買ってきたゲルを使うと、
端っこがつぶれて異様な形になるんだけど、皆さん
どこのメーカーのもの使っていますか？
良い市販ゲルがあれば教えて下さい。

>373
NuPAGE(Invitrogen)

　　　【在日が帰国しない・帰化しない理由】
------------------在日特権 ------------------

地方税→　固定資産税の減免
特別区→　民税・都民税の非課税
特別区→　軽自動車税の減免
年　 金→　国民年金保険料の免除
　　　　　　 心身障害者扶養年金掛金の減免

都営住宅→　共益費の免除住宅
　　　　　　　 入居保証金の減免または徴収猶予

水　 道→　基本料金の免除
下水道→　基本料金の免除
　　　　　 水洗便所設備助成金の交付
放　 送→　放送受信料の免除
交　 通→　都営交通無料乗車券の交付
　　　　　　 JR通勤定期券の割引

清　 掃→　ごみ容器の無料貸与
　　　　　　 廃棄物処理手数料の免除
衛　 生→　保健所使用料・手数料の滅免
教　 育→　都立高等学校
　　　　　　 高等専門学校の授業料の免除

ほとんどの日本人が知らないでしょう。

＞３７４
Xcell surelockですか。ちゃんと加圧機構を考えてますね、これ。
タンパク、DNA両方行ける。使い勝手はどうですか？

170 名前： 堀江 投稿日： 2005/09/04(日) 05:33:46
すごく基本的なことなんだけど、SDS?PAGEってめんどくさくない？
手がびしゃびしゃ？になるし、端のウエルはつぶれて変な形になるし、
まっすぐに泳動した試しがありません。
使っている泳動装置のモジュールが変形しているのか、ゲルが悪いのか？
皆さんどこのメーカーの装置使っていますか？自分はbioradなんだけど。

360からの報告待ち

【在日に日本国民の血税が３兆円使われている 】

在日６０万人、韓国系金融機関に１兆６０００億
北朝鮮系金融機関に１兆４０００億円　公的資金投入
合計３兆円。
在日朝鮮人１人あたり、５００万円
４人家族なら、２０００万円のプレゼント

外国人登録者数（平成13年）
総　　　数　　1,778,462
生活保護人員数　 （厚生統計要覧13年度）
日本国籍を有しない外国人　421,651人
在日外国人の4人に1人が生活保護対象者？
なんだこれは・・・。
そして、、、在日６０万人のうち２０％の人間（421,651人）が、
何もしないで月に約２３万円もの血税を摂取しているという事実。
掛けあわせると・・・
月当たり　96979730000　970億円
年間当たり　970億円*12ヶ月　1兆1640億円
医療保険控除等を含めると、、、もう見当もつきません…。

島津が最近出した「バキュロ系in vitroタンパク質発現キット」ってどうよ？

>>375
思い切りすれ違いだけど、それほんと？

初めて大腸菌発現系たちあげるんですけど、プラスミドとホストは何がお勧めですか？
カタログ見たら目移りしてレストランでメニュー見て迷ってるみたいな気分です。
MW60,000くらいの可溶性の酵素です。-S-S-が分子内にあります。
N末シグナル配列はとっちゃうんですか？
ちなみにありふれたタンパク質なんですが、まだ遺伝子を持ってないです。
ちゃんと釣ってくるもんですか？それとも買っちゃうのが普通ですか？
動物由来です。
急ぐ場合・急がない場合、予算、その他で変わってくると思いますが。。
よろしくお願いします。

>>380
無細胞系ってそのうちやってみたいですがいろいろでてますね。
・大腸菌
・ウサギ
・小麦胚芽
・カイコ
で
Transdirect, Puresystem, RTS, PROTEIOS, ....どれが良いんでしょうねえ。。

S-S結合の在る分泌タンパク質は動物細胞系でやれ

分泌タンパクではないです。
でも-S-S-あったら動物細胞系ですか？
どっかで大腸菌でできたという話があったので。。

＞N末シグナル配列はとっちゃうんですか？


こういう記述があんのに、分泌タンパク質ではないの？

だいたい、大腸菌の細胞質内は大むね還元状態なんでS-Sは形成されず-SHでないの？

済みません分泌ですた。
大腸菌では無理ですか？

分泌でMWもわかっててSS形成することも分かってる････
つまり論文出てるやつでしょ？
ならその通りにやった法が早くね？

それより遺伝子持ってないのかよ!!
どうすんのよ？まずそっからｼﾞｬﾏｲｶ??

論文出てますが。古かったんで折角やるなら今時な感じのが使いたくって。。
遺伝子は売ってるみたいです。お値段いろいろ。

ちょっ、おま･････(゜д゜；)
今時の感じって･････
こちとらどれくらいタンパク発現精製に苦労してると思ってんだヽ(ﾟДﾟ; )ﾉｺﾞﾙｧ
精製できるんならいいじゃないか!!
精製できたから、もっと単純化から最近のヤツ使ってみるとかよぉ

まったく、これだから今時の若いモンは困る･････

いや、若くもないんですけど・・・生物の研究室じゃないんでゼロから立ち上げるなら何が良いかなと。
じつはそのタンパク自体にもこだわりがないんです。

ターゲットにこだわりがなかったら精製も大変かと。

もし物理化学の方法論とかがやりたいんだったら
簡単というか安定なタンパクにしなよ。
発現精製ではまるから。

Origamiって大腸菌株だと、細胞内が酸化的状態なのでS-S結合もできるってさ。

>>391
ゼロから立ち上げるならここであれこれ聞くより
近所のラボで生物系やってるとこにお世話になるのがいいよ

Origamiで劇的に可溶化されたことねぇなぁ（´・ω・）

インクルージョンボディに入ったら、グアニジン塩酸で可溶化して、
アスパラギン、グルタミンの溶液中で透析したらどうよ？

Origamiと可溶化とはそもそもあんまり関係ないのでは？

>>392
発現が簡単なタンパクで同じことできないか考えてみます。

>>393,395
カタログにそういうのもありますね。
いろいろあって迷うんで、とりあえずこれ持っとけ、って系はなんでしょう？
pETナントカ + Ecoli. BL21
あたりでしょうか。
で、うまくいかなかったらOrigamiをあんまり期待しないでw 試してみると。。

>>394
やっぱそうですよねー。
実験は楽になりそうですが・・・

なんか質問する方が要領を得ずすみません。

pETはいるでしょ。
pcoldと、古典的なIPTGベクターをそろえておけばいいんじゃない。
大腸菌を数種そろえておけば、今後のラインにも使えるし。
あとはいる量だけど、これは、精製度、回収率である程度読めるはずでは。
インクルージョンボディーは余りお勧めではないです。
手法が決まっていれば、いいけど。

pcold、使ってみたん？
どうやった？

pcoldって本当にいいんか？
高いし今ひとつ信用できんしで手を出せないよ。。。
だれか感想キボンヌ

pGEXとpMALあたりがスタンダードなんでないの？

pETはT7ポリメラーゼを発現するBL21DE3でないと駄目だから、あんまし好きくない。

Gatewayっていい？

普通だとほぼ封入隊のタンパクを、
pCold使ってやっと今日精製できますた。
もっとも漏れのばやい他の改良点が奏功したんだけど…。
でも、15℃できちんと誘導できる点はいいと思われ。

>>381
http://www.geocities.co.jp/WallStreet-Bull/2487/

膜たんぱくって大腸菌で発現させて精製できる？
情報きぼん

膜タンパク質ってどうやって精製しているの?
何か特別な工夫や、アグらないようにうまく精製途中で
界面活性剤を加えているとか?
それだけじゃ難しいのかな?

活性を保ったまま
タンパク質の濃縮をしたいのですが、
硫安分画とエタノール沈殿、どちらがいいですか？

pCOLDやっぱ　難しいところでは働いてくれるのね　でも高い　自作してます

>408
普通　硫安が先でしょ
でもエタノールが簡単だから条件検討してくれ

>>406
膜貫通ドメインとか存在してるから大腸菌で精製するの難しいってことか？



やったことねぇから('A`)ｼﾗﾈ
age

>>406
精製出来るかどうかは
やってみないとわかんない。
他人に他の幕タンパクのこと聞くより、
おまいの幕タンパク関連の論文調べた方が早いと思われ。

>>407
まず遠心で幕画分回収。
detergentで幕タンパクの火曜化。
その後カラムなどで精製。

GST融合蛋白質を大腸菌で作ろうと思うのですが
敢えて封入体に融合蛋白質を持っていきたい場合はどのような
条件検討をすればよいのでしょうか

>>412
適当に37度でドカッと誘導かければ

風乳体なら
Hisタグのほうがいいかと

ここは専門的なようなんで俺は場違いかもしれんが、ここでちょっと話題に
なってる糖鎖を飲み始めて調子がいい。血糖値も下がったし。これから
爆発的に流行するんじゃないだろうか。どんどん研究して今は不治の病
といわれているような病気にも応用できるようにしてくれ！
ちなみに筋ジストロフィーとかダウン症とかにも効果があったらしいが
すごいね。

免疫沈降で使うProtein Gは抗体以外のタンパクにも非特異的に
くっつくものなのでしょうか？これが原因でネガティブコントロールで
不必要なタンパクが降りてくることはあるのですか？

くっつく。
降りてくる。

pColdでの発現はBL21(DE3)でも問題ないですよね？
T7うごいちゃいますが。

>>417
無問題

>>418
謝謝

　 /￣/　―/―　　／　 ‐７￣　　　￣￣￣　　, ニ,　/ フ
. /￣/ 二二/二 ／/ ―‐/―‐　　　――　　 /二/ /＿）
/―/　ヽ＿/　　 　/　＿/＿　　＿＿＿＿　/-‐l　/

　　　 ／￣⌒ ⌒￣｀丶、
　　／　　　　　　　　　　 ＼
　/　　　　　八　　　 　　　 ヽ
　l　 ／ /／　 ＼ヽ ＼　　　|
　i　 ／━　　　　 ━ ＼ 　　!
　 V　（●）,　　､（●）､ ::V /　　＋
　　|　　 ,,ノ(､_, )ヽ､,, 　 .::|/
.　　|　　 r=ﾆこﾆ=ｯ　　.:::|　+
　　 ＼　 ｀ー-‐‐'´　.::／　　　　　+
,,.....イ.ヽヽ､ー--‐―ノﾞ-､._
:　 　| 　';　＼_____ ノ.| ヽ　i
　 　 |　　＼/ﾞ（__)＼,| 　i　|
　 　 ＞　　 ヽ. ハ　 | 　 |｜

はじめまして，生化学初心者です．

植物の膜タンパク質で，透析したあとに
アフィニティゲルを通したのですが，
収率がめちゃ悪かったんです．
MS/MSでみてみたら，他の結合タンパクもひっかかってませんでした(ガクシ)

そういえば，アフィニティゲルに，サンプル通してる時に
徐々にゲルが硬くなっていって，
滴下スピードが遅くなってたなと思いだしました．
もしかして，ゲルにちゃんとサンプル結合してなかったのかな?
とおもいました．

超低レベルな質問ですみません，よろしくおねがいしま〜す．

私信

2000年の名簿が出てきました。
みなさん、メアド変わってませんか？

>>421
個別の原因解消ではどうにもならんレベルだ。
まずはボスに相談しろ。

>>421
何をしたのか、したいのか、よくわからん。
特にこの辺
>植物の膜タンパク質で，透析したあとに
>アフィニティゲルを通したのですが，

「膜タンパク」「ゲルが硬くなって」というキーワードからして、
タンパクとかアグってんじゃない？
bufferにdetergent十分入ってんの？

タンパク精製初心者です。
質問させてください。

今度、血清タンパクの精製をすることになり、とりあえず、

硫安分画→イオン交換orアフィニティor疎水性→ゲルろ過

という形で進めていこうかと思っています。
そこで、血清タンパクを精製するのに適しているアフィニティや疎水性クロマト用のカラムを
幾つか教えていただけないでしょうか。できれば、HPLCで使えるやつがいいです。

よろしくお願いします。

どんな蛋白にも寄りますが、取っ掛かりとして、
論文、特許からヒントを得てみてはどうでしょう。
特に特許は眉唾ものもありますが、ある程度はわかります。
アフィニティーでは、ブルー、ヘパリン等々がよく使われてます。
疎水では、Butylか、phenyl でしょうか。

>>426
お返事ありがとうございます。

精製したい目的のタンパクというのは特にありません。
なので、血清タンパクをできるだけ吸着してくれるようなカラムであれば何でもいいです。
液クロ以外にも血清タンパクを精製する方法について、うまい方法がありましたら教えていただけないでしょうか？
タンパクは変性させずに回収したいです。

よろしくお願いいたします。

アルブミンを吸収してくれるカラムなら売ってるよ。

すいません！！
SDS-PAGEで、ものすごくバンドがシフトしてしまうのですが。。。
21.5kDaのものが15kDa付近に出ます。
SDSでは10％くらいの誤差はでるときいていますが、30％くらい出てしまい
困っています。どなたかこれくらいバンドシフトが起こった方っていますか？
また、これの同定法ってやはりMSかペプチドシークエンスしかないのでしょうか？
もちろんプラスミドはDNAシークエンスにかけて、モノであることがわかていますが。

疎水性が高いとか酸性残基ばかりなんでは？

>>427
とりあえず、アルブミンを除くことからでしょうか。
検出その他で必ず邪魔になります。
アルブミンは、blueで吸着します。（他の血清タンパクもつきますが、、、）
全てのものを拾うのであれば、
（濃縮→）凍結乾燥→ゲルろ過である程度分画。
あとはアッセイしながら（陰、陽）イオン交換、HPLCで分取、分析

>>429
サンプル溶液の影響として、
サンプルの塩濃度が濃い、薄い→脱塩してみる。
還元剤のかけ方→SDSPGE中でも酸化します。還元性蛋白では注意する。
phast systemがあればいいけどね。

UREA入りSDS-PAGEだと相対分子量が比較しやすいという。
タンパク質の変成作用が強いからか？

>421の初心者です。
>423,424さま、ありがとうございます。

細胞をつぶしてる時にdetergent(CHAPS)入りのbufferで、やってます。
量がすくないのでしょうか？

アフィニティゲルが硬くなるのは、
膜のせいですか?
アフィニティゲルを操作してるときのbufferには、
detergentは入ってないです。

>>431
レスありがとうございます。
大変勉強になります。

アルブミン以外の血清タンパクを精製していく際、
まず初めにアフィニティー・ブルーカラムでアルブミンと他のタンパクを分離してから
精製を進めていくというのが一般的ということですか。

あと、ゲルろ過やイオン交換についてなのですが、どの手法が精製のどの段階で
主に使われるのかという感覚が分かりません。ファルマシアのカタログでは、ゲルろ過は
精製の最終段階における手法であると書かれていますが・・・。

最後に、血清タンパクの精製についてお勧めの論文があれば教えていただきたいです。
長々すみません。

アルブミン除去ならいろいろあるよ。
ttp://www.prophoenix.co.jp/?ID=5940
ttp://www.cosmobio.co.jp/product/products_PSI_20050322.asp
ttp://www.technochemical.com/pierce/protein/page/prtoseek/prtoseek.htm
ttp://saj.ds-navi.co.jp/~saj/sigma/life_science/ppba_igg_removal/

>>421 & >>434
こらこら、膜タンパクなんだろ？
detergentって何してるか勉強してね。
そんな状態でよくMS/MSまでやらしてもらえたね。
おまいの指導凶漢はどうなってんの？

>>435
最終工程で使用されるゲル濾過は微量の２量体、多量体を除くのが目的。
蛋白濃度がそれなりにあり、分子量である程度分けたいときにゲル濾過を行います。
ゲル濾過は、ゲル担体の1-5%しかアプライできませんから、蛋白濃度は濃いほうが効率
がよくなります。
それぞれのゲル担体の組み合わせは、主に、サンプルの塩濃度、蛋白濃度によって決めます。

>>436,438
お返事ありがとうございます。
とても勉強になりました。
また何かあったら教えてやってください。
ありがとうございましたー。

>>421
>>423の言うとおり、指導教官に尋ねるレベル。
なんともいえないつうか、チェック項目が多すぎる。

可溶化した段階（以降、各操作段階）で、目的タンパク質の存在は確認されているの？
収率が悪いというけど、処理した量は充分なの？
（スタートの量が少ないと収率はどうしても落ちる。）
透析するときは臨界ミセル濃度に気をつけている？
カラムの担体（樹脂）の選択は適性なの？
界面活性剤が無いと可溶化しないタンパク質だとすると、カラムと界面活性剤の
相性があるけど、それは大丈夫？
バッファーの組成とカラムの組み合わせは合っている？
ｐHや塩濃度は適性？
流速は？
「ゲルが硬くなる」が目詰まりすると言うことなら、夾雑物は遠心なり
0.22または0.45で除いている？
目的タンパク質はフロースルーに漏れているの？
それともカラムに強く吸着して溶出されないの？

ざっと挙げてこのくらいかな。
あと、精製途中で分解した可能性もありますね。

質問させてください。

pCold-TF(大腸菌シャペロンの一種らしいです)でやっと可溶化でき、それをthrombinで切って、
ニッケルにかけFTに回収しようとしたところ
タグとの分離ができていませんでした。（FTにもElutionにもバンドあり）
また、イオン交換や分子量分離でも無理で、
条件として界面活性剤(1% tritonまで)や、塩濃度(2M NaClまで)を試してみたのですがダメでした。
TFタグとの相互作用が関係していると思うのですが、
界面活性剤と塩濃度以外で相互作用をなくさせる方法などありましたら教えてください。
TFタグにはシステインはありません。
NMR構造解析をやりたいので変性はさせたくないです。
目的タンパク質に活性がありませんので。

よろしくお願いします。

>>441
質問はもっと推敲して理解しやすい文章で書いてくれ。
まず第一歩は、主語を省略せずにきちんと書くこと。

それはさておき、目的蛋白質がFTに出てくるなら、それを回収、濃縮して使う
ってのはダメなの？
あと、ヒスタグがきちんと働く範囲内でpHを変えるとか。
カラムと条件（界面活性剤、塩濃度、ｐH、グリセリン濃度）を変えて、
タグの方をFTに回収するという方法も採用できるんでないか？

monoPだったら分かれるかもしれない。
ただし、原理上（ポリマー製のバッファを使う）分子量２万以上じゃないときつい。

NMRだったらラベルにかかるお金の都合上、収率高くしなきゃいけないしな。

ベタだけど、いったんタグ付きのままイオン交換等で精製して、
余計な夾雑タンパクを取り除いてから、トロンビンの消化時間を長くするとか
そんなのはどうでしょう。

>441
ATPとマグネシウム入れてインキュベートするか、
ATP-アガロースという担体があるからそれに通す。
もしシャペロンとしてがっちりくっついているのならそれで取れるかもしれない。
ただし、取れたと同時に沈殿することがままある。

>441
私も同じようなことが起こりましたが、ヘパリンカラムで分離できました。
比較的近い条件で出てきますが、塩の勾配をゆるーくまたは平行に
するなどやってみたら分けられました。イオン交換ではどうやっても
完全には除けなかった。
でも、444さんのおっしゃるとおり、ATP-マグでインキュベートは
有効かもしれません。私も次はやってみよ。pCold-TFってホントにすごいよ。

>>442
漏れは441の文でだいたい何をしたか推測できるが…
というか、442のレスの方が　ハァ?( ゜Д゜)。

>>441
TriggerFactorはATPase活性ないはずなんで、ATPは関係ない。
GroEL介してくっついてんならATPで取れるかもしれないけど、そじゃないしょ。
この場合、問題はTFタグがFlowthroughに出てくることでしょ。
たぶん一度Niカラムで精製後、Thrombin処理してるんだと思うけど、
基本的なことだけど、Thrombin処理後のNiカラムに逝く前に、ちゃんとImidazole除いてる？
そもそも、ちゃんとThrombinで切れてるの？
あと、本当にくっついてるか知るためにも、イオン交換など他のカラムを通してみて。

Nickelカラムを使うときにEDTAとか還元剤を入れるというポカはしてないだろうな？

>>441
タグはニッケルカラムに残ってるんだよな？
タグと切り離したはずの本体がカラムに引っかかるのが問題なんだよな？
まさか>>446の解釈のように、タグがFTに来るってことか？

言葉足らずで申し訳ありません。
まさかこんなに親切に意見してくれとは思わず、簡単に書いてしまいました。
お許しください。

発現させたタンパクは
Hisタグ-TFタグ-thrombin site-目的物（65kDa）
という列びになっています。
まず、TFタグと目的物とのfusionとしてタンパクを発現させました。
それをNi-NTAにかけたところタンパクがElutionに出てきたので回収しました。
その後、PBで透析し、thrombin処理しました。
大部分は切れたのですが、すべてを切断することはできませんでした。
48時間処理でも切れ残りがあったので、ひとまず24時間で処理しました。
確認の方法はSDS−PAGEで行い、バンドが３つありました。(fusion;65k、タグ50k、目的物;15k)
それを再びNiにかけ、目的物をFTにたのですが、FTにもElutionにもバンドが３つ出てきました。
ですが、Elutionに50kのバンドが強く出ていたので、FTをもう一度Niにかけてみました。
が、やはりFTにもElutionにもバンドが３つ出ました(今度はFTもElutionもすべてのバンドの比がほぼ同じでした)
Elutionも同じ結果になりました。
以後はTritonやNaClの条件を変えたり、イオン交換や分子量精製を行ったのですが、
どうやっても、バンドが３つでてきてしまうといった感じです。

色々なご意見とても参考になります。
片っ端から試してみようと思います。

441です。449も同じです。

追加ですが、タンパク量が少なくなってくると、
NiでもQでもElutionのみに３バンドが出てきます。
(fusionとTFタグのPIは5くらいで、目的物のみは8くらい)
この結果から、目的物がタグに引っ張られてるんじゃないかと思い
現在は、タグと目的物を分けられるような(相互作用を消せるような)条件検討を行っています。

ひとまず頑張ってみます。

これに対する解決策ではないけど、Ni-NTA担体に結合した状態で
thrombin加えればステップがひとつ減るような気がするのだが、
いかがなものか。

>441
Niカラムを結合より少し高いimidazole（１０−２０ｍM)で洗ってみた？
もしくは樹脂にノンスペについてる可能性もあるから，樹脂を変えてみるとか．

封入体を可溶化したいんですが、
ドロドロになってしまいます。
何か良い方法おしえて！

>>453
タンパク扱わない研究室にいる？

ソニックをちょっと（数秒程度）かけるか、DNase�TとRNaseA（安いやつでいい）で核酸を壊せばいい。

これらをするタイミングは細胞（または菌）を破砕した直後に行うほうがいいらしい。

精製ﾏﾝﾄﾞｸｾ､ﾔﾘﾀｸﾈ｡

80kDaのものが120kDaの位置に出る事だってある。気にするな。
チャージの多いタンパクならずれて当たり前。

GSTが二量体っていうけど、解離定数はそんくらいなの？

すみません、質問させてください。
文献を読んでいたら、疎水クロマトにphenyl sepharose CL-4Bを使用したとありました。
このCL-４Bというのはなんでしょうか？
この実験を追うことになりそうなのですが、
うちはもともとタンパクをほとんどやらないラボなので全く見当がつきません。
アマシャムのAKTAはを借りることになりましたが、どのカラムを選べばいいのやら・・
どなたか助言お願いいたします。

セファロースの繊維の編み目のサイズとかグレード、あるいは固さの指標である
クロスリンクの頻度など。

CL-4Bとは担体の特徴（粒子の大きさとか）ですね。
プレパック・カラム（カラムに充填したもの）ではなく、
レジン（ビーズ）として売られているので、
自分でカラムに詰めるか、オープン・カラムとして重力に任せるかしたのだと思います。

フェニル・セファロースについてはここをご参照ください。
http://www.jp.amershambiosciences.com/tech_support/msds/chr/chr8.asp
http://www.chromatography.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/(FileDownload)?OpenAgent&docid=22721E84D2DC7DFEC1256F5E000DBE6B&file=71708000AD.pdf

ÄKATAで使うなら、カラムに詰めてあるものも売られています。
http://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=159

Ä:KTA ね。かっこわるい。

>>459-460
回答ありがとうございました。

とりあえずamershamの疎水カラムセット（HiTrap）で試してみて、
Hiprepにスケールアップという方向でいってみようかと思います。

硫安分画でちまちま硫安入れるのがつらいんですが（やたらVolumeが多いもので）
なんとか楽になりませんか？

哺乳類細胞に発現させる目的で、ある蛋白の遺伝子をpcDNA3.1Hisに
クローニングしました。
手っ取り早く、きちんと蛋白が発現しているかどうか確かめたいんですが、
大腸菌の系でIPTGで誘導して、発現を確認することはできますか？
Invitrogenのカタログでは、pcDNA3.1は哺乳類細胞発現用ベクターと
いうことになっているんだけど、T7プロモーターがついているし、
大腸菌でも発現できるのかなーと期待しています。
どなたか情報をお持ちの方、教えてもらえませんか？

シャインダルガーノ配列とかが開始Metの近傍にないと、
難しく無いか？

>>465
さっそくのレス、どうもありがとうございます。

試しに大腸菌で発現させてみたんだけど、SDS-PAGEの泳動像では、
IPTG誘導下と非誘導下で違いがないんですよね。

が、これだと大腸菌系ではそもそも発現しないからなのか、
コンストラクトに問題があるからなのか、よくわかりません。
やっぱり哺乳類細胞にtransfectして、
時間かけて確認するしかないのかな？

新しく作ったコンストラクトの場合、
発現確認はどのようにするのが一般的なのでしょうか？

>>466
Hisタグでウエスタン。

>>467
どうもありがとうございます。
とりあえず、Hisタグのウエスタンをやってみます。

ただ気になっていることは・・・
大腸菌用ベクターで発現させた場合は、
いつもSDS-PAGEだけで確認しています。
今回、もしHisタグのウエスタンで検出できたとしても、
PAGEレベルでは確認できないということは、
発現量が著しく低いことになります。
が、この場合、発現効率が悪い理由が、
大腸菌で発現させたからなのか、
コンストラクトに問題があるからなのか、分からないですよね。

・・・と、堂々巡りなんですが（笑）、
とりあえずHisタグのウエスタンをやってみます。
どうもありがとうございました。

他に情報をお持ちの方、教えていただけたらうれしいです。

>>463
俺はカラムにかける時に使うポンプ(なんて名前だったっけ？)使って放置してるぞ。
30~60分位かかるのでその隙に飯食いにいってる

硫安の粉を１０分ぐらいかけて、ゆっくり少しヅツ入れればいいぢゃん。

>>464
>>456の言うとおり、SD配列が開始コドン上流に無ければ発現しないよ。
て言うか、何を確認したくてそんなことやるの？フレームがあってるとかそういうこと？
大腸菌で発現が良いとか悪いとかと、その同じコンストラクトで培養細胞できちんと発現
するかということの間には、ほとんど何の関係もないだろ。繰り返すが、フレームが合ってる
かどうかとかそういう低レベルの話を除いては。まさか、フレームが合ってるかどうかを
わざわざそんなやり方で調べないよな。

>>466 時間かけて確認て、トランスフェクションして抗Hisタグ抗体でウエスタン一発やん。２日で結果出るやん。

シャインダルガーノ配列とコザック配列をタンデムに繋げた開始Metにする
ことで大腸菌でも真核細胞でも翻訳可能なmRNAを設計することは机上では可能だが、
ちまたでは見た事無いなぁ。

>>469, 470
リッターレベルの溶液ですので出来ればこれ以上溶液を増やしたくないです。
かといってちまちま粉末硫安を入れるとえらい時間がかかります。

pET32っていっぱいタグがついているんですが、どうやって精製に用いるのですか？？
His-Tag2つも付いてるし。。。
初心者ですみません(T_T)

>>470
100mL程度の小スケールで落ちるところを確認すれば？
70-90%で落ちるようだと、１−５Lスケールではこの方が楽です。

ヒント：砂時計

皆さんの中でＮ末にGST、Ｃ末にHisタグを付けて精製している人はいますか？
もしよければそのような例の載っている文献等も紹介してくれると助かります

pETベクターにて蛋白発現をしています。
IPTG濃度、培養温度、ホストなどなど、いろいろ試しましたが
どうしても可溶性へと移行しないようなのでベクターを変える
ことにしました

で、可溶化させるタグとしてNusAってのがあるんですが、
これってほんとに可溶化するんですかね？？

可溶化しやすいって話だけども
やってみないとわかんないよ

私のはtagなしHis,GST,MBP,Nusいずれも駄目だった
結局巻き戻したけど

>>478
お、なんか同士が。
当方も困っております。Ｎ末にGST,Ｃ末にHisをつけて精製してます。
2xytでカルチャー　＞　集菌してＰＢＳでソニケーション　＞　遠心
＞Niカラムにかける　＞50mM imida wash ＞500mM　imida elute
＞CBBでチェック　＞ final　5mMになるようＤＴＴadd
＞GSTセファロースと混和

と、ざっとやってるのですが、ＣＢＢでチェックまではうまくいくのですが（多分）
そこからＧＳＴに結合してくれません。なぜかフロースルー画分に出てしまいます。
なにかアドバイス及び、プロトコールあればよろしくお願いします。
ちなみにＧＳＴのみの精製だとうまくいくのですがデグラデーションバンドが
でるのでこうしています。
一応目標は「目的蛋白質のみ、ＧＳＴセファロースに引っかけること」です

言い忘れましたが
一応トラブルシューティング的なものはクリアしてるつもりなのですが
http://www.jp.amershambiosciences.com/tech_support/faq/chm/aff_fp.asp
何か有りましたらよろしくお願いいたします

GST融合タンパク質だと立体障害かなんかでグルタチオンビーズに結合しにくいことがある。
ビーズとタンパク質を混ぜて,NaOHを加えてpH11ぐらいにして変性させた後、
撹拌しながら少しずつ中性にしていくとビーズとGSTが結合する場合がある。

つかぬことを伺います

ベクターはpColdI,宿主はBL21の系で

大腸菌をLBで培養→IPTGで蛋白発現誘導→遠心して集菌→PBSで懸濁→超音波破砕→遠心して上清採取

以上の工程で粗蛋白液を調製したのですがNi-NTA agarose(Qiagen)にかけても問題なく精製できるのでしょうか？

pHはNi-NTA agaroseに使うbufferが洗浄、平衡化、溶出でそれぞれ8.0,6.3,4,5,
PBSが7.3（上清はまだ測ってませんけど多分このくらいではないかと思います）
なのでちょっと気になります

あと誘導かける前の大腸菌培養時のODが1.0超になっていたのですが発現誘導に影響はないのでしょうか？

>484
素人さん？

まず粗タンパク液の調製って、それは普通の方法なので問題ないも何も・・・
あえて言うならDTTやEDTAをたっぷり加えているとうまくいかない。
PBSのpHだとツキはあまりよくないのでオススメはしない。
Tris (できればHEPES) pH8.0を多少加えればよいのではないだろうか？

pH変えて溶出するのはなぜ？
論文に載っているのか知らないけれど、普通はイミダゾールで溶出する。
pH変えるとタンパク質が変性することがあるため。

O.D.1.0以上はあまりいいとはいえない。タンパク質によっては発現しなくなる、
というかpColdはアンピシリン耐性なので、発現するタンパク質がある程度
毒性を発揮するものならば、プラスミドが落ちてしまう。
カラムにかける前に、発現しているかをチェックすることが必要。

His tag蛋白の精製なんですが・・・
大腸菌から導入してNiカラムで抽出すると、目的の蛋白以外にも複数のバンドが
出てきます（ノンスペがくっついてしまう）目的の蛋白はHis tagウェスタン
で確認済みです。HPLCかけると何十ものピークが・・・

みなさんどう対処していますか？自分としては
�@lysis buffer,wash bufferに10mM程度のイミダゾールを入れる。
�AHPLCのピークをちまちま集めてMS
を考えているのですが・・・他にいい知恵があったらご教授ください。

hisの精製だけならそんなもんだろ。

>>486
TagはHisしかついてないの？

lysisには10mM imidazole入れようね。
washは20mMで 4〜5回やってみれ。
eluteは250mM

washingのさいにNaClを1M入れてガンガン洗う。

http://may.2chan.net/27/src/1131857574097.jpg

有り難うございます。ついでに教えていただきたいのですが、

抽出はやっぱり大腸菌導入からやり直したほうがいのでしょうか？
それとも先に抽出したノンスペいっぱいのsolutionを透析してlyophilize→
その後また低容量イミダゾール入りlysis bufferで溶解→Niレジンとmixして
抽出してもいいのでしょうか？

ウェスタンでは目的蛋白はばっちりでているのでもったいないと思っているのですが・・・

>>488、489
washに20mMイミダゾールと1MのNaClを一緒に入れてみてもいいんですかね？

教えてくれくれ君で申し訳ありません。お願いします。

やってみたら？ダメなら捨てればいいし、
ダメじゃなきゃ使えばいいでしょ。

でもさ。とりあえず、マニュアル読んで、
もーちょっと適当に色々実験できない？

>491に書いてあることも、>486に書いてあることも、
大腸菌の培養から始めても、せいぜい
1週間、はやくて3日やそこらで結果がみえることでしょ。

Hisx6タグ&Ni-NTAビーズの場合、washingのさいに6Mグアニジン塩酸でガンガン洗う、などという極端な操作もOK

変性させてもいいって条件のときのみだがな

>486
まず発現条件を検討して発現量をアップさせることをおすすめします。
ウエスタンでばっちり見えていても発現量が十分とは限らないので。
Ni-NTAやGSH-sepharose精製は簡単らくちんなのですが、目的蛋白質が
ある程度ないと、のんすぺ結合共雑物の森に埋もれてしまいます。
大腸菌体をSDS-PAGEして目的バンドがはっきり確認できない場合、
そのままでは精製にとんでもない苦労がかかる可能性大です。

>495追加
大腸菌破砕して上清に来る量をアップさせてくださいね。
念のため。
発現量上がっても沈殿ばかり増えるなら、別の手を考えないといけませんです。

おまいら、大量培養はどうやっている。
こちとら、2LのTBが3本がせいぜいだ。
もっと省労力的かつ省資源的に
菌体を得る方法はご存じない？
ミニプラントで連続培養できればいいのだが。

諸君　私は実験が好きだ
　諸君　私は実験が好きだ
　諸君　私は実験が大好きだ

　徹夜実験が好きだ　やっつけ実験が好きだ　追試実験が好きだ　コントロール実験が好きだ、
一発実験が好きだ　条件検討実験が好きだ　低温室実験が好きだ　無菌実験が好きだ　動物実験が好きだ
　大学で　研究所で　病院で　農場で　工業試験場で　水産試験場で　民間研究所で　海外で　保健所で　プレハブ実験室で
　この地上で行われる　ありとあらゆる生物実験が大好きだ
　試験管ラックにならべた　カラム操作実験の一連の溶出産物が、糞データと共に俺の作業仮説を吹き飛ばすのが好きだ
　何週間もかけて用意した実験サンプルが、一瞬の不注意でまったく無駄になったときなど　心がおどる
　卒業研究生の操る　研究室共用PCが何ヶ月もため込んだ実験生データをデリートしてしまうのが好きだ
　悲鳴を上げて　据えた匂いのする院生部屋から泣いて飛び出してきた後輩　あざ笑う時など　胸がすくような気持ちだった
　陰険な聴衆をそろえた　プログレスリポートセミナーで奴らが俺の発表をズタズタにこき下ろすのを聴くのが好きだ
　データの全くない修士論文発表の院生、なんのデータも示してない汚いスライドを指して
何度も何度も無意味な主張を繰り返している様など　感動すら覚える
　敗北主義の　D5論文無し先輩が教授に引導を渡されて寂しく机を片付けて出ていく様などはもうたまらない
　せっかく学位を取ったのに、どこにも就職口が無く、ODばかりが研究室に貯まってゆき、雰囲気が我慢できないほど悪いのも最高だ
　哀れな入ったばかりの院生達が　ろくに理解もしていない覚えたばかりの実験系で
健気にもデータらしき結果を出してきたのに、意地悪な先輩どもが木端微塵にけなし倒した時など　絶頂すら覚える
　せっかく書いた論文草稿を教授に見せて滅茶苦茶にされるのが好きだ
　必死に守るはずだった秘密実験が教授にばれて、そんな無駄なことが辞めろとそのままお蔵入りした時は　とてもとても悲しいものだ
　有名ラボの物量に押し潰されて　アイデア勝負なんて言うのも恥ずかしいことだと知るのが好きだ
　投稿した論文が競争相手の研究者まわされ　ひたすら重箱の隅をつつくようなコメント付きでリジェクトされるのは　屈辱の極みだ

　

　この地上で行われる　ありとあらゆる生物実験が大好きだ
　試験管ラックにならべた　カラム操作実験の一連の溶出産物が、糞データと共に俺の作業仮説を吹き飛ばすのが好きだ
　何週間もかけて用意した実験サンプルが、一瞬の不注意でまったく無駄になったときなど　心がおどる
　卒業研究生の操る　研究室共用PCが何ヶ月もため込んだ実験生データをデリートしてしまうのが好きだ
　悲鳴を上げて　据えた匂いのする院生部屋から泣いて飛び出してきた後輩　あざ笑う時など　胸がすくような気持ちだった
　陰険な聴衆をそろえた　プログレスリポートセミナーで奴らが俺の発表をズタズタにこき下ろすのを聴くのが好きだ
　データの全くない修士論文発表の院生、なんのデータも示してない汚いスライドを指して
何度も何度も無意味な主張を繰り返している様など　感動すら覚える
　敗北主義の　D5論文無し先輩が教授に引導を渡されて寂しく机を片付けて出ていく様などはもうたまらない
　せっかく学位を取ったのに、どこにも就職口が無く、ODばかりが研究室に貯まってゆき、雰囲気が我慢できないほど悪いのも最高だ
　哀れな入ったばかりの院生達が　ろくに理解もしていない覚えたばかりの実験系で
健気にもデータらしき結果を出してきたのに、意地悪な先輩どもが木端微塵にけなし倒した時など　絶頂すら覚える
　せっかく書いた論文草稿を教授に見せて滅茶苦茶にされるのが好きだ
　必死に守るはずだった秘密実験が教授にばれて、そんな無駄なことが辞めろとそのままお蔵入りした時は　とてもとても悲しいものだ
　有名ラボの物量に押し潰されて.／￣￣￣￣￣￣￣＼ アイデア勝負なんて言うのも恥ずかしいことだと知るのが好きだ
＼投稿した論文が競争相手の研｜　 うるさい黙れ　　 ｜ リジェクトされるのは屈辱の極みだ 　／
　　￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣＼＿＿＿＿＿＿＿／￣￣∨￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　∨　　　　　　(ﾟдﾟ　)
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これからHisタグ付きのタンパク質の精製を行う者ですが、イミダゾールについて教えて下さい。
みなさんは、どこ（会社名）のどの製品（cat.Noなど）を使用していますか？
例えばシグマのカタログを見ると、いくつか載ってはいるのですが、どれを選べばよいのかわかりません。

皆様有り難うございます。
＞＞492
おっしゃるとおりです。「とりあえずやれ」ってことですね。
マニュアルには色々書いていてどれを使うか、もしくはどれとどれを組み合わせるか
が解らなかったもので訊かせていただきました。

＞＞495
大腸菌培養の条件は導入時間、導入温度、IPTG濃度を振ってウェスタン上一番
発言量が高い条件でやっています。TBは12L作って集菌しました。sonicationも
やっています。
Ni 抽出産物をSDSにかけると目的蛋白付近にバンドは出ているのですが、その
他にも多量体や、わけわからんバンドも見えます。多量体はDTT処理でなんとか
しようと思っていますがそれでもHPLCではピークの山です。

ゲル切り出しって手もありでしょうかね？

↑K崎さんがDicer全長を大腸菌で発現させようとしているかのようだなｗ

冷蔵庫が爆発しますた

No royal road to protein purification.

サンプルを硫安30％にして疎水カラムに通したところ、分離はできたのですが失活していました。
怪しいとおもって、カラムに通す前のサンプルを透析してみたら、それも活性がなくなっていました。
失活させずに塩濃度を上げるいい方法はないでしょうか？

硫安じゃないといかんの？

硫安でなくてもいいです

>>486
Hisタグでもともと量が少ないなら、そりゃあんまりきれいにはならんだろ。
・発現量がそもそも少ないのか、sonication後の可溶性画分量が少ないのか？
・タグを変えてみるのもアリかと思うが。当方GST使いの結晶学者。

>>501
そんなもん特級ならどこでもいいだろ。うちはナカライ。

>>486
もう遅いかもしれませんが・・・。
とにかく、菌体サンプルをSDS-PAGEで分析して目的バンドが分かるくらいの
発現量がほしいのです。
どのくらいロードしているか知りませんが、ウエスタンで見えるくらいの
量しかないのでは精製は厳しいと思ってください。
培地はTBのみですか？
TBを使うと目的物の大半がインクルージョンボディとして
発現してしまう場合があります。
そのほかでは、発現菌体を変えるのも有効です。
それでだめならコンストラクトの変更をお薦めします。
GSTでも良いですし、Hisの位置を変えるだけでも発現量が変わることがあります。

SDS-PAGEのゲルを筒につめて、蛋白を流して、分取する機械が結構使えるそうですよ。
近くに持っている人がいれば使ってみるとよいかも。
変性蛋白で良ければの話ですが。

>>506
疎水クロマト以外の精製方法を使った方が良いと思うのですが、
どうしても疎水クロマトが良いのですか？？

>>511
いえ、硫安分画からいっきに行けるので楽かと思って選びました。
でも硫安使えないとなるとステップが増えそうですね。
疎水にしてもワンステップとはいかないのでしょうが・・・

>>497
H15を使え。OD=1.0でもinductionがかかる魔法の培地だ。
菌体終了はTBの比較にならん。

>>513

詳細を、、

Vigil LJ, Danielson PB, Sollars C, Yee TM, Foglemen JC. A c h i e ving
shaker flask-scale cell densities in miniprep-scale cultures
with baffled culture tubes and growth medium H15. Biotechniques
2000; 29:1207–9.

皆様有り難うございます。
>>492
一回Ni精製したsolutionをもう一回精製してみましたがだめでつた・・・orz

気を取り直して大腸菌からやってみましたが、少し良くなったかな？って感じです。
>>510
SDSで目的蛋白付近にバンドは見えています（結構濃い）。でも、他にも
バンドが見えていて、HPLCをかけるとピークの山・・・
CNBrでMを切ってMSかけると目的massに結構ピークは出るのですが、
当然他にもピークがあり、junkの山に目的蛋白が埋もれています。
やはりHPLCでちまちまピークあつめしかないのでしょうか？

それともコンストラクトからやり直しか・・・2ヶ月はバックだな。orz・・・

N末とC末でダブルタグしたら？

FlagとHix6とかいうふうに別のタグにする。
全長発現して分解してないものだけが2回のカラムで分離できる。

GST融合タンパクの精製をしてます。
SDSページで見ると、GSTカラムに吸着後ちゃんと目的タンパクが溶出されますが複数のバンドが見られました。
分離するのに陽イオン、陰イオン試しました。
共に吸着して溶出されましたが溶出パターンが一緒でした。
異なるイオンカラムで溶出パターンが一緒ってことは、つまり目的タンパクに不要タンパクがへばりついてて分離できないって理解で正しいのでしょうか？
マニュアルにATP＋Mg、37℃インキュベートって書いてあったので試しましたけど変化が見られません。
何か、アドバイスありましたらお願いします。長くなりすみません。

GST融合タンパク質にしばしば結合しているdnaKらしきHSP70はサンプルを尿素かグアニジン塩酸で
変性させてから希釈して再生してグルタチオンビーズに吸着すると除けた。

すいません
分泌蛋白を大腸菌で発現させる場合シグナル部分の配列
とってしまったほうが発現量増えるのでしょうか？

＞519
アドバイスありがとうございます。
試してみます。

>519 ありがとう。

>>518
陽陰イオンはどちらも荷電の強弱を利用しているので、
pI値が似たところにあると、溶出パターンが近いことがよくある。
SDS-PAGEでわかるのでしたら、ゲル濾過をしてみたら？

みんな苦労してるようだな。
ちなみに俺はpET15bのベクターでキアゲンのキット使って簡単に精製できたぞ。
ここ参考になるぞ。
http://www1.qiagen.com/JP/literature/handbooks/ProteinPurification.aspx

HISタグを使ってタンパク精製を始めるものです。
精製後は酵素活性を測定しようとしています。
精製後のサンプルからイミダゾールを除去する方法を教えてください。
アマシャムからイミダゾール除去用のカラムが販売されていますが、もっと安く出来る方法を知っている方がいたら教えてください。
よろしくお願いします。

透析チューブを知らんのか？

PD-10か？
G10かG25をバッファで膨潤させてディスポの５ｃｃの
ピペットに綿栓かまして自然落下でつめればよろしい．

ヒト血中から精製したIgGサンプルからIgG１とIgG2を取り出したい
と思ってるんですが、なかなかうまくいかない。とりあえず、
プロテインAカラムでｐHを傾斜させてみたけれど、分離はイマイチ。
なんかもっといい方法ないですかね。

ディスク等電点電気泳動

IgG１は10mgくらい欲しい。。。。強欲者です。

GSTって熱処理でビーズから溶出できると思う人いる？

>>531
重いまつが、何か？

>>528
カウンターイオン濃度変えてもだめなのか？

>>531
いえ，ふつうにあぐるです．
酸もやめとけ．
アルカリなら・・・・

>>525

amicon

thrombinって4℃でも切れる？N末His tag 除きたいんだけど。
20℃ 16時間ってもたないタンパクけっこうあると思うんだけど、、

試してから聞け

ベクター乗り換えてこれつかえば？
http://www.merckbiosciences.co.uk/Products/ProductDisplay.asp?catno=71493&
HRV 3C protease

His-tag付き。消化酵素自体はアマシャムのPreScissionと同じ。
使ったことは無いので保証はしない。

>>537
口だけの能無しはハンゲでもいってろ

>>538
高杉。普通のプロテー酢過剰量で処理してみて、ダメだったらこういう際物を検討するのが吉。

脱塩カラムなんてけちってたら活性どんどん下がっていっちゃうぞ〜。

>>541
すみません、いま尼のHitrapに充填されてる樹脂を掻き出して再生してるのですが、恥ずかしながら
不勉強ゆえ「樹脂をけちると活性が下がる」の意味が分からないので詳しく教えてください。
樹脂をけちると収量が下がるというならわかるのですが、活性も下がるのですか．．．．

活性も？

透析だと脱塩カラムするよりも処理時間が長くなるから、
失活しやすいタンパクには、けちらずに脱塩カラム使え
…ってことかな？ｗ

>>536,538>>541
merckbiosciences、ぜってー使わん。出てけクソ業者。

精製とは少し違うかもしれませんが，GST pull-downについて教えてください。
現在，ヒトのある転写因子（全長56kDa）をbaitに数個のpreyタンパクのpull-downを試みています。
BaitはBL21(DE3)pLysで全長が発現し，CBB染色で可溶性分画に回収できるところまで確認済みです。

1.Glutathione Sepharose 4Bに結合させて精製したbaitをSDS-PAGEで確認すると，目的サイズの他により低分子側に複数のバンドが見えます。
同手順で精製した別のタンパクでは目的以外のバンドは（GSTを除く）ほとんど見られません。
洗浄不十分等で，ビーズやGSHに非特異にタンパクが結合したとは考えにくいと思うのですが，
精製中にbaitが部分的に分解したと考えるのが自然でしょうか？

2.上記GST-fusionタンパクでpull-downを行うとpreyが検出できますが，同時にコントロールのGSTでもpreyが落ちてきてしまいます。
ラボメンバーに意見を求めたところ，pull-downの前にビーズをBSAでブロッキングしてはどうかということなので
これは試してみるのですが，他に非特異的結合を防ぐ方法はありますか？

pGEXvectorだけで発現させると27kDaのGSTの他に70kDaのDnaKらしき大腸菌内在性タンパク質が
co-purifyされてくることがある。例は違うが、2hybridでもGal4DNA結合ドメインだけでも
転写活性化が観察されるのでビコイドなどを付けてネガティブコントロールにしている。
GSTのコントロールについてもC末に何か短いペプチドを繋げれば非特異的吸着が減るのではないか。

あとGSTだけではなくてプラスチックチューブ内面にタンパクが付着する事があるので、
pull-down　assay前に1%NP-40を含む緩衝液などで、チューブ内面を洗っておく方が良い。

>>547
ありがとうございます。短いペプチドということですが，
FLAGとかのタグでちょうどいいですかね？　トライしてみます。
この際だからbaitのC末にもつけてみますか。

今、DH5αでコンピテントセルを作っているんだが(ラボでは数年来自作してない)、SOBに入れて
18℃でロータリーシェイカーする時、フタは締めておくものなんだろうか？

液量50mlを500mlフラスコに入れて振っているんだが、40時間培養中に酸欠にならないか心配なんだが。
本には「酸欠を防ぐよう、口の細いビンは避ける」とあるが、チーフは「ちゃんとフタ締めとけよ」と。

どうやってますか？

>>549
うちはアルミホイルでやってます。

>>550
ありがとうございます。アルミホイルだけでフタしてますか？
こちらは蓋を閉めて、なおかつその上からホイルしてます。なんでやねん。。。

ホイルだけで良さそうなら、今度からそうしようかな。

>551
ホイルかけてオートクレーブで十分問題ない。

フラスコの蓋ってどんなんだろう。
通気性のある（フィルターになってる）やつなら使ったことがあるけど。

魚肉ソーセージみたいなのが吉

>>554
想像してﾜﾛﾀ

タンパク質の等電点計算できるサイトどっかにないですか？

すいません
ようやく見つかりました

　　　　　　　　,. -─‐-､
　　　　　　／　　　　 __ 〉 _ ＿_
　　　　　〃　　　 ／´ ￣　　 　 ｀丶､
　　　　　{{　　　/ / l　 l　　　 　 ､ヽ　ヽ､_
　　 　 　 ｀　　 !! l　|　 ﾄ､ヽ 　 　 l　|　 l ヽ＼
　　　　　　　　 |ヽﾄ」＼|　 ｀ヾ､_ .斗ﾘ　 |　}／
　　 　 　 　 　 _Vら::ヽ 　 ,ィヂ下 ｊ/ 　 | 人
　　　　　　 ／ ∧ヾジ 　　匕::;;}　》　　/Y{_ﾉ
　　　　　 / 　 !{:z ｰ　r‐ ､ `ｰﾞ__ノ-‐'´丿 {ﾞヽ　　・・・ってばっちゃが言ってた！！
　　 　 　 {　　　＼ __ {　　」　_zzイ┬f´　└r{
　　　　　 丶　　rく⌒了丁厂ヾ}ﾍ 〈..ﾉ　　 〈_ 〉
　　　　 　 　　　｀!:`〜ﾚ::| ゝノ::{;::}/}} 　 　　ハ

>>552
ネタだよな？

質問です。
HPLCのシステムがもう壊れそうなので買い替えようということになったのですが、
おすすめの会社、機種ってありますか？
初心者なのにボスに選べと言われて困っています。
使いやすいとか、壊れにくいとか、、、。
後、これは着けた方がいいっていう、オプションはありますか？
ちなみにいままではBeckmannのsystem gold, 12年前のものを使っています。
用途はタンパク精製、小分子精製、いろいろです、、、。

あ

>>560
センシュー科学って会社は、アフターサービス等すごくいいですよ。
社長さんがすっごくいい人。

>>562
ありがとうございます。デモカラム制度っていいアイディアですね。

>>560
一応HPLCメーカー勤務だけど、各社で一長一短あるからなんともいえんね。
一般的なGPCと逆相ならどこのも極端には違わない。使い勝手はユーザの性格次第。
とりあえず君がLCの基礎を教えてもらってる師匠に相談しる。
手頃な師匠がいなければ、分析やってるラボの助手かPDつかまえて師匠にしる。
そしてその人の進めるシステムを中心に２〜３社を選んで見積提出させる。

オプション、検体数が多いならオートサンプラ（冷蔵＋防爆）ないとしんどい。
フェラル類は多めにサービス品としてもらって、ストックしておく。
カラムの試供品なんて、だいたいどこのメーカーでも電話１本で出してくれる。

あと、メーカー各社の学術担当を次々に呼びつけて、今測定している中での問題点や
あーしたいこーしたいと、いろんなわがままを直接ぶつけてみるといい。
サポート力のあるメーカーなら分析条件まで詰めてヒントもいろいろくれるよ。

アドバイスありがとうございます。
同じ研究室のお師匠さんはこの前売れていきました。
売れた先でHPLC買うそうなのでそれも聞いています。
そういうわけで隣の研究室のPDをお師匠さんにしようと押し掛け中です。
トラブルシューティングでメーカーに電話しても、
なかなか本当の技術スタッフまで行き着かないことが多いです。
どうも現場を知らないらしい教育された電話オペレータが出てきて、
結局機械を送れと言う。学術担当って来てくれるんですか!!!
個人的な希望はsensitivityよりもトラブルの少ない機械です。
あの、ちなみにサポート力のあるメーカーってどこですか？

>>565
おかしいですね、ふつうシステム買うと言えば学術担当か、せめて技術営業ぐらい
連れてきてくれるけど。
運用上のトラブルシューティングだと、人数が少ない会社はなかなか訪問できないとか
ありますね。出張料金がかかるケースもあるので、このへんは会社ごとに違うかと。
ここでメーカー名を出してしまうと業者乙と言われるだけなので、とりあえず
学生さんでも気軽に参加できるHPLCの研究会をご紹介します。

液体クロマトグラフィー研究懇談会
http://apollo.jiu.ac.jp/~nimura/lc/default.html

この会にはメジャーなメーカーの技術担当が参加するので、東京近辺なら
ここでいろいろ聞いてみるのが良いかもしれません。生物ネタもやってます。

懇談会ですね。いいことを教えていただき、ありがとうございます。
売れていったお師匠さんは、
BeckmannになれてるからBeckmannを買うと言ってました。
当たり前かもしれません。
私は何にも慣れてないんですが、、、。
Beckmannの営業さんが来てくれて相談したら、結局全くおんなじ型番を勧められました。
ソフトはずいぶんか進化したみたいですが、ポンプは変わってないみたいですね。
いい機械だから、安定して売れているということかもしれませんが、
お師匠さんが世話を焼くのが大変とこぼしていましたので、
ちょっと心配です。
普通に運用している時間の何倍もトラブルシューティングしているといっていました。
でもお師匠さん、机の上もぐちゃぐちゃだったんですよね。
ちゃんと世話焼いていたのかは疑問とみんな言ってます。

おいおい560さん、世の中の情勢や研究機器のメーカーもある程度
知っとかないと時代についていけませんよ。
たんぱく質の精製だけで中圧カラムを使用するなら、これはアマシャム
現社名はＧＥヘルスケアしかない。安物は東京理化とかあるけど、全自動不可能で
いまさら使える代物とは。
高圧のＨＰＬＣなら、もう少し選択肢増えるけど実際にサポート力と安心感を
考えるとＷａｔｅｒｓか島津しかないのでは？
うちの研究室にもいろーんなメーカーあるけど、十数年以上新製品も出さず
サービス遅いメーカーはトラブル対応で大変な目にあってます。
564さんがそこに入ってたら申し訳ないですけど、日立や日本分光工業、東ソー
サヌキ工業ははっきり言ってサービス力やアプリケーションサポートは僕が学生時代から
見てもますます悪くなっています。他大学の友人も同じ意見です。今時BeckmannやGilson
を買うなんて狂気の沙汰だと思います。Beckmannはキャピラリー電気泳動では新製品も出し
サービス力も感動しています。

あ、ついでに言っときますが、日立は超遠心分離器で絶大な信頼がるし、日本分光工業は
低価格の割には悪くない分光光度計、東ソーは蛋白精製のゲルろ過カラムで信頼しています。
どこのＨＰＬＣを買うにしても東ソーのカラム営業部とはコンタクトしてたほうが
イイと思います。けしてメーカー全てを否定した訳じゃないので許してください。
逆に中途半端な分野はやめちゃったほうがBeckmann含めてかえって好印象になると感じるのは
私だけじゃないと感じています。とくに生化学の集まりでは時々話題になります。

すみません、いままではあるものをただ使っていたので、、、。
実際的なアドバイス、ありがとうございます。
はい、高圧のものを買い替える予定です。
Beckmannが新製品を出していないのは気付いていましたが、
今時BeckmannやGilsonは狂気の沙汰、ですか、、、。

うちのボス曰くBeckmannやGilsonがＨＰＬＣ注力してたのは２０年前。
Beckmann日本のホムペ見てごらん、ＨＰＬＣなんて載せてないよ。
Gilsonにしてもうちにあった２０年前の装置とおんなじ。
断言できないけどソフトも日本語化していないと以前に聞きました。
趣味の世界でもないのに旧式技術を導入することないのではないですか。
Gilsonのピペットはいいですけど。

Glutathione sepharose 4BでGST融合タンパクを精製しようとしたのですが、
溶出のバッファーとして、マニュアル通りに10mM還元型グルタチオン、in 50mM Tris/HCl pH=8
で溶出させました。
そして、各フラクションをSDS-PAGEでチェックしたところ、pre, post resinには
ほぼ同じ濃さのバンドがと見え、ほとんど溶出していないことがわかったのですが、
これはグルタチオンの濃度をもっと高くすればよいのでしょうか？
ちなみに、グルタチオンを流しているfractionでのバンドはほとんど見えませんでした…

グルタチオン自体がかなり酸性だからグルタチオンストック溶液自体のpHをNaOHかなんか加えて
8付近にしておく。還元型グルタチオンによる溶出はGSTに結合してグルタチオンビーズと
溶液のグルタチオンとの交換反応だから、溶出液のpHを9以上に上げるとよい。
あと溶出液の塩強度は0.5M以上にしといたほうがいいかも。

>>573
アドバイスありがとうございます。
グルタチオンストック溶液のpHを測定したら、少し酸性側に傾き、7.5程度でした。

pH、塩濃度を高くした方がいいのはなぜなのでしょうか？
素人考えでは、グルタチオンの濃度を上げれば交換効率が上がると考え、
50mM, 100mMで5フラクションずつ流してみようかと思ったのですが、
これだと、タンパクの変性が起こる可能性があるのでしょうか？

PAGEで泳動中に、たまにマーカーのバンドの下に空気みたいのが出るんだがあれ何？
泳動自体は問題なく終わるけど、ちょっと気になる。ゲルの組成が悪いのかな？

もしかしてスレ違い？たんぱく質実験系の質問スレあったら誘導よろ

>575
空気みたいなものって、そりゃ空気だろ。

どのバンドかも分からないし、ゲルの性状も書いてない。
泳動時間も、電流も書いてない。

悪いのはゲルの組成ではなく、質問の仕方。

>577
質問してるくせにsageてるから、釣りなんじゃねぇの？

MG132って最初にDMSOに溶かして保存しますよね？
でもその後使用する時水でメスアップすると白い沈殿が出てくるんですが・・
このまま使用しても問題ないのでしょうか？

最近新しいラボに移って今新しい蛋白質の発現系を作ってます。
そろそろ初期精製系を作るのに必要なカラムを準備することに
なったんですが（自分が今のラボでは蛋白質精製の経験が一番
あるんで一任されています）

Pre-pack
SP sepharose(1mL)
Q sepharose(1mL)
Superdex 75 & 200
Benzamidine colume (1mL)
Heparine column (1mL)
HIC Kit 1 set

Resin
Ni-NTA resin
Hydroxyapatite resin

ぐらいを揃えようと考えていますうちは基本的に細胞外プロテアーゼ
を扱っているんでBlueなんかのDNA結合蛋白質に使われるカラムは
まあいかなあと思っています。

どなたか初期精製系の検索時に他に揃えておくと便利なカラムやレジン
などありましたらアドバイスお願いします。

フェニルセファロースとかブチルトヨパールとか欲しいな。

>579

DMSOでメスアップしなさい
実際に培地に添加するときには数千倍希釈になるから沈殿は出ないよ

基本かもしれないけど、抗体を使ったAffinityChromatographyで、
塩濃度の影響ってどうですか。
Washに低塩濃度のbuffer使うと、抗体とターゲットタンパクの
結合が弱まることってある？

質量分析にかけるタンパクサンプルってUreaなんかが混在していてはまずいでしょうか？
Ureaがある程度(4M以上とか)存在しないと可溶化しないサンプルなんですが、、、

>>582
ありがとうございます
MG132 5mM DMSOを500倍希釈して100uMになるように
培地に加えているのですが、
もうすこしDMSOでの濃度を高くして、
数千倍希釈になるように加えたほうがいいということでしょうか？

おれは試薬を希釈して生体に使用するときストック溶液に入ってたDMSOの最終濃度は0.1%以下にしてるけどなぁ。

MG132 50mM DMSOでした
>586
今の条件でやっててMGが効いている気配がまったくないので
最終濃度0.1%以下で試してみます

ヒスタグ付タンパクをアフィニティ精製しております。
溶出は、0−500mMイミダのグラジエントで行っております。
イミダ溶液のpHは、イミダを入れる前に調整し、イミダを入れてからはpHは合わせなくてよい、と言われましたが、みなさんはどうしてますか？

イミダゾールそのものが緩衝能があってpKa=7あたりなので、イミダゾ−ルのストック溶液自体を
ちゃんとHClで中性pHに合わせておくこと。

>>580
当方、結晶学者。

俺ならイオン交換はResource系かUNO系（Bio-Rad）にする。
ハイドロキシアパタイトもプレパックのものを買う。
グルタチオンセ樹脂も買う。
ベンズアミジンは買わない（使ったことがない）。
あと、>>581の言うとおり、最初のステップで使える疎水性樹脂もあれば便利。
SPとQの樹脂も買ったらどうだ？

なぜDEAEトヨパールが出ない？あれはいいイヲン好感樹脂だぞ。

>>590
実はまだこのラボ立ち上がって間もないんでまだ研究費があまり自由に
つかえない状況です。私も長年蛋白扱っているんでおっしゃりたいことは
わかります。現在クロマト装置が１台しかなくほとんど別の実験でいつも
占有されているんでまずは低温室にこもってシリンジ使って蛋白をアプライして
50mM、100mM、150mMみたいな連続的ではなく段階的な塩勾配で溶出すること
を考えています。そうなるとUNO系のようなものは今のところ使えそうにありません。
使えるのはハイトラップやオープンカラムのみです。もちろん何らかの結果が出れば
新しい高圧で使えるクロマト装置の購入やMONO、UNO系のカラムを使って本格的な
精製系の構築に移れると思います。

改行が多すぎると怒られたんで２つに分けます。

>ハロキシアパタイトもプレパックのものを買う。
ハイドロキシアパタイトのプレパックを見たこと無いんですがやっぱり
高圧で使うタイプですよね？ですからレジンを買ってオープンカラムで
使おうかなあと思っています。あれってオープンで使っちゃ意味の無い
カラムでしたっけ？

>グルタチオンセ樹脂も買う。
>ベンズアミジンは買わない（使ったことがない）。

今のところGSTを使う予定が全く無いんでグルタチオンははずしてあります。
あとベンザミジンはうちの扱っている蛋白質がプロテアーゼなんで
プロテアーゼインヒビターであるベンザミジンのアフィニティーカラム
は必須なんです。

>あと、>>581の言うとおり、最初のステップで使える疎水性樹脂もあれば便利。

とりあえずHICのお試しキットを買うんでそれ使って使えそうかどうか検討して
みてからそのあたりは決めようかと思ってます。

>>591
DEAEはとりあえずQで様子を見てみて陰イオンがいい感じで使えそうだったら
追加で買うつもりです。

>>584
つZipTip

>>580
俺が賢しげに助言する必要なんてない人みたいだな。

ハイドロキシアパタイトをオープンで使ってもいいだろうが、
高圧用プレパックカラムはBio-Radから出てる。

>>595

590様
>俺が賢しげに助言する必要なんてない人みたいだな。

そんなことはありません。助言がいただけたのに感謝しています。
特にHICやハイドロキシアパタイトはまだ実際に使った経験が無いんで
助かりました。

助言を頂いた皆様へ

また何か精製で困ったことがあったらここに書き込無かもしれません。
その時には助言お願い致します。

組み換えタンパク精製のため大腸菌を尿素入りbufferで溶菌していますが
ライセートの粘性がやたら高いのです
遠心しても粘性が高いままなのでカラムにかけるのも躊躇されます
この場合どのようにすればよいのでしょうか？

プラスミド調製の経験から、もしかしてゲノムDNAではないかと思うのですが・・・
（そうだとすれば、溶菌する時点でボルテックスしてしまうのもいいかもしれません）

ソニケーションって言葉も知らないの？

>>597
超音波、シリンジで切断、尿素加える前にDNaseで切断、懸濁するバッファーの容量を増やす。
いずれかの方法で。あなたの推測通りそれはDNAです。

解決したら報告求む。

>>598-599
即レスありがとうございます
buffer容量を増やしても解決できませんでしたので
とりあえずソニックとボルテックス、あとシリンジ切断で試してみます

ボルテックスはやめた方がいい
目的タンパクが変性する

597の場合は変性しててもいいやんない？
尿素無しソニック→遠心沈殿を尿素有りで溶解とかどう？

バッチ精製しる

ライゼートの入ったチューブにビーズ入れて4度で2時間回してから遠心

すみません、教えてください。
細胞質内のタンパクのリン酸化を見たいときに使うLysis BufferはRIPA+inhibitorもろもろでも
Cell SignalingのKinase Assay KitについてるLysis Bufferでもどちらでもいいのでしょうか？
あと、Sonicationは不要でしょうか。別に核蛋白や膜蛋白はいりませんので。

　　　　　　　　 ﾊ,,ﾊ　　
　　　　　 　 ('(ﾟ∀ﾟ∩_　おいらをどこかのスレに送って！
　　　　　　／ヽ 　 〈／＼　お別れの時にはお土産を持たせてね！
　　　　 ／|￣￣￣|.＼／
　　　 　 　| .ﾓﾂ煮..|／
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現在の所持品：たばこ・ライター・コーヒー・ブラックブラック・枕・ケータイ電話
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TYG02・小嶋進社長・ゲルトモ・ディプスファンタジア・抵抗1kΩ(黄紫橙金)・媚薬
バーボン・メシマズ嫁のお手製弁当・吉牛の割引券・銀魂１巻・将棋の駒(角行)
ｼﾞﾝｷﾞｽｶﾝｷｬﾗﾒﾙ・上戸彩 ・エミレーツのＣミール（ムスリム食指定）・切腹用の脇差
ビックリマンシール（ロッチ）・かまどうま（昆虫） ・USEN株（1000株）
サッポロラガービール・HDD250GB・ｴﾛｹﾞパイズリCG100枚・寄生獣全巻・ほんの少しの愛
和田アキ子のニューアルバム

ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、濃縮ゲルと分離ゲルにより蛋白質を
分離して、分子量を測定したんですけど、なんで濃縮ゲルをいれるのかが
よくわかりません。。。いろいろ、本とかみたんですけどよくわかりません。
誰か、簡単に濃縮ゲルの原理を教えてください。お願いします。

>606
泳動バッファー中のグリシンはアルカリで負にチャージしますので、電気泳動開始と共に
＋極に向かって進むのですが、濃縮ゲル上部に到達するとpHが6.8となるためグリシンの
電荷はほぼ消失し極端にグリシンの移動度は遅くなります。一方、濃縮ゲル内の
塩化物イオンは横一線となり先頭を走ります。この様な状況になりますと、
先頭の塩化物イオンとしんがりのグリシン間は、通電するためのイオンが少ないため
抵抗値が高くなり、ゲル全体にかかる電圧の大部分がこの狭い領域にかかります。
つまり、この領域中にあるタンパク質の移動スピードは非常に速くなります。ただし、
塩化物イオンに近い領域では、同イオンの存在量が増してくるため、抵抗値は小さ
くなり、結果としてタンパク質の移動スピードは遅くなり、逆にグリシンに近いタンパク
質は非常に高い電圧にさらされ移動スピードは速くなります。
この、塩化物イオン−グリシン間の電圧の差により濃縮が生じます。

泳動バッファー中のグリシンはアルカリで負にチャージしますので、電気泳動開始と共に
＋極に向かって進むのですが、濃縮ゲルに到達するとpHが6.8のためグリシンの電荷
はほぼ消失し極端にグリシンの移動速度は遅くなります。一方、濃縮ゲル内のCl(-)イオン
pHに関係無くは一定の速度で移動しようとします。このとき（pH6.8環境下では）SDSで
−イオンとなったタンパク質の移動速度はCl(-)イオン＞タンパク質＞グリシンとなり、
両−イオンに挟まれ濃縮します。分離ゲルに到達するとpH8.8となるため移動速度は
Cl(-)イオン＞グリシン＞タンパク質となり、分子量に基づき分離します。

過去ログで「硫安塩析した沈殿を長期保存する場合は-70度以下で保存」
というのを見つけたんですが皆さんこの保存方法使っていますか?
「蛋白の性質による」という意見もあるかもしれませんが、一般的に
どれぐらい使われている方法なのか知りたいもので。

いくつか質問させていただきます
(その１)
精製したタンパク質の濃縮に
セントリコンプラス20(再生セルロースUF膜)を使うつもりですが
８個２２０００円と結構高いので
使用後に洗浄した上で再利用を考えていますがそれは可能でしょうか？
この場合洗浄の溶媒として水とかエタノールは使えますでしょうか？
また何回くらいまでなら再利用できるでしょうか？

(その２)
Qiagen社のNi-NTAアガロースを洗浄するのに
取説どおり0.5MのNaOHを加えて30分おいたところゲルが白っぽくなり
NaOHを抜いて水で3回、エタノールで2回洗うと元の青っぽい色に戻りました
このゲルはすぐ精製に使えるようなものでしょうか？
またはNiSO4でNiをチャージし直さなければならないのでしょうか？
（以前同じ操作を行ったところゲルが褐変してしまい戻らなくなったので
あわててNiを再チャージしたことがあります・・・ステップが多くてかなり時間がかかりました）

>>610
(その１)
以前いたラボで再利用してた。乾かさないように何かの溶液に
つけて冷蔵庫で保存。カビさえ生えなければ問題ないと思うので2
0%EtOHが使えそうな気がするけどその辺りは念のためメーカーに
確認かな。自分で再利用したことないんで回数はなんともいえない
けど結局のところ膜が詰まるまでは使えるとしか言いようが無いなあ。
再利用回数が増えればその分遠心の時間が長くなるだろう
からその時間が許容できるうちはOKといったところ。

(その２)
洗浄後もとの青っぽい色に戻ったのならそれはNiイオンが
付いている証拠だから多分すぐに使えるでしょう。
Niイオンをリチャージすれば完璧だけど取り合えずそのまま
試してみてあまりにも精製効率が悪かったらリチャージで
いいんじゃないかな。

>>611
即レスありがとうございます
セントリコンは20%EtOHにて「遠心＋逆遠心かけて洗浄」と「浸漬保存」を行ってみます
Niカラムは一回このまま使ってみて問題なければいいのですが吸着できなければ再チャージしてみます

以前大腸菌で蛋白質は発現するが封入体にいってしまうため、
インダクション前にヒートショックでシャペロン蛋白質を誘導した後に
IPTGインダクションをかけて上清に来る蛋白質をようにするみたいな
プロトコールを見かけたんですが現在見つけられません。確か特殊な
試薬も必要だったと思うんですがどなたか詳しいプロトコールお持ちの方
教えて頂けませんか？

アスパラギン、アルギニンの濃厚液中で巻き戻しをする、とかでは？

それ、うちじゃ散々試したけど駄目だったよ。

ヒント：チャンピオン・データ

溶液のままで巻き戻すから中間段階のモルテングロビュール状態でアグリゲーションになるんでは？
Hisx6タグ付けてグアニジン塩酸6Mで変性してNiビーズに吸着させて、
そのあとグラージエントかけてグアニジン塩酸濃度を下げていったら、
個々のポリペプチドが分子運動でぶつかるわけでないのでアグリゲーション
せずに巻戻らないかな？

ビーズのマトリクスと疎水結合しそうだな。

皆さんのお話をうかがった感じではあまり効果は期待できそうにないですね。
もちろんやってみないとわからないので一度は試して見たいんですが。

>>617
ビーズ上での各分子同士の距離にもよりますがカラム上で巻き戻すという
話は聞いたことありますね。その方法も一度試して見たいと思います。

>>253
Origami2DE3を試してみたんだが
カナマイシン耐性遺伝子を持つpETベクターのを組み込んでも
カナマイシン感受性になってしまうの？
トランスフォーメーションしてプレートに撒いてもコロニーが出てこなかった
添付されていたpUCのスタンダードでもやってAmpのプレートに撒いたが
BL21に比べて異常に形質転換効率悪かった。

プレートにまきだす前に、きちんと抗生物質無しの培地で振ったか？

>>621
無しの培地で1.5hrほど振ってるよ
次は長めにやってみるか

>>599
無事解決しました

＊培養液の1/10容になるようにbufferを加えること
＊bufferを加えてすぐボルテックスすること
＊遠心した大腸菌のペレット、または大腸菌をbufferに懸濁したLysateの-20℃保存をやめて
Lysateをすぐ遠心してタンパク液を分離すること

この３点を実行することでLysateの粘性はなくなりました
ありがとうございました

今、Ｍ１なんですけど、学部のときと実験の内容ががらりと変わってしまい、
いきなり、今まで全くやったことのないタンパク精製なんぞをすることになり、
ニッケルカラムで精製しろと言われ、
ありとあらゆる手引書を調べまくってるんですが、具体的な操作方法が載っていなくて、
「buffer」とか「溶出」といったことと無縁だった自分にはチンプンカンプンです･･･
どなたか、ニッケルカラムの使い方を教えていただけないでしょうか？

今、Ｍ１なんですけど、学部のときと実験の内容ががらりと変わってしまい、
いきなり、今まで全くやったことのないタンパク精製なんぞをすることになり、
ニッケルカラムで精製しろと言われ、
ありとあらゆる手引書を調べまくってるんですが、具体的な操作方法が載っていなくて、
「buffer」とか「溶出」といったことと無縁だった自分にはチンプンカンプンです･･･
どなたか、ニッケルカラムの使い方を教えていただけないでしょうか？

すみません。間違って２回も書き込んでしまいました。

QUAGENのカタログに詳しく載ってるよ。

ラボに精製できる人いないの？

いないのなら、ボスに話つけてもらって他所に習いに行くとか。
まあ共同研究もあれこれあって大変だけど。

なるほど。カタログ探すとこからはじめてみます。
一応使える人はいるんですけど、ちょっと意地の悪い人で、
自分で探せって言われてしまうので･･･

>629
いや、ちょっと意地悪とか言ってないて。
その人に教えてもらえよ！

よく、朝鮮半島から労働力としてたくさんの人々が強制的に連れてこられた云々の話があるのですけれども、ちょっと、それだけですっと言ってしまうのはどうでしょうか。
わたしは忠清道（チュンチョンド）出身です。
親戚関係・ムラ社会を通じて、どんどん招ぶわけです。「日本に来て働かんか。金儲けになるで。」というわけで、たくさんの人たちが日本にやって来ます。

ただし、パスポートはありません。いわゆるドンドコ船と言いましたが、１週間、２週間、飲まず食わずで、
漁船の底に潜んで日本に来るのです。
日本に来て、親類の人の所へ着けば、それでもうなんとか匿われるわけですから、
どんどん密航という形で、大阪へ、生野へやって来るわけです。

もちろん当時の入管警察は、形の上で摘発はするのですが、適当で、ほっとくわけです。
何故かというと、働き手が必要なのです。それが日本の経済発展にとって必要なものなんです。それでどんどん人が来ます。

http://kangaerukai.net/150kim.htm

>>629
根回ししろ。
ちゃんと指導すればセカンドオーサーにしてやるとボスから言ってもらえ。

total cell proteinをPAGEすると、Wを逆さにしたような形のバンドがいくつか出ます。
なぜこんな具合に変形するんですか？

>>633
塩濃度じゃないかな？全てのレーンの塩濃度をそろえればそういうことなくなるかもね。
後は、核の画分と細胞質の画分を交互に流すとそういうことある。核はDNAが多く含まれるので
泳動が乱れることあるよ。

解決方法はまあ、自分で考えてみな。解決したらレスしろよ。

ニッケルカラムの使い方教えただけでセカンドオーサーなんて・・・

≫632
うちのボスにそんな権力ありましぇん･･･

リゾチームで溶菌するときに、白い沈殿がいっぱいできるんですがなんででしょうか？
撹拌してるとなくなりますけど、延伸した上清をビーズとカップリングさせてる間にタンパクが
あぐって沈殿することもしばしば。凍結誘拐＋ソニケーションの時はこんなこと起きないのになんでー？
ビーズで精製してる意味なくなっちゃうじゃんかよ．．．

>>637
そりゃDNAじゃないかい？DNase入れてる？

>>638
俺もそう思う。

DNase Iでも入れとかないと、上清の粘性が高すぎてカラムクロマトグラフィーにサンプルを供すときに悩むことになります。
http://www.promega.co.jp/lit/pdf/HisLink_Tech.pdf
の2ページの表 E.coliの項が参考になるのではないでしょうか。
"リゾチーム DNase" でぐぐると、いろいろ見つかるよ。

レスどうもありがと〜う
DNase Iは入れてあるんです。上清はさらっとしているし、ペレットもキュッと固いのができてるんで
十分かなと思っていたんですが、まだ足りないんですかねえ。
アグリまくりのビーズを泳動すると、フロースルーを薄めたようなバンドパターンになってます。

症状はどっちかというと粘性というより、白濁するという方なんですが．．．
例えば５０mlコニカルでカップリングさせてるんですが、上清の液量が少なめだったときに
バッファーを足すとパーッと白濁する・カップリング後ビーズを集めて洗いに入るときに
またパーッと白濁する。そもそも１時間カップリングさせるとコテッとした沈殿物ができてるし。
バッファーのpHは7.5で変にぶれてないのは確認してあるし、DTT は0.5 mM、塩も100 mM入れて
あるんですが．．．orz
タンパク濃度があんまり濃い〜〜のも良くないんですかねえ

あ、ちなみにうえのバッファー条件はGSTタグのときのです。His タグ付きのコンストラクトでもおんなじ
問題が起きてます（そのときのバッファーは20mM イミダゾールpH 7.5, 100 mM NaCl, もちDTTはなし）

【栄養】ﾁﾝｶｽとﾏﾝｶｽを栄養学的視点から考査【満点】
http://news18.2ch.net/test/read.cgi/news7/1148466691/

今、GSTのくっついたGFPタンパクをグルタチオンセファロース4Bカラムで精製しようと頑張っているんですが、全く上手くいきません。どうしたらいいですかねぇ〜？

>>643
学部生か？どうしたらいいですかねぇ〜と書かれてもな。。
君の質問の仕方では何を頑張ってどう上手くいかないのかも分からんじゃないか。

とりあえず遮光したらいいって院生が言っていたのでそれを実行しつつ、溶出液をpH8.0ぐらいにしてタンパクを溶出してしているのですが…

トロンビンでGSTと切り離したあとに蛍光がなくなるんですよ↓↓↓

>643
おまいアタマわるそうだな。義務教育受けたのか？

その院生もどうしようもないな。
笑える。これからも馬鹿っぷりを晒してよ。

でも、かわいそうだから少しだけ教えるね。
ファルマシアのマニュアル持ってる？まずは手に入れて良く読むんだ。

後、質問の仕方覚えろよ。その質問じゃ誰もアドバイスできないな。

�@　大腸菌内の還元性が強い→S-S結合阻害→封入体
　　と習ったのですが正しいのでしょうか？
�A　リフォールディングはよくないと聞くのですが、
　　具体的な理由はなんでしょうか？
ヒントになるサイトだけでもご存知でしたらお願いします。

>>648
1.　封入体の一部はそれで説明つく。
2.　正しい立体構造に戻らないことが多い。

大腸菌で異種発現させたタンパク質を回収しました。
目的のタンパク質は熱に対して安定性が高いので、
熱処理して余計なタンパク質を除きたいのですが
何か注意点があったら教えてください。
Asnのデアミデーションが気になるのですが。

経験豊富な方教えてください

pIが5のタンパク質を陰イオン交換カラムにかけました。
緩衝液は10 mM Tris-HCl(pH 8.0)だったのですが吸着しませんでした。
サンプルはほとんど精製できている状態です（~80 %くらい)。
pHを上げても駄目でした。何か良い対処ほうがあったらご指導お願いします。

そいつだけ素通りさせるとか。

>>649
ありがとうございます。
封入体の原因ってほかにもたくさんあるのでしょうか？
タグとの相性は当然としても・・

>>651
普通くっつくでしょ...何かやらかしてると思われ。
それがホントなら>>652。
陽イオンカラムにはくっつくの？

>>654
まったく吸着しないというわけではなく、
塩濃度を上げなくてもだらだら溶出されてきます。
かなりブロードな溶出ピークになって困ってます。
塩を加えずに、溶出させ続けると、
サンプルボリュームが軽く30倍になってしまいました。

陽イオン交換カラムにはpH 5.5で、吸着しませんでした。

>>651氏
タンパク質の精製の相談でその情報だけで適切なアドバイスが出来る人はいないよ。
(いるとしたら口出しが好きな人だけ、といったら言い過ぎか)

樹脂のキャパシティーとかの問題はクリアーしてるの？
界面活性剤の使用は？
そのタンパク質の活性を見てますか（見れるのだったら）？

>651
核酸が結合してたりするとそうなる。260 nmの吸収は見た？
あるいは酸性側にするとアグってしまってるか。

学校の実習で、大腸菌に発現させたタンパク質を精製するため、ヒスチジンタグをつけて、ニッケル樹脂で精製しました。
樹脂にタンパク質を吸着させた後、可溶化バッファー（８M尿素入り、ｐH8.0）、洗浄バッファー（６M尿素入り、ｐH6.5）、溶出バッファー（６M尿素入り、ｐH4.0）
という順にバッファーを入れました。実際にタンパク質を溶出するのは、最後に入れた溶出バッファーですよね？その前に入れた2種類のバッファーの役割がよくわかりません。
洗浄バッファーは目的物以外の余分なタンパク質などを取り除くためのものなのでしょうか？
それらが尿素で行える理由もよくわかりません。
また、なぜ、各バッファーのｐHは段階的に下げてあるのでしょうか？
透析の際に3Ｍ→1Ｍ→0Ｍという順にやりましたが何故でしょうか？質問たくさんですいません。。。

板違いかもしれないが・・

カタラーゼのnative-PAGE→活性染色
がどうにもこうにもうまくでずに困ってます。
ひとまず精製カタラーゼ（ウシ）使ってるけど、全然ダメ。
CBB染色ではちゃんとそこに居てるんだけどなあ、、
こんなもん失敗するわけねえだろとか思ってたぶん余計に鬱。

やったことある偉人居てたら話聞かせてください。
アクリルアミドが古いと酵素が失活するなんて事あるんかな・・？

>>656
おっしゃる通りです。すみません。

界面活性剤は使用していません。
活性も追っています。


>>651
核酸は混入していないと思います。
硫酸ストレプトマイシンで落として、吸収を見ました。


その後いろいろ試したのですが、Tris緩衝液の濃度を
5 mMにすることで吸着させることが出来ました。
NaClのグラジエントでちゃんとしたピークで溶出されてきました。
いろいろレスしてくれた人には感謝です。

>>650
酸性条件で、Asn-Glyとならんでたら
デアミが起きやすいと聞いたような

SP Sepharose（アマシャム社製）のカラム使っているんですけど、2MのNaClで溶出させても出てきません。
8MのUrea使おうとしてるんですが、平気ですかね？？
溶出してきたタンパクはエドマン分解する予定なんですけど・・・

>>658
指導教官or院生に聞けよ

GSTカラムとＧＳＨカラムは同じなんでしょうか？

グルタチオンカラムをGSTカラムと呼ぶのは適切ではないように思うんだよなあ。
ProteinAカラムみたいに、レジンにタンパクが固定化された状態を想像する。

>>665
ということは、周りの人が言ってるＧＳＴカラムというのはＧＳＨカラムのことを勘違いして言っていると捕らえていいんでしょうか・・？

勘違いというか慣習というかでしょ。
カラムは入れ物のことだから、むしろGSTレジンが正しいって言い張るやつすらいる。

そうなんですか。何はともあれ同じものなんですね！謎が解けました、ありがとうございました

へパリンアフィにティーとかsp、cmにもurea使って平気なことが論文読んで分かりました。
ありがとうございます。

>>658
原核生物の大腸菌に真核生物のタンパクを発現させると
大腸菌はタンパクを不要物と認識するのだろうか、
封入体に放り込んで不溶化してしまうことがよくある

そこで尿素を使い細胞膜をマイルドにぶっ壊す・・・これが可溶化buffer
洗浄bufferは5両編成以下のヒスチジン残基がついた外道タンパクを洗い流す
そして溶出bufferで6両編成以上のヒスチジン残基がついた本チャンのタンパクを出す
本来ならばヒスチジンと構造の似ているイミダゾールで流し出すんだけどpHを下げる理由までは不明・・・

ただこのままではタンパクの立体構造がべしゃげてしまい活性を出せないので
透析で塩濃度を下げて元の立体構造に折り畳むor巻き戻す

とまあこんな説明でよかったんでしょうか

>>659
ゲルは蒸留水で少し洗った？染色液のpHは酵素の至適pHに合わせてある？反応温度と時間は？
活性染色は多分そこが鍵かもしれません

pHはHisのプロトン化を使ってるのでは。
His-H+はレジンとのアフィが下がって溶出される。

Ni-NTA-ビーズのカルボキシル基はEDTAと同じで低pHで金属イオンとのアフィニティが下がることを利用してんでは？

＞670
ありがとうございます！参考になりました

>>672
オイオイ、それじゃNiが出ちゃうよ。

だから低pH緩衝液ではNiもHisx6タグタンパク質もいっしょにカラムから溶出するんだろ。
普通はイミダゾール-HCl, pH7.5あたりで溶出させるんだが

NTAのカルボン酸のpKaってそんなに高いのか？

>>670
すみません、3,3'-ジアミノベンジジンがへたってたみたいで、
新しいの購入したらバンバン出ました。
そもそも塩酸塩じゃないやつを使っていて、
これが全然バッファーに溶解しないのですが、
そんなものかと思って使ってました。
俺のバカ

しょうも無いことで板を汚してすみませんでした。
レスありがとうございました。

初心者です、教えてください。
培養細胞由来のwhole lysateを二次元泳動→銀染色→ワンスポット取り出してMS/MSにかけたの
ですが、なかなかいいスコアでヒットしません。タンパク量の問題だけではなく銀染色でMS/MSを
かけるのは難しいと言われました。どなたか成功したかたはいらっしゃいませんか。
今後カラムで精製などする必要もありますが、この場合、微量なため困難が予想されるため、
銀染色でやりたいのですが。

タンパク質の蛍光染色を試してみそ
なんとかルビーとか、さいぷろるびーとかそういうやつ。

MSは自分の所ですか？受託ですか？受託ではクマシーで検出できてないと同定できない
所もありますね。
銀染色はもちろんMS用の銀染色キットお使いですよね。
スポットの濃さにもよりますけど、インビトロジェン使ってけっこう同定できています。
あとはいIn-gelの効率とか、MSはなにを使っているかだとか‥‥

お返事ありがとうございます。
MSは大学にある共通機器を使っていて、メンテナンスなどしっかり対処してくれています。銀染色のキット
もMS用wakoからインビトロジェンに変えたら、少し改善されましたが、もう一歩です。
ケラチンなどフィラメント系のものが多くとれてきて、どうもコンタミしているようです。
細胞培養で使っているクリーンベンチを使っているのですが、皆さんはどういう設備で行っていますか。
よろしくお願いします。

http://www.sexy-gy.com/

大腸菌でタンパク質を発現させると封入体になり、昆虫細胞で発現させると（分泌シグナルのある可溶性タンパク）可溶になると思っていたのですが、不溶性のようで遠心でペレットに落ちてしまいます。
分泌などの行程を受けると思い、C末にHis−Tagをつけて発現させたのですが、プロセッシングも受けておらず、プロペプチドと思われる長さで検出されました。（実際には少し短く、糖鎖の影響かと考えております。）
カラムによる精製の前段階で、培地中にはほとんど存在せず、細胞をソニック＆凍結溶解のコンビで破砕し、遠心すると沈殿しました。
His-Tagをつけると大腸菌では不溶性になりやすいといった話を聞いた事があり、昆虫細胞で発現させた場合でもHis-Tagをつけて発現させると不溶性になるといった認識でいいのでしょうか？
それともN末、C末でHis-Tagどちらかにつけるかで溶解度が変わるのでしょうか？
宜しくお願いします。

やらないとわからないから両方やる。これ基本。

タンパク質を大腸菌で発現させたらCBBではっきり見えるくらいに大量に発現
でもHisタグで精製したらごくわずかしか精製されませんでした
こういうことってよくあることなんでしょうか？また、対策等があれば教えてください

ちなみに変性系でやってます

対策というか…破砕から精製までの各ステップごとにサンプリングして
どこでどの程度ロスがあるのかを追跡する。

樹脂に付けてrefoldingなのかな？
…だったら樹脂も流してみるとたんまりバンドでるかもよ。


ってもバンドの太さでなくて　実際にmgで判断した方が良い。
菌体の時何mgで精製後は何mgあるかって。

還元剤やキレーターを破砕緩衝液に入れてないか確認しろ。
C末Hisタグならシーケンスしてin frameでHisx6タグになっているか確認しろ。
内在性プロテアーゼで切断されやすい配列がHisタグと目的タンパク質の間にあるのかもしれない
からHisタグの位置を変えてみるとか。

>>683
その分泌シグナルは細胞外に移行するシグナルなの？
俺がやったときには、感染後３日目ぐらいから培養上清中に放出されてた。
だから、細胞内に局在してるような気がする。
HisタグをN末C末どちらにつけるかで溶解度がどうなるかは聞いたことないけど、
タンパク質によっては発現したりしなかったりするってのは聞いたことがある。
あと、プロセシングの有無は何で確認したの？
除去されたシグナルペプチドと同じぐらいの糖鎖が付加された場合、
SDS-PAGEだけだと区別できないと思う。

返事遅くなりました。そしてありがとうございます。

＞684
両方やろうと教授にかけあった所、時間とお金が無駄だ。今あるものでガンバレ。言われました。
なんとか頑張ってみます。

＞688
細胞の中にかなり残っているようですが、同じく2、3日目ぐらいから細胞外へ分泌されます。
シグナルは細胞外移行性シグナルです。
プロセッシングはシグナルペプチドとは別に、プロセッシングプロテアーゼで切断されるため、長さで判断しています。
しかし、少し短めに検出されてしまったため、シグナルペプチドが切れているのか、糖鎖が付いてないのかなど、いろいろと考えてしまいました。
あまり使いたくなかったのですが、尿素などの変性剤を用いて精製していこうと思っています。

DNAグレードと書いてあるハイドロキシアパタイトってタンパク精製用に流用できますか？

AKTAに適合するマイクロシリンジ（100μl 以下）を紹介して下さい！
ニードルの規格が違うのしか見つかりません。。

電気泳動で、濃縮ゲルと分離ゲルがありますが、なぜ濃縮ゲル中では分離されずに濃縮されるのですか？

それは教科書でも読め。

むしろ市販のプレキャストゲルで濃縮ゲル無しでもOKなほうが不思議だな。

濃縮ゲル中でも等速状態で分離されています。等速電気泳動を学ぶべし！
Cl(-)イオン＞タンパク質A(---)＞タンパク質B(--)＞タンパク質C(-)＞グリシン
607&608を参考に！

>>693
一度濃縮ゲル無しを自作してみては
俺は先輩の目が怖いからようやらんが

ありがとうございます。

もう一つ質問なんですが、電気泳動上のあるバンドを形成してる
タンパク質の種類を知るためにはどのようなことをすれば良いのですか？

イムノブロット
活性染色
末端アミノ酸配列分析
質量分析

PAS染色
proQダイヤモンド染色

His-tag付きのタンパク質をNi樹脂で精製し、イミダゾールで精製しています。
精製後のタンパク質は早めにイミダゾールを除去しないと、
タンパク質にイミダゾールが結合してしまうと聞きました。
Niと結合していたHis-tagがイミダゾールが置換されると思うのですが、
どうしてタンパク質にイミダゾールが結合するのでしょうか？
教えてください。

目的タンパクの分解が精製中に進みすぎ。。。
コンストラクト変えなきゃ、ダメかな。
まいったなぁー。

目的タンパクを発現させたら上手い具合に可溶化したのはいいのですが
保存のため-85℃で置いておくと再溶解したときに不溶化して沈殿しました

これを防ぐためにはどのようにして保存すれば良いのでしょうか？
それとも使う直前に精製するしかないのでしょうか

どなたか蛋白質が単分散になる理由おしえてください

>>701
つアルギニン！！

可溶化と変性の違いがよくわからないんですが、可溶化は構造がグチャグチャにほどかれた状態というわけではないんでしょうか？

>>702
翻訳後修飾などを受けると単分散じゃなくなるよ。
単分散の定義は教科書そのままだよ。

>>all
教科書ちょっと読めば分かることを聞くのはやめないか？

FactorXaってThrombinサイトなんかも切っちゃうもんなんだな。
逆はありと思ってたが。
いっそのことトリプシンでもいい？

塩酸グアニジン処理したサンプルをSDS-PAGEのサンプルバッファーに
溶かすと混濁してしまい、困っています。何かいい処理の仕方がありますか？
不純物を除去する為のキットがあるようですが、出来れば使わないですましたいと
思っているのですが・・。

グアニジウムイオンはSDSと不溶性の塩を形成するから
一度、滅菌水で希釈してTCA沈殿してからアセトンで洗って
6M尿素で溶かしてからSDS-サンプルバファーに溶かしなさい。

ミトコンドリアD-loop領域のPCR増幅という実験をやったのですが、
D-loop領域からの産物が増幅されませんでした。これは、ミトコンドリアDNA
とプライマーの配列が合致しなかったため、ってことまではわかったのですが、
実際にどのように塩基置換が起こっているのか調べるためにはどうすればいい
のでしょう？

>>708
ありがとうございました。
早速やってみます。

タンパク発現で6Mグアニジンでも可溶化しなかったタンパクはどうやって精製したらいいでしょうか？

711
detergent使うか、発現条件変える

尿素入りbufferで溶菌した大腸菌から抽出したタンパク溶液を持っているのですが
このままイオン交換クロマトで精製できますか？
それともゲル濾過をいったん通さないとダメですか？

使うbufferにもよるだろうけど、尿素入りでもDEAEかCMのどちらかにはつくと思う。
イオン交換で考慮すべきは荷電粒子。

どういう条件で発現させたかにもよりますね。

>713
714と同じく
イオン交換樹脂の性質によってUrea可能か否かがあると思う。
説明書（化学耐性のところ）をキッチリ読んだかい？
大概は書いてあるし、判らなかったら業者の学術に電話してみる。

あと、逆質問。
ゲル濾過でUrea除去と言ってるが、refoldingをゲル濾過中にすると解釈しても良いのね？

713は、変性状態で精製後にRefoldingしたいのか、
Refolding後に精製したいのか？
それとも「とにかくモノが欲しい」という意味なのか？

いづれにせよ、可能な限りの手段を講じて低労働／高収量の条件を見い出せると良いですね。

蛋白質って、大豆とかに入ってるｱﾚでしょ？的な知識の僕ですが、
なんか、このスレ、絵を見ているようで離れられません。

ミトコンドリアD-loop領域のPCR増幅という実験をやったのですが、
D-loop領域からの産物が増幅されませんでした。これは、ミトコンドリアDNA
とプライマーの配列が合致しなかったため、ってことまではわかったのですが、
実際にどのように塩基置換が起こっているのか調べるためにはどうすればいい
のでしょうか？

>>718
>>1

せめて http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1146716446/l50
に行くべし。

困っています。
ウエスタンをやっているのですが、どうしてもnegative controlにバンドが出てしまいます。
目的のバンドは見えます。バックも強くありません。
元の細胞を新しくしたり色々変えてみたんですが、変わりません。どうすればよいのでしょうか？
お知恵をお貸し下さい。

>>720

つphotoshop

>>720
一次抗体がへたってたときに変なタンパクが可視化されたことがあった。
抗体改めたら改善したよ。

>>720
１，抗体の濃度を下げる。
２, サンプルのアプライ量を減らす。
３，washの時間と回数をふやす。
４，wash bufferの組成を換える。
５，抗体を換える。
６，細胞を換える。
７，実験系を見直す。

すまん、これぐらいしか、思いつかん。

>>720
実験の概要と、negative controlとして何を流しているのかを
知りたい。別に具体的な分子名とかは出さなくてよいので。
ほんとにnegative controlになるサンプルなの？

眠い！

それぞれ異なる抗生物質耐性遺伝子をもつpETベクターを使って共発現系を作るのって
不可能ですか？（不和合性とか聞くんで…）

最大5つくらい一度にいけるような組み合わせがあったような。

ほれっ
http://www.merck.co.jp/japan/pdf/bioseminar/tec_seminar.pdf

>>728
ｳﾎｯ
ありがとうございます。
これ、pETマニュアルなどと重複はありますが、良い感じにまとまっていていいですね。


やっぱりpET同士は推奨されていないようです。
ペリプラスム移行シグナル付きで別の複製開式点をもつプラスミドが欲しいのですが。。
まあ力業でもなんでもいろいろやってみます。

大腸菌でタンパクの発現をやってるんですが、
破砕時のバッファーに還元剤を入れるのは当たり前だと
聞きました。会合を防ぐためですか？
あと、2MEとDTTの違いがよくわからないんですが。
どなたか教えて頂ければ。

あたりまえなわけでもないぞよ
とくに融合タンパク質をその後の処理でタグを切り離すなんて
操作がはいるときはproteaseによってはthrombinやFactorXa
などは還元剤で阻害かかるから透析の手間が一回増えるぞよ
アミノ酸配列をみてシステインがあるやつはいれといた方が
無難ぞよ
2MEは安いがタンパク質を修飾することがあるぞよ
DTTはその心配がないが値段が高いぞよ
いずれにせよ割とすぐに不活性化してしまうぞよ
最強の還元剤はTCEPぞよ

>>730

pETとかのHisx6タグベクターを使ってNi-NTAビ-ズカラムを通す
ときは還元剤をいれたらあかん。

>>730
どうしても還元剤いれたいときは2MEを上限5mMまでなら
なんとか耐えるけど、DTTはあかんぞよ

横槍の質問なんですが、タンパク質にシステインが1個しかない場合って還元剤いれても凝集の抑制効果はないんでしょうか・・？

たとえば結晶化のばやい、DTTを入れないと結晶化しないものもあるから
サンプルに依るとしかいえん。

なるほどなるほど。
GSTﾀｸﾞ切るときに2ME入ってないバッファーで
溶出してたからちゃんときれたのか。
>>731-733ありがとうございました＞＜

>>731
DTTって分子内S-S結合があると切るというか
結合を切って片方の-SHをDTT内に取り込んじゃいませんでしたっけ？
あれってある意味修飾かなと思うんですが。。。
その上、反応後のDTTは280nmに吸収を持つとか。。。


>>733
Ni-NTA通すならってことで？

>>734
高濃度→分子間SS→沈澱/inclusion body
なので、一個だからといってあなどれない

>>731
蛋白質のフリーのSHの先に2MEが一分子付加する反応が
2MEの還元力がへたってくるとよく起こる
可逆的だが気を付けないといけない
DTTはそれ自身が分子内SSするので、それが起きにくい。

TCEP最強

>>737
なるほど。TCEPが最強だってことがよくわかりましたｗ

>>737
ありがとうございます。
タンパク質間でジスルフィド結合をする可能性があるということですね。

質問さてください。

SEAPって大腸菌で発現させて機能を持ちますか？
どうも発現させても活性が無いみたいなのですが…

バカな質問があります。

westernでメンブレン（ニトロセルロース）のど真ん中だけバンド（actin）が無くなる事を経験しています（10回やって1回ぐらいの割合）。
タンパクが通り抜けるか、もしくはtransferされないのどちらかで、
原因は明らかに操作ミスなのですが、同じ事を経験したひとはいますか？

ちなみに気泡は大きさ的にありえないので、余ったtransfer buffer（メタノール混和後）を残して使っているのが良くないのでしょうか？

発熱してそこだけ熱がこもってbufferが乾いちゃってるんジャマイカ?

電圧は100V（１ｍA相当）で、高過ぎないと思いますが、低くも無いですね。
高い電圧だと、トランスファーにムラがでる事って有りますか？

スターラーを槽の中で回しながらトランスファーをしている人も見たことはあるのですが、
それで結果は良くなりますかね？

槽の中うんぬんということは、ウェットタイプのトランスファーってことね。
じゃあ、ゲルとメンブレンを挟むスポンジが劣化していて、トランスファー
中にメンブレンがゲルから浮いているんじゃない？スポンジ洗ったら雑巾み
たいに絞っちゃだめよ。変形しないように平らにして水を切るべし。

>>744
おーっ、心に響いた。
完全な盲点、新しいスポンジにしてみます
（もちろん絞ってませんが、6年もので波打ってるかも）。

他にも基本的な操作でコメントがあれば、ご教示お願いします。

細胞からhis-tag fusion proteinを精製するとき、purificaion kitはどこの会社のがおすすめですか？

sigma

溶出する際のイミダゾールがタンパク変性起こすから
His-tagはあまりよくないって本当？
問題起こった人いる？

His-tag付きのタンパク質をNi-NTAで精製しているのですが、
F.T.に結構タンパク質が出てきてしまいました。
F.T.をSampleとしてNi-NTAで再び精製しても大丈夫でしょうか？
以前、His-tagで精製して素通ったものは
再精製してもNiに吸着されないと聞いたことがあるのですが・・・

6M尿素とか6Mグアニジン塩酸で変性させるとタンパク質がほぐれて立体障害が解消されてNiーNTAビーズに

>>749
単純にキャパ超えただけならおｋ
気持ち効率は悪くなるが気にするな
キャパ超え以外の原因（いろいろある）ならダメな場合が多い

749
カラムは蔵出しの新しい奴でしょうか？
それとも使い回しでしょうか？

NiやMnカラムは使うたびに劣化しますよ。
劣化するとゲルあたりの吸着量が極端に減ります。
レジンが心持ち薄い色を呈しているのならNi-やMn-の再チャージか新しいレジンを使われる事をお薦めします。

ちなみに、再チャージのやり方はインストラクションマニュアルに記載されていると思います。TALONは記載されてましたよ。

TALONって再チャージできたっけ？あれってしかもコバルトじゃなかったっけ？うろおぼえスマソ

753サン
記憶力よいですね。

つ　ww.clontech.com/proteomics/pdf/TalonResins.pdf

CoClは思ったより安価なんで当方は再チャージしてリサイクルしてます。弱小ビンボラボなんで恥ずかしい限りですが、馴れれば10分程度の作業行程なんで手間を惜しまずやってます。

749です。
いろいろな情報本当にありがとうございました。
Ni-NTAは新しい物を使っているのですが、
いつ購入したのか分からないものなので、劣化しているのかもしれません。
6Mグアニジン塩酸で変性させてからカラムに通しているので、
立体構造的な問題ではないはずなのですが。
Western blottingで検出できているので
His-tagが切れてしまったということもないと思います。
一度F.T.を再精製してみます。

,:::-､　 　 　　__
　　　　　　,,r::::::::::::〈:::::::::） 　　　ｨ::::::ヽ
　 　 　　〃::::::::::::;r‐''´:::::::::::::::::::::ヽ::ノ
　　　　,'::;'::::::::::::::/::::::::::::::::::::::::::::::::::::
　 　 　l::::::::::::::::::ｌ::::::::::●::::::::::::::●:::::ｊi
　　　　|::::::::::::::::::、::::::::::::::( _●_)::::::,j:l 　クマー！
　　　　}::::::::::::::::::::ゝ、::::::::::|∪|_ノ::;!
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　　　　';::::::::::::ﾄ､::::::::::::::i＾i::::::::::::/
　 　 　 ｀ｰ--'　ヽ:::::::::::ｌ l;;;;::::ノ
【ラッキーレス】
このレスを見た人はコピペでもいいので
10分以内に3つのスレへ貼り付けてください。
そうすれば１４日後好きな人から告白されるわ株は上がるわ
出世しまくるわ体の悪い所全部治るわでえらい事です

753 >>754
情報どうもです

【ラッキーレス】コピペしたことあるけど、鬱な気分で辛くてもう病院行こうか
どうしようかって状態ですが。

pfu DNA polymeraseで増幅したPCR産物をそのままSma Iで切断したｐBSにクローニングしたけど、
seqenceを読んでみたら、PCRで増幅したinsert DNAの5’末端一塩基が足りない。
こういう現象は普通に起こるんですか？原因は何でしょうか？

エクソヌクレアーゼの混入というかpfu自体がエクソヌクレアーゼ

なるほど、じゃもうpfuをやめた方がいいの？
どうすれば、いいでしょう？

>>759
マルチポストする奴は地獄に落ちろ！

と言いつつ、こちらもマルチレスだ！
あのな、合成オリゴが3'→5'方向に合成されてるってこと知ってるか？
HPLCで-1の長さのオリゴを除くような精製をしないかぎり、5'の欠けたオリゴは常にコンタミしてるんだよ。
合成の効率が悪ければ、-1、-2のオリゴが半分くらいってことだってあるんだよ。
そもそも、一個だけシークエンスって、何だよそれ。トーシロかよ。

15kD程度で配列既知の精製した目的タンパクを丸ごとMALDI-TOF-MSで飛ばして
正確な分子量を決定しようと思います

PD-10カラムで脱塩したモノにTFAを加えてもなかなかイオン化できず
Ziptipでの脱塩処理を試みたのですがサンプル吸着か溶出に問題があるらしくピークが出てきません
（Ziptipで処理できる分子量に上限があるのでしょうか・・・？あとZiptipは再利用できるでしょうか？）
なのでタンパクを真空遠心乾燥→TFAに溶かしてイオン化しようと考えているのですが
これで正解でしょうか？
それともやはりZiptipまたは他の逆相カラムにかけるべきでしょうか？

>>763
>正確な分子量を決定しようと思います
質量分析器の精度以上のデータはとれないよ。

15kだとリニアでしかデータ取れないんじゃないかな。
リフレクターモードはせいぜい2〜3kDaまでかな。
リニアとリフレクターでは精度が1桁ちがうからねぇ。。

マトリクスは何使ってる？
α-CHCAとシナピン酸両方試した？

>>764
モードはリニアにしぼっています

CHCA,シナピン酸両方やりましたがだめでした・・・

濃度は思ったより高い方が良いよ。
でも濃すぎると飛ばない。
１桁ずつタンパク濃度振ってみて。

あと、逆相カラムの樹脂はペプチドまでだよ。
タンパクは溶出してこない。

>>766
濃度は0.1ug/ul程度で考えていたのですが
それでも飛びにくいとしたら
少しずつ濃度を落としてみます

ZipTipC18でも処理できるのはペプチドまででタンパクはダメなんでしょうか？
（多分ポアサイズの関係かもしれませんが・・・）
だとするとサンプルの脱塩はゲル濾過とか真空乾燥くらいしか考えつきません
一度このような方法で処理したサンプルに
TFAを終濃度0.1%になるように加えるという形で
飛ばすモノの前処理を検討してみます

MOLDIでは正確には出ない
ESI-TOFなら誤差0.5　Da以内ででますよ
LC−TOFならサンプル処理いらず
外注しなさい

そりゃそーだろうけど（笑）＞外注

わたくしも同意
LC-TOFで精度の良い装置（MICROMASS社、BRUKER社、WATERS社のいずれか、間違ってもSHIMAZU社は回避）
を持っている受託機関か大学機器センターへ頼みなさい
MALDIは時間の無駄だと思います

His-tag精製の時の担体ってNTAのものとIDAのものとどっちがいいとか、
こういうときはこっちのほうがいいっていうのはあるんですか？
あと、GEの担体ってどっちのタイプ？マニュアルに書いてなかったんですが･･･

GEのHis trapは特許出願中で非公開でないか

組換え蛋白質の精製を行っています。
GST付きで発現させ、GST-affinty columnで精製し、GSTを切り離して、ゲルろ過にかけています。
ゲルろ過をしてみると、いらないタンパクはピークがはっきりしているのですが、目的のタンパクだけがピークがブロードになってしまいます。
orz
これはどうしてでしょうか？

His-Tagカラムで、His-Nus-融合タンパク質を精製した後、20mM Tris-HCl pH8.4, 150mM NaCl, 2.5mM CaCl2で透析しているのだが、O/N透析後の透析膜内のpHが6.0程度になる。細胞膜外のpHは8.4。なんで？
わかる人いたらよろしくです。

間違えた。
「細胞膜外のpHは8.4」ではなく、「透析膜外のpHは8.4」です。

>>774
温度じゃないの？

>>776
温度ではないと思います。
Tris-HClは温度依存性が高いようですが、同じ温度の透析膜内液、透析膜外液を用いてpHを測定していますので。

元の蛋白溶液のpHは？

>>777
pHはどうやって測定したの？

>> 778
pH 7.0です。

>> 779
pHメーターをしようしました。
棒状の電極を溶液に付けるやつです。

平衡に達していない段階で測定したのではないか？

ドナン平衡でググれ！

蛋白濃度高すぎでキチンと測れてないとか。
pH試験紙でも同じ結果になる？

Thrombinで処理したタンパク質をGEのHiTrap Benzamidine FFで精製したところ、
目的のタンパク質までHiTrap Benzamidine FFに吸着してしまいました。
セリンプロテアーゼではないのですが、吸着することもあるのでしょうか？

あるある。

784です。
対処法があったら教えてください。m(__)m

うちではBenzamidine Sepharose 6B とFFを使い分けている
6Bのほうが非特異的吸着が少ないよ
glycerol 10%程度添加はおまじない程度に効くことがある

ありがとうございます。
Benzamidine Sepharose 6Bの購入を相談してみます。

計算上の等電点が6.4とか7.2のタンパクを精製する場合、グルタチオンセファロースとか
His-bindレジンにかけた後、どのような精製がありますか？
ゲル濾過の前に一本通して純度をたかめたいんですが。

>>789
イオン交換とかいくらでもあるだろ

>>767
ZipTipのC4を使うといいですよ
濃度はそんなもんで妥当だと思います

もうとっくに解決してるでしょうが

Ｎ末シークエンスがうまくいかないのですが、
もしかしてＴＣＡ沈殿後のサンプルはＮ末にかけられないのでしょうか？
うまくいったサンプルと、うまくいかなかったサンプルの差がそれしか
思いつかなかったもので。

酢酸がよくないのは聞いたことあるんですが…

>792
んなことぁ無いと思いますよ。
無水酢酸ならばN末のアセチル化リスクが増大しますが…。

TCA/アセトンがイヤなのならば

つ「クロロホルム／冷アセトン」

やり方はプラスミド取りと同じ。

>793
そうですか…他に思いつかなかったのでもしやと思ったんですが。
とりあえず、TCA抜いて普通のアセトン沈殿でサンプルを作ったので、
それで試そうと思います。
ありがとうございました。

>>768
>MOLDIでは正確には出ない
なんですか'MOLDI'って？聞いたことがないので解説よろ。

>ESI-TOFなら誤差0.5　Da以内ででますよ
どのくらいの大きさのタンパクでの話ですか？ペプチドじゃないの？
それに0.5Daで決めるったって、同位体ひっくるめた平均分子量でしょ？
アイソトープレベルで分離できなかったら、同定しようがないですね。

>LC−TOFならサンプル処理いらず
そりゃまたずいぶんと綺麗なサンプルなんですねっ。
一般の（この板を見て実験の参考にしようとしてるようなレベルの）人が
見たら、いきなりアホみたいに汚い試料ぶちこんでカラム詰めますよ。

>795
いっそ清々しいほど、話についていってないな。

それはすまないことで。
別にマスに限ったことではなく、ここの住人のみなさんの、計測に対する無関心さに
暗澹たる気がしましてね。
みなさん、いま手にしたその数字は、どういう意味があるの？
誤差とか統計とか考えたことあります？

コンピューターで統計処理しまくりですが何か？

酵素活性とタンパク定量で比活性と純度を

>765が何をそんなにつっかかりたいのか理解できないんだけど、
専門性というものだよ。統計処理が必須の
研究をするんだったら、統計の勉強をするべきだし、
蛋白の精製をするんだったら、精製に関する
知識を持つべき。

むしろ、>797が蛋白を精製しているんだったら、
マスの基本的な語句も知らないし、調べる気もないという
事の方が問題だと思うが。

>763は、同位体を分離して蛋白を同定したいというわけではないし、
そこにつっこむあたりも、こういう仕事をしている人のセンスとしては
とても変だと思うんだけど。

>765 ×
>797 ○

周りが統計のとの字も知らない生物屋ばかりだと思ってちょっと説教垂れてみたかっただけでしょ。

生物屋にとって重要なのは、統計などではなく、思いこみと丼勘定と捏造。
その点で>>797の主張は的はずれ。

それにしてもMOLDIってなんだよ。基本的な語句を知らないのはむしろ>>800。

質量分析屋が多いのかな？

タンパクの巻き戻し(renaturing or refolding)の
スクリーニングキットを使ったことある香具師いるか？

不溶性画分に逝ってしまわれたタンパク質に
もう一度再起のチャンスを与えたいのだ。

タンパク質の脱塩・脱グリセロールを同時にしようとして
セントリコン（ttp://www.dinop.com/bio/centricon.html）使ったんですが、
フィルターに半透明の不溶性タンパク質がコッペリとへばりついてしまいました。
無適時ピペッティングはし、それほど濃く濃縮したつもりもありません。
どなたか同じ経験はありませんか？

無適時→無論、適時

です

グリセロール濃いまま濃縮しない

脱塩カラムを通すと同時にグリセロールも取り除くことができれば
この作業後に限外濾過すればいいんじゃないの？
無知な俺が言ってみる。批判、アドバイス期待してます。

グリセロール濃いまま脱塩もしない

つか、脱塩、脱グリセロールなら透析しれ

805ですが、もう少し詳しい内容を書いておこうと思います。
今、脱グリセロール、脱塩しようとしているのはプリオンタンパク質で、
グリセロールはポリマーの精製過程で入ってしまい、塩（グアニジン）はポリマーのモノマー化に使います。
モノマーがポリマー化し始める時間を知りたいので、脱塩に時間のかかる透析は使いたくありません。

皆さんの話を総合すると、透析以外で一度に脱グリセロールと脱塩を行うのは難しそうなので、
先にグリセロールを除いてから塩を添加し、改めて脱塩しようかと思います。
つまり、今までは「精製（グリセロール混入）→塩添加→脱グリセロール、脱塩」だったのを、
「精製（グリセロール混入）→脱グリセロール→塩添加→脱塩」という流れで。

>>808の方法ですが、手持ちに脱塩カラムがなかったものですから。
買えばそれまでですが、とりあえず手持ちの装備でやってみます。
駄目なら手を広げるということで。

脱塩カラム案はダメだったか。

sdsパゲしまくってると、バンドがないのにあるように見えてくるから困る。

海草種子からタンパク抽出（デンプン分解系）を試みているのですがなかなかうまくいきません。
とにかく活性が低いです。原因がわかりません。なにかお知恵をください。

活性が低い理由なんていくらでもありそうだな・・・

813です。
抽出条件は
100ｍM　HEOPES-KOH　ｐH7.5
１ｍM　EDTA
５ｍM　MｇCl2
５ｍM　DTT
１０ｍM　NaHSO4
でやってます・・・

分泌タンパク質で基質といっしょに抽出されてくるとか、S-Sボンドで多量体化してる
酵素では、その組成からいきなりアフィニティカラム精製はミリだろ。

DTTを抜いて、ついでに細胞破砕液を高速冷却遠心して上清を調製したら、
一度、硫安塩析してみたら？

上清をいきなりアミロースレジンに混ぜても、混入してくる多糖があると
コンペティションがかかってアミロースレジンに着かないことがある。

そもそもその酵素はその程度の活性しかないというオチではないの？

かもしれませんが、あまりにも低いので疑っています。

どういう手順でやってるのかわからないけど、とりあえず精製の
各段階で活性はかってどこで活性なくなってるか調べてみたら？

酵素反応がヘタクソとかはないだろうな？
反応条件については問題ないのかい？

ありがとうございます。なんかどれもあてはまりそうなのでもう一度見直してみます。

あるタンパクのdeletion mutantをGST融合タンパクとしてつくろうとしています。
モトは６０kDaで、部分的に１０，２０，３０kDaのタンパクとして作ろうとしています。
PCRで遺伝子増幅後、pGEXベクターに組み込んで大腸菌にトランスフォームし、コロニーも拾えました。
シーケンスもばっちり合っているのですが、なぜかタンパクとして発現していないみたいです。
モトの完全長タンパクは簡単にIPTGで誘導され、可溶化タンパクとして発現します。
なにかコツのようなものがあるんでしょうか？
それとも遺伝子によっては発現しない場合も？

こつというか…
培地を変えてみる
誘導タイミング（OD）を変えてみる
温度を変えてみる
IPTG濃度を変えてみる
辺りを試行錯誤するしかないと思うが。
Truncationで誘導条件が変わる事なんてざらだと思うよ。

>822
フラグメントに切る位置はちゃんと検討しないと，フォールドしないで分解される。
二次構造予測とホモロジーからドメインの境界を決め、さらに境界を前後数残基振ってもよい。

みそのタンパク質は
人間の体にどういうように　効くのか
おしえてください。　学校で調べるために

学校で調べるなら、ここで聞く必要ないでしょ？

>823、824
どうもありがとうっす。
切る位置は結晶構造から大きく分けられる部分を選んで切ってるんすけどね・・・
前後数残基含めた方がいいんだろうか？
インサートが入っていれば、タンパクが発現しないなんてことはないのかな？

>827
構造ベースなのか
ならば特にC末端側を構造とるようにしておく。もしくはC末端側にタグをつける。
結構末端配列によって変わる。

でもGSTだろ？結構できるんだけどなぁ・・・フレーム間違いないの？

タグをエンテロキナーゼで斬りたいんだが、
メーカー推奨の２２℃、８ｈｒってこわくね。
タンパクの分解が怖くて低温でやりたいんだが、
４℃じゃキレないかな。
経験者は語れ。

聞く前に両方試せ

>>830
こいつアホか
やるのが嫌だからきいてんだろ、ヴォケ

( ﾟдﾟ)



( ﾟдﾟ )

エンテロキナーゼなあ。
おそらくどっちの条件でも満足に切れないか、
いらんとこまで切れるかのどっちかの可能性が高いぞ。
最近おれのまわりでエンテロつかってる香具師ほとんど誰もいない。
みんな一度痛い目にあってるようだ。
ということで、俺のおすすめは両方試すのすら時間の無駄の可能性が
あるのでいまからコンストラクトつくりかえろ、ダ。
お疲れさまです。

ノンスペ切断の少なさはプレシジョンプロテアーゼ最強。TEVも自前で調製出来るなら安いしオススメ

>>829
10倍入れれば切れる

>>829
プレシジョンがおすすめ。低温でもいけるよ
コンストラクト変えた方が早いよ
おれはそうだった

タンパクの大量調整をするコンストラクトを設計するためのバイオインフォマ
ティクスツールってどっかにころがってますか？

DNA死すとかGENET糞がていばんじゃね
無料ならビオEDIT

質問です

今 hiｰtrap キレイティングセファロース HPに COイオンを 配位させて His tagタンパク質精製を行おうとしているんですが 溶出条件は どのようなものが 良いですか？

今 TALON レジンの マニュアルのように 平衡化ならびに洗浄バッファーの イミダゾールを 0mMにして 溶出バッファーのイミダゾールを 60mMくらいにして溶出しようかと思っているのですが、幾分 初心者なもので 精製できるか不安で不安で…

前まで Niを配位させて精製していたのですが 精製が不十分だったもので…

発現タンパク質によって 条件は まちまちだとは 思いますが 何卒 アドバイスお願いします

長文失礼しました

一酸化炭素かと思ったｗ

すいません コバルトです(..;)

んっとね、昔Co吸着させてやってみたんだけど、あんましくっつかなかったｗ
還元剤ほんのちょっといれただけでめちゃめちゃ還元されたし、Co使いづらい
Ni使った後、もう一本カラム通した方がいいよ
条件検討めんどくさかったらNi使った後、TALONで軽く精製してもけっこうきれいになるお

コバルトは NIより ヒスチジンとの結合能が良いみたいなことが書いてあったんですが だめなんですか？

NI後 疎水クロマトで 精製していたのですが 精製が不十分でして

NI後 コバルトってのは 良さそうですね ありがとうございます

いや、そうは書いてなかっただろう。
選択性がいいんだよ。

>842のカラムは別カラムだろう。

初心者ならせめていい加減に読まないで
ちゃんと読めよ。

>>844

すいません。

なんでいまさら旧式のIDA担体（hiｰtrap キレイティングセファロース）を使う。
ＧＥ製でも最近のレジンならNi-NTAやTALONと同等だぜ。

師事している 教員の指示で キレイティングセファロースを使いました

自分は結晶化を目的にタンパク質精製をしているのですが、なかなか うまくいかず 今回 NiからCoに交換して やってみようと なったんです。

>>ＧＥ製でも最近のレジンならNi-NTAやTALONと同等だぜ。

それってどの製品の話し？

今は IDA担体は主流じゃないんですか？
今の主流は なんでしょうか？

IDAは金属に対する配位結合数が３で金属が遊離しやすく、結合洗浄条件が甘くなりがち。
配位結合数が4のNTAその他のキレート担体が断然使いやすい。
以前はQ社、C社の寡占だったが、最近はG社、P社、S社、、、も参入。
微妙に特徴が異なるが、その辺はお好みで。

HISタグに行く前にプロタミン硫酸沈殿か硫安沈殿して透析してから、
HISタグカラムにかけている方はおられますか？

851です変な質問しつれいしました。スルーしてください。

10kDaのタンパクと50kDaのタンパクを分離できる中高圧で使えるゲルろ過カラムありませんか？

あります

誰かアミノ酸配列からタンパクのKDa求めるフリーソフト教えてください

自分で組め

うちらの大学院では実習でプログラミングやらされるな

>>855
http://www.expasy.org/
の
http://www.expasy.org/tools/#primary
からお好きなのをドゾー。

TALONで his tagタンパク質 精製を 始めたんですが、洗浄・溶出条件（イミダゾール濃度）は みなさま どんな感じで 行っていますか？

タンパク質によって 異なるとは 思うんですが 参考に 教えて頂けませんか？

洗い５０ｍＭ　溶出２００ｍＭ
いみだぞーるに敏感なタンパクだとこんな感じ。

ありがとうございます

あと カラムの洗浄なんですが マニュアル通り グアニジンで タンパク質を変性させず 高イミダゾール濃度で 洗浄させるだけでは まずいですかね？

場合によりけり
イミダゾールだけで不安だったり　明らかにその後の調子がおかしかったら
マニュアル無視もあり得るが…

サポセンに電話しろ

タンパク質の定量について質問です。

現在「BCA Protein Assay Reagent Kit(PIERCE社)」を使用しています。
以前先輩が行った実験方法を参照したところ、BSA検量曲線から求めた
目的タンパク質溶液の濃度に「ファクター」なるものを乗じています。
このファクターとは、目的タンパク質溶液の濃度をアミノ酸分析にて
求めた際の濃度と、BCA法で求めた際の差なるものです。
つまり、アミノ酸分析にて求めた濃度が「1」、BCA法で求めた濃度が「3」
だった場合、今後はBCA法で算出された濃度にファクターとして「3」を
乗じていきます。

BCA法を使用している方は上記のような、別方法で算出した濃度を基に、
各タンパク質固有のファクターなるものを乗じているのでしょうか？
Kit添付の説明書には、各タンパク質間でのファクターのような差は平均する
と1.02程度なのでOK的なことが記載されており、必要性を感じないのですが。

ご返信宜しくお願いします。

使う目的による

>>865
定量を行ったタンパク質の主な使用目的は「結晶化」及び「Assay」です。
Assayにおいては定量した濃度を用いて動力学的解析(Unitや比活性)を行うので、
出来る限り正確な濃度を求めたいです。

>>866
864）ファクターの必要性を感じないのですが。
866）出来る限り正確な濃度を求めたいです。
矛盾しています。二者択一でどちらか犠牲にするよりない。
サンプルがBSAの場合だけ両立するが、あくまで例外

呈色反応による定量なんて、あてにならん。
濃度をきちんと調べたければ、アミノ酸分析をしてモル吸光定数を求めて吸光度を測れ。
が、我が師の口ぐせでした。

僕もそう思います。
呈色反応でBSA当量が分かったとしても、それは「BSAに換算したらこれくらい」と言ってるだけで、その蛋白質の実際の量を示したものではありません。
酵素反応論的な議論をするのであれば、なおのこと、こんな適当な濃度測定法はお推めできません。

一度、モル吸光定数が決まってしまえば、あとは吸光度計にサンプルをセットするだけで濃度が分かるから、毎回キットを使うよりお手軽ですよ。

WやらYやら無い子もいるんです＞＜

モル吸光定数を求めて吸光度を測る場合に、ふぉーるでぃんぐしてるのをぴろぴろさせないと駄目なんですよねえ？。教えてえろいひと。

6M GdnHCl

8M Ureaとか7M GdnHCl
これでも沈殿してくるうちの子は…

タンパク質のモル吸光係数ってどうやって求めるの？

ヌクレオチドがついてる子もいるぜ＞＜

lysateが多い場合、カラムを数本用意し、
溶出に持って行く方がセオリーなのか？

プロトコルどおり250mlに存在する菌体を
４０mlのLysis bufferで溶解させ
10mlアプライ>Ni-NTAと反応＞上清除去を
４回繰り返して洗い>溶出したところ、コンタミ率が高かったわけだが。

それとも、今回の系で洗いの回数を増やすべきなのか？

もしくは、最初のLysis bufferで懸濁する量を減らし,
Lysateの量を１回のアプライで済ませるようにするべきなのか？

>>873
おまい、これを見ろ

ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=8563639&dopt=Abstract

How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.

Protein Sci. 1995 Nov;4(11):2411-23.

Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T.
Department of Medical Biochemistry and Genetics, Texas A&M University, College Station 77843-1114, USA.
によれば
ε(280)(M＾-1 cm＾-1)=(#Trp)(5,500)+(#Tyr)(1,490)+(#cystine)(l25)
だそうな。あれ、フェニルアラニンって関係ないのかな・・・まあいい。

おまい、御礼として漏れの疑問に答える！！

セレノメチオニンを含む大腸菌培養液を捨てたいんだが、どうやって処理すれば良い？
大学の廃液処理所でセレンを含む化学廃液は処理してくれる。
だが、それにはオートクレーブしなきゃいけないだろ。
でも、オートクレーブしたら、セレンが大気中にばらまかれてしまうじゃろ。
あーーー、蛋白結晶なんて作るもんじゃねえ。

カルキで滅菌したらどうだ？

>>876
つハイター

>>876
native + 重原子誘導体 なら無問題。
もしくは、直接法で位相決定できる結晶を作製とか。

いずれにしろ、セレンなんて使わないことだ。

Se使わないなんて冗談も休み休み

今いるところはハイターだな。
前はオートクレーブしてた。

だってそんなに毒でもねぇだろ。程度的に。
Se欠乏症もあるくらいだし、少しくらい吸っても

>>877 >>878 >>879 >>880
OH! THX
廃棄施設のおさーん（にいちゃん？）曰く、
どうせSeなんて微量じゃろ。
オートクレーブして有機廃液として処分したまえ。
有機廃液は焼いちまうからよ。
大丈夫、焼却炉にフィルターが着いているから外部には漏れぬ。
だそうな。

こちとらブツが18Lもあるんで、
ハイターにしろオートクレーブにしろ
厳しい戦いを強いられそうだぜ。
最後の懸念は、廃棄処理の料金って従量制なので、ラボの財布が傷みそうだな。
我が赤貧ラボの狂授が怒らなければよいが。

キムタオルに含ませて可燃物？

Seだが、うちはオートクレーブ後にK分類で廃液処理。
甘ーい匂いが立ち込める。でも気にしてない。

「セレンなんて使わないことだ」にはまったく賛成しかねる。釣り？

>>883
廃液処理のことを考えずに、「とりあえずセレンでやってみるか」ってな実験をするような奴になら、「セレンなんて使わないことだ」と言ってもおかしくないと思うが。
>>876は、セレン廃液処理の手順を確認せずに実験して「排液出ました。どう処理したらいいでしょう」と言ってるように見える。

うちの場合、SeMetを導入できるサンプルが少ない…。 orz
いいなぁ、SeMet使えて。

分子量の同じ２種のタンパクをSDS電気泳動しました。
しかし、泳動度がバンド一本分くらいずれます。
サンプルが違うので当然タンパクの持つチャージもが違うのですが
ＳＤＳ化しているのでまんべんなく−にチャージしているはず。

どんな理由が考えられます？誰か答えられる人教えてください。

レポート課題は自分で解決しろ

>>884
前任者が捨てずに出て行きやがった、しかも大量に。
データとか実験資料を残していくのはいいけど、汚物を残されてもなあ。
こんなモン片付けたって実績にもなんにもならん、これボランティアっすよ。

>>885
タンパクの
電荷、形、ニオイ、味、愛、気合、恥辱、スリーサイズ、就職濃霧
に影響される

そんな何日もブウブウいう暇に手を動かせば
とっくに処理できてんじゃねぇの？

そんな言うほどの手間じゃないと思うんだけど、
雑用耐性のないやつだなぁ。

>888
そのとおり、もう糞享受のもとで仕事をするのが嫌になっています
学位もらったら、娑婆（会社）に出て行きます
スレ違いだが、博士Go持っていても文系就職で優遇されないのはなぜ
↓こういうのみると、なえる
ttp://www.asahi-net.or.jp/~wk2t-oosw/hakase.html

博士号取ろうとする奴がそんなことも考えられないのか？

28歳職歴なし、あるのはプライドだけ
博士号持ちなのに優遇されないとか文句だけは一人前
そんなの採用するより、22歳の学部卒とか24歳修士を採用して
3〜5年現場で働いてもらったほうが安上がり＆使える

崇城大学　応用生命科　上岡研究室　西山ゆうき　上熊本で痴漢をし逮捕

タンパク質の精製ができるから俺はSOJO大学の博士に進めた

>>885 もう一回やりなおしてみなさい。

４発以上やったんですけど同じ結果なんですよ。
先に進む（活性チェック）こともできなくもないんですが気になる・・・

そもそもSDS-PAGEは分子量のほかにどんな要因が絡んで泳動度に現れるんだろう・・・
１〜２個アミノ酸が違うだけでバンド１本分とか泳動度が変わるものなのかしら？

>>894
修飾状態が違うんじゃない?
大きめの糖鎖の状態が変わったら、バンドにも影響でるけど…。

PAGEの位置は目安程度にしかならない
変性剤への耐性によっては部分変性でとどまって
結果バンド位置が変化したりする。

気になるなら等電点電気泳動とか
変性剤存在下でのCD測定とかしてみたら？

本当に同じMassかはMSが手っ取り早いだろうけれど。

＞１〜２個アミノ酸が違うだけでバンド１本分とか泳動度が変わるも



はい、変わります。

みんな有難う。ちょっとミーティングしてきます。

一週間放置かよ
さっさとMS飛ばせよ

TCEPのストック溶液を、1Mで作ったらすごい酸性になってしまいましたorz
コレは、NaOHでpHあわせてもよいのでしょうか？
それともトリス等の緩衝液で、あわせたほうがよいのでしょうか？

１Mトリスとか１Mダイベーシックのリン酸とかの方がいいのでは。

けいこうらべるでつかう？
どーせTCEPはfinal conc 1mMでつかうだろうし、
ラベル入れる反応は緩衝液をつかうでしょ(10-50mM)。
よゆうで、pHは緩衝されると思うが。
ところで、phosphineの何処が効いて酸性になるんやろ。

>>901
レスありがとうございます。
1Mトリスベースであわせてみます。
>>902
精製バッファーで使いたいのです。
final1mMです。
10mMトリスでは緩衝されなかったです。

膜タンパクのレセプターをアフィニティー精製したいのですが膜から抽出した後もリガンドとの結合能残ってるんでしょうか？

ケース・バイ・ケース

ただし経験的に非イオン性界面活性剤で可溶化出来た場合は残ってる場合が多い

質問です。
抗体を精製しようと硫安分画を行ったところあまり精製できませんでした。
原因はサンプルの濃度が低かったことだと思われますが（濃度を大きくすると精製できたので)、なぜ濃度が低いと精製の効率が下がるのでしょうか？

実際にそんな事しようとする人はいないでしょうから、誰かに質問されたことをここで聞いているのですか？

>>906
精製のステップごとに精製したいものはどんどん減っていくんだから
たとえ収率が同じでも最初が少なければ最終的に検出限界以下まで
減ってしまうのは当たり前じゃないのか？

抗体精製に硫安分画なんて使うのか？

アフィニティー精製する前に一度硫安沈殿するプロトコルもある。
そのステップを飛ばしてもとれてくる抗体の質にあまり差を
感じないからおれは最近はやってないけど。

>>906 proteinA搦むつかえよ

質問です
MonoS,MiniSのような陽イオン交換カラムに
PIPES(pH7.0)緩衝液は使えるでしょうか？

この緩衝液で透析したタンパクを持っているのですが純度が低いので
できるだけ緩衝液組成はうごかさないで精製したいと考えています

陽イオン交換には酢酸緩衝液のような酸性のものがよいのでしょうけれども
バッファー交換での失活が怖いです

等電点次第

H15 培地を使ってみたいのですが、>>515 の論文が大学のサーバーでは落とせない&図書館でも見つかりませんでした。

誰かこの培地の組成だけでも教えていただけないでしょうか？
もし可能ならこの論文をうｐしてくれるとありがたいですが・・・。

ね、Googleって知ってる？
とっても便利だから使ってみなよ。
いや、ちっとも難しくないよ。

>>914
2chらしい回答ありがとうございますｗ
少しググってみたところ平成15年（H15）が相当な数ヒットしてしまうので分からなかったんですよね。
論文はどうしても落とせなかったので途方に暮れてました。

googleで普通に見つかるようならもう少し頑張って探してみます。
あとBio technical フォーラムに H15 の組成について投稿したのは私ではありませんのでｗ

>>916

×914
○915

間違えました

H15 mediumで検索してみな。

連投すみません。
論文落とせました。これからはできるだけ自分の力で探します。

イライラさせて申し訳ありませんorz

>>918
ありがとうございました。

質問させてください。
大腸菌を使って、微生物由来の通常の可溶性タンパク質（膜結合モチーフがないという意味で）の発現を試みています。
発現させたタンパク質は、pET、pColdベクターを用いた単独での発現では可溶性画分に得られませんでしたが、
分子シャペロンGroES, ELとの共発現によって可溶性画分に得ることができ、活性も確認することができました。
ただ、GroELと強く相互作用しているようで、Niアフィニティーやその他DEAEなどでは精製することが出来ませんでした。
ATP, Mgとインキュベートしてもうまくいきませんでした。
何か経験のある方がいらしたら、アドバイスをいただけませんでしょうか？

グアニジン塩酸変成下でNi-ビーズに結合させたあと、グアニジン塩酸濃度を暫時減らして
reffoldingさせてからイミダゾールで溶出したらだめか？