▼今実験でうまくいかないこと▼パート4▼

1 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/21 10:14

いま実験でうまくいかないことスレッドです。
グチからアドバイスまで幅広く語り合いましょう。

皆様よろしく。

過去スレ

いま実験でうまくいかないことｽﾚｯﾄﾞ
http://cheese.2ch.net/life/kako/967/967541407.html
▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/
▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼
http://science2.2ch.net/life/kako/1026/10263/1026312578.html

主な関連スレ

◆生物学専門家への質問はここに書き込もうPart12◆
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1091287391/
◆■◆2ch高校生のための生物質問板◆■◆
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1084118712/
　　「実験の裏技ありますか？？」２　　　
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/996490423/
タンパク質の精製２
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1039524190/

2 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/22 14:28

このスレッド、忘れ去られて、既に上から５４番目になっているんですけど～

3 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/24 11:35

今見たら８１番目だ。

4 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/24 16:27

諸先輩方に質問なんですが、うちの研究室は超音波破砕機がありません（お金なくて・・・）。
大腸菌などを破砕したいのですが、代わりの方法なぞありますでしょうか。。。

5 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/24 21:06

>>4
フレンチプレスもないよね、それだと。

うまくいくかどうか分からないけど、
リゾチームとfreeze and thawing、界面活性剤を組み合わせるとか。。。
粘稠で困るようだったらDNaseIで処理。とか。。

ちと無責任だったかな？

6 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/24 21:19

>>4 目的書こうぜ。
こんなんどう？ttp://saj.ds-navi.co.jp/~saj/sigma/CelLytic.html

7 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/25 11:01

>>5 >>6
アドバイスありがとうございました。
遅れましたが、目的は大腸菌からの発現タンパク回収とある菌の inclusion body の単離です。
早速やってみたいと思います。
リゾチーム、界面活性剤はありますし、>>6さんの薬品いいですね。
勉強になります。

8 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/26 15:44

Bugbuster(NOVAGEN) 、B-PER(PIERCE)、ってのもあるよ。

9 ：4：04/08/27 22:14

>>8さん、ありがとうございました。
これも恥ずかしながら知りませんでした。
本当に勉強になります。

10 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/27 22:38

>>9
結果の報告もよろしくね。

11 ：名無しゲノムのクローンさん：04/08/28 13:10

このスレ立てたことすっかり忘れてたよ

>>7
インクルージョンボディーからとってくるんなら
凍らせて溶かす＋リゾチームかな>>5
うちはpLysSが入っている菌だから凍らせて溶かすだけ。
ついでにbenzonaseとPMSFも入れる。

Hisタグがついていて、精製後巻き戻すのなら
いきなり8M尿素入れて１時間振り回せばいいし。

12 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/02 04:44

どうなったのかな？

13 ：華α：04/09/02 04:48

>>10，>>12
結果の報告はin press以降になるのでは？

14 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/02 04:57

高分子タンパク（200k以上）の効率的blotting方法しらね？
当方、手持ちアイテムは蝉ドライタイプ。

15 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/02 06:07

wetを試せないのではお話しになりませんな。
バイオラッドで安いセットがあるから、試してみたら？

16 ：4：04/09/03 13:50

皆様、報告が遅れて申し訳ありませんでした。
とりあえずあった lysozyme と DNaseI で処理し、凍結融解を繰り返したところ、
きれいに溶菌し、inclusion body を回収できました。
ほんとにありがとうございました。助かりました。

>>11さん
そんなベクターあるんですか。。。早速調べてみます。

17 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/04 05:45

Hisタグが入ってるベクターなんて死ぬほどありますよ。

18 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/04 09:35

pLysSのことを言っているように思う

19 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/04 15:55

マウスがちゃんと妊娠してくれねぇ
胎生が欲しいからplug-だとどんどん先送りになっちまう

仕方ないけどね

20 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/15 14:30:45

PCR産物をゲル回収した後、確認の泳動をするとなぜか回収したバンドよりも大きなサイズの薄いバンドがでるのですが、なぜなのでしょうか？

21 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/15 17:31:33

実験法を思いつきました。
part1のスレッドにあった形転後のミニプレップの改変版です。
1. 形転した菌を植えたプレートを10xTEで洗い、菌を集める（詳しくはpart1のスレッドを見てください）。
2. 集菌、ミニプレップ。
3. 1%アガロースで長めに泳動し、cccをセルフライゲーションのものとインサートが入ったものに分離する（インサートがある程度大きければ大丈夫？）
4. インサートの入ったcccのみをゲルから抽出。

どうでしょうか？　だめなところがあればだめ出し願います(-_-;

22 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/15 18:30:59

「ガウス分布」及び「クローン」の意味を考察してみてください。

23 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/15 20:31:45

>>21
インサートの種類が決まってて向きもわかってる強制クローニングでないと使えないから却下

24 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/16 17:41:24

プラグ着いても妊娠してくれねー

実験がどんどん先送りに・・・

25 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/16 18:30:34

毎日掛け合わせろよ

26 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/16 20:52:30

>>20
切り出すことによって、バンドが大きくなるってことですか？
PCR産物は、バンド一本ですか？
もしそうなら、TEではなく、滅菌水にゲル回後、溶解してませんか？
俺は、ゲル回後、TEでなく滅菌水に溶解していた時、バンドの大きさがずれてましたよ。
また、滅菌水に溶解したゲル回PCR産物にTEを半量加えると、目的の大きさにバンドがシフトしましたよ。

27 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/17 00:49:38

>>24
・雌が年寄りだと妊娠しない確率が高まります。妊娠しても子供の数が
　少なく成長も不揃いになるため、特に初期発生の実験で問題になります。

・雄が絶倫だと、ろくに発情していない雌にまで種付けしてしまう
　ことがあります。もちろん妊娠しません。
　発情を確認してから同居させるやり方をおすすめします。
　せっぱつまった場合はホルモン注射で強制的に発情させる方法もあります。

・騒音や高アンモニア濃度、他の雄の匂いなどは流産の原因になります。
　良好な居住環境を維持しましょう。

・系統によってはもともと妊娠しにくいものがあります。
　そのつもりで実験計画を立てましょう。

28 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/18 09:38:02

タンパク発現大腸菌株に導入されているプラスミドを回収しようと何度もミニプレを試みているのですが、どうしても回収できません。
ゲノムのバンドは出るのですが、cccのバンドが出ないのです。抗生物質の濃度が薄すぎるからでしょうか？（抗生物質は相当な濃度で添加し、さらに培養中に加えています）
それとも、発現株に導入されていることによる阻害作用があるのでしょうか？
すいませんどなたかアドバイスお願いします。

29 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/18 10:15:15

>>28
ccc?

30 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/18 10:42:47

>>28 プラスミドとホストは何？

31 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/18 13:31:54

こばれん（ｒｙ

32 ：28：04/09/19 06:21:18

どうやらカナマイシン耐性であることが原因だったようです。過去ログを読んでいたらヒントがいくつも見つかりました。
もう１度試してみます。お手数かけました。ありがとうございます。

33 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/19 14:30:09

>>32 pLysSとかのプラスミドのこと？あれはvery low copyのoriだから、収量がめちゃ低いよ。20倍量泳動してみな。

34 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/20 03:16:44

pLysSはCm

つか、Kmで過去ログでって、よく分からんけど、よかったよかった

ちなみに、みんなKmの濃度ってどれぐらい？
うちは、overnight、ミニプレ 50μ　expression 10μぐらい

35 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/23 01:45:54

リゾチーム処理ってどういう風にやってんの？温度とか濃度とか。
自分は菌液10mLに対して5mgでやってるんですけど粘性が出ないです。
濃度を変えたりしてもうまくいかない。

36 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/23 10:55:19

目的は？

37 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/23 12:15:42

大腸菌をバラバラにしたいんでしょ。

大腸菌の場合、リゾチームが分解するペプチドグリカン層は外膜（外壁）の内側を構成しているのではなかったか。
よって、ただ加えただけでは到達できなくて、外膜（外壁）をある程度の破壊ことが必要ではなかったか。
ソニケーションを少しするとか、界面活性剤を少し加えるとか、Freeze & Thaw をするとか。

pLysSからできるリゾチームにも、Ｔ７ポリメラーゼにくっついて誘導前の発現をおさえるという役割だけでなくて、
本来のリゾチームの役割もあるけど、生きている大腸菌を溶菌してしまわないのは、内膜の為にペプチドグリカン層に到達できないからでしょ。
こちらの場合は、一度大腸菌を冷凍庫に入れて、出してくると溶菌しますね。

38 ：1492：04/09/26 22:20:25

定量PCRのことでお聞きしたいことがあるのですが。
私はまずアニーリングの温度を決定するためにグラジエントをかけて普通のPCRを行い、それをアクリルアミドで泳動し、バンドが１つ（＝目的バンド）しか出ない温度を探します。
そして目的バンドだけが出る温度が見つかったサンプルを、次は定量ＰＣＲでグラジエントをかけて行い、メルティングカーブ等で目的外のものが増幅されていないことを確認しています。
今回最後の確認として、定量PCRをかけたサンプルをアクリルアミドで泳動してみたのですが、melting curveおよびquantitationで全く問題のなかったサンプルまで目的外のバンドがうっすらとすが出てしまっています。
これは無視しても良いのでしょうか？　それとも何かしら改善すべき点があるのでしょうか？
定量PCRについて詳しい方、よろしければアドバイス願いいたします。

39 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/28 02:40:32

ゲルシフトのバッファにBSA入れたのですが、
転写因子を入れないコントロールがシフトしました。
どうもBSAがくっついているようです（コンペティタなし）。
これは一般的なことですか？
それとも俺のBSAが今民してるのでしょうか？
BSAシフトバンドはワンバンドですが、特異性はないです。

40 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/28 08:21:32

BSA無しのレーンがあるのか？

41 ：39：04/09/28 17:51:46

>>40
もちろんです。水とプローブ、バッファとプローブ、
バッファとプローブとBSA、
水とBSAとプローブのレーンもあります。
BSA入りはシフトし、BSAなしはシフトしません。
プローブも3種類まったく違う配列で試しましたが、
どれもBSA入りはシフトします。
dI-dCを入れるとシフトは消えます。
BSAの濃度は500μｇ/ｍＬです。BSAの濃度は振ってません。
BSA抜きで実験すればいいんですが、なんか気持ち悪いので
こんな経験ある人いませんか？

42 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/28 18:22:53

そこにモノ入れて更にシフトすればいいんでないの？
ていうか漏れはＢＳＡなんて入れんが。
それとdI-dCは常に入れているが。

43 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/02 06:42:58

子供がなかなかできません、どうしたらいいですか？

44 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/02 07:13:08

まずゴムを外す

45 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/02 10:35:01

お尻に入れない

46 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/02 10:43:37

皮を剥く

47 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/08 21:46:31

抗体作製のノウハウがないラボで抗体作製をしています。
抗血清の抗体価がいまいち（ELIZAでx2500）だったので
prtein Aカラムで精製しようと思ってるんですが、
精製した溶出画分の濃度チェックはどうすればよいんでしょうか？
図書館でしらべたところ「A280を測定、もしくはSDS-PAGEで確認する」
としか書いてなかったんですが、詳しく載ってなくてよくわかりません。
IgGて150kDaくらいですよね。
バンドは10%で長く泳動したら見えるかも知れませんが、
分子量マーカーが94kDaまでしか対応してません。
分光高度計の方は、1000倍希釈くらいしてA280測って1.45で割ればいいんでしょうか？
なんか基礎的な質問なんでしようが調べても判らなかったので
どなたかアドバイスお願いします。

48 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/08 21:51:51

>>43
まず、どういう努力をしたのか、何がどううまくいかなかったのか
具体的に説明してくれないと、答えようがありません。

49 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/08 21:54:32

>>47
そんな大切なことをココで聞いて信用していいのか？

50 ：47：04/10/08 22:04:13

43～46の書き込みみるとアレですが、このスレの過去ログは全部目を通してます。
役に立つ情報も多く、非常に有り難いです。
ここは２chのなかでも結構信頼のおけるスレだと思ってますよ。
鵜呑みにせずに自分で考えチェックしてから少スケールでやってみる所存ですが。

51 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/08 22:32:09

>>47

150kDaはH鎖x2本、L鎖x2本がそれぞれジスルフィド結合したのが
IgGなんだから、SDS-PAGEで見える個々のサブユニットは150kDaより小さいがよ。

52 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/08 22:34:36

>>47

プロテインAでトータルIgG画分を精製するのって、意味有るか？
抗原カラムで特異性の高いIgGをアフィニティ精製するのが筋では？

53 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/08 22:40:52

>>47
「A280を測定、もしくはSDS-PAGEで確認する」でぴんとこないようなら、タンパク実験に関する知識不足です。このまま研究を進めるとうそデータ乱造の危険性大なので、近所のラボやボスの知り合いでタンパク実験（抗体精製でなくても良い）の出来る人を捜しましょう。

54 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/08 22:53:30

ヒメダカの尾びれの再生実験での
継続観察むずかすぃ

55 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/08 23:45:45

>>52 もちろん意味あるよ。じゃなきゃ、アマシャムやらピアスやらがプロテインＡを使った精製キット出してるはずがない。抗血清にはアルブミンやらグロビンやらざぶざぶ入ってて、いろんな用途で邪魔になることがある。

56 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/09 03:29:11

血清からだったらまず硫安分画では?

57 ：20：04/10/10 00:30:21

返事が遅くなりました。
>>26
ゲル回収産物を泳動すると目的バンドももちろんでるのですが、その倍ほどの大きさのバンドも出てしまいます。
サイズは相当違うので回収の際に混ざってしまったとは考えられません。
また、回収産物は1xTEまたは0.5xTEに溶解しています。

58 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/14 17:12:31

今、困っていることがあります。
MSCVベクターにある遺伝子を組み込み（スタートコドンからストップコドンまで、又配列もシーケンスで確認済み）
ましたが、タンパクとして発現していないようなのです。同時に入っている薬剤耐性は発現しています。
やり直すとしたら、導入遺伝子の前後をもう少し拡大する事が効率いいのでしょうか。

59 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/14 18:14:11

>>55

いろんな用途って具体的になによ？
抗体を固定化したイムノアフィニティカラムにするっていっても
抗原であふぃにてぃ精製せにゃいかんだろ。プロテインAビーズでIgG分子を
わざわざ精製しなきゃいけないシーンてマイクロインジェクションぐらいか？

精製した抗体は失活しやすいから抗血清のままで使用できるんなら、無駄に精製
する必要はない。

60 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/14 18:21:11

きれいなSDS-PAGE写真が欲しいとか

61 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/16 02:42:23

>>58
プロモーターとかにmutationが入ってるんじゃない？

62 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/17 17:30:51

タンパクのラベリング　FITC　Biotin
リポソーム作り

63 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 18:52:33

>>58
読み枠がズレテるんじゃネ？
もしくは大腸菌との相性かな・・・

64 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 19:44:12

ベクターとインサートをklenowで平滑末端にして、
大腸菌に形質転換しとるんだども、
うまくいかんです。
何かコツありませぬか？

65 ：ばばんばばんばんばん：04/10/18 19:52:51

ＣＩＰかけたかぁ？

66 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 19:56:35

5末にリン酸が無いんでないの？
バッファーにPEG入れて　４℃でライゲーションしてみてけろ

67 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 21:13:22

ゲノムPCRする時って、制限酵素処理するよな？？
だれか、教えて・・・・

68 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 21:33:13

欲しいPCR産物には当然制限酵素サイトは無いよね　ならいいんじゃない

69 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 21:44:21

>>68
レスサンクス
ということはあれか　別に処理いらない・・・とも言えるのね・・・
ゲノムDNAってPCR条件で工事構造とったりしないですよね？

70 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 22:36:11

>69
そうですね　あとはプライマーとか　taqの問題じゃないかな？
ゲノムの場合GC含量がうるさいんじゃない？　ATリッチも
ノーマルのrTaqだと500bpの断片も増えないことがあるから注意が必要

71 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 23:16:18

>>64の
うまくいかん
加減によって対策はちがってくる

どねぃ？

72 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/18 23:22:15

>>70
サンクス
では制限酵素処理は必要なしでプライマーに頭ひねります
にしてもCGリッチな領域のプライマー作りって・・・頭痛が・・・

73 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 15:00:39

リン脂質をELISAプレートなどのプラスチック製品にコーティングさせる方法ありますか？

74 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 15:55:55

みなさんCpG islandのPCRかけるときって何か工夫してます？
CpG islandの外からPCRってのが、常套手段ですかね・・・？

75 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/19 21:27:53

>>74
DMSO入れてる。

76 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 00:11:20

そういやCGリッチな配列にPCRかけるときってよくDMSO添加するよな
あれってなんでなの？
やっぱ水素結合切ってTｍ下げるのが目的なんか？

知ってるヒトいたら情報キボンヌ

77 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 00:14:29

Tm値が下がるんでなかったっけ？
特異性が下がるだけかな

78 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 00:17:39

>>76-77
どっちも正解。一本鎖の高次構造をほぐす。

79 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 01:26:07

5%? 10%?

80 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 07:20:59

GCrichには、DMSO 5% + Betaine 1.5 M かな。キアゲンのＱ液は、Betaineらしいけど、
いい思いではない。

81 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 10:02:16

puromycinのレジスタントマーカーがはいっているプラスミドを
他のhygroやＧ４１８に改造したいのですが、どうやってやるのですか？

82 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 21:17:25

>>80
なんでBetainがいるの？
DMSOだけどいいんじゃない？

83 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 22:45:10

キアゲンがいいと言ったからさー
DMSOが効かないときは次を試したくなる
溺れるものは・・・　　って感じ
ベタインは俺も試したけど　あんまりだった

84 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 23:09:57

>>81
バイナリーか？
それと、puromycinの両側に制限酵素切断部位はあるか？
あったら切り取って、そこに他のプラスミドから取ってきた
HPTやNPTを平滑末端でライゲーション。

なかったら、ほかのプラスミドから切り取った
HPTやNPTをマルチクローニングサイトにぶち込め。
少々長くなるが、レジスタントマーカーが増える分には問題なかろう。

とにかく情報がないとなんともアドバイスできん。

HPTのコンストラクトを作るより、
puromycinで選抜できる条件を検討するする方が、
意外と有用な情報が取れたりするもんだぞ。

85 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 23:25:07

今から組換え実験はじめるんだったら
新しく買えば？　

86 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 07:32:01

>83
最初は、Roche（というかBM)じゃないかな。
Qiagenは成分を明かしてない。
5'RACEで、GC 75% とかうまくいったよ（600bp位）。

87 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 08:04:51

5'RACEならRocheいいみたいね
俺はinvitrogen Generacerで結果出ました　論文かけた
Clontech SMART全然だめだった　なんでか？

88 ：86：04/10/21 08:21:22

ああ、おれもSMARTやったけど、だめだったよ。
論文おめでとう。

新規遺伝子も拾って、ＫＯも作ったけど、いまだに机の肥やしになってる。
来年くらいは発表しないとね。

89 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 21:05:04

完全長ってどうやって判断するんでしょうね

90 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 23:37:23

リン脂質をELISAプレートにコーティングする方法を教えてください
適当にやればくっつくらしいんですけど　お勧めの材質とか溶媒とか
このまえクロロホルムに溶解してウェルに入れたら溶けました　悲

91 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/23 07:16:30

>>84
マルチクローニングサイトに入れると言うアイデアは知らなかったな。
でも、それじゃダブルでレジスタントになってしまうね。

92 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/23 11:20:57

無問題

93 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/23 21:51:53

>>91
植物の世界では割と多いね。
確か、ｐIG１２１なんかはGUSの両側をカナマイシン耐性とハイグロ耐性ではさんであるので、
導入した植物体がダブルでレジスタントなら必ずGUSを持っている罠。

それから、マルチクローニングサイトにはプロモーターも一緒に入れないといけないので、
ちょっと大変だな。

94 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 10:24:43

リピート構造のあるプラスミドは大腸菌で増やす時に苦労するから、
２つの遺伝子の発現に同じプロモーターを使わない方がいいと思う。

95 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 10:30:59

pET-Duetベクターのように　プロモーター+MCSがタンデムに2つ並んでいるような
ベクターは安定的に2つのインサートを発現できる？
私の感じでは片方だけたくさん作られるような気がするんですが

96 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 14:13:51

プロモーター間干渉がなければ（違うプロモーター）であれば問題ないはずだが
細胞とプロモータの相性もあるのでもちろんどっちかが発言大井こともあるだろう

97 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 14:44:37

pETは大腸菌での発現用だろ。

98 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 15:56:06

そうだよ　T7プロモーターが２つ

99 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 20:28:08

大腸菌ならなんでbicistronicにしないの？

100 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 20:56:42

あぐりやすくなるから

101 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/24 21:22:52

>94
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=15240823

102 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/26 20:28:00

リアルタイムPCRのデータに再現性が無く困っております。
PCRをする時のハンドリングが問題なのか、cDNAの作成の仕方に問題があるのか‥。
もし同じ苦労をされた方でアドバイスがあればお願いします。

103 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/26 23:43:12

RNAがデグってるんじゃないの？

104 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/27 00:19:57

サンプルが古い、　精製がちんたらしている、　保存が悪い
精製できてない、　プライマーがあってない、　PCR条件があってない、など

105 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/27 07:05:37

>102
そもそも再現性が得られないような実験条件でないの？
と、身も蓋もないことを言ってみる。

106 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/27 18:37:46

>103,104,105さん
レスありがとうございます。
デグるって何の略なんでしょうか？

107 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/27 19:19:13

degradation

108 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/27 21:40:18

density gradient

109 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/27 22:03:35

demi glace source

110 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/27 22:26:03

deglycosilase treatment

111 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/28 01:30:08

デグタン。

112 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/28 03:51:00

puroやG418耐性のベクターを入れた後、puroなどを加えるまでどれくらいおいてる？
よく論文でみるのは48時間だけど、実際24時間で十分なんじゃないかと思ったり。
24時間と48時間じゃ生き残る細胞数に差が出るのだろうか？

113 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/28 14:33:51

誰か体外受精（IVF）やってる人いますか？

114 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/28 21:07:11

ニトロセルロースメンブレンってメタノールで溶けるけど
クロロホルムなら大丈夫
糖鎖とか脂質をクロロに溶かして　ドットブロットできますか？

115 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/28 21:32:02

クロスリンクできる？

116 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/29 00:04:12

メンブレンにくっつく？　という意味
フォスファチジル酸はメンブレンから抜けた

117 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/29 20:21:45

細胞から抽出したゲノムにPCRかけてるんですけど、
Primerのみの非特異的増幅が目的バンドのところに強くでてて
ホトホト困っております
こんな時の解決策ってPrimerを変えたりするしかないのでしょか？
アニーリング温度を変化させたりはしてみましたが変化なしです
なにかコツを知っていたら教えて下さいm(__)m

118 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/29 21:27:07

プライマー替えろ。
以上。

119 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/29 22:37:14

primerのみで目的のサイズにバンドがでるんだから、
産物の試薬へのコンタミだろ。
試薬を新しくして、フィルター付ピペットチップを使うようにする。

120 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/29 22:43:05

>117
そりゃお金があるラボならプライマー変えるのもいいが、
その前にやることは山ほどあるだろ。

「Primerのみの非特異的増幅」ってのが何を意味するのか
よくわからんが、それがプライマーダイマーのことなら
まずはプライマーの濃度を下げれ。テンプレート（アンタの
場合はジェノミックDNA）の濃度に対して、プライマーの
濃度が高すぎると、プライマー同士で増幅しあって
プライマーｘ２程度のサイズのバンドが増える。

一方、「Primerのみの非特異的増幅」を文字通り解釈して、
テンプレート抜きのネガコンでもプライマーさえ入っていれば
バンドが出るというなら、そりゃコンタミだ。試薬作り直せ。

121 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/30 00:41:41

ちょっと質問させてください。
大腸菌発現系で使う大腸菌にはB株由来とK株由来の株が市販されてますけど、
マニュアルにB株はプロテアーゼが欠損してあって云々と書いてあって一部の
タンパク質は安定とありました。この一部のというのはどんなタンパクですか？
この一部を除けばB株でもK株でも同様の発現をするものなのでしょうか？
教えてください。

122 ：117：04/10/30 00:55:00

>>118-120
すみません
説明足らずでしたm(__)m
Primerのみの非特異的増幅ってのはネガコンのことで
PrimerとGenomeDNAを入れています
Primerを片方しか入れていないのでバンドは存在しないはずなんですが・・・
しかも新しい試薬を使っても同じ結果になりました
たんなる実験の腕の問題なんでしょうか？？

123 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/30 01:47:35

PCRに腕なんか関係ない。混ぜるだけなんだから。
Primerが片側だけでも増えたからといって
それが２つ入れたときも同じように増えるとは限らない。
つまりネガコンにならない。
教えてくれた先輩は誰かに教わったほうがいい。
目的バンドがホントに目的でないのか？
切ってチェックして、目的じゃなかったら温度とか酵素とか
Primerとか変えたら良いんじゃない？

124 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/30 02:10:21

>>123
うちのラボでもそれで1年くらいはまってたよ。
まったく同じ症状。
プライマー変えてたり、温度を調整したり、いろいろやったけど、
まったくダメ。
おかげで、モレキュラー関係の仕事がまったく進まなかった。

泥沼から抜け出せたきっかけは、
ホットスタート。
HOTGoldstar　DNA Polymerase最強。
もうそれまでの人食い産物が嘘のように消えて、
ごついバンドが1本バーンと現れる。
感動したね。

125 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/30 02:47:15

>>123
オレは昔からanti-TaqでのHotStart（古いけど）。
Cold stratも心がけてる。
　（単に全て完全氷冷試薬でスタートさせるだけ）
個人的にはtouch-downサイクルもお気に入り。
　（72℃から2℃ずつ下げて、65-55℃で20-25サイクル）

126 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/30 04:34:53

>>117=122
まだ説明がわかりません
primerとgenomic DNAを入れるネガコン？

説明がちゃんとできること
は実験だけでなくいろんな場面で研究ができる必要条件

primer片方だけで増幅ってのは
インバースリピートかも知んないけど
むしろprimerのコンタミを疑った方がよい

フォワードprimerを吸ったピペットチップで
リバースを取りにいってるとか

ねこも杓子もDNAをやる時代になって
おばかなラボも増えたからな

127 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/30 08:33:28

>117
プライマーの品質がおかしいってことを疑って、
おなじ配列のプライマーを再度注文してみたら？
私自身に経験はないけど、プライマースレなんかみると
ありえないことではないので。

128 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/30 10:14:41

>>117
126＆127のご指摘にもありますが
①primerコンタミ
②プライマー品質
③配列が最悪
④プライマー、DNA濃度が高すぎ
などが現状では可能性大かと。
残念ながら、オレは全て経験済みw

特に②は社名だせないけど、
少なくともinヴィtro○やSI熊なんかだとも問題ないと思う。

129 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/30 10:31:02

試薬のせいにするのは、大概ダメな奴

130 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/30 15:38:43

>>129
同意

まず足りない頭を必死に振り絞って考えてみろ。
闇雲に実験繰り返すのは時間と金の無駄遣い。

たいてい考えなしに実験やる奴は他人のプロトコールで（ｒｙ

131 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/30 19:14:33

遊びに行ったラボで
たまたま学生がPCRで悩んでたので
トラブルシューティングしてやった
ネガコンから増幅するって

手の動きを聞くと
PCRチューブに先にテンプレートを入れておいて
上からMixを連続分注器で入れていた

だめじゃん
てか
そんなこともトラブルシュートできない教員って（ｒｙ

オートクレーブのお釜洗ったり
ミリＱのフィルター替えたり
ミリＱ入れるメジウムびんを新品にしたり
ピペットマン買ったり
何やっとるんじゃあｺﾞﾗｧ

132 ：122：04/10/30 20:24:19

>>123-131
レスサンクスです
とりあえず今ゲル切り出しからnested試してます
一回やった実験なんで気乗りはしなかったんですが・・・・

ちなみにすべて試してみます
実験手順、Primer濃度、Primerの新調（分けてあるので元から自分で作ってみます）
温度、Hot-Start・・・・
うちのラボはお金がないのでHot-Start用Taqを買ってもらえそうにありませんが

結果が出次第知らせますんで！
他にもアドバイスあったらお願いします（ぺこり

133 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/30 22:50:25

お友達いっぱい作って　少しずつ分けてもらえるようにしたほうがいいっすよ
taq　抗体　少しあれば実験できるからねえ
モニター物ももらっとけ

134 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/01 23:26:16

たいてい　うまくいってない

135 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/02 00:16:56

A と言うウイルスゲノムから、Bと言う遺伝子を
PCRで増幅し、電気泳動で大きさをチェックした後、
TA クローニングしました。

さて、塩基配列はあってるだろうかとシークエンスし、
確認したら、目的のBとは全く違う塩基配列でした。

とりあえず、良く読めてる部分200bpをBLAST
に放り込んでみたのですが、Aウイルスのどの
部位も引っかかりませんでした。引っかかって来たのは、
全く関係ない人のゲノムの一部で、１５bpくらい・・・。

俺は一体何をクローニングしたのだ？
インサートの大きさも問題なかったのに・・・orz

Help me ........

136 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/02 00:30:02

>132
最初のDenature温度に達してからMgを加える。
マニュアルホットスタート。

137 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/02 03:21:04

>>135
たまたまノンスペをＴＡクローニングした可能性があるね。
生えて来たコロニーをいくつか試して見るべき。

138 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/02 08:22:42

TAだったらＰＣＲ産物のはじっこ、プライマーの配列を読んでちゃんと
２つのプライマー配列があるか確認して

インサートチェックで大きさはチェックしているようだ

139 ：小腸：04/11/02 09:34:18

>>135
PCRの前にはオナニーは控えろよ

140 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/02 11:17:06

アンチセンス法でノックアウトをしたいんですが、
アンチセンスDNAを発現させるばやい
その遺伝子の5'と3'を逆さにして発現ベクターに組み込み、
発現させるとアンチセンスDNAはできまつか？
僕には理解できないのですが・・・・
てんていがそう言うんです・・・

141 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/03 01:01:38

>>136
それってTaqを加えるホットスタートと差異があるのか？
バッファーの組成を考えなくて良い分、Taq後入れの方が
簡単なような気がするんだが・・・
やった事ないから勘でスマソ・・・
で、どうんなんだ？

142 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/03 05:28:20

>>141
その通り。
Taq後入れで十分。

143 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/03 05:33:54

>>137
たまたまノンスペ？
ウイルスゲノムとプライマーから？？
Aウイルスのゲノム内の配列でもないのだから、
ゲノムが今民してたとしか考えられん。
ウイルスゲノム調整からやり直した方が良いね。
（プライマー・試薬類はきれいなこと前提で）

144 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/03 18:43:52

すいません、今プラスミドのPEG沈精製やってるんですけど、PEG-NaCl混ぜて
インキュベートしてから遠心すると、きちんと白いプラスミドのペレットが
落ちてくれる時と、半透明のPEGの固まりが底にこびりついててプラスミドが
ほとんど回収されてない時とがあります。どこの手順が狂うとこういう差が
出てくるんでしょうか？アドバイスお願いします。

145 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/03 19:33:15

>>144
元のプラスミドの量は一定だよね？
だとしたらincubateの時間と温度。
それも一定だったらよく混ぜていないかも。
PEGは粘性高いからよくvortexすること。

146 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/03 19:40:03

>>144
フェノールでも混じってんじゃないの？

147 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/03 21:12:14

>>144 それ、モロにプラスミド量の違いだと思うよ。DNA濃度の濃いときはすぐに糸状の沈殿が見えるけど、少ない時は氷上で１時間程度置く必要があって、それでも半透明の沈殿が出る程度。

148 ：144：04/11/03 21:56:02

なるほど、プラスミド量とvortexですね。ではもっぺんやり直してみます。

149 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/08 21:56:31

5kのベクターに2kのインサートがなかなか入りません。
なんか良い案ありませんか？

150 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/08 23:45:39

>>149
形質転換体が得られないと言うこと？
それとも、ｾﾙﾌﾗｲｹﾞｰｼｮﾝのものばかり取れると言うこと？

ｺﾝﾋﾟﾃﾝﾄｾﾙの方は大丈夫ですか？
意外とこちらが穴の場合もありますよ。

151 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/08 23:48:06

ありません。個々のステップを疎かにしないこと、それに尽きる。

152 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/08 23:51:31

おっと出遅れた。>>151は>>149へのコメント。

153 ：150：04/11/09 00:30:15

>>152
俺が怒られたと思ったじゃねえかよーﾌﾟﾝﾌﾟﾝ＃

154 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 00:59:22

おれは3kのベクターに3kのインサートを入れたよ

155 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 01:17:49

大きさの問題ではないと思われ。
俺は7kbのベクターに200kbのインサート入れたし。

156 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 01:58:59

まじかよ

157 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 02:02:33

BACとか？

158 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 02:04:01

漏れはインサートしたらすぐに果てたが。

159 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 02:45:47

漏れはもっぱらセルフライゲーションだが。

160 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 04:13:16

ベクターとインサートのモル比を変えてみれば？
通常１：３とか言われてるけど、
ベクターとインサートの大きさがあまり変わらない時は
１：１で試してみると上手くできることがあるよ！

161 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 05:42:48

ベクターも気になる
既製品のone cutを使っているのか
自分で切ってるのか

あとの場合だと出来にばらつきがある

162 ：155：04/11/09 09:02:34

>>157
その通り。BACです。

149の情報だけだと何が問題なのかさっぱりわからん。

163 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 12:30:28

大至急なのですか。。。
BigDyeに水とプライマーを混ぜてしまったものは、1-2日保存できますか。
保存できるのならば冷蔵、冷凍どちらがよいでしょう？？？
ABIにはわからないといわれてしまいました。

164 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 12:36:27

>>163
だぶんできるだろ。
保証はできないが、凍らせておいてもいいんじゃない。

165 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 14:40:20

大丈夫　うちではみんなmixしたあと冷蔵庫に入れてPCRの順番待ちしているから

166 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 14:57:53

んだんだ、
あと遮光しておくといいべ

167 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 21:44:06

>>149
サブクローニングのトラブルは、とにかくコントロールをとりまくれ。
ポジもネガも。
「無限個のコントロール」

168 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 23:54:17

HindⅢとXbaⅠで切断したインサートを
ベクターのHindⅢ＋EcoRⅠ切断サイトに入れたのですが、
うまくいきません。
手順は
インサートが入っていたベクターをHindⅢとXbaⅠで切断
電気泳動して、断片を切り出してゲルからキアゲンで抽出（長さ１ｋｂ）
一方、ベクターをHindⅢ＋EcoRⅠで切断
電気泳動して、断片を切り出してゲルからキアゲンで抽出（長さ１５ｋｂ）
ベクターとインサートをHindⅢサイトでライゲーションして電気泳動
もっとも長い断片を切り出してキアゲンで抽出
TYOBOのBluntingHighで平滑化→セルフライゲーション
DH5αに形質転換。

100μｌのコンピで１０個しかコロニーが出ず、
インサートチェックをしたら切れなかったり、
異常に短いバンドが出たりとばらばら。

大腸菌のなかで欠失や組み換えがおこったのでしょうか？
ちなみにもともとのインサートを入れたベクターにはもともと
インバーティッドがあって、インサートを入れた後、
タンデムリピートが追加されることになります。

169 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 23:58:02

>>168

馬鹿ですか？
まず１方だけ切って平滑末端化してから、熱失活させてHindIIIで切れ。
それから断片をアガロース電気泳動して切り出し精製。その後
混ぜてライゲーションだ。

ボケ。

170 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/10 00:04:18

>>168
どうしてそんなにややこしいことをやるの？
インサートもベクターも共に最初からblantにするとかしないの？
もしくは、ベクター側に他のsiteはないの？
例えば、NheI、SpeIとかのsiteがあれば、XbaI末端と繋がるよ。

インバーティッドがあるとプラスミドが不安定になることもしばしばだから
そのせいかもしれないけど、クローニングの仕方があまりスマートではない気がします。

171 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/10 00:32:46

>>169
ボケと言われても返す言葉がありません。
ありがとうございました。

>>170
方向性をもって入れたかったので。
他のサイトはありませんでした。

分子生物学を全く知らない教授にベクター構築を命ぜられて、
しかも、情報が漏れるので他のラボには相談するなと言われて
自分の頭の中とプロトコールブックだけでぐるぐる考えてこのざまです。
それにしても、スマートじゃなかったですね。
もっと、勉強します。ありがとうございました。

172 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/10 00:39:06

インサートの入ったプラスミド：
XbaIで切る、その後、熱失活
Klenowで平滑末端化する
HindIIで切る。
アガロース電気泳動で1kb断片を精製

ベクター：
EcoRIで切る、その後、熱失活
Klenowで平滑末端化する
HindIIIで切りながらCIP処理する。
フェノールクロロフォルム処理、エタノール沈澱

上のインサートとベクターを量比を変えたセットを作り、それぞれライゲーションする。

173 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/10 00:42:11

上のHindIIはHindIIIの間違い。

ベクターは切り出し精製する必要は無いと思うぞ。

174 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/10 00:44:25

＞分子生物学を全く知らない教授にベクター構築を命ぜられて、
＞しかも、情報が漏れるので他のラボには相談するなと言われて

キティ害教授の匂いがプンプンするw

175 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/10 00:54:11

>>172

Klenow処理のあと熱失活を忘れないようにw

176 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/10 23:20:41

今バキュロウィルス発現系でタンパク発現しているんだけど、発現力がかなり乏しい、予備実験ではかなりいいところまでいったので安心していたらいざデータ出そうとしたら全然発現しねーでやんの。誰かいい方法しってる？

177 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/10 23:28:44

うまくいかないとかじゃなくて
指導教官蹴飛ばしたい

小汚いことばっかして！！

178 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/10 23:36:14

>>176

元のウイルスに戻ってやりなおせ。
ウイルスを植えついでいる間におかしくなることはある。

179 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/11 00:30:37

>>177
何があった？
具体的に。

180 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/11 00:39:51

かけるわけないじゃん！！
うちの教官絶対ここ見てるし
２ｃｈにかかれたことをよく
しゃべってるし
はーそれにしても上に弱くて下に強い！！
どこの世界でも同じかなー

181 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/11 01:09:11

>>180
そうか。
アンタが偉くなったときに、自分が書き込んだ時の気持ちを忘れないこと。
それが世の中を変える第一歩だ。

うちの研究室はこの前退官した教授がとんでもないDQNだったが、
その後、助教授から昇格した助教授は、まあ理想の先生とはとても言えないが、
前任教授のようなＤＱＮにはなるまいと努力して、
不器用ながらも学生と意思疎通を図ろうとしてくれる。
俺は世の中は徐々に良くなっていくと信じている。

クソ教官なんかにかまわずに、
自分の出来ることを粛々とこなそうぜ。
あまり考えるな。ゴミのことを考えると頭が腐るからな（Ｗ

182 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/11 02:09:24

そうだねーがんばろうっと。
でもふと冷静になるとゴミは自分なのかな？
本当に指導教官のほうがゴミなのか分からなくなる。
自分がゴミなら指導教官の態度は正しいわけで・・

183 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/12 19:39:12

卒論提出まで後一ヶ月を切ったというのに実験がすすみません。。
指導教官や共同研究をしている教官の方にも相談したのですがよい方法が（というか本来の指導教官はほとんどアテに出来ない状態）見つけられません・・
私が取り扱っているのは二本鎖のRNAで、これの塩基配列の決定を行おうとしています
流れとしては二本鎖RNAの精製⇒ｃDNA合成⇒クローニング　となるのですが
この二本鎖RNAの精製の段階でつまづいています
以前ゲルからの切り出しによる方法でクローニング、シークエンスを行ったところ失敗したため
今回は酵素処理により二本鎖RNAだけの状態にしたいのですが
酵素処理を行っても100bp～500bpほどのRNA？がどうしてもとりのぞけません
RNaseを使用すると二本鎖RNAも分解してしまうため、一本鎖のDNA、RNAを分解する酵素を使用しています
PEGNaによる沈殿でも除去できず、酵素処理によっても完全に除去できず、切り出しも控えたいという状態です
なんらかの方法で高分子の核酸だけ回収する方法などご存知の方いないでしょうか？
誰かorz

184 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 12:59:08

カラム使えばか

185 ：183：04/11/13 14:47:55

カラムも選択肢の一つとして上げられたのですが
操作に慣れた人であっても若干量の分解産物が残るという指摘を受けました
よって自分はまだカラムを使った核酸の精製を行ったことがありませんが
カラムを用いれば期待する結果が得られるでしょうか？
経験のある方いましたらお聞かせ下さい

186 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 15:48:51

>>183
切り出し～シークエンスのとき何をどう失敗したのか？
100bp～500bpのRNAは２本鎖RNAでないのか？
クローニングするだけなのにどうしてそんなに高純度な
2本鎖RNAが必要なのか？
それが聞きたいです．

187 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 16:54:49

つまり１８３はdicer等のmutantからdsRNAをクローニングして、
生体内に存在しているmiRNAたちの先駆体の配列を見つけ、
ライブラリーを構築しようと言うわけですか？

188 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/13 23:51:07

>186さん
切り出しに後に回収したバンドをチェックしたところバンド自体がややスメア状になっており
一部が分解しているように感じられました
その後シークエンスまでは順調に進みましたが、Blastで何とも引っかからず、確認でのハイブリも失敗
現在の段階では失敗の原因は直接分からないのですが、精製の段階でのミス（コンタミ）という方向で進めていました

100bp～500bpのが二本鎖ではないか・・というのははっきりとは分かりません
もしそうであれば酵素処理によって除くのは難しいのでしょうか

>187さん
自分の卒論の段階では、一部の塩基配列決定までとされていたのですが・・

189 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 00:05:53

力技で良いなら　
RNAを変性させてRNALigaseでアダプターつけて（オプション）
ランダムプライマーで逆転写
RNaseH後　DNApolで2本鎖にしてTAクローニングじゃだめ？

190 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 02:07:28

何か参考にしてる論文とかあるんじゃないの？

191 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 09:13:53

バンドとして確認できるくらいの量があるなら、作ったcDNAライブラリーをハイブリでscreeningすれば良いんじゃないの。

192 ：183：04/11/14 10:46:18

以前別の二本鎖RNAの解析を行った人の方法を元に行っています
酵素処理＋ﾌｪﾉｸﾛで十分取り除けたらしいのですが。。

>189>191さん
その力技によっても、やはり若干の目的としないRNAの混入はあるのでしょうか？
それともハイブリでのscreeningをするならば完全に精製を行う必要はないのでしょうか・・？

自分はまだ勉強不足のためお二人が挙げて下さった方法があることを知りませんでした
調べた上で、これらの方法を使用できるか否かを教官と話てみようと思います
ありがとうございました（ﾍﾟｺﾘ

193 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 12:35:25

大腸菌中で特に不安定な配列というわけじゃないのなら、
ライブラリーから50クローンくらい片っ端からシーケンス
すれば当たりも取れると思う。

194 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 12:36:20

>>187
ナイス・アイディア！

195 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 12:37:42

jien

196 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 13:43:45

さあ、クローニング競争が始まりますた！

197 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/14 14:46:38

>>187
NCBにdicerノックアウト論文出した深川研とかがやってそうだな。
ってか深川研の人？

198 ：LO：04/11/16 23:56:01

質問です。専門外なのですが、今、遺伝子実験をしている学生です。
核酸などを電ゲルに掛けた際に、500ラダーと目的の試料の理論値が余り正確に合いません。
これをクリアする方法は何かあるでしょうか？　もう、馬鹿ちんなもんで脳みそプスプスいってます。

（基本中の基本レベルの、ＪＭ109のpUC18挿入実験中です。今後質問しまくる可能性がありますので、どうかお助けくださいませ…　orz)

199 ：LO：04/11/16 23:56:37

あ、返答がくるか心配なのでage

200 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/17 00:28:59

>>198
DNAサンプルをラダーと一緒に流したら、DNA断片のサイズ（既知）がいまいち
合わないってことかい？

塩濃度が異なると（異なる塩濃度のサンプルと同時に泳動すると）そういうこと
もある。もしそれが理由なら、エタちんでもしたらいい。

201 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/17 01:18:35

pUCを制限酵素で切らずに流しているんじゃないの？

202 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/17 16:51:34

site-directed mutagenesisをキット買わずにDpnIで切る方法でやろうと思うんだが、
ストラタジェンのプロトコール見ると、プライマーが思いっきりダイマー化する気がするんだが、大丈夫なのか？

203 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/17 19:10:42

cDNAからRACEを行いたいのですが、Long PCRがどうしてもうまくかかりません・・・
5kbくらいで増幅されると思うのですが、強烈なスメアばかりです。

温度をあげたり、酵素（Long PCR用）を変えたり、プライマーを変えたり、
Nested PCRも試してみましたが、3kb以上になるとどうしてもダメ・・・
（短い場合は増えるけど、スメアの中にバンドがある状態）

どなたかアドバイスをいただけませんでしょうか？よろしくお願いします。

204 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/17 21:37:00

ストラタジェンage

205 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/17 21:58:38

>>203
5'か3'か。どちら？

206 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/17 22:17:10

>>205

5'です。

ポリメラーゼ各社のカタログを見るといとも簡単に10-20kbとか
増えてるのに、5kbでこんなに苦労するとは思いませんでした・・・
Long PCRで陥りやすい罠って何でしょうか？

207 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/17 22:38:57

>>206
RACEのキット使ってるの？おそらく使ってないでマニュアルでやっているんだろうね。
遺伝子の転写領域付近はCG-richだからPCRかかりにくいことが多いです。
その場合はCG-richに適した酵素が各社から販売されているのでそれを使うか、
DMSOを2-10%と入れてPCRかけるといいです。

ヒトの遺伝子ならネットで5'付近のCG contentsが調べられるのでそれを調べてみてはどうでしょうか？

208 ：LO：04/11/18 01:36:30

>>200,201
サンクスです。

pUC18のbpを電ゲルで泳動掛けた後に白黒でＣＣＤ撮影をし、その写真で数値計算をしています。
pUC18の理論値は2686bpなのに、写真では2300～2200位にしか見えません。こんなもんなんでしょうか？

---------------------------------------------------------------------------------------------
あと、後日、pUC18/JM109を培養し、そこからプラスミドだけの単離作業をし、
それらにRNaseA処理、未処理、EcoRⅠ処理の三種を行い、電ゲルをしました。
それをλHindⅢ、500bp DNA Ladder、プラスミドRNaseA処理、プラスミドRNaseA未処理、
プラスミドEcoRⅠ処理したものを平行に泳動させました。
これも写真を撮影し、その写真で計算しようとしています。
いま、pUC18 super coil DNAのバンドのDNA量とプラスミド溶液の濃度、収量を計算しようと思っているのですが、
どのように計算すればよいのか少々困っています。
バンドのDNA量はマーカーから見ればよいかと考えているのですが、残り二つの方法がいまいちわかりません。
この計算方法がわかる方、または説明してあげるよっていう方、もし居られましたら助けてください　orz

209 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/18 03:22:25

>>202
プライマーのダイマー化は起こる。
だから、まず片方だけで数サイクル回してから混ぜる。
それから１０サイクル程度PCRすれば効率があがる。

210 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/18 10:15:15

>208
OD260=1.0のときそのサンプルは50ug/ml濃度のDNA溶液だ
教科書とか読まないのか？　先輩とか先生とか教えてくれんのか？

>206
テンプレートをもう少し短く断片化したもので始めたら？　いきなり完全長は無理なときがある
Seegeneのキットはたいてい使えないぞ

211 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/18 10:27:16

>>208

まず上の部分についてですが、さすがにリニア－にして流してるよね？
切った後にエタ沈してから流せば、そんなに違わないと思うが。
それと、ゲルの解像度にもよる。2000-3000bpの分離が良い
ゲル濃度で流した方がいい。

下の部分だけど、バンドのDNA量が分かれば他の2つは自動的に分かるのでは？
それくらいは自分で考えた方がいいよ。
また、リニアなバンドなら泳動像から量を求められるけど、super coilのままだと
ずれるよ。リニアなものとsuper coilではEtBrの染まり方が違うから。
もちろんマーカーがリニアなものを用いてる場合だけど。

212 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/18 19:37:19

>>207

アドバイス、どうもありがとうございます。
横着にも、キットを使用しております・・・
それで、コントロールとしてキットについてくる遺伝子のプライマーを使用しても
スメアが強いのです（一応バンドは見える）。

もうこんな状態だと、PCRの一般的な問題にかかってくるのかな、と思ってしまいます。
遺伝子内部で短いアンプリコンだと、普通のTaqで問題なく増えるのですが、
長くするとダメ・・・3'→5'exoの酵素を使う上で注意点とか、ありましたら
どなたかおしえてください。

213 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/18 21:41:00

これからTet-systemを使ってタンパク発現制御を細胞内で行いたいのですが
Tet-systemの構築が難しくって難しくって・・・・
PNASとかNARのTet-systemの論文読んだんですけど分かりません
お味噌がタラなさ杉かも・・・
そいで教えて欲しいんですけどtTAとかtetRとかtetOとかってどこから
持ってこればいいんでしょうか？？
e.coliからとかって論文には書いてあるのですけど詳細なプロトコールって
何かに載ってますか？
だれか構築したヒトいたら教えてください（ペコリ

214 ：LO：04/11/18 23:59:21

>>210,211
あ、意味が分かりました。
ちょっとなんか勘違いしてたみたいです。
躓きに気づかせてもらいました。ありがとうございます。

215 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 00:06:40

>>213
大事なことを一つだけ教えてやろう

×持ってこれば
○持ってくれば

216 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 00:07:24

>>214
いったい何をどう勘違いしていたのか気になる。

217 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 13:38:48

pUCをカットせずに環状のまま流してたとみた

218 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 14:19:28

ノーザンをやっているんですが、どうしてもうまくいきません。
私が作ったメンブレンを使って、他の人にやってもらったところ、私のだけバンドが出ませんでした。
恐らく、ハイブリと洗いのステップに問題があると思われるのですが、
どのようなものが考えられるでしょうか？

219 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 14:24:04

>>213
セットと細胞を買えっていうか、釣り乙。

220 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 15:19:03

>213
いまいちどういう状況にはまっているのかわからないけど、
Tet systemの発現vectorを売っている会社のカタログを
よめば、発現制御の原理から説明してあると思うが、日本語だしさあ。
たしか、クロンテックじゃなかったけ？

221 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 15:21:19

>218
私が作ったメンブレンを使って、
他の人にやってもらったところ、
私のだけバンドが出ませんでした。

ということは、あなたの作成したメンブレンがだめなのでは？

222 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 16:15:02

>>221
説明不足ですみません。
私が2枚メンブレンを作成し、その後を二人で別々にやったところ
私のでは出ずに他の人のだけバンドが出たのです。

223 ：218：04/11/19 16:25:19

追加です。
私がやった場合、マーカーは濃いバンドだけでます。
やってもらった場合は全てのバンドが確認できました。
また、プローブをメンブレンにドットしてから発光させる事は出来ました。
以上のことから、ハイブリと洗いに原因があると思っています。
何か、注意点などあればお願いいたします。

224 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 16:37:07

そのうまく逝った奴にきけよ>>223

225 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 16:58:09

たしかに、224の言うとおりだと思うが。
その人と一緒に並んでやって、自分と操作がどう違うのか、
よーく観察してみれば、あとその人に自分の操作をみてもらって、
違和感を感じないか指摘してもらったら？

226 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 17:25:46

抗体を水で希釈してるんじゃないの？
BSA入りのにしてる？
俺の知り合いにlectin（１次）をスキムミルクで希釈しているやつがいた
本人曰く「うまくいっている」だそうな

227 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 17:28:14

もしかしてそのうまく逝った人ってKがつく人ですか？

228 ：218：04/11/19 17:30:54

>>224,225
確かにそうですね。
まだ細かいところに関しては聞いていないので、いろいろ聞いてみたいと思います。

>>226
抗体はDIGのバッファーで希釈しています。

>>227
いえ、違う人ですよ。

229 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 17:57:00

>>219
お金がないから作ろうかと・・・いや、まじで
やっぱ上を説得するしかないんですかね
>>220
つまり、一から作ろうなんていう状況です
原理自体は分かるんだけど、詳細なベクター構築方法が分かりません
遺伝子Xの導入とかじゃなくてシステム自体の構築です

購入しか方法はないですかね・・・？
だれか助けて・・・・

230 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 18:23:41

>>229
まずinvitrogenあたりからマニュアルを落とせ。

231 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 18:26:49

>>229
自作しても、オリゴを合成したりすると結構高くつくよ。
クロンテックで売っているレベルのものなら誰かにリクエストすれば手に入るのでは？
pUHD何たらとかいう名前だったと思う。

232 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 18:30:00

>229
それは、たぶんまずいと思われるけど、
Tetのシステムはクロンテックが特許をとっているから、
たとえ、研究が目的とはいえ、勝手に配列をPCR等で取得して、
構築したとしても、クロンテックから権利の侵害を言われるのでは？
たしか、クロンテックのホームページにTetシステムに関する
使用制限記述してあったとおもうが。たとえば、Tetのシステムを
ちょっと改良してvectorを改築したことがあったけど、
他の研究者の譲渡は厳しく制限されていた、さらに企業はなんて、
問題外。使用したければ、クロンテックに使用料を支払わないとダメだったはず。
非公表で使用するならばれないけど、論文に公表したとき面倒なことになっても
知らないよ。

233 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 18:33:02

普通に考えたらデッドコピー自作の方がコストかかると思うし、むなしいのでやめとけ
ボスに頼むのが難しい状況なら、自腹か知り合いを当たってこっそり分けてもらう（違法）しかないな。

234 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/19 19:05:42

>>230-233
レスサンクスです
そうですよね
さっきクロンテクのマニュアル読んだんですけどなんか最後にこ難しい権利
について書いてました
問題になるくらいなら購入を上にせがんだ方がよいかもしれませんね
わかりました
ありがとうございます（ぺこり

235 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/20 01:45:52

アデノウィルス作成がどうしてもうまくいきません　何かアドバイスがあればお願いします

使っているキットはBDのAdeno-X
pShuttle2まではうまく入っていると思いますが、

それをdouble digestionしてAdeno-Xベクターにライゲーション
→ampicillinで選択
→colonyを拾ってMiniprep

さて、ここで簡便に当たりかどうかを見るためにキット付属のPCR primerを使って
Adeno-X内に目的の産物が入ったかどうかを確認すると、8コ拾って6つ、という
感じでPCRがかかるのでうまくいったのかと思い、500mlで増やしてMidiprepで
生成したものをdouble digestionすると何も入っていない orz

この繰り返しです。たまにうまくいくこともありますが、本当にたまにです。
BDのAdenoXシステム使っている方は問題なくがんがんウィルスできていますか？

236 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/22 00:22:36

青コロニーと白コロニー・・・
大腸菌のシングルコロニーの色がなぜ変わるのかという明確な理由がわかりません。
何かいい文献無いですか？　知ってる方は教えてください。お願いします。

237 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/22 00:23:02

挙手age

238 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/22 00:31:15

>>236
Short course in bacterial genetics
Jeffrey H.Miller

239 ：236：04/11/22 01:46:57

>>238
ありがとうございます。ただ・・・・・・もし出来れば、日本語で書かれた何かを…

240 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 10:00:14

Tm値が大分違うプライマー（４５度と６０度）でプラスミドターゲットに
PCRやろうとしているのですがうまくいきません。なにかいい工夫ありませんか？

241 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 12:07:51

プライマー作り直せや

242 ：240：04/11/23 13:22:53

繰返し配列やGCリッチ配列ばかりなんであまり選択の余地がないんです。

243 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 13:41:44

>>236 http://www.h5.dion.ne.jp/~iyaku/Trans3.htm

244 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 14:40:17

プラスミドを１カットしておく

245 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 20:21:00

real-time PCRのプライマーがなかなか決まりません。。。
Taqman版のリアルタイムのプライマーをsyber greenのリアルタイムで用いることができるでしょうか…？
すいませんどなたかアドバイス願います

246 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 22:31:47

ABIの人の話では、プライマー検索プログラムはTaq manとSYBRで同じだったような。
だから、使えるんじゃない？
っていうか、ABIに聞いたら～

247 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 22:36:22

CpGメチル化って配列から分かりますか？

248 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 22:39:15

>>247
bisulfite sequencingやらないとわからないよ。

249 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 23:16:58

>>247
MSP法もあるけどな。

250 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 23:20:30

今Thermo sequenase II使ってプラスミドをシークエンシングしてるんですが、ピークがやたらと低く
塩基解析してもNばかりが出てしまいます。最初はテンプレートがコンタミしているせいかとも思いましたが、
EtBrで精製されているプラスミド使ってポジコンとってもおんなじようなので、多分手先が不器用で
PCR反応後のサンプル精製でロストしてるんだと思います。でキャリアーを使ってロストしないように
するつもりなのですが、キャリアーとしてLPA使ってもキャピラリカラムは大丈夫なのでしょうか？
経験のある方ご回答よろしくお願いします。

251 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 23:22:16

>>247
COBRAってのもあるよ。

252 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/23 23:24:59

>>250
LPAではなくグリコーゲンならOKだったけど

253 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 13:25:10

>250

外注にだせば

254 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 22:06:41

>250
うちはグリコーゲンで落としています。
使わなくても結果にかわりはありませんが、
念のためにいれています。

255 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 22:34:14

LPAで無問題

256 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 23:28:17

キャリアーよりもDNAの質とかprimerに問題があるのでは？

257 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 23:35:47

キャリア入れてる時点でヘタレ

エッペンタイプなら
純正のエッペンを使えば
デカントだけでほとんど廃液できる
そのまま（残ったまま）７エタ
ちょっと残った７エタは暗所で１～２時間放置

ＰＣＲプレートなら
デカントで半分ぐらいしか落ちないが
ひっくり返して弱いＧ（～50ｘＧ）で遠心すれば
完全に廃液できる

258 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/24 23:58:48

わたすも>>256に同意！
キャリアなんてRIレベルで見えるか見えないかくらいの
DNA量のときにしか入れない。
操作とか不器用とかそういう問題ぢゃないと思う。

259 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/25 00:28:35

キャリアで済むんなら入れればいいじゃん

260 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/25 01:58:07

プラスミドのポジコンもだめっつーわけだから
キャリアとかDNAの質とかprimerの問題ぢゃなくて
単純に下手としか言いようがない

キットについてるコントロール反応用のテンプレートと
プライマーで
バカ正直にやってみる

261 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/25 08:15:25

まあ
中には
ほんっとに
信じがたい香具師がいるから

一応チェック

１．ピペットチップは別の種類の液を取るたびに取り替えてる？
２．イエローチップで１μＬ取ったらどれぐらいか覚えてる？
３．蛍光色素の入った試薬を長時間明るい室内で晒してない？
４．エタ沈でちゃんと脱塩されてる？
５．キャピラリ用ローディング液（ホルムアミドとか）には絶対にイオンが入ってない？

262 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/25 08:34:00

お前ら相変わらずレベルの低い質問にはよってたかってしたり顔するな

263 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/25 10:53:34

そう言いたくても我慢してる香具師は100人は下るまい

264 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/25 13:13:28

出来ることをやったらいい。
ここには助けを求めて人が来るのだから。
役に立てそうなら返事をしたらいい。

何の役にも立てそうにないときには、
沈黙によってS/N比を落とすことに貢献できる。

265 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 14:25:03

SDSを用いないゲノムDNA抽出法で非イオン性界面活性剤(Tween20とNP-40)を用いる方法があるのですが、
今NP-40がないのでTween20だけでもPCR検体に使えるだけのものが回収できますかね？

266 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 14:48:53

>>265
NP-40の代用ならTriton X-100が良い。
NP-40 = Polyoxyethylene（9）Octylphenyl Ether
Triton X-100 = Polyoxyethylene（10）Octylphenyl Ether
基本的には、同じもの。
Tewwn20は、菌体を完全には壊さないと思う（穴は空くとは
思いますが．．．）。だから、DNAがとれてくるかどうか？
Tween20=Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monolaurate

267 ：265：04/11/26 15:03:15

>>266
素早いレスありがとうございます。
Triton X-100はあったのでこれで代用してみます。

268 ：250：04/11/26 18:59:03

色々アドバイスありがとうございました。で、問題の方はPCRの設定そのものの方でした。
使っていたプライマーのアニール温度がかなり高めだと言う点を別の研究室の人に
指摘され、試しに熱変成を推奨の96度30秒から97度40秒に変更したら、キャリア使う
までもない程しっかりとPCR産物ができました。ｲｯﾀｲﾅﾆｦﾔｯﾃﾀﾝﾀﾞｼﾞﾌﾞﾝ OTL

269 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 19:30:00

TAクローニングベクターのセルフライゲーションばかりでインサートが
挿入されないんですけど、だれか助けてください
Tベクターは購入したもので、ライゲーションミックスを使ってJM-109に
トランスフォーメーションしてます
インサートは700bpのCpG　islandなんですけど・・・
プロトコールそのままなのになんで・・・・（涙

270 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 19:50:44

>>269
PCR productはちゃんととれてる？ちなみにPyrobestではダメですよ。
あとはcolor selectionできるベクターならやった方が効率よくいきます。

271 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 20:12:21

P y r o b e s t ではダメですよ。

272 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 20:34:22

>>270-271
レスサンクス
大丈夫です　　EX Taq使ってます
PCR産物もゲル抽出してるんですが・・・
ligationをマニュアルどうりに5分でやってるんですが時間が短いですか？？
ﾅｿﾞﾀﾞ･･･

273 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 22:03:24

ゲルちゅーが
いかんのかも

はしっこのＡなんか不安定かも

274 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 22:20:39

プライマーの配列によってはＡが付きやすくなる
5'にGTTTCTTを付けてみる

Brownstein MJ, Carpten JD, Smith JR. 1996. BioTechniques 20:1004-1010

275 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 23:11:30

3'がピリミジンだとAがつきやすいみたいね。
EX-Taqビミョウなり。

276 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/26 23:51:18

私はExtaqで十分入ってます　pGEM-T easy
PCR産物がそこそこきれいなら精製しないほうがよく入りますよ

277 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 00:54:16

DNA溶液の濃度やベクター/インサート比なんかも大丈夫かい？

278 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 01:03:52

俺の経験によると、サブクローニング（TA含む）がうまくいかない奴には
以下のアドバイスが一番効果的だった。

「真剣にやらんかい！」

これ以上のアドバイスはないと思う。

279 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 01:27:44

insertの入ったpGEMはなんらかの機構でE.coli内でのreplicationが
阻害されているのかも。

280 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 11:10:54

アホ
ゲル抽出がヘボイだけだ
エタチンだけでライゲーションしろ
それから>>271は>>270を揶揄してるだけだろ

281 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 12:03:25

コンピテントセルのなかにすでにベクターが入っていたりして

282 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 13:12:22

>>269
クローニングでは、インサートDNAの定量をきっちりして、
ベクターとの量比をほぼ１：１（若干インサートが多めの
方が効率は良い。）で行うこと。ベクターの量は多すぎない事。
プロトコールの１／５で出るものはでる。
うまくいかない時は、ベクター：インサートの比を変えて
実験してみる。出てくるコロニー量、青白の比はどうなるか？
あと、700bp程度なら、配列次第ではインサートが入っても
青コロニーになることもあるので、色だけで判断せず、
いくつか（色の薄そうなの）をミニプレップしてみましょう。

283 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 13:28:27

上手くいかない時は282の言う通りに基本に忠実にやった方がいいだろうな。
まぁ、普通はTAクローニングキットを使えばどんな悪条件でも取れることが多いが。
どうしても取れないなら、279のような可能性もあるかもしれんから
ベクターやホストを変えるっていうことも考慮した方がいい。
それと、TAクローニングベクターは凍結誘拐繰り返してるとバックグラウンドが
高くなることがあるから気を付けた方がいいよ。

ちなみに俺は、購入したTAクローニングベクターを10倍希釈して分注して保存し、
ligationとかは通常の1/10以下のスケールでやる。
バンドが薄くて見えるか見えないかの断片からでもちゃんとクローニングできてるよ。
断片はゲル回収するか、PCR反応液をスピンカラムで精製することも多いけど。

284 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 17:14:52

>>273-283
レスサンクスです（ぺこり
インサートの濃度なんですがPCRかけてゲル抽してから量ってないです・・・
これから濃度もきっちりしてやってみます
>280
ゲル抽せずにエタチンだけでやって大丈夫なんですか？？
>282
インサートが入っても青コロになるっていうのは、本当ですか？？
なぜかは分かりませんが青が異様にコントロールに対して多いんですよ・・・

285 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 17:38:12

>>284
フレームが合えばそういうこともあります。

286 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 21:12:54

>>284
切り出しするよりもなるべくextra bandがでない条件でPCRすべき。
少量を泳動して、ある程度の量があったらligationしてtransformation
o.n.か10hくらいが良いかと思う。
そして100個くらいcolony PCRしてもあたりが無ければあきらめる。

287 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 21:51:11

俺はゲル切りをお勧めするよ。
extra bandが出ないような条件を見つけることは理想的だけど、
条件探索をするのに時間がかかったら面倒だし、領域によっては
かなり難しいこともある。
primerの設定が上手くいかないとprimer dimerができることもあるし。
それより、目的の領域が増えてさえすれば切り出し精製する。
たった１時間程余分な時間を費やすだけ。
それで確実ならそうした方がいいと思います。
100個もコロPする必要もないし。

288 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 22:14:05

final extention 30min

289 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/27 23:03:34

Aがつきやすいってわけね

290 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 00:14:43

TA cloning なんて基礎の基礎じゃん　しっかりしろよ

291 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 06:57:41

うちのような
vimbo labとしては
ベクター（pGEM-T）を１０倍ぐらいに薄めて使う
インサートもバンドの濃さにより
５から１０倍ぐらいに水で薄める
プレートに１０～５０個ぐらいコロニーが出るように

何百も出たってしょうがないしな

ほとんどコロニーがはえないことがたまにあるが
そういうときには
冷蔵庫に取っておいたSOCの残りを遠心濃縮して蒔き直す

292 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 13:19:25

ベクター手作りしないのか。

293 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 14:54:16

お前ら
ほんっっとおおおおおおおに
低レベルな質問には頑張ってよってたかって知ったかぶりするね！

294 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 14:57:30

なんにも知らない専門卒フリーターは黙ってな

295 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 15:00:52

普通に説明書嫁と思う今日この頃

296 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 15:06:27

bisulfite sequence のプライマー設計なんですが，
経験者に，PCRプライマーの末端部はもとのゲノムがCだった部分が
Tに変わったと仮定して用いた方がCからTへの置換がおこった
DNA断片を効率的に増幅できるといわれたんですが，
でもそうすると，PCRの段階でバイアスがかかってしまうと思うのですが，
無関係な所を末端にするか，元はCの所にするか，どちらがいいのでしょうか？

297 ：296：04/11/28 15:10:42

高学歴な>>294さんよろしくお願いします

298 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 15:15:11

腕が悪くて仕方がない→TOPO TAか、Pfu系を使ってZeroBlunt TOPO
水にヌクレアーゼがコンタミしている
インサートが少なすぎる
ライゲを5分ってのは短い
くらいか？

製品マニュアルのとおりやると、場合によって効率が悪いこともある。
某社のマニュアルを信用してやってみたらえらいめんどくさい作業をさせられ失敗した。
自己流で別製品と同じようにやったらうまくいく、というのはしばしばある。

299 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 15:19:00

>296
複数プライマーでやってみれば、バイアスのない結果になるでせう。

300 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 16:40:16

自演乙

301 ：296：04/11/28 17:26:24

>>299,300
こんなバカしかいねえのかよ
おまえらはミニプレップについてでも語り明かしてろバカどもが

302 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 17:39:38

ミニプレ
もうほとんどやんね

303 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 17:40:46

優秀な296さんは、にちゃんなんかやってないで実験頑張って下さい。
質問している人にろくなアドバイスもできず、馬鹿にするだけなら書かなくていい。

ま、そんな性格だからリアルで構ってくれる人が誰もいないんだろうけどな。

304 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 18:53:04

>>296
経験的には、しっかりとbisulfite処理していれば、完全に変換が行われる
から、あまり気にする程ではないと思うよ。

305 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 23:36:39

たとえ、専門から見れば低レベルでも、学生から見れば助け舟になるんじゃないのか？
そのあたりは理解できているのか？

306 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/29 03:27:29

嵐に反応するのも嵐なんだってさ。

>>302やらないのはロボットがあるから？
学生にやらせるから？

307 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/29 21:16:53

>>306
じゃあ
どういうときにミニプレが必要なの？

308 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/29 21:51:35

>>307
306じゃないけど、ミニプレは頻繁にやるよ。
いろんなコンストラクトを作る際には不可欠でしょう。
targeting vectorも含めて。

309 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/30 01:27:58

>>303
普通に考えて301≠296だろ

310 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/30 12:37:01

答えは実験しないからかも。

311 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/30 18:35:32

two hybrid やるんだけど，
bait とか prey をイーストに入れるときに
簡単でよく生える形質転換法があったら教えてください

312 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/30 18:37:46

えれぽ

313 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/30 19:48:40

エレポじゃない方法で簡単なの無いですか？

314 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/30 20:09:35

すふぇろ

315 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/01 09:18:23

ぬるぽ

316 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/01 11:19:57

Dでも無職はねｗ

317 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 13:17:53

すごく基本的な質問なのですが、QIAGENのPlasmid Purification キット（フィルタータイプ）を
使って大腸菌からプラスミドを精製すると、最終産物にタンパク質が80ug/mlほど残ります。
タンパク質は除フィルターで除去されるはずなのですが。

しょうがないので、エタノール＋アンモニウムアセテイトを使った沈殿を２回繰り返したのですが、
タンパク質はほんの少ししか除去できませんでした。

優秀な皆さん、助けてください。

318 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 13:22:40

>>317
OD260/280はいくつよ？

319 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 14:22:07

>>317
普通にフェノクロやれよ。

320 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 14:33:22

そうな、なんか白いもんでるよな、キアゲン。
フェノクロ振ると中間層か、沈殿になる。
いっぱいとれたときによく出るな。
Maxiのカラムで５００ug位とれるときには、
こいつも多い。

あれ、邪魔だな。

321 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 14:57:06

>317
だから何なの?目的がわからない。蛋白質を完全に除去したいのか?
だったら超遠心でもしとけよ。

322 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 15:46:46

また低レベルな質問によってたかりはじめたーーーーー

>>319で終わってるだろ

323 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 16:18:30

>>321のいうように目的によって何が必要か考えるようにしよう。
タンパクあってもどうでもいいことも多い。

324 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 18:08:49

酵素反応にＢＳＡ入れることもあるしな

325 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 20:34:33

ねえよ

326 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 20:38:10

>311　ﾘﾁｳﾑｱｾﾃｰﾄで十分だろ？

327 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 20:53:17

>>326
イーストの培養とかも教えてほしいんだけど
植え継ぎしないでいい培養条件とか

328 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 21:01:28

mid-logで回収して形質転換すればﾘﾁｳﾑｱｾﾃｰﾄで十分transformantが取れるよ。

>イーストの培養とかも教えてほしいんだけど
>植え継ぎしないでいい培養条件とか

植え継ぎしないってどういうこと？良くわからない。

two-hybridのホストなら普通にYPD（liquid)で振ればたくさん生えるでしょ？
一ヶ月位だったらYPD(plate)で4℃に入れておけば大丈夫だし、長期間保存するんだったら
ｸﾞﾘｾﾛｰﾙｽｯﾄｸしとけば？

329 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 23:12:57

何ml培養して一回分に用いてますか？ってことです

330 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/02 23:30:07

形質転換したいplasmid量にもよるけど大体1ml培養液がplate一枚分位で計算すれば十分じゃないの?

331 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/05 21:07:52

>315
がっ

プラスミド中の複数のXbaⅠサイトのうち、うまく切れるとこと切れないとこがあります。
メチル化の影響以外になんか原因あるんですかね？

332 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/06 04:39:11

TCTAGATC......

333 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/06 10:07:37

↑メチル化以外って書いてあるんじゃない？

334 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/06 12:49:51

ハイブリダイゼーションバッファーのストックにDenhardt's Solutionって入れても
かまわないのですか？それとも、使う直前に入れたほうがいいのですか？tRNAとpoly(dA)は
使う直前に入れたほうがいいのはわかるのですが。

335 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/06 12:59:07

俺は直前だな。

基本的に、使用直前に混ぜるのがデフォルトだよ。
めんどくさいけど、失敗しない。

336 ：334：04/12/06 13:12:10

>>335

ありがとうございます。

337 ：名無し＠昆虫：04/12/06 13:13:13

皆さん、昆虫には興味はありますか？

338 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/06 14:29:47

invirogen のレンチウイルスキットってどう？
使って見たいんだが、、、。

339 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 09:59:02

細胞培養中のヒロシです、細胞が見えません！！

340 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 10:05:22

眼科と精神科いけ

341 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 10:33:27

すみませんが、先輩諸氏にお聞きしたいのですが、
今、目的遺伝子ーIRES－GFPが入ったレトロウイルスを作っているのですが、
リン酸Caで導入したパッケージング細胞を蛍光顕微鏡で見ると、ほとんど光っていません。
一応、目的遺伝子が入っていないIRES－GFPの方はばっちり光っています。
IRES配列があると、こんなものなのでしょうか。著しく導入効率は落ちるものなのでしょうか。
何かご経験があれば、お教えください。

342 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 11:39:23

ベクターの薬剤耐性でセレクションかけてる？

343 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 13:56:18

優秀な皆さんに質問です。大腸菌を激しく増やす方法を教えてください。

100mLのLBに凍結保存した大腸菌を入れて、一晩振ってプラスミドをキアジェンの
ミディキットを使って分離するのですが、いつも40ugほどしか取れません。
遠心してもペレットらしきものは見当たらず、いつもチューブの壁を洗うようにして
この40ugを得ます。シングルコロニーから培養しても似たような感じです。

344 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 14:04:20

？菌体ペレットは？
プラスミドがlow copyとかじゃないの？
だったら大容量カルチャーかCamだな。

345 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 14:07:38

>>344

菌体ペレットも小さめのような。
大容量カルチャーとは、大容量のLBで一晩増やすってことですか？
Camってなんですか。質問ばかりですみません。

346 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 14:12:41

ミニプレップでは普通に取れるの？
以前KOベクターが大量培養だと取れなくなることがあって、そんとき
２ｍｌ×５０で振って精製前にまとめたら普通に取れた。

347 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 14:16:25

>>346

ミニプレップはないので試したことがないです。取れる量が少ない場合はミニのほうが
効率がいいのですかね？

348 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 14:28:37

小スケールのほうが大量系より収率がいいのは合成化学でも大腸菌でも同じ。

349 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 14:30:03

＞ミニプレップはないので

？
キットとかの話ではなくて、少量で振るってことだよ。

350 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 14:33:20

>>348
>>349

少量の培養をたくさん作って、一晩振ってみます。
いろいろありがとうございました。

351 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 14:45:58

かなりのアホだな
理解してないぞこいつ

352 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 15:28:08

いや、俺の意図は通じたぞ。
とりあえず明日結果報告しなよ。

353 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 15:40:15

大腸菌の培養方法はいろいろあるからな。
カタログ見てると、マジックLBみたいなのも売ってるし。
>351みたいな末路を送らないように、がんばれやｗ

354 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/07 16:18:24

たびたびすみません。
＞＞３４１です。
今、MSCVのレトロウイルス系何ですが、レンチ系に変えた方が
感染・遺伝子発現に関しては安定した結果が得られやすいでしょうか？？
作業の手間等考えた時、どっちが効率いいですか？？

355 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/08 15:50:32

ある系統のマウスで作ったデータをもとに、ジャクソンからマウスを買って次の実験をしようと思ったら、ジャクソンのマウスは微妙に違う亜系から作られてた・・・・・

356 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/08 16:01:48

スタブつくるときって，培養してから保存してる？
それとも刺したらいきなり保存？
どっちがいいの？

357 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/08 16:52:22

>>350

どうなった？

358 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 12:25:35

>>356
どっちでもいいんじゃない？
どっちのやつも見たことある。
おれは刺して室温で一晩のあと4℃に放り込んだ。
たぶん室温保存の方がいいはずだが。

359 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 14:57:39

マイクロアレイ用のスライドグラス上でハイブリダイゼーションをした後、
マイクロアレイスキャナで読み込みたいのですが、封入剤（？）を使ってカバーグラスで封入する
のですか？むき出しのままだとおかしいですよね。周りに聞ける人がいないので、
よろしくお願いします。

360 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/09 22:26:15

>>359
washして乾かしたらなにもしないでそのままスキャナーに読ませますよ。
すくなくともうちではそうしてる。

361 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/12 14:17:47

すみません、うまくいかないことではないのですがちょっとお聞きしたいことがあるので質問させていただきます。
syber greeenを用いたリアルタイムPCRなのですが、複数の遺伝子発現を経時的に追っています。
その際、同一時期の遺伝子発現を遺伝子間で比較することはできるでしょうか？　productのサイズ、primerのアニーリング温度など条件が異なるので一義的に比較はできないような気もしているのですが…。
どなたか詳しい方アドバイスをお願い致します。

362 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/12 17:13:11

つまり別の遺伝子の発現量の比較をRTPCRで出来るかと言うことでしょう？
あなたの懸念通りだと思う。
そんなもんPCRの条件次第でなんとでも成りうる。
そもそも別々の遺伝子なんだから翻訳調節なんかも異なる可能性もあるし、
最終遺伝子産物の量の評価はかなり怪しいことになるだろうし。

363 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/12 20:31:00

ミニプレップできれいに取るにはどうすればいいですか？ミニプレップのポイントを教えてください

364 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/12 20:57:40

>>363
その後の目的による。

365 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/14 23:16:39

どうしても制限酵素切れる場所が無いとき、
プラスミドの一部（４ｋｂくらい）をPCRで増やして
別にベクターにインサートするってありですか？

366 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/14 23:24:12

>>365

ごく普通、go ahead!

367 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/14 23:33:07

>>365
mutationに気を付けた方がいいよ。
念のためにシークエンス確認するか、クローニング後にインサートの中を
別の制限酵素で入れ替えた方がいい。

368 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/14 23:39:30

KODかPfuを使って10-15cycles程度で増やすならモーマンタイ

369 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/14 23:54:29

>>366-368
ありがとうございました。
指導教官が、そんなこと聞いたこと無いと言うもんで・・・・
早速プライマーを注文してもらってやってみます。

370 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 01:43:25

質問です．GFP mouse から採取した細胞の培養を続けているとGFP陰性の細胞もでてくるのですが
GFP Tg mouse のgfp ってgenome にintegrate されているわけではないのでしょうか？
それとも常にセレクション用の薬剤をいれておかないと落ちてしまうのでしょうか？
教えてくんで申し訳ありませんが、宜しくお願いしますです．

371 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 06:55:10

>370
薬剤耐性遺伝子が無傷でも目的遺伝子に傷が入ることはありうるわけで、
薬剤でセレクションかけても全てが解決という訳ではないです。
出来るだけ早い段階でストックをつくり、ある一定期間で切り替えていくのが
無難ではないでしょうか。

372 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 10:34:39

>>370
GFPマウスの全ての細胞でGFPが発現するとは限らないし、
継代を重ねるとGFPが落ちていなくても光らなくなることはある。

373 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 14:28:01

細胞懸濁液でSDSPAGEのサンプルを調製したのですが
納豆みたいに粘性のあるサンプルになってしまいました。
これはサンプルの濃度が高いということですか？

374 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 14:49:29

細胞のゲノムDNAが粘性の原因。
軽く超音波破砕してやればおk

375 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 14:55:44

>>373
もっと簡単なのは針付き注射器で何回か針を通してやればサラサラになるよん。
眼鏡クリーナーみたいなバッチのチョー音波装置があればそっちの方が簡単だけど。

376 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 15:00:14

>>369
経験浅そうだから念のため言っとくけど、
PCR産物はベクターに入りにくいよ。

貰うか、買うかしてPromegaのpGEM-T easyとかに一度いれて
酵素で切り出した方がいい。

377 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 15:10:34

↑
なにこのひと
あたまわるいんじゃねえ？
いみわかんねえ

378 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 15:17:54

>>377
わかんねえなら黙ってろよ（w

379 ：370：04/12/15 19:48:37

>371, 372
サンクスです．
やっぱ光らなくなることもあるか．．．．

380 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 00:32:09

>>376
PCR産物はベクターに入りにくいなんて初耳です。

381 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 07:37:56

>376
俺も初めて聞いた。
(煽ってるわけじゃなくて)
理由があるなら教えてよ。

382 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 11:54:30

一度いれて切り出すってのもよくわからんな
はやく教えてください
経験豊富な376=378

383 ：373：04/12/16 12:08:11

>>374,375

おお、そうでしたか
ありがとうございます、やってみます。

384 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 13:24:35

>202です
>209
みたいな技をつかわなくても，マニュアル通りやれば出来ました．
3ベースおきに３箇所にポイントミューテーションをいれようとしましたが，
一回では無理でした．
２箇所まではOKでした．
以上報告まで．

385 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 15:34:03

376ではないが
制限酵素サイトを付けたプライマーでＰＣＲを行ったものをクローニングしたい場合
（１）ＰＣＲ産物を制限酵素で処理した後にベクターに挿入する。
（２）ＰＣＲ産物をそのままＴベクターか平滑末端ベクター（３’Ａなしの時）に挿入する。
の二通りが考えられるが（２）の方がクローニング効率が良いと言いたいのだろう。
（３）「一度入れて切り出す」は（２）で作った中間ベクターから制限酵素で目的領域を切り出して本命ベクターにサブクローニングすると言う意味だろう。

（１）の方法で本命ベクターにそのままクローニングする方が手間が少なくて良さそうだが、かなりの手練れでも制限酵素や配列によってはなかなか成功せずに２週間以上過ごすこともままある。
（２）（３）は２ステップで面倒くさいが失敗は少ないので、期日までに完成させる必要がある場合や、同じ配列をいろいろな発現ベクターで使い回す予定があるなら配列決定の手間を減らすため採用する。
376の言うように初心者向きかもしれない。

386 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 15:48:02

最後の配列決定の手間を減らすってのが意味不明ですよ
3時くらいに巡回してるんですか？あなた

387 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 15:49:16

ああ，そういうことねわかった失礼

388 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 16:20:26

>>385 の説明は（「配列決定の手間を減らす」の部分も含めて）わかったけど、
>>376 の「PCR産物はベクターに入りにくい」という表現はよくないね。

>>386 の「3時くらいに巡回してるんですか？あなた」の方が意味不明です。

389 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 22:34:35

>>385
（１）の方法はやる前に使う制限酵素を選べば何の問題もなくできるし、
その場合は（２）より効率いいけどね。
自分の場合はＴベクター使わずに常に（１）でやってるよ。
末端で切れ難い酵素の場合は（３）のようにするけど、それでも（１）を
経て（３）だね。

390 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 13:04:06

アホかお前ら
足場つけときゃたいてい切れるわぼけ
一回ほかのベクターに入れるなんか聞いたこと無いわ

391 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 14:13:01

↑
無知なヤツ発見！

392 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 14:14:05

>>390
NEBのカタログよく読め。

393 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/17 15:12:46

は？６bpくらいつけとけばたいてい切れますが？
足場ってのは認識配列じゃないですよ？
逆に切れないやつを教えてほしいね

394 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 23:13:57

NdeIでインフレームに入れるときはTA vector 使う。
どっちにしろ大した問題じゃないからやりやすい方でやればいい。

でもダイレクトで入れることを強要して学生虐めちゃダメだよ。

395 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 23:26:02

>>380,381
自分が上手くいってるかいってないかは別として、そのくらい知っておくべき。
将来指導的立場についたとき、ついた学生が不幸になる。

396 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/19 00:10:13

>>395
何を知っておくべきなんだ？
PCR産物が入り難いことなんてないぞ。

397 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/19 00:13:33

>>396
「入り難いこともある」ということ。
ラボ移っただけで、突然PCR産物が入らなくなることもある。

398 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/19 00:18:32

>>396,397
というか、この手の議論は不毛じゃないか？
経験したことない人は「入る」と言うし、経験した人は「入り難い」と言うし。

399 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/19 00:20:00

>>397
それはPCR産物に限ったことじゃないのでは？

400 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/19 00:38:58

>>400
genomic PCRが上手くいかなくなったりな。
世間では「水が悪い」ということになってるが、本当かどうか。

401 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/19 15:36:26

蛍光抗体法のウェスタンなんですけど、
標的のタンパクと同じくらいの位置に別のタンパクも多く出ている場合、
それによって標的タンパクがマスクされ抗体が付きにくくなる、という事はあるんでしょうか？
ブロッキング、抗体、界面活性剤濃度等の条件さえ適切であればそれでも十分に検出されるものですか？
あるはずのバンドが全然見えなくて困っています。

402 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/20 02:43:28

単なる疑問点なんですが教えて下さい。
大腸菌培養LBプレートって中性にpHあわせてますけど意味ありですかね？
じつは、中性に合わすの忘れたっていうプレートを時間がなくて使ったんですが、
なんら問題なく生えてるんですが・・・
ただ、なぜかえらくコロニー数が多いのが疑問点っていったら疑問点なんだが・・・
だれか知ってたら教えてください

403 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/20 14:38:57

>>401
量による。
例えばIPして Westernで検出する場合、無造作にボイリングで溶出すると50kDaにIgGのヘビーチェーンが
ドカッとでるが、目的タンパク質も50kDa近辺だと非常に検出しにくい。
これはタンパク質がマスクされるというよりか、メンブレンのキャパがオーバーしてるのだと思う。
その他、Whole cell lysateを流したときでも、大量すぎるときはキャパオーバーになって逆に検出しにくくなる。

>>402
別にpH合わせなくてもOK。自分は合わせたことない。極端にアルカリとか酸にかたよってなければ生える。
コロニー数が多かったのはたまたまだと思うが。

404 ：401：04/12/20 16:09:40

>>403
レスどうもです。その場合はカラム精製によって解消されますかね？
cntで精製タンパク流した時も感度低かったんで、
そもそも条件検討からして問題がある気もしますが・・・

405 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/20 17:56:49

>>403
レスサンクス
やっぱりそうなのか
いや、なんとなくそんな感じはしてたんだが微妙にpH酸性だと耐性物質
たとえば、アンピシリンとかが壊れてなんでもかんでも生えるのかとか考えて
しまいましたよ
pH合わせも儀式みたいなものなんですかね・・・・(ｰｰ;)

406 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/20 19:05:59

ビシッと合わす必要もないが、大幅にずれると生えは悪くなると思う。
TB培地とかバッファー入れてるくらいだし。

407 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/20 19:52:01

酸、塩基性では導入遺伝子が変異起こすとかっていう報告ないんかいな？
素人考えなのだが・・・・

408 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/20 20:34:58

fusion PCR　っていくつか方法があるが，
これでウマくいったという経験者はいますか？

409 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/21 11:40:04

>>404
大体、使ってる抗体はOKなの？
例えばEndoのタンパク質は市販抗体でも検出限界以下の場合も多いよ。
どうしても見たかったらカラムでフラクショネーションして濃縮するしかない。
その前に遺伝子持ってたら大腸菌なりCOS1なりに強制発現させて、条件検討かな。

410 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/21 12:17:27

401=404 は何が問題点なのか自分でわかっていないのではないか？

411 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/21 12:24:18

>>406
ＬＢとかでは培養していると大腸菌の排泄物でｐＨがどんどん下がって来てそのうち増殖が悪くなる。
緩衝作用でｐＨを大腸菌が増殖しやすい中性にしときましょって言うのが、その辺の培地。
バッファーの意味は、コロニー作る頃はほとんど関係ないでしょう。

コロニー作る時はバッファー入れなくてもいいけど、一応 pH6.8～7.4 ぐらいにしておいたら？

412 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/21 12:26:43

最後の一文は　>>402 へのレス

413 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/21 13:58:00

>>412=411
そうですね。一応プレートも中性付近にしときます　
しかし、培養と違ってプレートのpHってのはやっぱり不明だなぁ・・・

414 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/21 14:07:00

LBならうちの試薬だと毎回1リットルに1N NaOH1.4ml加えれば中性になるから毎回pHはからずにNaOH加えてるよ
一回条件決めとけばあとは楽だからぜひはかった方がいいよ

415 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/21 14:19:27

細胞分離したいんだけど
磁気ビーズつかうのと比重遠心するのと
どちらが簡単かな？

416 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/21 21:46:37

頼むから何をしたいか目的くらい　以下略

417 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/21 22:10:26

>415
ビーズを使いたいのなら、目的とする細胞の細胞膜表面のマーカーに特異的な抗体がなきゃならんし
比重では(そのまんまだけど)細胞の比重がハッキリと異ならんと分けられない。
自分が何を目的としているか分かっていれば、どちらを選択すべきかは決まってくると思うのだが...

それだけじゃなんなんなので....

どっちもキットがあるから楽と言えば楽。
ただし比重に関しては、遠心機やパケットに応じて細かい予備実験が必要になるかもな。

418 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/22 01:59:24

5'RACEやった後のPCRがやるたびに違うバンドがでちまう。
ちょっと泣けてきた。
誰か助けてほしいっす

419 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/22 11:43:11

>>415

必要なものが揃ってるならどっちも簡単。

420 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/22 12:04:25

>418
nestedをやってみたら？　キット使っているんですか？

421 ：418：04/12/22 13:00:40

nested PCRはやってますよ。
キットは○ンビトドジェンのGeneRacerっての使ってる。
やっぱ発現量がめちゃ少ないせいかな

422 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/22 13:04:00

それ，ビトロジェンの偽ブランドだからうまくいかないんだよ

423 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/22 18:11:55

RIでフジフィルムのBAS使ってる人いる?
imaging plateで白と青の2種類があるんだけど何が違うの？

424 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/22 21:32:38

415ごめん。
CD34マーカーにして細胞分離したかったのよ。
どっちが楽かしらと思って。
その後の培養できたりできんのかしら？？
磁気ビーズも結構種類あって
どれにしていいかわからん。
MACS辺りが良いかしら？

425 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 15:12:09

>423
青：トリチウム（Fujiは使い捨てを推奨）
白：それ以外

426 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/27 16:59:10

だれか、癌原因タンパクの発現度とその遺伝子の増幅度が一致しないときって
どういうときか知ってたら教えてください
例えば細胞は増殖しないのにたんぱく質ばっかり発現されてる状態って考えても良い
のでしょうか？？
癌細胞に見られるように1日経ったら二倍に増える・・・とかがないのに癌原因タンパクが
一杯でてる・・・そんな感じなんでしょうか・・・
スレちがいかもしれんがよろしくお願いしますm(__)m

427 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/27 21:49:03

変異した淡泊ばっかりとか。
活性がちょろとしかないとか。

428 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/27 23:10:59

>421
おれもGeneRacer使っているけど　このキットはかなりうまくいくよ
ただCIP処理が不十分だと不完全長がいっぱい取れてきます
もちろん自作プライマーが駄目だと非特異的がいっぱい
とりあえず大きいサイズののバンドをサブクローニングしてみれば？

429 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/27 23:17:47

>>418
元のRNAは同じもの？

あと、もう少し目的をはっきりさせないと分からないが、
今ならデータベース検索だけでもおおよその情報は得られるよ。
cDNAとしてつながってなくても5'を絞り込むことは可能。
そのプライマーと自分の3'でPCRかかればひとまず終了だろ。

あと、はまりの可能性を一つあげるとスプライシングバリアントだね。

430 ：418 421：04/12/27 23:32:47

>>428
CIP処理ってキットの説明書通りだと50℃１hですよね
これをたとえば２時間にするとか酵素量を増やしたりするとうまくいくのですかねえ？

>>429
元のRNAは同じです
自分の研究は既知の遺伝子でUTRもcoding reagionも配列は
もうわかっててその遺伝子のスプライシング機構を調べようってものなんですよ
やっぱりスプライシングバリアントなんですかねえ

431 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/28 00:37:32

>426
>だれか、癌原因タンパクの発現度とその遺伝子の増幅度が一致しないときって
>どういうときか知ってたら教えてください

遺伝子がアンプリファイされていないのに、
蛋白の発現量が多い場合ってこと？
一般論としては、遺伝子のamplifyと蛋白のoverexpressとは
別の話だよね。
それがなんで後半の細胞の増殖の話につながるのか、わからない。

432 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/28 08:57:15

>430
うだうだいってないでシーケンスしろや

433 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/28 09:49:08

>>431
無知ですまん　勝手に解釈しました
DNAの増殖ってのは複製とはまた違うってこと？
どうもDNAの増殖ってのがピンとこないんですよ
なんかどっかに詳しく載ってるのとか知ってたら教えてください

434 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/28 11:56:49

遺伝子の増幅という言い方は、
そのDNA配列がなんらかの理由で一つの細胞の中で
たくさん存在するようになることを表していて、
細胞が分裂するということを表している表現じゃないよ、
っていえば分かる？

多分ガンに関するごく基本的な教科書を読めば
どっかに載ってると思うけど、専門から少しずれるので、
各論の論文を読んだことはあっても、教科書を
買って読んだことはないので、
詳しく載ってるところっていうのは、分からない。
ゴメン。

435 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/04 20:28:36

>癌原因タンパクの発現度とその遺伝子の増幅度が一致しないときって

単純にこのフレーズだけ読むと、mRNAが出てるのにタンパクが出てない、あるいはその逆、
と解釈される場合が多いと思う。正確な言い方じゃないけど、そこは阿吽の呼吸ってやつで。

でもその後に続く文を読むと殆ど意味不明になる。したがって、自分的にはこの質問はスルー（w

436 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/05 18:40:57

>>435
それならtranscripionもしくは遺伝子の発現って書くだろ
amplificationってなってるから分からないって言ってるからその解釈は間違いだと思うがな

437 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/06 11:53:37

オマイラ考え込み過ぎ。
質問者がわけ分かってないだけだろ。
スルーしる。

438 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/07 08:01:55

最近プラスミド抽出の収量が低すぎます。
midi-prepで１００μgも取れないです。ちなみに３００ｍｌマイヤー内５０ｍｌ液体LBで３７℃、１６hr culture。ベクターはpGEM-T。
インサートが原因なのかなあ。シーケンサーで配列を読んだらインサート方向も特定の方向（T7がセンス方向）ばっかりだし。
何か対処法やコツがありましたらどうか教えてください。

439 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/07 11:58:13

midiで100 って、qiagen midi filterならそれは公称100だったと思うが。
対処法がどうこうというのより、
pgem-tでそんなに取ってどうするという気もするし。
いい使い道があるなら教えて。
もっと必要ならmaxiにしたらどうでしょう。

440 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/07 14:38:28

Trizolを使って海馬から全RNAを抽出するときに、どのタイミングでRNase inhibitorを
入れればよいのでしょうか？最後にRNAのペレットができて、水に溶かすときに入れるのは
わかるのですが、ホモジェナイズする時にTrizolのなかに入れてもよいのでしょうか？
このinhibitorはたんぱく質なので、Trizolの中に入れても変性してうまく働かないような
気もしますが、ご意見よろしくお願いします。

441 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/07 14:50:05

駄目に決まってるだろ。

442 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/07 18:35:14

逆転写の時に入れろ

443 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/07 18:39:42

RNA分解を心配しすぎるのは初心者の悪い癖

444 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/07 18:42:05

>>440
そんなに心配だったら、RNAの安定化剤みたいなのが
あるから、それを使えば。
RNAlaterってやつ。使ったことないからいいかどうかわかんないけど。
よほどRNaseが多いところ（膵臓とか）以外はだいたい普通の操作で
大丈夫だと思うけど。

445 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/07 20:51:44

RNAlaterエタノールなどで不溶化するしRNAと挙動が同じで
除きにくい　でもタンパクも安定だぞ　むふふ
抗体なんかの保存に使え

446 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/07 21:48:55

あはっはっ、だっはっはっっ！！
電気泳動かけたゲル落として粉々にしちまったよ。
あとプラス１時間実験延長。

447 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/08 09:36:26

ある遺伝子をレトロベクターに導入しています。
２．７Ｋほどまで挿入が完了し、あとの３００ｂｐをいれようとしていますが
全くはいりません。
この３００ｂｐの部分は両端にEcoRIサイトを持って、２．７ＫのほうをＥｃｏＲＩで処理後
CIP処理してライゲーションしています。
簡単なはずなのですが、まったく挿入されません。
大腸菌のコロニーは少数できます。50コロニーほど拾ってみると、４９は意味不明のシークエンスとなったベクター、
１コロニーのみ、EcoRIサイトで逆にはいったものがあります。
セルフライゲーションはありません。
これっていったい何が起こっているのでしょうか？
30℃で培養したりしていますがうまくいきません。

448 ：岸本要一郎：05/01/08 09:40:29

わからんね

449 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/08 10:50:12

努力をケチるな

50といわず96といわず
192ぐらい拾ってみる

いやがるインサートというのはしょっちゅうあるが
拒絶されるほどのはむしろ少数派

だから
けし粒みたいな小さなコロニーを優先的に拾ってみる

450 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/08 11:02:39

>>449
なるほど、参考になります。

451 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/08 11:04:16

>>449
アホかお前は。まさか学位餅じゃないよな？
なぜ意味不明なインサートが入るのかを考えるのが先決だろ。
「意味不明なインサート」は何かはっきりさせろ。

対策はそれからだ。

452 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/08 11:12:26

>>451
いや、「意味不明のインサート」じゃなくて、ベクター自体が意味不明になっているのです。
ちゃんと複製されているから、オリジンは保たれているのでしょうけど
元のベクターよりかなり小さなものになっています。
マルチクローニングサイト近くにプライマーをおいたＰＣＲでもかかりません。

おそらく最後の３００ｂｐをいれることで、大腸菌が嫌いなシークエンスができて
破壊されてしまうのではと思っています。

453 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/08 11:15:51

じゃあstrain変えたら？

454 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/08 11:42:41

>>452
インサートを増やしたベクター由来じゃないの？
意味不明っていうふうに片付ける癖をつけるのは良くないよ。
ベクターが小さくなったのは何故か、徹底的に調べなよ。
そのままだとソルジャーになっちゃうよ。

455 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/08 12:10:14

インサートを増やしたベクター由来ってどういうこと？

456 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/08 12:18:05

>>455
インサート切り出したつもりが、余りのベクター側もコンタミしてるかもしれない。
両端にERIサイトがあるってことは、ベクターのあまりもセルフライゲーションする
可能性があるだろ。

457 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/09 06:29:14

>>452
>元のベクターよりかなり小さなものになっています。

Ｓｔａｒ活性がでてるんじゃないの？
制限酵素の切断条件を見直した方が良いと思う。

ＣＩＡＰはしっかり失除けてる？
これまた大量に入れてると後々しっぱいにつながるよ。
（Ｉｎｓｅｒｔも脱リンされたりとかして）

確立されてる実権でおかしなことが起こるときは大抵初歩的なミスが多い。

>おそらく最後の３００ｂｐをいれることで、
>大腸菌が嫌いなシークエンスができて
>破壊されてしまうのではと思っています。

って考えるより、自分の操作、利用してるＤＮＡが
正確かを確かめることの方が先決です。

458 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/09 13:00:56

まあまあ皆さん、いつもうまく行ってるのに今回に限って…ということ
であれば、constructのtoxicityってことも十分にあり得るわけで…
StratageneのSTBLというhostはプラスミドのコピー数をぐっと下げる
ので、toxicなプラスミドでも安定ですよ。試してみたら？

459 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/09 13:19:32

>>1-458
そんなところで苦労してるようじゃいつまで経ってもbig jouranlは無理だねえ

460 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/09 15:47:43

>>458
ABLE

>>459
journal

>>447
ABLE CかK使っても良いが、ABLEはKan(r)、Tet(r)だからね、一応。
転写産物がtoxicなのかDNA自体が維持されにくいのか不明だけど、
後者ならSUREやStbl2を使ってみても良い。単に取れにくいだけの
コンストラクトの場合は、TOP10やDH10Bみたいな高い効率の出る
株をつかってElectroporationするのが近道っていう場合もある。
形質転換効率が低いほど変なバイアスがかかるからね。

461 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/09 19:19:27

>>418
>>421
>>428

私もGeneRacer使っています。困ったことがあるんです。
5'Primer抜き、3'Primer抜きでPCRすると濃いバンドが現れます。
でも、双方を加えてPCRを行うと、全くでは無いにしても、
とても薄いバンドしか現れません。
一般的にこういう時、何が原因なのでしょうか？？

房な質問かも知れませんが、ご教授お願い致します。

462 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/12 07:37:06

>>457
CIPはフェノール＋クロロで処理してます。
ＣＩＰ失活はしていると思うのですが、フェノールの処理に問題があるかもしれません。

463 ：４４７：05/01/12 08:10:42

>>460
参考になります。
あらゆる可能性を考えて実験を繰り返しています
うまく行けば又報告させていただきます

464 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/12 10:15:47

>>462
そんな部分の問題じゃないだろ。

465 ：４４７：05/01/13 05:19:50

結局、ＣＩＰをやり直してライゲーションしなおし、生えて来たコロニーを200ほど拾って
2クローンを得ることが出来ました。
どうしてこれほど効率が悪いのかわかりませんが、ＣＩＰ後のフェノール処理で
フェノールが残存していたのか？と思っています。

皆さんＣＩＰ後の不活処理ってどうしてます？

466 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/13 11:16:18

>>465
だからCIPは関係ないって。
なぜそんなにバックグラウンドが出るかが問題だろ。

467 ：466：05/01/13 11:18:21

訂正

フェノールの残存とかＣＩＰ後の不活処理は関係ないって。

468 ：４４７：05/01/13 11:55:17

>>466
ですね。
でもまぁ目的とするクローンが出来たからよしと。

469 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/13 13:29:23

＞CIP
そういうことがある場合、nucleaseのコンタミを疑うべし。
CIPで苦労してクローニングしたら、ベクターの端がかじられていたことがあった。その場合、せっかくリン酸はずしたつもりでもバックがあがるよ。そういうときはBAPとかにするのが一番。

470 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/13 14:44:45

>>465
ベクターにもよるけど、インサート3kはキャパ限界に近い可能性もある。
効率が悪いのは多分このせい。

あと意味不明のベクターが入ったコロニーは多分何かのコンタミ。
インサート切り出したりするときの泳動槽をよく洗うとか注意。

CIPは>>469が言うように、かませすぎると末端が欠けることあり。学部４年のころコレで失敗した。
自分はユニット控えめで、制限酵素で切った後エタ沈もしないでCIPだけ入れて30分ぐらいやってる。
至適pHより酸性側に寄ってるのはわかってるが、その程度で十分だと思う。

471 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/13 22:41:37

コンストラクトの時には泳動バッファもエチブロも新しいのを使うのがいいですね

とかいいつつ
短いインサートなら適当にやっても別にぃー

472 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/13 22:49:42

>>470
3kbのインサートは限界に近いんですか？
今度両側に制限酵素切断サイトを付けた７ｋｂのPCR産物を
ベクターのXba－BamHサイトに入れないといけないのですが、
大きなインサートを入れるためのコツとかありますか？
やっぱし２００個とかコロピーしないとダメかなあ。

473 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/13 23:03:53

>>472
3kbが限界か否かはベクターによるんじゃない（そんなベクターは知らないけど）。
俺はmainにpUC119かpBluescriptを使ってるけど、25kbのインサートは
難無くクローニングできる。もちろんインサートの配列によっては不安定に
なるんだろうけど。

それと、７ｋｂのPCR産物をXba－BamHサイトに入れるような単純な
クローニングの場合、コロＰなんて10個で十分すぎるだろ。

474 ：472＝初心者：05/01/13 23:29:59

>>473
ありがとうございます。
ベクターはｐBI121という植物にアグロバクテリウムで形質転換するときに
よく使われるベクターです。
１４Kbもあるベクターなので、さらに７Kbも入れると２１Kbになるので、
大腸菌に形質転換しにくかったりとかするのかなと考えたわけです。

まあ、そんなに恐れずに、とにかくやってみろってことですね。

475 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/14 02:24:02

>>472
Xba-BamHIの７KB？
何の遺伝子かわかったよ

476 ：４７５：05/01/14 02:25:13

あ、と思ったら違うみたい。

477 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/14 03:02:48

しかしまぁ、
誹謗中傷、妬みと欲望が渦巻く２ちゃんねるの中にあって
オアシスのような素晴らしいスレだな

478 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/14 15:25:24

>>477
ていうかね、昔はこういうスレが多かったんだけど、
アフォな書き込みする奴が増えてから
まともな書き込みができる奴が去った。

最近は中傷と就職の話ばっかり。

479 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 13:41:06

>>474

pBI121のマルチクローニングサイトのXba I - BamH Iの配列を確認してみろ。
異様に近く無いか？普通はダブルダイジェッションできないんぢゃないか？

480 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 13:53:20

ヲレの手元の配列データではpBI121のMCSは

TCTAGAGGATCCCCGGG

XbaI/BamHI/SmaIと並んでいるが、近すぎる。

481 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 14:04:06

XbaIもBamHIもendに近くても良く切れる酵素だけどね。
www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_linearized_vector.asp
心配だったらvectorを別の酵素（XxxIとする）で切って、XbaI-XxxI、XxxI-BamHI、XbaI-BamHIの
3 piece ligationするとか。

482 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 22:54:11

>>480
ｐUC１９由来かな？これ。

483 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/17 08:47:14

t ctagaggatcc
agatc tcctagg

切れるやろこんぐらいだったら。
忘れたけど俺もxba bamでやったことあるような気もするぞ。

484 ：教えてください：05/01/18 10:18:38

PCRやらサブクローニングやらをくり返して、やっと作った3.7ｋｂのinsertを6.6ｋｂのvectorに入れたいのですが、
どうしても入りません。
vectorにこれ以外のREサイトがなく、これ以上insertを分けることは不可能なのです...。
どなたか「こういうの試してみたら？」というのがあれば教えていただけませんでしょうか。

具体的には
このinsertの入ったplasmidおよび目的のvectorを
Asc１とPac1でdouble digestion(NEBuffer4)ののち
キアゲンのGel extraction kitで精製。

ligationは
NEBのT4 DNA ligese(high concentration)を用いて
vector(75ng):insert比を1:2, 1:5, 1:10とふって
total 20ul, 16℃×O/N.

（両端sticky endですので、ligaseを混ぜる前にDNAのみ、60℃×3min→on iceのheat denatureを行っています。）

transformationは
invitrogenのpir2 chemical competent cell 50ul
（このcell以外では増えないvectorなので他のchoiceはありません）
にligation反応液の2.5ulを入れて行っています。

通常のT4 DNA ligaseを使っていたあいだはコロニーがまったく得られず、
high conc.にしてコロニーが10個だけ出てきてよろこんでいましたがすべてはずれでした。

それほど大きなインサートでもなく、困り切っていますが、
上の書き込みで「25kbのインサートは難無くクローニングできる」と書かれておられる方もいらっしゃいますし、どうしても入らないときはどう条件を振ってみればよいのか、どなたか知恵を貸していただけませんでしょうか。

485 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 11:24:24

>>483
末端の残り短い方で１ベースでしょ？かなりギリギリだと思う。
最初にXbaIを入れて１時間インキュベーションした後、
BamHIを過剰にいれて３時間インキュベーションするとかの
工夫がいると思う。

486 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 11:40:48

>>484
単純だけど、もう少しDNA量増やしたら？
スターティングが75ngで20ulの系で、Tf.に2.5ul使うということは最終的に10ng弱を大腸菌に入れてるわけだし、
ライゲーション効率も結局DNA同士のエンカウンターの確率だから、濃ければそれだけモノができやすい。

487 ：教えてください：05/01/18 12:04:29

>>486
レスありがとうございます。
DNA量をふやすというのは、ligation時にmixするDNA量を増やすということでしょうか。
それとももしcompetent cellにmixするligation productの量を増やしてみれば、ということでしたら、その量というのはどの程度までOKなのでしょうか。
わたしはだいたいcellのtotal volumeの10％くらいが上限かと思ってました（根拠なく）。
DNA量が少ない方がかえってtransformation効率が上がる、と思いこみがあってしまい、増やすことにおっくうになってしまっているのですが。

（ところで書き忘れましたが、もともとのvectorそのもののtransformationは非常に良好で、もう数え切れないほどのコロニーが出てきます。）

488 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 12:17:07

>>487
486ではないけど、cellのtotal volumeの10％くらいが上限というのは
守っておいた方がいいと思います。
ligation時のDNA量を増やす、もしくはligation volumeを減らして
DNAの濃度を高くするなどしてみては？
ligation volumeは2ulくらいまでは余裕で減らせます。

489 ：488：05/01/18 12:23:41

ちなみにligationは16℃ 2hr以下で大丈夫かと（僕の経験上は、
取れない時はO/Nでも取れない）。
NEBのT4 DNA ligeseはPEG入ってたっけ？

488ではDNA濃度を上げればどうかと書いたけど、ベクター75ngもあれば
十分すぎる気もするなぁ。

490 ：484；教えてください：05/01/18 12:49:18

>>488
ありがとうございます。
NEBのものにはPEGは入っていません。

先日の条件でとれたコロニーでは、1：10の比率ではインサートの倍の大きさのもの（RE digestionで半分になりました）ができ、その他はてんでばらばらの大きさでした。
ふしぎにvectorと同じ大きさのバンドがまったく出てきませんでした。
取れないときはなにをしても取れない、のかもしれないのですが、どうしても取らないといけないのです...。

とりあえずligation時のDNA量を増やしてみようと思います。
あとどのようなことをためすべきでしょうか。

491 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 13:36:33

はっきりいってこれまでのアドバイスは無意味

60℃→on iceを
60℃→一時間くらいかけてゆっくり4℃にさます

これで解決する

以上

492 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 14:47:08

キレイで濃いvectorとinsertをまぜてらいげー所ん。
これ最強。俺も１０ｋのベクターに２１ｋクローニングに
するのをてこずったけど濃くしたら普通に逝けた。
がんがれ>>484

493 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 15:35:10

>>490
えーと、念のため聞くけど、ベクター濃度75ngってのはライゲーション直前にちゃんと濃度測定した値なの？
それともスターティングマテリアルから算出してそのくらい、ってことなの？

前者なら、ベクターとインサートの濃度を濃くしてライゲーションやり直しでいいと思う。
普通75ngあれば出るのだが、実際出ないのだから濃くするのがいいと思う。
>>491のテクニックは自分は全く使ったことないが、別にやらなくても行く。
もちろんやっても害はないし、少しは効率上がるかもしれないけど、
あまりクリティカルなポイントではない気がする。

後者だと途中でロスってる場合もある。キアゲンのゲルを溶かしてからDNAをビーズにくっ付けて精製するキット
なら自分も使ったことがあるが、特に長いDNAは高めの温度でエリューションしないと回収が極端に悪くなる。

494 ：491：05/01/18 15:52:00

>>493
やったことも無く原理も理解できないなら黙ってろ白痴

495 ：488：05/01/18 16:24:27

>>491
60℃にする意味分かってる？

496 ：488：05/01/18 16:37:13

PEGをfinal 5%で加えるとligation効率が上がるよ。
それと、精製した断片をとかす時にEDTAが0.1mMのTEで溶かす
（もちろんDWでもOK）とか。

497 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 16:47:15

>>494
ゆっくり温度落とすと末端がアニーリングしやすくなる、ってんだろ？
くだらん。威張るほどのことか？
だったら>>496みたいにPEG投入でブラウン運動を抑制して、
DNA同士が出会ってから離れる間の時間を長くしてやった方が効果的。

498 ：491：05/01/18 16:50:08

>>495

495 名前：488 ﾒｪﾙ：sage 投稿日：05/01/18 16:24:27
>>491
60℃にする意味分かってる？
↑
この発言，，，，全く理解してないのはお前ですから
残念

499 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 16:57:10

確かにon iceで急冷するとしばらくannealingが抑制されるから
悪影響だと思う。
どうせならやらない方がいいくらい。
結構重要なポイントでしょ、491は口は悪いが。

500 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 17:31:33

ここは馬鹿が書き込むスレだな。

501 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 19:07:57

↑
だからお前が書き込んだんだろ

502 ：484;教えてください：05/01/18 20:11:18

みなさん、レスありがとうございました。

あの...　DNA溶液を60～65℃で加温後に急冷するのは、
ligationに有効なsticky endを確保して効率を高めるため、ですよね・・・？
やだ、わたしへんなこと言ってます？ >491さんは冗談おっしゃってるのかと思ってたんですけど...。あれ？
どうもすみません、まだまだmolecular biologyは若葉マークですので...。

DNA濃度はQIAGENのGel Extraction kitで精製後に1ulを取り、100ng, 200ngのマーカーとともに流してバンドの濃さをもとに濃度決定しています。
まずPEGを入れて再挑戦させていただきます。

transformationする際に多量のDNAを入れると（反応液を入れる、というのとはちがう意味で）transformation効率が落ちる、と思いこんでいたのですが、いかがでしょうか。
みなさんはどれくらいのDNAまでならOKだと考えておられますか？

>492さん
あの、すみません、具体的にどれくらいの濃さでどのくらいの系で反応させて、そのうちのどれくらいを入れてよいのか、教えていただけないでしょうか...？
あと、上記のQIAGENのkitですが、これで精製したDNAは十分きれいなのかと思っておりましたが、問題のあるときがあるのでしょうか？

>493さん、「特に長いDNAは高めの温度でエリューションしないと回収が極端に悪くなる。」というのはわたしも思い当たる節があるのですが、
どのくらいの長さのDNAの場合、具体的にどのようにしてelutionすればよろしいのでしょうか。

みなさん、すみませんっ（汗）
でも、ほんとうにこのステップを超えないと進めないんですっ！（というか卒業できないんです...）
よろしくお願いします！！

503 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 22:22:23

1μｇと1μｇでうまくイキました．
（5μｌの系で1:2の盛る費）
わっさわさだった．

504 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 23:31:51

釣りと見紛うようなバカばっか。本気で言ってんのか？
>>491 4bpのdsDNAのtmが何℃だか分かってんの？60℃保温ってのは宗教的儀式か？
>>497 ブラウン運動が何の関係があんだよ！PEGのcondensationでDNAの実効濃度が上がるんだよ。

505 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 23:40:32

>>502
以前25kbのfragmentをクローニングした者ですが、
僕の場合は、10ngのベクターに、ターゲット領域を含む300ngの
BAC制限断片（ターゲットは30ngくらい相当）をクローニングして
上手くいっています。ちなみに1.2ulスケールでligationしました。
何度か同様のクローニング（サブクローニング）をやりましたが、
問題があったことはないので484さんが何故上手くいかないのか
難しいですね。そのベクターと大腸菌は使用経験がないので良く分かりません。

濃度の測定法はバッチリそうですし、精製法も一見問題なさそうですが。
高めの温度でelutionってのは、BACの回収の際に55℃でやりましたが、
それは200kb以上だったからで、QIAGENの説明では50kb以下では問題ないと
いう話でした。
いずれにしても、回収後に濃度checkしてるんだったら回収率の問題ではないですね。

transformation時に多くのDNAを入れると効率悪くなることはありますが
（transformation効率を測定する際に、1pgのpBRを導入するのと1ugのを
導入するのとでは効率は異なりますから）、その辺の問題でもないでしょう。
他に何かコントロールをとった方が良いかもしれません。例えば、インサートを
別のベクターに入れてみるとか、ベクターに別のinsertを入れてみて上手くいくかを
調べるとか。
あまり力になれないけど頑張れ～。

506 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 23:43:21

>>504
お利口な貴様に聞くけど、お前なら何℃でやるんだ？
それと、DNAの実効濃度って何なのか説明してくれ。

507 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 23:50:33

ligationは旧世紀から16℃でやるって決まってるもんだ。

508 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 23:57:56

>>506
http://oshiete.eibi.co.jp/kotaeru.php3?q=1024547

509 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 00:04:04

>>508
この中の解答が正しいものであるならDNAの実効濃度については理解したけど、
温度についての解答は？

510 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 00:08:33

ligationは旧世紀から16℃でやるって決まってるもんだ。

511 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 00:13:52

subcloningの時のligationなら室温でも４℃でも問題ない。ただ、60℃に
加温する理由は金輪際ない。

512 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 00:28:06

>>506
沢山レスが付いてるみたいだが、これで納得できたのか？それともまだ必要か？

513 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 00:46:10

難しいことはキット使ってやれ

514 ：509：05/01/19 01:05:21

>>512
484はligationは16℃でやるって言ってるだろ。
504のお利口さんはただの勘違いだろ。
511は理由をよく考えてみた方がいい。
例えば、ゲノムをSau3AIで切断した後に泳動すると、切断前のゲノムより
大きなサイズの領域にスメアをひくことがある。何故だか分かるか？
ちなみに60℃で加熱後氷冷して泳動するとそうならない。

515 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 02:07:19

60度で加熱した後急冷したら、らいげーしょんのときにも
くっつきにくくなるんだよ馬鹿
だからベクターとインサート混ぜてからゆっくりひやせっていってんの
ゆっくり冷やしてる間によくくっついてらいげーしょんされやすくなるの
これを理解せずに馬鹿みたいなこと言ってるやつは死ね

516 ：484;教えてください：05/01/19 03:01:08

あ、ご、ご、ごめんなさい（汗）。
まさかこんなにレスいただいてると思わなかったもので…。

>503さん　ありがとうございます。DNA量、増やしてみます。
>505さん　もう一度ctrl取ってがんばります。
>504,508さん　PEGについてとてもよくわかりました。つまりPEGを含むbufferの問題さえクリアできれば、DNA量はやはり多い方がコロニーの絶対数は増えるはず、ということですね。ありがとうございます。
>512さん　お、お返事遅くなって、ご、ごめんなさい。まさかこんなにいただいてるとは思いませんでした。以後気をつけます。
>514,515さん　ほんとうにありがとうございます。お恥ずかしいのですが、正直に申し上げますと、「DNA溶液を60～65℃で加温後に急冷する」というのは以下のサイトのTakaraの受け売りなんです…。よく勉強もせずにおうかがいしてごめんなさい。↓
http://bio.takara.co.jp/catalog/qa.asp?ID=334
でもどうしよう…　弱ったな。

517 ：484;教えてください：05/01/19 05:35:25

あの、恥のかきついでというか、あつかましいついでにもうひとつお聞きしてよろしいでしょうか。
この掲示板をみつけて「すごく勉強になるスレッドだなー」とうれしくなって、
いま以前のスレッドも読み直しているところですが、
ゲル抜きする際にUVにあてる時間（10秒以下）に気をつけるよう書いてありました。
これまでわたしは10秒をはるかにこえてUVをあててしまっていたので、
それでmutationが入っていたのかな、と思っております。
で、UVも長波長を用いよとのことでしたが、どれくらいの波長のものをもちいるべきなのでしょうか。
ちなみにうちのものは254nmです。

518 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 06:09:28

255って短波長じゃないの？
３６６が長波長だと思うが。
短波長に一分もあててるとＤＮＡバラバラになるよ

519 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 08:53:45

UVまずいよ。可視光で見える染色剤使うようになってから、コロニーの数が一桁上がったもん。

520 ：484;教えてください：05/01/19 09:04:49

>>518さん
やっぱりそうですよね...。書いてあった‘10秒以内’ってほんとなんですね...　知らなかった。

>>519さん
その染色剤、ってどこから出てるなんていうものですか？
なにか問題はありますか？（なんらかの反応にはよくないとか、EtBrに比べて見えにくいとか...）

521 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 09:20:23

どうやら４８４がうまくいかない原因が明らかになりつつあるな

522 ：484;教えてください：05/01/19 09:58:18

>>521さん
そうですよね？ほんとにそうですよね！

そうなんだ、UVでそんなにちがってきちゃうんだ...。
みなさんそんなに短時間で切り出されてたんですね...　知らなかったです。
うちのラボ、手でかざすハンディなUV（254nm）しかなくて
（大きいのはとなりのラボのを借りなくちゃいけなくて気をつかうんです）、
部屋の電気を落として見るんですが、見えにくいので思いっきりUV浴びせてました...。
10秒以内ならこの短波長でもだいじょうぶでしょうか？
（でもちょっと自信がないです...（涙））

523 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 09:59:23

>>515
お前、つかえねーやつだろ。

524 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 11:06:35

Gel Indicator Kit (フナコシ)使え
ttp://www.funakoshi.co.jp/h_news/0501/050111_BDLi.php

あとトランスイルミネーターもないのにDNAの仕事をするのは・・・
どうでしょう

525 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 11:46:57

>>504
というか、DNAの実効濃度が上がるのがブラウン運動と関係あるんですけど？？
もっと物理化学も勉強せい。

526 ：484;教えてください：05/01/19 11:50:30

>>524さん
ありがとうございます。さっそくためしてみます。
イルミネーターはいちおうあるんです、となりのラボと共用で。
でもうちは若くて小さなラボだけどとなりは超巨大戦艦みたいなラボで、
使ってて後ろで待たれたりするともうびびっちゃって...。
途中でもあわてて譲っちゃったりします（涙）。

でもこのスレッド、ほんとうに勉強になります。
みなさんほんとうに親切ですし、いいスレッドですよね。
がんばります。結果、必ずご報告します！

（あの...最後に怒られるのを承知であえてお聞きしたいのですが...
　‘60℃加熱→on ice？’の話、どなたか私に分かるようにストレートに答えと理由を教えていただけませんでしょうか...
　>>514さん、だめでしょうか？（汗））

527 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 11:58:20

>526
Biotechniques. 1996 Nov;21(5):898-903.

Protection of DNA during preparative agarose gel electrophoresis against damage
induced by ultraviolet light.

Grundemann D, Schomig E.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=8922632

528 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 12:04:11

なんでそんな見当違いのpaper紹介してんのかね

529 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 14:48:51

通りすがりだけどね。

>>526
末端がcohesiveだと、断片を精製した後、二種類の断片を混ぜる前にぺたぺたくっつく
分子がいたりする。そういう奴らはコンカテマーになってvector-insertのライゲーションに
寄与しないので、ライゲーション前にばらしてやろうというのが60度加熱の発想ですよ。
急冷する事でその状態を保って、ライゲースを入れてはい用意ドンスタートっていう
ことになるわけなんだけど・・・。

実際問題としては、やる必要は皆無です。理由は・・・普通に制限酵素で切ったDNA断片
ゲルに流してみれば分かるように、末端cohesiveだからって普通スメア引いたりしませんよね。
（引く場合が無いとは言いませんが）
末端4nt程度のアニーリングなんて、もともとついたり離れたりを繰り返してるもので、
わざわざばらさなくても無問題。まああなたの場合はAscIの切り口がGC4ntなんで、
おまじない程度にやっておいても良いかとは思いますが。
急冷するのがまずいと仰ってる方は、単に何か勘違いをされたんでしょう。

本筋のクローニングの話ですけど、Echo使いたいんじゃないかと思いますが、
どうしてもEchoじゃなきゃだめなんですか？
pir2みたいなcompetencyの低い株だと、プラスミドが大きくなればなるほど
入りにくくなりますよ。pir1じゃだめな理由はあるんですか？

vectorとinsertの組み合わせによっては、絶対取れない（大腸菌が嫌う）コンストラクト
というのも無いではありませんが、普通は何とかなるもんです。基本的には
DNAがあればあるほど形質転換体は出ますし（頭打ちはありますが）、形質転換効率
が良ければ良いほど形質転換体が出ますから、その方向で条件を振るしかありません。
具体的には、ライゲーション時のDNA濃度を上げる、スケールを上げてライゲーション
した後DNAを回収、濃縮する、とか、まあ色々ありますが。DNAにダメージを与えない
っていうのも、intactな分子の数を稼ぐのには重要です。

一番簡単に効くのは形質転換効率なんですけどね。エレクトロコンピを自作してみても
いいかもしれませんね。

530 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 16:44:15

毎回いってるけどお前らってホント低レベルな質問にはよってたかって
知ったかぶりするよね

531 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 16:58:30

>>530
お前は基本的な質問にもろくに答えられないんだろ
言ってろ馬鹿w

532 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 17:26:13

>>530
お前の人のことを馬鹿にする態度は気に食わないけど、
同意する。
ほんとに普通のラボでコンストラクションが
うまくいかないときって60度の加熱がどうだの
ＵＶ当てすぎとか気をつけるのか？
ブラウン運動なんて考えたこともない。
みんなが主張してる理屈は正しいんだろうけど、
それを原因として考えうるデータは出てるのか？
金魚を味噌汁に入れたら死んだから
味噌汁は身体に悪いんじゃないかって推測に
に似ている感じ。

533 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 17:30:01

>>532
少なくともＵＶ当てすぎは劇的に影響及ぼすんだよね～。
知っといた方がいいよ。

534 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 21:08:55

>>532
少なくとも旧帝大上位クラス以上のラボなら、ブラウン運動がどうだくらい議論するだろ？
ロンダ君じゃない限り、みんな物理化学とか量子力学の基礎的なことぐらいは頭に入ってたよ。

ちなみに君はどこの大学出てるの？

535 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 22:15:50

>>534
能ある鷹は爪を隠すってしってるか？
そんなくだらんこと議論するのはコンプレックスのあるロンダだけだろ

536 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 22:24:39

>>535
あと学歴気にする所を見ても534はロンダ決定だなw

537 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 22:59:46

>>532
自分がものを知らないことを誇るとは･･･
いやはや、ゆとり教育って罪深いね

538 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 23:08:31

いくら高分子だっていったって溶質なんだから、ブラウン運動とか言ってるバカはいい加減反省しれ

539 ：484;教えてください：05/01/19 23:20:03

>>529さん
ありがとうございます。とってもよくわかりました！
pir1、試してみます。この際なんでも試してみます！

>>537-
あ、あ、あの、みなさん、しょうもない質問しちゃったのはわたしですし、
でも答えをいただいたおかげでとっても勉強になってよろこんでますし、
そ、それでいい、と言うわけではないのかもしれませんけど、
不勉強な私のためにボランティアしていただいたということで...。
荒れて他の方が寄りつかなくなるとせっかくのスレッドがもったいないかなと...。
えらそうなこといって、す、すみません...。

540 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 23:24:07

いーのいーの
なんだかんだいって遊べたんだから

541 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 23:25:52

>>539
まぁ気にすんなって。クローニングでも何でも今のうちに
苦労しといた方がいいよ。
煽るヤツらはラボで苛められてるか何かで心に余裕がないんだろ。
２ちゃんがストレス発散の場なんて悲しいねぇ。

542 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/20 12:23:31

>>538
意味不明なんですけど？

543 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/21 09:45:24

↑意味不明はオマエだよ。溶質の熱運動のことをいつからブラウン運動って言うようになったんだ？

544 ：菌：05/01/22 18:41:35

僕、大腸菌だよ・・
を参考に汁！！
ほぼ同じだYO

545 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/24 10:34:20

>>543
「溶質とはなにか？」から勉強し直す必要があるな。

546 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/24 13:53:23

まだ醜い争いしてたのか

547 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/25 10:27:05

学士四年生です。
スタートからクローンがとれんとです。
卒論になりません！
学士四年生です…

548 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/25 12:48:15

＞＞547
天職か転職かだな。

549 ：484;教えてください：05/01/25 22:42:04

484以来お世話になっていたものです。
ありがとうございました！ligation、うまくいきました！！
DNAを切り出すところからはじめからぜんぶやり直してみました。
UVをあてるのは5秒以下、
ligationにはvector:insert=1:2-10とふって
DNAのみを60℃×2min→on iceののち、
NEBのT4 DNA ligase(high conc.)を用いて
total 5ul(DNA 800ng)の系で
16℃, overnightで反応させました。
50ulのcmpetent cellにtransformationしたところ、
vector/insertの比にかからわずどっさりコロニーが！
RE digestionで確認しても思った通りのinsertが入っていました！！
ほんとうにうれしい！
ありがとうございました、みなさんのおかげです！！
これからもよろしくお願いします！！

さらに。。。molecularの貧弱な私におしえてください。
うちではcompetent cellはDH5αを使っています。
ストックが切れてきたのでそろそろまた作らなくてはいけません。
"Molecular Cloning"のInoue methodで作ろうと思うのですが、
通常のsubcloningで少し入りにくいようなtransformationを行う際に
おすすめのcompetent cellのstrain、
あるいは他の作成方法があれば教えてくださいませんでしょうか。
よろしくお願い致します。

550 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/25 23:56:11

エレポの方が安定して入るような気がするが・・・・
エレポの機械がなくて、少し入りにくいような
勝負transformationのときは、東洋紡のコンピテントハイがお勧め。
ちょっと高価だけどね。
本当に入りにくくて困った時にはいいかもね。
普通のtransformationは自作のエレポ用コンピで十分っすよー。

551 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/26 00:20:27

結局60℃にする意味あったのかな　できれば60℃なしで再実験してけろ

552 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/26 00:36:06

レトロウィルスのパッケージング細胞何使ってますか？

553 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/26 01:46:04

60℃にしなくてもとれるハズだけど、60℃にしたことで効率が
上がったのかは知りたい。
おそらくUVの当て過ぎが問題だったんじゃないかな？

554 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/26 07:16:38

255nmではいかんだろ
うちは304だが
結構普通に当ててもうまくいくよ

555 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/26 11:08:47

plat E

556 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/26 11:23:35

↑
そんなに良いか？
タイター高い？

557 ：484,549教えてください：05/01/26 23:13:43

>>550さん
やっぱりみなさんcompetent cell、お買いになってるんですね...。
うちは貧乏なラボなのでとても買えないんです（涙）。
エレポレの器械もとなりのラボに借りなきゃいけないし...。
XL10GoldやTop10なんかを一箱だけ買って、
Inoue methodで増やしたりしたらふつうのDH5αとかより効率は高いんでしょうか？

60℃にする必要があったかどうかはちょっと不明です。
DNA量を増やしたこと、UVに極力気をつけたこと、
それが勝因かなぁと思っていて、
60℃にするのはおまじないみたいなものかな、と思いました。
わるささえしなければ、気は心、かな、って（笑）。
今度、おなじ条件で60℃×3分、というステップだけ外してみます。

558 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/26 23:29:13

普段使いのcompetent cellはさすがに自作のラボがほとんどだろ。
半日の仕事でラボの半年分が出来る。
そいで、普段使いならDH5αで十分だよ。
ligation前に60℃にするのは、その昔lambda phageを使ってた頃にcos siteをはがそうとした名残。
4 bp程度のcohesive endには全く無意味だ。

559 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/27 00:22:34

>>558
あ、俺のそれ思っていた。ずっとロムっていたけど。

＞その昔lambda phageを使ってた頃にcos siteをはがそうとした名残。

しかし、どうしてこういう迷信がはびこるのかが不思議だ。
ちなににlambdaの件は迷信じゃないよ。

560 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/27 00:24:11

>>558
cos siteの名残りなのはその通り。
しかし4 bp程度のcohesive endとは言え、目的によっては全く無意味ではない。

561 ：550：05/01/27 00:31:24

>>557

いえいえ、うちもほとんど自作ですよ。
勝負実験の時やどうしてもうまくいかない時にだけ、
既製品を使っています。
実は、うちのラボもウルトラ貧乏で、
エレポマシーンも大学の共同利用施設に出かけていって使っています。

大抵の大学には共同利用施設があると思うので、
ボスに頼んで使用登録をしてもらった方がいいですよ。

うちの大学の場合では、
年間数万円でほとんどの機器が使い放題
クローニングから遺伝子導入まで、
ほとんどの実験を施設内で完結できる。

こういう学内の便利な施設の情報は、
以外に全体に伝わっている場合があるので、
情報収集に熱心でない教授なんかは全く知らない時がある。
うちの教授もそうだったので、私が自分で調べて、
教授に頼み込んで共同利用施設の使用料を払ってもらった。

それ以来、分子生物学関係の研究が飛躍的に進んだ。

562 ：484,549教えてください：05/01/27 00:46:55

>>550, 558さん
レスありがとうございます。
自作の場合はやはりHanahan法あるいはInoue法ですか？
なにかmodifyされてます？
strainはDH5α、DH10β以外に試されたことありますか？

P.S.lambdaのCOS末端は、lambda-HindIIIマーカーを使うときに加熱→on iceするのと同じ考えですよね？

563 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/27 02:47:16

>>561
阪大？
共同研はいいよね

564 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/27 04:26:34

DH5αF'IQはいいですよ
Inoueの方法で同じように作っても
DH5αよりも１桁ぐらいよく入る
ただし菌は増えにくくてプラスミドの収量は悪い

565 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/27 06:29:26

コンピを作るのにＯＤ600計ったんですが
ＳＯＢをブランクにするとなぜか-0.2ぐらいに出たんです
水をブランクにしたら0.4だったんですが
どういたらいいでしょう？

566 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/27 07:49:04

エレポレ用のcompetent cellを自作しているが気を抜いて作っても
1 ug当たり１０の９乗はいく、
まじめに作ったら５Ｘ１０の９乗はいく。
chemicalのを作って、１０の８乗いったことはない。

567 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/27 07:51:34

INVITROGENからでているケミカルの奴、
UltraMAX(TM) DH5(TM)-FT(TM) Cells
５ｘ１０９乗以上と歌っているが、本当かなあ？

https://catalog.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=viewCatalog.viewProductDetails&productDescription=454

568 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/27 08:32:39

>>566
1 ug?

569 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/27 11:21:14

エレポレとか言ってる時点で少数派ＤＱＮラボプロトコール

570 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/27 23:10:17

>>560
例えばどういうときに意味があるのですか？

571 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/27 23:27:25

>>524さんお勧めの
Gel Indicator Kit (フナコシ)
ttp://www.funakoshi.co.jp/h_news/0501/050111_BDLi.php
は良いですよ。同じ量のinsert使って、長波長UVで切り出したものより一桁違います。
難点は、EtBrより感度が低いので、バンドあたり0.1 microgram程度欲しいところですが、
よほどケチらない限り普通は問題ないでしょう。毒性を気にしなくて良いのも吉。

572 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/28 10:16:18

>>570
ゲノムライブラリーを作る時。
酵素でpartial digestionした後に60℃にしないで泳動したら
切断前より大きな領域にもスメアし、しかも欲しい大きさの部分を
ゲル回収すると目的のものより小さな断片がたくさん混在している。
60℃の処理をしてから泳動すると大きな領域へのスメアはなくなり、
目的の大きさの断片が回収できた。
１つでも取れればいいような通常のクローニングでは問題にならない
はずだけど、cohesive endどうしがくっついている分子はあるだろうね。

573 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 03:33:55

室温で泳動したらくっついちゃうじゃん

574 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 11:34:20

>>572 それはcohesive endのannealingが原因じゃなくって、
制限酵素かその共雑物がDNAに結合してgel retardationみたいに
なっているのが原因だと思われ。60℃処理でそのタンパク質が変性
したんだよ。

575 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 11:38:09

>>573のツッコミに賛成！

576 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 11:52:21

>>571
これいいなぁ
アメリカでも売ってるかな

577 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 12:01:15

正体はNile Blueだと思われ。
www.ncbe.reading.ac.uk/DNA50/staining1.html

578 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 12:13:37

>>574
フェノール処理してエタ沈してから泳動してるよ。

579 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 12:16:33

室温で泳動したらくっついちゃうじゃん

580 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/29 12:19:28

>>571
よさそうだけど、感度がちょっとなぁ。
数ngのバンドを切り出しクローニングすることが多いので。
それと染色時間長過ぎ。それだけの時間があったら断片精製し終わって
ligation始めてるよ。

581 ：484,549、教えてください。：05/02/01 11:03:09

以前いろいろおうかがいしましたものです。
先日、stratageneのXL10-Gold Ultracompetent cellを用いて、
Inoue methodでcompetent cellを作りました。
chemical competent cellですが、cfu=8ｘ10 8乗と良好でした。
growthもDH5αに比べて格段にはやいし、
plasmidの収量も上がったような...
（同一のplasmidで比較したわけでないのであくまでも感触ですが）。
ラボのメンバーにも好評でした。
菌がやや粘性でsuspendしにくいというのが難点ですが。

582 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/01 11:29:32

Inoueって18度で培養するやつですよね
何時間ぐらいやりましたか

583 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/01 17:48:10

もともと血清入りで培養している細胞を無血清で培養したらどのくらい持ちます？
ちなみにその細胞に遺伝子をリポフェクション後，無血清で飼ったら余計に逝きますか？
また，これに関連した実験している論文とかないですか？
教えて下さい。

584 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/01 22:25:14

細胞によりけり

585 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/01 22:33:32

>>580
後染めじゃなくって泳動バッファーに入れる方法なら、泳動中にバンドの分離が
可視光で見える。感度は低いが、mini-gelならバンド当たり50ngならしっかり見えるよ。
小さいバンドなら微妙だけど、500bp以上の断片ならmini-prepの1/10も切れば十分でしょ。

586 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/01 23:02:10

追加
泳動中にバンドが見えるから、欲しいバンドが他のバンドから分かれたらすぐに
泳動を止めて切り出しに入れる。UVじゃないから顔を近づけてバンドギリギリまで
切り出せる。メリットいろいろあるよ。一度やったらEtBrには戻れない。

587 ：484,549 教えてください：05/02/02 02:59:48

>>582さん
colony pick upして37℃で6時間培養した25ml cultureから
10mlをとり18℃で培養したところ、思っていた以上に時間がかかり、
前日の18時からスタートしてOD600が0．55を超えたのは翌日の22時でした（涙）。
菌が粘性なためsuspendが難しく、
（不安に思いながら）10mlピペットをチューブの底に押しつけて
ゆっくりと2回だけピペッティングしてようやく溶かしました。
Inoue methodにしただけでDH5αでも効率が格段に上がりました
（具体的な数字は覚えていません、すみません）。
ぜひ一度試してみてください。

588 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/02 05:28:49

>>586
なるほど
リアルタイムでバンドが分離していくのをみるのは面白いですね

589 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/02 12:48:56

>>587
なるほど

590 ：poly A：05/02/02 23:52:11

ひとつ教えてください。
トランスジェニックマウスのコンストラクトを作る際、
polyAをつける場合にSV40 early / late polyAなどいろいろありますが、
種類によって発現量に差があるのでしょうか。
トランスジーンによる相性や、どのpolyAをつけるのがおすすめかなど、
できればおしえていただけませんでしょうか。
またその前のgeneのstop codonとのつなげ方などに、
とくに約束ごとなどあるのでしょうか。
よろしくお願いします。

591 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/02 23:58:37

大腸菌を超音波で破砕するとき
どの程度やればいいかわからない！！

592 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 00:45:44

一度、一定時間超音波かける毎に50μlずつサンプリングして、
まとめて遠心して、supをSDS-PAGEして条件を決めれ。

593 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 01:06:22

>>592
質問ばかりでゴメンナサイ。
supとは上清のことですか？

それから、ソニケートしすぎてもタンパク分子が壊れてしまうなど悪いことがあるんですか？

594 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 01:08:13

他人の論文を読む暇がほとんどないから気にしない。
俺が他人の論文を読むのは
１．コーヒーブレークになんとなくラボにころがっているNS
２．自分の論文のイントロとディスカッションを書くとき
３．予算申請書を書くとき

１は単にそこに転がっていて比較的はずれがすくないから
２は論文そのもののよしあしには関係なく、引用すべき
もの、自分の論文に都合のいいものはともかく読む
３は流行の分野の総説からが中心

595 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 02:22:31

DNAをenzymeで切った後、heat killingなしで、
アルカリフォスファターゼ処理してもいいんでしょうか？
制限酵素が反応を邪魔しないんでしょうか？

596 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 03:09:07

NEBのカタログにはheat inactivateしろと書いてあるね

597 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 03:21:57

おれ、したことないよ、
というよりも、制限酵素と脱リン酸化を
同時にした後、heat inactivate している。
で、問題になったことはほとんどない。

598 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 03:35:08

同時？
同時にＣＩＰと制限酵素入れてるの？

599 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 05:18:55

ぜんぜーん問題ね～
一回やってみんさい、騙されたと思って
一時間、家に早く帰れるよ

600 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 05:19:44

今度やって見ます

601 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/03 12:21:30

>>590
発現量の差については知らないけど、intronを含んだpolyAの場合には、
遺伝子のstopコドンを付ける位置に気を付けた方がいい。
NMDの機構を考慮して、final intronの上流50bp以内にstopコドンが
くるようにする。
あとはリードスルーとかが不安な場合は、polyAをタンデムに繋ぐこともあるけど。

602 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/04 19:39:19

レトロウイルスの感染効率あげるには
濃縮するとポリブレンの濃度あげるの
他になんかありますか？

603 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/04 20:56:46

>>593
うちのラボでは５回のところを１０回にしても問題なしということになってる

604 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/05 02:18:08

>>593
ソニケートはかなりタンパク質にダメージを与えます。ですので
可能な限り弱い方が良いです。ですが、使う機械によって違うので
その辺は自分で決定するほかないです。労を惜しまないで下さい。

大腸菌なら一般にはケンダク液が透明になるまでと言われています。
ですが、私の体験では透明になるまでやるとやり過ぎでした。
やり過ぎというのは精製時に余計なタンパク質までもくっついて来てしまったって
ことです。
この辺は実際に目の前でやってもらえないと指示できません。

あと、supとは普通遠心後の上精を言います。

とにかくタンパク質の精製は労を惜しまないこと。これしかありません。

605 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/05 06:04:38

>>602
spinoculation
細胞の種類にもよるが、lentivirus系のほうが良い場合もあり

606 ：また教えてください。：05/02/06 03:07:30

以前subcloningについて教えていただいたものです。
また基本的なことを教えてください。
5'突出末端をfill-inしてblunt endを作りたいと思っています。
具体的にはNot1 siteをつぶすためにNot1で切った後、
平滑末端化してSma1 siteとligationするつもりです。
Bluntingの際、うちではKlenowを用いていますがどうも効率が悪いです。
Takaraは「DNAの末端修復後のライゲーション効率が悪い場合、
Klenowは3'-末端をfill-inした後、1塩基余分に付加する傾向があります。
突出した末端は3'-exonuclease活性で除去されますが、
その効率が低いため完全には平滑化されません。
平滑化のためにはT4 DNA Polymerase、またはDNA Blunting Kitをお勧めします。」
と書いてあります。
私の場合T4 DNA polymeraseの方がよいのでしょうか。
またこの1塩基付加ってそれほど影響あるものなのでしょうか。
さらにNEBは25℃ 15分、Takaraは37℃ 10～30分です。
みなさんはどうなさっておられますか？
よろしくお願いします。

607 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/06 03:33:40

宝のブランティングキット買え

608 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/06 03:47:50

>>602
ポリブレンの濃度が高ければよいというものじゃないだろ
細胞が死なないとしても、高いほど効率が上がるというものでもない。

609 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/06 12:57:23

>>606
Klenowで困った経験がないね、これでいいんじゃないかな。
T4 DNA polymeraseを使ったこともあるけど、この酵素ってklenowと比べると値段が高いからKlenowを使ってた。

610 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/06 13:44:37

隣のラボにたのんで少し分けてもらったら

611 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/06 16:59:52

>>610
乞食ラボ？

612 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/06 18:43:11

せこらぼっす

613 ：606,教えてください。：05/02/06 20:13:38

>>609さん
ありがとうございます。
とくにどちらがいい、ということもないのかな。
incubateは37℃ですか？

それとTakaraのblunting kitを使っている方にお伺いしたいのですが、
あれはT4DNA polymeraseによって、
５’突出末端ならfill-in、３’突出末端なら削り込み、ということなんですよね？
通常のT4DNA polymerase単独で使う場合に比べて、よい点というのはなんなのでしょう？

614 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/07 09:41:50

>>605
Spinoculationて何かしらないけどありがとう。

>>608
最適濃度ふったけどだめだったのです。

615 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/07 09:43:30

>>605
Spinoculationて何かしらないけどありがとう。

>>608
濃度をあげる方向でふったけどだめだったとです。
下げてみます。

616 ：609：05/02/07 14:03:24

>>613

平滑末端化する活性としてはT4 DNA polymeraseの方が圧倒的に高い。
確か２００倍くらいはあったはず。
でも、クローニング等にはklenowで大丈夫。37C,30minくらいでいいよ。
あ、dNPTをちゃんと加えてね。

Takara Blunting kitのバッファー内にはdNTPも含まれていて、
いちいち試薬を混ぜる必要がないくらいしか利点はないと思う。
そのキットではBlunting後そのままライゲーションできますなんて書いてあるけど
一度も成功したことなかったなぁ。僕の腕が悪いだけかもしれんが。

617 ：615：05/02/07 18:35:15

>>605　さん
Undiluted supernatant was centrifuged onto the cultures at 1800 x g for 2 h on the first day of culture.
ですね。
ありがとう。

618 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/08 08:11:44

>>617
あと、よく考えたら、超遠心によるウイルス濃縮が手っ取り早いかな。
１００倍くらいは感染効率をあげられる。

619 ：615：05/02/08 17:16:58

>>618
まじですか？
回転数, 時間、温度とか教えてくれたら有り難いです。
あとそれは100倍のウイルスを濃縮するのですか？
おねがいします

620 ：：05/02/09 02:05:43

SDS-PAGEでサンプルを可溶化するとき、サンプルと等量のバッファー
（2％SDS、βメル含）を加えるとありますが、サンプルが固形タンパクの場合バッファー
はどれくらい入れるのでしょうか？（SDS：タンパク＝1.4：1の結合量により）
タンパク重量の1.4倍（ｗ／v）ですか？どなたか、詳しい方ご教授ください。

621 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 03:43:36

1X sample bufferに溶かせ。

622 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 05:16:51

>>618
パッケージング細胞の種類によるだろ

623 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 08:58:52

赤色強制発現用ベクター(CMV+dsRed)を改造したら(MCS+IRES挿入)発現しなくなってしまいました。
何が問題なのでしょう。

Stopコドンには注意しました。細胞はNIH3T3です。
MCS+IRESを組み込む前のプラスミドではRedはもちろん発現しました。
MCS+IRESのデザインに失敗が有ったと思うのですが、
他に何を注意したらよかったのでしょうか？

MCSに何も入れる前にRedが発現しないので仕事が止まってしまいました。

624 ：あ。：05/02/09 09:40:05

>>623
じつはそれ、まったくおなじ経験あります。
というよりもついこのあいだまでそれで困っていました。
こちらの場合はclontechのpDsREd2-N1をもとにあるDNAのうしろにIRESを導入、
11番目のATGをstart codonとしてDsRed2をつなげたものです。
3T3, 293cell、どちらでも発現しませんでした。
一般的に使われているように12番目を使えばよかったかなとも思いましたが、
同じようにつくったIRES-EGFPではなんの問題もなかったため
（やや発現量が下がりますが）、
DsRedでは相性が悪いのかな、とあきらめたのです。
623さんは12番目のATGを用いられているのでしょうか？
（こっちの方が一般的ですもんね、Nco1も利用できるし。）
DsRedそのものの蛍光はあまり強くないので、
IRESのうしろにつけて発現量が下がるとさらに見えにくくなると言うことなのでしょうか？
他の皆さんはそのような経験があるのでしょうか？

625 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 13:40:58

IRESはかなりいい加減なエレメントなので信用できるコンストラクトを
買うかもらうかした方が良い。StopとかATGとか全く気にしないで、
いい加減につくっても動く奴は動くけど、どんなによく考えて設計しても
動かないものは動かない。理由は誰にも分からない。

626 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 14:15:21

突然トランスフォーメーションが上手くいかなくなりました。
特に高いcfuが必要でない実験なので、培養が37度で早くてすむ塩化ルビジウム法使ってたんですが、
以前は最低でも10^7行ってたのに最近は10^6切るようになってしまいました。
新しく作ったバッファーがいけないのかと、上手く行っていた時のバッファーが多少残ってたので
それを使って改めてやってみてもやはり同じような結果です。手順はむしろ最近のほうが温度や
けん濁に気を使ってやっているのですが。皆様の中にはこういう症状に遭われた方はいらっしゃいますか？
またどのように対処して解決しましたか？

627 ：624, あ。：05/02/09 19:06:20

>>625
うーん、それはちょっとちがうと思いますよ。
IRESというのはみなさんがつかっておられるのはだいたい同じでEMCVのものを使っています。
clontechのいわゆるIRES、IRES2などもオリジナルのEMCV IRESとsequenceは全く同じで、
ただpIRES（って名前だっけなぁ？）は１０番目のATGのうしろにＭＣＳをつけて、
うしろにつけたコンストラクトのATGが１１番目となるようにしてあり（それとひとつだけpoint mutationが入っている）、
IRES-EGFPは１１番目、IRES2-EGFPは１２番目のＡＴＧにＥＧＦＰの開始コドンがあわせてあるんです。
１１番目のＡＴＧと１２番目のＡＴＧはフレームがあっていて、本来のＥＭＣＶでは１１番目から翻訳がはじまります。
で、１２番目のうしろからはじめようとするとじぶんのコンストラクトの前にＭＡＡＴのアミノ酸がついちゃうので
それが気持ち悪いと思って１１番目からはじめたのですが...。
じぶんのはsequenceもちゃんとしらべて、１１番目か１２番目かのちがいをのぞけば
まったくＥＭＣＶのものと同一でした。
たぶんみなさんのまわりにあるIRESはほぼこのどちらかの１つのはずです。
だから625さんのおっしゃるようにいい加減なエレメントでもないし、
stopとかATGとか全く気にしなくていいわけでもないと思いますよ。
いや、待てよ。
そう思って必死で考えてつくっても動いていないのだから、
625さんの言うことはまったくその通りかな・・・（涙）。

自分の場合は前のコンストラクトとの相性があるのかな、と思ったのですが...。
そういやpIRES2-DsRedとはちがうpolyAをつかったなぁ。
そういうのもあるのかなぁ？

628 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 23:03:47

hIRES最強。下流のやつでも、IRES2の10倍ちかく発現しているぞ。

629 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 23:14:28

>>627
IRESは難しいです。
627さんのいうようにpIRESの変異型IRESを使えば自動でIRESの後ろの
目的タンパク質のATGが開始コドンになるのだと思ってたのですが自分の
経験では動かない事がけっこうあります。

ずっと気になっていることは変異型IRESの１０番目のATGと目的タンパク質
の1st ATG（１１番目のATG）との間にStopコドンがあるとマズイのか
どうかですが誰か答えを知りませんか？

630 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/09 23:18:11

>>628
hIRESってHCVのIRESのことですか？

631 ：あ。：05/02/10 04:53:29

>>628
ぼくもそれ聞きたい。教えてください。

632 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/10 05:53:07

>>627
あ。さんへ
Stopコドンを気にするとはどういう事なのですか？

633 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/10 06:45:35

>>628
そんなに効くんですか？
HCVIRESのことだとすると、個々のベクターに使ってみたというのはまだあんまり聞かないですよね。
興味ありますねー。

FGF2-IRESもいいとは聞いたのですが、どうですか。
どなたかトライされました？

634 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/10 10:06:40

IRESの後ろはATGタンデムに作っておいた方が無難なんかな？

635 ：５９３：05/02/10 15:13:30

>>604
遅くなってしまいましたが、アドバイスありがとうございました。
助かります。

636 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/12 03:06:12

実験が上手くいかないわけじゃないが、何で俺の細胞は増えが早いんだ。
こんな時間に出てきてpassageは嫌だ。あと２時間待ち。

637 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/12 04:41:19

>>628
hIRESのこと教えてくれー！

>>633
FGF2-IRESのこと教えてくれー！

その他だれでもいいからよく発現するIRESの情報を教えてくれー！

638 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/12 05:10:02

こっそり血清混入させたらコンタミるよ(･∀･)ﾆﾔﾆﾔ

639 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/12 05:15:47

>>637
君は踊らされてるぞ
俺の意見はどのIRESも信用できん
以上

640 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/13 12:25:54

FACScanを使っているのですが、急に細胞をカウントしなくなってしまいました。
ノズルに何か詰まってしまったような（？）感じなんですが、なんとか直す方法はないでしょうか？
マニュアルもなく、さらに土日は誰もラボにいないので、とても困っています。
いい解決法をご存知の方、宜しくお願い致します。

641 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/13 12:42:21

マニュアルもないラボは終わってる。
そしてトレーニングも受けてないおまえがいじってる時点で・・・・

642 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/13 13:17:23

>>640
FACSはじめたばかり？

吸入口に合うチューブを探し、注射器につけてピストン運動すると通るよ。

643 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/13 14:19:43

ポリアクリルアミドゲルから50bpのDNAを回収したいんですが、
市販のgelからの回収キットでは駄目で、簡単な回収キットを
探しているのですが何かご存じありませんか？

644 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/13 15:14:38

ゲル切片を透析チューブに入れてTAEを満たしたミューピッドで
電気溶出しろ。そのあと2-ブタノールで脱水して容積を減らして
エタチンメイトかグリコーゲンを入れてエタ沈すれ

645 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/13 16:48:58

>>643
別にヌシーブGTGで４％とか５％ゲルを作ればいいじゃん。
それとも１bp単位で分離能が必要なわけ？

646 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/13 22:33:59

640です。FACSの件返答ありがとうございます。
今までは長らく遺伝子ばかり扱っていて、FACSは使い始めてまだ２ヶ月の初心者です。
早速チューブと注射器を使ってやってみます。

まあ、いちいち反応するのもどうかと思うんですが、
大学と隣の病院の研究所内に、私が知っているだけでFACSが使える場所が４カ所ありますが、
どこにもマニュアルはおいてありませんでしたよ（だから困っているんですけどね）。
トレーニングは受けてますよ。受けないと使用許可が下りませんから。

647 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/13 23:14:30

じゃあ、その４ヵ所とも終わってるんだよ

648 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/13 23:34:27

>>643
ゲルを細かく砕いて
0.1M酢酸ナトリウムいれて
一晩ローテータにかける
これででてくるはずだけど

649 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/14 00:32:04

>>643
俺はDEAEペーパーをバンドのところに挟んで
再びえいどうしてペーパーを0.1MNaClでウォッシュ．
１MNaClで溶出してます．
大体回収率は50%くらいでつ．

650 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/14 17:47:32

シーケンス用ゲル板を組み立て、ゲルを流す時に均一に流れなく
空気ばかり入るのは、ゲル版の上の部分が欠けていてテープで
貼っているからか？ちなみに縦９０、横４５せんち。
発狂寸前です。５回もやった。

651 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/14 20:13:58

>650
ゲル版が汚いんじゃないか？　シグマコートとかやったら

652 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/14 21:43:11

１．汚れのせい
　汚れているところをゲルが遠回りするので島状に取り残されやすい
２．均一に入れようとするせい
　ゲル上面をスキャンするように往復しながら流し込もうとすると泡を取り込みやすい

解決策は
１．ガラス面のアルカリ処理
　洗剤で洗いよくすすいでから
　５ＭのＮａＯＨをたっぷり付けたキムワイプで優しく拭い
　さらによく洗剤で洗う
　コーティングはそのあとだ
２．ゲル上部中央の１点からとぎれないように一定の速度で流し込む

653 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/14 23:02:14

>>650
秘伝を教えてやろう。

空気が入ったらゲル板建てて素早く固いものでガンガン叩くんだ。

まあ、もちろん出来るだけ板きれいにしてからやることだけど。

654 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/15 03:55:39

>>653
たたいたら下の方からたくさんの小さな泡が
ゆっくり浮き上がってきて
かたまっちゃったんですけど・ﾟ・(つД｀)・ﾟ・

655 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/15 04:17:16

ｶﾞｲｼｭﾂだったらｽﾏﾇ
ｼｰｹﾝｽじゃなくてPAGE用のｹﾞﾙの場合も
空気入る要因はガラス板の汚れかのう?

656 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/15 05:20:55

>>655
PAGE用のゲル板ってちっこいじゃない。
俺はゲル板をはがしやすくるシリカ（なまえなんつった？）を
塗ったらめっちゃ泡入った。
やっぱプライマーエクステンションとか
フットプリントとかじゃなかったらあれは塗っちゃだめだな。
俺みたいなぶきっちょは磯プロで我慢汁ってこった。

657 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/15 06:19:21

ぬったあとでティッシュで磨きあげるのだ。

658 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/15 07:09:32

シーケンスのゲル版の上の部分は欠けやすいですよね？

--- ------
| ← |
| |
　　------

ここを両面ともテープで防いでいるのは原因にならないかな？
やっぱゲル板の汚れかもしれないが。
そもそもサンプル入れるだけでシーケンス読める機械使えば
いいんだけど、金がないらしい。卒研発表間際にくだらないことで悩んでます。

659 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/15 07:10:52

上の図、思いっきりずれた・・・

ようは両角の部分です。

660 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/15 07:40:29

多分関係ない。

661 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/15 11:21:19

叩くというか、圧をかけて流れの遅い部分を強制的に押し延ばす。
慣れないうちは二人で均一流し込み係と叩き係に分かれてやったほうがいい。
見栄張って時間のロスしたら意味無いぞ。

662 ：655：05/02/15 15:24:13

＞＞656.657
遅くなってしまいましたが、アドバイスありがとうございます。

15ｃｍぐらいのゲル板使っているんだな。
そして去年まではなんともなかったんだが、人の移動があった今年になってから
空気が入ってしまうのが頻繁になったんだな。
磯プロでがんがります。

663 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/15 15:53:46

ご教授下さい。

行っている実験系において、使用しているﾘﾎﾞｿｰﾑのﾓﾙ濃度を知る必要が出てきました。
吸光度による濃度測定を行いたいと考えております。
2chの過去ﾛｸﾞを参照したところ、ﾘﾎﾞｿｰﾑは、
Abs260=1の時、24pmolと書かれていました。

しかし、吸光度から算出されるべき値は示強性状態量(mg/ml等)であり、
molという示量性状態量では表せないのではないかと思います。

もしも私の理解が間違っているのであれば、どなたかご教授下さい。
また、他のﾘﾎﾞｿｰﾑの濃度測定・定量法をご存知の方がいらっしゃいましたら、
ぜひご教授下さい。

664 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/15 16:10:44

大体の分子量が判ってればmg→molにできる
って答えじゃ駄目なのか？

665 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/16 01:25:51

>>663
言いたいことはわかるけど、
（要するに24pmol/?Lなのか知りたいんだよね？）
そもそもりぼそーむって定量できるのか？
あなたの使っているりぼそーむがどんなのか知らないけど、
大体でいいなら売ってるリボソームをコントロールにして
タンパク濃度出したらだめ？でもどのくらいがかいりしてるとか
わからないしなぁ？普通どうやってるの？>>666

666 ：663：05/02/16 19:03:04

>>664
絶対量ではなく、濃度が知りたいのです。でも算出法が分からないです。
>>665
そうです、24pmol/L、24pmol/ml、24pmol/μlのように濃度が知りたいのです。
使用しているのはE.coliから抽出した原核生物の70Sﾘﾎﾞｿｰﾑです。
抽出したﾘﾎﾞｿｰﾑからは30S、50Sｻﾌﾞﾕﾆｯﾄは完全ではありませんが取り除いてあります。

売っているﾘﾎﾞｿｰﾑと抽出したﾘﾎﾞｿｰﾑの解離程度は異なると思いますから、
それをｺﾝﾄﾛｰﾙとしてﾀﾝﾊﾟｸ質濃度を算出する考えは難しいですよね。

あぁ～誰か助けて・・・。

667 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/16 22:06:09

濃度を知りたいのであれば分子量を出さないことにはねぇ・・

668 ：663：05/02/17 12:18:17

>>667
MW=270万です。
分子量が分かれば、吸光度から濃度算出できるんですか??

669 ：& ◆l1nyQBuBhA ：05/02/17 16:45:41

ブラッドフォード法でタンパク濃度（g/ml）を出した後
分子量で割っちゃいけないの？
または、MALD-TOF MS でタンパクごとマス分析して定量
ってのは？

670 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/17 19:39:56

>>668
手計算でできるだろ

671 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/17 20:12:55

もっと上を目指すなら、暗算だ！

672 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/19 21:38:08

大腸菌を粉砕→遠心した上清の濃度を上げたいのですがうまくいきません。

上清をエタ沈後、沈殿を再び溶かしました。
ところが混和しても完全には溶けません。
もしかしたらエタノールを乾かしすぎたのかもしれませんが・・・
全部溶けきらないのは仕方ないのでしょうか？

673 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/19 22:42:49

>>672
お前が何をしたいのかはわからないけど、
大腸菌を壊してエタ沈すると糖がいっぱい落ちてくる．
でもこいつが解けないなんてことは経験ない．
核酸が飽和することはしばしばある．
単純にクルードを濃くしたければ菌をサスペンドする液を
少なくするか菌を増やすかしたらいいじゃん．

674 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/22 22:34:46

>>650
昔、どこかのスレでテメーダを入れてしばらく待ってから注ぐと
泡が入りにくいと書いてあるのを見たことがある。
自分でやったことはないけど。

675 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/23 01:29:56

RNA愛
愛を下さい

676 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/24 07:45:27

サブクローニングして酵素で切ってチェックしたとき、
目的とするインサートとベクターや空ベクター以外に出来てくるあの出来損ないのプラスミドって、
いったいなんなんですか？
いちどシークエンスしたり酵素で切って調べてみましたが大きさもまちまちで不明です。
どなたか教えてください。

677 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/24 08:54:53

今　hummanの細胞を培養してますがいかなる細胞も数日で死んでしまいます。
人間末梢血リンパ球のみならず腫瘍細胞さえだめです。サイトカインや培地
は問題なく顕微鏡上　コンタミもしてません。ほかの教室のインキュベータでは
大丈夫なのに　とある頃から　うちのインキュベータはだめなようです。
　表示上、C02 5%,温度３７℃で問題ないようですが。。下のバケットには
NaN2入りの水をいれてあります。　
何がいけないのか　さっぱりわからず　実験がすすみません…

678 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/24 09:18:07

P19細胞にトランスフェクションしたけど、
効率がすごく悪い。

リポフェクトアミン2000
だいたい細胞増えるの速すぎ。トランスフェクション翌日には超コンフルエント。
どうしましよ

679 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/24 22:23:21

>>677
NaN3って大丈夫なの？
直接入れてるわけではないので関係ないのかもしれませんが
一応、NaN3は細胞には適さないのでは？

うちは水は滅菌したものに安息香酸エチルを加えてます。

680 ：トルメキア第4皇女：05/02/27 17:14:02

シークエンスのサンプルは
脱イオンホルムアミドのなかでどれくらい保存可能でしょうか？

詳しい状況は、
シークエンス反応の後、エタ沈して、
脱イオンホルムアミドをl加え、
95℃でヒートショックの後、氷上で冷却して、
さあ、シークエンスしようって時に、
突然シークエンサーが故障してしまったのです。

修理にどれくらいかかるか不明とのこと。
1週間くらいは大丈夫でしょうか？

681 ：クロトワ：05/02/27 19:46:30

俺は4度で1週間保存したサンプルを流したことがあるけど
問題なく読めた．
でも凍らしたサンプルは次の日でもほんとに汚かった．
遺伝子の同定だったから問題なかったけど．
ちなみに377ね．凍らすと駄目って聞いたことがないけど、
俺の中では駄目ってことになってる．
あと室温で1ヶ月放置はまったく読めなかった．
先生ごめんなさい．

682 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/27 23:19:21

>>677
培地は何色になって死んでいるか？
温度計でincubator内温度は確認したか？
どうしてもおかしいようなら業者に点検依頼。
それでも異常なしなら・・・いや～な予感。

683 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/28 00:10:52

>>680
私は経験ないけど，周囲の経験から考えると，４℃で保存しておけば１週間は大丈夫みたい．
それは681さんと同じのようですね．
凍らせたらどうなるのか，分かりませんが，ダメになりそうな気がする．根拠はないけど．
私のラボはABIの3100，3700．

どういう故障か分かりませんが，長期の修理になることを考慮して，もう一回シークエンスサンプル作っておけば？

684 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/28 00:26:39

>>トルメキア
余裕。1週間なら何の問題も無し。

685 ：トルメキア第4皇女：05/02/28 01:44:23

>>681
クロトワ、報告ご苦労（W

>>683-684

みなさんありがとうございました。
実は、サンプルは凍らせてしまっていました。
やばいですよね。
でも今さら解凍するわけにもいかないし。
シークエンサーにかける直前に氷中で解凍することにします。
結果は後日報告しますね。

686 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/28 02:03:56

うちのCO2インキュベーターはバットに水を張ると暴走して20%CO2とか供給してくれる
しかも表示は5％のまま　中見ると　まっきいろ　全滅
バットの水を入れなければ順調　たぶんセンサーが湿度に弱いんだろうな

687 ：683：05/02/28 04:20:12

おまけ(みんなやっているだろうが)
冷凍保存について思いついた．
シークエンス反応が終わった直後のサンプルは冷凍で１～２ヶ月可能
そのあとのエタ沈後のサンプルも冷凍で１～２ヶ月可能
大規模なシークエンスをやっているので，冷凍庫にサンプルが結構貯まっている．．．
でもホルムアミドと入れてDenatureさせたサンプルを凍らせるとどうなるのでしょう？
そんなことは確認したくないですが．．．悪くなるような気がしますが，何故でしょうか？＿

688 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/28 14:41:46

formamidは-30℃では凍らない。

689 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/28 15:18:23

ﾊｧ？

690 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/28 18:04:43

>>688
凍りにくい画分は変質（イオン化）している
凍らないホルムアミドは使えない

691 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/01 06:22:09

>>683

>でもホルムアミドと入れてDenatureさせたサンプルを凍らせるとどうなるのでしょう？
>そんなことは確認したくないですが．．．

ホルムアミドで変性させた後、ディープフリーザーに放り込んでいれば、
結構大丈夫ですよ。

692 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/01 06:45:03

電気泳動について質問があります。

免疫沈降をした後、90度ぐらいのSDSバッファーでeluteしたサンプルを
電気泳動で流します。普通サンプルをゲルにロードすると、ウェルの幅全体に
勝手に広がっていきますが、この免疫沈降したサンプルは粘度が高そうにみえ、
広がらず、ウェル内で凝縮しているように見えます。

電気泳動すると、ウェルの真ん中に狭い幅で流れていきます。
何か対処方法がありますでしょうか？よろしくお願いします。

抗体やProtein Gなどが大量にサンプルに含まれているので
タンパクの濃度があがったのが原因だと思うのですが。

693 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/01 12:58:58

バッファー増やしてよく溶かせばいいんじゃない？

694 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/01 23:04:11

DNAを32PでラベルしてEMSAやりたいんすけど、
なんか一本鎖DNAが見えるんです。
タンパクが1本鎖にくっついちゃうんで
なんとかなくしたいんですけどいいアイデアありませんか？
DNAはPCR産物を切り出して、T4PNKでRIラベル。
その後、フェノクロエタ沈、DRYで水に溶かしてます。

695 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/02 00:04:02

>>694
もうちょっと性格にプローブ作るところを書いてご覧。
アドバイスしちゃる、ワシヽ(´▽｀)ノ

696 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/02 00:15:15

>>694
ほなら一本差DNAでブロッキングしたらいいじゃんか！
と思うんですけどどうですやろ？

697 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/02 00:57:24

>>694
水だと変性しちゃうとかどっかで読んだような

698 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/02 12:38:19

>>695
まずプロモーター領域をクローニングしてあるプラスミドを
テンプレートとしてPCRして、こいつを電気泳動します。
するとエチブロ下で１バンドになるので切り出します。
切り出しはエッペンドルフのゲル切り出しキットで水に溶出しまつ。
すると大体毎回30ng/λ位になるので、こいつを3μl（大体100ng）を
50μlの系でT4PNK処理。この時32Pは２MBq。
でこいつをpH8.0のフェノール抽出して、
上精をクロロホルム処理。
でもってエタ沈で20～40μlの水に溶かします。
で、5～20万cpm/μlのプローブができます。

今のところ>>697の意見もあるように、最後のエタ沈後の
溶出に20mMTris（8.0）100mMNaClを使ったら良化したんですが
完全にはなくなりませんでした。
一本鎖バンドが出ない
条件をごきょうじゅくだされ。

>>696
シフトバンドが一本鎖由来かどうかの区別がつかないです。

699 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/02 18:10:21

一本鎖→塩不足による変性と思っています。

なので、

1.低塩濃度にならないよう
常に100mM程度のNaClが存在するようにする。
おいらはカラム使って精製してます。

でも、完全に一本鎖バンドをなくすことは難しい。
プローブの配列やGC含量にも依存すると思うし。

2.dIdCを加える。
ウソと思うかもしれないが、
dIdCををTE+100mM NaClに溶かしたあと、
熱変性したもの熱変性後アニールさせたもの
をまぜるとノンスペ・コンプレックスのバンドが
かなり消えたことがある。
一本鎖、二本鎖それぞれのdIdCが
ブロックしてくれたと思っている。

初期の頃の研究で、間違えて一本鎖DNA結合タンパク質を
クローニングしてしまったなんていう悲しい話もあるので
いろいろ条件振って検討した方がよいっすよ。

700 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/02 19:24:33

>>699
ありがとう。やっぱ苦労してる人は
苦労するところなんですね。
転写解析は素人ラボなんでノウハウがなくって。
dIdCは加えられない状況なんで常に塩を入れるってのを
切り出しの時からやってみます。
ガッツリDNAを入れないと見えない系だから
一本鎖DNAは切実です。

701 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/04 03:35:46

>>694
ラベルしたＤｕｐｌｅｘをゲル精製（ＰＡＧＥ）すれば良い。
溶出時に塩入りのバッファーで溶出。
これでＳｉｎｇｌｅ　Ｓｔｒａｎｄが見えるなら、
そのＤｕｐｌｅｘの安定性が低過ぎるって事。
もう少しＧＣ含有量増やした配列を付加すべき。

それより・・・、
あなたのラベル後の精製方法ではフリーの３２Ｐ-ＡＴＰすら
除けてないんじゃない？
エタ沈だけじゃなくゲルろ過、逆相、ＰＡＧＥなどの精製方法も合わせて
もう少し純度の高いラベルＤＮＡを調整したらどうでしょうか。

702 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/04 12:02:05

dsRNAをAnnmonium acetate-isopropanolで沈殿して、
Dicerにかけて、２１ｂｐのfargmentを回収しようとしているのですが、
ぜんぜん、回収できないのです。
一方、LiClで落としたものを使ったら、問題なくいきます。
これって、過剰のNTPが混入しているとDicerの反応を阻害するということ
なのでしょうか？

703 ：694：05/03/04 14:39:28

>>699
2回トライして2回とも一本鎖消えました。
ありがとう。

>>701
最初はG50で精製してたんだけど、
フリーのPの混ざり具合がサンプルによって異なったんですよ。
つまり同じcpmでもバンドの濃さが違ったのね。
で、シークエンステンプレートのPCR産物から
プライマーの除去にフェノールを使ってたことを
思い出して、低分子の核酸ならフェノールで除けるかな
って思ってやったら、G50よかはるかにキレイな
DNAが取れました。っていうかなんでみんなフェノールじゃなくて
G50使うんだろ？
まぁおれのG50カラムの作り方がいまいちだったんだけどね。

704 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/04 22:09:08

>>702
酢安-イソプロ沈だと低分子核酸は沈澱しないよ。
PCR反応液のプライマーやミニプレのRNA分解物を除くのに良く使ってるよ。
ミニプレではシークエンスできる程度には精製される。dNTPもきれいに除かれます。
21bpのdsRNAは完璧に除去されてしまいますよ。
酢安-イソプロ沈だとだいたい200bp以下は沈澱しないかな？

705 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/06 00:50:04

この間からとある試薬を細胞にぶっかけて様子を見ているのですが。
その試薬を作る時に全量を１００μlに溶かすところを1mlに溶かしてしまいました。
高価な試薬で怒られるのが怖くて本当のことをいってません。
みんなその試薬をつかってますが結果はでないでしょう。
みなさんごめんなさい。

706 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/06 13:46:51

(　・∀)人(∀・　)通報しますた！

707 ：Tベクター：05/03/12 15:41:16

Tベクターを自前で作りTAクローニングを行っていますが、なかなか
インサートが効率よく入るベクターがつくれません。ブラントエンド
のベクターをEcoRVで切断していることはゲルえいどうで確認しているので
おそらく問題はTを付加させるところに有ると考えています。
何か良いアドバイスが有ればどうかよろしくお願いします。

708 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/12 17:02:43

購入してください
一番確実です

709 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/12 17:35:17

自作してるところからすると，ケチなラボでしょ．
ということは，
もらってきたプラスミドを大腸菌に入れて，
ミニプレで取ってるでしょ．
そういうのはちゃんと切れませんから，
Tがちゃんと付いてても未切断のコンタミのせいで，
青ばっかり．

710 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/12 18:25:22

>>709
お前のラボはどんなミニプレのプロトコル使ってるんだ？
ミニプレで切れないって・・・新しい宗教か？
しかもEcoR5だろ？ガッツリきれるっ中年。
シークエンスだって読めるっ中年。

>>707
Sma1サイトにTつけるとナイスな効率だったって
いう過去ログがあったと思うが。

711 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/12 22:03:54

>>707
条件を言わないとアドバイスしようがないよ。
切断後ベクターは切り出したのか？
使ってる酵素は？etc

712 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/13 02:14:08

>>710
50ngのプラスミドの99.9％が制限酵素で切れると
（こんなもんでもガッツリ切れたように見える）
50pgが切れのこる
青コロニーは500個ぐらい出る

99.99％切れたら
青コロニーが50個ぐらいになって
ブラントだったら
ぎりぎり許せるレベル

99.999％切れたら
青コロニーは5個ぐらい
これを元にTベクターを作ると
90％にTが付くとすると
両側にTが付いてるのは81％
両側ともTが付いていないのは1％で
その10％がセルフライゲーションすると
青コロニーは505個ぐらい
（ocの効率は悪いからここまではいかないだろうが）

さっさと買え

713 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/13 02:25:40

>>707
どううまくいかないのかわからんと答えにくい
青コロニー出まくりなのか
何もはえてこないのか

714 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/16 17:32:42 ID:jL3lcFmL BE:53568454-

ANTQUARIUMを自作しようと思うんですが
材料がなんだかわかりません。
だれかアイデアをよろしくお願いします！

715 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/18 20:34:40

>>712
俺、切れ残りなんて想定したことなくって君がそんなことゆーもんだから
きのうちょっとチェックしてみました。そしたら切れ残りなんて全然ない
じゃん！50－100ナノグラムのプラスミドをえこあらんで切って、エタ沈、
トラフォメしても何も生えてこなかったさ。ぷんすかぷん！
でも、シップしてライゲーションした奴はわっさわさ生えてきてんだよな。
これじゃインサート入りをスクリーニングする気が起きない。

716 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/18 23:50:10

>>707
PCR産物の3'の配列でもAがつきやすいつきにくいがあるそうですね。
（設計の段階で考えておくと）

717 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/19 01:57:31

>>715
２ｃｈの意見ってそんなもんですよ。
やったこと無い人が知ったかぶってほざいてるだけ。
ちなみに俺はＴベクター作ったことあるけど、上手く行きましたよ。
何でも購入ばっかりしてちゃダメだよ、>712

718 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/19 03:09:21

PAK-CRIB pulldown assayがどうしてもうまくいきません。
Rac1とCdc42のGTP型のみに結合するPAKのCRIBドメインをGSTに融合させた
蛋白質で、GEFの活性を測る方法です。
293にGEFの活性化型をトランスフェクションしたLysateを、GST融合蛋白質
によってpulldownしています。
コントロールとして用いたRac活性型であるG12Vはpulldownされ、不活性型
であるT17Nはpulldownされないのですが、MockとGEFをトランスフェクションした
場合での差が見られないんですよねぇ。
同じassayをした論文をみると、Mockではほとんどpulldonされてないのが
GEFを入れると見事にバンドが太くなっているのですが…
トランスフェクション後、血清なしの培地に変えるなどしてみましたが、
特に変化ありませんでした。

719 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/19 06:23:56

I would recommend other enzyme like SmaI
due to the less reproducibility after ligation.
EcoRV-generated vector, even self-ligated vector,
can produce false postive because of possible
mutation around EcoRV-cleaved sites
(Please see BioTechniques 2002, Vol 32 (no 6); 1244-1246).

720 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/19 12:48:22

>>715
712じゃないけど、切れ残りを想定するのは当たり前なんだけど。
transformationの効率はいいのか？　悪けりゃ切れ残りは出ないわな。
まぁ、いずれにしても今回の場合CIAP処理がうまくいっていないようだね。

721 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/21 01:35:57

精製したタンパクの残りが100ugくらいしかありません
ペプチドマッピングして　シーケンスしたいんですけど　どんな方法が確実ですか？
個人的にはV8プロテアーゼが一番いいかなって思っているんですけど

722 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/21 01:49:14

>>718

GEFはRac野生型のGDP結合型からGTP結合型に変えるわけだが、
Rac G12VはそもそもGTPase活性を欠いているだから、GEFいれようが
なしにようがGTP型に固定してるがな。

GTPase活性を保持しているRac野生型でやらないとGEF活性は検出できないんでないのか？

723 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/21(月) 04:25:42

>>718
トランスフェクションしたGEFは全長？
それともPH DH？

724 ：718：2005/03/21(月) 15:13:11

>722
G12VとT17Nは、GST-PAKによって、前者はpulldonされず、後者は
pulldownされないことを確かめるためのコントロールとしただけです。
GEFをいれたときは内在性のRacに対する変化を見ようとしています。

Rac野生型とGEFを同時に入れてみることも試したのですが
うまく差がでなかったんですよね…
問題点として、MockでもGTP型がpulldownされすぎてしまう
ことがあげられます。
>723
全長ではなく、PH DHです。

725 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/22(火) 05:14:38

>>720
キレ残り？
ゲルから切り出せば、そんなに目くじら立てるほどの
キレ残りなんて存在しないでしょ？

>707　Ｔベクター作りでCIAP処理したらダメだよ。
しても良いけど、プライマー側をリン酸化したものを注文するか、
リン酸導入してからＰＣＲしないとダメだから邪魔臭いｏｒ金かかる。

726 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/22(火) 07:13:32

たしかに
ゲルから切り出すと青コロニー劇的に減るよね

でも
たぶんニックとかたくさん入ってると思う
これをそのまま普通にライゲーションするなら問題ないはずだけと
>>707みたいにTaq処理すると5'->3'exo活性が悪さしないかな

727 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/22(火) 19:17:24

>>725
>>720に対するツッコミどころはそこよか
コンピの効率とか逝ってるトコでしょう。
逝ってることはぜんぜん正しいんだけど>>715は
CIAPして生えてきてるって逝ってんだから。
それにCIAPがうまくいっていないって判断もできないっしょ。
50ナノとかトランスフォームしてる事自体おかしいんだし。
まぁ>>717のいうように2chでトラブルシューティングするほうが
間違ってるよな。

728 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/22(火) 21:16:03

ああああああああああ
ＳＤＳ　ＰＡＧＥのゲルが破れたorzorzorz

729 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/22(火) 21:26:32

m9(＾Д＾)ﾌﾟｷﾞｬｰ

730 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/23(水) 23:52:25

以前から思ってるのだが、オリゴの作成技術って安くなってるけど技術的には
向上して無いと思わない？
もっと長いベースを作る技術ってできないのだろうか。
もし５Kぐらいまで簡単にできる技術ができたら、ベクターも一気に作成できるだろ？
どこかそういうことに挑戦する会社無いのかな？あったら注文殺到するぞ

731 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/24(木) 00:11:43

　　http://game9.2ch.net/test/read.cgi/gamerpg/1111388501/172-174

　　リアル神の降臨を見よ

732 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/24(木) 04:00:54

>Rac野生型とGEFを同時に入れてみることも試したのですが
うまく差がでなかったんですよね…

うちはそのアッセイ、学部学生でもきれいにいっているよ！
GEF発現してね～んじゃないの？　ウエスタンで確認したの？
GEFのコントロールが動かなかったら、何か刺激を加えてGTP-formに
なるようなポジコン選べよ。血清刺激ありと、なしとでとか選んで
RacのGTP/GDP ratioを変えるような刺激を加えて・・・

>問題点として、MockでもGTP型がpulldownされすぎてしまう
ことがあげられます。

pulldownしたGST-PAKとbeadsを1xSDS buffer 40ulにsuspendして
boilした後に、20-10-5-2.5 ulをそれぞれSDS-PAGEにloadしてWesternしてみて、
Westernの感度って、ECL使っていればわかるけど滅茶苦茶narrowなんだよ。
そのリニアになるところで差を見なければ行けないから、一点だけで比較した場合
差が隠れてしまって見えなくなることはよーくある。

これで差が出ないんだったら、lysateの量を固定して、逆にpulldownするときのGST-PAKの量をふってみて、

733 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/24(木) 18:13:27

age

734 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/28(月) 10:50:44

スレ違いかもしれないけど質問させてください。
ヒトDNA採取のため、口腔内細胞の採取キット使ってるけど、
安くてオススメありますか？
Buccal swabお試しで使ってみたけど、高杉です、、、、、

735 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/30(水) 05:50:16

妊娠マウスにBrdUうってembryoで検出しているのですが、
突然検出できなくなりました。
抗体はへたっていなさそうです。
BrdUって簡単に変質、劣化するのでしょうか？

736 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/30(水) 11:38:58

素人質問で失礼します。

ＰＣＲプロダクトをアガロース電気泳動して
エチジウムブロマイド染色しますよね？
トランスイルミネーターで見て写真を撮りたいんですけど
UVランプの「ムラ」が激しく写真を撮るのに苦労します。
トランスイルミネータは、２０万円ぐらいの汎用機種。
（故障や、UVランプが古いせいではないと思います）

いつもはできるだけ均一な所に目的とするバンドが来るようにゲルを置いて
写真を撮っていますけど、かなり大変だし、定量性も怪しいし。

みんな、どうやって綺麗な写真を撮っているんですか？
かなり困っているので、なにか良いアドバイスをよろしくお願いします。

737 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/30(水) 21:02:52

>>736
たぶんデジカメか35mmフィルムで写真を撮っているのだと思いますが、
普通のＵＶトランスイルミネーターは安全性とコストの関係で可視光
（450nm以下や700nm以上）も透過しているフィルターを使っています。
ＵＶトランスイルミネーターを点けると紫色の光りを出します。
昔ポラロイドフィルムを使っていたころは近赤外領域の感度が低かった
ので青い光だけカットする目的でＹＡ３（オレンジフィルター）やＲ１
（赤色フィルター）が使われていましたが、デジカメや３５ｍｍフィル
ムでは近赤外の感度が高いため、同じようなフィルターを使用しても
ＵＶ管の形に光が透過して言われているような「ムラ」が写ります。
この「ムラ」を除くには近赤外をカットするフィルター（IRカットフィ
ルター）を用いれば良いわけです。もっと簡単な方法としてはバンド
パスフィルター(600nm±60程度のもの）やEｔBr用フィルター（バンド
パスタイプのもの）を使うことですが、使われているデジカメやフィルム
によっても感度特性が異なりますので２枚重ねや特性の異なるものを試す
必要があるかもしれません。また、ＵＶトランスイルミネーターには肉眼
的にはUVしか透過していない高性能フィルターを使用したタイプもありま
すので、レンズ前に付けるフィルターと併用するとフィルター選びが楽に
なります。

738 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/03/31(木) 06:18:10

>>737
詳しい説明ありがとうございます。
とても助かります。

ご指摘の通り、撮影はデジカメです。
早速試してみますので、結果を報告に来ますね。
どうもありがとうございます。

739 ：　：2005/04/08(金) 10:59:52

DNAのスペクトル取るときに、200nm近辺でピークが高い時って何が入っているんでしょうか？

740 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/08(金) 11:07:48

多糖

741 ：Dナ：2005/04/09(土) 00:30:17

糖＝アガロース　と思うしと手を挙げて

742 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/09(土) 03:04:36

>>739
EDTAもあなどれない。違うバッチのTEでblank取るとかなりずれる。

743 ：& ◆rgblk2EFus ：2005/04/09(土) 10:39:18

>>740-742 面白いコメントありがとうございます。
普段あまり気にしてないところかと思うのですが、
知っておくとためになるユニバーサルな知識ですね。
他にもあるのでしょうか。

744 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/09(土) 11:00:50

240nm近辺だとフェノールとβMEも怪しい

745 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/10(日) 03:51:10

>>743
徳島のご様子は如何ですか？

746 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/10(日) 04:52:08

よくある話だけどね。
で、DNAを精製する時って何使っている？

747 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/10(日) 20:36:59

GENELUTE

748 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/11(月) 02:21:38

４年になって卒研はじめたばっかりの素人なんですがPCRがうまくいかず、
バンドがなかなか出ません。同じような経験がある方、
なにを改善したら上手くいったか教えてもらえるとありがたいです。

749 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/11(月) 07:10:44

ポジコン

750 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/11(月) 09:59:40

>>748
何がうまくいかないか書きなさい

751 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/11(月) 11:43:34

>>748
先方に理解してもらえるように、分かりやすく的確に質問するのも勉強だ。
ネットだけでなく、先輩やら先生に質問する勇気も試練だ。
忙しい人に対して迷惑かも知れないと思ったら、その分雑用をしてあげれば良い。
ガンバレ。

752 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/12(火) 06:33:47

設計したプライマーやサイクル条件が働くかどうか、とりあえずRT-PCRをしました。

RNAは1ug、100ng、10ngで、10ngのサンプルのみ増幅が見られました。
素人考えでは、RNAがたくさん入っているほうが増幅しやすい気がするのですが、
1ugや100ngでうまく増幅されないことというのはあるのでしょうか？
改善できるポイントがあればよろしくお願いします。

サイクル条件は普通のもので、
50C 10'
95C 5'
50X 95C 15"
60C 30"
40C 1'

で、その後は融解曲線分析に入ります。

753 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/12(火) 23:28:09

RNAを抽出した時の純度が不十分で、
1ugや100ngのとき不純物がPCR反応を阻害した可能性がある。

754 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/13(水) 02:20:58

RNAがきっちゃないんだね。
もっとしっかり仕事せなかんで～！とか言ってみる。

755 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/13(水) 04:37:50

>>752
５０回も回してるのか...

756 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/13(水) 05:31:49

外国に細胞を送ろうと試みているのですが、2回やって2回とも相手国の税関で引っかかって
うまくいきませんでした。
相手国はドイツなんですが、税関で一週間ほったらかし。
凍結細胞だったのですが、当然ドライアイスは溶けて細胞は全滅です。
生きた細胞を送る方法もあるのですが、細胞の寿命は同じようなものでしょうね
何か良い方法は無いものでしょうか

757 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/13(水) 05:35:40

>>756
愚直な方法をとるのはどうかなと思うよ。
余裕でドイツと株のやりとりしてる。
とマジレスしてみる。

758 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/13(水) 07:10:58

>>757
どうやってるの？

759 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/13(水) 19:29:21

>>757通報しますた

760 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/13(水) 23:52:10

久しぶりに遺伝子実験することになって、なんかよく分からん状態になったんでヒント下さい。

・主題；E.coli JM109/pUC18 lacZ域にPCRでpBR322 tet域を部分的に増やして、ぶち込み、カラーセレクション
・現在；tetを部分的増殖完了。pUC18の増殖抽出完了。この後EcoRⅠ加工を施してligation→transformに持っていく予定。

・何が聞きたいか；pCU18の増殖が出来ているかAGEにかけたところ、RNase処理をしたにも関わらず現れたバンドの正体を知りたい。

　pUC18はscDNA状態でAGEにかけた（濃度計算の為だけに流したので切る必要がなかった）
　2000bp近くに濃いバンドが見えるので、これはpUC18のscDNAってのは判別可能。

　疑問1；3200～3300bp付近に、微かなバンドがうっすら見えるがこれは何でしょう？
　疑問2；マーカーとして流したλ-HindⅢの1stバンド付近の距離に極めて薄いバンドが見えるが、
　　　　　これは前処理で処理し切れなかった宿主DNＡだろうか？

↓バンドイメージ（ＡＡ）

　　　　　　　　　　　　　[λ-HindⅢ 1st]　　　[3200][2000]
ウェルサイド　　　　[]　　　　　　　　||　　　　　　|| 　　　||　　　　　　　+サイド

761 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/14(木) 00:28:01

oc、linear、ポリマーか、ゲノムでしょ。ポリマーって書くと、アホがなんか言うと思うけど、スルー汁。
何れにせよ、気にせず実験しなよ。
基本的な思想が君には欠落してる。何かは自分で考えてくれ。
と、自分のラボの学生相手なら言うだろう。
繰り返すが、大目標がはっきりしてるんだから、任務遂行してくれ。
気持ち悪いだろうけど、そのバンドが何かは、現在の分子扱ってるラボでも少数しか知らない。
分子生物学の勃興期にいたヒトをボスに持つラボぐらいだ。
ワシは教えてあげないｗ。

762 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/14(木) 00:52:18

>>761
（´・ω・｀）ｼｮﾎﾞｰﾝ・・・

なんか、参考文献か勉強のヒントがあったら、教えてください・・・

763 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/14(木) 00:57:27

>>761
CCC型、OC型と、一部ニックが入ったLinear型って認識じゃダメなんでしょうか
（´・ω・）　専門じゃないんで、よく分からんのです・・・

764 ：761：2005/04/14(木) 01:15:04

>>763
適当な制限酵素できってごらん。
二つを良く見比べて考えるとすぐわかるよ。

765 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/14(木) 02:11:52

>>764
学生実験なので、試薬は自由に使えないんです・・・

うーん・・・過去のpUC18のEcoRⅠ処理の泳動写真と見比べてみましたが・・・
距離が全然違います。（DNS 500bp laderを一緒に流してる）

これでは、pUC18のocだとしてもあまりにも重過ぎます。
sc、破損的oc、リニア、CCC、ニックのいずれにも到底当てはまらないので
scダイマーを想定したのですが、これも排除でしょうか・・・

てか・・・よう分からんなってきた・・・　orz
勉強が足らん・・・うぼぁ・・・

766 ：761：2005/04/14(木) 02:19:02

ああ、やっぱり学部生か。
まあ、いろいろ考えてご覧よ。
で、それを検証するための実験を自分で組めるかどうかが、トレーニングされるかどうかだな。
がんがれヽ(´▽｀)ノ

767 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/14(木) 02:21:09

>>766
わかりました。
レポではヘリクツ並べて検証の為の方法を書くって形で纏めていきます。

（´・ω・）　やることは専門的なくせに、検証は自由にさせてもらえない・・・
　　　　　　まだラボにすら入ってないからしゃーないか・・・
　　　　　　精進します。

768 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/14(木) 19:16:35

>>761
今日、EcoRⅠで切って流すことが出来ました。
結果、こう考えられるかなと・・・

一番濃くて遠くに流れたのが　　　　pUC18 sc
次に遠くまで流れた薄いバンド　　　voltexでnickが入ってしまったpUC18 oc
λ1ｓｔ付近の薄いバンド　　　　　　　ゲノムの混入

こんな感じですね　（・ω・｀）

769 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/17(日) 18:17:35

ワインの水割りと言えば、共和制ローマの元老院の大カトーを思い出す。
このおっちゃん元老院での演説は、かなりの凄い物を持っていて彼のカルタゴの殲滅に世論を動かした人物。
元老院での演説では、いつもワインとそら豆の「伴奏」が付くと言われたほどの鯨飲家で彼が記した「農学書」では
農業やめて放牧に回帰しろと言っていた。

その農学書の中に当時のワインの飲み方が記載されている
カトーのワイン学の中でおもしろいのは、ワイン１０に対して、酢を２、濃厚ぶどう汁２の割合で混ぜたものを、
ワインの量の５倍で水で薄めて飲む当時の水割りの飲み方が紹介されていることで、その貯蔵法として、
この水割りしたワインにさらにその全量の４分の１の海水を混ぜるよう指導している。ここでは、ギリシアのコス島の
海水割の習慣を受け継ぎ、しかもこれを防腐剤として、長期保存法としている。
まあ、そのやり方で想像してみる味覚に関しては多少疑問の余地もなきにしもあらずだが、この時代のローマ人たちは、
古くて濁ったワインを水鉢に入れて、これに香辛料などを混ぜて飲んでいたようだ。
　また、手に入れば氷を入れて冷たいワインもあったとは驚きで、逆に熱湯のホットワインなども賞味していた。
かなり乱暴な飲み方とも言えるが、あくまでギリシア式を踏襲したのだろう。このままでは古典ワインから新ワインと
いうわけにはいかない。純ワインを生地（きじ）のままでやるのはあくまでも医薬品に限られていたようで
、このような乱暴な飲み方は徐々に改善されていくことになる。
ローマ人がワインをそのまま（生地）で飲用する様になったのは、共和制終わりの紀元前１世紀頃、BC１２１年は
ワインの当たり年とされています。

770 ：SDS-PAGE：2005/04/18(月) 15:11:28

10%のアクリルアミドゲルのSDS-PAGEで、prestaind protein ladderというマーカーを流してみると、バンドがシャープじゃないんですよね。
まわりの人のを見ると、バンドがシャープで見た目きれい。
一般的に、バンドがシャープになる条件って何かあるんですかね？

771 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/18(月) 15:22:04

どれだけの血税が中国人留学生一人につぎ込まれているか？
おそらく、大多数の日本人は知らないのです。知ったら、爆発するよ。

大学に留学する場合です。
1)奨学金／月額142,500円（年171万円）
2)授業料／国立大学は免除、公立・私立大学は文部省が負担(年52万800円:現時点)
3)渡航旅費／航空券支給　東京-北京　(111,100円)
4)帰国旅費／奨学金支給期間終了後所定の期日までに帰国する場合は航空券を支給　(111,100円)
5)渡日一時金／25,000円
6)宿舎費補助／月額9,000円または12,000円　(年144万円)
7)医療費補助／実費の80％
上記 1) +2)+3)+4)+5)＝380万円！年に380万円ですよ。
なおかつ全て血税ですよ。
奨学金とはいえ、支援・支給額です。返さなくていい。奨学金をほしい日本人は
わんさかといるのにもらえない人が多い。それなのに、中国人留学生は当たり前の支給と思って
全ての人がもらっているのです。繰り返し、言います。年に380万円ですよ。
4年いたら、1520万円ですよ。血税で養っているのですよ。貧乏な日本人学生が多くいる中で。
しかも、10万人。いくらでしょう？
3800億円です。どこかの国の国家予算規模ですよ。
それをふんだくるばかりか、勉強もせずに、バイト。居心地よくて不法滞在。

なんで怒らないの？血税ですよ。

772 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/18(月) 17:00:55

>>771
しっとるわな。
だからと言ってどうしろと？

773 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/25(月) 09:36:33

頭二つのプラナリアを作りたいのですが
上手に真っ二つにするコツってありますか？

774 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/25(月) 16:19:20

>>773
双頭は頭近くをスライスだ。
上手くいけば双頭。

775 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/25(月) 23:31:21

縦ですか
横ですか

776 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/25(月) 23:52:22

>>775

＜：>＝＝＝＝＝～
　　||
　　　↑
　　この辺りをこの向きにねね。100％じゃないけど、双頭が生まれることがある。
　　根気よくね。何匹か一度に生贄になって貰うと良いよ。

777 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/26(火) 23:21:08

貝印の両刃カミソリを、それも毎回使い捨て。
無駄な圧力をかけないように、引く力で自然に切るべし。

778 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/27(水) 00:09:05

>>770
Pre-stainedはそもそもあまりシャープにならないよ。
でもシャープに流したいんだったら、ゲルの固め方を
工夫するといいよ。
低温で長時間かけて均等に固めるようにするといい。

779 ：773：2005/04/27(水) 00:24:23

>>774-777
㌧です。明日早速やってみます
引く力で自然に＞この辺が特に参考になりました。
今まで押して切ってたので…

780 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/27(水) 00:27:18

それと横切りもトライしてみます。

781 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/27(水) 01:09:10

切るんじゃなくて斬るんだ！

そんな俺はワイヤー法をオススメする。

782 ：773：2005/04/27(水) 23:28:29

今日やったら潰さずにうまく斬れました！！
皆さんアドバイスありがとうございました！
あとは冷蔵庫で経過待ちです。
縦割りも横割りも上手く頭二つになってますように…。

783 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/27(水) 23:42:08

>>782
他に、クローン体を作って移植と言う方法もありますが、これは邪道ですねｗ

復活待ちのようですが、ここで一つ。
加速剤となる物質を添加してやると、復活は早くなります。
（なんという物質かと言うのは、自分で調べてみよう。良い勉強になるよん♪）

784 ：GM3：2005/04/28(木) 12:45:29

puc19を制限酵素処理してT vectorとすることは出来ますでしょうか。Taqで増やした
産物をTAクローニングをしようと思ってます。

785 ：T vector：2005/04/28(木) 16:05:23

＞７８４
やったことはありませんが、できるはずです。

786 ：T vector：2005/04/28(木) 16:11:54

ある制限酵素によって平滑末端したプラスミドを、dTTP存在下でTaqを効かす。
細かい条件は知りません。

787 ：SDS-PAGE：2005/04/28(木) 16:22:16

>778
ありがとうございます。
抗体による検出後、あなたの指摘通りであることに気づきました。
マーカーに比べ、検出したバンドがシャープだったのです。
低温で長時間でもやってみたいと思います。

788 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/28(木) 16:57:21

初めて書き込みます。グーグルの検索で、「人に言えない恥ずかしい実験の失敗」
という過去スレのキャッシュ（>>1から78まで）をゲトしました。あまりに抱腹モノ
で面白く、続きを読みたいのですが、html化したものや後継スレが見つかりません。

失敗事件、もとい失敗実験スレって今は無いのでしょうか？

789 ：GM3：2005/04/28(木) 20:09:36

>785
>786
ありがとうございます。やってみます。平滑末端にしたプラスミドとdTTP、Taqを混ぜて
72度30分くらいでしょうか、。

790 ：脱灰：2005/04/29(金) 10:41:03

骨を含む組織を脱灰／Ｉｎ　Situ　ハイブリダイゼーションしたいんだけど、
１０％ＥＤＴＡ溶液の作り方教えてください。

多くの人が、ＥＤＴＡ－２Naを溶かし、１０％（重量/Ｌ）にして、NaＯＨ溶液で
ＰＨ7.4にして、って書いている。
うちにはＥＤＴＡのみの粉末があるんですが・・・。

791 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 11:13:16

>>790
電離量計算をして、上手いこと混ぜて味噌。

792 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 14:53:38

EDTA-4Hと2Naの分子量の違いは？

793 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 16:21:26

ライゲーション話を蒸し返すようで申し訳ないんですが、
実験がうまくいかない話をさせてください。

ラージスケールのライブラリをつくるためのライゲーションが効率悪いです。
制限酵素断片をゲルで切り出して抽出したものをライゲーションしました。
そのときに、ゲルの融解のために55度にインキュベートしてから、室温放置しているんですが、
ひょっとしてこれで付着末端同士がくっついているのではないかと。
その証拠 (？) として、ライゲーション産物内には、インサートのモノマーはなくて、
ライゲーションでインサートのほとんどがダイマーやらなんやらになって、バンドが数kbにわたってスメアになってました。
以前、同様の実験をしたときは、インサートとベクターのバンドが残っていたのですが・・・
ベクターのバンドもよくわからなくなっていて、異常に分子量の大きいほうにテーリングしてました。

そこで熱処理→急冷を行ってみたいのですが、
60℃で熱処理→急冷が効果があるかどうかについて意見が分かれていたようですが、
効果があったときって、どのくらい効率が上がったとかいうデータがないのでしょうか・・・？
ちなみに、DNAの両端はそれぞれ1塩基、4塩基突出です。

794 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 17:29:13

>>792
なぁ・・・一応実験するんだから、試薬の分子構造ぐらい知っておけよな・・・

>>793
ゲルで切り出すとかの意味がサパーリ分からん。
俺がＤＱＮだからですか、そうですか　orz

AGEで流したものを抽出とかいう意味が分かりません。
俺がＤＱＮだからですか、そうですか　orz

DNAがダイマーってなんですか。
俺がＤＱＮだからですか、そうですか　orz

結局なにがしたいのか分からないんですが。
俺がＤＱＮだからですか、そうですか　orz

795 ：793：2005/04/29(金) 18:01:51

>794
AGEと書いてないのに抽出とかなんとか書いてあるので、文脈理解してくださっているのでは？
長文を避けたかったので省略しておかしな文になってますがすみません。
DNAがダイマーってのはおかしかったですね。
インサート2つがライゲーションされた産物のことです。

インサートはゲル電気泳動で複数バンドが確認されるPCR断片(制限酵素処理済み)、
ベクターは制限酵素で切ると2箇所で切れます。
そのため，AGEでDNAを分子量によって分けて、エチブロで染まったバンドのうちの目的のバンドを
含むゲルをかみそりで切りとってから、市販のキットを使ってその断片を55℃で融解し、
融解した液をスピンカラムにとおしてDNAを結合させ、洗浄後に溶出して精製しているのです。
PCR断片がマルチバンドになるのは、実験上仕方ないことなので、そこの突っ込みはなしで。

その精製ステップで使う55℃の処理では、結局熱処理後に室温にゆっくりと冷ましてしまっていたのですが、
このときにベクターとインサートを別のチューブで処理するので、ベクター同士、インサート同士が
突出末端の塩基対を作ってしまって、その後のライゲーションで不必要なDNA断片ができてしまうのかな、と。
このスレの上のほうでは、4塩基突出くらいではそんなことは起こらないという説と、
場合によっては問題があるという説があったので、実際のところはどうなのか、何倍ライゲーション効率が
上がるのかを質問しています。
ライゲーションキットには一応、フリーな突出末端をつくるために、60℃→急冷
がライゲーション効率の上昇に効果があると謳っていますが、ほんとのところはどうなんでしょう？
逆に、60℃→徐冷して、効率が落ちたことはありますか？

796 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 18:27:27

>>795
EtBrでDNA染めたら、そのDNAはほぼ使えないものになってると思ってちょ。
EtBrはDNAヘリックスに侵入してカチリンコと嵌る物質だから。
それに、AGEで流した奴を刻んで収穫とかというのも辞めたほうが無難。

どうせ、取りたい部分の塩基配列は分かってるんでしょ？
だったら、PCRでその部分だけ選択的に合成してあげた方が良いよと、大学ニ回生がほざいておきますｗ

で、急冷うんたらってのは、分子u・・・ん、面倒だからいいや。うん。

あと、もう一つ。EtBrはBrを含んでいるので、増殖すると塩基置換が生じる可能性があるよ。
これも常ｓ・・・まあ、いいや。うん。
例えば・・・

CTTCC　　BrU化→　CTBCC　複製or増殖→　CTTCC　　　　　CTBCC
GAAGG　　　　　　　　GATGG　　　　　　　　　　　GAAGG　　、　　GAGGG

この後、BrUはCに置換されるので　T-A部がC-G部に置換されてしまいますね。
結果、情報が狂います。

もしかして、分子生命とか有機化学とか苦手な方ですか？
乱暴に言えば、AGEはペーパークロマトグラフィーと同じですよ。
有機合成でなんか作って、精製にペーパークロマトは使えますか？
普通、カラムで精製ってのが妥当じゃないですか？
この時点で、なんかおかしいなと気付いて下さるとありがたい・・・

797 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 18:36:34

>>796

かなりデタラメ入って無いか？
DNAフラッグメントをアガロース電気泳動してEtBr染色して切り出し、精製して
サブクローニングするのは分子生物学実験の基本中の基本でないか。

最近はUVイルミネータでなくて安全は青ライトで綺麗にDNAが染まるからDNA損傷は
気にせず切り出しできるよ。

でもアガロースから切り出したDNAのライゲーション効率は混入してくるアガロース分子のせいかあんまり良くないね。

798 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 18:36:35

>>796
＞ EtBrでDNA染めたら、そのDNAはほぼ使えないものになってると思ってちょ。
そんなバカな、あんたそんなこと言ったら全世界100万人の「Molecular Cloning」の読者はどうすりゃええねん？

＞EtBrはBrを含んでいるので、増殖すると塩基置換が生じる可能性があるよ。
エート、何をどう勘違いしているのか良く分からないんだが･･･

799 ：798：2005/04/29(金) 18:43:28

おや、先を越された>>797

>>793
ライゲーションは全てのcompatibleな制限酵素切断末端を区別しないから、
産物がスメアするのは当たり前。断片の濃度と濃度比でスメアのピークが
どのあたりになるかは変わるだろうけどね。それから、オレは急冷は宗教
上の理由以外に意味はないと思っている。上でアニーリングした分子が
ゲルで観察されるとか言ってた奴も、何で泳動中に解離しないのかと言わ
れて反論できなかったし。lambdaのcos siteの場合の習慣と混同している
だけ。

800 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 18:54:33

>>793 特定の断片のクローニングなのに、何でラージスケールのライブラリなの？

801 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 19:03:57

>799
私も4塩基程度のアニーリングなんて室温で安定におこるはずはないと思うんですが、
実験結果的にアニーリングがおこってるような気がして。
ここでスメアリングといってるのは、ライゲーション後のサンプルなので、
共有結合してないアニーリングサンプルとは違います。
急冷云々に関わらず、スメアリングするのは当然なんですが、
徐冷したときのほうがひどいように見えました。

>800
変異体のライブラリです。なので、同じ長さの断片になっています。

802 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 19:13:12

>>793
ライゲーション反応後のサンプルを得たチンか薄めてから
ながしてみよう。ホントに「インサートのほとんどが
ダイマーやらなんやらになって」いるって判断していいの？

俺は反応液を直流しすると必ずスメアになります。
具リセロールのせい？って勝手に思ってます。
でもこの現象はラボでも俺だけなんだよな・・・
まぁうまくいってるからあんまり気にしてないけど。

803 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 19:21:18

>>793
１塩基突出の酵素サイトはligation効率が著しく悪いものがあるよ。
酵素のカタログのコメント調べてみたら？

804 ：793：2005/04/29(金) 19:24:56

>802
確かにPEGがはいったままのを泳動したので・・・
その可能性はあるなと思ってました。
ただ、普通、本来のインサート程度の長さのバンドって少しは残りません？
今回は明らかに1×インサートは皆無で、2×インサートのバンドが見えました。
したがって、ライゲーション反応自体は進んでいると思いますよ。

まぁもう一回やってみたときに、60℃→急冷をやってみます。
そんなにめんどくさくもないんで。
それで向上したら、大量のDNAの場合にはいいことがあった、ということになるんでしょうねぇ。
個人的な予想としては、エタ沈でこんがらがったDNAが適当な熱摂動で解けるから効率が上がるのかな、と。

805 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 19:44:11

ベクターとインサートの量はそのままでリガーゼ反応系をスケールアップ。
つまりベクターとインサートの濃度を両方とも下げる。
効果１）１：１ライゲーション産物が増える
効果２）ライゲーション効率が低下する
効果３）リガーゼを大量に消費して景気に貢献する

806 ：793：2005/04/29(金) 19:52:15

>803
使ってるのはまさにその効率の悪い制限酵素で・・・
ただ、今までもよくやっていますし、今回の系でも、
この前ゲル精製なしでやったときはうまくいっていたので。
あ、それなのでゲル精製はベクター側はあきらめようかと。
インサートはさすがにやるしかないんですがね。

>805
確かに。リガーゼちょっとけちり気味なんですよね。
思い切って3倍くらいにスケールアップしてみようかと思います。

807 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 20:17:25

この板の博学な方に伺いたいんですが、CanonのデジカメPowerShot G5を
ヲリンパス顕微鏡に繋ぐ方法ってないですかね？

アダプター鏡筒とかどこで扱っているのかでもいいんですが。

808 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 21:34:44

>>796
>>796
>>796
>>796

凄いや。正しい部分がほどんどない(w

809 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 21:41:08

そろそろ釣れた宣言が出るのか？

810 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 21:44:04

>>796みたいなのが研究室に入ってくると困ったちゃんになるんだよな。

811 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 21:45:15

> この時点で、なんかおかしいなと気付いて下さるとありがたい・・・

このメッセージが釣りであることを指している。

812 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:01:18

なんか、大漁ですね。
サビキ釣りでもした気分です。

>>811
説明㌧

813 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:12:23

>>812
で，楽しい訳？

814 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:13:42

こうして天才釣師にまつりあげられた彼は晒しageられているわけだが

815 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:16:44

ヤバくなると釣りだったで逃げる奴、最近多くね？
有名な、not equal厨とかさ。

816 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:27:34

でも、壮絶に釣られたわけで。

しかも最後に気づけとばかりに仕込んだ一行を無視して釣られまくったわけで・・・

817 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:27:57

>807
>796は博学だ。彼に聞いてみろ

818 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:32:55

>>796のBrによる塩基差し替えはちょっと気をつけないといけないのは確かだな。
TがBrと反応してBrU化ってのは、まあまあ起こるから重要な域でやられるとまずいんだよね。
PCRかけたときとか、最初の時点で組み変わってしまうと最後で泣きたくなるよな。

819 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:47:58

結局、796は間違ってるのか？　正しいのか？
実際、同じ事言ってる教授とかザラにいるが。

820 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:55:04

>>891
言ってることは間違ってないが、今回のネタとはちょっとずれてるかもな。
だが原因の一つとして考えるにはいいと思うよ。

821 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:55:11

オイオイ、EtBrでBrUになるわけないだろ。昔はEtBr-CsClでプラスミド取ってたんだぞ。
796は大バカ、釣りですらない。

822 ：820：2005/04/29(金) 22:55:32

819だったな、すまん。

823 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:56:25

>>821
EtBrは遊離反応するぞ。

824 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:57:23

電離じゃないのか？

825 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:57:34

>>816 あの一行を釣り宣言だと言うのはかなりムリがあると思うぞ。

826 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:57:50

>>823
遊離するが、反応するのか？

827 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:58:30

>>823
反応しても、そんなに反応効率は悪くないから無視できるだろ？

828 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:59:03

大体、EtBrってなんなんだ？

829 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 22:59:53

>>828
エチブロだろうが、そんなのも知らんのか。
バカだなあ。

830 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 23:19:19

>>789
pUCだとあんまりうまくいきませんよ
pBluescriptを使うのがおすすめです。
ラボにころがってるといいですね

831 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 23:31:37

Mg2+濃度を5-10mMにするといいらすぃ

832 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/30(土) 00:21:53

>796は結局どうなのかFAキボンヌ。

833 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/30(土) 00:29:42

>>829
また釣られてるぞ。

>>832
間違いじゃないが、合ってもない。
点数で言えば70くらいか。
場違いという意味なら60もやれないが。

PCRで部分的に増やしてぶち込めってのは納得するが。

834 ：脱灰：2005/04/30(土) 02:32:20

＞＞７９１
お礼がおそくなりましたが、ありがとうございます
おっしゃるように、ＥＤＴＡのｍｏｌ濃度あわせます。

835 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/30(土) 04:08:52

>>793
ラージスケールのライブラリを作るのに、PCR産物のバンドをライゲー
ションと読めるんだけどおじさんにはその目的がよくわからん。

が、ダイマ－ばかりできるってのは片方の制限酵素しか効いてない
ってことはないのか。

836 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/30(土) 04:20:17

>>793
ライゲーションは上手く行ったのでしょうか？
ライブラリー作成のちょっとだけアドバイス。

大量のベクター＆インサートを利用するライブラリー作成は、
条件検討が雑になりやすい傾向にあります。

従って、ライゲーションの際のモル比決定や、
ベクター＆インサートの酵素処理＆精製などを
正確に行えていない場合が多々あります。

以前に小さなスケールで成功しているライゲーションなら、
その制限酵素サイトによるライゲーション効率の良し悪しは、
あまり関係ないのではないでしょうか。

是非、大量調整後のベクター＆インサートを用いて、
小スケールでの予備試験を行ってみてください。

呼び検討が成功したなら、そのままスケールアップすれば上手くいくはずです。
失敗に終わったらな、インサートが悪いのか、ベクターが悪いのかを
確認すれば、自ずと答えが導けると思います。

急がば回れ。

Ｐ．Ｓ．
ライゲーション時の熱処理はあまり気にし過ぎなくて良いと思います。
ゲル抽出も普通に行えば問題は生じないと思われます。

837 ：793：2005/04/30(土) 12:28:40

変なのが憑いてきてしまったようで、
私はスルーしたんですがこんなことに・・・orz

>835
cDNAやゲノムライブラリではなくて、
ひとつの遺伝子のなるべく多様性をもったミュータントライブラリを作るんです。
それ以上のことについては明かせませんが・・・
制限酵素は新品を取り寄せて使っていますし、ベクター側を同じ酵素で切っていて、
ちゃんと切れていることを確認しております。

>836
一応ベクター：インサート比はあわせてるんですよ。
あわせてないところといったら、ライゲーション溶液中のDNAが濃い目というとこですね。
経済上、けちろうかとおもったのですが、これほど効率が落ちるんであれば豪快に使うことにしようかと。
というか、うまくいかないといっても10の7乗クローンは得られるんです。
コンピも自作で10の10乗cfu/マイクログラムpBR322を作って確認しました。
目指しているのが10の9乗から10乗なんですが、いまのところ3×10の8乗が最高記録・・・
確かにプラスミドの分子数を計算すると、目標値が物理的限界に近いんです・・・
その最高記録では、ベクターをゲル精製しなかったので、今度はそれでやってみようかと。
GWは試薬もこないし実験できないので、結果がでるのはちょっと後になるかと。

838 ：793：2005/04/30(土) 12:31:25

ちなみにEtBr染色ゲルからUltrafreeで抽出したDNAを、EtBr抜かずに
テンプレートとして加えてPCRしても、変異はいったことないですが、とマジレスしてみる。

839 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/30(土) 12:34:41

EtBrで組み変わってしまった経験があるんですがと、マジレスしておく。

多分、「運」だな。

840 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/30(土) 12:49:05

>>839
多分EtBrが濃すぎたんだろう。
濃いとまれに起こるよ。

841 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/30(土) 15:20:52

>>839
ｲ㌔

842 ：835：2005/04/30(土) 15:52:20

>>837
だいぶ高度なところでお悩みなようで...

うまくいくかどうかわからんけど、インサートの方をBAP処理して
インサートどうし連結しないようにするとかはどうでそう。
効率は悪くなるかも。しかし片側の末端の連結が先に進んで
しまうのであれば、多少は効果あると机上では考えられるんだけど。

燃える闘魂でがんがれ。

843 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/30(土) 15:56:30

10の八乗って、それが不満ですごいなw

844 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/30(土) 16:50:20

ようは、美人がもっと綺麗になりたいと思うくらいのワガママだってことだな。

845 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/30(土) 17:45:30

だって、pBR322はスパーコイルな大腸菌から調製したメチル化済みの
完全なDNAだろ？

片や、ライゲーションしたサンプルはライゲーションして一方のストランドだけリン酸ジエステルで繋がったオープンサーキュラーで
しかもインサートはメチル化してないPCR産物だろ。

カタログ通りの形質転換効率をどこまで期待してんじゃ！？

846 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/30(土) 20:41:42

卓上の計算しか出来ない人なんでしょ。
まあ、ここに居る大半が走だと思うが。

847 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/01(日) 23:29:37

>>807
博識じゃないけど、これらが参考になれば。

http://www.mecan.co.jp/original/microscope/digital/index.html
http://www.kenbikyou.com/
http://www.lcv.ne.jp/~cosmosak/microscope/DGAD.htm
http://www.vixen.co.jp/MICROSCOPE/Accessories/DG-MF.html

848 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/04(水) 20:42:25

lactobacillusのelectroporationがうまくいかない。
電圧の設定とか教えてもらえませんか？

849 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/05(木) 02:47:18

ゴールデンウィーク中に一言。
>>793
形質転換効率の話なんだけど、
ベクターゲル生成後→１０の７乗、ベクター生成せず１０の８乗って
言ってるけど、１０の８乗のインサート導入効率は確認したのでしょうか？

ベクター数ｕｇ利用して作成するライブラリーは
バックグラウンドを無視することができないと思います。
ベクターの精製を甘くして（例えばゲル精製しないとか脱リンしないとか）
１０の９乗稼げても、バックが高ければ意味が無いでしょ？

ゲルからの抽出操作をしても正しくを行えば、
ライゲーション効率が著しく落ちることはないと思います。

オナニー実験にならないように、気をつけて下さいね。

850 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/07(土) 00:29:27

クリオスタットで作成した切片をスライドグラスに貼り付ける際、気泡が入ってしまい困ってます。
どなたか屈強なcell biologistさん。良いこつがあれば教えてくださーい。
も少し面積が小さい組織ならうまくいくんですけど・・・。

851 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/07(土) 00:46:02

TOPO クローニングベクターみたいに、セルフライゲーションしたらccdBで
大腸菌が死ぬようにしておけば、バックは減るのでは？

852 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/07(土) 01:03:29

>>850
cell biologistなぞに聞いてる間はずっと気泡が入りまくるぜｗ

853 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/07(土) 01:17:15

そそそ

なんでエポンに包埋しないの～とか言われちまうわけだよw

854 ：850：2005/05/07(土) 01:29:04

素早いレスどうも。

>852
さすがにmolecularな人には聞けません

>853
Timmやりたいんですが、樹脂でもいけるのかどうか・・・。
何よりもOCT compoundでうまくやっている人間が世の中に居るので、
何かコツがあるのではと思った次第です。
切断面はhorizontalで、1cm×2cmといったとこでしょうか。
職人さん、アドバイスください。

855 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/07(土) 01:48:54

　　　http://www.freepe.com/ii.cgi?kitanocunika
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856 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/07(土) 01:50:14

>>851
それは致死の遺伝子が導入してある既存のクローニングベクターの話でしょ？
わざわざ致死の遺伝子クローニングしたベクター作ってから
目的タンパクと入れ替えるつもり？

ナンセンスです。
（もっと良い方法あるでしょ？考えてから書き込みしましょう）

857 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/07(土) 08:07:31

拾う時にすみっこから流れる用にひっつける。

それでもだめなら、ラボにあるタングステンニードルの
良く研いだ奴で、拾った直後に気泡を突いて空気を抜く。
タングステンニードルが無いラボなら、
最初からそのラボでは無理だ。

そもそも細胞生物屋はsectionをめったに切らない。
そんな事するのは発生屋と解剖学、病理学の人くらいだ。

858 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/14(土) 13:31:25

>>850
拾う時に、切片の端からくっつけて、
切片の方からガラスに吸い付いてくる「間」を取ってやる感じ。

細胞屋になってから切片なんてまるで切ってないな。

859 ：858：2005/05/14(土) 13:34:53

そして俺の悩みは、クロンテックのGFP-actinをトランスフェクトした細胞が
まき直すとうまく張り付かない、張り付いてもアクチンの動態がおかしい、
ステイブルとろうとすると多核になったりする、というもの。

あれはそういうものなのか？

860 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/14(土) 17:11:28

はい

861 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/20(金) 00:11:49

ビオヂアスターゼの分子情報についてなんですが、
この手の複合酵素のモデル及び推定分子量は何処から引っ張ってくれば良いでしょうか？

こういう情報の検索方法を教えてもらえますか？

862 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/20(金) 16:30:48

percoll gradientを使った無傷葉緑体の調製がうまくいきません。
どんな問題点が考えられますか？

863 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/21(土) 21:42:57

誰も質問に答えられない件についてｗ

864 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/21(土) 23:28:04

polygenicのミュータントマウスの
遺伝子見つける方法ってある？
質的形質（？）でQTLは使えないらしいんだけど

865 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/21(土) 23:37:17

しょうもない質問なんですけど、
プライマーなんか注文するときアミノ酸残基の数をmerっていうけど
何の略かとか分かりますか？

866 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 00:39:18

>>865
-mer１mono-, di-, tri-, poly-，のような接頭語に付く化学の接尾語で，反復する構造の最小単位を表す．例えばpolymer．２isomer, enantiomerのように，特別のグループの一員であることを示す接尾語．

867 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 00:53:40

>>866
あっ、そういうことなんですか。
わざわざありがとうございました。

868 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 01:46:46

単なる英語の基礎知識程度しか解答されない件についてｗ

869 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 02:52:58

>>865
アミノ酸残基じゃなくて塩基じゃないのか？
何の略かは知らん。

870 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 13:36:33

どうでも良い突込みしか出来ない奴しかいない件についてｗ

871 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 13:42:54

↑たんぱく質が自己複製するんだよ。

872 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 14:16:08

そもそも質問が「実験でうまくいかないこと」ではない件についてｗ

873 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 14:17:46

実験後の考察では？

874 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 14:39:54

>>871
するの？

875 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 15:28:51

なんか、中学生が紛れ込んでますよ？

876 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 15:38:10

↑異常プリオンとかのプライマーなんでしょ。

877 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 16:11:54

うは、ＤＱＮ大量発生ｗ

878 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/22(日) 21:37:02

ttp://www.uploda.org/file/uporg106132.jpg

879 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 11:27:35

研究室にあるすべてのキットを使って結晶化したが
結晶できない

880 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 16:28:17

>>879
そのキットの条件じゃダメなんだ。
条件検討しる。

881 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 17:20:33

>>880
あふぉ？

882 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/05/26(木) 21:55:57

>>879
通いの業者に質問しまくるべき。使える人間を見つけるいい機会だ。

883 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/03(金) 00:30:19

先輩の引き継ぎ実験をやっています。
脾臓細胞を調整して、脱アシル化するためにアルカリ処理（0.2M NaOH 37℃ 60min）とノートに書いてあるのですが、
NaOHをどれだけ加えたらいいかわかりません。
そのあと0,1M HClで中和するとあります。
それとも、最終濃度が0,2Mになるように濃いNaOHを加えるのですかね？

884 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/03(金) 02:21:36

>>883
細胞殺しちゃやーよ？

885 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/03(金) 14:10:01

質問です。
死んだ大腸菌からプラスミドを抽出→コンピにクローニングといきたいのですが
死んだ大腸菌から上手にプラスミド抽出する方法ってあります？？
フェノクロだけでいけるかな。

886 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/03(金) 15:44:42

赤血球ゴーストの遠心での調製がいまいちわかりません。
Dodgeの原法通りにやると最終的に3-4層できるのですが、どの層が
ゴーストなのでしょうか？

887 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/06(月) 19:26:32

>>885
ヒント：alkaline lysis with sds

888 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/17(金) 01:55:41

質問です。現在、とある遺伝子をクローニングを試みているのですが、どうしてもできません。
TOPOクローニングをしたり、様々な制限酵素を用いてみたりしたのですが、どうしても
完全長の遺伝子がとれません。何回か候補の断片がとれた時はあるのですが、
そのような時でも、シーケンスした結果、1～2bpのdeletionが生じていることがわかりました。
この遺伝子をクローニングする際に大腸菌をプレートにまいた翌日、不思議なことに小さいコロニー
が沢山、出現し、いくつかの大きなコロニーが出現しました。大きめのコロニーをつついて現在
解析を行っています。deletionが起こるということから、大腸菌がその遺伝子を嫌がって、plasmidの構造を
変化させてしまっているのではないかと私は疑っています。
そのような場合にはどのように対処したら遺伝子をクローニングすることができるように
なるのでしょうか？
誰か悩める私をお助けください。お願いします。

889 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/17(金) 04:51:38

>大腸菌がその遺伝子を嫌がって、plasmidの構造を
変化させてしまっているのではないかと私は疑っています。

そりゃあノーベル賞ものの発見ですね。

実際にはDeletion/mutationが起きなかったものは、
その配列による毒性でコロニーが生えてこなかった。

って事なら解るけど。
タンパクが少量作られてしまってそれによる阻害で菌が増えない時は、
低い温度で（３３℃くらい）で培養する。
DNA複製はできるけどplasmid由来タンパクの合成の効率はややおちるので、
plasmid由来タンパクが蓄積するのに時間がかかり、その分だけ菌が増えられる。

890 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/17(金) 06:08:37

>>888, 889
ストレスが多いとゲノムやプラスミドDNAに異常が起きやすくなるのは常識です。
うまいこと毒性遺伝子がdeleteしたプラスミド持つ菌が選択的に増えてくるので
あたかも意志を持って組み換えおこしているように感じられるだけです。

891 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/17(金) 19:39:13

885
配列特異的に「嫌がる」というのは実際にはほとんどないが
（そうに違いないと思っていたクローンもいったんとれるとあとの取り扱いは普通）
生えるのが遅いことはよくある

そういうわけで
小さいコロニーを拾ってみたら？

892 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/17(金) 22:24:46

>>891
おいおい、聞くからにヤバいだろ、それ。無理やりクローニングして、
変異が入ったから大腸菌で安定に増やせるようになっただけじゃねえの？

893 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/18(土) 02:19:52

deletionがあるのは何でわかるの？

894 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/18(土) 21:54:38

大きなdeletionは泳動パターンで、小さなdeletionは全長sequenceで。

895 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/18(土) 23:55:17

毒性を減らせることのできるABLEっいうコンピを使うのは
どうでしょう？

896 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/19(日) 04:56:27

lacI^q持ってるホスト使ってるなら
IPTGとX-gal入れないで撒いてみたらどうですか？
インサートの配列を発現させなければ
取れやすくなりませんかね
ライゲーションがうまくいってるなら
どのみち青コロニーは１割もないので
大して手間は変わらないでしょうし

897 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/06/25(土) 19:13:27

すみません、教えて下さい。
半定量的RT-PCRで、結果が激しく振れるんですがどうしたら良いでしょうか？

【症状】
さる５系統のマウスの精巣から取ったRNAをRTし、目的の遺伝子をPCR。
バンドの濃さに差が出たので、確認の為にRNA（同一サンプル）→cDNAの
操作を３度、合計４回やりましたが、RTの度々で結果が変わる。
（RT１回目の時はほとんど出なかった系統が、RT２回目では煌々と出てる、等）
同じcDNAサンプルを使うと結果は再現されるのでアプライミスというよりかは
RTにミスがある気がするのですが…。

RT自体は（65℃10min denature、4℃∞）→（42℃60min、99℃5min、4℃∞）
で行っています。

cDNA量は1/2階段希釈を８段階まで行い、27cycleでのGAPDHのbandの濃さで
合わせていますが、何かβ-actinをかけてみるとbandの濃さに差が出るんです
よね。GAPDHとβ-actinって量的に相関しないんですか？

898 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/02(土) 16:54:05

突然ですみません。

線虫とか、ショウジョウバエとかの市販RNAって存在しますでしょうか。
全然あつかったことないので、購入できるならすぐに使用できてありがたい
のですが。メーカーとか教えて下さい。

899 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/02(土) 18:39:29

>898
RNAつっても一杯あるし、メーカーに問い合わせた方が早いぞ。
それにせめてどんなRNAくらいは書けよ

900 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/02(土) 23:11:25

ところでそれが「今実験でうまくいかないこと」なのかな？

901 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/03(日) 01:16:22

>>900
いや、「無知無能の阿呆でどうにもならないこと」だと思われｗｗｗ

902 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/03(日) 03:22:24

>>897
RNAの抽出でやり直した方がいいんじゃないの？
どだいあんた、同一のRNAって保存しているってことだろ？
そりゃ分解を疑った方がいいんじゃね
ちなみに一回目の結果が２回目以降出ないということは一回目で失敗している
という可能性もあるし、一回目を正解と考えるのはどうかと。
ちなみに機械にミスはたぶんないと思うがね

あとcDNA作ってるってことはｍRNAを抽出してんのか？意味が分からんのだが

903 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/03(日) 06:11:02

RTーPCRのさいのcDNA合成でランダムプライマーでやってみそ

904 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/03(日) 17:15:20

激しく質問です。
この前、HeLa細胞を蒔いて、コルセミドで染色体を調製しました。
で、そいつを顕微鏡で蛍光撮影したところ、染色体の本数が、66～69本程度で、
予想していた数字と違いました。もしかして、in vitroでこういうのを増やすと、
染色体の数って、狂ってくるもんなんでしょうか？　モノによったら、77本とかいうのも
出たんですが・・・こういうもんなんでしょうか？　ぜひ教えてください。

905 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/03(日) 17:51:01

HeLaって4倍体とかの奴もあるって聞いたことがあるが…

906 ：ケン：2005/07/03(日) 18:36:40

グアニジンチオシアネートに関して質問です。
この試薬を用いて骨からのDNA抽出を試みたいと考えています。
一つ分からないことがありまして、DNA抽出の作業でこの物質を含んだ廃液が出るのですが、これをどのように処理すればいいのか、どなたかご存知の方おりましたら教えてください？
よろしくお願いします。

907 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/03(日) 19:03:41

キムタオルにしみ込ませて、可燃ごみに捨てる。

908 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/03(日) 21:41:29

>>905
激しくどうも。調べたところ、HeLaなど、無限継代可能な細胞株は、倍数が変わることもあるという文献を見つけました。
HeLaはヒト由来であるのを想定して、3倍体になったと考えれば、説明が付きます。どうもです。

909 ：GM3：2005/07/04(月) 15:06:26

HL-60にdsRNAで遺伝子をノックダウンさせたいのですが、浮遊細胞って遺伝子導入が
難しいようです。リポフェクションはかなり難しいのでしょうか。
エレクトロポーレーションならばだいじょうぶでしょうか。おすすめの方法がありましたら
お願いします。

910 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/04(月) 19:05:11

>>909

俺もいろいろ試したけど，ウイルスベクター以外では
せいぜい数パーセントしか入らんね．

今ならキットも売ってるからレトロかレンチ，
トランジエントでいいならアデノがお勧め．

ところで今からやるんならsiRNAのほうが
いいんじゃない？

911 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/04(月) 22:56:35

>>909
dsRNAで遺伝子ノックダウン････
リポフェクトアミンの最新版使えばかなり効率良いはずですよ

まぁ最近の傾向からいって、siRNA使わなきゃ論文だすとしたら厳しいんじゃないかと思うがな。
とりあえずレトロがsiRNAにしときなさいよ。

912 ：GM3：2005/07/05(火) 09:43:10

そうですね、siRNAにしときます。やっぱりウイルスですよね、、。
ウイルスの場合、どこのキットがおすすめですか？

913 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/05(火) 19:44:17

バクテリアからゲノムＤＮＡをとろうとしていますが、市販のキットでは
収率が悪すぎなのです。うまくいってる人いますか？

914 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/05(火) 22:08:49

>>913
取り出し→ライブラリ化→増殖→精製

でいいんジャマイカ？

915 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/05(火) 22:35:56

>912
φNXとpRSとレトロネクチンプレートで20%弱だったかな

レトロネクチンを使わないで入る方法があったら誰か教えて下さい

916 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/06(水) 00:26:11

>913
どこの何てキット？
茹でるんじゃだめなの？

917 ：910：2005/07/06(水) 05:22:39

>>912
俺はキット使ってないんで，よくはわからんが，
クロンテックとかinvitrogenで出てたと思う．
rentiだったら濃縮すれば6-7割は入ると思うよ．
HL60でも．
IRES-GFP付きがセレクションに便利．
一番いいのは実績のあるラボからベクター
もらうことだけどね．

918 ：910：2005/07/06(水) 05:23:48

renti>lentiね．

919 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/06(水) 10:28:34

教えてください。
コンタミ防止に使用するブリーチは、どこのものをどのくらい希釈して使用していますか？

920 ：913：2005/07/06(水) 22:29:10

ども。キアゲンのキットですがあまりうまくいきません。

921 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/07(木) 01:04:53

質問です。バキュロでHis融合蛋白質を精製して、Ni-NTAに吸着させ、
プロメガのキットでin vitro translationした蛋白質を
pull downしようとしています。その際、Bufferとして
50mM HEPES 150mM NaCl 0.1%NP40 1mM DTTを用いたところ、
レジンに赤い沈殿物が付着しており、Washしても除けませんでした。
DTTによりNiイオンが還元されているのではないかとと思い、
DTTを除いて見ましたがやはり赤い沈殿が出てきました。
しかし、さきほどのBufferに5mM EDTAを入れるとこの赤い沈殿は
消えました。ちなみにpulldownに用いたHis融合蛋白質は
50mM Na phasphate (pH8.0) 300mM NaCl 10% Glycerol 250mM Imidazole
という組成のBufferに入っています。

この赤い沈殿物は何でしょうか？この実験ではポジコンも結合せず
うまくいっていません。

922 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/07(木) 05:59:10

赤いのは還元されたニッケルだ

そういうプルダウンするなら抗Hisタグ抗体でやれ

923 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/07(木) 08:36:11

ヒント１：ヘモグロビン

ヒント２：NTAはNiよりFeに親和性高し

ヒント３：QIAGENのFAQ。

924 ：GM3：2005/07/07(木) 10:00:58

>915,917ありがとうございます。検討します。

925 ：921：2005/07/07(木) 15:05:26

>922
不勉強なためすみません。
抗Hisタグ抗体でやるというのは、His融合蛋白質をelute
させて、抗His抗体で免疫沈降するということでしょうか？

>923
Feの影響は気づきませんでした。ありがとうございます。

926 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/07(木) 16:57:35

確かにHisタグ-NiNTAでプルダウンするのってどうかなぁ・・・
塩濃度下げるとノンスペが増えていくし，Ni存在下でおかしくなるタンパク質もあったり
DTT使えなかったり不便があるような。タグならGSTなんかのほうがいいし，
量とるわけでないんだったら免沈のほうがよさそう。

927 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/07(木) 23:49:40

>131

始めからふーんっと思いながら読んでいたのですが
131番で
「遊びに行ったラボで
たまたま学生がPCRで悩んでたので
トラブルシューティングしてやった
ネガコンから増幅するって
手の動きを聞くと
PCRチューブに先にテンプレートを入れておいて
上からMixを連続分注器で入れていた
だめじゃん」
とあったのですがRT-PCRなどでテンプレートから先に入れてあとから
Mixを入れるという方法はなぜだめなのですか？
理由がわからないんでよろしくお願いします。

928 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/07(木) 23:53:44

>>927

分注の時、チップの先端がチューブに接触したらコンタミするぢゃねーか。

929 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/08(金) 00:27:44

>928
ありがとうございます。自分はチューブの上から落とすようにMixを入れていたので気づきませんでした。

930 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/08(金) 02:58:24

学生が連続分注機なんて。

931 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/08(金) 09:32:36

>>928 チューブの上から落として正確な液量になるか？
目的によっては50ulが40ulでも60ulでも構わないって実験もあるだろうが。

932 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/08(金) 13:29:13

>>913
ﾘｿﾞﾁｰﾑ処理→SDS→ﾌﾟﾛK→CTAB→ﾌｪﾉｸﾛ抽出→ｲｿﾌﾟﾛ沈でかなり綺麗なのが取れる。

933 ：ダメM1：2005/07/08(金) 21:44:14

ライゲーションが上手くいかなくて困ってます。
目的遺伝子（１５００bp）をSmaⅠサイト、BamHⅠサイトを付けたプライマーでPCRで増やし、pGEM-T-easyに乗っけて、
シークエンスを確認しました。
これをSmaⅠで切断したあと、エタ沈してバッファー交換してBamHⅠ処理し泳動してゲルから目的の長さの
DNAを切り出し，精製（GFX）しました。
これを別のpYES2のMCSを変更したベクターにクローニングしたいのですが，何故かうまくいかんのです。
ベクターの方の制限酵素処理もインサートの方と同様にやっています。AP処理はやっていません。
コンピは問題ないはずです。ライゲーションはT4DNA リガーゼ（pGEMについてたやつ）を使って，室温
（エアコン設定が２６℃）で２時間くらい。

今までブラントエンドって扱ったことがなくて、よく分からないんですが、そんなにライゲーション効率が悪
いもんなんでしょうか？なんかコツとかありますか？火曜日までにプラスミドが出来上がらないとマズい状態
で、非常に焦ってます。

低レベルな質問ごめんなさい。

934 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/08(金) 23:44:42

だめM1よ。

何がだめなのか、かけよ。
コロニー出ないのか？

935 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/08(金) 23:53:44

>>934
こんなやつに関わっていては駄目。
こういうのは放っとくに限るよ。

936 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 00:03:04

だめM1よ。

インサートの長さくらい書けよ。
インサートの長さによってベクターとの比率が変わってくるんだから、色々試してみ。

あと、室温、しかもエアコンの設定って････おまえ・・・もうちょっときっちり指導してもらえ。
さらにクローニングしているらしいが、制限酵素処理がうまくいかないのか、なにがうまくいかないのか
全く分からん。
つぅか、君の腕の問題がかなりあると思うんだがな。ｶﾞﾝｶﾞﾚ

937 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 00:04:41

>933
26℃でligation、ってのがメチャメチャ妖しいかほりがするでつ。
15~16℃で保温する設備はないのでしょうか？

コツなどに関しては何とも言えませんが、「試薬・酵素の取扱説明
書・添付文書を良く読む」事はキホンでしょう。

私自身はタカラのLigation Kit V2.1を常用しております。
特に支障を感じた経験はありません。(15℃ o/n でやってます。突
出-突出 / 突出-平滑 / 平滑-平滑(ベクター側はAP処理)のいずれの
ケースでも問題なく出来てます)

あと、コンピテントセルのコンピテンシーは「本当に」大丈夫ですか？
次の実験の際にはuncutのベクターでtransformする対照実験も併行した
方が良いのではないでしょうか？

938 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 00:08:41

あーもう、駄目なやつに駄目なやつが絡むともう本当駄目だね。
>>936
インサートのサイズは1500bpでしゅ。
あなた、私のレスよくよんでくだちゃいね。

939 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 00:22:19

>928
貴君はエアロゾル発生器でつか？
（二つ以上向こうの実験台で実験してね～）

940 ：937：2005/07/09(土) 00:29:43

>>933
ベクター側の制限酵素消化のあと、切り出ししてる？
濃度確認してる？

941 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 02:03:26

>>937
室温は問題ないんじゃない？
Rapid Ligation Buffer使ってるっぽいから。

>>933
漏れ的にはMCSを変更したpYES2ベクターってのが何か怪しい気がする…。
制限酵素処理にBSAとかTriton-Xをmixの1/10量入れると良いらしい。
制限酵素処理後のベクターはSAP処理かCIP処理した方が良いんじゃないかな？

942 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 02:22:06

駄目M1へ。

まず、いろいろコントロールとって見。
改変ｐYES2のセルフライゲから何から。コンピの質も。
インサートとかライゲ前に流してみて、はっきりバンド見えてるか？
ブラントは効率落ちるから気にするなよ。
何が駄目で何がいけてるのかを調べて報告してくれないと駄目。

943 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 02:30:47

そういやブラントのライゲん時に使うと良い、とかいう酵素があったな・・・・
だがしかし、忘れた。
カタログ探せばあるよ、ということで探してみるヨロシ

944 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 02:47:46

コロニー大杉なのかちっとも出ないのかだけでも分かればね

945 ：937：2005/07/09(土) 02:58:05

>>941
室温でもOKとはありますが、>933氏の「室温」が再現性なさそうな表現
なので……。
NEBのT4 ligaseの説明みると、Unit Definitionは16℃でやってるよう
ですし(Hind III だから、突出末端ですが)少なくとも「明らかに使える」
温度だと言って支障なさそうでしたので。

Rapid Ligation Buffer は使用経験ゼロなので、言及・批判致しません。

あと、BSAの件ですが「1/10量」ってのはタカラの付属バッファの場合です
ね。NEBはよりによって100X 濃度のBSAが付属してきます…… --;;
っていうか、制限酵素処理の条件（温度・時間・バッファ・単位数・DNA量・
反応容量）が明記されてませんでしたね。>>933

制限酵素処理後のベクターのAP処理に関しては、SmaIが突出末端なので、
あまり気にしなくては良いのではないでしょうか。むしろ、切れっ端の
短い断片をきちんと除去する方が……。

あと、BamHI処理に関しては☆☆活性が出やすい条件で処理してたりしない
のかなぁ？とか……

>>942
御意

>>943
メーカーはどちらでしょうか？
（漏れ、Takara Ligation Kit で困った時の候補として覚えておきたいので）
でも、モノに頼る前にウデを一定以上の質に鍛えるのがスジですぜ>933

946 ：ダメM1：2005/07/09(土) 07:56:33

バカな質問に付き合っていただき、ありがとうございます。
コロニーはⅠプレート２０以上はでてますが、すべてハズレです。

制限酵素の処理して切り出したあと、泳動して確認しているので、ここまでは問題ないはずです。
コンピはDNA１μgあたり１０の7乗くらいです。

今日はライゲーションを16℃でo/nでやってみようとおもってます。

947 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 09:46:30

SmaIのサイトはXmaIで切れ

948 ：937：2005/07/09(土) 09:49:48

>>946
20 colony/plate って、どのくらい蒔いて20なのか……
実験の条件をdiscussするに際しての最低限のパラメータは書かないと
マジレスつかないですよ。
ネガコン(insertless)のコロニー数と対比できればまだしも、、、、

＃ 100ulのコンピテントセルにベクター5ng相当のライゲーション産物
＃　を加え、42℃ 30秒のヒートショック後に即氷冷。その後に○○培地
＃　を900ul加えて37℃で○○分incubateした。
＃　この産物の○○ulを抗生剤○○をxx mg/mlで添加したxxプレートに
＃　蒔いて…
＃ってくらいの情報は必要でしょう。

ligationするなら
　１）切断ベクターとインサートのモル比を振る（>>　氏も記しているが）
　２）インサート「ゼロ」のコントロールもおく

ベクター側の制限酵素処理が「確実」な保証はあるのでしょうか？

取り敢えず、「問題ない『はず』」という思い込みの部分に失敗が潜んで
いるとなかなか問題解決できませんよ。

というか、、、指導者はどう教えたらこういう実験者が育つんだ？！

949 ：937：2005/07/09(土) 09:58:14

>>945
自己ツッコミですが…
誤)制限酵素処理後のベクターのAP処理に関しては、SmaIが突出末端なので、

正)制限酵素処理後のベクターのAP処理に関しては、BamHIが突出末端なので、

950 ：937：2005/07/09(土) 09:59:20

>>947
もしかしたら、「改変pYES2」の方にはSmaIサイトが無く、別のblunt end
のサイトしかないの鴨。
>933氏のカキコの仕方からするとそのくらいのことはありそうな悪寒。

951 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 10:03:02

ていうか、この程度のサブクローニングって
何やっても上手くいくでしょ？

それが出来ないのはピペットマンがちゃんと使えてないとか
使ってるH2OにSDSがコンタミしてるとかじゃないの？

952 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 12:38:24

んー
でも両端が同じでないライゲーションの条件は普通よりは厳しい
コンパチなエンド同士が衝突する確率が低いから

とりあえずDNAの濃度を上げるか反応系の液量をうんと小さくしてみ

953 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 13:48:05

インサートレスの空ベクターばっか拾ってるんなら、
ベクターのBamHIとSmaI(?)の間は十分とっている？とかかなぁ。

954 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 15:56:32

プライマーが19merの時のランダム配置の確率の計算の方法を教えてください

955 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 15:57:40

プライマーが19merの時のランダム配置の確率の計算の方法を教えてください

956 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 18:10:35

要はあれだ、気合なんだよ、気合ｗ

>>954-955
実験じゃねぇじゃんｗ
数学は手前味噌でｶﾞﾝｶﾞﾚ
計算方法？　そりゃぁ、てめぇですんだよ。

957 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/09(土) 18:11:22

>>960
次スレ頼んだ

958 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/10(日) 22:22:47

>>960
|ー゜)ノシ　次スレ頼む　

959 ：937：2005/07/11(月) 01:50:02

＞＞９６０
次スレよろしく。

＃ダメM1よ、プラスミドどーなった？
＃成功記念に次スレよろ。

960 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/11(月) 13:22:14

いやん

961 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/11(月) 16:05:22

>>960
責任持って建てる事。逃げは許さん。

962 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/11(月) 16:11:26

　 ∧＿∧
　（　;´∀｀）
　人　Y　/
　(　ヽつし
　（＿）＿）

かわりに勃っちゃった

963 ：?ダメM１：2005/07/11(月) 22:18:20

プラスミド間に合いました。ライゲーションを１５℃でオーバーナイトに変更したら、やたらコロニーが増えました。
なんか嫌な予感（自己閉環の予感）がしましたが、もっさりと当たりコロニーでした。

今培養してます。明日朝ミニプレやる感じです。
バカな質問に答えて下さった皆様に感謝です。

最近になって分子生物っぽいことに手を出し始めたばかりで、質問に不備がたくさんあってご迷惑おかけしました。
物理系の研究室なのです。

964 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/11(月) 22:32:33

それはつらいわな。

965 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/11(月) 22:46:06

>>960
次スレまだ～

966 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/11(月) 23:04:36

>948
キミもうまくいかないと指導者のせいにするヒトみたいね。
キミ朝来るの遅いでしょ？

967 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/11(月) 23:54:07

>>966
キミほど遅くはないョ。（稿

968 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/12(火) 00:15:39

>>960が無能のクズで仕方ないので、>>970さん、おねがい

969 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/12(火) 00:25:24

>>970
君に運命は託された・・・・(｀・ω・´)ｶﾞﾝｶﾞﾚ

970 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/12(火) 00:53:53

たてますた

▼今実験でうまくいかないこと▼パート5▼
http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1121097197/

971 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/12(火) 10:45:07

>970
乙！

972 ：こばやし：2005/07/12(火) 16:00:39

実験でお聞きしたいことがあります。
ベクターを二種類の制限酵素で切断したもの（７k）と、
合成を依頼した一本鎖DNAをklenowで二本鎖にし、
同じ組み合わせで切断したインサート（80 bp）
のライゲーションがうまくいきません。

セルフか未切断ばかりでインサートが組み込まれません。
インサート／ベクターは３、５、１０で行っています。
以前同じ方法で調製したインサート（130bp）ではうまくいったので
ベクターは問題ないと思っています。
インサートの調製する際の注意点やこつなどがあったら教えて下さい。

973 ：ねぎぼう酢：2005/07/12(火) 16:47:06

インサートが切れてないんやないの？
ゲル電で確認したん？

974 ：こばやし：2005/07/12(火) 16:49:11

インサートはPAGEで切れていることを確認しております。
原因がわからなくて困ってて、、、
その他に思い当たる原因てありますか？？

975 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/12(火) 16:52:49

50merを二種類注文してアニールさせてからKlenow処理したんかな？

短いインサートはアクリルアミドゲルで調製したら？
短いDNA断片は普通の塩強度ではエタ沈できないケースがあるから、
キャリアーを入れるとか。

976 ：こばやし：2005/07/12(火) 17:01:59

26merと98merでKlenowでのばしました。制限処理後、
インサートは切断できているものだけをPAGEで精製しました。
キャリアはグリコーゲンを使いましたが、だめでした。

ちょっとどこが悪いのか、よくわからないんですが・・・。

977 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/12(火) 17:33:39

>>972
二種類の制限酵素で切断したのに
セルフが出るというとこがすでにおかしい。
片方の酵素で切れていないのでは?

978 ：こばやし：2005/07/12(火) 17:43:29

>>977
いちおう、同じベクターで他のインサートを試したら、
入ったので、インサートが悪いんじゃないかとは
思っているんですが、インサート調製のどこが悪かったのか
よくわからないんです。
セルフというよりも、未切断のものが混じっているんじゃないかと
考えてますが。

979 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/12(火) 18:09:31

技術的な問題がないのだとしたら、
インサートにリピート構造がある。
ベクターにインサートと(ほぼ)同じ配列がある。
80bpが翻訳されるとtoxicなタンパクができる。
などが考えられます。

980 ：こばやし：2005/07/12(火) 18:26:23

指摘された点を考慮してちょっと配列の見直しを行ってみます。
すみません、ありがとうございました。
また何か引っかかる所があったら質問させていただきます。
ありがとうございました。

981 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/13(水) 17:06:20

ぼくもライゲショソがうまくいかじ・・・

982 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/13(水) 21:24:45

とりあえずさ、このスレでライゲーションの話はなしにしようぜ。

ライゲーションって実験か？w

983 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/13(水) 23:01:44

実験だけど、ライゲーションのみの話は相応しくないね。

984 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/14(木) 03:34:23

プラスミド（メチル化+/-）使ってバイスルフェートPCRの練習やってるんですが
ターゲットをPCRで増やしてTAベクターにクローニングしてみるといつもバイスルフェート
反応が不完全です（非メチル化CがTに変わっていないところが多い）。
プラスミドをバイスルフェート反応の前に制限酵素で切るとか何か工夫がいるんでしょうか？
反応はPCRマシンつかって９５度と５０度のサイクルでやってるんですが５０度でO/Nの方が良いのでしょうか？

985 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/15(金) 00:00:48

>>984
Probably, your treatment of bisulfite method was insufficient to change non-MeC to U.
The Primer extension stages may be no problem.
How long did you expose a plasmid in the reaction solution?
After first reaction, the plasmid was sufficientlly treated with NaOH solution?
This stage is very important to change non-MeC to U.
Probably, the first and second stages of reaction time were insufficient, I think.

986 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/15(金) 09:29:40

微妙にマズい英語だな･･･

987 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/15(金) 19:30:36

985 を要約すると "984，あんた気ぃ短いやっちゃなぁ" となる．

988 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/15(金) 22:53:41

バイサルファイトと漏れは言うんだが、みんなはバイスルフェートと言うのか？
一瞬何か分からなかったんだが、どうよ？

989 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 08:41:36

おたづねします
ビンボーラボなので
ミニプレのキットは使っていません

ふつうにsol1->2->3 phe-chl EtOHなんですが

１．sol2入れたあとすぐにsol3入れても大丈夫ですか？（待ち時間もったいない）
２．sol3入れたあとすぐにphe-chlしても大丈夫ですか？（待ち時間もったいない）
３．phe-chlの遠心は最高回転５秒でも大丈夫ですか？（待ち時間もったいない）

990 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 09:29:21

１．せめて10秒まて。
２．せめて20秒まて。
３．論外。きっちり遠心せよ。フェノクロははまると泣かされるぜ（ｗ

991 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 09:32:00

１．透明になればオケ
２．endAのホストで、サブクローニング程度の目的ならphe-chlは不要
３．同上

992 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 11:44:13

１．エッペンの蓋を閉めて、転倒混和
２．転倒混和してから氷上で一休み
３．だめ。窓から飛びたいなら止めないけど。

993 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 12:43:07

１、２．転倒混和する。待ち時間はイラネ。３．だめ。

994 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 12:44:26

うちはmini prep.でRNaseAを決して使用しません。
RNAはLi-acetateとPEGで問題なく除けます。

995 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 13:09:47

無理です。RNaseを使わない理由は？

996 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 15:46:34

>>994のやり方で混入するRNAはほぼtRNAのみで、プラスミドのシグナルの数十分の１程度です。

組織からRNA抽出して、ノーザンやライブラリー作製する部屋でRNaseを含む
エアロゾルやゴミが出るのは嫌なんだよ。
贅沢に別々の部屋とかは無しな。

997 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 18:41:28

エアロゾル !?　そんなの気にしてるんでつか？？

998 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 21:14:38

RNaseなんてubiquitousなんだから、
極端な高濃度の溶液を使わないかぎりは
そんなに神経質になったって意味無いのでは？
唾液だって汗だってRNase入りだ。

999 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 21:22:05

>>998
極端な高濃度ってどのくらい？具体的には。

1000 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/16(土) 21:23:06

1000ｷﾀｷﾀｷﾀｷﾀ━━━(ﾟ∀ﾟ≡(ﾟ∀ﾟ≡ﾟ∀ﾟ)≡ﾟ∀ﾟ)━━━━!!!!!!!!!!

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