genomic PCRだけど・・・
1 ：名無しさん：
tail check用にgenomic PCRしてるんだけど、
PCRプライマーが合っているのはプラスミドで
確認済みなのに、genomic DNAではでてこないんだよね・・・
DNA量を変えてもPCR条件変えてもホットスタートやっても
だめ。誰かそんな経験あるひといますか？
PCRプライマーが合っているのはプラスミドで
確認済みなのに、genomic DNAではでてこないんだよね・・・
DNA量を変えてもPCR条件変えてもホットスタートやっても
だめ。誰かそんな経験あるひといますか？
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2 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/28 23:21
スレ立てるほどのことじゃないだろー。
かなり厨房なとこにひっかかってるよ、それは。
かなり厨房なとこにひっかかってるよ、それは。
3 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/28 23:22
単発質問でスレ立てんな。
夏厨並みの脳味噌しかないくせにPCR？
笑わせんなって。
夏厨並みの脳味噌しかないくせにPCR？
笑わせんなって。
4 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/28 23:23
DNA精製度には自信有る？
有るのなら、それでもおまじないで、
Phenol抽出もういちどだけやって、
それでも出ないなら、５０ベース以上離れた所に、
デザインしなおす方がいい。
有るのなら、それでもおまじないで、
Phenol抽出もういちどだけやって、
それでも出ないなら、５０ベース以上離れた所に、
デザインしなおす方がいい。
5 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/28 23:55
1はＰｈＤとるためだけに学歴ロンダしているアホ私立出身の29歳。
6 ：1：02/07/29 01:48
＞４
まともなコメントありがとう。
実は前の研究所で同じプライマー、同じサンプルで
バンドでてたんだよね・・。移動したら
どうしてでないのかわからんが・・・。
他のKOのPCRとかは全部うまくいってるのに、このgenomic
PCRだけ急に動かなくなって本当に困ってるんだよね。
因みに他のPCRペアでは動いてるサンプル。
こういう経験あるひとって他にもいるかと思ったんだけど・・
とりあえずフェノ抽ってトライする価値あるのか。
＞５
う〜ん、自分でもあほらしくてやってられないが
君の推測は外れてるね。
まともなコメントありがとう。
実は前の研究所で同じプライマー、同じサンプルで
バンドでてたんだよね・・。移動したら
どうしてでないのかわからんが・・・。
他のKOのPCRとかは全部うまくいってるのに、このgenomic
PCRだけ急に動かなくなって本当に困ってるんだよね。
因みに他のPCRペアでは動いてるサンプル。
こういう経験あるひとって他にもいるかと思ったんだけど・・
とりあえずフェノ抽ってトライする価値あるのか。
＞５
う〜ん、自分でもあほらしくてやってられないが
君の推測は外れてるね。
7 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/29 18:24
PCRの機械がちがっていると、うまく行かない時があったので、自分も困った経験がある。
8 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/29 18:40
水が悪いんだ
9 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/29 20:16
簡単な実験ほど上手くいかないとはまりこむんだよな、
わしも経験あり。
原因はやはりゲノムDNAの精度だった。
よりpureに取れる方法を採用したら解決しますた。
わしも経験あり。
原因はやはりゲノムDNAの精度だった。
よりpureに取れる方法を採用したら解決しますた。
10 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/29 20:58
まず、プラスミドテンプレートでは0.1fmolくらいでもばんばんに出る？
ラボのやつも一度条件検討したはずなのにうまく行かなくなっていたけど、
プライマーを少し長いやつに変更して新しい酵素を買ってもらってやったら
うまくいってたよ。
というか>1は予め>6見たいな情報を書いてくれなきゃ。
ラボのやつも一度条件検討したはずなのにうまく行かなくなっていたけど、
プライマーを少し長いやつに変更して新しい酵素を買ってもらってやったら
うまくいってたよ。
というか>1は予め>6見たいな情報を書いてくれなきゃ。
11 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/29 21:36
有効なアドバイスが出たんで終了と言うことでひとつよろしく。
>>1 次はここを使ってね。
▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/l50
>>1 次はここを使ってね。
▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/l50
12 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/29 23:13
新しいプライマーや酵素が買ってもらえるラボでうらやましいです
>10
>10
13 ：1：02/07/30 01:48
なるほど、みんなありがとう。試してみるね。
結果はアップします。
結果はアップします。
14 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 01:59
調子に乗るなよ。
くそスレ立てといて。
さっさと削除しろよ
くそスレ立てといて。
さっさと削除しろよ
15 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/30 02:02
14は口は悪いが同意
16 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 15:03
>>1
もう終わったスレっぽいですが、自分も今同じ状況で悩んでます。
しかも、他の人がやるとなぜか出るＰＣＲなのに、
自分がやるとできません。
でも、同じサンプルでも、違うプライマーだと出ます。不思議です。
まあ、このスレ読んで、ＰＣＲマシーンが違うと出ないことがあるということなので、
ＰＣＲマシーンを変えてやってみたいと思います。
もう終わったスレっぽいですが、自分も今同じ状況で悩んでます。
しかも、他の人がやるとなぜか出るＰＣＲなのに、
自分がやるとできません。
でも、同じサンプルでも、違うプライマーだと出ます。不思議です。
まあ、このスレ読んで、ＰＣＲマシーンが違うと出ないことがあるということなので、
ＰＣＲマシーンを変えてやってみたいと思います。
17 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 17:16
PCRに固執しないで、さっさとサザンすれば？
一応そのつもりです。
でも、ＰＣＲである程度絞りたい・・・
でも、ＰＣＲである程度絞りたい・・・
19 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 22:56
ていうか、ＰＣＲをやたら重視するのって、アホ私立出身の医者がｐｈＤとるのに
するクソ論文のための実験だろ？
適当に検体選んで、30例にＲＴ−ＰＣＲしたらこんな結果が出ました、みたいな。
センスがあればＰＣＲなんて簡単なんだよ。世の中の人はもっと高度なことで悩んでいるわけ。
するクソ論文のための実験だろ？
適当に検体選んで、30例にＲＴ−ＰＣＲしたらこんな結果が出ました、みたいな。
センスがあればＰＣＲなんて簡単なんだよ。世の中の人はもっと高度なことで悩んでいるわけ。
20 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 23:20
21 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 23:36
／￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
| こ、このスレ さ、さむいモナ〜
Λ＿Λ ∠＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
（；´Д｀）
（ ( つ ⊂ ））
〉 〉く く
（ （＿_）（＿.）） ...ｶﾞｸｶﾞｸ
| こ、このスレ さ、さむいモナ〜
Λ＿Λ ∠＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
（；´Д｀）
（ ( つ ⊂ ））
〉 〉く く
（ （＿_）（＿.）） ...ｶﾞｸｶﾞｸ
22 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 00:14
ＰＣＲも外注があるから、
どうしてもできないアフォは
さっさと外注しろ。
そして二度と発言するな！この役立たずめがぁ！！！
どうしてもできないアフォは
さっさと外注しろ。
そして二度と発言するな！この役立たずめがぁ！！！
23 ：4：02/09/21 00:55
>原因はやはりゲノムDNAの精度だった。
よりpureに取れる方法を採用したら解決しますた。
だろ。
よりpureに取れる方法を採用したら解決しますた。
だろ。
24 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 01:05
genomic PCRに関連して。
漏れは今、inverse PCRをやっているけどなかなか上手くいかない。
ちなみに、ぷらいまーは動くことは確認済みだし、得られるサイズは
サザンで確認済み。
やっぱりligationが上手くいってないのかなあ。
EcoRIとHindIIIで切ったDNAでやってるんだけど・・・
なんかいい方法はないかな？
漏れは今、inverse PCRをやっているけどなかなか上手くいかない。
ちなみに、ぷらいまーは動くことは確認済みだし、得られるサイズは
サザンで確認済み。
やっぱりligationが上手くいってないのかなあ。
EcoRIとHindIIIで切ったDNAでやってるんだけど・・・
なんかいい方法はないかな？
25 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 03:02
基本に帰れ。
ゲノムの精度か・・・
27 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 07:15
28 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/21 20:50
厨はバンド出なくても、自分の腕を棚に上げて
すぐプライマーだ試薬だと言うからな
すぐプライマーだ試薬だと言うからな
29 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/22 00:39
>>28
激しく同意
激しく同意
あぼーん
（＾＾）
（＾＾）
（＾＾）
34 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/26 23:05
single cellからのDNAをPCRするとき、細胞と培地どうやって処理してますか？
いい方法キボンヌ。
いい方法キボンヌ。
（＾＾）
（＾＾）
37 ：名無しゲノムのクローンさん：03/04/12 01:33
ゲノム抽出してテンプレートにしたら増えなかった。
でも、コロ二-ＰＣＲなら増えた。
結局、ゲノムの精製度を上げたら増えた。
ちょっと、欝
でも、コロ二-ＰＣＲなら増えた。
結局、ゲノムの精製度を上げたら増えた。
ちょっと、欝
（＾＾）
━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―
∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ ( ＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
＝〔~∪￣￣〕
＝ ◎――◎ 山崎渉
ﾋﾟｭ.ｰ ( ＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
＝〔~∪￣￣〕
＝ ◎――◎ 山崎渉
携帯ゲーム機"プレイステーションポータブル(PSP)
このPSPは、新規格UMD(ユニバーサルメディアディスク)というディスクを利用しており、そのサイズは直径6cmととても小さい(CDの半分程度)。 容量は1.8GBとなっている。
画面は4.5インチのTFT液晶で、480px x 272px(16:9)。MPEG4の再生やポリゴンも表示可能。外部端子として、USB2.0とメモリースティックコネクタが用意されているという。
この際、スク・エニもGBAからPSPに乗り換えたらどうでしょう。スク・エニの場合、PSPの方が実力を出しやすいような気がするんですが。
任天堂が携帯ゲーム機で圧倒的なシェアをもってるなら、スク・エニがそれを崩してみるのもおもしろいですし。かつて、PS人気の引き金となったFF７のように。
このPSPは、新規格UMD(ユニバーサルメディアディスク)というディスクを利用しており、そのサイズは直径6cmととても小さい(CDの半分程度)。 容量は1.8GBとなっている。
画面は4.5インチのTFT液晶で、480px x 272px(16:9)。MPEG4の再生やポリゴンも表示可能。外部端子として、USB2.0とメモリースティックコネクタが用意されているという。
この際、スク・エニもGBAからPSPに乗り換えたらどうでしょう。スク・エニの場合、PSPの方が実力を出しやすいような気がするんですが。
任天堂が携帯ゲーム機で圧倒的なシェアをもってるなら、スク・エニがそれを崩してみるのもおもしろいですし。かつて、PS人気の引き金となったFF７のように。
42 ：なまえをいれてください：03/07/24 18:14
ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。
43 ： ◆qfX.V7okN6 ：03/10/09 11:27
age
44 ：名無しゲノムのクローンさん：03/10/09 19:15
ageんな
実験がうまくいかないのはちょっとした愛情がないからに決まってる
俺もうまくいかないときは愛情が足りなかったと心当たりがある必ず
実験がうまくいかないのはちょっとした愛情がないからに決まってる
俺もうまくいかないときは愛情が足りなかったと心当たりがある必ず
45 ：ohta109025.catv.ppp.infoweb.ne.jp：04/02/05 07:19
tes
46 ：ohta109025.catv.ppp.infoweb.ne.jp：04/02/05 07:21
tes
47 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/06 22:08
EX Taqを使い、PCRを行った時の変異頻度を教えてください。
48 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/06 22:56
そんなもんtemplete量とcycle数によるがな…
49 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/12 23:19
TAIL PCRのコツって何でつか？
どうしても不得意産物ばっかりで困ってるんだけど。
とりあえず羊℃社のプロ見てトラブルシューティングは全て行ってみた。
なんだろー。やっぱりもとのDNA？
どうしても不得意産物ばっかりで困ってるんだけど。
とりあえず羊℃社のプロ見てトラブルシューティングは全て行ってみた。
なんだろー。やっぱりもとのDNA？
50 ：現在ノックインマウス作成中：04/03/12 23:48
丁寧タイピング
1)しっぽを lysis buffer(TrisHcl 10mM,Nacl 150mM,EDTA 10mM)＋ProK処理 65℃ overnightで
なるべく振とうする
2)遠心して不純物を落としたあと、上澄みをフェノクロ(以下室温で操作する）
3)0.7等量の2-propanolを加えて、イソ沈そのあと70%EtOHでリンス
4)5minほどドライアップして、TEなどに溶かす。65℃1hrとかO/Nとかvortexとかしてよく溶かす。
5)定量してtemplateに0.1ugほど使う。
＊溶かしが甘いとバンドが出にくい。操作は室温の方がいいみたい。
定量はめんどいんで、１サンプルだけやればいいでしょう。
タイピングPCRではtemplate量はそんなにそろえなくても大丈夫。
＊これでもバンドが出にくいなら、プライマーを変えた方が良い。
1)しっぽを lysis buffer(TrisHcl 10mM,Nacl 150mM,EDTA 10mM)＋ProK処理 65℃ overnightで
なるべく振とうする
2)遠心して不純物を落としたあと、上澄みをフェノクロ(以下室温で操作する）
3)0.7等量の2-propanolを加えて、イソ沈そのあと70%EtOHでリンス
4)5minほどドライアップして、TEなどに溶かす。65℃1hrとかO/Nとかvortexとかしてよく溶かす。
5)定量してtemplateに0.1ugほど使う。
＊溶かしが甘いとバンドが出にくい。操作は室温の方がいいみたい。
定量はめんどいんで、１サンプルだけやればいいでしょう。
タイピングPCRではtemplate量はそんなにそろえなくても大丈夫。
＊これでもバンドが出にくいなら、プライマーを変えた方が良い。
51 ：その２：04/03/12 23:52
速攻ジェノタイピング
1)しっぽに0.1% SDS,0.1N NaOH を100ulとH2Oを50ulぐらい入れる。
2)98℃、15min
3)TEを300ulぐらいいいれる。
4)1ulをtemplateに使ってPCR
*遺伝子やプライマーによってかかりにくい。
*速さ重視ならTakara Z-Taq、
丁寧タイピングでも速攻タイピングでも
お勧めはeppendorf HotMaster Taq や
Takara-Extaq HS(Hot Start)など。
特にHot Start系の酵素の方がgenomic PCRはかかりやすい。
1)しっぽに0.1% SDS,0.1N NaOH を100ulとH2Oを50ulぐらい入れる。
2)98℃、15min
3)TEを300ulぐらいいいれる。
4)1ulをtemplateに使ってPCR
*遺伝子やプライマーによってかかりにくい。
*速さ重視ならTakara Z-Taq、
丁寧タイピングでも速攻タイピングでも
お勧めはeppendorf HotMaster Taq や
Takara-Extaq HS(Hot Start)など。
特にHot Start系の酵素の方がgenomic PCRはかかりやすい。
52 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/12 23:59
TAIL-PCR
thermal asymmetric interlaced PCRの略称です。
どなたかコツ教えてくらはい…。
thermal asymmetric interlaced PCRの略称です。
どなたかコツ教えてくらはい…。
53 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/13 01:23
俺も知りたいなあ。
InverseうまくいかんかったらTAIL-PCRにしようかと
InverseうまくいかんかったらTAIL-PCRにしようかと
54 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/13 01:24
フナコシに新製品ででてたぞ
55 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/17 21:33
DNA Walking SpeedUp Kit
だっけ？あれってプライマーの正確な塩基配列はわかんないのかな〜
論文載せるときどうすればよいやら。
だっけ？あれってプライマーの正確な塩基配列はわかんないのかな〜
論文載せるときどうすればよいやら。
56 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/17 22:57
おれはTAIL-PCR失敗したことない．
クロモソーム歩行やってるときに１００％成功したが．
ちゃんと原著論文よんでるか？
あと対象生物によってはゲノムのＧＣ含量によって
AP配列を変えた方がいいらしいが
クロモソーム歩行やってるときに１００％成功したが．
ちゃんと原著論文よんでるか？
あと対象生物によってはゲノムのＧＣ含量によって
AP配列を変えた方がいいらしいが
57 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/17 23:13
失敗したことないんだ…すげー
原著論文読んだこと無いです…じゃあ読みなさいという話になるんでしょうが
今は読んでる時間がなくって…言い訳すいません。
なんかプライマーダイマー形成しないかとか確認しました？
これって基本事項なんですかね。
アニーリング温度変えてやってもダメ
原著論文読んだこと無いです…じゃあ読みなさいという話になるんでしょうが
今は読んでる時間がなくって…言い訳すいません。
なんかプライマーダイマー形成しないかとか確認しました？
これって基本事項なんですかね。
アニーリング温度変えてやってもダメ
58 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/17 23:18
2chにくるひまがあったら読みなさい
59 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/18 15:06
60 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/18 18:57
あ！試してみてください！
感想も希望。10回分で27000円だっけ？ちょとたかいかも。
ただいま TAIL PCR の原著読みました。
ナルホド，なんかポイント的なことが（プロトコールではわかりにくいこと）
書いてあるね。
TAIL の質問なんですが…
specific primer で primary, secondary, tertiary と段々 Tm 下げてるのは
意図的なんでしょうか？
教えてくんですいません。
感想も希望。10回分で27000円だっけ？ちょとたかいかも。
ただいま TAIL PCR の原著読みました。
ナルホド，なんかポイント的なことが（プロトコールではわかりにくいこと）
書いてあるね。
TAIL の質問なんですが…
specific primer で primary, secondary, tertiary と段々 Tm 下げてるのは
意図的なんでしょうか？
教えてくんですいません。
61 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/18 21:43
なんでkitなんかつかう必要があるのかね？
論文よんでプライマー発注してその通りやればいいだけじゃねえか？
バカかおまえら
論文よんでプライマー発注してその通りやればいいだけじゃねえか？
バカかおまえら
62 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/18 23:10
そりゃあ年度末で経費を使い切るためだろ
63 ：名無しゲノムのクローンさん：04/03/18 23:46
はいバカです。
64 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/01 22:53
なんと，止まってるし…
だれか効果的な答え書いてやれよ。
ここはそういう板なんだろ？
TAIL-PCRは，最初のtemplateの濃度も大切。
薄目にこしたことはない。
と思う。
だれか効果的な答え書いてやれよ。
ここはそういう板なんだろ？
TAIL-PCRは，最初のtemplateの濃度も大切。
薄目にこしたことはない。
と思う。
65 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/02 02:34
自分の経験では、最初は、しっぽの入れすぎ、きちんと溶解していない、DNAがとけていない、というのが多い失敗では？と思います。
まじめな方ほど、たくさんしっぽを入れて、早く実験をしようとして、はまるのでは？
私は、しっぽは、ほんの3mmほどを、数日かけて、たまにボルテックスをして、溶かしてます。
うまく溶けると、しっぽの毛がエッペンの下にたまるのを目安にしてます。
まだ、溶液がもやもやして毛が溶液中に浮かんでいるとPCRには不向きではと思います。
また1/10TEに溶解後、一日はおいてから使います。genomeはとけにくいので。
plasmidで出るのは最低条件で、あまりgenomic PCRには参考になりません。
コピー数が違いすぎます。Taqの種類によっても変わります。
もう一度、プライマーを自分で３−４ペア設計して、やり直した方が早いのでは？
たいてい、一つくらいは動きますよ。
今、３系統のtail PCRをしてますが、うまくいってます。
今日はヘテロばかりでした．．．．．．．．
個人的な体験ですが、参考になりますでしょうか？
まじめな方ほど、たくさんしっぽを入れて、早く実験をしようとして、はまるのでは？
私は、しっぽは、ほんの3mmほどを、数日かけて、たまにボルテックスをして、溶かしてます。
うまく溶けると、しっぽの毛がエッペンの下にたまるのを目安にしてます。
まだ、溶液がもやもやして毛が溶液中に浮かんでいるとPCRには不向きではと思います。
また1/10TEに溶解後、一日はおいてから使います。genomeはとけにくいので。
plasmidで出るのは最低条件で、あまりgenomic PCRには参考になりません。
コピー数が違いすぎます。Taqの種類によっても変わります。
もう一度、プライマーを自分で３−４ペア設計して、やり直した方が早いのでは？
たいてい、一つくらいは動きますよ。
今、３系統のtail PCRをしてますが、うまくいってます。
今日はヘテロばかりでした．．．．．．．．
個人的な体験ですが、参考になりますでしょうか？
66 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/02 04:31
inverseは条件検討さえすれば特に失敗する実験では
ないような気がするのは俺だけですか？
系さえ立ち上げればTAILよか簡単だと思うんだけど・・・
ないような気がするのは俺だけですか？
系さえ立ち上げればTAILよか簡単だと思うんだけど・・・
67 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/02 14:31
>>66
確かにそれは思った。
inversePCRはきちんとligationできていればその後は
大抵うまくいく。
TAIL-PCRだとなんやかんやと調製もめんどいかな。
まぁ，実験する人それぞれによるけど。
ただ，ゲノムウォーキングしてるとプライマーが多くなるのが難点。
確かにそれは思った。
inversePCRはきちんとligationできていればその後は
大抵うまくいく。
TAIL-PCRだとなんやかんやと調製もめんどいかな。
まぁ，実験する人それぞれによるけど。
ただ，ゲノムウォーキングしてるとプライマーが多くなるのが難点。
68 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/05 03:06
69 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/12 16:04
inverse PCRで用いるプライマーは
degenerativityどのくらいでやっていますか？
それとも配列がはっきりしているものじゃないと
だめなんでしょうか？
degenerativityどのくらいでやっていますか？
それとも配列がはっきりしているものじゃないと
だめなんでしょうか？
70 ：名無しゲノムのクローンさん：04/04/13 21:47
TAILとtail 、全然関係ないけどスレタイにはあってるのでまあいいや。
genotypingは普通溶解したSUPをそのままtempにするだろ。
加熱はするけどね。
尻尾切った翌日、embryoなら当日結果出てないと困るやん。
genotypingは普通溶解したSUPをそのままtempにするだろ。
加熱はするけどね。
尻尾切った翌日、embryoなら当日結果出てないと困るやん。
71 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/29 02:10
この前、inverse PCRで
10ｋｂほどの断片をとってきて、
なんとか全部シークエンシングした。
うちのラボのボスが
PCRで取れてきた配列は信用できないから、
最終的にはゲノムライブラリーを作って、
PCRで取れてきた配列とハイブリさせてスクリーニングして
ゲノム構造を確定しなさいと突然言ってきた。
従った方がいいのでしょうか？
それとも無駄な実験?
10ｋｂほどの断片をとってきて、
なんとか全部シークエンシングした。
うちのラボのボスが
PCRで取れてきた配列は信用できないから、
最終的にはゲノムライブラリーを作って、
PCRで取れてきた配列とハイブリさせてスクリーニングして
ゲノム構造を確定しなさいと突然言ってきた。
従った方がいいのでしょうか？
それとも無駄な実験?
72 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/29 03:22
３個読めば許してくれるよ
73 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/29 05:12
>PCRで取れてきた配列
２００ー３００bpに１こ、mutationはいるそうです。
結構きついよ。
２００ー３００bpに１こ、mutationはいるそうです。
結構きついよ。
74 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/29 05:16
TAIL-PCRをマウスのしっぽのgenom PCRと勘違いしているのが、
おかしい。無理も無いけど、前後の文脈からわかれよ。
おかしい。無理も無いけど、前後の文脈からわかれよ。
75 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/29 05:33
馬鹿な奴って微笑ましいなあ
76 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/29 10:06
まさかKOベクターの構築をPCRでやってるﾔｼ、いないよな？
77 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/29 10:08
78 ：71：04/05/29 22:01
>>72
>３個読めば許してくれるよ
許してくれればいいのですけど。
表現型に差のある１０系統でライブラリーを作って、
ゲノム構造の系統間差をみなさいと命令されている。
それはちょっと大変なので
なんとかPCRで済ませたいのです。
というのも、うちの研究室には
ハイブリを誰もやってないので、
１から系を立ち上げないといけないもので。
>>73
>>PCRで取れてきた配列
>２００ー３００bpに１こ、mutationはいるそうです。
>結構きついよ。
LATaqやEXTaqなんかを使っても
きついですか？
>３個読めば許してくれるよ
許してくれればいいのですけど。
表現型に差のある１０系統でライブラリーを作って、
ゲノム構造の系統間差をみなさいと命令されている。
それはちょっと大変なので
なんとかPCRで済ませたいのです。
というのも、うちの研究室には
ハイブリを誰もやってないので、
１から系を立ち上げないといけないもので。
>>73
>>PCRで取れてきた配列
>２００ー３００bpに１こ、mutationはいるそうです。
>結構きついよ。
LATaqやEXTaqなんかを使っても
きついですか？
79 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/29 22:06
>>78
長くて正確性を期待するならロッシュの酵素もいいと
思う。
LaTaqとどっちがいいかわからないけど、その辺は自分で判断してください。
ロッシュのは実際使っていて良かったよ。滅多にmutationは入らなかった。
およそ10000塩基対でゼロ。
長くて正確性を期待するならロッシュの酵素もいいと
思う。
LaTaqとどっちがいいかわからないけど、その辺は自分で判断してください。
ロッシュのは実際使っていて良かったよ。滅多にmutationは入らなかった。
およそ10000塩基対でゼロ。
80 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/29 22:23
81 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/29 22:36
>>78
ライブラリーさえできてればcloningはPCR＆sib-selectionでできるよ。
ゲノムを十分カバーするクローン数を10等分して20 poolをbulkでculture
＆DNA取り。PCRでどのpoolに求めるcloneが入っているかcheckしたら、
さらにクローン数を10等分して20 poolを…以下single cloneまで繰り返す。
ライブラリーさえできてればcloningはPCR＆sib-selectionでできるよ。
ゲノムを十分カバーするクローン数を10等分して20 poolをbulkでculture
＆DNA取り。PCRでどのpoolに求めるcloneが入っているかcheckしたら、
さらにクローン数を10等分して20 poolを…以下single cloneまで繰り返す。
82 ：71：04/05/29 22:47
>>72-73 >>79-80さん
皆さん本当にありがとうございます。
とても参考になりました。
>>79
ロシュの酵素も調べてみます。
10ｋｂでmutationが０なら、とても心強い結果です。
>>80
direct sequencingすれば、それだけmutationの入る確率が減る
ということでしょうか？
皆さん本当にありがとうございます。
とても参考になりました。
>>79
ロシュの酵素も調べてみます。
10ｋｂでmutationが０なら、とても心強い結果です。
>>80
direct sequencingすれば、それだけmutationの入る確率が減る
ということでしょうか？
83 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/29 22:51
>>82 最悪のケースを想定してPCRの最初のcycleでmutationが入ったとし
ても、元のtempleteが1000分子（普通はこれより遥かに多いでしょ）だっ
たとすればそのmutationは、いくらPCRで増幅されたとしても最終産物の
中のたかだか1/1000。すなわちerrorでおこるmutationはdirect sequencing
をするかぎりは結果に反映されない。
ても、元のtempleteが1000分子（普通はこれより遥かに多いでしょ）だっ
たとすればそのmutationは、いくらPCRで増幅されたとしても最終産物の
中のたかだか1/1000。すなわちerrorでおこるmutationはdirect sequencing
をするかぎりは結果に反映されない。
84 ：71：04/05/29 23:40
>>81
すいません。
私の>>78での書き込みの説明不足ですね。
お恥ずかしい話ですが、
そのゲノムライブラリーも系を立ち上げ中でして、
いつになるやらという状態なのです。
系が立ち上がった折には参考にさせていただきます。
ありがとうございました。
>>83
なるほど。ありがとうございました。
でも私の場合は最初にinverse PCRでとってくるので
その時点で最低2回PCRをしているので、
エラーしている可能性がちょっと高いですね。
すいません。
私の>>78での書き込みの説明不足ですね。
お恥ずかしい話ですが、
そのゲノムライブラリーも系を立ち上げ中でして、
いつになるやらという状態なのです。
系が立ち上がった折には参考にさせていただきます。
ありがとうございました。
>>83
なるほど。ありがとうございました。
でも私の場合は最初にinverse PCRでとってくるので
その時点で最低2回PCRをしているので、
エラーしている可能性がちょっと高いですね。
85 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/30 00:41
86 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/30 00:41
(1/1000)x2のサイクル乗の間違いだ．
87 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/31 00:40
(1/1000)x(1/2)のサイクル乗のまちがいでしょ
88 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/31 13:00
エラーおこってても関係ないんだよ
つうか数理的に無視できる量になるはず、ということやろ。
つうか数理的に無視できる量になるはず、ということやろ。
89 ：71：04/05/31 22:07
みなさんありがとうございました。
理解できました。
direct sequenceの方向で教授を説得してみようと思います。
理解できました。
direct sequenceの方向で教授を説得してみようと思います。
90 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/31 23:18
ただしＰＣＲ産物が１０ｋと長いのでプライマーウォーキングになるね
そんなにたくさんプライマー作るお金出してくれるかな？
７００ｂｐ平均，両側１００bpづつ重複で２０分割，３８本
そんなにたくさんプライマー作るお金出してくれるかな？
７００ｂｐ平均，両側１００bpづつ重複で２０分割，３８本
91 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/31 23:23
既にsequence用のプライマーは揃っていると思われ
＞この前、inverse PCRで
＞10ｋｂほどの断片をとってきて、
＞なんとか全部シークエンシングした。
＞この前、inverse PCRで
＞10ｋｂほどの断片をとってきて、
＞なんとか全部シークエンシングした。
92 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/01 02:20
今時の糞がきはnested deletionも知らないのか
93 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/02 23:24
94 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/03 00:21
だーかーらー
10ｋもあるから
なかなか入んないから
ダイレクトでっつってんじゃんかよー
それともなにかい？
ＰＣＲ産物を直接デリーションしてブラントで入れると？
効率いいのか？
10ｋもあるから
なかなか入んないから
ダイレクトでっつってんじゃんかよー
それともなにかい？
ＰＣＲ産物を直接デリーションしてブラントで入れると？
効率いいのか？
95 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/03 00:45
nested deletion後にどうやってdirect sequenceするっつうんだよ。偉そうにするまえにちょっとは考えろや。
96 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/03 05:14
PCR産物の直接デリーションは理屈の上ではできるかもしれないが
普通のデリーションはセルフライゲーションだということを忘れてはいけない
このたびの例は10ｋのインサートで入りにくいというわけだから
500ベースずつ削っていくと
10ｋ 入りにくい
9.5ｋ 入りにくい
9ｋ 入りにくい
・・・
となって事実上無理だね
ところでデリーション後にダイレクトシーケンスって（ｗ
普通のデリーションはセルフライゲーションだということを忘れてはいけない
このたびの例は10ｋのインサートで入りにくいというわけだから
500ベースずつ削っていくと
10ｋ 入りにくい
9.5ｋ 入りにくい
9ｋ 入りにくい
・・・
となって事実上無理だね
ところでデリーション後にダイレクトシーケンスって（ｗ
97 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/03 07:28
＞＞71
蒸し返し遅レスだが
ボスが言ってる
>PCRで取れてきた配列は信用できないから、
ってのはインバースやらテールやら途中に技をかましたやつ
ということでないの？
たぶん大丈夫だろうとは思うけど
念のためゲノムからあらためて取ってきて調べた方がいいとは思うよ
ただし，わざわざライブラリー起こすんじゃなく
今度は普通のＰＣＲ（というよりロングPCR）で
というか
そんなことはもうやってるって？
蒸し返し遅レスだが
ボスが言ってる
>PCRで取れてきた配列は信用できないから、
ってのはインバースやらテールやら途中に技をかましたやつ
ということでないの？
たぶん大丈夫だろうとは思うけど
念のためゲノムからあらためて取ってきて調べた方がいいとは思うよ
ただし，わざわざライブラリー起こすんじゃなく
今度は普通のＰＣＲ（というよりロングPCR）で
というか
そんなことはもうやってるって？
98 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/03 11:14
ロンダＰＣＲ
ん？なんかくってかかってるやつがいるが
俺の発言は>>91の，プライマー全部揃ってるかもって言う発言に対してのものだよ．
さいしょにiPCRで１０kbひろってシーケンスしたってのは
クローニングしてdeletionかもしれないでしょ？
なにもnested deletionでやれっていってるわけではない
俺の発言は>>91の，プライマー全部揃ってるかもって言う発言に対してのものだよ．
さいしょにiPCRで１０kbひろってシーケンスしたってのは
クローニングしてdeletionかもしれないでしょ？
なにもnested deletionでやれっていってるわけではない
100 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:11
これまでについたレスがなんかよくわかんない・・・
一通り10ｋｂ読めてるでしょ？
その時のprimerの組み合わせでdeletionされたかどうか分子量で確認できるよね。
10種あるなら、先ず対象箇所のPCR productをすべてSequencing、
相違箇所が見つかれば、そこを再度重点的に。
conserve regionはSequence dataが信頼できることは説明しなくてもわかるはず。
なぜPCR productが信頼できなくてCloningされたLibraryの配列なら
信頼できるのか良くわからんよ。コロハイまでやる実験じゃないよ。
あとTaqのことだけど10kbならExでもOKです。
3'→5' exonuclease活性はLAだけでなくExにもあるので。
10kbという長さが不安なら既存のSequence primerで（重なるように）半分づつやったらどう？
一通り10ｋｂ読めてるでしょ？
その時のprimerの組み合わせでdeletionされたかどうか分子量で確認できるよね。
10種あるなら、先ず対象箇所のPCR productをすべてSequencing、
相違箇所が見つかれば、そこを再度重点的に。
conserve regionはSequence dataが信頼できることは説明しなくてもわかるはず。
なぜPCR productが信頼できなくてCloningされたLibraryの配列なら
信頼できるのか良くわからんよ。コロハイまでやる実験じゃないよ。
あとTaqのことだけど10kbならExでもOKです。
3'→5' exonuclease活性はLAだけでなくExにもあるので。
10kbという長さが不安なら既存のSequence primerで（重なるように）半分づつやったらどう？
101 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:16
見落としてた。すいません。
97で言ってたこととかぶりましたね。
ライブラリつくれというボスが「？」です。
genomeのdirect sequenceはnonsenceですよ。
97で言ってたこととかぶりましたね。
ライブラリつくれというボスが「？」です。
genomeのdirect sequenceはnonsenceですよ。
103 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:20
104 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:27
だれだ? nested deletionって馬鹿の一つ覚えのように喚いているのはw
んなことする必要ないだろ。よく考えなさい。
馬鹿の一つ覚えもほどほどに。
んなことする必要ないだろ。よく考えなさい。
馬鹿の一つ覚えもほどほどに。
105 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:31
いや，そんなことする必要は無い
だが，シーケンス用プライマーは全部揃ってないかもしれない
なぜなら最初のinverse PCRでとってきて10kbシーケンスしたのは
デリーションでやったかもしれない
というのが92のいい分だとおもう
べつにデリーションでやれとはいってない
だが，シーケンス用プライマーは全部揃ってないかもしれない
なぜなら最初のinverse PCRでとってきて10kbシーケンスしたのは
デリーションでやったかもしれない
というのが92のいい分だとおもう
べつにデリーションでやれとはいってない
106 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:34
あらら・・・だめだこりゃ。
deletion
deletion
ついでに１００はPCRでのデリーションと勘違いしてる模様
108 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:35
（続き）
かどうかの判断法は100の3行目読んでね。
かどうかの判断法は100の3行目読んでね。
109 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:36
110 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:38
111 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:44
92=105 がnested deletionの話を持ち出したことが意味不明。
本当にわかってんのか勘繰ってしまう。
本当にわかってんのか勘繰ってしまう。
112 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:44
かんけいないかもしれないけど、
Pfu Turboでふやすと、塩基置換は無いけど
4baseくらい抜けてるときがあるんだが、
おれだけですか？
いままでに３回くらいある
Pfu Turboでふやすと、塩基置換は無いけど
4baseくらい抜けてるときがあるんだが、
おれだけですか？
いままでに３回くらいある
113 ：１０５：04/06/04 02:47
ん？なんでおれが92なのよ
だから、nested deletionで10kbよんだんなら、
10kb読むためのプライマーは持ってないんじゃないかってことだとおもったんだが
だから、nested deletionで10kbよんだんなら、
10kb読むためのプライマーは持ってないんじゃないかってことだとおもったんだが
114 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:54
112=113
逃げんなって。。。
[nested deletionで10kbよんだ]
なんてどこに書いてありますか？おしえてよ。
逃げんなって。。。
[nested deletionで10kbよんだ]
なんてどこに書いてありますか？おしえてよ。
115 ：１０５：04/06/04 02:55
PCRで10kb読んだとも書いてないですが
116 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 02:59
[今日学んだ教訓]
馬鹿に何を言っても無駄。
馬鹿に何を言っても無駄。
117 ：１０５：04/06/04 03:01
118 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 03:15
まあまあみなさんおちついて
119 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 03:29
すいません、ちょっとnestedって言ってみたかっただけなんです。
120 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 14:30
だれか整理して下さい。
PCRやSequencingの知識が無い人も読んで、参考にしておりますので、
知ったかぶりの人たちだけでやり合ってないで、説明して下さい。
PCRやSequencingの知識が無い人も読んで、参考にしておりますので、
知ったかぶりの人たちだけでやり合ってないで、説明して下さい。
121 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 17:46
まずは自分で整理してあってるかどうかを問うのが筋ってもんだろ。
なんでも人にやらせるな。
なんでも人にやらせるな。
122 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 21:39
問題はiPCRで取って読んだという10kbの配列を、それは信用できないから
ゲノムライブラリを作って読めと言われて困っていると言うことだね。
１．解としてPCR産物のdirect sequenceが上がった。（正しい）
２．プライマーが沢山いる。（正しい）
３．もう既に持っているのではないかという指摘。（不明）
４．nested deletionも知らないのかという突っ込み。（間違いではないが？）
５．途中で技をかましたPCRが信用できないのでは？（正しい）
６．100（分かってない）
3に対して4だとプライマーが揃ってないかもという突っ込みだが、正直枝葉だ
よね・・・。本題とはあまり関係ない。それにnested deletionも否定は出来ない
けど常道では決してない。ゲノムプロジェクトやってるラボならともかく、普通は
サブクローン＆プライマーヲーキングのほうが簡単で速い。そうじゃなくても
どのみちプライマー作れば良いんだし、オリゴなんて高い物じゃないし、教授が
文句言っても俺らの問題じゃないし。
6は論外としても、何でやりあってるのか部外者にはよく分からん。
おそらく>>92の言い方に問題があるのだろうが。
ゲノムライブラリを作って読めと言われて困っていると言うことだね。
１．解としてPCR産物のdirect sequenceが上がった。（正しい）
２．プライマーが沢山いる。（正しい）
３．もう既に持っているのではないかという指摘。（不明）
４．nested deletionも知らないのかという突っ込み。（間違いではないが？）
５．途中で技をかましたPCRが信用できないのでは？（正しい）
６．100（分かってない）
3に対して4だとプライマーが揃ってないかもという突っ込みだが、正直枝葉だ
よね・・・。本題とはあまり関係ない。それにnested deletionも否定は出来ない
けど常道では決してない。ゲノムプロジェクトやってるラボならともかく、普通は
サブクローン＆プライマーヲーキングのほうが簡単で速い。そうじゃなくても
どのみちプライマー作れば良いんだし、オリゴなんて高い物じゃないし、教授が
文句言っても俺らの問題じゃないし。
6は論外としても、何でやりあってるのか部外者にはよく分からん。
おそらく>>92の言い方に問題があるのだろうが。
123 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 21:59
まあそんなことはどうでもいいことで、
ようするにdirect PCRやれってことで終了
ようするにdirect PCRやれってことで終了
124 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 22:13
ゲノムの脱離があろうがなかろうが、シークエンシングの時に作成したprimerで
みればいいのでは？ＧＡＰがあればそこをフィリングすればいいでしょ。
ＧＡＰサイズ知りたきゃサザンすればいいんだし。クローニングよりも先ず、
ＰＣＲでみたほうが早い。その結果をみて次の手を打てばいい。
71で
10ｋｂほどの断片を全部シークエンシングした。
と言ってるけど。
みればいいのでは？ＧＡＰがあればそこをフィリングすればいいでしょ。
ＧＡＰサイズ知りたきゃサザンすればいいんだし。クローニングよりも先ず、
ＰＣＲでみたほうが早い。その結果をみて次の手を打てばいい。
71で
10ｋｂほどの断片を全部シークエンシングした。
と言ってるけど。
125 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/04 22:21
いや、またおかしな人が来ましたよ
126 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/05 00:59
124を補足すると
>この前、inverse PCRで
>10ｋｂほどの断片をとってきて、
>なんとか全部シークエンシングした。
この文章読んだらどこにもcloningした工程が書かれていない。
つまりnested deletionではなく、Walkingでシークエンス決めたと解釈できる。
もしnested deletionで決めたのなら
>PCRで取れてきた配列は信用できないから、
と書くのではなく、
「nested deletion」で取れてきた配列は信用できないから、
と書くのが順当。
何れにせよ71がどうやって10ｋｂを決めたかの回答によると
思うが。
>この前、inverse PCRで
>10ｋｂほどの断片をとってきて、
>なんとか全部シークエンシングした。
この文章読んだらどこにもcloningした工程が書かれていない。
つまりnested deletionではなく、Walkingでシークエンス決めたと解釈できる。
もしnested deletionで決めたのなら
>PCRで取れてきた配列は信用できないから、
と書くのではなく、
「nested deletion」で取れてきた配列は信用できないから、
と書くのが順当。
何れにせよ71がどうやって10ｋｂを決めたかの回答によると
思うが。
127 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/05 01:53
正直どっちでもいい
そもそも実際どうかじゃなくて
こう考えられるってことでもめてたんだし
解凍にならんな
そもそも実際どうかじゃなくて
こう考えられるってことでもめてたんだし
解凍にならんな
128 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/05 02:05
要するに、そう考えていることの誤りを指摘しているわけだが。
129 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/05 05:12
で>>71はもう来ないの？
130 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/05 07:27
ゴガギーン
ドッカン
ｍ ドッカン
＝＝＝＝＝） ）) ☆
∧_∧ | | ／ ／￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
（ ）| |＿＿＿＿＿ ∧＿∧ ＜ おらっ！出てこい>>71
「 ⌒￣ | | || （´Д｀ ） ＼＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
| / ￣ | |/ 「 ＼
| | | | || || /＼＼
| | | | | へ//| | | |
| | | ﾛ|ﾛ |／,へ ＼| | | |
| ∧ | | | |／ ＼ / （ ）
| | | |〈 | | | |
/ / / / | / | 〈| | |
/ / / / | | || | |
/ / / / =-----=-------- | |
ドッカン
ｍ ドッカン
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131 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/05 07:49
Λ＿Λ ／￣￣￣￣￣
（ ´Д｀） ＜ よっしゃ 71>>！何も言わず飛び込んでこい！
） （ ＼＿＿＿＿＿
／⌒ ⌒ヽ
／／| |ヽ ＼
／／ | | ＼＼
｜| | | ｜｜
（＿）￣￣ ￣￣（＿）
／ ／￣￣￣￣￣￣￣ヽ ヽ
｜｜ ｜｜
⊂＿＿） （＿つ
（ ´Д｀） ＜ よっしゃ 71>>！何も言わず飛び込んでこい！
） （ ＼＿＿＿＿＿
／⌒ ⌒ヽ
／／| |ヽ ＼
／／ | | ＼＼
｜| | | ｜｜
（＿）￣￣ ￣￣（＿）
／ ／￣￣￣￣￣￣￣ヽ ヽ
｜｜ ｜｜
⊂＿＿） （＿つ
132 ：71：04/06/05 14:45
うわー
久々に見たら大変な事に・・・・・
すいません すいません すいません。
もうてっきり話題が終わったものと思っていました。
こんなに盛り上がっているとは・・・・・
皆さん本当にありがとうございました。
えーと、えーと、
何から説明したらいいのか・・・・
まず、inverse PCRで 取れてきた配列を
シークエンシングした方法は、
ショットガンです。
よそのラボに材料を持ち込んでやっとできました。
なので、シーケンス用プライマーはそろっていません。
もしウォーキングをするなら全部揃えないといけないです。
ショットガンでやるか、ウォーキングでやるか現在検討中です。
皆さんのおかげで教授を何とか説得できました。
もちろんこのスレッドを見せたわけではないですが。
久々に見たら大変な事に・・・・・
すいません すいません すいません。
もうてっきり話題が終わったものと思っていました。
こんなに盛り上がっているとは・・・・・
皆さん本当にありがとうございました。
えーと、えーと、
何から説明したらいいのか・・・・
まず、inverse PCRで 取れてきた配列を
シークエンシングした方法は、
ショットガンです。
よそのラボに材料を持ち込んでやっとできました。
なので、シーケンス用プライマーはそろっていません。
もしウォーキングをするなら全部揃えないといけないです。
ショットガンでやるか、ウォーキングでやるか現在検討中です。
皆さんのおかげで教授を何とか説得できました。
もちろんこのスレッドを見せたわけではないですが。
133 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/06 20:21
ショットガンじゃdirect sequence出来ないしな
クローニングして５クローンくらいsequenceしないといけない
金あるんならプライマーそろえるこった
クローニングして５クローンくらいsequenceしないといけない
金あるんならプライマーそろえるこった
134 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/06 21:41
平均22mer
38本
安いところなら\70/mer
で
\58520
38本
安いところなら\70/mer
で
\58520
135 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/26 18:02
(ﾟ◇ﾟ)ﾉ
136 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/10 09:45:40
genomic DNAをテンプレートにLong PCRをしたいのですが
どこのポリメラーゼがおすすめですか？
どこのポリメラーゼがおすすめですか？
137 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/10 11:51:45
KODなんかは？
138 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/11 16:28:22
10kb超->LA-Taq
それ以下->ExTaq
KOD-dashは5kbぐらいまで
あとは知らん
それ以下->ExTaq
KOD-dashは5kbぐらいまで
あとは知らん
139 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/12 00:25:24
Z-taq すげえぞ
140 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/12 18:54:05
よくコンタミする
141 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/13 15:42:45
Blend taqが 最近のお気に入り
142 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/16 13:57:27
俺のボスはfosmidでlib作る方法をやたらと薦める。
読みたい長さは40kb〜
読みたい長さは40kb〜
143 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/20 21:01:25
細胞から抽出したDNAとRNA混在のままPCRかけて
pureなバンド出たヒトっています？
やはりRNase処理って不可欠行程ですか？
教えてください
pureなバンド出たヒトっています？
やはりRNase処理って不可欠行程ですか？
教えてください
144 ：べイカル十翔長：04/10/20 23:56:52
145 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 00:05:25
＞サーマルサイクラーもなしで
バンドって 切れてないゲノムのこと？
普通混在のままかけるんでないか？
うちは人血液から菌とか原虫の検出してるけど
種も越えて混ざってるよ
バンドって 切れてないゲノムのこと？
普通混在のままかけるんでないか？
うちは人血液から菌とか原虫の検出してるけど
種も越えて混ざってるよ
146 ：べイカル十翔長：04/10/21 00:12:57
ごめん
バンドというか、ただ増えただけだよ。
LAMP法とAmpdirectで。
でも、やりようによってはバンドも見れないことも無い。
バンドというか、ただ増えただけだよ。
LAMP法とAmpdirectで。
でも、やりようによってはバンドも見れないことも無い。
147 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 08:12:19
あー いまはそんな方法もあったんだね
なんかまだ眉唾もんなんだけど 使える？
アマシャムのゲノム増やす奴は便利そうだ
コピー数が少ないときは使えそうだけど
他の種が混在しているときはどうなるんだろう
ベクトルがかかるんじゃないか？
なんかまだ眉唾もんなんだけど 使える？
アマシャムのゲノム増やす奴は便利そうだ
コピー数が少ないときは使えそうだけど
他の種が混在しているときはどうなるんだろう
ベクトルがかかるんじゃないか？
148 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 22:10:19
ある遺伝子の配列をしりたいのですが
何処で調べればいいのですか？
gen bankとかですか？
詳しくお願いします！！
何処で調べればいいのですか？
gen bankとかですか？
詳しくお願いします！！
149 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/21 23:12:08
150 ：１４８：04/10/21 23:33:36
>149
激しくサンクス！！
ルシフェラーゼでつ。
激しくサンクス！！
ルシフェラーゼでつ。
151 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/03 19:38:15
ゲノムからある遺伝子の一部を取り出したくてPCRをやっているのだが
どうにもこうにも全くかかりません・・・
欲しい遺伝子の一部というのはExon１ですからその前のIntronと後ろのExon2をPrimer
としてるのだが この設計が悪いのでしょうか？
PrimerをBlastにもかけましたがなぜこんな事になるのか分かりません
HotStartもやったし切り出しもNestedもやったんですが・・・
だれかアドバイスください（ペコリ
どうにもこうにも全くかかりません・・・
欲しい遺伝子の一部というのはExon１ですからその前のIntronと後ろのExon2をPrimer
としてるのだが この設計が悪いのでしょうか？
PrimerをBlastにもかけましたがなぜこんな事になるのか分かりません
HotStartもやったし切り出しもNestedもやったんですが・・・
だれかアドバイスください（ペコリ
152 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/03 19:43:03
>>151
CG contentsが高いんじゃないかな？exon1の前っていうと結構CpG islandがあって
PCRかからないことあるよ。一度調べてみなよ。
もしそうならPCR反応にDMSO加えてみ。濃度は10%以下で、一応濃度振ってみてね。
CG contentsが高いんじゃないかな？exon1の前っていうと結構CpG islandがあって
PCRかからないことあるよ。一度調べてみなよ。
もしそうならPCR反応にDMSO加えてみ。濃度は10%以下で、一応濃度振ってみてね。
153 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/03 21:29:24
ExonならcDNAからも試すとか
154 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/04 20:53:16
>>152-153
レスサンクス
そしてかかりました！！
DMSO１０％添加してやったらゴツイバンドがドガ＝＝＝ンとでましたよ(つAT)
これからNestedして確認してTAクローニングします
本当サンクスです！！
レスサンクス
そしてかかりました！！
DMSO１０％添加してやったらゴツイバンドがドガ＝＝＝ンとでましたよ(つAT)
これからNestedして確認してTAクローニングします
本当サンクスです！！
155 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/06 15:14:43
既知のｍRNAの配列を元にgenomicPCRを計画しているのですが、
プライマーの途中にイントロンが入らないか心配です。
ｍRNAの配列のみからイントロンの位置を知ることは可能でしょうか？
うちのボスには
「可能だという話を聞いたことがるので、自分で調べなさい」
といわれているけど、
いろいろ調べましたが、どうしてもその情報が見つかりません。
本当に推測可能なのでしょうか？
とりあえずは、他の種で報告されている類似の遺伝子のイントロンの位置から
推測しようと思っています。
ちなみ材料は高等植物です・
プライマーの途中にイントロンが入らないか心配です。
ｍRNAの配列のみからイントロンの位置を知ることは可能でしょうか？
うちのボスには
「可能だという話を聞いたことがるので、自分で調べなさい」
といわれているけど、
いろいろ調べましたが、どうしてもその情報が見つかりません。
本当に推測可能なのでしょうか？
とりあえずは、他の種で報告されている類似の遺伝子のイントロンの位置から
推測しようと思っています。
ちなみ材料は高等植物です・
156 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/06 16:40:57
>>155
不可能です。少なくとも哺乳類では。
不可能です。少なくとも哺乳類では。
157 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/06 17:09:37
コンセンサス配列があるって聞いたことあるけどな。
完全に知ることは不可能でも、ある程度は推測できるんじゃないかな。
完全に知ることは不可能でも、ある程度は推測できるんじゃないかな。
158 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/06 17:21:12
159 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/06 17:57:36
進化上保存されたイントロンというか挿入場所もあるので、ナズナとイネのオルソログのゲノム情報を調べてみるのも無駄ではない。そうでない場合もあるが。
160 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 10:34:20
私の遺伝子は5'UTRにイントロンが入っている
植物だったらゲノムデータベースで調べてみたら？
入りそうもない位置にプライマー何種類か作ればいいじゃない
植物だったらゲノムデータベースで調べてみたら？
入りそうもない位置にプライマー何種類か作ればいいじゃない
161 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/09 10:36:52
プライマーにイノシンを入れると増えにくくなりますか？
takaraのExTaqは反応性が鈍るとホームページに書いてあるんです
3'-->5' exo活性があるとだめなんですかね
takaraのExTaqは反応性が鈍るとホームページに書いてあるんです
3'-->5' exo活性があるとだめなんですかね
162 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/12 22:57:56
だけど・・・
163 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/13 01:48:16
でも論文にはIが入っているプライマー exで増やしたと堂々とかかれているよ
164 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/15 23:44:19
165 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 08:50:39
焼いた骨からでもバンド出るんだからそんくらい自分で考えろや
166 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/16 09:05:39
>>165
二週間かけてねぇ。苦笑
二週間かけてねぇ。苦笑
167 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/30 23:52:50
プライマーの蛍光染色の仕方を教えてください！！！
ちなみに6-FAMです
ちなみに6-FAMです
168 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/31 01:09:45
委託
169 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/01 02:18:07
>168
委託だと面白くない・・・
っていうか最近は皆様委託が普通なんでしょうか・・・・
委託だと面白くない・・・
っていうか最近は皆様委託が普通なんでしょうか・・・・
170 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/10 20:57:27
>167
委託が面倒無くてよいんじゃない？
染めてもよいけど使用期限とかもあるし。
ていうか みんな 本当に 自分で染めたこと ない？
委託が面倒無くてよいんじゃない？
染めてもよいけど使用期限とかもあるし。
ていうか みんな 本当に 自分で染めたこと ない？
171 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/11 08:10:42
気になるのだが、生物板に書き込みしている役職層ってどんなもんよ？
助手以下？
助手以下？
172 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/11 18:34:18
>171
陰性ですが・・・
陰性ですが・・・
173 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/11 21:42:33
アマシャムのRCAってどう？
コンタミしたらそれも増えるのかな
コンタミしたらそれも増えるのかな
174 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 15:05:23
>>172
いや、陰性、学部生がメインだろうけど、上がどんなもんかとおもって。
いや、陰性、学部生がメインだろうけど、上がどんなもんかとおもって。
175 ：名無しゲノムのクローンさん：05/02/05 17:21:25
>174
たいしたもんじゃね〜だろ〜〜よ
たいしたもんじゃね〜だろ〜〜よ
176 ：& ◆/p9zsLJK2M ：05/03/06 13:10:19
はっくしょい
177 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/10 17:50:04
サイクラー買ってもらえる！どこのがいいですかい？
178 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/10 21:17:19
astec
179 ：名無しゲノムのクローンさん：05/03/12 03:22:20
180 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/08(金) 23:20:03
PCRいやだ。どうすれば楽しくなりますか。
181 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/10(日) 09:17:13
サーマルサイクラー
182 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/25(火) 03:15:16
ヲイ、将来の教授様候補どもの藻前等！
マイクロサテライトマーカーをPCRした時にヘテロバンドが片一方の親のアレルに
吸い取られすぎてヘテロかホモか判別つきづらい時の対処法を教えて下ちい。m(_ _)m
マイクロサテライトマーカーをPCRした時にヘテロバンドが片一方の親のアレルに
吸い取られすぎてヘテロかホモか判別つきづらい時の対処法を教えて下ちい。m(_ _)m
183 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/25(火) 10:02:36
184 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/25(火) 22:35:19
うちのラボにあるPEのサーマルサイクラーがお亡くなりになりました。
なんか緑色の汁を垂らしながらの壮絶な最期でした。
なんか緑色の汁を垂らしながらの壮絶な最期でした。
185 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/26(水) 00:44:32
2400だっけ？
186 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/28(金) 00:19:52
>182
Null alleleのことを言いたいんか？
Null alleleのことを言いたいんか？
187 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/28(金) 07:37:32
>182
数当たれ
話はそれからだ
数当たれ
話はそれからだ
188 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/02(水) 00:22:16
そろそろ数当たり終えた？
総当たり戦は前々からしょっぽい研究費を浪費しながらマーカー注文して
やってはいるのだが、おそらくPCRコンディションによると思うんだよね。
ともかく遺伝子マッピングした人ならこういう経験あると思うんだけど
どうなんだろ？経験者後輪キボン。マッピングしたことあるけどそういうの
特になかったypっていう方は、PCRコンディション教えてくだちい。
やってはいるのだが、おそらくPCRコンディションによると思うんだよね。
ともかく遺伝子マッピングした人ならこういう経験あると思うんだけど
どうなんだろ？経験者後輪キボン。マッピングしたことあるけどそういうの
特になかったypっていう方は、PCRコンディション教えてくだちい。
ちなみに朕はSTEP DOWN（１サイクル毎にアニーリング温度下がってくやつね）で
68℃から始まって55℃に達したら55℃×30サイクルってコンディションでやってまつ。
解決して原因遺伝子特定できたらNature Genetics出しまつ。ノシ
68℃から始まって55℃に達したら55℃×30サイクルってコンディションでやってまつ。
解決して原因遺伝子特定できたらNature Genetics出しまつ。ノシ
191 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/02(水) 01:51:44
じゃぁ、６３℃Ｘ１０→５５℃Ｘ２０でやってみそ
つか、起きてる現象いわんとよくわかんないや。
テンプレートのＧＣ含量とかもわかんないし。
いつものアニ温は何度でやってんのか、とか。
テンプレートとプライマーのサイクル反応なんだから、
何がおきちゃってるのか言えば、アドバイスのしようもありそうだが。
スメアになっちゃうなら、この手でいける。
つか、起きてる現象いわんとよくわかんないや。
テンプレートのＧＣ含量とかもわかんないし。
いつものアニ温は何度でやってんのか、とか。
テンプレートとプライマーのサイクル反応なんだから、
何がおきちゃってるのか言えば、アドバイスのしようもありそうだが。
スメアになっちゃうなら、この手でいける。
192 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/05(土) 15:12:52
Nature GeneticsはNGみたいだな
193 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/15(火) 10:40:49
PCR断片って制限酵素で切れにくくない？
194 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/17(木) 19:48:20
>>193
断片の配列や使う制限酵素によると思うけど
断片の配列や使う制限酵素によると思うけど
195 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/18(金) 23:04:46
プライマー濃度を５μMとかなり濃くしたら、今まで検出できなかったバンドがみえるように
なりました。プライマー濃度ってそんなに重要なんでしょうか？
なりました。プライマー濃度ってそんなに重要なんでしょうか？
196 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/18(金) 23:53:31
重要な場合も全然重要でない場合もある。
degeneragePCRなどでは濃いめにすると良いとされるが、
0.5μM以上の濃度増加は、効果がない場合の方が多い。
degeneragePCRなどでは濃いめにすると良いとされるが、
0.5μM以上の濃度増加は、効果がない場合の方が多い。
197 ：ｙ：2005/11/19(土) 06:15:32
193へ
プライマーの端に制限酵素サイトを付けてそれを切ろうとしているならそのさらに
外に２ｂｐほどTTなりATなりの配列を加えたプライマー設計にするとうまくいくとき
がある。制限酵素にも時には足場が必要らしい。
プライマーの端に制限酵素サイトを付けてそれを切ろうとしているならそのさらに
外に２ｂｐほどTTなりATなりの配列を加えたプライマー設計にするとうまくいくとき
がある。制限酵素にも時には足場が必要らしい。
198 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/19(土) 10:37:13
PCR反応液は塩が含まれてる事を考えずに切るバカが大量にいるから切れにくいとかいってる奴がいるんだろうな
PCR反応液はM bufferくらいの塩濃度だから，LとかMなら酵素だけいれれば切れる
PCR反応液はM bufferくらいの塩濃度だから，LとかMなら酵素だけいれれば切れる
199 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/19(土) 10:58:00
KClじゃ切れない酵素もあるしね。
200 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/19(土) 15:32:03
細菌のゲノムをtemplateにして以前は出ていたバンドが、最近出なくなりました。
ゲノムDNAはキットで抽出したものを冷蔵庫で半年ほど保存していたのですが何か
問題あるでしょうか。ちなみにプライマーの保存（一旦溶かしたやつ）は皆さん
どうしていますか。
ゲノムDNAはキットで抽出したものを冷蔵庫で半年ほど保存していたのですが何か
問題あるでしょうか。ちなみにプライマーの保存（一旦溶かしたやつ）は皆さん
どうしていますか。
201 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/19(土) 21:54:18
EDTAが入ってれば−３０℃で半年は持つのでは。
202 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/19(土) 22:54:34
203 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/19(土) 23:00:27
>>200
ゲノムDNAは電気泳動で壊れていないかどうか確かめた？
私はゲノムDNAはTEで保存してる。数年は大丈夫。でも冷凍した方がより長く保存できると思う。
プライマーもTEで溶解している。水だとどうも壊れやすい傾向にあると思う。
プライマーのTE保存、冷凍で２〜３年は経験的に大丈夫だった。
ゲノムDNAは電気泳動で壊れていないかどうか確かめた？
私はゲノムDNAはTEで保存してる。数年は大丈夫。でも冷凍した方がより長く保存できると思う。
プライマーもTEで溶解している。水だとどうも壊れやすい傾向にあると思う。
プライマーのTE保存、冷凍で２〜３年は経験的に大丈夫だった。
204 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/19(土) 23:45:08
菌体をそのまま凍結保存したものと、抽出したDNAをTEに溶解したものを
-30℃で保存していたら、DNAの抽出液は半年以上もったけど、
凍結保存していた菌体から再抽出したらDNAが壊れていた。
よって、菌体は抽出後に捨てて、抽出液だけを保存すべきだということに
今頃気がついた・・・
-30℃で保存していたら、DNAの抽出液は半年以上もったけど、
凍結保存していた菌体から再抽出したらDNAが壊れていた。
よって、菌体は抽出後に捨てて、抽出液だけを保存すべきだということに
今頃気がついた・・・
205 ：193だけど：2005/11/19(土) 23:53:58
PCR液の塩濃度、酵素反応のための足場は理解してるよ。
アモニウムアセテート使ったエタ沈でpurifyしたやつ使って、
1kbくらいのproductで、端っこから300bpくらいはなれたとこを
SphI 1hr処理で切ろうとしたんだけどほとんど切れなかった。
めんどくさいから他の構築方法にした。KClでどうとかは調べてない
からわからん。まぁ適当にやっただけだし流してくれｗ
>>200
PCRで増えなくなったら、とりなおしてるよ。それをストック用と
実験用（濃度調整もする）で保存してる。プライマーもストックと
実験用で分けてる。PCR productのsizeはどんなもん？
longならtemplate取り直し、primer作り直しのほうがはやげ。
アモニウムアセテート使ったエタ沈でpurifyしたやつ使って、
1kbくらいのproductで、端っこから300bpくらいはなれたとこを
SphI 1hr処理で切ろうとしたんだけどほとんど切れなかった。
めんどくさいから他の構築方法にした。KClでどうとかは調べてない
からわからん。まぁ適当にやっただけだし流してくれｗ
>>200
PCRで増えなくなったら、とりなおしてるよ。それをストック用と
実験用（濃度調整もする）で保存してる。プライマーもストックと
実験用で分けてる。PCR productのsizeはどんなもん？
longならtemplate取り直し、primer作り直しのほうがはやげ。
206 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/20(日) 00:01:33
取り直しするには、DNaseが働かない条件で菌体を保存する必要がありますね。
プライマーのストック(100μM液？)は大丈夫だろうけど。
プライマーのストック(100μM液？)は大丈夫だろうけど。
207 ：２００：2005/11/20(日) 00:14:35
>>203 >>204 >>205
どうもありがとう。1kbの断片ですがゲノムは安定なものだと
思ってたので保存についてはあまり気にしていませんでした。
取り直してみます。プライマーは何回位凍結融解に耐えうるもの
なんでしょうかね。よく使用するものなので心配な点ではあります。
どうもありがとう。1kbの断片ですがゲノムは安定なものだと
思ってたので保存についてはあまり気にしていませんでした。
取り直してみます。プライマーは何回位凍結融解に耐えうるもの
なんでしょうかね。よく使用するものなので心配な点ではあります。
208 ：203です：2005/11/20(日) 00:46:26
200さんへ
どのくらいの頻度、量のプライマーを使うのかわかりませんが、
私も205さんのようにストック(私の場合100uM)と薄めたやつ(２uM)の2種類準備し、
ストックは冷凍、薄めたやつは冷蔵で保存し、薄めたプライマーを使ってPCRしています。
「何回くらいの凍結融解に耐えられるか」の本質的な質問の答えにはなっていませんが、
私の経験で思うに、数十回の凍結融解には耐えられないと思う。
200さんへの参考になればと思います。
どのくらいの頻度、量のプライマーを使うのかわかりませんが、
私も205さんのようにストック(私の場合100uM)と薄めたやつ(２uM)の2種類準備し、
ストックは冷凍、薄めたやつは冷蔵で保存し、薄めたプライマーを使ってPCRしています。
「何回くらいの凍結融解に耐えられるか」の本質的な質問の答えにはなっていませんが、
私の経験で思うに、数十回の凍結融解には耐えられないと思う。
200さんへの参考になればと思います。
209 ：２００：2005/11/20(日) 00:59:18
203さん。ありがとうございます。薄めた溶液での冷蔵も考えたんですが
安定性が悪いような気がして・・。冷蔵でも結構もつものなんでしょうか。
安定性が悪いような気がして・・。冷蔵でも結構もつものなんでしょうか。
210 ：203です：2005/11/20(日) 01:42:43
最近あるプライマーの組み合わせをつかったPCRの増幅が急に悪くなったので、
ストックから薄めた、つくりたてのプライマーと古いプライマー(約2ヶ月前作成)
を使ってPCRし、増幅度合いを比較してみました。そうすると、
明らかに古いプライマーを使ったPCRの増幅が悪かったです。
しかし、2ヶ月経ってもPCR増幅に問題ないプライマーがわたしの場合ほとんどで、
この上記のプライマーが特殊であると考えています。
200さんのプライマーがPCR増幅を安定させるかどうかはわかんないです。
ストックから薄めた、つくりたてのプライマーと古いプライマー(約2ヶ月前作成)
を使ってPCRし、増幅度合いを比較してみました。そうすると、
明らかに古いプライマーを使ったPCRの増幅が悪かったです。
しかし、2ヶ月経ってもPCR増幅に問題ないプライマーがわたしの場合ほとんどで、
この上記のプライマーが特殊であると考えています。
200さんのプライマーがPCR増幅を安定させるかどうかはわかんないです。
211 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/12/18(日) 00:14:34
DNAからではなくRT-PCRを行う理由は、DNAにはスプライシングなどでｲﾝﾄﾛﾝの部分もふくまれるが、RNAなら、直接タンパクの情報を見ることができるからですか？
212 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/12/18(日) 00:18:44
age
213 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/12/18(日) 06:14:59
>>211
かなり根本的なところから勉強し直した方がいいと思うぞ。。
かなり根本的なところから勉強し直した方がいいと思うぞ。。
214 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/12/18(日) 15:01:44
転写制御も生きているからこそ可能。
ホモジナイズしたサンプルに意味はない。
ホモジナイズしたサンプルに意味はない。
215 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/11(水) 22:43:18
PCR産物を電気泳動して、geneクリーンしたものの波長をはかると、
230nmだけ、異様に高くなるときがあるんですけど、
このままdirect sequenceもっていっても阻害とかないんすか?
誰かいれば教えてください。
230nmだけ、異様に高くなるときがあるんですけど、
このままdirect sequenceもっていっても阻害とかないんすか?
誰かいれば教えてください。
216 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/13(金) 21:07:05
>>215
やってみりゃ良いじゃん
やってみりゃ良いじゃん
217 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/13(金) 21:20:34
ゲルから切り出したものは
シグナルが減衰するよ
シグナルが減衰するよ
218 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/13(金) 21:46:48
ちゃんと手順どおりにやりなさい
PCR->
精製（エタ沈）->
ライゲーション（シークエンスベクター使用）->
導入（塩化カルシウム法）->
培養・コロニー採取->
ミニプレップ->
精製（PEG沈）->
シークエンス反応->
精製（スピンカラム）->
電気泳動（大型ゲル使用）
PCR->
精製（エタ沈）->
ライゲーション（シークエンスベクター使用）->
導入（塩化カルシウム法）->
培養・コロニー採取->
ミニプレップ->
精製（PEG沈）->
シークエンス反応->
精製（スピンカラム）->
電気泳動（大型ゲル使用）
219 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/13(金) 22:39:00
>215
プラスミドに入れて、大量セシクロ精製してからシークエンスしろよ、カス。
こんなことでトロトロやってんじゃねーよ。 オッサンがよ。
てめー修士前の学生だろうな？ それ以上だったら今すぐ辞めて他の職探せ。 このニート予備軍。
プラスミドに入れて、大量セシクロ精製してからシークエンスしろよ、カス。
こんなことでトロトロやってんじゃねーよ。 オッサンがよ。
てめー修士前の学生だろうな？ それ以上だったら今すぐ辞めて他の職探せ。 このニート予備軍。
220 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/13(金) 22:48:52
オッサンだからダイレクトシークエンスを嫌がるんじゃないのｗ
221 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/13(金) 22:50:43
死ぬまで悩んでろｗ
222 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/13(金) 22:51:18
すでに教授ですが何か？
ちょと実験したくなっただけですが。
ちょと実験したくなっただけですが。
223 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/13(金) 22:53:17
プラスミドに入れちゃったら、感度が１０分の１ぐらいに下がるよ。
わざわざプラスミドに入れるのは、ＴＡクローニングとかをやる場合だけでしょ。
わざわざプラスミドに入れるのは、ＴＡクローニングとかをやる場合だけでしょ。
224 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/13(金) 23:02:34
ダイレクトシークエンスだとプライマーの配列部分が読めない。
プラスミドに入れるのはユニバーサルプライマーが使えるし
PCR産物の全長を読めるから。
プラスミドに入れるのはユニバーサルプライマーが使えるし
PCR産物の全長を読めるから。
225 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/13(金) 23:32:09
>>161-163
Knittel T, Picard D.
PCR with degenerate primers containing deoxyinosine fails with Pfu DNA polymerase.
PCR Methods Appl. 1993 May;2(4):346-7.
PMID: 8324509 [PubMed - indexed for MEDLINE]
Knittel T, Picard D.
PCR with degenerate primers containing deoxyinosine fails with Pfu DNA polymerase.
PCR Methods Appl. 1993 May;2(4):346-7.
PMID: 8324509 [PubMed - indexed for MEDLINE]
226 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/15(日) 17:08:03
>>224
反対から読めるよ。ーー＞プライマーの配列。
反対から読めるよ。ーー＞プライマーの配列。
227 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/15(日) 18:40:11
両端解析するならね。
228 ：215：2006/01/18(水) 18:06:50
久しぶりにきたらいっぱいレス来てた。ton。
いままで、1年間くらいこれしかやってなくて、シークエンス読めてたから、
別にどうでもいいんだけど、気になったからさ。
大腸菌使うのマンドクさいんだもんなぁ。＋2〜3日くらい?
1発で出るならと思うと鬱になるよ。
あーでも、プライマーの位置の重複とか考えると大腸菌使った方が早くてきれいなのかも。
一回やったら、コロニー取り出して?培養するところまではうまくいったんだけど、
アルカリ法?の途中で失敗したみたいで、いまいち嫌ってるんです。
ちなみに、俺は学士4年だから、まだ職を変えなくていいみたい。
いままで、1年間くらいこれしかやってなくて、シークエンス読めてたから、
別にどうでもいいんだけど、気になったからさ。
大腸菌使うのマンドクさいんだもんなぁ。＋2〜3日くらい?
1発で出るならと思うと鬱になるよ。
あーでも、プライマーの位置の重複とか考えると大腸菌使った方が早くてきれいなのかも。
一回やったら、コロニー取り出して?培養するところまではうまくいったんだけど、
アルカリ法?の途中で失敗したみたいで、いまいち嫌ってるんです。
ちなみに、俺は学士4年だから、まだ職を変えなくていいみたい。
229 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/07/23(日) 00:43:31
同じ組成でPCRを何回かかけると、
泳動後のバンドが徐々に薄くなっていく気がするんだがなんで？
templateが凍結、解凍の度に消失していっているのか？
教えてください。。。
泳動後のバンドが徐々に薄くなっていく気がするんだがなんで？
templateが凍結、解凍の度に消失していっているのか？
教えてください。。。
230 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/07/23(日) 04:55:23
凍結・解凍の繰り返しは確かにあまり良くないな
ただ、数回程度でそこまで影響があるかといわれるとちょっと疑問だ
ただ、数回程度でそこまで影響があるかといわれるとちょっと疑問だ
ちなみに凍結、解凍は3回くらいしかしてないっす。
232 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/07/24(月) 17:36:03
俺には同じ組成でPCRを何回かかけるとの意味がよくわからん。
遺伝子プールを何回か凍結、解凍して使いまわしてるのか。
NESTEDだっけ?PCRみたいに同じものを何回かかけてるのか。
前者なら、気のせいじゃないの?俺のcDNA poolは15回くらいやっても問題なかった。
少しあれば大腸菌にtransfectionできるしね。気になるようなら分注しとけ。
後者は俺も減るような気がする。
遺伝子プールを何回か凍結、解凍して使いまわしてるのか。
NESTEDだっけ?PCRみたいに同じものを何回かかけてるのか。
前者なら、気のせいじゃないの?俺のcDNA poolは15回くらいやっても問題なかった。
少しあれば大腸菌にtransfectionできるしね。気になるようなら分注しとけ。
後者は俺も減るような気がする。
233 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/07/24(月) 17:56:28
なんか最近このスレの流れおもしれえな
234 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/08/01(火) 17:48:21
わたしも、正直211さんと同じようなレベルです
院生1年目 もうなにがなんだかわからないレベルです
こういうど初心者の居心地がいいスレ、もしくは
この本嫁っていう初心者用の本などないでしょうか？
あまりにわからなくて、周りに聞くのがかなり恥ずかしいです・・・
申し訳ありませんがご教示ください
院生1年目 もうなにがなんだかわからないレベルです
こういうど初心者の居心地がいいスレ、もしくは
この本嫁っていう初心者用の本などないでしょうか？
あまりにわからなくて、周りに聞くのがかなり恥ずかしいです・・・
申し訳ありませんがご教示ください
235 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/08/01(火) 20:34:46
夏に冷房の効いていない実験室でサンプル放っておいたら、半日でDNA消えますよ。
完全にDNaseフリーのサンプルだったら大丈夫かも知れないけど。
>>229
実験がうまくなって、特異性が高くなってるのかも。
PCRの反応条件を変えてるのでは？
もしくは>>232の言うように、Nestedにしたとか。
>>161
3'末端をリン酸化するかLNAにしたプライマーを使えば、
イノシン入りでもExTaqが使えるのかな？
完全にDNaseフリーのサンプルだったら大丈夫かも知れないけど。
>>229
実験がうまくなって、特異性が高くなってるのかも。
PCRの反応条件を変えてるのでは？
もしくは>>232の言うように、Nestedにしたとか。
>>161
3'末端をリン酸化するかLNAにしたプライマーを使えば、
イノシン入りでもExTaqが使えるのかな？
236 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/08/02(水) 03:59:28
RNAのODについてなんですけど、質問させてください。
細胞からtotal RNAをtrizolで抽出して、ODを測ると、波形のピークが260mmじゃなくて、269mmあたりに来るんです。
何度やっても同じです。そのサンプルでRT-PCRやればちゃんと結果が出ます。
同じ吸光度計でDNAを測るととピークは260mmに来ます。
これって、ウリジンとチミンの違いから来るものなんですか。
細胞からtotal RNAをtrizolで抽出して、ODを測ると、波形のピークが260mmじゃなくて、269mmあたりに来るんです。
何度やっても同じです。そのサンプルでRT-PCRやればちゃんと結果が出ます。
同じ吸光度計でDNAを測るととピークは260mmに来ます。
これって、ウリジンとチミンの違いから来るものなんですか。
237 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/08/02(水) 22:39:38
フェノール除けてる？
nestedじゃないっす。。
というかnestedしようとして、PCR後の産物からPCRすると、とてつもなくスメアになります。
PCR後の産物をもっかいPCRするときの注意点としては何が考えられるでしょうか？
MgとTaqはいれなおしてるんすけど・・・
>>232
>>235
ご返答ありがとございます。
気のせいではなく、もはやかすかに見える程度までうっすいバンドっす。
template増やしても、Primer作りなおしてもだめっす。
解凍後はすぐon iceでおいてます。
自分にはもう万策つきた感じです。
実験すすまねぇ・・・orz
というかnestedしようとして、PCR後の産物からPCRすると、とてつもなくスメアになります。
PCR後の産物をもっかいPCRするときの注意点としては何が考えられるでしょうか？
MgとTaqはいれなおしてるんすけど・・・
>>232
>>235
ご返答ありがとございます。
気のせいではなく、もはやかすかに見える程度までうっすいバンドっす。
template増やしても、Primer作りなおしてもだめっす。
解凍後はすぐon iceでおいてます。
自分にはもう万策つきた感じです。
実験すすまねぇ・・・orz
239 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/08/04(金) 22:09:21
PCRしたサンプルを次のPCRのテンプレートにしてるの？
240 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/08/05(土) 14:21:53
ネステッドってPCRしたサンプルからまたDNAを精製しないとうまくいかないの？
241 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/08/06(日) 11:43:20 BE:59905722-2BP(10)
馬鹿だらけｗ
02年の>1さんの書き込みから数年後か…。
自分もおなじ経験たびたびあるなあ。
自分は↑言われているようなことすべてやっても解決しなくて、
時間が解決してくれたっていう非科学的なｵﾁｗ
いつもすいすいやっていたことが突然できなくなるとﾋﾞﾋﾞﾙね
自分もおなじ経験たびたびあるなあ。
自分は↑言われているようなことすべてやっても解決しなくて、
時間が解決してくれたっていう非科学的なｵﾁｗ
いつもすいすいやっていたことが突然できなくなるとﾋﾞﾋﾞﾙね