実験のこだわりをかたるスレ

ウエスタンのブロッティングはニトロセルロース。
PVDFはつかわない。

アガロースゲルは４％に限る。

ウェスタンのブロッティングは PVDF。
ニトロセルロースは安いけど、もろすぎるからいやん。

メロンパンの表面が湿っぽいヤツはダメ。
カリカリのクッキー地に限る。

アンパンは粒餡。
漉し餡はだめ。
アンパンマンも粒餡。

あげ

>>2
おまえはホモ上田か？
自分のことは自分でやる！

コロピー大好き

ライブラリー作成、シーケンシングは自分でやらない。
すべて外注に限る。

プラスミドはかならずCsCl超遠心で取る

プラスミドは院生に取らせる。これ最強。

大腸菌は半ばうんこと思え。

カエルのoocyteはst6になりたての少し黒ずんだやつを使う。

サンプルに愛称をつける。

ゴローとか。

5 名前：ニダ ：02/06/25 20:45 ID:Vflq4QhT
留学生 「マチャミ先生、2-hybridの一次スクリーニングで600個ほどコロニーが出ました。
　次はLacZ検定してから、ダブルチェックが住んだキャンディデェートからプラスミドを
回収して、PCRしてから４塩基認識酵素で切ってグループ分けしてみます。それから、、、」

マチャミ「もたもたしてるんぢゃない、いいから全部のコロニーからプラスミドを回収してシーケンスするんだ！」

留学生「ですから、その前にチェックを、、、」

マチャミ「つべこべ言わずに、全部シーケンスするんだ！あとインサートは全部、ベイトとプレイを入れ替えて相互作用を
　　確認するんだ！いいな！今月中だぞ！」

留学生（泣）「、、、、、（それで、本当に論文でるニダか？）」

46 名前：名無しさん＠おだいじに ：02/06/25 20:59 ID:khYUE5Cz
生徒「●と利せんせー、保利子試験の落ちこぼれが自作自演してますー」
●と利「まーいいだろう。大いにやりたまえ。」

サクサクやんないと、スリッパでぶつよ！

ウエスタンのブロッティングはナイロン。
いくらブロッキングしてもし足りないあのバックグラウンド！

おいおまへら！
顕微鏡などで取り込んだ写真の解像度、画像サイズを勝手に
一定値に返還してくれるソフトとか、Photoshop-Plug-inとかはないのかよ！？
絶対需要高いと思うんだが

>>18
　Photoshopのアクションを使えばフォルダごとバッチ処理できるよ。
うちは顕微鏡で取り込んだJPEG画像を72dpiから300dpiに変換、
サイズ縮小、保存のアクションを作ってます。
　簡単に書くと、まず「ウィンドウ」メニューの「アクション」パレッ
トを表示する。パレットメニューから「新規アクションを作成」を選択
し、アクションに名前を付ける。するとパレットウィンドウの下のボタ
ンが赤丸になる。で、画像を拡大したり色々と加工すると、その操作が
一つずつ記録される。記録を中止したいときは、黒四角ボタンを押せば
OK。記録した操作それぞれのチェックマークをはずせば、それはバッチ
処理の時実行されなくなる。また、ファイルごとに解像度やサイズを変
更したい場合は、アクションの該当操作のところで、チェックマークの
隣の四角い凹みを押すとマークがつき、バッチ処理の際に、その操作の
時にダイアログが出るようになる。実際にバッチ処理するときは、「フ
ァイル」メニューから「自動処理」→「バッチ」を選択し「アクション
名」と、実行したいフォルダ(ソース）を選んでやればOK。
　上の方法はMac版Photoshop6/7を元にしてるので、Win版とは少々
違うかも・・そのときはごめんなさい。参考になったら嬉しいです。

>>19
神認定

あ

high　fidelityを追求するならどのtaqがいい？
TakaraのLAは思った以上にエラーが多くてびっくりしたよ。
あれは精度が高いから長いのが増えるんじゃ無くて
勢いで長いのが増えるんだろうな

実験室で食うのはヘビー生地。クリスピーはカスが飛ぶ。

>>18
こんなんじゃだめ？　Ｗｉｎだけど・・・
http://www.vector.co.jp/soft/win95/art/se132646.html

>>22 pfu turbo KOD あたりは？

>>22
pfuこれ最強

>>25-26
やっぱそれか。

あ、今日Big Dye terminator の
ver.3使ってみたけど、
最高でしたよ。
お前らもversion upしる！

http://isweb37.infoseek.co.jp/sports/gikohisa/cgi-bin/test/read.cgi/swa/1034245662/

http://isweb37.infoseek.co.jp/sports/gikohisa/cgi-bin/test/read.cgi?bbs=swa&key=1034245662

おまえらカラムにこだわってる？
メンブレン、ゲル濾過、シリカ、色々あるけど。

おれはかなり濃縮したいときはメンブレン　Microcon-100
薄くてもいいならシリカゲル　キアゲン系
よっぽど変な溶液の脱塩にはゲル濾過　BioSpin　Colum 6
とかって感じだけど。

マイクロコン高いけど5ulとかに濃縮できるから頻繁につかってるよ

ゲル濾過ってアングルローターで回しても平気なの？

>>32

全然平気
普通エッペン回すようなローター，
アングルローターくらいしか使わないし

まあね。
でもアングルだとゲルとチューブの隙間をDNA溶液が素通りしてしまう
気がする。
まあスイングないからアングルでやってるけど

つうかおまえらもっとこだわれよ。
のびねえな。このスレ

とりあえず、何ごとも直射日光が当たらないところで、ひっそりとやってますが。。

>>22
LA-Taqやっぱりエラー多いよね。俺はKOD Plus使ってる。
TA-cloningの時はTaqとdATP加えてA突端作ってるが，
3'-Aをくっつけるhigh fidelityの酵素ないかねえ？
Rocheのがいいとは聞いたことあるんだけど使ったヒト，どうすか？

rocheのhigh fidelity、自分は相性良くなかった。
あと1回使っただけでへたったことがあり、それ以来
TakaraのExTaqでやってる。
よく増える割に1〜2kbくらいならわりとno mistakeでいける。
てゆうか１ｋｂ以上は分割して伸ばしてつなげた方が良いと思うよ。
（用途によるけど）

LATaqはLong用だからエラーしかたないべ。

>>37
QIAGENからA-Addition kitなるものが出てるがどうなんだろ？
パンフ見てたら、すげー効率いいよ、って謳ってるんだが。

マウスの生前の姿を撮影しておき，
学内で発表するときは必ず”生前の姿です”といって紹介する．

>>40
あなた2ちゃんねらーだったんですね。

A付加の話が出てますがブラントで入れたら何かまずいんですか?

ブラントで入れても何もまずいことが無いのにみんなが気がつくと、
TAクローニング用ベクターの売れ行きが悪くなるのでまずいんです。

>>42
ちゃんと入るならブラントで十分。なかなか入らないからTA使って
るだけ。

ブラントの方が実ははいる効率いいんだけどな

T/AのTってちっこい粘着末端であると同時にベクターがセルフライゲート
しないように付けてあるんでしょ。

じゃブラントでやってるヒトって、SAPとかCIAP処理して、PCR産物は
5'-リン酸化してってやってるんですか？
T/Aベクター作る方が楽なような気がするんですが。

>>45
＞ブラントの方が実ははいる効率いいんだけどな
今まで比較実験したことないけど、そうなんですか？
ブラントで苦しんだことあるんで、なんか信じられないんですが。
なんかコツとかライゲーション・バッファーの特別なレシピみたいなもんが
あれば教えて下せえ。

>>40-41
なんか面白い。
どこの学会なんだろ？（藁

>>46
ベクターのＣＩＰ処理はするけど、インサートはそのまま。
ブラントのほうがラク。

>>47
高い金使ってプライマーにリン酸付加しておくのか、
プライマーやPCR産物に自分でリン酸付加するのかドッチなんだ？

それとも勘違いか、知ったかぶりか？

>>48
どう考えてもお前がバカ。

>>48

実際にサブクローニングしたことあるのですか？

47のインサートはＰＣＲ産物じゃないんでしょ

どういうケースでブラントの方が効率良くなるの？？
まじで教えて！！

とにかくよくわからんが
タカラのＢＫＬキットを使ったら
出てきたコロニーを数えるのに小一時間（以下略）

ああ、きっとね。長さ、短いでしょ。
それなら沢山はいるよ。

　表面的な大人しさ（偽善）に騙されるな！
A型の特徴

●とにかく気が小さい
●ストレスを溜め込んでは、キレて関係ない人間を巻き添えにして暴れまくる
●自尊心が異常に強く、自分が馬鹿にされると怒るくせに平気で他人を馬鹿にしようとする
●他人の忠告を受け入れない、反省できない、学習能力がない（自分の筋を無理にでも通そうとするため）
●「常識、常識」と口うるさいが、実はA型の常識はピントがズレまくっている（日本の常識は世界の非常識）
●権力、強者（警察、暴走族…ｅｔｃ）に弱く、弱者には威張り散らす
●あら探しだけは名人級（例え10の長所があってもほめることをせず、たった１つの短所を見つけてはけなす）
●基本的に悲観主義でマイナス思考に支配されているため、根が暗くうっとうしい
●一人では何もできない、女は連れションが大好き（群れでしか行動できないヘタレ）
●多数派（注・日本では）であることをいいことに、少数派を馬鹿にする、排斥する
●異質、異文化を排斥する
●集団いじめのパイオニア＆天才
●悪口、陰口が大好き
●他人からどう見られているか、体裁をいつも気にしている
●ＤＶ夫が多い
●自分の感情をうまく表現できず、コミュニケーション能力に乏しい（知障に限りなく近い）
●頑固で融通(応用）が利かず、表面上意気投合しているようで、腹の中は各自バラバラ
●人を信じられず、疑い深い
●自分は常に自己抑制しているもんだから、自由に見える人間に嫉妬し足を引っ張ろうとする
●おまけに執念深くしつこい（「一生恨みます」タイプ）
●自分に甘く他人に厳しい（冷酷）
●要するに女々しい、あるいは女の腐ったみたいなやつが多い

>>53 これ？
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0284
PCRとライゲーションの試薬が動いているならあと要るのはT4 DNA pol.だけかと。
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0152
安いし。

これ
http://bio.takara.co.jp/catalog/Catalog_d.asp?C_ID=C1038

ＰＣＲとライゲーションの試薬が動いてるならあと要るのは
リン酸化でしょ
というわけでＴ４ポリメラーゼじゃなくてＴ４キナーゼ

>>58
あのなあ。
さっきからアホな事書いてる奴は同一人物か？
プライマーリン酸化とか。
宝のブラントやりゃリン酸化いらないんだけど

T4ポリメラーゼ->ブラントライゲーションは、切り口の違う制限酵素サイトを
つなぐのに普段使っているんですが、ブラントにしてCIAPしたベクターを大量に
作って小分けに凍らせておいたら、まさかTAベクターいらな……
Taq系とPfu系のPCR産物をブラントでつなぐのに、インサートがわに必要な処理に
ついてマジレスお願いします！
プロメガには言いませんから！！

ん？　ここってこだわりを語るスレなのでつか？

>>60
Taq系ならfill inして5'-リン酸化。Pfu系なら5'-リン酸化でしょう。
でも私はpGEM-TやoGEM-T/Easyの青コロニーをつついて
ccベクターを取ってきてEcoRV消化後dTTPでTaq反応行なわせて
自己生産しています。
ここぞと言うときだけTopo T/A cloning。

TA TOPOやるくらいなら
Blunt TOPOつかう

リン酸化って必要なのですか・・・・
私はブルースクリプトのSmaIサイトに、Pfuでつくった
フラグメントをそのままライゲーションしてるけど・・。

>64
SmaIカットしたベクターをCIP処理していなければ大丈夫です。
もししていたら、リン酸基がベクターとインサート両方にないことになるので、
理論上はligateされません。
PCR primerが5'phosphate処理したものを使っていれば大丈夫ですが. . .。

ってかベクターBAPかけてても普通にはいるし

>66
すいませんが教えてくださいです。
BAPかけたブラントのベクターとリン酸化してないPCR産物
どうやったら普通にはいりますか？
ベクターとインサートの量比とか
特別なライゲーションのテクニックがあったら教えてくださいです。

>66
BAPのかかり方がいまいちなんだよ。だから入る。

http://fry.to/kokoro

ということは
ちょうどいいぐらいに中途半端なBAPのかけ方があるんでつか？

ごめんなさい。酔っぱらってかいたネタです

＞６７
PCR断片の末端をきれいにしてやればいいでしょう（Polishing）。
PCRの反応液50ul当たり
0.5ulの10mM dNTPと１ulの1mM ATP、
0.5ulのT4 DNApol(NEB)と0.5ulのT4 polynucleotide kinase(NEB)を加えて、
室温で１５分→DNA精製→ligation
これで失敗したこと無い。
あ。ベクターはEcoRVで切ったpBluescriptIIを良く使います。

それはひょっとして
PCR反応液のバッファがそのまま
T4Polとキナーゼのバッファにもなってるってことすか？
そういう場合，あらためてdNTPを入れるのは念のため？

T4DNApolについては
http://www.neb.com/neb/products/polymerases/203.html
T4 DNA Polymerase is active in any 1X NEB restriction enzyme reaction
buffer and T4 DNA Ligase reaction buffer when supplemented with dNTPs.
T4PNKについては
http://www.neb.com/neb/products/mod_enzymes/201.html
This buffer is suitable for forward reactions, but for the purpose of
radiolabeling does not contain ATP. For nonradioactive phosphorylation,
supplement to a final ATP concentration of 1 mM or use T4 DNA Ligase
Reaction Buffer (see notes).

T4 DNA Ligase(NEB)を買うとBufferがめちゃくちゃたくさんついてくる。
しかもATP添加済み。これ最強。
しかしDTT濃度がやたら高かったような気がする。上記の用途に問題ないのか？
そんなことも覚束ない俺はタカラのブラントカイネーションキットでも買って
なさいってこった。

シークエンスリアクションは薄め液を使う。

ふつうのPCR Bufferで薄める。

（＾＾）

（＾＾）

>>76
それじゃいつものPCR用のバッファが足りなくなるじゃん
ｐＨも低いしな

sigmaの薄め液で薄める

鬼の居ぬ間に実験。

（＾＾）

>37
KOD Plus使ったのにmutation入りました。
俺の腕がmutagenなのか。

>83
はいるよ、そりゃ。

（＾＾）

　　 ∧＿∧
　　（　　＾＾ ）＜ ぬるぽ（＾＾）

組織からの細胞分離は「２回洗え」と言われたら５回洗う｡

人から聞いたプロトコールは、真に受けない。

寒天は自分で畑で育てたものしか
使わない。

　 ∧＿∧　　　　http://togoshi.ginza.st/hiroyuki/
　（　・∀・）/＜　こんなの有ったっち♪
http://togoshi.ginza.st/hiroyuki/2ch01.html
http://www.togoshi.ginza.st/hiroyuki/2ch09.html
http://togoshi.ginza.st/hiroyuki/2ch05.html
http://www.togoshi.ginza.st/hiroyuki/2chz08.html
http://togoshi.ginza.st/hiroyuki/2ch06.html
http://www.togoshi.ginza.st/hiroyuki/2ch10.html
http://togoshi.ginza.st/hiroyuki/2ch04.html
http://www.togoshi.ginza.st/hiroyuki/2ch03.html
http://togoshi.ginza.st/hiroyuki/2ch02.html
http://www.togoshi.ginza.st/hiroyuki/2ch07.html

をい、寒天の原料は紅藻テングサだぞ

>>89　はどの部分がネタでどの部分がマジなのかが気になるｗ

ゲルライトとか、ゲランガムって原料はなんですか？

━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

　＜アスペルガー症候群（自閉症スペクトラム）←脳の機能的疾患（遺伝が要因）＞
http://www.ypdc.net/asuperugar.htm
http://www.autism.jp/l-02-03-aspe3.htm
http://www.geocities.co.jp/Beautycare/5917/as/
●接し方のルールがわからず無邪気に周囲の人に対して迷惑なことをしてしまうこと
がある。人を傷つけるということには鈍感です。年配の先生に向かって「おばあさん
先生おはようございます」と明るい大声で挨拶する生徒もいる。こういった言動をす
る場合にも彼らには悪意はない。
●小さな声でひとり言を言ったり、考えていることを声に出して言うことがある。
●融通が利かないことも学校生活で問題になる。時間割の変更や突然の教師の欠勤と
いう事態で不安を感じたりかんしゃくをおこしたりする。あまりに規則に厳格なため
に、遅刻した同級生に延々と注意をしたり、修学旅行などで消灯時間をかたくなに守
り、他の生徒のヒンシュクをかったりすることがある。
●行動･興味･活動のパターンが貧困で反復常同的なことも自閉症の特徴である。すな
わち、日常の活動の様々な面にわたって柔軟性のないルーティン（決まった手順や日課）
を押しつける傾向、これを慣れ親しんでいる習慣や遊びのパターンだけでなく、たいてい
は新しい活動にも押しつける。そしてルーティンや個人的な環境の細部の変化（家の中の
置物や家具の移動によるなど）に対する抵抗がみられることがある。
●揺れる木の葉を見続ける子どもは興味のレパートリーが狭いとも言え、視覚的な敏感さ
があるといっても良い。
●精神遅滞を伴うものと伴わないもので大きく分かれる。１００％果汁のオレンジジュー
スを思い浮かべてください。それにだんだん水を加えて薄めて行くと終いには水にごく近
くなる。一口飲んで「オレンジジュースだ！」とわかるものは自閉症、水に近いけれどな
にかオレンジの味が混じっているのがアスペや高機能・・。その濃度はさまざま。濃いオ
レンジジュースであったとしても早期の療育や周りの対応によって水に近づいていくこと
は可能。しかし間違えてはいけないのはオレンジジュースが一滴でも落ちている場合は
「純粋な水」にはなれないのです。

　　　 　∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　(　　＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣〕
　　＝ ◎――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉

ryou-slay

大は小を兼ねる！

100　ゲット！

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

扱ってる菌のことを「うちの子」と呼ぶ。

　　　 (⌒V⌒)
　　　│ ＾ ＾ │＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　⊂|　　　　|つ
　　　（＿）（＿）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎パン

RI実験で手袋をしない

ageとくか

>103
同様に、培養させている細胞のことを「ｳﾁの○○」と呼ぶ。

RNA実験で手袋をしない

もちろんアクリル板のプロテクタなんて不要
手も洗わない

ＲＮＡ実験では必要ない罠ｗ

ﾏｼﾞで？？！！

手は洗えよ