ウエスたん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ﾊｧﾊｧ

同調ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

実にくやしいと言わざるを得ないが、スレのタイトル見てwarata

チビたん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

カルシにゅうりん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

……トリス…トリシン…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

プローブ　→　処女に挿入したペニス
ブロット　→　パンティのしみ

マイ子たん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

オステオぽんちん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ドビュッキュキュリン…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

マラ痒いーとグリーン…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

イ、インサート？？…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

え？ＳＭ？！…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

す、吸い出す？！…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ちゅ、注入？！…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

TransFac ト、トランス　ファック？！…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

せ、接合？！…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`) 　　　　　　　　　　

免チン？！…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`) 　　　　　　　　　　

オルガナイザー…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ピュペット…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

セントリフーガルマシーン、全撮りフードルまじー？！…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

Ｎ末たん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

Ｃ末たん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

5'末たん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
3'末たん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

アミノさん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ミューたん･･･じい････ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

はじめて5'RACEを見たとき、5'RAPEに見えてどっきりした･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

エッチブロ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

フェラール･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

クロロホルム･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

トルエン･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

Purinpurin
Churyuchuryu
Rorirori ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ロサルたん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

エたん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

プリン･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ピル　ビン　さ　ん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

すぐレイパー･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

NatureとかのABの広告に出てるお姉さん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

DNAマイクロアレイプ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

リンゴさん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д

FACS･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

フマルさん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

奈良先たん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

PNAS、ペニス･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

マンコプラズマ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

理系女･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

だれてきてるぞヽ(`Д´)ﾉ 　ゴルァ

ウエストウエスたん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ファーウエスたん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

サウスウェスたん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ゆび　き　ちん　･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

アフガニスたん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ダーマ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

2P･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

10P･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

100P･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

なんだい、そりゃ？

マ　　　　　　ップカイネス･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

RNA愛･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

マン　ノース･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ピ　　　　ペッティング･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ゴミのようなネタも多いが、傑作と評価できる作品もいくつか見出される。
生物板でのみ可能なネタの数々は、その新規性ゆえ、後世に記憶されるべきである。
名作と思われるのはこの辺。

>1　ウエスたん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
>5　カルシにゅうりん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
>11　マラ痒いーとグリーン…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
>22-24　Ｎ末たん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)　以下、Ｃ末端、5'、3'の類似作品連続投稿行為。
>25　アミノさん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
>54-57　2P･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)　以下、57のツッコミまで含めて評価。
>61　ピ　　　　ペッティング･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

乳ロン･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

オッ NALGEN･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

キムワイフ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

チッ　間違った。
NALGENE　だった。

ふぇらシアン化かりウム･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ユビキちん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ふぇらチオ硫酸ナトリウム･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

そ、挿入配列･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

hungtinちん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/dispomim.cgi?id=143100

キ、キちん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
キ、キトたん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

絡む･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

スフェラプラスト･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

アクちん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

穴ふぇらキシー･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

フェラチン･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

　　淫イオン･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

FUKUちん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/dispomim.cgi?id=253800

カル勃起キシル基･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

backcross＝バック交配･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

まんまやん

>>80
カリ勃起汁気…（´д｀；）ﾊｧﾊｧ

遮精板･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

グリセロール密度後背位･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

スピードバック･･･こ、高速バック突き？！･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ラテックスゴム？！･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ローター･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ニップル・･・ﾊｧﾊｧ（；＊´Д｀）

>88 ローター

藁た。

インポ　　　ーチン･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

　　　　　　　　　　ぢゃなくて萎えか？

接合レ（ン）ズ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ヌードマウス･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ブルセラ 菌･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

イー こり ﾊｧﾊｧ

SM AD ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

陰圧･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

えぇどぉぉ…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

活気ないね。そろそろまとめに入る？

膣スミア･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

エチ、Ｈ風呂･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

淫靡ボ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

>>100
既出です。>>28　失格。

あ　クチ　ビンビン･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

近交系ボ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

>>104 ボは間違い　鬱氏

>>62
そろそろ評価しろやー

Editorial policies and practices: Instructions to Authors

評価基準を明確にせよとの多くの投書が編集部に寄せられた。以下に、declineの
可能性の高い数例を引いたので、General criteriaのガイドラインとされたい。

>免チン？！…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`) 　　　　　　　　　
>マンコプラズマ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
今どき小学生でも反応しないマンだのチンだのといった配列を含む
モチーフだけでは、scientificなオリジナリティがあるとは認められない。

>アフガニスたん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
本ジャーナルは分子生物学一般を扱うが、いわゆる広義の生物学（博物学・行動生態学・
心理学等）は審査の対象外である。社会科学・計量経済学等に関しても、特に
分子生物学との関連が示されない限り、考慮されない。

>乳ロン･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
特に乳関係については、理系全般板の「巨乳発電所」スレの強力なネタの数々を
熟読の上、投稿前にオリジナリティを自身で判断して欲しい。競合の激しい分野を
あえて避けることも、戦略として有効である。

>オッ NALGEN･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
>チッ　間違った。
>NALGENE　だった。
著者らは投稿前に十分時間をかけて原稿をチェックし、publication quality and
free of errorsを心がけるべきである。

>ヌードマウス･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
観察材料に対してbiologicalなanalysisが行われていない。
（要するに元ネタそのままでﾊｧﾊｧできるものは対象外）

>セントリフーガルマシーン、全撮りフードルまじー？！…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
必ずしも必須ではないが、ネタは可能な限りself-explanatoryであるべきである。

>エチ、Ｈ風呂･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
>既出です。>>28　失格。
指摘の通り、著者らは類似の過去文献を精査すること。すでに報告されている結果の
追試は考慮されない。

著者らは以上の点を考慮の上、よりspecificなジャーナルに再投稿すべきである。

つーか、上の書き込み自体が、論文査読を元にしたネタなので、
悪例として参照された人、どうか気にしないでね。

それにしても、「よりspecificなジャーナルに再投稿」・・・何度
見てもヤなフレーズだ。

ワラタヨ
でもreviewerよりeditorかeditorialsの方が良いかも

>>101
This manuscript is potentially of high interest.
However, it is a little bit preliminary.
Addition of data of in vitro experiments would greatly improve
the quality of this manuscript.…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ﾊｧﾊｧ(;*´Д`), ｱｩｱｩ(;*´Д`), ﾋｨﾋｨ(;*´Д`)
* these authors contributed equally to this work.

ﾋﾟﾝｿﾞﾛ! ﾜｹﾜｶﾝﾈｴｮ!

ヘリックス・たぁん･ﾍﾘｸｽ･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

Σ(n,i=1),(Xi-X)/(n-1)。。。標準分さん･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
標準偏さん。。。以下略
標準誤さん。。。以下略

エクース線・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

沈降計数...ちんこケース・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ロータリー・・ロリータ…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

トリス・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

カル ぱくチン

スーパー姉ちゃんと..

オーラルセッション・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

むちん ﾊｱﾊｱ

裏汁・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

土手汁・・・硫酸Na・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ミエりん・・・ﾁｮﾄ歳ﾀﾞｹﾄﾞ・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

淫手リン・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

テクニシャン・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

※うちのラボはテクニシャンの女の子が・・・と工学部の奴に話したら
　むっちゃ興奮されてしまいました

ｼﾅ ぷす ﾊｱﾊｱ

発現パたん …ﾊｱﾊｱ

ストリーキング・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

異様な盛り上がりを見せたこのスレも、もう終焉か？

セックスリーサル　......ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

バ　　　ンコマイシン・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

自淫・とぅー・せるず…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

アドレナりん…ﾊｱﾊｱ

ｺﾞﾙｧｰ!! ｹﾞﾝ・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ペグちん…ﾊｧﾊｧ

X-gal xxx-ギャル・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

メスシリ ﾝダー・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ア・・アナライズ・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

淫ﾊﾟｸｯとfuckだ−・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

身お黒ビン・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

フェーラ細胞・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

グリ　あ。・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ナ・・ナース細胞・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ドエッチマン博士・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

グリセリン・・・注射器・・・陰圧・・・カップリング・・・ﾊｧﾊｧ
　　　　　　　　　　　　　　∧ 　　　　　　　　　　　∧
　　　　　　　　　　　　 　/　・　　　　　　　　　　　/　';,
　　　　　　　　　　　　. /　　';　　　　　　　　　　./　　';
　　　　　　　　　　　　/　　　；＿＿＿＿＿＿/　　　；
　　　　　　　　　　／　　　　　　　　　　　　　　　　　　＼
　　　　　　　　 ／　　　 ／　　　　　　　　　　＼　　　　　＼
　　　　　　　 /´　　　　　　　|＿＿＿＿|　　　　　　　　　　｜
　　　　　　　 | 　///// 　　 |　　　　　| 　　　/////　　　 ｜
　　　　　　　｜　　　　　　　 .| 　　　　|　　　　　　　　　　　｜
　　　　　　　 |　　　　　　　　 |　　　　|　　　　　　　　　　　｜
　　　　　　　　|　　　　　　　　'; 　　 /　　　　　　　　　　　／
　　　　　　　　 ＼　　　　　　　 ＼／　　　　　　　　..　／
　　　　　　　 　　　ヽ　　　　　　　　　　　　　........:::::::＜

Sm（すとれぷとまいしん）ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

陰毛タライズ・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

グチャグチャにしてやった。
今は「熱いよう、臭いよう」とか言っている。わがままな子だ。少しずつ進めていこう。
↓
電極挿してみたら何か泡吹いていたけど、アレが少しずつ開いているのがわかる。体は正直だ。
↓
優しく強く、ぎゅっとはさんであげたあと、また電気。アメと鞭ってやつですな。
↓
白い液体をぶっかけてやった。少し濃いな。
↓
放置プレイと反復動作(wを繰り返す。
↓
何も反応が無い。また明日新しいの採ってこよう。

ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

忘れてました。

パンチ・ライン
パンチラ・イン！

>>150
本当は何やってたの？

boke! >>1

ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
米倉涼子イイ!

ちょっと惜しいけど、ネタもきれたようだし、倉庫でいいかな？

アナル　バイオケミストリ−　ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

fusion protein　ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

か、活性たん・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

Ｎｅｕｒｉｎ・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

>>160
□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□
□□□□■□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■□□□□□□
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□□■■■■■□□□■□□■□□■□□□■□□■□■□□□□□■□□□■□□□■□□
□□□□■□□□□□■□□■□□■■■■■□□■□■□□□□□■□□□■□□□■□□
□□□□■□□□□■□□□■□□■□□□■□□■□■□□□□□■□□□■□□□■□□
□■■■■■■□■□□■■□□□■■■■■□■■■■■■□□□■■■■■■■■■□□
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□□■□■□□□□■■■■■□□■□□□□□□□■■□□□□□□□□□■□□□□□□
□□■□■■■□□■□□□■□□■□□■□□□■□■□□□□■□□□□■□□□□■□
□□■□■□□□□■□□□■□□■□□■■□□■□■□□□□■□□□□■□□□□■□
□□■□■□□□□■■■■■□□■■■□■□■□□■□■□□■□□□□■□□□□■□
□■□■■□□□□□□□□□□■■□□□□■□□□■□■□□■□□□□■□□□□■□
□■□□□■■■■■■■■■□□□□□□■□□□□■■■□□■■■■■■■■■■■□
□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□

あ、コノスレまだ有った。
最初の方で10コくらい（ノミネートはカルシにゅうりんだけ）連発したら
150くらいまですぐ伸びて感動したよ。ありがとう、みんな。
そしてさようなら。

あげ

さるべーじ

age

イースタン…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
（eastern blotting …　アメリカでは昔カンニングの意味で使っていた）
微妙だな。

パイオ淫フォ…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
先人の知恵には、かなわなかった。

ﾜﾗﾀ age

シクロペンたん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

50ml tubeﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

蝋燭は、燃え尽きる瞬間、狂おしく炎をあげる

　エッチブロはぁはぁ

エンド斎藤死す。

今日からここは真面目にウエスたんについて語るスレになります

>>174
それもいいかもしれない。

では早速、サンプリング編↓

では早速、ロード編↓

>>177
おいおい・・・

ジスカールデスたんﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

サンプリングの時どのくらい（種類）
プロテアーゼインヒビター入れてる？

＞１８０
いっぱい

手持ちの全部。
まあ、おまじないと民間伝承の最たるもんだ。

史上最強のライセートバッファーって何だと思いますか？

正直、細胞内の事象でヌケと言われたら何でヌク？
漏れはそーね・・・、ホリデージャンクションかな？

ぶっちぎりでsmooth endoplasmic reticulum

>>183
グアニジンチオシアネート
抗原性もぶっ壊れるほど最強。

>>186
まるでホルマリンみたいだな

>186
それでいて免沈可能、とかだったらかなり摩訶不思議だが(w

スペルミジンﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

じゃああえて買い足したりすることは
よほどのことがない限りしないのか

>190
わてのことかい?

うん、もちろん初めてのプロトコールで指定があれば買ってでも入れるけど、
基本的に定番レシピを入れることでおまじないとしてる。
やってみてダメならそこでいろいろ試すのは悪くないと思うけど、経験上
インヒビターをいじりまわすよりメソッドを見直した方が良いことが多いです。

どう見てもスレ違いなのでsage

>>191
174以降はよりよいウエスたんについて語ることになったのでOK

トリスたんﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

説明するが、トリスたんは粒子加速器なので板違いだ。
ﾊｧﾊｧするなとは言わんが。

>>191
見直したことがあるメソッドってどのへん？

>>193
時代オクレ

タグつきのやつってバンドたくさん出るよね。
何とかならないかなぁ？

動物と植物でサンプリングに差はある？

>195
いやもう、温度やら時間やらpHやら界面活性剤や塩の種類と濃度やら
上げたらきりがないですだ。

そして完成した極上のレシピおせーて

おせーて

トリスたん　と　いぞるで

ウエスたん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

レシピ！

>>200=>>201=>>204
こじゃれたジョークで皆を爆笑させてみろ。
そしたら教えてあげるん。

わたしのファルコン(50ml)。

。。。。。

その前に199＝205だという証拠が・・

同意

ミニゲルでリン酸化アッセイできる？

ポール・ナース　ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

>210
できるでしょ、当然。
系が上手くいってなければ何やっても見えないのは経験者が一番良くわかってる・・・。

>>212
具体的におながいしまつ

>213
ゲルだけが問題ならとりあえずやってみるのが良いと思います。

ありがとうございます

ageeeeeeeeee

>>214
できました

おめでとう!!

あ、iNOS(愛の巣）ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

こんな懐かしいスレ上げてるのは誰だ?

>220 お前だ
こっそりとウェスタンスレとして再利用されています。

じゃあ真面目にウェスﾀﾝを語ってみよう。

抗HA(Y11)ﾊｧﾊｧ。

>>222
HAの12CA何とかってどうゆう意味なの？

>223
同じHAでも免疫時に使ったエピトープが違うのでそれを各メーカーが名づけている。
ポリクロならペプチドの番号とか。
モノクロならクローン番号をつけたりする。
Y11はラビットポリクロ、12CA5はマウスモノクロだ。
詳しくはカタログ見れ。

あげてみるか。

トランスファーするときのバッファーってどんなの使ってる？
トリスとグリシンとメタノールだけ？
SDSいれると効率上がるっていう話もあるけど。

SDS入れても変わらないよ
むしろ泡ができやすくなって転写ミスする罠

PVDF ならmethanolないほうが（・∀・）ｲｲ!! かも。
理屈上はSDS入れたほうが転写は早くなる。
私は3段重ねbuffer使ってるけど、一種類のバッファーでも
微妙なことするんじゃなければ大して変わらんような気もする（セミドライの話）。
まじめに比較したことはないけどな。

そもそも、ＰＶＤＦのほうが良かったという思いをした事が一度も無い。
結局今でもニトロ。

うちはwetです。1Lに10%SDSを1mL。おまじないみたいなもの。

転写後のゲルを染めてみたことあります？うちは大量発現なんですが
目的タンパク質だけが選択的・定量的に染まっておもしろいです。
（転写前はあまり染まらない）

>>230
それはつまり、大量発現の蛋白は桁違いに大量にある、ということ？

>>231 そんなにたくさんあるようにはみえないんですけどね（苦笑）
転写中に巻戻ってる、とか妄想してみたり……

セミドライか。。。うちはでかい蛋白（100以上）なので使えないなぁ。

>>230
転写後のゲルに残っていていいのか？
そのぐらい大量ということだろうが。
むかし学生実習では転写後のメンブレンをポンソー染色していた気がする。
抗体反応を妨げない染色って他に何がある？

>>234
でも、ゲルに残らなくなるまで
長時間トランスファーするのも問題あったりしないか？

>>235
ニトロセルロースだと抜けるかな？
2枚重ねるとか、PVDFだと抜けにくいとか聞いたような。

>>235
セミドライだと焦げるらしいな

コールドルームでやれば蝉ドライでもＯＫ

普通の部屋でセミドライo/nやっても大丈夫だよ。
200k以上でもきちんと移る。

>>239　バッファー・電流など、ぜひそのときの条件が知りたい！

厳密な条件はすぐには分からんけど、特殊なバッファーとかではないと思う。
トリスとグリシンとメタノールとSDSが入ってる普通のバッファー。
ゲルとPVDFmembrane重ねたものをバッファーでびちょびちょにしたろ紙で挟んで、
1平方センチあたり0.5mアンペアで流せばo/nでやっても発熱しない。
250kのマーカーも全てきっちりと移る。

>>241　せっかく教えてもらったものの、実はセミドライの装置自体が
今ない＆ほとんど経験がない。
バッファーを大量に使うタンク型は、これからは嫌がられるんだろうか。
メタノール入りの廃液はほんとは流しちゃいけないとか聞いた気もするし。

　まじめにウェスタンの話をしているところを申し訳ないが、
このスレで落とすわけにはいかないものが残ってる

　少女奪え…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

セミドライの装置はバイオラドのでいいんじゃない。
値段も手頃だし。
バッファーはろ紙にしみ込んでるので「可燃物」処理で廃液はゼロ！

ばふぁなんて水道に流してるが…いかんのか？

> きわは、阪大の研究室に竹村を訪ねる。竹村は助手の早坂と猩々蝿を飼育して
> 遺伝学の研究に没頭している。顕微鏡で見た猩々蝿の燃えるような緋の色が
> 鮮やかにきわの眼にやきついた。

> 猩々は、映画｢もののけ姫｣の中に描かれている猿｢ショウジョウ｣で、中国の伝説
> 上の生き物といわれています。 又、猩々は大形の類人猿であるオラン・ウータン
> の俗称を指すとも言われています。
> ｢広辞苑（岩波書店｢｣には、「人に似て体は狗の如く、声は小児の如く、毛長く、
> その毛色は朱紅色で、面貌は人に類し、よく人語を解し、酒を好む」とあり、
> この伝説上の動物の血は地上で最も赤いと言われるところから､この血の色に
> なぞらえて､真っ赤な緋色を｢猩々緋｣と呼んだのです。

よって、(;*´Д`)←この状態が猩々。

> 　また、赤褐色は猩猩の血で染めた色と言われ、「猩々緋」と呼ばれた。
> 赤褐色の葉や花を持つ「猩々木」「猩々草」、鮮血色の美しい「猩々蝦」
> などの派生語がある。更に、酒や甘味に群がる習性のある蝿は「猩々蝿」
> と名付けられ、酒豪の人を赤ら顔にたとえて「猩々」と呼ぶ風習もある。

http://www.aii.co.jp/contents/movie-sl/_data/daiei/movie/entry/0205006.html
http://www.h2.dion.ne.jp/~kuro-be/moji/aka.htm
http://ghibli-fc.net/rabo/monoke_yo/yomitoku30.html

【あらすじ】　京都の堀川の東一帯に、京都大学の研究所が立ち並んでいる（適当）。
ひっそりした建物を表から眺めても、何をテーマにしているラボかわかりにくいのだが、
裏側から見れば、どの研究室のＸＸにもＸＸＸＸがあって、何十ＸＸものＸＸＸが常に
ＸＸＸているのだった。「丸由研」と屋号を名乗る舟木由次郎（東野英治郎）のラボも
この研究所の一角にある。由次郎はもう定年、講師のみつ（橘公子）とはIFが三十も
違い、今では助手のきわ（山本富士子）が研究室の中心となって、「ウエスタン
ブロッティング」に老教授をしのぐ腕をみせている（意味不明）。
　海外留学に行くポスドクの美代と夫の清吉を京都駅に送っていった帰途、きわは学会
会場に立ち寄った。大学院生の岡本五郎（川崎敬三）が「フォトレタッチングによる
ウエスタンブロットの恣意的解釈」と題してきわとの共同研究を発表していたからだ
（やめとけ）。岡本はきわに好意を　ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)　寄せていた。

　きわは、インディペンデントポジションを某利権関係の研究所に得たいと思った。
しかし、話はなかなか困難である。たまたまそれを知った所長（小沢栄）はきわの美貌
に心を動かし、主任研究員のポストを任期付きで提供することを約束するが、とかく
嫉妬丸出しの2chネラの目がうるさくて仕方がない。
　同じ頃、きわは奈良先端大に一日を過して、学生のあつ子と共に桜を見ていた阪大教授
の竹村幸夫（上原謙）を知った。それ以来きわは、いつしか自分が目的のバンドを好んで
エンハンスしたりしていることを知って驚くのだった。
　学生が鬱で休みがちになる新緑五月、きわは堀川の研究室を訪れた竹村を見て、喜びの
頬を輝かす。二人は市内を散策したが、きわは竹村と別れがたい気持ちになるのだった。

　きわは、阪大の研究室に竹村を訪ねる。竹村は助手の早坂と猩々蝿を飼育して遺伝学の
研究に没頭している。顕微鏡で見た猩々蝿の燃えるような緋の色が鮮やかにきわの眼に
やきついた。
　競争相手の留学帰り大沢はつ子と競って、きわは所長の紹介で某○権進出にも成功する
（今さら伏字）。Ｍ某ジャーナルの表紙に掲載したきわのFigure?は燃えるような猩々蝿を
一面に散らしたものだった。
　一方、竹村は飼育室のミスから、せっかく発見した猩々蝿を全滅させてしまう。もはや、
竹村の心の痛みはきわ自身の痛みでもあった。
　○権の新人の歓迎会でしつように迫る所長から逃れたきわは、友達の官田満の経営する
日系バイヲテクのセミナーで竹村と会う。竹村は岡山の大学にかわるというのだった。
その夜、二人は結ばれた　ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)　。

　きわに心を寄せる岡本は、捏造はヤバいですよと今さらながら忠告する。怒りを
浮かべるきわに、岡本は「僕はあなたを尊敬しているんです。これ以上下の人を苦しめ
ないで下さい」と叫ぶのだった。
　数日後、竹村の学生あつ子から、竹村のやり方もかなりヤバいらしいことを聞いた。
捏造の件を忘れたいと願う一方で、竹村への思慕も抑えきれなくなっていた。
　大阪へ用事でやってきたきわは、そのまま梅田駅から京都へ帰るつもりでいたのだが、
いつのまにか阪大へとハイヤーを走らせていた。きわは、竹村と白浜へ行った。そこへ、
大阪から電話があり、竹村の論文の受理取消が知らされた。

　竹村の捏造は晒された。喪服に身を包んで大阪へ告別式にでかけたきわは、
「次はお前の番だ。待っていてくれ」と言った白浜での竹村の言葉を思い出していた。
不幸な女の破滅を誰かが2chで望んでいるのではないだろうか。何という残酷な言葉。
うちは違う！うちは違う！きわは泣きながら、心の中で叫びつづけるのだった・・・。

http://ime.nu/www.aii.co.jp/contents/movie-sl/_data/daiei/movie/entry/0205006.html

『夜の河』（1956年　カラー作品）
行く人への想いをこめて、とめどなく流れる七彩の夜の河、暮れゆく春の
女ごころがしのび泣く。
諦めは慕情をつのり、その恋のはかなさ故に忘れんとして想い出は更に深まる！
京の都の夜を染めて、燃えるは大文字山の送り火か、
美貌の肌に映える灯影も妖しく今宵恋のいのちを燃えつくす女を、
哀れにも美しく描く総天然色文芸巨編！

山本富士子の代表作です。原作は、沢野久雄の「夜の河」。結婚もしないで
仕事に打ち込む京染め屋の娘・きわと、病弱の妻を持つ大学教授・竹村との
美しくもはかない恋の物語です。この作品では、単なる「天然色」としての
カラー映画ではなく、芸術家のような「色」の表現が模索されています。
グレーを基調としたトーンの中にあらわれる主人公の衣装のさまざまな色の
バリエーション、フレームに切り取られる京染めものなどのさまざまな事物
の色がアクセントとして生きてくる、という意欲的な作品です。

￣￣￣￣￣￣￣○￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
　　　　　　　　　　　O 。
　　　　　　　　　　　　　　　　 , ─ヽ
＿＿＿＿＿＿＿＿　　　　/,/＼ヾ＼ 　　／￣￣￣￣￣￣￣￣￣
|＿＿|＿＿|＿＿|＿　　 __（（´∀｀＼　）＜　というお話だったのサ
|＿|＿＿|＿＿|＿＿　／ノへゝ/''' 　)ヽ　　＼＿＿＿＿＿＿＿＿＿
||＿＿|　　　　　　　 | | ＼´-｀）　/　丿/
|＿|＿|　从.从从　　| ＼__￣￣⊂|丿/
|＿＿|| 从人人从.　|　/＼＿＿/::::::|||
|＿|＿|／//ヽヾ＼　 /　　　::::::::::::ゝ/||
────────(~〜ヽ::::::::::::|／　　　　　　　　＝完 ＝

　　メタノール入りの大量のバッファーは
　　普通に水道に流してよいんだろうか…
＼　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　／
　 ￣￣￣￣￣￣○￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣　
　　　　　　　　　　　O　
　　　　　　　　　　　　O　　　 , ─ヽ
＿＿＿＿＿＿＿＿　゜　　/,/＼ヾ＼ 　　／￣￣￣￣￣￣￣￣￣
|＿＿|＿＿|＿＿|＿　　 __（（´Д｀*;　）＜　ご意見お待ちしております
|＿|＿＿|＿＿|＿＿　／ノへゝ/''' 　)ヽ　　＼＿＿＿＿＿＿＿＿＿
||＿＿|　　　　　　　 | | ＼´ё｀）　/　丿/
|＿|＿|　从.从从　　| ＼__￣￣⊂|丿/
|＿＿|| 从人人从.　|　/＼＿＿/::::::|||
|＿|＿|／//ヽヾ＼　 /　　　::::::::::::ゝ/||
────────(~〜ヽ::::::::::::|／　　＝ つづく ＝

http://www.j-shiyaku.or.jp/home/anzen/meoh.pdf
活性汚泥法
メタノールを含む排水は、活性汚泥等の処理により清浄にしてから排出する。
だそうですが……

大きなのっぽのガラス板、シーケンスゲルの遺産。

運悪く水質検査の日にあたらないことを祈りながら流す

チビタン…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

>>259
顕著に既出

活性炭でトラップを作って容器に貯めておけば、と思ったら、
一年ぐらいも前に既出でした。

159 ：名無しゲノムのクローンさん ：01/12/26 00:44
か、活性たん・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

SDSやトリスの廃液水質基準はどうなんでしょう。

　岡田英子さん（仮名）を忘れてないか

　オカダ酸　ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
　エイコ酸　ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

>>61

　英語風に発音した方が気分出るよ

　パイ　ペッティング･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

で、ECLって最強？

>>265
ECLにも色々あるよね。定量性に優れたやつとか、ひたすら高感度のやつとか。

ECL plus ってどうですか？
ECL並盛の箱に、宣伝のカードがひたすら入っていたのですが。
よーし ECL plus にしちゃうぞーとも思ったけれど、ウエスタン通から
お前らは並で十分と言われて注文できません。
そもそもみんなケミルミの試薬はアマシヤムですか？

Pierce WestPico 室温保存可

>>268
WestPico強力ですね。露光1秒とか。フィルムのずれを直す暇もないです。

>>267
検出感度が十分なら、ECL 並で十分だよ。
plus はバックが汚くなるから。

>255
タンクに密封で保管しておき、ある程度量がたまったら、蒸留して
メタを集めて、再利用

> plus はバックが汚くなるから。
なるほど。ひたすら高感度というのは例えばこういうことですか？
> メタを集めて、再利用
20％も入れてるし、何かできそうな気もするのだが……

露光時間の速いケミルミ試薬は、退光も速いんでしょうか。

「あなたの風邪はHis-Tagつき?　Tagなし?」
「わたしはTagつき」
「そんなあなたにはこの、銀のヒートブロック」

熱伝導率などがめちゃくちゃ良さそうだが、ただでさえ高いヒートブロックが
リアルタイムPCR機とかを軽く越えそうだ。

わしの膜蛋白はECLじゃチョト弱いのよね。
んで、いままでECLplusしか使ったことなかったが、
こないだ初めてピアスのWestDura使ってみた。

膜の形に真っ黒けになった。。。

おいおい、もう皆帰ってるよ。なんでこんな年末に実験しなくちゃ
いけないのー。これから、１次Abしてwashして、、、、ひえーー。
でも今日はがんばっちゃおっかなー。
Transfer,最近のお気に入りはBathタイプ。

おまいは未来のノーベル賞

>277　自分も今日ウエスタンだ。
がんばれ　>自分

俺も今日やったぞ。
ネガだった・・・・・

>>280
乙カレー

抗体使い回してる香具師いる？

>>282
検討時なら。

うわ〜い、古いバッファー使ったらいっぱいポツポツ出たぁ〜

ひえ〜論文にするデータをまとめたらウエスたんの
データばっかりになってしまった！激鬱
こんなん投稿できるのか？

>>285
JBCならＯＫ

＞283
じゃあ基本的に使い回さないんだね

抗GST抗体でいいのあります？

ヤギいいらしいよ

>>287
信頼できる結果が欲しいならな。

清き一票を!
【日本の政治評論家不人気投票】
池田大作もエントリーされている。
HP内の右上のリンク先から政治家不人気投票（神崎武法がエントリー）
　　　　　　　　　　　　マスコミ不人気投票（聖教新聞がエントリー）
http://www.amiva.com/an/vote001/tvote.cgi?event=001&show=all

　下記は池田大作の発言ですが原爆を投下されたのは創価学会を迫害したから
ということです。このような人物が権力をもっていてよいのでしょうか？

先ほどから話がありましたが､大聖人様御在世に大聖人様を迫害したがゆえに
一国謗法であり､一国が正法を護持しなかったがゆえに他国侵逼の難､二回の
他国侵逼の難がございました｡文永の役と弘安の役｡その大きい難を通じて､
民衆は大聖人様の予言を少しずつ知ってきたわけでございますが､下って
大東亜戦争の際､日蓮正宗を国家が弾圧し､創価学会を弾圧し､二度の原子爆弾の
投下をされております｡一発は九州､一発は広島｡日本の国が正法を誹謗した報いです｡
　いままた日本の国が､もしか広宣流布ができなかったならば､それ以上に､
日本の国が重大の岐路に立っている｡それはなにか｡戸田会長はそれをいちばん
心配して､それを青年に､これからの行くべき道をたくさん教えてくださったわけで
ございます｡大聖人様御在世のときには二度の他国侵逼の難｡大東亜戦争のときには
世界始まっていらいの二つの原子爆弾の投下､今度は日本の国が､ソ連とアメリカと
二つの大国から攻められていくべき宿命にあるということを､真の青年は知らなくては
ならないと思うのでございます｡
　国立戒壇建立を､もしかできなければ､日本の国は永久に属国とし､永久に日本民族は
滅びる運命の段階にあります｡ただひとつ､三大秘法の御本尊様を信じ､国立戒壇を
建立するならば､仏天の加護によって日本の国には原子爆弾は落ちないし､日本民族は
必ず繁栄するというのが､会長先生の御遺訓なのであります｡
『会長講演集　第三巻』　Ｐ２９０〜２９１より

>>290
やっぱりそういうものですよね。
ありがとうございます。

標識抗ヤギ抗体でいい会社あります？

ヤギ盛り沢山のサンタ○ルーズはどうよ？
ヤギじゃないけどウサ抗GST抗体Z-5だったかは使えた。

抗体作る動物って決まってるけど利点知ってる？

>>295
それ以外の動物で作るメリットが何かあるのか？

ところで、使用済みのメンブレンどのくらい保存している？
最近保存が邪魔くさくてどんどん捨ててるんだけど。

使用済みの保存って、例えば冷凍保存のこと？なら保存はしないなあ。
個人的にreprobingしない主義なので。
乾かしてノートに貼る。マーカーをとっときたいので。

>>298
そうそう。でも、いちど数ヶ月前にやったウェスタンを染め直したいときがあって、たまたま4度にほってあった
メンブレンが見つかったので染めたら完璧だった。
抗体の質が良かったというのもあるが。

メンブレンを買った時のロール一巻ぶんぐらい冷凍保存してあります…
一応reprobeは直後に続けてやってはあるんですが。
equal loading controlとかIPした側の確認とか、reprobeしませんか？

>>300
もちろん、直後のリプローブはやります。問題はその後。
とりあえず用済み、でも捨てるのはもったいない、ということありませんか？

>>300
> equal loading controlとかIPした側の確認とか、reprobeしませんか？

趣味の問題じゃないか？漏れはそういう場合、複数枚流す事が多いから、
reprobingはしないし、membraneも保存はしないが。loading controlには
分子量の大きく違う蛋白を使って、membraneを切ることで対応。

よほど貴重なサンプルでなければ即用なしだな・・・。

リプローブのプロトコールおせーて

1% SDS, 100 mM BME in PBS or TBS
65 C 30 min
wash extensively
blocking

マウスからラビットのように一時抗体の動物種を変えているか、
目的とするバンドのサイズが重なっていない時は、そのまま
ブロッキングから再開しています。
またはAmershamのECLの説明書の方法に従って2-ME入りバッファ
でstripping後しばらくTBSTで洗い、ブロッキングから同様に
しています。
いずれも化学発光でなく発色系の方法の場合は無理だと思いますが。

>>304 >>305
ありがとうございます。
試してみます。

> 抗体作る動物って決まってるけど利点知ってる？
二次抗体が使い回せるというのは現在ある抗体について
大きな利点であると思うけれど、最初に目的の抗体を
動物に作らせる技術が生まれた時代にウサギなどが
選ばれたのはなんでなんだろう。

大きさが手頃、既に実験動物だった、繁殖が簡単、
おとなしく扱い易い、とかいろいろあるんだろうが。
ウサギの場合、皮下に注射しやすいというのもひとつ
だと思う。けしておとなしいとは思わないが。

>>307
大した理由はないんじゃない？

近くにいたから、だろ

漏れもそう思うが何か知ってる香具師いる？

想像するに、丁度ｲｲからじゃないのかな。
マウスで作ったことのある椰子は、絶対
えー。これっぽっち！？　と思ったはずだ。
ねずみは使えるんだが小さいからなあ。

かといってでかい奴も飼いにくいし。

結局ウサギが一番良いサイズなのでは、と勝手に想像。
草食だし、比較的おとなしいし、狭いかごで飼えるし。

結構取れるし。（スマン＞うさぎ

どこから取りますか？
使えるぐらい力価が上がったら即全採決でしょうか。
耳からでも一回５０ぐらい取れてたのに、全でも１００
ちょいしか取れなかったことがあるのですが、飼い続け
取り続けるではまずいでしょうか。

コストがかかりすぎ

売ってる抗体の値段？自前で作成するコスト？

>>314
飼い続け取り続ける

乜 勹 〰 スㄜㄝㄋ

NYは生きものぢゃないよ

http://www.hi-net.zaq.ne.jp/bubbs207

http://kinbou,zone.ne.jp

乜 勹 〰 スㄜㄝㄋ

十二支のなかで抗体作るのに使われている動物は？

子卯午未酉か

戌・丑不詳

子＝マウス
丑＝ウシ
寅
卯＝ウサギ
辰
巳
午＝ウマ
未＝ヒツジ
申
酉＝ニワトリ
戌
亥＝ブタ

ゲルの濃度はみんないくつ？

10 と 12.5

8とか4とか18とか・・
（電気泳動スレもあるでよ）

どこまで薄くしても平気なのかね？

4も18もやったことない。
4まで薄く、18まで濃くできるってこと？

グラジエントゲルにすれば高分子量も低分子量のタンパク質でも同じ膜に一緒に転写出来る罠

それは学部でも知ってる罠

>>329
俺もそう思うが、まーいいではないか

>>328　自分で作ってるのかな？

漏れはよく作るよ。

俺はよく作らせるよ

俺はよく孕ませるよ

ダメじゃん・・・。

>>335
何が？？

作らず買えよ！と。

どこの買いますか？
どのぐらいの期間もちますか？
グラヂエントぢゃない普通のも買ってる人いますか？

昔会社で作ってたら笑われた･･･
好みの濃さ厚さが無かったのに〜

自作の方がきれいに流れるんだよ。

>>340
胴衣

自作の腕が良過ぎるのか、業者のがへぼ過ぎるだけか

上のいくつかの話はグラジエントゲルでしょうか。
作る人の腕によって性能が変わるものでしょうか。
（熟練に時間を要するとしたらどのくらいか、とか）

340だが、グラジエントゲルの話。
腕の善し悪しは知らない。普通にprecastと同等か、より良い物が
できると思う。

単に低分子量を流し切りたくないだけの場合は、stepで十分だし。

ステップって境目平気なんですか？

全然平気。

作り方を簡単に教えてもらうことはできますか？

>>1
逝ってよし
　　　　　　　　　＾
　　　　　　　　　‖
　　　　　　　　　‖
　　　　　　　　＾＾＾＾　
　　　　　　　<　　　　）

今年も、、今年こそ、、
いい思いをしちゃいましょう(^▽^)v

http://ok.halhal.net/~2ch/

>>347
できます

>347
340だが。

stepの作り方が知りたいのかね。それともgradient?

stepは、

まず濃いめAAのlower gel mixに5-15%くらいのGlycerolを入れて、
組み立てたゲル版に注ぐ。すぐに通常のseparation gel mixを
注ぐ。適当に混ざって境目がなだらかになる。後は普通に。

Tipsとしては、TEMEDをかなり控え目にすること。すぐ固まると
むらが出来る。重合開始を遅くして、重いlowerが水平になる
時間を稼ぐ。目安としては通常の半分-1/4くらいで試してみては？

あと、どちらかのgel mixにBPBを少しだけ足してうっすら色を
付けておく。成功したかどうかが目で確認できるように。

ゲル溶液はゲル版の真ん中から注ぐこと。端を使うとうまくできないよ。
Glycerolの濃度はゲルの厚さやなにやらで適当な量が変わってくるから、
試行錯誤だな。

Gradientのplotocolがほしければrequestしてくれ。

protocolでおながいしまつ。

とりあえずすぐ使う立場ではないですが、説明をどうもありがとう
ございます。
BPBをゲルに混ぜても泳動に支障がないことは知っていたのですが、
ペリスタポンプとか複雑な装置を組み立てずにできそうですね。
mix の温度や脱気などには何か特別に注意するのでしょうか。
また step gel という名前自体知らなかったのですが、正式に
通じる名称なんでしょうか。

改行が多すぎると怒られたので三つに分けます。

>352,353
mixの温度や脱気は気にする必要ないよ。普通に。
BPBは入れすぎると泳動を乱すから、控え目にね。
stepが通じるかどうか・・・。うーん。正確には、この手のゲルは
step gradient gelと言うんだが、漏れの周りならアメ人にもstepで通じる。
けど、通じないとこもあるかもね。

さて、普通のgradient gelだけど、これもperistaとか複雑な装置は
使わなくて出来るよ。

まず、lowerとupperのgel mixを用意する。lowerには例によって
20%のglycerolを加えておく。どちらかにBPBで薄く色をつける。
どちらにつけるかは大した問題ではない。

次に、ゲル一枚分のlowerとupperを、正確に量り取り、TEMEDを加えて
混ぜる。例によってTEMEDは控え目に。

適当な大きさのシリンジに、18Gか21Gくらいの針をつけ、upper、lower
の順でそっと吸い上げる。界面を乱さないように、そっと。

全部吸い上げたら、そのままシリンジを引いて、中に気泡を入れる。
気泡が界面をかき混ぜて、きれいなgradientが出来る。気泡は10個
弱かな。適当に好みで調整。このとき、引き込む気泡の数を覚えて
おいて一定にすると、再現性の良いゲルが出来る。

さらに、シリンジを45度に傾けて一回転し、なじませる。

そのまま、そっとゲル板の中央から流し込む。シリンジを垂直に
保つこと。注射針をガラスプレートに沿わせると良い。

あとはアルコールを重層して、待つのみ。複数枚作るなら繰り返す。

peristaとgradient makerを使わないので完全なlinearではないけど、
使用上大した問題ではない。実にきれいに流れるよ。ゲルを染色する
場合は、固定前に5分ほど純水でゲルを洗ってglycerolを抜いておくと
よい。ウエスタンならそのまま何の問題もなく転写できる。

Tipsはstepの時と同じ。TEMEDの量は重要。重合開始に10分くらいは
かかるように減らしておく。但し、30分もすれば完全に固まって
ほしいものだね。

ふう。つかれた。こんなもんでどうでしょ。

極上プロトコールに転載してもいいですか？

良スレだな。ageとこ。

たびたびありがとうございます。すばらしい。
電気泳動スレも確かにあるわけですが。

>>174以降かなり優良スレになったな。

これからはスレッドもリサイクルの時代だ！

喜んで貰えてなにより。長文書いた甲斐がありました。

>357
極上プロトコールってしらんけど、２ちゃんに上げた時点で
転載自由と理解してるから、どこへなり載せて貰っていいよ。
ただこれはラボプロトコルじゃなくて漏れのoriginalなので
もし良かったら出典を、340@ウエスたんｽﾚとでもしておいて
貰えるとうれしいが。

>359
電気泳動ｽﾚに書いた方が良かったかもね。今電気抵抗で盛り上
がってるようだが。まあ良かったら試してみて下さい。
市販の馬鹿高いの買う気がしなくなるから。

特に話題も振れませんが、何か他にお役立ちネタがありましたらまたどうぞお願いします。

TEMEDの量って固まる速さを決める役割なんですか？
TEMED入れる理由はそれ？
たくさん入れても少なく入れてもできたゲルは同じです？

同じです。APSとTEMEDは重合開始剤として働くのよ。TEMEDの
量が少ないと、開始反応が少なくなり、必然的に重合時間が伸びる。

出来上がったゲルの固さはAAとbis-AAの濃度にのみ依存。

勉強になりますた。

>365
つか、その手の本見れ。
原理もしらんで実験してるとそのうち痛い目見るぞ。

>>366
すいませんでした。

ところで「その手の本」紹介していただけませんか？

通りすがりですが、堀尾武一先生編集の実験法の本はどうでしょうか。
なんか緑色っぽいのと茶色っぽいのの２冊で、けっこう高かった。
「タンパク質の精製２」スレッドでも紹介されていたはず。
実験をやり始める前に買ってそのときは難しすぎて後悔したけれど、
値段だけの中身があり調べ物に使える本だと思います。

ありがとうございます！探してみます。

washの時にTBST使いますよね。
あれって余分な抗体を洗い流すと思いますが
目的のタンパクに結合した抗体は平気なのでしょうか？

最近バンドが全然出なくて・・・
tweenの量とか影響しますか？

ふだん0.1%で、0.5%まで上げる場合もあると聞いた気が。
1%とか越えない限り平気かも。

>>371
そうですか。。じゃあ別の原因ですね。
ありがとうございます。

マジレスをsageで書くなんてシャイだね

ウエスたんポロッと、おっぱい･･･ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

>>370
それって一次抗体が腐ってるんじゃないのか？
以前はバンドが出ている条件なんだろ？？

抗体は悪くなると全然だめになる。それでずいぶん遠回りしたので注意。
ニトロセルロースからPVDFにするとか、一晩付けるとか、二度付けするとか
で何とか見える場合もあるけど。

ストリッピングってどうやるんですか？

生物板の悪意の固まりのようなスレはここですか？

>>378 違います。極上プロトコールの方でもありません。しばらくネットから距離を置いて自分を見つめ直してください。

いいこと言った！

>377 ストリッピングのやり方は、ごく最近話題になっていた記憶があったのですが、このスレッドではなかったようですね。
探してみます。
メンブレンの種類（PVDFかニトロセルロースか）、検出の方法（ケミルミか色素による発色か）なども書いてくださるとよりよいと思います。

>>381
メンブレンはニトロセルロース、検出は化学発光です。
抗体ではないタンパク同士の相互作用で検出するキットを使ってます。

340だけど。

極上プロトコルとやらを探して読んだよ。
めちゃめちゃ嫌な気分になった。
こっちのスレでもそうだけど、なんでこういうのに悪意を持つ人が
いるのだろう。
Glycerol入れて固まるかどうかなんて、やってもないのによく非難できる
もんだよ。
こちとりゃ試行錯誤の上、泳動に全く影響しないのを確かめて使ってるのに。
Sucroseなんかも試したんだよ。

そりゃどこでも誰でもうまくいくなんて保証はとてもできないけど、
そんなのはこの世界の常識だと思ってたんだけどなあ。

ある程度毀誉褒貶は覚悟してたけど、こうまで悪意をもって迎えられるとは
正直思わなかったな。騙すならこんな手間かけないよ。あほらしい。

喜んでもらえた人もいるようで、少しだけほっとしたけど。

◆◇◆◇◆最新情報◆◇◆◇◆
http://yahooo.s2.x-beat.com/linkvp/linkvp.html

あ、鬱になってちゃんとお礼を言ってなかったが、
転載してくれた人や、感想をくれた人どうもありがとね。
うまくいかない人は状況を上げてくれれば、もしかしたら、
なにかコメントできるかも。

漏れ自身あまり２ちゃんに居る時間は長くないし
日本とは時間がずれてるから、即レスは難しいかもしれんけど。
(340)

>340のひと
叩いているのは自分で手を動かしたことのない人、想像力の足りない人だ。
俺は正直、目から鱗だった。
普段何気にやってること、使ってる試薬や機材でも、
そこから応用するとなるとまた別の話なんだよなあ。

そういえば縦にゲル濃度、横にbis濃度のグラジェントゲルの作り方とかも、
良くもまあそんなこと考えるものだと感心したものだった。
#10年も前にちらっと聞いただけなので忘れてしまったのが悔やまれる。
#本に載ってるんだろうか。

>>378 はまさしく「生物板の悪意の固まりのようなレス」でしたね。
グリセロール云々と書いてくれたお陰で見当違いの人らしいことは分かりましたが、
なぜこういう反応（一人だと思うのですが）をしてきたかは分かりません。
340氏並びに他の有用なレスをつけてくださる方々においては、どうか2chに幻滅せず
また来ていただきたいと思います。
（グリセロール云々の方も、再登場の折には最初から論点を明確にした上でのレスを
お願いします。）

ストリッピングのプロトコル発見しました。
100 mM b-ME, 2 % SDS, 62.5 mM Tris pH 6.7 で50℃30分インキュベート。
きつく洗いたい場合は70℃まで上げられる。
PBS-TかTBS-Tで洗ってブロッキングへ。

出典はアマシャムのECLの説明書。

>>388
転載しますがよかですか？

>>388
転載しますた

バンドでました！
みなさんありがとう！

バンドの濃さの定量性ってどの程度あるんでしょうね。

（＾＾）

コントロールさえしっかりしてればあると思われ

つか、コントロールとってない時に定量性を語ってはいけないと思われ。

悪意の固まりあげ

ウエスたんの数値的な定量性を出すには、
・コントロールの希釈系列の抗原と並べる
・シグナルのsaturationがないことを確認
・取込みにFluorImagerとかFujix LAS, FLAなどを使う
などでどうでしょうか。

>>396
>>378 が余りに哀れだからそっと氏といてやれ。

>>397
酵素反応で定量性って出せるもんですか？

>398
HRP conjugated Ab, ECLによる発色で一定範囲内ではそれなりに直線性はあると思うのですが、
蛍光二次抗体の方が確かなもんなんでしょうか。

フォトショップ使って定量できませんか？

無理です

>>401
そういうのはNIHimageの方が得意そうな気がする。

>>401-403
ソフトとしてはNIH Imageがよいでしょうが、画像を取り込むところが
問題です。スキャナはデンシトメータに比べて直線性がいい加減だし、
何も考えずに取り込むとホワイト飛ばしたり輪郭強調処理してくれたり。

>399
出せる条件はたいていの場合ある。
大事なのは定量性のある反応のレンジを把握しておくことと、
それをきちんと示してからやることだと思う。

悪意の固まりあげ

まさかとは思うが・・・
>>378 = >>396 = >>406
だったりしないよな？

NIH image DLできん！（泣）

>>408
たしかに重いらしい・・

フィルムを感光させまくってポジコンと発現が同じと言うのはありですか？

saturationしてるということですか？
隣のバンドと融合してるようなのはほんとはいけないのかな。

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X線フィルムも定量性のあるレンジというのは存在する。
直感的に考えるよりかなり狭いので注意が要る。

一般に反応がシグモイド曲線をとる場合、
線が寝ている部分は使えないとするのが普通。
410のは、明らかにサチッたところでモノを言っては
いけないよという親切な喩えと思われる。

>411
オートラで定量したい場合、1レーン開けるとかして隣の干渉を
遮断した方が良いです。

>>408 最近だと ScionImage か ImageJ では？
また mac 版のみだが ImageSXM とか。

>>414
サンキュウ。DLしてみます。

ダウンロードサイトも書いてないのに、とか思ったが、googleとかで検索すれば一発で飛べたかも。
Scionは名前とメールアドレス取られたような気が。今確かめもしませんが。

LAS とかについている ImageAnalysis のソフトで定量するのと、Exportした8bit TIFFをNIH Image
などで解析するのとで、どのぐらい変わってくるもんでしょうか。

そう言えばうちのラボにLASあったな。。試してみるか。

アプライする時に素早く、しかし漏れださない入れ方を教えて下さい。

ウェルの底まで届くチップで、隅の角のところから流し込む。
チップの中の残量を見ながら、泡がぼこっと出ないぎりぎりのところで引き上げる。

流し込む速度と等速でピペットを引き上げる。

トランスファーのときに泡が入らないようにする秘訣を教えてください。
いまタンク型でやっているのですが、セミドライとどちらが泡が入りにくいでしょうか？

泡よ出ろ！と念じる

>>421
一般的には、セミドライの方が泡が入りにくい。しかしご存知の通り、セミ
ドライは高分子量の蛋白質がトランスファーされにくいなどの欠点もある。

ウェットでやる場合のコツは、サンドイッチの組立をトランスファー液中で
やることだ。大きくて深めの容器に、用意したトランスファーバッファを
たっぷり注ぎ込み、カセット、3MM紙、メンブレン、ゲルを全てその中に
浸す。液体の中で組み立てれば、気泡は入らない。多くの人たちが、
ピペットをコロコロ転がして気泡を除いたりしているが、それはバッファ
がヒタヒタの状態でサンドイッチを組立てるからだ。そんなことする必要
はないんだよ。

大きくて深めの容器の中でころころやってます・・・
濾紙とかスポンジも前もってバッファーに浸水させておくようにしてます。

ウェットでバッファーどのぐらい使ってます？
バイオラドのやつで１台あたり１Ｌ近く使ってるんですが。
グリシンの消費量を思うとセミドライでやれんかな、と思ったり。

>>424
BioRadのミニゲルタンクで１リットル。ラージゲルタンクで3.5リットル。
だから、同じだね。でも、コロコロする必要あるかな？
大きくて深めの容器に、その１リットルのバッファ全部入れるんだよ?
カセット組み立てた後は、もちろんそのバッファはそのままタンクに移して
泳動に使うから無駄にはならない。

濾紙やスポンジ、メンブレンも、浸した後、裏表をよく見て泡が付いてない
ことを確認して、水面から上に出ないようにしてカセット組み立てるなら、
気泡入る余地はないと思うんだけど。

俺も初めの頃は教わったとおりコロコロさせてたんだけど、柔らかいゲルが
ちぎれたりズレたりするので嫌いなんだよね。

（＾＾）

>424
俺はトランスファー後、バッファー回収してる。
次やるときにそのバッファーを濾紙やメンブレン浸すのに
使って、半量くらい新しく作って混ぜてやってるよ。
いまのところ転写もうまくいってるよ。

http://www6.ocn.ne.jp/~endou/index2.html
　　　　　★YAHOOOプロフィール★

４２７(・∀・)イイ!!

密封できる大きめの弁当箱型容器にバッファーを回収しておけば、そのまま濾紙やメンブレン浸すのに使えるだろうか。

トランスファー後のバッファー再利用の注意点は、トランスファーにより
membraneを通過した蛋白がバッファー中にあるということ。だから、
あまり何回も同じバッファーを使うのはどうかと思うが。まあ２回程度なら
大丈夫かな。

例えば HA-tagged protein をよく流している場合、どんどんバックが上がっていくとか。

ブロッキングはどうしてますか？
うちは５％スキムミルク／ＴＢＳＴで室温数時間。
これから。

ブロッキングの時はトライトン入れないほうが良くない？

俺も入れてない

（　ﾟдﾟ）ｳｰ
ｳ！(ﾟ∀ﾟ Ξ ﾟ∀ﾟ)ｳ！（　ﾟ∀ﾟ）ｳｪﾙﾃﾞｨ!!

は？

うちは洗い液と分けて作るのが面倒くさいので全部TBSTであります。
ブロッキングはBSA 5mg/ml 37℃（培養シェーカー）で30分であります。
ちなみに、TBSTはTween 20を用いているであります。

437に同意であります。
漏れは3mg/ml milk, 3mg/ml BSAで30分以上であります。
ちなみにTBSTにはTritonであります。
なぜならTween20はしばしば腐るからであります。

10%雪印スキムミルクでブロッキング、TBSTで軽く洗浄の後、
5%で抗体をつけてるです。
過去、森永に代えて不調になった歴史があるため、
うちのラボでは雪印を推奨されてるです。(w

脂肪分を極限まで絞り取ったりしているんだろうか。
これからはメグミルクブランド？

メグミルクか…MEGUMI…ﾊｱﾊｱ

何にでもﾊｧﾊｧするスレ確かあったよね

腐ったスキムミルクが黄緑色になっていくのは何が起こっていますか？
その中につけたメンブレン上のタンパク質にも影響しますか？

抗体をハイブるときハイブリバッグに入れていますが、パラフィルムのお皿に寝かせる方法もあるようです。
自分もやってみましたが、どうもうまくいきません。
こちらの方がうまくできるという人がいましたら、こつを教えてください。

ハイブリバッグなんて使ったことないや。いっつもパラフィルム。
それっていいの？

TGU

>>445
うちでは液量を減らしたい時に使っている。
パラフィルムは使ったことない。いつもはチップの箱の蓋を使ってる。

>>444
パラフィルムでうまく逝かないって、どううまく逝かないの？
皿が上手く出来ないんだったら、くっつけたいところを少し引っ張って伸ばす。
伸ばさないとパラフィルムはくっつかない。餃子作るようなもんだ。

>>443
腐ってるんでしょう。何が起こるかはわからんけど作り直したほうが早い。

パラフィルム使うときって、引っ張らずにメンブレンよりちょっと大きい
くらいに切って液の上に浮かせる感じで載せてたが、それとは違うやり方なのかな。
今のラボじゃハイブリバッグだけど、前は良くやってた。

>448の場合、メンブレン自体は何の上におくのでしょうか。
蓋のできる平たい入れ物？

約８ｘ６ｃｍのメンブレンを作って使っていますが、ハイブリパックで１ｍｌの抗体希釈液を入れてハイブリさせています。
液量をさらに減らせるでしょうか。
パラフィルムの上に乗せる方法だと、液量はどのくらい使っていますか？

ウエスたんのメンブレンをCBB染色するプロトコル希望

>>451 普通にCBB3分ぐらい。40%エタノールで作った脱染色液入れて電子レンジ30秒。
シェイク10分でどうでしょう？

それよりも誰かニトロセルロースメンブレンを銀染色した猛者はいないのか？

>>418に関連してMWを流したレーンにもフィルムを見るとバンドが
出てしまう・・・漏れてるんだろうな・・・俺は下手ですか？

>>439
おまいはワタシの後輩ですかｗ
わしのいた講座も森永絶不調の時代を経て、雪印推奨でした。
女教授だったりして。

>>450
最近やってないんで、数字言われてもぴんと来ないが、
パラフィルムの上にメンブレンを置いた後、
パラフィルムを上から掛けてやると、
液量は結構減らせるよ。

パラフィルムが発する静電気は問題にならない？

なるよ。だからやめておきなさい。

>454
あああやっぱりそうなのかあああ。
いやうちの教授はデブオヤジなので関係者ではないと信じていますが。(w

>>457
ならないって

魔法少女ポリメラーゼ　

トリスの不思議な冒険

Ca2+、グロブリンを強化したスキムミルクだったりして

>>452
脱色液のアルコールの選び方がミソなんでしょうか？

うん。
純米吟醸使ってね。

泳動戦隊ロングレンジャー

http://www.agemasukudasai.com/bloom/

>>451
なぜCBB?

>467
internal controlのウエスタンをやる代わり。

そういうときは、下の方とかの切ったあまりのゲルを染めると吉。
どうしてもメンブレンを染めたければプロッキングする前にポンソーで
染めて写真撮っといたら良いかと。
#CBBでやっちまうとウェスタンﾊｧﾊｧできなくなっちまうでな。

ポンソーの試薬うちに用意してない。
学生の時の実習で、確かにポンソーで先に染めてprestainedでないマーカーを描いていたが。
あと感度は足りる？

CBBはストリッピング後にやっている（PVDF、もちろん毎回やっているわけではない）。

ポンソーぐらい買いなはれ･････。
それか、CBB染色用にゲルをもう一枚流すとか。

回転の速い常備試薬でできることがこのプロトコルの価値だと思う。
CBBはゲル染めるのによく使うけどポンソー使うほどのラボじゃないんで。

http://jsweb.muvc.net/index.html
　★お気に入りに追加してしまったアドレス★

だからまず上とか下とかの余ったゲルをCBBで染めなされというておるのよ。
検出したいバンドのある部分なんてたいていごくわずかで、たとえ複数の
抗体で染めたとしても切って捨てる部分は多少なりともあるはず。

どうしてもメンブレンをCBBでというのであれば、多少大きめのメンブレンを使い、
要らない部分をちょっびっと切って染めれば良い。
ポンソーがイヤならそうしたらいいかもよ。

ちなみにマーカー染色が目的なら、マーカー部分だけメンブレンを切って
そっちを染色し、ウエスタンの像と合わせるのが常套手段。
ただしメンブレンによっては縮みを考慮しなければならない場合もあるので注意。
#うちはプレステイン使い出すまでポンソー使ってた。あれは縮まない。

トランスファー後のゲルがどうも縮んでいるということがあるのですが、どうでしょうか。

トランスファー後のメンブレン染めるのはアミドブラック
でもできるよ。こいつは優秀で抗体で染めた後でもタンバク染められるから
うちのラボでは重宝してた。しかもアミドブラックで染めたでも
もう一度抗体で染められるからね。

>>476
ポンソーでも染まるYO!＞抗体染色後

何を難しく考えてるんだか。。

ポンソーに種類がたくさんあるけど、それぞれ何が違うのか教えてほしいです。

千円札の夏目漱石が、子供のような甲高い声で
「ろっポンソー」と叫ぶのです。

チンマーマン反応(;´Д`)ﾊｧﾊｧ



ってもう！いつの間にウェスタンスレになってんだよ！

>>451
CBBは一瞬で染まるよ。
オイラの場合はCBBをカードケースかなにかに入れ、
ムラにならないように揺らしながら５秒ほど染めておしまい。
水で良くすすいだ後、50%MeOH/10%AcOHで１０分シェイク。
あとは水ですすいで乾かして終了。
脱色が足りないくらいでも乾けばコントラスト比は上がるので大丈夫。

>>475
トランスファーバッファーのメタノール濃度が高いんじゃないかな？
もしかしたらバッファー不足かも知れません。

ご、五秒!?
是非ポイントを教えてくれっ。

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>>475
まったくのど素人で、転写(semi dry)の条件やらなにやらを一生懸命やってる私です。
みんなウエスタン未経験者というものすごいラボなもんで。。。
近頃、実験やってるんだか、遊んでるんだかわからない状態です。

もしかしたら、こんなの常識なのかもしれないのですが、
ゲルを切り離してすぐに転写バッファに放り込んで電圧をかけるとゲルが縮むことが多いような
気がしました。
（バッファはトリスとグリシンと20%メタノールで転写装置はbio-radのセミドライのやつ)
で、転写バッファの中に15分くらいゲルをつけておくようにしてからは縮むことはなくなりました。
当たり前のことかもしれませんが。。。。

まだ転写の条件が決まらず悩んでます。

>>484
そですね、泳動後のゲルは転写液で〜30分ほど膨潤させるといーですね。

しかしめんどくさくて5分くらいしか浸してないな。。。

どうよ？↓
ttp://www.gakusai.co.jp/igaku/t-015.htm
東京だけどね。

>484
試しに要らないゲルを100%メタノールの中につけてみてください。
時間が短いとどうして縮むのか、ご理解いただけるかと。

セミドライでトランスファーする場合、過剰のバッファーは紙などで
ふき取った方がうまく行きます。
液が溢れているとゲルの外を電流が流れてしまい、うまく移りません。

定電圧の場合は電流の下がり方を、定電流の場合電圧の上がり方をチェックして
うまくいったときの条件を出しておくと良いです。

分子量の大きいタンパクは移りづらいので、注意が要ります。
OWLのPtブロッターを使ったケースですが、ろ紙の枚数を１枚増やすことで
うまくいった例があります。

>485, 486
いろいろ教えてくださってありがとうございます。
講習会、すごく行きたいですが、結構高いですね。。。

トランスファーは定電圧から始めたのですが、15V 1hの時点で180mAまで
下がったので、「もういいだろ」と終了。200のマーカーはほとんど転写されずに
ゲルをCBB染色すると、ゲル内に200のマーカーと、流した蛋白がばっちり見えました。

定電流だと1.2mA/cm2 90min, 2.0mA/cm2 1h（いずれも電圧が上がりきったと
思われるところ）でやってみたのですが、やっぱりゲル内には結構蛋白が残って
いました。

2.0mA/cm2 1hが高分子については一番うまくいったように思います。
セミドライだと、やはりゲル内に蛋白がCBBではっきりわかる程度に残って
しまうものなのでしょうか?
本をみても、このことについての記載がみつからないのです。

あと、ずいぶん昔の話題で恐縮ですが、ブロッキングの際に
5% milk+3% FBS(TBST)でやってみると、5% milk + 3% BSAよりもバックがきれいでした。
一概には言えないのですが、リン酸化抗体はFBSを使うとあんまりよくないですが、
普通の抗体はFBSの方がバックはきれいでした。
抗体希釈は5%milkでやってます。

>484
ゲルやバッファやブロッターによっても違うだろうから一概には言えないけど、
200kDaなら15V1hは足りないんじゃないかな。
うちなら1.5hコースです。
ちなみに定電流でやるときは過熱でブロッター壊さないように注意した方が良いです。

高分子量のタンパクがセミドライで移りにくいのは423でも言われている通り
既知の事なので、その辺は皆さん工夫しているわけですヨ。
うまくいけばきれいにうつるもんです。
どうしてもダメならウエット使ってみてはどうでしょう。

>487,488
一つ聞きたいんだけど、ゲルに残る残らないではなく、
メンブレンをその抗体で検出したときは、1hとか1.5hで
バンドの見え方に差は出てるの？

でますよ。もちろん。

リン酸化抗体でも5%milkで希釈して使ってるんでしょうか？

ぜったい昔のブロット槽の方がうまくいくって、
それも扱えない人間にセミドライは無理だよ。

がいしゅつだけどゲルが縮むのはﾒﾀﾉｰﾙのせい。
CBB染色やったことあれば気づくんじゃないかな。
ちなみに、グリセロール入ってるゲルは縮まない。

面白いサイトが見つかりました。

http://home9.highway.ne.jp/cym10262/fenomina.html

http://www.agemasukudasai.com/bloom/

>486
でさ、転写時間が違うと目的のバンドだけじゃなくて
非特異的なバンドの出方も違ってきませんか？
そうすると、ゲルに残るか残らないかってことが
転写時間の条件検討の目安になるかどうか疑問に思うのだけど
どうですか？

milkに入っているカゼインは脱リン酸化してないだろうから、
抗リン酸化アミノ酸抗体にはゼラチンかBSAをブロッキング液に入れたほうがいいのでは？

あいもかわらず転写条件決めるのに拘っている私(今は泳動中)です。
486さん、492さんがおっしゃっていますように、本来はウエットでやれば簡単に?解決するはずであろう
問題だと思いますが、ウエットの器械がないため、指をくわえるしかないのが今の状況です。
今週一杯は頑張ってみるつもりです。
うまくいきましたら、お礼も兼ねて報告させていただきます。

話は変わりますが、私の言葉の使い方が悪かったみたいで、みなさんに迷惑をおかけしました。
「リン酸化抗体」についてですが、4G10のような抗体を指したのではなくて、
リン酸化Akt(Ser473)のような抗体を指したつもりです。
申し訳ございません。
また、指摘していただいた491さん、497さん、ありがとうございます。

ところで、抗リン酸化アミノ酸抗体の場合にmilkでブロッキングすると、milk中のカゼインのために
メンブレンが真っ黒になるという話は本で読んだことがあるのですが、リン酸化Aktのような
ある特定の部位かつリン酸基の構造であればSer/Thrだろうと抗体をmilkで希釈しても実用上
問題がないと考えてよろしいのでしょうか?
(私がやっている限りでは、このような抗体でメンブレンが真っ黒になったことはないのですが)

単にブロッキングの効果が強すぎるのかなと思っただけです。
Cell Signal社のphospho抗体とかのインストラクションでも5%BSAが指示されていたりするし。
4G10はAnti-phosphotyrosineでしょうか。

500回目のウエスたん（；*´Д｀）ﾊｧﾊｧ

ピアスのスーパーシグナル使って化学発光で検出してるんだけど、
添付のプロトコールみると、5分間agitationって書いてあるんです。
こんなことしたら、バンド逝っちゃわないのですか？
ECLだと1分間静置ですよね。

おはようございます
>>499
ブロッキングの程度については検討したことがありませんでした。これに
ついても、またじっくり調べさせていただきます。
4G10は抗リン酸化抗体（ほんとの意味での)です。ときたま論文で
みかけるので、4G10で通用するものかと勘違いしていました。
すみません。
>>501
私のところでは、ロシュのlumi light plusを使っていますが、3分静置となっています。
感度は高い分、特異性をさらに高めた結果、反応時間が長くなったのかと勝手に
解釈して使っておりました。

484です。
転写がうまくいったので報告させていただきます。
電圧や電流の設定をいろいろ変えてもうまくいかなかったのですが、
バッファのメタノール濃度を20から5%に減らして、15V 1.5hでゲル内にタンパクが
ほとんど残らないようになりました。今、一次抗体をかけ終わったところです。
以前は「このゲルって転写後??」という状態だったのですが、今回は見るからに
転写後のゲルという感じになりました。

なんとか成功したのも、みなさんにアドバイスをいただいた結果だと思っています。
本当にありがとうございました。

>502
参考になるかわかりませんが、
私はphospho-p38の抗体を使ってますが、
抗体の希釈は5%milkでもBSAでもあまり違いはありませんでした。
ただ、4G10(anti-phospho-tyr)はmilkだと、真っ黒ということはありませんが、
バックが高くてバンドが見にくかった記憶があります。

>484のひと
転写後のメンブレンを良く見るとタンパクがうっすら見えますので、
転写具合はもちろん気泡の入り具合とかもチェックできます。(w

http://www.agemasukudasai.com/bloom/

>>504
phospho p38ってダメになりやすくない？

>507
これまでに3本買いましたが、
なんか、ロット差が激しい気がします。

>>508
禿道

ちゃんと分注して-20℃で保存してるか？

>>510
４℃じゃだめですか？

>>511 分解するよ。-20℃が吉。

リン酸化認識抗体は取り扱いに注意しないとすぐダメになる。

>>513
ダメになるより早く使い切るペースで実験。これ最強。

>505

本人は冗談が煽りのつもりで書いたかもしれないけど、
実際メンブレンをPBSからあげて生乾き中に普通の天井ライトの
反射光をみると、
ブロットされたバンドが見えるね。
写真に取り様が無いと思うけど。

うん見えるね。タンパクにはSDSが結合してるから水分はじいてるから、とか？

>>502
時間ではなくて、agitationかけるとバンド逝っちゃわ
ないのかってことなんです。
発色じゃないから関係無いんでしょうかねー？

関係ないと思われ。

関係ないと思われ。

関係ないと思われ。

質問です！
私は化学発光ではなく、発色でバンドを検出しています。
発色の場合、リプローブってできるんですか？
プロトコルをご存じの方は教えてください！！

うちもウェスタン初心者ばかりの研究室なので
わからないことだらけです・・。

>521

メンブレンが乾いていない状態であればリプローブ可能。
たとえば、DABで発色させた後に乾燥させたらもうダメ。

リプローブの方法は何種類かあるけど、ｐH2.5 でやるのより
はｐH6.8でSDSと2-MEが入ったbuffer中で５０℃３０分反応
させるのがきれいに抗体がはがれる気がする。

>522
早速返事してくださってありがとうございます！
もう少し聞かせてください。

・bufferとはPBSでよいのでしょうか？

・一度発色させた後、乾燥させたらダメとのことですが、
その場合、先に発色させた方のバンドの解析は湿ったまま
ラップにくるむなどしてするものですか？　その間に
乾燥しそうで心配です。それとも、発色自体は残って抗体だけが
はがれるのでしょうか？

DABを発色させるときNi入りのほうが感度が良いというのは本当でしょうか？

>524
バンドが紫っぽくなって、コントラストが良くなるよ

>>525
マジで？いい情報さんくすこ。

>>518、519、520
解説お願いしまする。。。

>>527
三連コンボ、ﾜﾗﾀ。

通りすがりだけど、化学発光の場合、常に標識二次抗体のある場所でしか
反応が起こらないので、agitationかけても関係ないです。

そもそも発色法でもagitationかけてOKです。やりすぎるとバンドが
ファジーになる場合がなくはないが、そこまで振るのはしんどいです。
バンドが極太の場合は色素が流れ出して周りに沈着することがあるけど、
それはオーバーロードなので。

>523

メンブレンが撮影時に乾くのを防ぐには、写真を一枚
ずつ入れるフィルム状のケースを使うとよい。これに
挟んでおけば半日は乾かずにいる。写真屋や生協で入
手できるから探してみて。

BufferはTBSを使用。多分PBSでも可。
リプローブするとメンブレンに転写したたんぱく質以
外は全部外れる。もちろん色素も。バックに残った色
はそのまま残るが、ブロッキングががっちり決まって
いればバック残りは少ない。5％スキムorBSAならまず
大丈夫だった。

>529
ありがとうございます！！
早速やってみます！

>>530
どうだった？できたか？

私は発色法でやったことはないのですが、
PVDFメンブレンであれば、万が一乾いてしまった時に
再度メタノールに漬けた後、TBSTで馴染ませるという手は使えないのでしょうか?
私自身は、PVDFメンブレンにECLの組み合わせで、メンブレンを乾かしてしまった時に
再度メタノールに浸してリプローブすることでうまくいった経験があります。

>>532
俺がやった時はだめだった。

SDS-PAGEはどこまで時間短縮可能ですか？

君の腕と目の解像度にかかってる

腕次第でゲル板洗浄から下ゲル充填まで5minでイけるようになる(マジ)。

・・・って、そういう話ではなくて?(w

http://www.agemasukudasai.com/bloom/

それも含めてトータルで。

時間短縮のTIP：
プレキャストゲル。8連オートピペッター。良質のコンスタパワー。

染色の部分はちぢまりにくいな。ＣＢＢ入れとくわけにいかんのだろか。

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>>539
和光のクイックＣＢＢ染色剤なら電子レンジで
1分染色→水で1分脱色×3回で終わる。ちゃんと脱色できるが、
キムワイプを一緒に入れてチンするほうがよく色落ちる。

転写条件でお訊きしたいのですが、
ウェット(タンク)型装置、ＰＶＤＦ膜で転写液を5％MetOHにしても
転写は可能でしょうか？

今日ちょっとやってみてたのです。ゲル内に残る蛋白量は
20％MetOHより格段に減ったのです！

しかしちゃんと膜にくっついてるのかな。。と心配で。
ポンソで染めるにも、PVDFなんで真赤ッ赤にしかならないので、
明日の発色待ち。今O/N抗体反応中。ﾄﾞｷﾄﾞｷ｡｡｡

>>542
大丈夫だよ〜ん

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絶対儲かるから登録してみて
http://www.cashfiesta.com/php/join.php?ref=yamashita-y

エイドウ速度はどこまで早くしても平気？

そりゃあ、上限を問われればゲル板が割れるまで(wと答えるが、
冷却やゲルの条件によっていろいろあるだろ。
バンドがボケやすいタンパクならあまり無茶はできんだろうし。

http://www.agemasukudasai.com/bloom/

>>546
300Vくらい平気ですか？

>>543
大丈夫でした!　２０％と５％MetOHの両方でやってみたら、転写量も
５％の方が格段にあがってました。　これからは５％で行こう♪

何アンペアで何時間くらいが妥当かわからなかったので
今回は１５mAでO/N転写でした　←ただ疲れて早く帰りたかったともいうw

>>545
第一化学のPAGミニゲルだと、一枚当たり40mA定電流で一時間流せとあります。
すると、泳動の最後の方では370V超えてます。
最初から300V低電圧で平気かはやってみないことにはわかりませんが、
低温室でやってみたらいけるんじゃないかなぁ。。。やってみようかな。

１時間か。。良いかもしれない。
俺もやってみよーっと！

むかし自作ゲルの場合は150Vで一時間泳動してたなぁ。

つーか定電流と低電圧、どっちが泳動に良いとかあるのかな。探してみよう。

えーと、泳動槽に寄っては最大耐圧などが指定されていることもあるので、
まず取説を良く読みましょう。
壊してからじゃ遅いですし、なにより言い訳ができません。(w

>>552
ありがとございます！

http://plaza8.mbn.or.jp/~mnet_hp/idol01.html

力の限り５５５！

ミニゲルの弱点を指摘しなさい。

小さいので中の人が苦しいです。

>>557
つまらんので晒す

>>555
まだやってるんだっけ？

もちろんやってないよ。理由はわかるよね？w

ゲルろ過

>>561

ここ最新１０ぐらいの話の流れが読めない。

というわけで時間短縮の話に。
サンプルアプライから
SDS-PAGE (1.5h)
transfer (8h)
blocking (3h)
1st Ab (16h)
wash (1h)
2nd Ab (1h)
wash (1h)
ECL (0.5h)
でバンドの検出まで最短でどのぐらい？
( )の中はうちで急がずやってる時の平均。

transfer 8hが長すぎ。

SDS-PAGE (1h)
transfer (2h)
blocking (1h)
1st Ab (1h)
wash (0.5h)
2nd Ab (1h)
wash (0.5h)
ECL (0.5h)

>>560
ナゼですか

SDS-PAGE (30m)
transfer (1h)
blocking (30m)
wash (10m)
HisProbe (1h)
wash (0.5h)
ECL (10m)

SDS-PAGE (1h)
transfer (2h)
blocking (1h)
1st Ab (1h)
wash (0.5h)
2nd Ab (1h)
wash (0.5h)
ECL (0.5h)

やっぱりみんなトランスファーには（相対的に）しっかり時間をかけるんだね。

PVDFなら多少長くても良いが、ニトロセルロース使ってるなら何もかも
抜けてしまうことがあるので長ければ良いというものでもない。
また、セミドライブロッターの場合はメンブレンやブロッター自体に
ダメージが行くことがあるのでこれまた長ければ良いというものでもない。

時間はタンパクの分子量によって変えるのだが、常識的な範囲で最大値を
取っておけば無難、ということになろう。

SDS-PAGE (2h)
transfer (1.5h)
blocking (2h)
1st Ab (1h)
wash (0.5h)
2nd Ab (1h)
wash (0.5h)
ECL (0.5h)
全細胞からp53をみてます。

>>570
ニトロで４時間やってますが平気ですよ。

SDS-PAGE (1.5h)
transfer (2h)
blocking 0.5h)
1st Ab (3h)
wash (0.2h)
2nd Ab (0.5h)
wash (0.2h)
ECL (0.2h)

SDS-PAGE (1.5h)
transfer (4h)
blocking (3h)
1st Ab (16h)
wash (1h)
2nd Ab (1h)
wash (1h)
ECL (0.5h)

ＩＰしたらよけいトランスファーがうまくいかなくなるってこと
ありませんか？

それはIPがうまくいってないんでは・・・。

transferはセミドライをつかって15分だけど。。。

セミドライの欠点てなんですか？
うちのラボでは両者を比較するまでもなくウェットなんですけど。

A (0.1 h)
B (0.3 h)
C (0.3 h)
x3 times...haa haa...

セミドライは簡単だし、
うまくやれば３００キロでも全部移せる。
ウエットなんかやめれ。
面倒くさいだろ。

>578
ｶﾞｲｼｭﾂ

http://www.agemasukudasai.com/bloom/

579は何が言いたいのれすか？

キス6分、ペッティング18分、ｾｸｰｽ18分を三セット、ﾊｱﾊｱ、じゃないのかな？
毎日ならタフだな・・・。

な、なるほど・・・絶句

つーか長くね？漏れはトータル20 minくらいでshakingは5 min at room temperatureが限界

ここはウエスタンスレと聞いて来たのですが間違ってますか？

合ってますよ。何か質問？

587じゃあないけど質問です。
一般的な比較的低塩濃度の免沈用細胞溶解バッファーでも
核蛋白質は抽出されてきますか？
それとも400mM程度のKClかNaClを含んだバッファーでないとダメでしょうか？
後の処理を考えるとあまり高塩濃度のバッファーは使いたくないのですが。

>589
モノによって違うんで、いろいろ試してみろとしか言いようが。(w
低塩濃度画分と高塩濃度画分で挙動が違うこともあるので注意。

SDS-PAGE (0.5h)
transfer (1.25h)
blocking (なし)
1st Ab (1h)
wash (5min)
2nd Ab (15min)
wash (5min)
avidin-AP (15min)
wash (5min)
NBT&BCIP (15min)

もう時間はいいよ

セミドライとウェットてどちらが昔からあるの？
誰か第三の装置を颯爽と開発してくれ

ドライブロッティング装置。

in silico ブロッティング装置。

波動ブロッティング装置。

スーパードライブロッティング装置。

マグナムドライブロッティング装置 (ちょっと安め)

破壊されても次の週には何事もなかったかのように生えてるんだろうか。>第三のブロッター

600

原理とかやり方の簡単な説明も

なんか毛管現象でこう

>>602
第三ブロッターが生えてくるのか?

糖含量の高いペプチドをトラップできる
膜は何かないすかね。
PVDFだとトラップしてくれないんです。

>604
低分子量の奴使ってみた?
糖はどうかわからんけどサンプル貰って試すくらいならやってみる価値あるかもよ。

（＾＾）

（＾＾）

山崎ｷﾀ━━━━━━(ﾟ∀ﾟ)━━━━━━ !!!!!

PAGEのフロントの流れ方が微妙に変だったので鬱

Tricine-SDS PAGEをするとBPBの移動度とタンパク質の移動度が一致しないのはなぜ？
BPBが最前線がまで泳動されてもタンパクの最前線はgelの中頃までしか泳動されていないんですけど？

「寂しいから舐めてほしい？」

んじゃそのへんのアクリルアミドでも舐めててくれ。
ウエスたん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`) とかいいながら。

>610
普通のSDS-PAGEで一致するのはなぜなんでしょう

mini protean 欲すぃ。
あのセット幾らぐらいしますか。

（＾＾）

　　 ∧＿∧
　　（　　＾＾ ）＜ ぬるぽ（＾＾）

>614
7,8万ぐらい？

men液チンコー・・・ﾊｧﾊｧ(;´Д｀)

そんなに安くないなりよー

15ﾏｿくらいだったかな。。

　とある蛋白をPVDFにトランスファした後血清を一次抗体として反応させて、
血清中の抗体の存在をスクリーニングしようとしているんです。
　２次抗体は抗ヒトIgGで、染色はAPでやってます。

　なんか血清のかわりに普通のバッファーをいれても、うっすらと
ラインがでてしまうんです。つまり、一次抗体はないはずなのに
ラインが浮かんできちゃう。
　これを消そうとすると、２次抗体をすごく薄くしたり
めちゃくちゃWASHする必要があり、
そうすると陽性ということにしたいバンドまでかなり薄くなって
きてしまい、てこずってます。
　これって一般的な現象なんでしょうか。それともトランスファーさせてる
蛋白に抗体をくっつけてしまうような性質があるのかな？？

イラク戦争の写真がいっぱい！！！！

まともに見れるかよ！！！！

心臓の悪い方はご遠慮ください！！！

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>>621
メンブレンの上に問題の抗原しかタンパク質が乗ってないなら、そりゃしょうがないんじゃないの。どんなタンパク質だってPVDFよりゃ抗体に対するaffinityは高いでしょ。ポジコンになる抗血清は手に入んないの？

　素人なもんで、すいません。
　ポジコンは確かもうすぐ手に入ります（かなり高かったもので、なかなか
買えず。。）うさぎに免疫したポリクローナル抗体だったかな？わりと
マイナーな蛋白なのであちこちで売ってるものと違うのです。
　ただ、ヒトの血清と、当然うさぎでつくられた
抗体とは同じメンブレン上で単純な比較はできませんよね？

　先ほど述べたバックグラウンドの問題もあって、どれを陽性ととるか
苦慮してしまいます。

>621
blockingはどうしていますか?
検出はどんな系(あるいはキット)を使用していますか?
抗体の濃度や量はどうしていますか?

多分、そのへんをきちんと記述しないとここでの解決は難しいでしょう。

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>>621
基本的な事だけど、とある蛋白とやらはどれだけ膜に乗せてる？
例えばBSA1ug乗せれば、ほぼどんな抗体でもクロスするが。

まあそれ以前の問題として、
その方法だととある蛋白の希釈系列を作って検出限界値を指標に
スクリーニングするべきだと思うがね。ポジ・ネガのアッセイには
なかなかならんよ。

うむ、タンパク山ほど載せればクロスする。
それをblockingや洗浄条件なんかでカバーするテクニックはあるにはあるが、
artifactでない有意なシグナルを見るには経験が要る。
627の言うやり方が理にかなっていると思うな、俺も。
後で数値化することもできるし。

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628に同意

で、結局621氏はどうしたんだろう。

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たんぱく高発現でゲル染色した時に確認できるくらい量がないとだめか？

627さん、628さんのおっしゃる風に系を組んで、あらためて
やってみることにします。アドバイスありがとうございました。

で、結局625や627の聞いてることはどうしたのよ(w
要は「適切なアドバイスが欲しかったら状況をもっと詳しく書け」という
アドバイスだと思うんだが。

それを知ってどうする？
懇切丁寧に教えてやるのか？
それとも、知的好奇心を満たして終わりか？ｗ

>637
初心者なら経験者には思いもよらない失敗してるだけかもと思った次第。
基本的に後者の立場だが、手持ちの知識で解決できそうなら
暇と妥協の産物でアドバイスもありうるわな。(w
もちろん、するだけ無駄だと思ったら生暖かくヲチするのみ。

|
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|⌒彡
|冫、）
|` ／
| /
|/　
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|

ガラクトースで発現誘導する時のガラクトース濃度はどのくらいがベストなりか？

>640
ホストとプロモーター次第でしょ。

では具体的にどのくらいなり？

だから、もっと具体的に書けと言うておる。
ゴーカートからダンプカーまで並べておいて「車の重さってどのくらい?」と
聞いてるようなものだ。

ウエスタンか・・・
ところで西部警察を英語で言うと
ウエスタンポリス？ウエスタンコップ？

新.宿.Cactusとは、“英語がよくつく身に付く楽しくつく
つまり、今後のあなた達に必要なイディオムを教えてあげ
るって”バンドですよ。ライブで覚えて、社会なんかでも
活用してはいかがかな？海外旅行にも最適かも・・・。
http://www.shinjukucactus.com/

とりあえず2％でやってみてダメなら増やせばいいと思うよ〈ガラクトース

酵母をガラクトース誘導かけるときは
２％ガラクトース1%ラフィノースを与えるのがよい

━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

647さん、それは何故でつか？

なんでだろう？

つか、その手の本読めば載ってるような事をこんなとこで聞くなと640に言いたい。

　　　 　∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　(　　＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣〕
　　＝ ◎――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉

ブロッキングは長い方がよいのでしょうか？

1xTBS+skim milkを室温1時間で十分、その日の内に1次抗体とコンタクト
させない場合、ブロッキング液に浸してヲーバーナイト低温室で
ほっといてもいい。でもECLキットでは専用のブロッキング液を推奨している場合、それに従ったほうがいい。

>>653
O/Nだとほんのちょっとだけどバックが下がる。時間がかかるが
論文用のデータにはそうしてる。

>655
精製抗体でなく抗血清を使う場合、劇的に下がる場合もある。
ノンスペが全部消えてビビったこともある。
あくまでケースバイケースだが。

SDS-PAGEでなぜか低分子量域だけスメアになるんだけど、なんで？

●●●文芸誌の書き手に盗撮されてるのですが…●●●　　　　http://book.2ch.net/test/read.cgi/book/1050463002/-100
79 ：吾輩は名無しである ：03/04/29 15:36
>>76
んなことに驚いているおまえの方がキモい。「文学業界」というのは
君の幻想の中にしか存在せず、実際にあるのは出版界というのよ、
そこでは盗聴、盗撮、盗作、盗妻、盗愛人なんか日常茶飯事、
君が生まれるずっと前から、伝統的に続いてきたことなんだワ。
無邪気な厨房の君が、ふと迷い込んで驚いたのもムリはないが、
この世界の、とりわけ「モノ書き」と呼ばれる連中が溜まる辺りは
真昼間でも何がなにやら文目もわかぬ闇の領域で、とても君なぞがうろつける場所ではない。
創作に役立つならば、自分の糞を皿にのせてナイフで切りつつじっくりと観察するなんか
朝飯前の作家が、うじゃうじゃ居る。ま、世界が違うんだから、悪い夢を見たと思って、
おかーちゃんとこへ帰って、ションベンして寝なさい。

80 ：吾輩は名無しである ：03/04/29 19:41
>>79
まるでシャブなんぞを燻らせては粋がっているクソガキみたいな物言いだね。
上っ面にどんな御託を配していたところで、その実態は旧態然としたもの。
権力の横暴がまかり通る“サル山”なみの支配原理からいまだ抜け出せずにいる
点においては、理性や知性の先端と思われがちな出版界も例外でないってことがそんなに新しいことなの？（ぷ

>657
ゲル板がキタナイづら。

↓詳細
http://osusume.zero-yen.com/daigaku.html

>>659
ゲル板がキタナイとどうしてスメアになるの？

大腸菌で蛋白発現させるときのIPTGの濃度って、濃すぎてもダメなの（もちろん極端な例は除く）？

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>662
どっから上が極端な例かと逆に尋ねてみたい気もするが(w

まあ、封入体が出来ない濃度に抑えるのは最低限の常識でしょう。
PAGE精製するからそれでもかまわんというときもあるが、
たとえそういうときでもなぜかトラブルが多いので自分は避けている。

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

初めての抗体で複数のバンドが微妙な分子量で出たとき
どうやって目的のバンドを確認してますー？

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/jaz10.html

今さらって感じですが、アポトーシスの時のチトクロムCの検出の時の
サンプル調整法を教えてください。
論文を調べてやってるんですがどうもコントロールにまでバンドが
出てしまいます。

>>669
もっとポイントを絞って訊いた方が良いのでは？

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/hankaku10.html

>>667

大腸菌で組み換え体タンパク質を調整してコンペティションアッセイする。

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ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

　　　 　∧＿∧　 ∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　（　 ・３・） (　　＾＾ ） ＜これからも僕たちを応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣￣∪￣￣〕
　　＝ ◎――――――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉&ぼるじょあ

　　　 (⌒V⌒)
　　　│ ＾ ＾ │＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　⊂|　　　　|つ
　　　（＿）（＿）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎パン

>>571
ﾜﾛﾀ

はなし変わるけど、携帯ゲーム機"プレイステーションポータブル(PSP)

　久夛良木氏は，“PSPはゲーム業界が待ち望んだ究極の携帯機”として説明。「ここまでやるかと言われるスペックを投入した」という。
　発表によれば「PSP」は，曲面描画エンジン機能を有し，3Dグラフィックでゲームが楽しめる。
7.1chによるサラウンド，E3での発表以来，クリエイターたちにリクエストが高かった無線LANも搭載（802.11）。
MPEG-4（ACV）による美しい動画も楽しめるという。これによりゲーム以外の映画などでのニーズも期待する。
　外部端子で将来，GPSやデジタルチューナーにも接続したいとする。
また，久夛良木氏は，繰り返し「コピープロテクトがしっかりしていること」と力説。会場に集まった開発者たちにアピールしていた。
　さらに，ボタン設定なども明らかにされ，PS同様「○△□×」ボタン，R1・L1，アナログスティックが採用される。

この際、スク・エニもGBAからPSPに乗り換えたらどうでしょう。スク・エニの場合、PSPの方が実力を出しやすいような気がするんですが。
任天堂が携帯ゲーム機で圧倒的なシェアをもってるなら、スク・エニがそれを崩してみるのもおもしろいですし。かつて、PS人気の引き金となったFF７のように。

突然変なこといいだしてすまそ……
GBAと比較してみてどうなんですかね？（シェアの事は抜きで）

保守します

　　　　　　 lヽ ﾉ l　　　　　　　　ｌ l　ｌ ヽ　　 ヽ
　 )'ｰーノ(　 |　|　 | ､　　　　　 / l｜ ｌ　ハヽ　　|ｰ‐''"ｌ
　/　E　　|　|　|／| ﾊ　　/ / ,/ /|ﾉ /l /　ｌ l ｌ|　ｌ　 E ヽ
　l 　 ･　　i´ |　ヽ､| |ｒ|| |　//--‐'" 　 ｀'メ､_ｌﾉ| /　 ・　 /
　|　 C　　l　 トー-トヽ| |ノ　''"´｀　　　ｒｰ-/// |　 C　｜
　|　 ･　　 |／　　 　 | l ||､　''"""　 j　""''/ | |ヽｌ 　・　｜
　|　 L 　 |　　 　 　 | l |　ヽ,　 　― 　 ／　| |　ｌ　 L　 |
　| 　 !!　 |　　 　 /　| | |　　 ` ｰ-‐ ' ´||　,ﾉ| |　|　　!!　｜
ノｰ‐---､,|　 　 /　│ｌ､l　　　　　　 　 |ﾚ' ,ﾉﾉ　ﾉハ､_ノヽ
　/ 　　 　 　 ／　ノ⌒ヾ､　 ヽ　　　 ノハ,　　　 　 |
,/ 　 　　　,イーｆ'´ /´　　＼　| ,／´ ｜ヽl　　　 　 |
　　　　 ／-ト、|　┼―- ､_ヽﾒr'　, -=ｌ''"ハ　　　　|　 ｌ
　　 ,／　 　|　ヽ 　＼　　_,ノｰｆ' ´　　ﾉノ　 ヽ　 　｜　|
､_　　　 _ ‐''ｌ　　`ー‐―''" ⌒'ｰ--‐'´｀ヽ､_ 　　_,ノ　ノ
　 ￣￣　　 |　　　　　　　　　　 ／　 　　　　￣

久々に浮上

共同研究でメールが着たが・・・
抗体のホスト：ウナギ
って。どうしろと？

>>687
ウナギアレルギーの人を探せ。

>>302
遅レスで申し訳ないけど誰か教えて下さい

> loading controlには分子量の大きく違う蛋白を使って

アクチン以外にはどういう物がコントロールに使えるでしょうか?

age

>>689
チューブリンでやってるのを見たことありますが、
アクチンにしても
ホントにコントロールになるのか
気になります。

俺の抗体がタンパク質のあの部分に結合して．．．ハァハァ

あのー質問があります。
washするbufferにtweenを入れるとバンドが
たくさん検出されてしまうのですが、
こんな経験された方います？

bufferはPBSとTBSを試しましたが、どちらの場合も
Tweenをいれるとノンスペが大量に出て
SDS-PAGEみたいな結果になってしまいます。
Tweenなしで行うとバックが大きすぎてバンドが非常に見づらくなり
困っています。
ちなみにPVDF膜でセミドライで行っています。

あまりウエスタンには良くない抗体なんだと思う。

まずTweenの濃度を振ってみ。

それから、免疫沈降して目的分子を濃縮して
からやってみるとか、ブロッキング条件を変
えてみる。

>>694
レスありがとうございます。

＞まずTweenの濃度を振ってみ。

そういう考えかたがあったんですね。やってみます。
助言ありがとうございました。
しばらく試行錯誤してまた報告に来ます。

オビ＝ワンがニトロセルロース使えって
言ってるのが聞こえた。

>>693

うちもtween（20だっけ？）/PVDF使ってるけど
blockingしなくてもちゃんとシグナル出るし。
（昨日はbackかなり高めだったけど）

10%tweenのストックが腐ってたときにおかしくはなったけど。
他の人はうまくいってるのね？

ノンスペが大量でSDSみたいってのがよくわからんけど
ノンスペの形は丸？横線？

>>696
御意。
転写されてるのにPVDFだと全然光らん人がいた。

今日はtweenの濃度を0.01%と0.005%で洗うものと
Tweenの代わりに0.05%Tritonを使ってみるものと
一次抗体の洗いにPBSを用いて、二次抗体の洗いには0.05%Tweenを
入れたものの4種類でやっています。

>>697
うちの研究室ではTween20を使う習慣がなかったのですが、
あまりにもバックが消えなかったのでTween20を0.05%入れてみたところ、
バックは消えたんですけどバンドがたくさん出てきてしまったというわけなんです。
SDSPAGEの結果みたいというのは、タンパクを流したゲルを染色したときと
同じように、たくさんのバンドが出てしまうという感じです。
あと他にウェスタンをやっている人はいません。

>>696
検討してみます。ありがとうございます。
オビ＝ワンってなんですか？

穴筋の弟子

>>699
違うよ。上から

ヨーダ＞オビ＝ワン＞アナキン、ルークだよ

||G|*‘ ｏ‘ﾘ＜じゃぁ、次は梨沙子でハァハァしてね（はぁと）
http://www.tsugunaga-momoko.com/cgi-bin/kids/img/kids309.jpg

こんにちは。693です。
>>698の結果が出まして
見事、0.01%Tweenで非常に綺麗なバンドを検出することができました。
ちなみに他の結果は
0.005%Tween・・・洗いが不十分でバンドも見えず
PBS→0.05%Tween・・・わりとと洗えていてバンドも見えるがやや薄い。さらにノンスペがうっすらと。
Triton・・・全く洗えていない。真っ黒。

というわけで行き詰っていた実験も前に進めそうです。ありがとうございました。

このスレはもう誰も見ていない

良スレばかりが良く沈む。

良スレage

ピロリン・・・ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ウェスタンのときよく泡が入るのですがどうしたら良いですか？
タンク式です

>>707
前にこのスレでその話題はあったので検索してみて下さい

Westernの最後にマニュアルどおり5分、ECLのsolution(2液）に
晒しました。一つはバンドが非常に強かったんですが、
同じ5分という条件で取りたいと思って、無理やり５分晒したら
肉眼で見えるくらいくっきり（薄茶色）バンドがでますた。
で、Documentationの露光装置使ったら、そのくっきりバンドが全く
光りませんでした。というよりも、その強いポイントは真っ暗になってしまっている。
これって、副生成物のせいですか？
それと、どのくらいのバンドが出たらやめていますか？

１からずっと見ていたが、なかなかいいカキコがあるじゃないか、
オレもそこ苦労したんだよねぇ、と思って日付けを見たら、自分のカキコだったorz

痴呆か。。。

ウェスタンでたまに非還元処理サンプル（SDS,glycerol,tris のバッファーで
ボイルしたもの）を流して、検出しているものがあるのですが、検出された
タンパクはどのようなタンパク構造になっているのですか？SDSは非共有結合
に影響するらしいので、単純に共有結合だけが残った状態なのでしょうか？
長い文章ですいません。どなたか非還元処理について教えていただけないで
しょうか？よろしくお願いします。

>>712
SDSはペプチドのbackboneに結合（どういう結合だったか忘れたけど）して、
タンパクにチャージを与えるという役割があるんだけど、還元剤はS-S bond
を切るために使うよね。
非還元状態で電気泳動すると言うことは、S-S bondが残ったままということに
なるから、タンパク質が直鎖状になってないんだよ。
たぶん非還元処理サンプルって言うのをウエスタンで使っているってことは、
使う抗体が、直鎖状になったタンパクを認識出来なくなるからかな。
どういうタンパクのウエスタンか書いてないから、これくらいしか言えません。

即答、有難う御座います。

バ　ン　ド　が　全　く　光　り　ま　せ　ん　で　す　た　！

光　り　ま　せ　ん　で　す　た　！

そりゃＨＲＰ反応の副産物でＨＲＰ自身が酸化されたんだろ、濃いから。

そうですか。
HRPのside productってどんなものなのでしょうか。
酸化したら化学発光もしないっていうのは
わかるけど、chemicalがどうかがわかりません。

光　り　ま　せ　ん　で　す　た　！

既出かもしれないが、アジ化ナトリウム盛られてないか？

709の内容見ずに答えた。そりー。

>>720
光　り　ま　せ　ん　で　す　た　！

ﾆﾔ

光　り　ま　す　た　っ　！　！　！

す　た　っ　！　！　！

そ　の　と　き　・・・・　バ　ン　ド　が　光　っ　た ！！！

バンドだから光っているのか、光っているからバンドなのかはっきり始祖

頑張ったかいがありやっと釣れました。
バックグラウンドやスミアーで光る場合も、
光っていないバンドもあるから、バンドと光るは同じではないよね、この場合。

ウチのラボのDQNはαGST抗体使ってHis-tag融合タンパクにシグナル出てたYO!

光　り　ま　す　た　っ　！　！　！

>>728
気合入れてれば出ることもあるだろｗ

もう、このプロジェクトは終わりだと誰もが思った。
しかし・・・・・・
>>725

光　り　ま　す　た　っ　！　！　！

>>731
「すごいぞ。これでNature間違いなしだ！」
その夜、ラボのメンバー全員で祝杯をあげた。

が、しかし・・・。

よく調べてみると


　　　　抗　　体　　が　　違　　っ　　た　　！

確　認　を　し　ま　す　た　っ　！　！　！

何　回　も　し　ま　す　た　っ　！　！　！

自分で抗原を用意した場合、
ポリクローナル抗体の受託合成ってどこが安いですか。
ウサギかラットでお願いします。

↑
MBL

やっぱりラット一匹での作成でも￥35000以下は無いですかね？

あそこの回しもんか。いてまうでゴラァ
っていうか、面接で落とされた。

メタノール０％でトランスファーすると何が起こるんでしょうか。逆にメタノールを入れる効果を知っていたら教えてください。転写効率と関係がありそうですね。

リン酸化のモノクロ−ナル抗体つくって、最終的にELISAポジティブなモノクロをとってきたんだけど、westernでバンドがまったく検出されず…。
抗体のアイソタイプを調べると、IgG3で他のIgとは性質がかなり異なるらしい（S-S結合が極端に多いらしい…）
これがwesternに影響することなんてあるんでしょうか？こんな経験あるかた対策教えて下さい。

>>741
ディネーチャー

ガーン、すでにSDS-PAGEで変性しているタンパク質がさらにどんなかんじで
アートネーチャーするのでしょうか。教えて下さい。

アフォか。面部連打よ。

面部連打よにアートネーチャーか。
おめでたいスレだな。
>>745
メンブレンの変性の機序を説明されたし。
メンブレンが変性したらタンパクくっつかないね。

アートネーチャー

エタノールを入れると赤くなる。つうか、誰だ間違えたやつは。

>>741
入れなくてもするやつはする。効率はどうかなあ。
うちのは大量に残るやつがあるので0.01%SDSもデフォでいれてるけど。

ＰＶＤＦ使ってて、ＨＲＰ発色ですが最近メンブレン全体がべたーっと
染まりムラができてしまう問題や、また別の時には1ｃｍくらいの点状に
まったく染まってない抜けがみられる問題が起こります。どちらもレーン
には全く関係ないものです。どういう原因が考えられるのでしょうか。

のびませんね

新参者です。
>>749
1cm位の天井に染まってないっつーのはtransferのときDr.ゲルとめんぶれんの
間に泡々入れたせーだとおもわるる。
染まり村はwash−washer−washestで回避。

>751
十分に気をつけたつもりですがやはりその要因が大きいのですね
ありがとうございました

二次抗体を別の会社に変えただけでノンスペの出かたって変わるもんなんでしょうか？
誰か教えてください。
P.S　この良スレをぜひ続けていただきたい。

>753
それはそうです。それぞれの会社が全く同じ由来のモノクローナル抗体で
作った二次抗体を売り出してない限りは、会社によってかわります。
また、二次抗体の多くはポリクローナル抗体です。
会社が同じでも、ロットで差が出ることもあります。

１からのあまりの様変わりにﾜﾛｽage

グラジエントのゲルってpHはどうなってるんですか？
均一ゲルの場合は上部と下部のゲルでpH違うけど

age

ブロッキングに5％スキムミルクを使っているのですが、
各社で売ってるブロッキング液を使われている方いますか？良いですか？

末尾にたんがつく言葉を捜して生化学辞典を見た僕は馬鹿ですかそうですか

今、スキムミルクが品薄なんだよ。おまえらどうしてる？

ttp://18road.com/diary/?date=20050508

>>760
森永じゃだめなん？うちは大学の生協のスキムミルク使ってるけど結果は
かわらないよ。後、ギフコから売ってなかったけ？高いけど。

ギフコ？
ギブコかディフコの間違いじゃ？

>>761
今は盛永も逝き印も市場からほとんど消えているよ。漏れのところも逝き印を大量購入して使ってたんだが、ちょうどなくなったところにこのブーム。今はかろうじて見つけた盛永の一袋でつないでいるところ。
ちなみに逝き印と盛永を使って出た結果には何の変化もありません。今のところ。

倭寇のを使え

その他は全て同じ条件で，ブロッキングだけ
ミルク，BSA, その他..で比べたことある？

回答期待あげ

Blockingでなやんだことないからなぁ。
生協、ネッスル、バイオラッドみんなスキムミルク（ノンファットミルクな）
ならかわらんって。
バックが高い人って、単に抗体使いすぎじゃない？
特にHRP二次抗体は、注意されたし。

スキムミルクってどうしてブロッキングできるのでしょうか？
リン酸化タンパクの抗原の場合使ってはいけないと言うのは本当なのでしょうか
調べているのですが、中々わかりません。
もしよろしければ、ご教授いただきたいです。

カゼインは自然状態だとリン酸化タンパク質だからでねぇか？

だからシグマのカタログではわざわざ「脱リン酸化カゼイン」が商品リストにある。

でも，実際にはミルクでブロッキングしても
リン酸化タンパクの抗体でほとんどの場合
検出出来るよね．

新規です

ECLうまくいかねぇす・・・
熟達者いまつか？

>>771

一次抗体と二次抗体の相性が悪い
抗原タンパク質が検出限界以下
ブロッキング試薬が適切でない
血清に入れたアジ化塩がHRPを失活させた

初歩的なところで躓いています。
バイオラドのMini-PROTEAN 3CELL（No 165-3301/3302）というゲル作成キットを用いて
ゲルを作っていますが、よくもれてしまいます。
少量のときはそのまま使っていますが、結構な量がもれるときもあります。

マニュアルどおりに組み立てていますが、もれるときの対処法はかかれておらず
ただ熟練せよと英語で書かれていました。
目で見てもGel Casette Sandwitchの底面にずれはないように見えます。
こつがあると思うのですが、どなたかに教えてもらえませんか。

先にミリＱ水でリークテストをしています。その後エタノールで洗浄して乾かして
それから泳動ゲル溶液を入れると結構な時間がかかるのですが、
これを毎回繰り返すしかないのでしょうか。。。

君がコツを見つけたら僕に教えて下さい

>>774さんはどのようにやっていますか？
多少の漏れを計算に入れて多めに入れるとかでしょうか？
あるいはワセリンなどでシーリングしてもよいのでしょうか？

>>773 ズレは無いように見えるというけど、漏れるのはズレてるから。
うちのラボにも、必ず漏れる奴と一度も漏らしたことの無い奴がいる。

>>776
なるほど、確かにそうですよね。
もう一度やってみます。

>>777
多少うまくなりました。フィードバックさせていただきます。
ずれをなるべく少なくして、一番上のSpring loaded leverのてこになっている部分
（スプリングがあるところ）にマイクロチューブを突っ込んでプレートを下方へ
より強く押し付けるようにしたら漏れがなくなりました。

漏れがなく固まったのですが、下面のgasketと接する部分のゲルがガタガタに
なってしまいました。これはなぜでしょうか。。。

>>377
ストリッピング！…ﾊｱﾊｱ

アトーHP（ttp://www.atto.co.jp/japanesetop.html）にウェスたんのコツ…ﾊｱﾊｱ　のファイルがあるんだが、クリックしてもNot Found。
URL削って/ｐｄｆ/にしたら一覧が見えるからそこから選んでゲット。
無料だし、初心者さんいかが？

みなさん教えてください。

ストリッピングはだいたい何回くらい可能でしょうか。
リン酸化タンパクを見るときに、リン酸化、もとのタンパク、アクチンを見るため2回やっているのですが、
後々の追加検査のためにメンブレンをウェットな状態で保存しておくべきかどうか迷っています。

またECL Advanceというのを使っている方に感想をお伺いしたいです。
ECLとECL plusを使っていますが、使い方次第ではAdvanceも良いのではと思っているのですが。

ひえ〜

invitrogenのiBlot最強
ブロッティングが6分で終了
電気泳動より早い
お前らも買え

あれって、一回千円かかるんですよね？

ストリッピングの室温でできるプロトコル、バッファ組成ってないでつか？

今BIO-RADかどこかのstripping buffer使ってるんだけど、高いから自作したいの。

俺も知りたい．どなたか教えて下さい．留学中はPierceの
stripping bufferを使ってたけど帰国後は高くて買えない．

>>784-785
10N NaOH 0.5ml+25mlH20でメンブレン３０分振るだけ。
そのあとミルクでブロッキング。

おれはいつもこれ。２回くらいストリッピング可能。
だまされたと思ってやってみ。

>>786
ありが�d

グリシン使う組成もあった気がするんだけど、どなたかご存知ないかしら？

手元のプロトコルだと、

100mM Glycine-HCl pH=2.9,20min, RT.
Rinse with wash buffer.

または

2% SDS, 62.5mM Tris pH=6.8,100mM BME. 30min at 50-70C.
Rinseしてblocking

>786
10N NaOHって膜痛まね？

ストリッピングすると結果汚くならない？
特に貴重なサンプルでもない限り、俺は流しなおす。

ECLシリーズは、ECL plusが使いやすいな。
それでバンドでないなら、PIERCEのwest pico, west dura シリーズで決まり。
面部連を二次抗体後キチンと洗わないと酷くバックが出るがな。

>>788
ありが�d。早速調製するます。
遅レスになってしまいましたが；
確か、グリシンの場合は4℃保存じゃないとカビるのよね・・

age

グリシントリス…グリトリス(*´д｀*)ﾊｧﾊｧﾊｧｱﾊｧ

ウエスタンしてフイルム現像すると、透明になりきらずに濁るってか曇るんだけどどうして？

現像液と定着液の後にちゃんと洗えてないんじゃね

>>794
ありがとう。
手抜きしてたぜ

今日はウエスタン10枚やった。
俺の努力プライスレス

↑価値の無い努力だなｗ

ウエスタン10枚ってどんな土方だよｗ

土方ﾊｧﾊｧ

800記念

心臓細胞中のリン酸化AktをCell signal社の抗体(Ser 473)とECL plusで検出したいのですが、1次抗体は
何倍希釈したらいいんでしょうか？
前の方の書き込みでブロッキング剤が重要みたいな話になってましたが、バイオラッドのTBS 1%/Casein では駄目でしょうか？

素人で申し訳ないです

>801
そんなの公開していいの？

cell signalingだったらカタログに推奨値があるだろうから、
とりあえずその値でやってみたら？

･ﾖ･�ﾁﾃ･ｭ･ｰ､ﾎｸｶﾍ､ｬ､・ｫ､熙ﾞ､ｻ､｣､ﾊ､ﾇ･ﾟ･・ｯ､茱ﾂ｣ﾓ｣ﾁ､ﾇﾈﾃｰﾛﾅｪ､ﾊｷ・・#10;､ｬﾍﾞ､ｨ､鬢・・ﾇ､ｹ､ｫ｡ｩ

ブロッキングの原理がわかりません。どうしてミルクやＢＳＡを使うんですか？

>>798
ひじかたさんです

ウエスタン・・・アハアハ

>801
自分で希釈倍率を振りなさい。

あげ

リン酸化ペプチド抗体のWBにカゼインなんか使うな、バカ
カゼイン自体がリン酸化タンパク質だろ、このやろ

かぜいしろたかぶ

age

あげ

あげ

グリシンなんか汚い

グリシルグリシンは？

エタちん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

フェノちゅう…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

カナちゃんマイちゃん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

>>818
シンちゃん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

PVDFをBSAでブロッキングした後、1週間くらいブロッキング液につけておいても
大丈夫ですか？
みなさんはどれくらいまで置いておいたことがありますか？

ブロッキングの原理を教えてください

>>820

半日、ブロッキングしたら風乾してラッピングして-30℃保存にしておけ。
数日でスキムミルクが分離、沈澱が出たり、なにより腐るカビる

>>820
アジ化ナトリウム入れとけばおｋ

つーか、そんなに長く放置するつもりなら、なぜブロッキングしてしまったのかと。
ブロッキングする前なら割と何日も持つのに。

何日もちますか？

試料タンパク質を結合させたPVDF膜をブロッキングしてからキムタオルの上で乾燥させろ。
サランラップに包んで封筒に入れれば郵送だってできる。

あげ

ぶろっ王ｗｗｗ

http://zip.2chan.net/a/src/1214468010243.jpg

ハァハァ
http://cgi.2chan.net/o/src/1215074167323.jpg

ァハァハ

β-アクチンまでdevelopmentの終わった後のmembrane、保存してます？

してません

西たん　ﾊｧﾊｧ

>>834
西はじめ？

上巣短

あげ

aghe