【Folding】タンパク質の【尿素・グアニジウム塩】

世界中でいろいろやっているようだから、俺にも教えてくれよ。

うは
タンパク質の構造としたかったのにいきなり間違えてる

アルギニンで決まりでしょ。

そういうときはシャペロン教

巻き戻しは泥沼にハマると悲惨だぞ

ほとんどの巻き戻しは泥沼にハマる　by Murphys's Law

巻き戻しってどんな主砲があるよ？
変性剤を取り除く意外で

とりあえず思いっきり希釈しとけ

希釈すればネイティブな状態にたぶん戻るだろうが
そのタンパク質が再生されたかは測定しなきゃわかんないよね

うわーピペド臭いスレだな

タンパク質の構造を３Ｄで見れたり、構造変化を予測できるソフトないの？
知ってたら教えてください

忠告その１。カラム上での巻き戻しは滅多にうまく行かない。
忠告その２。ゆっくり透析するぐらいなら，さっさと希釈した方がまし。

タイトな二量体形成する分子に異なるタグを付けてそれぞれ精製して、in vitroで混ぜても、
pull-downによる結合の確認実験が上手くいかない時、変成ー再生の過程を経ると、
異なるタグした分子間で二量体ができるので結合が確認できる。

忠告その３。尿素を使うぐらいなら，多少高価でも塩酸グアニジン使った方が良い。
忠告その４。可溶化に界面活性剤を使うなら，それをあとで除去することも考えよ。(透析では抜けない)
忠告その５。うまくいかない場合には，SS結合や金属イオンの必要性がないか考えよ。

じゃあ界面活性剤はどうやって取り除くの？

界面活性剤の取り除き方
その１。アフィニティ精製するときに洗い流す。
その２。界面活性剤を吸着する試薬を添加する。(シクロデキストリン，シクロアミロースなど)
その３。臨界ミセル濃度(溶媒条件によって変化する)によっては透析でもぬけることがある。
別解。はじめから必要十分量の界面活性剤だけ添加し，除かなくても済むようにする。

>>16
詳しいな
さんくす

ｱｾﾄﾝ沈殿で海面活性材は抜けますか

TCAアセトン法なら大丈夫かも。

何回も洗いたいのなら、CHCl3-アセトン法がおすすめ。
ﾐﾆﾌﾟﾚﾌﾟの応用だから、だれかしら知ってると思うが、
要望あったら書き込むよ

機能未知のタンパクの場合、精製過程で立体構造が保たれているかどうかは、わからないから辛い。

>>19はこのスレのネ申とする

SDSやデオキシコール酸はCMCが高いから透析で抜けやすいと言われるね

>>10
ピペドとオパピは響きが似てる。

泥沼にはまるだけだ。
手も荒れる。

発現領域を改めるか、さらに発現系を替えるか。

それでだめなら諦める。リスクでかすぎ。

まぁ、修士までなら結果ださなくていいんだし大丈夫だ

誰かいないの？

ダイナマイト浮上！

最近うまく行ったのはアミノ酸の添加によるいフォールディング。
アルギニンとグリシンでうまく行った。プロリン使う人もいるらしい。
分子量が小さいので透析で除くのも簡単。ただ除くとアグリゲーションを
起こすこともある。アミノ酸を除かなくてもいい実験系で使えればBest。

崩れたピペド人生を巻き戻したいのですがどんな方法がおすすめですか。

尿素配合クリームを顔に塗りたくりましょう

>>20
ゲル濾過のパターンでわかることがあるよ。
変な位置にでるとか、やたらテーリングしてるとかね

たまにあげ

>>31
うまく行っていないらしいことは耀かもしれないが正しい分子量の
位置にピークが出たとしても機能的かどうか確認できなければ
うまくリフォールドされたとはいえない。
それよりもフォールドした蛋白質はアグリやすいからカラムに詰まって
出てこない場合が多い。その場合カラムがお釈迦になるかWashにやたらと
時間がかかるからあまりお勧めできない（経験者談）。

>>33
リフォールディング技術ってそこまで重要なの？
めんどくせぇだけじゃんとしか思わない
新しいの買え・使えよとしか思わない

>>34はリフォールディングをリサイクルか何かと勘違いしてるのか？

>>35
34じゃないけど違うの？
ｋｗｓｋ教えてくれ

あと、この問題わかる？
２．タンパク質の折りたたみ（folding）について次の問に答えよ。
（１）モルテン・グロビュール(molten globule)とは何か説明せよ。タンパク
質がほどけた（unfolded）状態から折りたたまれた（folded）状態に至る
過程における自由エネルギー変化をモルテン・グロビュールも含めて示せ。

http://www.nubio.nagoya-u.ac.jp/m2003/m2007senmon.pdf#search='なぜモルテンがあるか%20タンパク質'

愛はお金じゃ買えません
ほとんどのタンパク質もお金じゃ買えません

だから大腸菌などに作らせます

ところが多くの場合は作らせても正しい構造をとってくれません
そんなタンパク質は使い物になりません

だから一旦作らせたタンパク質に何とかして正しい構造を取らせようとします
これがリフォールディング

工業規模で生産しようとすると、大腸菌や枯草菌で大量発現するときに、
最初のステップで目的蛋白質が沈殿に来ることがプロセス的にラクというこ
ともあります。工業生産では、まず蛋白質を封入体に押し込めて沈殿を
集めて洗浄し、それからおもむろに巻き戻し、なわけです。

一回も正しい構造をとってないのに、リ フォールディングってのも変な話だよな。

ミスフォールディング→アンフォールディング→リフォールディング　ってことジャマイカ

>>37
thx
>>36の問題はわかんない？
もしわかるなら解説よろしくお願いします

>>40
リフォールディングって言っても
ミスフォールディングに戻すわけじゃないし何ともいえないと思う

>>42
いやそうだけどさ
何でリフォールディングと呼ぶことになったのか想像してみただけ

>>41
んー絵を描く／探すのがメンドクサイのでスルーしたのだけどｗ

大雑把には
http://www.soton.ac.uk/~jbc2/energy.gif
の左端がunfolded、local minimumって書いてあるところが
molten globule、global minimumって書いてあるところが
folded。

モルテン・グロビュールは、二次構造は天然状態と同じだけど
三次構造は違う状態。

>>44
ｓｐｔｈｘ
よく知ってるな
何者ですか？院生とか？

＞モルテン・グロビュールは、二次構造は天然状態と同じだけど
三次構造は違う状態。

これ初耳。どんなタンパクでもそうなの？ちなみに参考論文とかあればｋｗｓｋ教えてくだしあ

>>45
いや、よく教科書に書いてあるよ。
図は普通はギザギザなしで、それぞれの状態の間を斜線で結んだ図が。

モルテングロビュールについては、αラクトアルブミンの酸変性で
ＣＤ測るとそういう特徴を持ったものがとれてきて、でその後、
フォールディングの中間状態がそういう性質を持つと思われる
タンパク質がいくつか出てきた。

でもリゾチームではモルテングロビュールは途中に見つからないし、
調べられてるものは小さい分子が多いだろうし、そもそもフォールディングが
決まった経路を通るなんて



あ、過激なこと言いそうになるからこの辺でｗ

>>46
その教科書教えてくだしあ
自分生物系じゃないんで教科書ないんです

>>47
あー今見てたのは洋書だね
訳書だと「タンパク質の構造入門」とか大学生協にあるんじゃないかな
モルテングロビュールって索引で見れば>>44と同様の図が出てくるよ
これに限らずあちこちで見かけた記憶があるから生化学や生物物理学の
教科書には結構な確率であると思うよ

で、「タンパク質の構造入門」の方だとリゾチームは複数の中間状態が
混ざってて、それぞれ部分的にモルテングロビュールって書いてあるね
でも部分的にってことを言えば何でもありな気がするけどｗ

>>48
テラｓｐｔｈｘ

＞モルテングロビュールについては、αラクトアルブミンの酸変性で
ＣＤ測るとそういう特徴を持ったものがとれてきて、でその後、
フォールディングの中間状態がそういう性質を持つと思われる
タンパク質がいくつか出てきた。

ここに興味があるんだけど、ここもタンパク質の構造入門に記載されてますか？

>>49
うーん、その件のそのものは載ってないね。
その説明はWhitfordのProteinsだけど、この本ときどき
大きく間違ってんだよなあｗ
gagliano.ims.ac.jp/tokutei/Newsletter/WBNLNo42.HP.pdf
を見ると、チトクロームｃが先ですかね。

チトクロームｃ・・・
ググったけど、生物じゃない俺にはいまいち想像できない
とりあえず酵素とだけ覚えておきます

間違ってるってｗ
まぁ、図書館にあれば読んでみますｗ

あと、尿素って変性剤ですよね？
どういう風に蛋白に作用して変性するんですか？
水素結合をきるみたいだけど、具体的にどういう風に尿素が影響するのかわかんないんです　

>>51
チトクロームcは酵素じゃないよ。
呼吸の電子伝達系の中で働く小さな水溶性タンパク質で電子を受け取ったり他にあげたりしながら電子を運びます。

教科書が間違ってることはよくあるよ。自分の専門以外のことも書かなくちゃならないからね。

尿素は液体の水の中にある水素結合の規則的な３次元ネットワークを壊します。
疎水結合は非極性分子の表面に水が規則的に並ぶのがエントロピー的に不利なことから生まれます。
したがって尿素は疎水結合を弱めます。

と思ってたんだけど、尿素は水の構造を破壊するわけじゃないらしいｗ
http://www.jstage.jst.go.jp/article/biophys/42/2/72/_pdf/-char/ja/
うーん、これに納得できないんだけどｗ　そうするとカオトロピック云々はどうなるんだ？
http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%AB%E3%82%AA%E3%83%88%E3%83%AD%E3%83%94%E3%83%83%E3%82%AF

いろいろ議論があるからきっとテストには出ないよｗ

>>52
いろいろサンクス

研究って難しいんだな
当たり前だけど、答え探す作業だからわからないことだらけ
なんかモヤモヤだわ

MG状態はあるタンパクにはあるかもしれないが，一般に言えるかどうかは疑問ってことになってた．圧力変えてNMRとかの実験で．

タンパク質の遠紫外領域におけるＣＤスペクトルを測ると
αへリックスの場合、二つのピークが出ますよね？
それらの二つのピークに由来するものは全く同じなのですか？

222nmはn-π*遷移、208nmはπ-π*遷移によるものです。

>>56
サンクス
難しくて、よくわからんが調べてみる

b-ZIPの二量体実験

分かった。

>>56
もう少しタンパク質の構造と絡めて教えてください！

そして、>>56に書いていることのソースください！

ちなみに208nmの楕円率は小さく（よりマイナスに）
222nm楕円率は大きくなる場合とかあるんですか？

>>60
そんなに「！」をつけられても出せるものは同じだよｗ

ソースは蛋白質機能の分子論（浜口著）

で、αへリックスだけなら、208nmと222nmの比は変わらないはず。
βシートが混ざると218nmに負のバンドがあるから、222nmが208nmより大きく見える。
ランダム構造も多少影響するけど。

というわけでn-π*とかπ-π*とか考えてもしょうがないんじゃないかな。構造的には。

タンパク質の円二色性スペクトルの原理を深く考えたことないなあ。
右巻きヘリックスを巻くから主鎖の紫外吸光に旋光性が出るとしか理解していない。

>>61>>62
ありがとうございます

論文等でαヘリックスが３４％から４４％に増えているとかありますけど
これはどうやって計算しているんですか？

論文が自分で読めるくらいの人なら、その辺の実験書を読んでみてください。
例えば、新生化学実験講座１　タンパク質�V　高次構造　東京化学同人　p50-51　とか。

>>64
ありがとうございます
チェックしてみます

うん、見つからないようだったらまたきいて下さい。

あー>>54見逃してた。コメントした方がいいかなあ？

Foldingの実験の大部分は限られた種類のタンパク質で行われてきたので、その理論に
本当に一般性があるかどうかは慎重に見た方がと思う、とか言ったら怒られるかなｗ

この研究って民間企業とのマッチングほとんどないですよね？
こういう研究してる人はどんな企業に行くんですか？

「この研究」とか「こういう研究」って、何を指してるのかな？

自分は企業のことはあまりわからないけど、企業の人が研究室にＣＤ借りに来るよ。

>>69
Foldingについての研究
どんな企業の人が来るの？

うーん、Foldingそのものについて研究してるわけじゃないから、それについては答えられないけど、
一般的には、タンパク質を大量生産しようとしていて、それがうまくfoldしないタンパクであれば、
当然企業はそこを改善しようとするんじゃないかな。早々に諦めてるのかもしれないけど。
研究という言葉でFoldingの理論的な研究を指しているのなら、その研究が実際のFoldingの
効率化に役立っているかどうかは怪しいところですねｗ（怒られそうｗ）

ＣＤを借りに来るのは、あるタンパク質を売ってる企業で、そのタンパク質が何度で変性するかとか、
変異を入れると安定性がどう変わるかとかを調べに来てるよ。

>>71
その企業名を伏せ字でいいからよろしく！

>>71
その企業名を伏せ字でいいからよろしくお願いします

>>72-73
それは無理というものですｗ　それに既にその企業はその研究から手を引いたしｗ

現在形で書いたから誤解を招いたようですみません。
ただ、他の企業が借りに来ることもたびたびあったし、これからも別の企業が来るだろうという意味で一般的な書き方をしました。

みんなたのむ
Team Id 58562

このスレタイにもあるように、
なぜfoldingを調べる際には尿素やグアニジウム塩を変性剤とするのですか？

これ以外もたまには見ますが、この二つが圧倒的に多い気がするのですが

逆になぜ○○を使わないのですか？と聞かれると答えられるかも？

>>78
他は・・・界面活性剤とかか？
そっちの方が安価じゃない？

一般に界面活性剤は加えた後取り除くのが面倒ですね。

値段で言うなら、尿素は十分安価じゃないですか？

>>80
foldingならそうだな
ちなみにunfolding調べる研究の方が多いと思うけど、その点（変性剤として尿素等をよく使う点）はどう思いますか？

＞ちなみにunfolding調べる研究の方が多いと思うけど、

すみません、用語にひっかかってしまうたちで。
unfolding調べる研究というのが、unfolding processを調べる研究という意味なら、逆だと思います。
別の意味でしょうかね。

misfolded (denatured) stateやintermediate stateを調べる研究という意味なら、それなりに多いですね。
この場合に用いるのは、熱変性だったり酸変性だったりいろいろじゃないでしょうか。

圧力変性ってのもあるよな

結晶化が進歩すればいいのにね

>>64
本が貸出中でした
論文で説明してる奴はありますか？

見つけることが出来ました。すみません

αヘリックスを見積もる方法として、βシートと不規則構造のＣＤは２２２ｎｍで一致するとありまが、どう見ても一致していません
２０８ｎｍの間違いではないのでしょうか？

元論文はこれですかね。
http://pubs.acs.org/cgi-bin/archive.cgi/bichaw/1972/11/i22/pdf/bi00772a015.pdf
これのTable VとFigures 1 & 3を見ると良いかな。

208nmを使った論文が>>88の３年前に出てます。
http://pubs.acs.org/cgi-bin/archive.cgi/bichaw/1969/8/i10/pdf/bi00838a031.pdf
>>87の方はこのFigure 1のような図を見ておられるのではないかと思います。

しかしこの方法では見積もりと実際の構造が一致しないことを>>88の論文は指摘しています。

>>88>>89
すみませんが、その論文見れません
私が言っているのは一般的に出回っている
タンパク質の２次構造に関するCDスペクトルの図のことです

>>90
一般的に出回っているタンパク質の２次構造と言われてもいろいろあります。
>>88の図は５つの蛋白構造から計算された理想的なヘリックス・β・ランダム構造のスペクトルで、222nmで交差しています。
>>89の図はポリ-L-リジンのヘリックス・β・ランダム構造と呼ぶ状態のスペクトルで、208nmで交差しています。
>>87の方は>>89の方を見てお話されているのでは。

>>91
おそらくそうです
あと本で見積もり方確認してみましたが、αヘリックスだけ見積もる奴以外は難しそうです
メアド晒したら、いろいろ教えていただけたりしますか？

無理ならもちろん断って頂いて結構ですが

うーんｗ
捨てアド作るのも面倒だし個人相手とは言え正体知られるのもつらいのでメールはご容赦ください

本質的にはそうですよ。つまりαヘリックス以外を見積もっても不正確です。

そうですか・・・
捨てアドでなくても、名前はばれないのでは？

あれは最初に書いてありました
たまにαヘリックスが増加して、Βシートがなくなるみたいな記載もみますが
あれはどうやて計算しているのですか？

論文なら推定方法がどこかに書いてあるはずですよ。
CDには推定ソフトがついているので、それで出てきた値を書いているかもしれません。
ソフトはたぶん、>>88に類似の方法でやっていると思います。
でもαヘリックス以外は不正確だと思った方がいいと思います。

あるいは、元の蛋白が結晶解析などからβシートだらけとわかっていれば、そういう書き方は
「推定」として許されるでしょうね。
また、典型的なランダム構造のスペクトルはよく知られているので、ランダムのみという
言い方も許されると思います。

>>95
ありがとうございます

http://search.e-gov.go.jp/servlet/Public?CLASSNAME=Pcm1010&BID=495080028&OBJCD=&GROUP=

２−メルカプトエタノールが毒物になります。

意見募集してるよ。

変性段階におけるα‐ラクトアルブミンの二次構造の変化を示した論文知りませんか？
上で言ってた、二次構造を推定したやつです。

上で扱った教科書では文献引いてないみたいなので、molten globuleとlactalbuminでPubMed検索した後、一番古い文献の要旨を見ると、
FEBS Lett. 1981 Dec 28;136(2):311-5.
Alpha-Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure?
Dolgikh DA, Gilmanshin RI, Brazhnikov EV, Bychkova VE, Semisotnov GV, Venyaminov SYu , Ptitsyn OB.
これじゃないかな？

>>99
ありがとうございます。
見れなかったけど

ネットで検索して探しているんだけど、具体的に計算例を示したのないなー
値を入れたら計算してくれるソフトとかあればいいのに

>>100
>>99は
http://www.sciencedirect.com/science/journal/00145793
から辿っていってみてください

>>100
ソフトは自分では使わないけど、
http://www2.umdnj.edu/cdrwjweb/
とか

>>102
英語全然わかんねー
すみません；

じゃこことか
http://www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/formjs.html

誤解させたかもしれないけど、挙げたのはＣＤのデータファイルを
入力するプログラムで、特定の波長の値を入れるようにはなっていないはずです。
（まともにチェックしてないけど）

特定の波長の値を数個入れる方法を期待されているのかもしれませんが、
αヘリックス以外は不正確になってしまうでしょうから、ないのでは？知りませんが。

そもそもプログラムはＣＤの装置についているはずですし、探す必要のある人は
少ない気がします。

α‐ラクトアルブミンのunfoldingって、どこまでわかっているんですか？
こういうのって、ＣＤ測って終わりって感じですか？
結晶化技術が向上して、MG状態等も結晶化できるようになるのを待ってる感じですか？

既存の測定法には、unfolding過程を知るには限界があると思うんですが

あとグアニジウム塩の濃度を少しずつ大きくしたサンプルをたくさん用意して
全てＮＭＲ測れば良くないですか？

フォールディングの測定法に関しては、こないだの船堀のタンパク学会で
若手セッションがあったらしいけど、漏れは引退したので知らない。
てゆか、人づてに聞いたが完璧に忘れた。

分散コンピューティング Folding@homeについて

トリプトファンの蛍光を計測＞unfolding

�_だろ

不溶性ばっかりとれる

アミコンウルトラを再利用している方いませんか？
やり方をお聞きしたいです･･･

経済産業省 二酸化炭素回収・貯留 研究
http://www.google.co.jp/search?hl=ja&q=%8Co%8D%CF%8EY%8B%C6%8F%C8+%93%F1%8E_%89%BB%92Y%91f%89%F1%8E%FB%81E%92%99%97%AF+%8C%A4%8B%86

kaken.nii.ac.jp 研究者番号 リゾルバーID 二酸化炭素 貯留
http://www.google.co.jp/search?hl=ja&q=site%3Akaken.nii.ac.jp+%8C%A4%8B%86%8E%D2%94%D4%8D%86+%83%8A%83]%83%8B%83o%81[ID+%93%F1%8E_%89%BB%92Y%91f+%92%99%97%AF


官学連携合作税金泥棒創成研究


経済産業省主導のオカルト研究らしい

大腸菌から取り出したタンパク質を変性させ透析するまで保存するのに
グアニジン塩酸を使うことを考えているのですが
グレードを生化学用の99.5%or98%のどちらにしようか迷っています

98%でもタンパクに影響が出ることはないのでしょうか？

使用前にグアニジン塩酸溶液を混合セルロースで濾過するか
透析を行えば不純物が抜けるのでしょうか？