vectorへのこだわりを語れや

plasmidからファージ,YACまで何でも語って

それにしてもinvitrogenのGATEWAYとTOPO最強な気がするけど、
お前ら使ってる？
TOPO自作出来ないところがちょっとつらいけど、
俺の試算だと1/4までは十分にスケールダウンできるな。
そうすると一回クローニング800円だからかなり安いと思うぜ

TOPOってなんだ？

TOPOも知らんヒト、このスレこんといて。

いいじゃねえか。
ligaseみたいなもんだ。
それがvectorにくっついてて、
インサートと混ぜると５分でライゲーション完了
しかもかなりの効率らしい。
PCR productもblunt endも５分

pPCR-TOPOとか、コンピ別で売ってくれりゃもっと安くなるのにな。
だれかTOPO自作できるやついないの？

ヴェクトルの内積と外積の違いについて述べよ。

ほ乳類発現ベクター何が好き？

>5さん
TOPOはcompetent cell有り無し選べないから、
ウチではさいきんQIAGENの同様のキットに乗り換えました。
こっちはcompetent cell有り無しが選択できますよ。
コスト的にも問題ないんじゃないかなあと。
TOPOもcompetent cell有りなしについてアンケートしてたみたいだけど
近いうち選択できるようになるのかな？

>>8
え？QIAGENにもTOPOあるの？
まあコンピのほうが足りなくなると思うからコンピだけ買えば良いんだけどな。

今キアゲンのページ見てきた。
JAROに訴えたくなる宣伝だった。

GATEWAY用のファージベクターとかってもうある？
もちろんin vivo exisionできる奴

>7 pTk

このスレよんで、昔記念に買ったTOPOで、
ブラントエンドにAつけてトラホしてみたらほぼ１００％白コロニーでびびった。
もうやめられません。

＜血液型A型の一般的な特徴＞（見せかけの優しさ・もっともらしさ（偽善）に騙され
るな！）
●とにかく気が小さい(神経質、臆病、二言目には「世間」、了見が狭い）
●他人に異常に干渉し、しかも好戦的・ファイト満々（キモイ、自己中心）
●自尊心が異常に強く、自分が馬鹿にされると怒るくせに平気で他人を馬鹿にしようと
する（ただし、相手を表面的・形式的にしか判断できず(早合点・誤解の名人)、実際に
はたいてい、内面的・実質的に負けている）
●本音は、ものすごく幼稚で倫理意識が異常に低い（人にばれさえしなければＯＫ！）
●「常識、常識」と口うるさいが、実はA型の常識はピントがズレまくっている（日本
の常識は世界の非常識）
●権力、強者（警察、暴走族…ｅｔｃ）に弱く、弱者には威張り散らす（強い者にはへつらい、弱い者に対してはいじめる）
●あら探しだけは名人級でウザイ（例え10の長所があってもほめることをせず、たった１つの短所を見つけてはけなす）
●基本的に悲観主義でマイナス思考に支配されているため性格がうっとうしい（根暗）
●単独では何もできない（群れでしか行動できないヘタレ）
●少数派の異質、異文化を排斥する(差別主義者、狭量）
●集団によるいじめのパイオニア＆天才(陰湿＆陰険）
●悪口、陰口が大好き（Ａ型が３人寄れば他人の悪口、裏表が激しい）
●他人からどう見られているか、人の目を異常に気にする（「〜みたい」とよく言う、
世間体命）
●自分の感情をうまく表現できず、コミュニケーション能力に乏しい（同じことを何度
も言ってキモイ）　
●表面上意気投合しているようでも、腹は各自バラバラで融通が利かず、頑固(本当は
個性・アク強い）
●人を信じられず、疑い深い（自分自身裏表が激しいため、他人に対してもそう思う）
●自ら好んでストイックな生活をしストレスを溜めておきながら、他人に猛烈に嫉妬
する（不合理な馬鹿）
●執念深く、粘着でしつこい（「一生恨みます」タイプ）
●自分に甘く他人に厳しい（自分のことは棚に上げてまず他人を責める。しかも冷酷）
●男は、女々しいあるいは女の腐ったみたいな考えのやつが多い(例：「俺のほうが男
前やのに、なんでや！（あの野郎の足を引っ張ってやる！！）」）

6時間くらいで十分増える超ハイコピーなベクターとかさっさと作れや。
何十年overnight cultureさせるねん

ユニバーサルプライマー自作してない奴っているんだな。

>>15
あんたそれ勘違いや
6時間くらいで十分増える超ハイグローな大腸菌とかさっさと作れや。
何十年overnight cultureさせるねん

ベクターはやっぱりpBluescriptが使いやすいな。
Blue/white selectionはつかわんけど。

pGEM-T easy しか使ったことないや．

汎用クローニングベクターの条件としては、
M13forwardとreverseプライマーが使える事と、
ハイコピーってことと両側から転写できるってことと、
青白選抜できるってことくらいか？
あとなんかある？

１本鎖レスキュー

ＭＳＣの外側に３突
内側に５突かブラントのサイトがある
クローニングサイトによく使うEcoRI，HindIII，BamHIは
ＭＣＳのどまんなか
これでデリーションも簡単

いっぽんさレスキューってなにするの？
昔のシーケンス？

>>21
やっぱBluescript?
でもあんましmaterial methodに出てこないよね。

>23
省略されちゃうからじゃない？

bluescriptにもカナマイで選抜できる奴ないのかね？
カナマイでできる良いベクターっつうと何？

つまんねーな。
クローニングベクターばっかりかよ。

pBluescript最高。クローニングの時はまずこれを考えるな。

んじゃ、>>26さん、こだわりをどうぞ

やっぱりpSUPERっしょ！！！

ワラタ（w

pSUPER の EcoRI, HindIII より外側は pBlueScriptII

>>25
pEGFP

T-vector自作法をきちんとだれか教えて下さい

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>>33
dTTP 1mM 入れて、
Taq poly入れて,
７２度で２時間バキューン.
でできますた

>>35

MgCl2を5-10mMぐらい入れろ。

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viral conditional expression vector!!

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viral vectorって始めるの大変？

TOPOのブラントのヤツって最大、どのくらいはいる？

ほだから、pSUPERの使いごこち報告してクレヨン。
オレは危うしだぞ、ゴルアアア！！

おいらの作ったKOのためのtargetting vectorは凄いぜ。
４piece ligationで
vector-short arm(2kbp)-neo(1.2kbp, blunt end)-long arm(3kbp)
でarmの両端は同じHindIII siteね。80クローンとって一つだけ
当たってた。それをprogress reportで発表したら普通そんなことしないって
いわれたよ。でも取れたもの勝ちだよね。

>42
よかったですね！ゴルアアアアアーーー！！

>>43
あ、ちゃんとすぐにKOされたES細胞もとったからね。でもその後の
ことは聞かないで。

危うしってどういう意味だよ、ゴルアアア！！

>>45
オレに聞いてるんですか？ゴルアアアアーーーー！！！

>>40

bluntのやつ買うのもったいないから、
pPCRIIにいれてる。
pfuで増やしたPCR産物なら、PCRの後にふつうのTaq少しまぜて
72どで10分あっためてそのままcloning
反応スケールを1/4にへらしてコンピも1/4にしたけど、
50こ位コロニーでて48こ位白かったよ

みなさんお勧めのベクタープライマーは何ですか？
シークエンスもきれいに読めるの。

545 ：名無しゲノムのクローンさん ：03/03/08 00:07
やっぱり、ベクター型って、相当あやしくない？
コトラしたら、トランスフェクション効率自体が激減
（もしくは、細胞が死んで）して、
見かけ上、発現量が減ってるように思うんだけど。。。

546 ：名無しゲノムのクローンさん ：03/03/08 00:48
>>545
おれもつくづくそう思ってた、だから論文のとかも信用できない。
コントロールのやつも飽和してるし、きっとけっこうづれてるはずかと。

547 ：545 ：03/03/08 01:22
>>546
ああ。。。やっぱりですか。
なんで、みんな疑問に思わないのかな？
論文の見るといかにもうまくいってるように見えるからかな。
オレが思うに、コトラでチェックするにしても、
「遺伝子Aベクターと、遺伝子Bベクターと、Aに対するsiRNAベクター」
の組み合わせでトランスフェクションして、
Bが変化せずに、Aのみが減る事を示さないと意味ないのではないだろうか。
そうすれば、トランスフェクション効率や細胞死のサイドエフェクトの
可能性を除外できると思う。
この方法でチェックしたヒトいる？


どうよ？！

10kb断片をTAクローニングしてみたいんですが、逝けますかね？
使うベクターはプロメガのT-vectorってヤツなんですって。

TA-vectorなんて自作で十分。

Sma Iか、EcoRVで切ったベクターにTaqバッファーと5mM MgCl2と
Taqを添加して７６度で２時間、フェノクロエタ沈で終わり。

0.1mM dTTPを入れ忘れるな。

SmaIよりもEcoRVの方が効率がよいな
なぜかわわからんが

そゆわけでpUCぢゃなくてBlueScript

49にレスくれよー

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インサートのサイズってなにに依存すんだろ。

ここで絶賛のTOPO。ブラントのヤツに５kbp入れようと
したけど一つも入らんぞゴラァ

>>57
1kbp越えるやつにはTopo XL PCR cloning kit 使えとマニュアルに書いてありますが、何か？

>>58
ブラントを入れたいのですが、なにか？

A付ければいいだけだと思いますが、何か？

（＾＾）

>>53
blunt end ligationでの入りやすさ EcoRV > > > SmaI みたいのはNEBのカタログにもあったと思うけど、TA vectorにする前のサイトとしてもそんなに酵素によって効率が変わってくるもんなの？

SmaIだとcccgggで切れるからligationの時末端が
ほぐれないのがイキにくい原因と聞いたな。

みなさん、やはりBluescript系がお好きですか？
俺はpGEM系が好きなんだけども。余計な配列付いてないし、３０００bp
きっかりで計算しやすいし。

その辺どうなんでしょう？俺の他にpGEM愛用してる人いませんか？

俺は青いpGEM-T easyやpTargetのコロニーから
元ベクター取ってきて自分でT-vectorはもちろん平滑末端
ベクターも作ってるよ。
　KOD plusやらふつうのrTaqやら目的に応じて使ってる。
特にpTargetは青白選択ができる発現ベクターだから
初心者には便利。
pBluescriptもいいと思うけど最近はPromega vectorsばかち使ってるなあ，
なにしろEcoRIやNotIで両端切れるのが便利やん。

>>56
意 味 が 分 か り ま せ ん
>>56
意 味 が 分 か り ま せ ん
>>56
意 味 が 分 か り ま せ ん

????????????????

元ベクターってEcoRV生きてたっけ？
どこのサイトで切ってTAにしてますか？

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>>68
よく読んでくだせえ。
青コロニーから採れるのは，両端のoverhangした（２つの）Tが
とれて環化したもの（むろんligationしてトラフォメしてるよ）。
　上ではこれを元ベクターと言いました。これを
EcoRVで切ってdTを付けたもんが，pGEM-T easyや
pTargetだす。
　元ベクターという言葉が曖昧だったかな。線状T-vectorsを
作るための元の環状ベクターという意味だったんよ。

65でも書いたけど２重消化しなくてよいし，A付きでもA無しでも
インサートできるし，環状ベクターとしても切り貼りできるから
重宝してます。プロメガさんには儲けにならない使い方してるけどね。

M13 reverse primer のサイトが２ヶ所あるベクターって・・・

>>71
どれよ？

（＾＾）

　　 ∧＿∧
　　（　　＾＾ ）＜ ぬるぽ（＾＾）

Gatewayってほんとにいいのかなー？？？

━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

―━―━―━―━―━―━―━―━[阪急大山崎駅ヽ（｀′）ノ]━―━―━―━―━―━―━―━―━

＜アスペルガー症候群（自閉症スペクトラム）←脳の機能的疾患（遺伝が要因）＞
http://www.ypdc.net/asuperugar.htm
http://www.autism.jp/l-02-03-aspe3.htm
http://www.geocities.co.jp/Beautycare/5917/as/
●接し方のルールがわからず無邪気に周囲の人に対して迷惑なことをしてしまうこと
がある。人を傷つけるということには鈍感です。年配の先生に向かって「おばあさん
先生おはようございます」と明るい大声で挨拶する生徒もいる。こういった言動をす
る場合にも彼らには悪意はない。
●小さな声でひとり言を言ったり、考えていることを声に出して言うことがある。
●融通が利かないことも学校生活で問題になる。時間割の変更や突然の教師の欠勤と
いう事態で不安を感じたりかんしゃくをおこしたりする。あまりに規則に厳格なため
に、遅刻した同級生に延々と注意をしたり、修学旅行などで消灯時間をかたくなに守
り、他の生徒のヒンシュクをかったりすることがある。
●行動･興味･活動のパターンが貧困で反復常同的なことも自閉症の特徴である。すな
わち、日常の活動の様々な面にわたって柔軟性のないルーティン（決まった手順や日課）
を押しつける傾向、これを慣れ親しんでいる習慣や遊びのパターンだけでなく、たいてい
は新しい活動にも押しつける。そしてルーティンや個人的な環境の細部の変化（家の中の
置物や家具の移動によるなど）に対する抵抗がみられることがある。
●揺れる木の葉を見続ける子どもは興味のレパートリーが狭いとも言え、視覚的な敏感さ
があるといっても良い。
●精神遅滞を伴うものと伴わないもので大きく分かれる。１００％果汁のオレンジジュー
スを思い浮かべてください。それにだんだん水を加えて薄めて行くと終いには水にごく近
くなる。一口飲んで「オレンジジュースだ！」とわかるものは自閉症、水に近いけれどな
にかオレンジの味が混じっているのがアスペや高機能・・。その濃度はさまざま。濃いオ
レンジジュースであったとしても早期の療育や周りの対応によって水に近づいていくこと
は可能。しかし間違えてはいけないのはオレンジジュースが一滴でも落ちている場合は
「純粋な水」にはなれないのです。

　　　 　∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　(　　＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣〕
　　＝ ◎――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉

どのスレで聞けばいいか分からなかったのでここで。
GST発現ベクターで、GSTがインサートのC末側につくタイプのベクターってないですか？
どこ探してもN末側につくやつばっかりで。。

自分でこさえろ。

ベクターの種類によって転写効率が違うことってあるのでしょうか

Mammalian用発現ベクター
おすすめ＆駄目なのおしえて下さい。
自分が使ったことあるのでは、

pRC/CMV：当たり外れ多し
pCEP4：ベクター内のEBNAがやな感じ（肝細胞での発現系なので）
pCDNA3.1：いいのかな？？

くらいなんですが。
強いプロモーターが欲しいときはどうしてる？？
EF-1aとかいいんですかね？

あと、二つの遺伝子を一つのベクターで発現させるときとかも
おすすめ有れば教えて下さい。
インビトロのpBudCEとか使ってる方いないですか？

長文スマソ

pIRES2-EGFP　と　Fugeneの組み合わせ: 付着性細胞には最良。

pCMV5のMCSの後ろにイントロンをいれてあるやつが比較的強かった。

pEF-BOSのEF1αのプロモーターが一番強かった。

http://homepage.mac.com/norika27/

＞84、85

レスありがとうございます。

自分で細工も出来るし、もらった物で良さそげなのも
いくつか持っているのですが、新しく来たボスが・・・
遺伝子に詳しくない＆ヒトに頭下げたくない＆共同研究しない
ヒトなので、論文に書けないのです。
できれば売り物でいいのないですかね？

アクチンプロモーターはヘタレだった。

SV40プロモーターだけでは、ダメだ。

COS7、HEK293TみたいにT抗原入った細胞に、SV40ori入りベクターで大増幅

これ最高。

>89
強力すぎる。何の実験に使うの？共チンはだめぴょん。

>85
イントロン入りって何？意味分からん。

☆セクシーサイト全開！☆　〜まずは無料サンプルムービーをどうぞ〜
http://yahooo.s2.x-beat.com/linkv/linkv.html

>>89お前はSV40のプロモーターとoriを分けることができるのかと小一時間…

>92
え？89はあってるよ？？？

ああ、意味分かりました。いいじゃん、細かい事だし。

細かい事とか言ってるようじゃ、分かってないと見た。きちんと調べてここに報告すること。

>95
含まれてるんでしょ？

それよか、ベクターに詳しいヒトなら、
>>85のイントロンってどういう意味か教えて！

イントロンを持たせるとmRNAの核外への移行が促進されるという話がって、クローニングサイトの上流や下流にわざわざイントロンを入れた発現ベクターも多い。

細胞種を問わない高発現だったら、灯台分政権初潮のＭ先生が若かりしころ作製したＳＲαプロモーター、これ最強。

植物の場合、35Sプロモーターやユビキチンプロモータ以外に強いのはありまつか？

ベクターはM13が最強。
特に他人に遺伝子くれてやるときにはシングルストランドDNAにしてから発送する。

ふつうにpGEMかpBlueScriptにしてやれよ。

>97
レスありがとう。
それは初耳で驚きました。
なるほど理にかなっています。
が、イントロンって決まったある遺伝子のものを
利用しているのでしょうかね。。。

みなさん、誘導型哺乳類発現ベクターって何使ってます？
tet system最強？！

ステロイド誘導
メタロチヲネインプロモーターを亜鉛で誘導

うちはtetは全然あかんかった。

>103
ステロイド誘導は、見たいものが
ステロイドに影響されるときは使えないですよね。
エクジソンなら大丈夫と思うけど。
亜鉛とか銅とかでの誘導ってサイドエフェクトないんでしょうか？

>104
そうですか。。
私はIPTG系を使った事があるのですが、
誘導前から発現していました。

バックがゼロで、誘導がキチンとかかるものないかなー

光で可逆的に活性化されるような転写因子が開発されるといいね。

それ、理想的。

理研で個々の細胞をレーザーで可逆的にマークできる
色素蛋白質を開発していたから、応用すればなんとかいくかも

不可逆なのだ　カエデシステム

キャンペーン中なんで、誰でも１０００円もらえるとさ。
http://f15.aaacafe.ne.jp/~storm/

>>108
どうやって色素タンパク質で転写が活性化できるのさ？

>>99
(AOCS)3-MAS
pBINS1のプロモーター。

pCRよ。カナマイ耐性遺伝子は激しく邪魔だからどけてくれ。

>>108よ、どうやったら色素タンパク質で転写を活性化できるのか、早く教えておくれよ。

やってまっかー！
GATEWAY！！

☆頑張ってまーす！！☆見て見て↓↓↓↓↓↓↓↓↓
http://endou.kir.jp/betu/linkvp2/linkvp.html

Gatewayは権利関係にうるさいし値段も高いから、既にいくつかのfull-length cDNAプロジェクトはCreatorに移行しちゃってるよね。

>>112
pBISN1ね。

今月の実験医学のクローズアップ実験法ためになりました

どんなの？

>>117
だがCreatorもDestinationの実験系はEGFPとかTetとかMATCHMAKERとか
権利関係にメチャうるさいものばかり。結局この手の区ロー人工システムって
大学しか使えない罠。

ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

　　　 (⌒V⌒)
　　　│ ＾ ＾ │＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　⊂|　　　　|つ
　　　（＿）（＿）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎パン

PCR2を使ってるけど、トランスフォームしたコロニーの大半がblueで、しかもwhiteはほとんどself ligationというのはvectorの質の問題でしょうか？

腕

質問です。日本で容易に入手できる自殺ベクターをご存知でしたら教えてください。対象はグラム陰性菌です。

遺伝研のベクターコレクションには無いのか？
http://gillnet.lab.nig.ac.jp/~cvector/NIG_cvector/aboutj.html

自殺ベクターってあんまり表にはでてこないけど、産業界ではよく使われているはずだよね。

あぼーん