BIACORE〜生体物質相互作用の解析スレッド〜

BIACOREって凄いの？

かなり高価ですよね。
使い心地はどう？
AffinixQとかもどうなの？

BIACORE使ってリフォールディングの研究とかってできないかな？

できますよ。たしか実験医学の夏目先生のコラムに書いてあった。

BIACOREってあんまり普及してないのかな

日本レーザーのも仲間に入れてやれよ。

>>5
噂では国内に 400 台だけど、企業のが多いのかもね。

　相互作用の時間変化がみれるので、Kd値がすぐでるのが利点ですね

AffinixQデモしてほしい

消耗品高い。ランニングコスト高過ぎて色々な実験ができない。

http://www.tigers-fan.com/~xxccxxc

http://www.tigers-fan.com/~kaaax

ヌキヌキ部屋に直行
　　コギャルとヌキヌキ
　　全国地域別出会い

>>9
特にチップが高いよねー。certified gradeなんて買えない。

>>7
すぐっつっても、真面目にやると結構時間かかるべ。

所詮は in vitroの相互作用
細胞内では役に立たない
アフィニティイが低い相互作用を定性的に見るのならば役に立つ
Kd計っても、所詮は in vitro
細胞内のデーターではない
細胞生物学者にしてみれば
余り面白くない

データーじゃなくてデータ

>>14
って優香
どっちでも良いじゃん
ビアコアでくっついて Kd出しても
細胞内で全くくっつかない
なんつうのもたーーくさんある
だから、意味無いことをやっていることにもなる
機械は高いし、データ出しても余り使えないしい
っつうことですか
買わない理由は。。。

Biacore買うくらいなら、FACS買った方が１万倍有益。

BIACOREに限らずほとんどの実験てvitroじゃないのか？

IAsysどうなの

バッチでしょ？IAsys
だめじゃん

>>17
in vitroだけじゃCNSにはのらないな

最近あまり使われなくなってるの？

in vitro の実験をきっちりとbiacoreで出す。そしてそれをvivoでも証明していく
といいんじゃない？矛盾あればそこになにか新たな発見が隠れているハズ。それを
さらに掘り下げてCNS級の仕事が出せます。要はきちんと実験きちんと考察が重要。

今22さんがとてもイイ事を言いました。

>>22
それをvivoでも証明していくっつーところがたいてい皆がこける所だけどね。

vivo でこけるのはﾋﾞｱｺｱのせいではなく研究能力に依存するよね。
さあみんながんばってﾋﾞｱｺｱのﾃﾞｰﾀ入れた論文だしてﾁｯﾌﾟもらおうね

>>25
まあ必ずしも研究者の能力が駄目なせいではないだろうけど。
Two-hybridで取れてきた奴がIPで落ちるかどうかなんて殆ど運だしね。
もちろん様々な条件検討は行うことが前提だけど。
ところでBIAcoreのデータが入った論文出したらチップって貰えるの?

>>25
ビアコアのデータ入った論文の別刷かPDFファイルを送ると、もれなくセンサーチップ一枚もらえま
すよ。２−３万円程度のものですが・・・。漏れは２枚もらいました。

使ってみたいんだけどお勧め実験てないですか？

だからあ
ビアコアでくっついてもvivoじゃくっつかないなんつうのがたくさんあるの

うちではﾋﾞｱｺｱをｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞﾞに使うのではなく、ﾐｭｰﾃｰｼｮﾝさせた蛋白の
相互作用を解析しております。ﾃﾞｰﾀは再現性も高く、それゆえそこから引き出
される結論に自信が持てます。ただ条件設定にｶﾅｰﾘ手小ずりﾏｽﾀ。また、複雑な
（1:1以上)系は解析が難しい感じです。まあ、どんな実験にも言えることです
が腰を据えて取り組むことが必要です。

>>29
その理由をちゃんと検討してる？
ただvitroとvivoでは違います。で終わらせてるんじゃないだろうな。

>>27
情報有難うございます。俺も別刷り送ります。
センサーチップも馬鹿にならんからねー。
特に赤貧ラボの場合。

エバネッセンス光の発見ってノーベル賞級ぢゃないの？

>>33
まあ一つの大きな発見であることには間違いないわな

ビアコアの原理ようわからんわ。

>>30
心に凍みる御意見ありがとうございます(；；)
その「かなりてこずる」けれども「どんな実験にも言えること」という
感覚をうちのボスに教えてあげてください!!
（一週間前)「ビアコアってかんたんなんだろ?すぐ結果だせるよな?」
（今日） 「ビアコアって使えねえな、生化学会であった知り合いも
うまく行ってないっていってるぜ。やめやめ!」

農学板からこんにちは。
私もＢＩＡＣＯＲＥ利用者です。
先日うちのドクターがＢＩＡＣＯＲＥシンポジウム
みたいなのに行ってきたのですが行った人いますか？
感想・文句等教えて欲しいのでageます♪

>>37
京都でやった奴か？

しかしまあ創薬に使うにはどういうin vitroの使い方が効果的なのかねぇ。
当然狙うものにもよると思うけど，一番使いでのあるのはどんなんだろ？

>>39
まあやっぱり標的レセプターと薬剤のkinetics解析だわな。
BIAcoreの御陰で結合様式を詳しく解析出来るので、
目的に応じた（くっついてからすぐ離れるもの、或いは長くとどまるもの）
化合物の選定が可能になったからね。

でしょ。それ以外に使うのってどうなんでしょ？

新規相互作用タンパク質の検出と言うのがあるな。
チップに調べたいタンパク質を固定化して、cell lysateを流す。
そして結合したものを溶出して、プロテアーゼで切ってMSにかける。
と言うのを去年の生化学会のランチョンでやってたよ。
まー上手く行かない事の方が多いだろうけどね。

ﾀﾝﾊﾟｸって何でもくっつく?
まあ大丈夫なんだろうね，DNAチップみたいにうまく行かないケースも
あるような気がするけど。
個人的には膜ﾀﾝﾊﾟｸをおながしたいです。

age

日本レーザのってどうなの？
特注品中心らしいけど一応国内１００台近くはでてるらしい

Biacoreは2000が結構普及してるみたい。
3000はあまりみない。

ところでBiacore使ううえでテクニカルな面でのポイントってありますか？

正直Biacoreはフローいらないのでバッチ出して欲しい
高すぎる割にデータに大して信頼性ないし

バッチじゃもっとデータの信頼性下がるよ

はじめばして。私もBIAcore利用者です。
現在卒論完成のため、毎日毎日BIAcoreを使っています。
なのに、ちっとも結果がでません。BlankのDataさえまともな台形？の形になりません。
どうやら解離がうまくいってないみたいなのですが、これを改善するための良い方法があったら教えて下さい。

>>49
解離がまずいってのは、
baseline や regeneration がサイクルを追うごとに変わっていくんだろ？

再現性のよい再生条件をまず見つけるんだな。

>>50
regenerationに問題はなさそうです。
実際にbaselineはほぼ元の位置に戻ってきているんで。
どうもアナライトが非特異的吸着をしているみたいです。
BIAcoreで市販しているHBS buffer には、これを防ぐためにSurfactant P20
という界面活性剤が含まれているのですが、アナライトの性質上、これは出来
れば加えたくありません。ｒunning bufferの塩濃度をあげたりしてみたもの
の、やはり上手くいきませんでした。アナライトの精製度に問題があるのでし
ょうか？

んー、
・アナライトが非特異的吸着をしている
・アナライトの精製度に問題がある
ってのがよくわからん。アナライト溶液は精製品でないわけか？

blank が台形にならんってのは、サメの背びれみたいになるってこと？

置けるんなら、リファレンスのフローセルを設定して差し引く。
測定試料中の夾雑物が悪さしてるなら、
測定試料を精製するか、希釈して測るか、試料の希釈液を改良するかだ。

界面活性剤は P20 (tween20 だな) だけでなく他にもマイルドな奴があるし、
塩も NaCl だけでなく、カリウムやマグネシウム塩で違う結果になることも。
pH も検討する余地があるし、
アナライトの類似物でリガンドと反応しないものがあるなら、
それを混ぜるのもいいかも。

そういう検討を、測定試料希釈液に対して行うことをすすめる。
移動相中へのそれらを添加するより、有効だよ。

>>52
ありがとうございます。
早速いろいろ試してみます。

（＾＾）

（＾＾）

私もBiacoreやってます。

一通り測定できるのですが、
レゾナンスが理論Rmaxを超えてしまいます。
また、付属ソフトによる解析結果のRmaxも
測定値のレゾナンスより低く算出されてしまいます。

理論Rmaxって超えてしまっても良いものなんでしょうか？

免疫やってるものなんスが、MHC-ペプチドとTCR又はBCRがどのくらい親和性
があるのかを見るのにbiacoreって有用なんですか？

我もBiacoreやったなり。
ちなみに理論Rmax越えた事は越えた事が無い。

>>58
1:1 binding model でしょうか？
1:1 binding でなければ理論Rmaxは超えてもかまわないと
自分では解釈してるのですが．．
他の人はどうなんでしょう？

カーブフィットさせて算出されるRmaxが低いのも気になるのです。
もしかして測定しなおし？

確かに、使ってるモデルが適合してない場合は、そゆことあるね。
夾雑物の結合や、アナライトの非特異結合でも、そうだろうね。

適合したモデルを使用して、理論 Rmax を超えるような場合は、
実験条件が適切じゃないんじゃん？

>>56,59
実測値が理論Rmaxは超えてはだめ。
想定している反応モデルが間違っている。
その際、考えられること。
　a.リガンド-アナライト結合比が想定と違う
　b.アナライトの分子量が違う
　c.固定化量が正確ではない
　　aはリガンド側に結合サイトが複数ある場合。
　　a.bはアナライトがアグッている可能性も考える。
　　cの可能性は小さい。
注意；理論Rmaxは結合比（価数）も考慮します。
理論Rmax=リガンド固定化量x(アナライト分子量/リガンド分子量)x価数

注意；もちろん、非特異結合は適切なリファレンスデータを差し引く(必須)。
引いていないとバルクの影響もあり正確な結合量はでない。

解析したときRmaxが測定値より小さいのはおかしい。
解析結果はフィッティングしてないでしょ？
フィットしてない以上、算出した値は意味なし。
とりあえず、bivalentでやってみて。
大まかにフィットするなら多分アナライトアグッてる。
でも、アグッていると正確な定数化はできないよ。

>>60,61
ありがとうございます。
早速やってみます。

スキャッチャードプロットをしたところ凹型曲線になりました。
この場合、異なる親和性の結合サイトが２ケ所あると
単純に解釈してもよいものなんでしょうか。

低濃度領域のみをカーブフィッティングさせた場合
1:1 binding with drifting baseline で Chi2=46 でした。
算出されたRmaxは実測値のRmaxに近い値を示したのですが
理論Rmaxの３倍近い値です。

bivalent model ではまったくフィットしません。

もし複数の結合サイトがあるならば、
酵素反応の結果との相関性から面白いデータになるので．．ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)

ところで、みなさんは1:1 binding でない場合
（1:2 や1:3でbindingする場合）
自分でフィッティングモデルを作ってます？

このスレ、タンパク質相互作用のわかってないう゛ぁかが時折混じってて
笑えますね。
そもそもBIACOREのデータをくっつく、くっつかないなんて程度でしか
議論できない連中は使わないほうがいいでしょう（ｗ
細胞ばっかりやってるとう゛ぁかが増えてまともな解析もできないやつが
量産されてますね。そのうち淘汰されていなくなるんでしょうが、目障りです。
逝っちゃってください。

>63
スキャッチャードプロットで凹型？？？
低濃度領域のみをカーブフィティング？？？？
”反応モデル”でフィットさせるのは、測定したセンサーグラムだよ。
「低濃度領域」ということは本当にスキャッチャードプロットにやってるの？
スキャッチャードプロットはstady state afinity（違ったけか？）モデルにしかフィットしないよ。
たぶん、解析で何やってるか理解してないでしょ？

あと、凹型になること自身がおかしいよ。
スキャッチャードプロットは必ず、濃度が大きくなるにつれてレスポンスが大きくなって極大値がRmaxだよ。（すごく基本）
だから、
１．アナライト濃度調製が出来ていない。
２．再生できていない。
３．再生条件がきつくてリガンドが失活している。
この辺りが凹型の理由では？

1:2とか1:3と言ってもリガンド：アナライトかアナライト：リガンドかで扱いは変わるんだよ。
アナライト：リガンド=1:3のTrivalent analyteモデル作ってる文献あるね。
でも、モデル作ってもそのモデルが妥当かどうか証明するの大変。

>>65
レスありがとうございます。
スキャッチャードプロットは反応モデルは使わずに
センサーグラムがプラトーに達したところのRU値(Req)を測定して
Reqを濃度で割ったReq/Cを縦軸に、Req値を横軸にしてプロットして求めています。
このとき、
Req/C=KA*Rmax-KA*Req
なので、プロットの傾きを求めてKA, KDと出してます。
このプロットしたグラフが凹型曲線になってしまいます。

反応モデルでフィッティングさせたのは、
そのスキャッチャードプロットの前半部分？(Req値の低い部分）のセンサーグラムです。
この前半部分はスキャッチャードプロットでも直線に乗る上、
フィッティングさせたときのChi2が40前後の値を取るので。
ちなみに後半部分も混ぜるとフィッティングしません。

スキャッチャードプロットが凹型になるのはおかしいですか。
うーむ。
測定のやりなおしはコスト面できついですね。。。
・・・変な値が出たところは伏せてしまおうかな？

貴重な情報ありがとうございます。
とりあえず、Trivalent analyte モデルを調べてみます。

>>66
すんません。ちゃんと解かってましたね。
でも、解析ソフトVerなに？
Ver.3以降であれば縦；Req/ 横；analyte conc.でフィッティングするモデル入ってるよ。

低→高濃度の順番で測定してる？
だとすると、高濃度つまり”後に測定したデータ”でフィットしなくなるのは65で指摘した、
２．再生できていない。
３．再生条件がきつくてリガンドが失活している。
この辺りが問題かも？
でも、データ見てみないと解かんないなぁ。
再測定するなら、今ある生データをちゃんと分析しないと意味ないよ。
ビアコアにこの解析について相談した？
メールにデータ添付すれば見てくれると思うよ。
たぶん、何かのヒントにはなるよ。

質問。

センサーチップに固定するとき、サンプル溶かした緩衝液のpH低すぎると問題ありますか？
NHSで活性化されてるＣにリガンドのＮ末端で結合しますよね、等電点以下ならＮ端は常にＮＨ３＋だから問題ないような気も。

ん？
逆か？

ＮＨ２の状態の非共有電子対で、センサーチップのＣにくっつくのか。
すいません。
でも、それだと等電点以下ならＮＨ３＋なのに何でＣにくっつくんですか？

http://www.agemasukudasai.com/bloom/

んー。
プレコンセントレーション効果の事言ってるなら、
あれは、疎水的相互作用でくっついてるんだぞ。

ちなみに、架橋反応自体の至適 pH は 8.5 だ。
だから、プレコン効果がある pH 8.5 に近い緩衝液を固定化する時には使うな。

まあ、違うやり方もなくはないけど。

>>68
71は間違い。
プレコンセントレーション効果は静電的な相互作用による吸着を利用した濃縮効果。
しかし、アミンカップリングの至適pHは確かにpH8.5付近。

プレコンセントレーション効果は、
１．サンプルのpIより低いpH
２．低イオン強度
この2点を満たすカップリングバッファー条件下で成立する静電的吸着。

しかし、もう一つ重要な条件がセンサーチップ表面が負電荷をもつこと。
pHが極端に低くなるとデキストランに導入されているCOOH基が負電荷でなくなる。
このためpH3.5以下あたりからプレコンセントレーション効果は望めなくなる。
また、低pH条件下ではカップリング効率も低下するので最終的な固定化量も減少する。
アミンカップリングは”プレコンセントレーション効果が得られる条件でできるだけ高いpH”で行う。

酸性タンパク質の場合、濃度を濃くしてpH8.5, NaCl 1Mぐらいで固定する。
もしくは、biotin標識してavidinチップに固定する。
尚、カップリングされるのはN末&Lysのアミノ基。

＞72
ありがとうございました。
デキストランのＣＯＯＨまで考えが及んでいませんでした。

デキストランの方のＣＯＯＨかな、正確には。
どうでもいいですけどね。

反応モデルの作り方を教えてください

熱量計はどうよ？

（＾＾）

良スレ

（＾＾）

　　 ∧＿∧
　　（　　＾＾ ）＜ ぬるぽ（＾＾）

━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

良スレ

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

ビアコアでストイキオメトリを論じるのはどうよ

>>84
どうやって論じるんですか？

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

保守

自分もBiacore使って論文書いてるけど、dataの信頼性が無いようなきがする。ストイキオメトリも悩みの種だす。
悩みの呪文はストイキオメトリトキス…

>>89
信頼性が無いのはあなたの実験系の問題だす。
ストイキオメトリはビアコアではできんだす。
QCMでもできんだす。
分子量で選別可能な技術（超遠心分析など）じゃなきゃ無理だす。

日本レー十ナﾞ電子ってサポート体制最悪で有名な会社やん・・・そんなん勧めたのどこの代理店よ？

あ、>>91は>>45のレスね。

表面プラズマなんとかあげ