1 ：
名無しゲノムのクローンさん：
プロテオームの決め手はこれ。 あとＰＭＦこれ最強。
ストリッパーの見方等。
2 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/07/20 05:27
ストリップゲルだった。。。鬱
3 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/07/20 05:29
２次元電気泳動で、高塩基側（ゲルの端）にしょっちゅう複数のバンドが出るんですけど、
これって何が原因なんでしょう？
誰か教えてください。お願いします。
おっす！あさっぱらから連続投稿ごくろうさん！
テロメアーゼ
テロメア
7 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 03:57
やりまくってるYO!
8 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 08:54
とりあえずはじめるには何を買えばよいの？
9 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 09:31
プロトコール本
10 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/07/21 10:55
最近2-DEはじめたんですが、銀染したときにやたらと横筋が入るんです。
これって何が原因ですか？
ちなみにサンプルは大腸菌、1次元目も2次元目も尼シャムのMultiphor2を使ってやってます。
sage
>10
ちゃんとグローブつけてやってるかい？
12 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/07/22 10:52
>11
グローブはつけてます。
横筋ということは1次元目に何か問題があるのかなと思ってるんですが…
２次元目の泳動バッファーにちょっとでも指なんかつけたりすると
ケラチンのバンドが６０kくらいに出たりする。銀染なんかしたらそりゃもう。
または、バッファー（２次元目の）コンタミしてないですか？
1D-PAGEでは同じような横線は出ないのかな？
14 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/07/23 00:14
ケラチンのスポットがすぐ出る、ていうのは聞いていたので結構神経質に実験はしてると思うのですが…
特定の位置に横筋が出るというよりは、全体的にスポットが横に伸びているんです。
とりあえず、試薬類を一度全て作り直してみます。
それでもおかしいときはまたお願いします。
15 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/07/23 00:20
１次元目に界面活性剤としてNP40を使用するとミセルサイズが大きいので膜タンパク質(Na/K-ATPaseなど）
はうまく等電点で分離されずスメアになることが知られている。
可溶化にCHAPSを使うか電気泳動前に膜タンパク質を除く処理をしなさい。
16 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/07/23 06:14
1次元目でスメアになるのって塩濃度が多いのも原因だと思うぞ。
乗せるタンパク質量が多いと出やすいなぁ
17 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/08/02 06:01
ラボのエアコン壊れた。
暑すぎるぅぅぅぅぅぅぅ。
いつも計１４時間かかる２次元が今日は１０時間で終わったよぉぉぉ。
エレクトロードがいつも以上に熱くなってたよぉぉぉ。
18 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/08/02 06:04
そういや暑かったせいかバンドがぐねぐねおかしなことになてたよぉ。
そういや暑かったせいか脱色も早く終わったよぉぉぉ。
サウナみたいで白衣着る気になれないよぉぉ。
19 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/08/02 12:05
2-MEからDTTに換えよ。それで６０ｋ付近のバンドは消える。
20 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/08/09 11:14
ＤＴＴで６０Ｋのケラチンバンドが消えるというのは，
２ＭＥとＤＴＴの還元性の違いなのでしょうか？
たしかＤＴＴの方が強力という記憶が，，
21 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/09/25 16:05
ゲル食ったことある人いますか。
どんな、味しました？
22 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/09/26 12:22
>20
DTTで60kのバンドが消えるんじゃなくて、
2MEに入ってる不純物（60k付近のバンドの原因）がなくなるってこと
多少高価だけど、バンドが気になるならDTTを使うほうがいい
率直な話、プロテオーム解析を可能なぐらいのタンパク質スポット数を出せる椰子は
どれぐらい居るのよ？
24 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/09/26 23:40
>21
酸っぱい味がしますた
25 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/09/27 00:52
アクリル網戸は毒だ用
26 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 01:28
ちょっと教えてほしいんですけど、２次元電気泳動って、どのぐらいの
高さまでいけるんですか？ たとえばRenalCellCalcinomaで出てくる淡白を
ぜんぶ見ました！って自慢してても実は200kD以上については何も
見えてなかったりするんですよね？
27 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 01:36
200kDaもあるタンパク質は１次元目の等電点泳動において、２－３％のゲル濃度に対して
タンパク質の分子量に対する相対的な荷電量が小さく、分子篩い効果が大きくなるのでゲルの内部に浸透しにくい。
よしんば長時間の等電点泳動を継続すると大きなタンパク質が最終的なpIに到達する前にアンフォラインが溶出してしまうので現実的でない。
どうしてもやりたければ非平衡等電点電気泳動とか、１次元目のゲルを寒天にするとか、効果はあまりないが、、、、
28 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 19:25
ありがとうございました！ 同僚が「俺の調べた中にはお前の
やっている淡白（250kD）はなかったで、望み薄やな」って言ってたもんで。
29 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 19:39
また関西か…
30 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/10/14 22:10
アンフォラインってどういう意味があるんですか？
31 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 00:27
二次元電気泳動でＡとＢでディファレンシャルをやる時、
２ＤにかけるサンプルはＡとＢの細胞数そろえるべきか、
タンパク量をそろえるべきか。どっちを揃えるべき？
どっちがいいの悩んでいます。
だれかよいご回答をおながいします。
32 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/11/02 00:31
inducibleならどっちでもさほど変わらん。
単朴のほうが定量できて安心かも。
33 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/11/05 22:24
３１です。
どっちでもいいのかな？
細胞数か、タンパク量か？
うーん。
34 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/11/08 22:28
二次元電気泳動ってプロモーター解析に使えます？
>26
electrophoresis/proteomicsに出てる論文を見ると250kD付近まできれいに
スポットが出てる論文もちらほら。
泳動バッファーと1次元電気泳動の条件次第でかなり改善されるらしい。
もちろん、原理的に
>>27の言うようにフォーカシングが困難ではあるんだけど。
あと、2次元目ゲルへの移行がうまく逝ってないのかも。
>31
漏れんとこではタンパク量。ディファレンシャルをやる場合だったら
とにかくトータルのタンパク量に差があると解析がキツイ。
いちおう解析ソフトで規格化はできるはずなんだけど、実際は怪しい。
ところで、Amershamのサチュレーションダイシステムを使ったことのある人
いませんか？
37 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/11/22 14:01
>>31 両方やる。レフリーによって見解が異なるから。
でも、細胞が途中で死んだりしなければ、細胞数を揃える方が良いかもね。
38 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/11/22 14:30
タンパクの２次元電気泳動で、泳動されるおおよその位置から、どんなタンパクの
可能性があるか検索するためのデータベースってあるんでしょうか？
39 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/11/28 00:09
40 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/11/28 12:04
>30
タンパク質の凝集を最小にして、溶解性を増大させるため。
...だった気がする。
41 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/11/28 16:27
２次元って同じタンパクのリン酸化の違いで
きれいに分かれますかねー。
>41
結構綺麗に分かれる。
ストライプのレンジ幅によるけど
43 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/11/28 20:32
>42
サンキュー。しかし意外とお金かかるね。
ampholineとか結構高いし。むー。
44 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/11/28 20:34
今のトレンドは３Ｄ１－ＥＰだろ？
45 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/12/02 20:33
しょーもないこときいてすみません。
SDS-PAGEで糖タンパクって糖の部分も含めた分子量のとこにきちんとバンドがでるんでしょうか？
46 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/12/14 19:01
荷電による移動度であって、糖鎖に限らず分子量と正確には一致しないのでは？
47 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/12/15 00:18
>45
アホ！そんなことも知らんで実験してんのか！
48 ：
名無しゲノムのクローンさん：02/12/22 18:57
普通のSDS-PAGEを始めるには Bio-Rad の mini protean などのセットを揃える
のが一般的だと思いますが、2次元電気泳動にも何かスタンダードになっている
ような装置があるのでしょうか。
↓こういうやり取りもあったけれど。
8 ：名無しゲノムのクローンさん ：02/07/21 08:54
とりあえずはじめるには何を買えばよいの？
9 ：名無しゲノムのクローンさん ：02/07/21 09:31
プロトコール本
49 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/01/10 01:01
リン酸基が１個付加されたタンパク質は非リン酸化型と比べてどのくらいpIが変化するの？
50 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/01/11 00:45
二次元電気泳動でディファレンシャル解析をしているのですが、銀染色はどうも染色ムラがきつくて上手くいきません。
そこで、蛍光染色の試薬を試してみようと思っています。
SYPRO ruby, SYPRO orange, 等があるようですが、感度、簡便さ、コストの面で実際どんなかんじですか？
使用したことがある方、感想をお願いします。
51 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/01/11 01:37
SYPROの問題点
1.コストが高い（500mlで2万ぐらい）
2.専用の蛍光イメージアナライザーがいる
特に2では、spotをmassにかける場合は直接spotが取れません
1度画像をOHPで印刷してゲルを重ねてとるか、ＵＶ照射下でとるかのどちらか（多少感度落ちる）
spotpickerがあるなら別だけど
銀染色をグルタルアルデヒドfreeの方法（vorum法）とかならきれいに染色できますよ
関係ないと思うが自動染色装置は結構染色がムラになりやすいです
染色でムラになるのはgelないのSDSとかがきれいに抜けていない可能性が高いです
固定時間を延長することで多少バックグラウンドは落ちます
53 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/01/11 12:15
>51
サンクスです。spot pickerは高いなあ…
あと何度も質問で申し訳ないですが、銀染色は反応停止のタイミングしだいで結果がかなり変わってきますよね
多検体を一気に染色する時、染色具合をそろえる良い方法ってないですかね？
（＾＾）
55 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/01/11 13:44
>53
マーカーを流してるのであれば、マーカーの染色される感じで大体調節できるはず
それでもそろわなければ、染色後にゲル乾燥してスキャナな取り込む
そしてコントラストなり明るさを調節してあわせることができるよ
（＾＾）
58 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/02/28 04:37
Invitrogen
59 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/03/05 23:17
？
（＾＾）
61 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/04/07 22:10
プロテアーゼインヒビター使ってる？
62 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/04/07 23:58
PMSF
ベンザミジン
ロイペプチン
ペプスタチン
このへんをよく使用します。
きれいなスポット出た？
カクテル使ってダメだったよ。
スポットがスメアになってがっくり。
プロトコルがいけないのかと思う今日このごろ。
（＾＾）
65 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/04/18 03:00
2次元電気泳動をはじめようと思います。
装置はきました。
いいプロトコール本を紹介してくれませんか。
∧＿∧
（ ＾＾ ）＜ ぬるぽ（＾＾）
∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ ( ＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
＝〔~∪￣￣〕
＝ ◎――◎ 山崎渉
__∧＿∧_
|（ ＾＾ ）| ＜寝るぽ（＾＾）
|＼⌒⌒⌒＼
＼ |⌒⌒⌒~| 山崎渉
~￣￣￣￣
ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。
∧＿∧ ∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ （ ・３・） ( ＾＾ ） ＜これからも僕たちを応援して下さいね（＾＾）。
＝〔~∪￣￣￣∪￣￣〕
＝ ◎――――――◎ 山崎渉&ぼるじょあ
71 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/08/29 14:24
結構２次元電気泳動で困っている人いるんだね。
確かに再現性がいまいちで比較するとき大変だと思うけど。。。。
でも、そんなに大変じゃないぜ。俺にとっては。。
始めてやる人は羊土社の’電気泳動最新プロトコール’を参考にしてみたら。
あと基本的にはアマシャムのトラブルシューティング見れば大体うまくいくよ。
72 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/08/29 18:53
AmershamのEttan DIGEさいこーです。
メ チ ャ 高 価 だ け ど。
73 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/08/31 20:35
二次元なくてもMassに進めMassからやらなくていいと思いMass
Pro-Q Diamondってどうよ？
実際に使った人居る？
75 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/09/12 20:18
Pro-Q,同じ部屋のMDが使っているけど???って感じ。
いちお染まっているけど、これってほんとにリン酸化タンパク？
だって２次元電気泳動したあとPro-Qで染めるとかなりのタンパクが染まってくる。
一般的にリン酸化だったら分子量変わらずに等電点が少しずれたところにスポットが
何点か並んで検出されるはずだが。。。
そういうところもあるけれど。。。
染色原理も明らかにしていない商品って信用できない。俺的には。
（でもネガコンもとらずに実験しているMDもMDだが）
76 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/09/12 22:25
PhDにはぐだぐだ理屈を捏ねるばかりで仕事が進まない奴けっこういるよね。理屈捏ねるのが目的なのか、何かを見つけることが目的なのか、もう一度良く考えてみたら？
77 ：
名無しゲノムのクローンさん：03/09/13 18:13
ネガコンは理屈をこねるとかそういう以前の問題だと思われ
泳動の技を磨くよりﾌｫﾄｼｮｯﾌﾟ技を磨くのが一番良いかと？
80 ：
名無しゲノムのクローンさん：04/01/27 15:58
二次元泳動で、異なったゲルでの銀染バンドを比較するのが上手くいかない（というか再現性が取れない）のですが
何か解決法はあるでしょうか？
81 ：
名無しゲノムのクローンさん：04/01/30 11:29
なんか久しぶりに来たなここ。まだあったとは。
>>80 ところで銀染色の再現性ではなく2次元電気泳動の再現性が取れないのでは？
バンドということは2次元ではなくSDS-PAGE?
もうちょっと具体的に書いてくれないと返答が？？？
82 ：
名無しゲノムのクローンさん：04/02/02 11:17
同じサンプルを最終段階で２等分して二次元泳動をするとスポットの濃さが異なるということです。
説明不足ですみません。。。
腕が悪い、としか言えない。ｽﾏｿ。
極力同じ操作をするように気を付けてみ。
84 ：
あかぬけない 対 青ぬけない：04/02/02 12:19
http://ime.st/music.goo.ne.jp/video/teichiku/TENPRV0020.html 小泉潤((彡ミミミミ))彡彡)))彡)
彡彡ﾞﾞﾞﾞﾞ"ﾞﾞ""""""ヾ彡彡)
ﾐ彡ﾞ ..＿ ＿ ﾐﾐミ彡
((ミ彡 '´￣ヽ '´/￣ ｀ ,|ミミ))
ミ彡 '￣◎' 〈￣◎ .|ﾐミ彡
ミ彡| ） ） | | ｀（ （ |ﾐ彡
((ﾐ彡| （ （ -し｀) ） ）|ﾐﾐミ
ゞ| ） ） ､,! 」（ ( |ソ ／￣
ヽ（ （￣￣￣' ) ）/ ＜ 青ぬけない諸君!
,.|＼､) ' ( ／|､ ＼演歌は敵だよ。
￣￣| ｀＼.`──'´／ |￣￣｀ ＿＿
＼ ~＼,,／~ /
＼／▽＼／
$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
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| _,,_,,, :'r,
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iﾂ :;;､ﾂ 丶;;;;;;;;;;ノ ヾ;;;;;;},
ヽ "'-ﾞ "'''ﾞ `,;;ﾞ /"i `'i
ヽ ヾ'-ー-..,,_ ..::;; i, _,)i (`
"'ヾ-ｰヽ "'ｲ _ ,_､,､,_,_,〈 ／￣￣￣￣￣￣￣
'i., ヽ::jｲj,iﾞtt,j,j,j.j.i´ ＜ いちいち言うな
’j ｿ,ftｒｒ,r,r,rr!, ＼＿＿＿＿＿＿＿
"-..,,_ "'`"' ﾞ}
"''--ー-´
85 ：
名無しゲノムのクローンさん：04/02/02 12:46
ある程度泳動経験つんだら、あとはﾌｫﾄｼｮｯﾌﾟをﾏｽﾀｰすべし！
これ最強。
87 ：
名無しゲノムのクローンさん：04/04/21 23:50
あの･･･実務で初めて2次元電気泳動やることになったんですが、事前勉強したいので
お勧めの参考書等あったら教えてください。ちなみにアマシャムの泳動プロトコールは
もってます。学生時代に何回かしか経験がないので心配だ。今はひたすらピペット操作の練習･･･。
88 ：
名無しゲノムのクローンさん：04/04/25 15:54
２D、面倒だからもうやらないよー。
冗談じゃねえや。尿素顔にひっかけた！
今週から2-D電気泳動だ。
幸い、ほとんどの試薬やゲルは既製品を使うので手間は省けるが、取説が全部英語だったりする･･･。
90 ：
名無しゲノムのクローンさん：04/07/22 23:56
age
91 ：
名無しゲノムのクローンさん：04/12/10 01:14:15
等電点だけやりたい。
二次元に限らず、電気泳動の解析ソフトでお勧めの奴ってある？
94 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/04/26(火) 13:51:49
染色にサイプロルビー使ってる人いるー？
やたら高いのだが、どんくらい使い回せますかね？
95 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/04/28(木) 20:14:33
2次元電気泳道って実用的な装置なん？
網羅的というが発現しているタンパクのほとんどは検出できないんじゃないの？
俺も最近そう思う。
97 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/09(月) 23:00:08
２次元ではないのですが、PAGEに関する質問はこちらでよろしいのでしょうか？
98 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/10(火) 10:20:20
99 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/10(火) 21:30:23
97です。
ちょっと特殊なバッファーでポリアクリルアミドゲルをつくろうとしたら
ゲルが固まりにくかったのですが、バッファーのpHって重合に激しく影響しますか？
ちなみに特殊なバッファーのpHは11です。
100 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/11(水) 11:14:47
>>99 影響します。
よく脱気する、もしくは窒素置換してから新鮮な過硫安を入れるべし、と達人のお言葉。
101 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/17(火) 14:40:13
２次元電気泳動やってる人、１次元目は、何を使ってますか？
水平型？ 縦型？
102 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/18(水) 12:08:49
蛋白の電気泳動で定電流と定電圧では結果がどう変わってくるのでしょうか？
シーケンスは定電圧で泳動するのに蛋白はなぜ定電流で泳動するのでしょうか？
EtBrをこぼしてしまって蜘蛛にかけちゃいました
綺麗にできてますか？
105 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/23(月) 15:46:59
アガロース電気泳動でバンドが横一直線にでないのってなんでですか？
バンドがこんな感じになる→ 】
普通ならこんな感じっしょ→ ｜
107 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/23(月) 22:56:38
>>106 ありがとうございます！冷やしが足りないんですか…つまりゲルが柔らかいから
ウェルがゆるくなって染み出しているということですか？
108 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/23(月) 23:04:55
温度は一定にしないとだめでしょ。
109 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 00:41:37
制限酵素のバッファーの塩濃度が泳動バッファーのそれと違うから、多少は仕方がないよ。
110 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 01:25:37
なるほど…ローディングバッファとTAEの違いも関係するんですね…
ありがとうございます！
111 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 12:17:57
なんだか、２次元だけでなく、電気泳動全般って感じになってきたね。
ほほえましい感じはするけど。
112 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 23:25:14
二次元電気泳動はランニングコストかかるし、やってる人も少ないのかな？
113 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/24(火) 23:32:47
コストの割には成果が少ない。。１次元で十分。
どうしても２Ｄを使わなくちゃいけない理由ってある？
あるんです。
複製中間体の検出にはふぉっしだなｗ
115 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/28(土) 01:51:31
部屋を無菌室みたいにしないといけないからね･･･
116 ：
名無し：2005/05/28(土) 13:46:01
毎日2D＆MASS解析には毎日行っても一年以上かかります。外注してみては。
117 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/05/30(月) 18:34:53
一元目の電流が一定じゃないとどうなるの？やっぱりうまく分離できないよね。パワーサプライが悪いんかい
118 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/06/03(金) 14:48:36
２次元ではないのですが、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
定電圧と定電流で結果が変わりますか？
もちろんマーカーとの相対比較での話ですが。
119 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/06/04(土) 10:42:37
120 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/06/16(木) 17:18:55
動物の組織から抽出したサンプルで二次元電気泳動してるんですが、一次元目のゲルのpIレンジを変えても
大体同じところ（塩基性側端から端から２センチくらい）までしか１次元目で分離できないんですが何が原因でしょうか？
そこでせき止められてるみたいにばーっと縦に線引きながらスポットが出ちゃいます。
ちなみに普通にpIマーカー流したときはそんなことになりません。
使っている組織が粘液とか多いんでそれが関係してるんですかね？
121 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/06/21(火) 23:42:17
チューブゲルとストリップゲルで泳動像って変わりますか？
チューブゲルは15cmなのに対してストリップゲルは24㎝くらまでありますよね。
ストリップゲルじゃなきゃだめ！とか、チューブゲルで十分！とか皆さんの意見を聞きたいです。
わたしはチューブゲルを使って植物のタンパク質の解析をしているのですが
文献見るとストリップゲル使いのものが多いので不安に。。
122 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/06/22(水) 10:06:18
>>121 チューブゲルを使っているあなたは優秀です。もっと自信を持ちなさい。
123 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/07/25(月) 14:43:54
その通りです。技術的に難易度が低く、誰でもある程度の結果が出せるストリップ
ゲル（IPG）は、国の予算付けの関係でタンパク屋が消え、分子生物屋しかいなくなった
ときに、ゲノムの次は機能解析だマイクロアレイだプロテオームだと本当はやりたくない
二次元電気泳動で、とりあえず美しいパターンが出せたので、P社（現G社）やB社の盛んな
営業活動もあり広まっただけで、チューブゲルの方が全体的にもスポット数が多かったり、
ストリップゲルではスポットの無いエリアにスポットが出ることが多々あります。
チューブゲルとストリップゲルは、クロマトと電気泳動を目的によって使い分けるように、
サンプルによって使い分けると良いのですが、どちらか一つだけでと言うならチューブゲルです。
124 ：
121：2005/08/01(月) 13:07:05
>122>123
未だにゲルの発熱やバッファー(NaOH)漏れに悩まされてますが、
なんとか比較可能なスポットを得られるようになりつつあります。
勇気付けられました。ありがとう。
125 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/01(月) 20:21:09
2DEをしている皆さんにお尋ねします。
タンパクスポットをPVDF膜にWBしてシーケンサーにかけたいんですが、CBB染色は膜に移してからするのと、ゲルを最初に染色（および脱色）してからWBするのではだいぶ違うんでしょうか？
染色はもちろん前者の方が簡単ですが、ラージゲルから切り出してミニゲルサイズのWBをする場合、後者の方がタンパクの場所がわかるので都合いいんですが．．．それとも先に染色してしまうとWB時のタンパク移行に影響がでたりするんでしょうか？
126 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/01(月) 22:39:54
バッファーに漬けるタイプのブロッティング装置を使っているなら先に染色する場合
は低分子タンパクの抜けや拡散を考えれば良いが、セミドライはそれに加えてWBを先
にする場合、SDS濃度が高くなら無い様ゲルのボリュームに対してブロッティング
バッファーの量平衡化の時間を検討をしたほうが良いです。
127 ：
125：2005/08/03(水) 19:23:58
>126 レスどうもです。
とりあえず、CBB先染め→WBしちゃいました。タンパクは約60kDaで、装置はウェットタイプ（○イオ△ド社）、80V・3hrでやってみましたが、半分ぐらいしか移っていないみたいです。染色・脱色・保存とゲルやタンパクを痛めつけたのがいけないのかなあ．．．
128 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/10(水) 02:03:10
SDSのゲルをキムワイプで包んでいたらちいちゃくなってました！カワイイ(*^-^*)
129 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/10(水) 21:43:10
age
130 ：
125：2005/08/12(金) 13:28:13
（127続き）
スポットをプロテインシーケンサーにかけてみましたが有意な結果が得られませんでした。もしや、と思い残りの膜を脱色・再染色したところ全くスポットがでませんでした。つまり、WBしたと思ったタンパクは全くゲルから移っておらず、色素だけが膜に移っていたようです。
2DEに限った事ではないんですが、アクリルアミドを溶かして中のタンパクを取り出す方法ってないんでしょうか？
131 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/12(金) 13:39:08
透析チューブにゲル断片を入れて電気溶出すれば？
132 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/12(金) 17:23:12
質問ですが、2-DEのマーカーって何使ってます?
ランニングコストが良いものを探しているんですが…
133 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/14(日) 11:22:03
>>130 まさかそんなことはないだろうと思いつつ、ひょっとしてCBB染色のときに
酢酸/メタノールで固定してたりしない？
134 ：
125：2005/08/14(日) 18:36:47
>>133 しっかり固定しました。えっ、ダメなんですか？CBB染色液（既製品）自体にもMeOH、酢酸が入っていますが．．．
135 ：
125：2005/08/15(月) 14:42:33
>>132 [ｶ○ｲﾄﾞｽｺｰﾌﾟ:ﾌﾟﾚｽﾃｲﾝﾄﾞｽﾀﾝﾀﾞｰｽﾞ]（○イオ△ッド）を仕方なく使用。15800円/500μl。一回10μlで、316円。ﾗｰｼﾞｹﾞﾙだとﾊﾞﾝﾄﾞの縦幅が広くなるのでお勧めできません。
136 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/15(月) 23:47:15
>>134=
>>125 えーと、釣りじゃないよね。
固定は文字通り固定だから、ゲルのマトリクスからはほとんど出て来なくなるんだけど。
137 ：
125：2005/08/16(火) 19:27:04
>>136 恥ずかしながら釣りではありません。現在進行形のリアルな問題です。指導者などおらず、試行錯誤の連続なんです．．．ﾊｱ
138 ：
ゲルン：2005/08/25(木) 18:24:18
2次元電気泳動で得たスポットを質量分析にかけ(PMF)、
有効だと思われるマスピークが得られたのですが、
肝心のタンパクのデータベースが充実しておらず、
タンパクの同定が出来ませんでした。
扱っている生物種のゲノムやESTは得られます。
ESTをアミノ酸に起こして、酵素で切断処理して、
修飾等も含めて算出した値と比較しようとは思うのですが、
遺伝子数が１万を超えるので一つ一つ手作業では困難だと思います。
何かいい方法はないでしょうか？
139 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/26(金) 00:17:44
ＰＭＦ？なんだそれ？
>>138 よほど特殊なタンパクじゃない限りall speciesで検索かけたらhomologueがかかるよ
Sequence coverageが高ければの話だけど
141 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/26(金) 01:29:27
2Dのゲルを作るとゲルの表面に層が二つできてしまいます。
普通のゲルの上にやわらかい層が５mmくらいの厚さで乗ってる感じ。
しかも上の層はとても柔らかいので、ストリップを乗せるのがしんどい。
この柔らかい層って何？
142 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/26(金) 13:51:59
"2Dのゲルを作るとゲルの表面"って二次元目のゲル上部のこと？
濃度は？重層液何使ってるの？放置時間は？
143 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/26(金) 15:41:10
15%で水を重層して２時間は放置してる。
重合の失敗かなと思ったので
TEMEDがよく混ぜるようにしてみた。
今まではゲル液1Lに270uLを直接混ぜてたのだげども
300uLを水1200uLと混ぜてからゲル液1Lに混ぜてみた。
14枚中4枚くらいは柔らか層ができていたが他は大丈夫っぽい。
144 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/26(金) 15:49:55
>>94 サイプロルビーは４回くらいまでは使っています。
でも、ちゃんとしたデータ用には１回目か２回目のを使います。
３回目と４回目は使用量を増やすと良いっぽい
145 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/29(月) 15:32:20
>>143 脱気の程度や過硫安の量、室温等がにもよりますが、TEMED少なめなのでゲル化のための
コンディションがかなり良くないと架橋の少ない直鎖の多いポリアクリルアミドができて
いそうです。余談ですが重層には水ではなく、５０％エタノール水や水飽和ブタノール
を使うと楽です。
146 ：
ゲルン：2005/08/29(月) 18:32:14
138です。
＞139さん
PMFとはペプチドマスフィンガーのことです。
飛行時間型質量分析機で、ペプチド断片の質量値を出して、タンパク質のデータベースと照らし合わせて、
タンパク同定を行います。
＞140番さん
ホモログではなくて、採取した生物種のなんていうタンパク質なのか知りたかったんです。
タンパク質名がわからなくとも、ゲノム上のどこの部分から発現してきたものなのか、知りたいんです。
>>146 140です。ですからね。目的のタンパク質とホモロジーのある別の生物種のタンパクがヒットしてきたら、
そのタンパクのどのペプチド断片がマッチしてきたのか見てみるのよ。
その配列を元に色んな検索ができるでしょ。
148 ：
ゲルン：2005/08/30(火) 11:47:03
>147さん
なるほど！
でも、ヒットはするんですけど、信頼性が低いんです。
取り合えず、やってみます！もう一度頑張ってみます。
149 ：
141：2005/08/30(火) 13:27:26
今日
>>143のゲルを使ってみたらやっぱりゲル上部が柔らかくて粘着
室温かな？最近よく起きる現象なんで。今度は低温室でゲル作ろうと思います。
上層する水の温度とかも関係あるかな？
要するに水と接触してる部分に問題があるんだろうなぁ
150 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/30(火) 16:48:32
低温ではなく定温ですか？ゲル化は化学反応なので低温室で作ったら、余計に不出来な
ゲルになります。最近とのことなので1.エアコンが効き過ぎている。2.エアコンの風が
当たっている。3.冷蔵庫からの出し入れと夏の湿気で過硫安が劣化してきている。4.冷
蔵庫からの出し入れと夏の湿気でTEMEDが劣化してきている。が考えられると思います。
151 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/30(火) 16:57:10
>141=149さん
どこのゲルキャスティングシステムを使っているのですか？
よかったら教えてください。
152 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/30(火) 17:20:45
>>149 >150さんの言う通り、低温でやったら余計に固まらないぞ。
水の温度はどうでも良いから、水じゃなくてイソブタノールを重層するんだ。
153 ：
141：2005/08/31(水) 13:27:10
使っているのはアマシャムのEttan DALTtwelveです。
>>150 むしろエアコンから遠いので室温が高いから何か問題があるのかと思ったんだけどもね。
やっぱブタノールを上層するのが手っ取り早いか。
154 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/08/31(水) 17:42:05
ってか、重層してなかったの？
155 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/01(木) 11:20:58
>>153 なんでメーカーに聞かないの？
まさか、ちゃんと答えてもらえなかったから、ここに来たのか？
156 ：
141：2005/09/01(木) 12:42:23
ブタノールではなく水を重層してました。
マニュアルはブタノールだけど大抵の人は水を使うもんだと思ってた。
みなさんはどっちを使ってますか？
157 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/01(木) 13:16:41
>>156 改善方法：
水、Tris-Clバッファー、アクリルアミド液を脱気する。
APSを粉で入れる。量はスパチュラのサジ1/3程度。
イソブタノール重層。
158 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/01(木) 13:23:52
質問なんですが、まず一次を行う際にチューブに入れるゲルの分量はどのようにしていますか？
界面活性剤の種類やアクリルアミド・APS・TEMEDの分量で迷います。
どなたかご教授くださいませ
159 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/01(木) 13:32:20
>>155 アマシャムに聞いたって、他社の使ってたら自社のを使え！アマシャム使ってたら
買い換えろ！って言われるのがオチだよ。
>>157 粉とはワイルドだな。平成の常識・やって！TRYか？
160 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/01(木) 13:46:14
APSを粉のままスパチュラで入れるのは束大生化の伝統方式だ。
161 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/03(土) 12:28:50
野○春○センセイ以来の伝統か？
162 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/06(火) 23:47:05
二次元電気泳動法でゲルなんか作るよりも二次元クロマトなんかのほうが簡単なんじゃないの？ LCMSMSのショットがん解析みたいな
163 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/07(水) 03:30:09
164 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/07(水) 11:38:07
165 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/07(水) 20:40:46
バイオラッドの装置ﾂｶｴﾈ
166 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/08(木) 05:57:25
まじ？
アマシャムは？
167 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/09(金) 01:00:36
日本エイドー製がいい
168 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/09(金) 15:29:44
どのへんが？
169 ：
拘束電気泳動：2005/09/09(金) 18:24:06
日本エイドー製がいい？
ドコが？
５月まではね！
今は品質低下、納期も遅い＝研究遅れる
どーすんのよ！俺！
170 ：
名無しさん＠そうだ選挙に行こう：2005/09/11(日) 20:08:45
バイオラッドの装置を使わせてもらえない・・・・・・・
教授たまには使わせて！！
171 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/12(月) 21:01:20
>>166 簡単だけど装置の修理代が・・・・・・・
172 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/14(水) 18:57:21
171=IPGphorユーザー？
173 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/15(木) 21:09:40
171=バイオラッド？
174 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/15(木) 23:56:08
とりあえず今日のProtein assayはうまくいったな
大学一年生なのにこんな実験やっていいだろうか？
175 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/09/20(火) 20:46:29
誰かレスを下さい
176 ：
やっぱりクロマト：2005/10/29(土) 22:09:57
誰も二次元電気泳動しなくなったんですね。
177 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/11/01(火) 19:11:41
定量測定をしようと、SDSで数マイクログラムの微量試料を流しています。
同じ試料を分割して1つおきに全部のレーンに同じ量だけ入れても調べたい
タンパクに対して2倍以上の強度差が出ます。2回ともそうでした。
CCDで長時間露光の後Scion imageで解析しましたが、見た目も明らかに違います。
泳動について、初心者が陥りやすい罠ってありますか？
ピペット動作だけでそれほど変わるとは思えないのですが･･･。
>>177 俺、遺伝子屋だからよく分からんけど、チップに吸着とかしてたりしないの？
179 ：
177：2005/11/02(水) 11:56:57
>>178 2回目以降はかなり気をつけてチェックしましたが、
目で見てわかる水滴はありませんでした･･･って、
もしかしてタンパク質そのものの吸着ですか？
ちょっと調べてみます。
180 ：
177：2005/11/02(水) 11:59:31
ちなみにアクチンを使っています。
181 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/11/02(水) 23:14:18
とっても初歩的な質問で申し訳ありませんが、サンプルのアプライ量はどのくらい
ですか？ チップは毎回変えてますか？
たとえば５μｌ位で、同じサンプルだからとチップを変えていないと、２度目はＳＤＳ
でチップ表面が馴染んでいて、サンプルにチップの先が付いただけで、にその位は毛管現象
で上がってくるくるので、１０μｌ近くアプライしたことになりますが、いかがですか？
チップ換えたらどう？
183 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/11/06(日) 23:33:49
とりあえずみんなどこのメーカーの2Dの装置使ってるんだ？
俺はアマシャムと日本エイドーとバイオラッド使ってる
でもアマシャムは凍らせているシートが高すぎ！！
184 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/11/08(火) 13:55:46
185 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/12/07(水) 08:16:10
2DE後にCBB染色してもスポットが得られません。
タンパク量は150μg程度なので、CBBだとキツイのは分かるんですが
分子量マーカーすらゲル上に現れません・・・
原因として何が考えられますか？
ちなみにCBB染色液は、KodakのCOOMASSIE Brlliant Blue G-250：50mgを
99.5%EtOH：23.35mlおよび85%酢酸：53mlに溶解させ、
DWで500mlにメスアップしたものを濾過して調製したものを使用しています。
>185
そもそもそれふつうのSDS-PAGEだと
検出できる条件なんですかね？
粉を溶かすCBB染色なんて最近やってないから
わかんないんだけど……
187 ：
185：2005/12/07(水) 20:11:11
85%酢酸でなく85%リン酸の書き間違えです。
>>186 タンパク質の定量に用いた染料をそのまま流用してるんだけどやっぱダメかな・・・
タブレット購入してアマシャムのプロトコールど－りやってみます。
あと染色時間ってどのくらいしてますか？
>>185 おれも150流してCBBで染めてるけど普通にはっきり見えるよ。
あと疑問なんだけど、リン酸てCBB染色に使うかね？うちは酢酸だよ。
189 ：
185：2005/12/08(木) 20:24:45
>>188 心配するな。俺もそう思う！
この時期から2DEやってマスやって・・・
卒論間にあわねーな、うん( ﾟДﾟ)y━･~~~
190 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/12/12(月) 13:07:02
CBBは普通メタノールと酢酸だろ
191 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/12/13(火) 14:01:06
G-250は燐酸とか硫酸とか。R-250がメタノールと酢酸。GはRより感度低い。
192 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/12/14(水) 03:31:31
クーマシーブルー
バイオラッドのやつが楽でいい
ディスステイン剤いらず
193 ：
185：2005/12/14(水) 11:44:07
これ以上サンプル無駄にするの嫌だから銀染色にした。
でも、うっかり増感と銀反応でアルデヒド使っちゃった・・・
質量分析できねーwww
194 ：
名無しゲノムのクローンさん：2005/12/14(水) 15:31:25
そういえば、177の人どうなったの？
電気泳動ゲルで定量する場合、ソフトによっても結果違うらしいけど、
解決したのかな？
195 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/01/02(月) 14:28:51
新年早々SDS-PAGEやってきましたよ
しかしバックグラウンドに汚れがwww
二次元電気泳動の定量って信用できるんかな？
なんか変動大きすぎて有意差でないし。
197 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/01/11(水) 18:38:04
イモビラインユーザー発見！！
198 ：
MAX：2006/04/13(木) 19:00:25
二次元電気泳動で血清アルブミンを除去するのにキットを使わない方法はありますか？
ぜひ教えてください。
199 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/04/23(日) 15:59:17
>>196 腕が悪いとしか言えない
>>198 市販されているキットはその方法をキット化しただけだから、
キットの原理を調べればおのずと解決
200 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/05/09(火) 22:49:40
ミクロポリアクリルアミドゲル2次元電気泳動ってどう？
使いやすい？
201 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/05/11(木) 00:01:51
それって、奥山先生や真鍋先生がやっていたものですよね。
富士理研もうないので、装置はどうされるんですか？
分離分解能は、たて×よこ×厚さに依存し、小さく薄くなれば検出感度が高くなれば、
分離されていても視覚化出来ないので、奥山先生・真鍋先生のミクロポリアクリルアミドゲル
2次元電気泳動ではそれなりのスポット数になります。ゲル厚は1mmだったと思いますので、
操作性は小さい割りに悪くないと思います。
202 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/05/11(木) 01:05:55
質問いいですか？
PCR産物をアクリルアミドゲルで泳動しているんですが、
どうも産物が高次構造をとっているのかしてサブバンドが出てしまう。
知り合いに聞くとアガロースで流したら高次構造の影響を受けにくいから
きれいに流れるんじゃない？て言われたんですが本当ですかね？
アガロースが何故高次構造の影響を受けにくいかわからないんで
知っている方いれば教えてください
203 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/05/19(金) 10:46:21
オリゴの純度が低いからでしょ？
204 ：
200：2006/05/26(金) 23:07:30
>201
装置、今それの改良型をアクリル加工にて制作中。
ニーズがあれば設計図、制作ビデオをディストリビュートしてもいいけど。
205 ：
2D：2006/06/01(木) 11:14:26
206 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/08/11(金) 23:22:15
誰かコンニャク使って電気泳動してみてよ。
できるとかいう噂を聞いたんだけど。
207 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/08/13(日) 03:04:45
スポットでねえよ！
209 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/08/13(日) 20:50:55
>>208 ありがとう。
今、電気泳動できない環境だからやりたくても出来なかったんだよ。
210 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/08/28(月) 16:20:55
211 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/08/29(火) 23:15:10
解析ソフトはパー金がいいよ。
イメージャーはちょっと変わってる。
212 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/08/29(火) 23:52:20
>211
それって島津がいいと同意語だよ。
誰かいらないえいどうそうください
14x14くらいの
214 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/10/30(月) 19:12:43
しみ
215 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/12/08(金) 12:23:01
あのぉ‥ ハタケ違いの者なのですが
泳動の実験したいので教材のとかいろいろｸﾞｸﾞってみたのですがなんか高くていまいちです。
レスを読むとキットみたいなのでなく自分で必要な試薬とかでやってるのとかありますが
何かそういった安く最低限でできる解説やＨＰとかありませんか？
または超安い簡易キットなんか知りませんか。
一応、電源は代わりの物がありますので培養だの指示薬とかのことでいいのがないかと。よろしくお願いします。
216 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/12/09(土) 00:26:21
ｸﾞｸﾞﾚ
217 ：
207：2006/12/24(日) 02:02:26
おらおらースポスポっとスポットが出ちゃったYO！！！
面白いと思ってそれを書いたのか
日本人の知能水準を守るためにもそうは思いたくないが
219 ：
名無しゲノムのクローンさん：2006/12/24(日) 11:10:43
知能水準を守るため？
以前ミニゲルで泳動やった事あるのですが綺麗に泳動するのが
難しかったです。大きいゲルの方がやりやすそう。
一人で二次元＋銀染初体験
銀染の噂にびびり停止液を相当早く入れすぎたもよう…
＼(^◇^)／
オワタ
保存
223 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/01/06(日) 10:36:27
エチブロがーエチブロがー
うっかりTEMEDこぼした…
くせー
225 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/06/09(月) 14:46:28
SYPRO RUBYで染色したいんやけど
固定化溶液ってみんな何使ってはりますか??
うちのとこは 固定化溶液と洗浄溶液(7%AcOH+10%MeOH)なんやけど
安定して染まってくれません。
当然インビトロジェンの方法(50%MeOH)とは違うけどメタの濃度って
固定化の具合に影響あるんでしょうか??
もし知ってはる人がいたら教えてください。
226 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/06/09(月) 19:45:13
失礼な質問かもしれませんが、SYPRO RUBY染色液、ケチっていませんか？
227 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/06/10(火) 09:59:34
正直割とケチってます。
シェイカーかけてゲル全体が浸かるぐらいです。
ただやり始めのころは同条件で染まっていたので問題ないと思っていたのですが
、ある時期を境に急に安定しなくなったのです。
第一銀染色キットではきちんと染まっていたのでタンパク量も問題ないはずなのです。
確かに染色液をケチっているのも問題かもしれませんが、染色自体、固定化段階の影響
を受けやすいのかと思い質問させていただきました。
228 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/06/10(火) 10:34:19
標準操作に従う必要は無いと思いますが、ギリギリのところだとガクッと感度が
落ちることがあります。もちろん、ある時期を境にとのことなので、ロット差や
保管や輸送状態の違いもあるのかもしれませんね。
229 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/06/10(火) 10:37:31
ご返答どうもありがとうございました。
いろいろと検討できるところが分かりました。
参考にさせていただきますね。
230 ：
さいちゃん：2008/08/17(日) 17:06:39
二次元電気泳動をしているのですが、一次元目が終了したときにゲルの酸性側に白い線がはいっていて、このゲルを二次元で展開するとスポットがゲルの酸性側に集中してしまいます。なぜこのようになるのかわかりません。誰かアドバイスお願いします。
231 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/08/19(火) 18:20:25
一次元目にお使いの装置は、何ですか？
232 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/08/20(水) 15:00:29
きっと、サンプルに塩が多く含まれていますね。
脱塩をしましょう。
233 ：
さいちゃん：2008/08/20(水) 17:46:00
装置はbio-rad社製のプロティアンIEFセルを使用しています。脱塩は20％TCA沈澱と50％アセトン沈澱を行っています。沈澱後にTCAとアセトンをうまく除去できていないからでしょうか？
可溶化不十分じゃない？
もっと尿素濃度を高め、チオウレアも入れよう。
235 ：
さいちゃん：2008/08/21(木) 22:44:35
わかりました。一度、試してみます。ありがとうございます。
236 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/08/22(金) 11:18:33
私はIPGstrip(pH5-8)の酸性側に白の縦線が在るけどおそらくアクチンじゃないかな??
白線があってもきれいにでるよ。
sample調製の過程がわからないけど80%Acetone沈殿してその後80%AcetoneWASHを二回か三回行えば
脱塩はできてると考えてもいいと思う。
ちなみにアセトンは揮発性が高いからしっかりDryさせば問題ないよ。
染色段階で縦線や横線がひどくない??白抜けとかもない??
もしかしたらサンプル量が多すぎるのかもしれないね。
あとウレア濃度上げる場合は濃度に気をつけようね。
チオウレアは最大で2M程度までにしておいた方がいいかもね。
とりあえず何通りかの条件検討は必要です。
237 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/08/22(金) 11:21:27
あ、ちなみに可溶性高めるならCHAPSを少量入れればいけるかな??
こっちも試してみてください
238 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/08/22(金) 11:39:58
Triton X-100はミセルサイズが大き過ぎて、ミセルに強く結合している内在性膜タンパク質は
1次元目の等電点泳動ではほとんど分離できず長ぁ～いスメアになる。
これ試験に出るからな。
CHAPSはミセルサイズが小さいので、内在性膜タンパク質を等電点泳動で分離できる
239 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/08/22(金) 12:09:38
おれ、この2DｰPAGEがうまくいったら論文投稿して、アカポスとるんだ
240 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/10/25(土) 22:25:27
ラボでは女の子がいなくて毎日性欲が溜まって仕方ない。みなさんどうしてますか？
いままで数年 RNA屋さんだったのにいきなりMSとか二次元とか・・・
わかんねーよーうぅうぅっぉぉぉぉ
242 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/11/07(金) 02:15:06
mixi
∩_ ∩
m（i x i ） 保守
243 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/11/13(木) 21:12:53
bio-radの２D clean up kitを使っている方いますか？
あれってやっぱりアセトン沈殿でしょうか？
組成知ってる方はいませんか？
244 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/11/15(土) 00:58:54
一次元のゲルをCBBしたらきれいなバンドになるのかな？？？
245 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/11/15(土) 10:33:17
>>243 プロトコールに書いてあるはずです。
というよりclean up kitはあまりお勧めしません。
まず先に普通に2Dしてスポット出るか確認しましょう。
>>244 一次元というのはSDS-PAGEでいいのでしょうか??
何を一次元で流したのかは分かりませんが不純物がきれいに取れてそうなら銀染色お勧めです。
タンパク量減らすとよりきれいに出ますし、感度が高いです。
もしくはSYPRORUBYをお勧めします。(特に2Dの方
脱色作業がいらないのでTOF-MSなどの分析器にかけるならなおお勧めです。
私はCBB時間かかるのであまりしませんね。
すいません。
246 ：
名無しゲノムのクローンさん：2008/11/17(月) 14:03:04
>>245 回答ありがとうございます。
どうしてclean up kitはお勧めではないのでしょうか？？
247 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/05/25(月) 18:37:53
蛍光色素でラベルしたタンパクをCBB染色すると染色性落ちる？
248 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/06/11(木) 11:42:29
サンプル溶かすためのbufferがなくなったので作り直したら
それまで出ていたスポットが出なくなった・・・orz
AMPHOLINEが古いのが原因と考えられる？
（ちなみに98年製造のもの）
249 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/06/11(木) 12:31:56
界面活性剤の量り方の誤差が第一に考えられるのでは？
AMPHOLINEはたぶん無罪だね。
250 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/06/11(木) 13:38:37
>>240 yourfilehost見ながら抜き抜き
251 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/06/12(金) 11:44:17
>>249 レス㌧です
2回作り直しても駄目で今3回目のバッファで確認中・・・
レシピ通りに作ってるつもりだけど以前のバッファを
作った人がもういないので確認もできず困ってます
（ちなみに界面活性剤はトリトンX100とCHAPS）
これでも出なかったら近い場所にあるスポットを
手当たり次第に抜いてIn gel digestionかなぁ・・・
252 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/08/25(火) 10:25:01
２次元電気泳動ではないのですが、卒研が進まなくて困っているので、質問させていただきます。
SDS電気泳動で、バンドが上に凸に出てしまいます。スマイリングの逆のような現象です。bufferやゲルの組成などを見直したのですが一向にうまくいきません。
このような現象が起こった事のある方がいたら、アドバイスお願いします。
253 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/08/25(火) 12:39:49
>>252 私も卒論でウエスタンやってるけどその様な現象が起きたことはないけど･･･
ゲルはTEMEDを入れた後、転倒混和してる？
ゲルを流し入れている最中に重合反応がおき、ムラができてない？
何mAで泳動してる？電流をあげるほどバンドが汚くなるので私は1.5mmゲル1枚当たり
8mA程度で泳動してるけど。
プロトコールの細かい注意書きまで意識してやりなおすとうまくいくかもよ。
254 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/08/25(火) 14:28:13
>>253 細かい事が重要だったりしますよね。
ありがとうございます。
夏休み返上でがんばっているので最後までがんばります。
255 ：
名無しゲノムのクローンさん ：2009/08/25(火) 19:12:04
スペーサー側のゲルの重合が不十分だったり、スペーサー側に電気的リークがあるとき、そんなパターンになります。
256 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/08/26(水) 10:16:29
>>255 スペーサー側（上ゲルの事ですよね？）に電気的リークが起こるのはどのような場合がありえるのでしょうか？
やはりＰＨでしょうか？
ゲルを作成する試薬も作り直しＰＨ調整もしたんです。（上ＰＨ６．８ 下ＰＨ８．８）
257 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/09/02(水) 20:34:42
どっかにいいプロトコール無い？
258 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/09/02(水) 21:50:47
>>252 ゲルの下端に空気が溜まっている場合、上に凸の逆すマイリングが起きる
259 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/09/06(日) 22:17:45
どんなに2次元電気泳動がんばっても、Cy標識してディファレンシャル解析できても、
ESI-MSが、故障と停止ばかりでろくにデータを出せない【鉄クズ】なので、タンパク質の
同定ができない…orz
2次元電気泳動でどんなに良好な結果がでても、エンドポイントですべてご破算。
260 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/09/15(火) 16:03:16
16-BAC PAGEしてますが上手くいかない
論文も少ない
誰かやってないですか？？
261 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/09/16(水) 15:38:40
>>252 サンプルの塩濃度高いとそうなるね 市販のゲル使ってやってみるといい
バッファーなんてそう簡単に作り間違えないだろう・・・マーカーはどうなの？
262 ：
名無しゲノムのクローンさん：2009/09/16(水) 16:58:29
263 ：
名無しゲノムのクローンさん：
泳動が乱れないように、６分くらいぐつぐつ煮てる。DNAがかなり切れてくれる。