電気泳動

あるタンパクのバンドでした（レーンの中の）

>>930, 931
>で、サンプルの中にはそのタンパクが入っているとわかるとします。

分かってる場合は別です。その場合は、同じタンパクだと言えますよ。
普通の実験では、未知のタンパクなり、マーカーと違うタンパクだと
分かっている場合が多いので。
あと、タンパクを泳動するだけじゃなくて、そこから色々な実験を
するので、考察はできなくてもそんなに気にしなくていいと思います。
原理的には、タンパクのサイズと量を見る程度しかできないと思います。

>>932
親切にありがとうございました。

まだ疑問があるのですが、
SDS-PAGEですが

タンパク質は、一般に負に荷電していますよね
そこで、SDSを結合させると、タンパクが持っている電荷はSDSと結合することによって
ほとんどが打ち消されますよね。
だから、泳動する時のタンパクが持つ電荷の量は、結合したSDSの量によりますよね。

つまり、分子量が大きいほどSDSが基本的にたくさん結合して電荷も大きくなり
分子量が小さいと結合する部分が少なく、電荷も基本的に小さくなりますよね

ということは、電荷が大きいほど移動度も大きくなるのではないのでしょうか？
けど、実際は泳動距離は短いですよね。

それは、アクリルアミドを重合させてポリアクリルアミドを断続的に全体に作らせ
そのポリアクリルアミドの間、つまり分離ゲルのふるいにかけられる際、
大きなポリペプチドのタンパクは、ふるいにかけられ移動度は短くなりますよね

でも、これだと電荷の意味は一体何ののでしょうか？
あと、濃縮ゲルがタンパク質を濃縮するのって、何の意味があるのでしょうか？
分離能をあげることは分かるのですが、方法じゃなくて、なぜに濃縮するとあがるのでしょうか？

ＰＣＲかけたまんまのプレートを
そのままセットしたら
自動でちゅーっとサンプル吸い取って
泳動して結果出してくれる装置って
開発してくれないかな

>>934 もうあるよ。

>>933 釣りでないなら一から勉強した方が良いと思う。short answerはＦ＝ｍａだから。

>>935
それって、ゲルの電荷の公式のやつでしょ
釣りではないです。マジです

Ｆ＝ｍａは運動方程式だ。分子量が２倍になればSDSによる電荷は２倍になるか
ら、一定の電場から受ける力も２倍になる。ｍもＦも２倍になれば加速度ａは一
定だから、溶液中ならばタンパク質は分子量によらず同じ速度で泳動されるは
ず。そこにゲルの分子ふるいの効果が加われば分子量で泳動度が変わることになる。

プールに電荷かけたら北島ももっと速くおよげるね　ビビビッと

北島って負に荷電してるのかな？それとも正？

>>939
北島は男だから陰陽道でいうと陽。すなわち正だろうな。
よって答えは「遅くなる」

>>938
残念でした。

じゃあ電場を逆にかければ完璧じゃん！

でもいっしょに泳いでいる人も、みんな速くなっちゃうから。

北島だけ4xSDSで

水着をSDS処理だ！

SDSは、ぬるぬるするよ。

界面活性剤だからね。
............海綿活性剤じゃないよ。

ちなみに北島はターンするぞ

北島二個目の金メダルおめでとう

アガロースゲルマン
　　　 　.＿＿
　＿＿ﾉ・∀・ハ　　やぁ
　|ヽヽ|￣￣´ン

染色した後のゲル（アガロースゲル）の保存ってどうしてますか？
市販されているゲルドライヤーを使うほかに乾燥させる方法ってあります？

今日ｴﾁﾌﾞﾛに漬かっちゃったよ・・・

>>950

セロハン紙に挟んで枠に嵌めて風乾

H風呂

>>952
それキットのやつ使ってるけど、
グラジェントゲルで白くならず割れないテクニックない？
自分が下手なだけかな・・・

>>952
割れずに乾燥する方法知りたい・・・
いつも割れちゃって悲しくなります

ゲル乾かす前に5%グリセロール入れる。ゆっくり乾かす。
メタノールも入れてみる。くらいかな？

泳動してるときのﾛｰﾃﾞｨﾝｸﾞﾊﾞｯﾌｧは

クロールですか？平泳ぎですか？

>>956
あ！MetOHは入れてない
やってみます。ありがとう

MetOHって、普通書くかい？ >>958

過疎スレの悪寒ですが･･･

>>933>>937あたりに関連して
なぜ分子量or塩基対数の対数が移動度に比例するかを知っている人いますか？
移動速度に比例する抵抗が加わっているからでしょうか？
物理的に理解したいのですが、数式が記述してある本などを見つけることができません。
どなたか教えてください。

高分子化学の本でも読んだら。

対数とは何か，を理解したら？

そういう問題じゃないことは確かだな

日本語でそういうことを詳しく書いたものはたぶんない。
ゲル電気泳動法の原理の開発当時の原著論文を探して読むのが確実だけど
それでもたぶん物理屋さんが納得できるほど深くは解明されてないよ。
生物の研究にそこまで必要ないし、物理学としては半端でしょ。

だからさ、移動度は高分子のマトリクス内の挙動、すなわち粘性とか荷電の
総和なわけよ。そういうのはゾルとかゲルとか専門にしている高分子化学っていう
物理化学入った領域があるから、そこら辺の読んでみたら？ってこと。

BIO-RADのMini Prep Cellを使い植物から目的のペルオキシダーゼを分取SDSで
分取する実験をしています。　一つ疑問なのが、分取後に等電点電気泳動で酵素の活性
を見るのですが、SDSでタンパクがコーティングされている状態で酵素に活性があるのか懐疑的です。
電荷が統一になっているので、酵素の活性もないと思うのですがどうなのでしょうか？
それとも、流動バッファーで流すときにタンパクに付着したSDSは取れるのでしょうか？

○○を分取SDSで分取する→意味不明

等電点電気泳動で酵素の活性を見る→これがペルオキシダーゼの活性測定法か？

>>967
日本語が下手で申し訳ありません。
実験では分取用のSDSを行っています。SDSでタンパクを分離し、長時間電気を流すことにより
ゲルの最下層から出てきたタンパクを断続的に流しているバッファーで流し取る作業です。
扱っているのが酵素なので、この作業は冷蔵庫の中で、行っています。

実験の目的が植物から1種類のペルオキシダーゼを分離することで、されにPIと分子量が分かっています。
等電点電気泳動では、酵素の死活を確認しています。

精製する前のサンプルにSDS加えて活性見てみれば？

>>968
説明しているつもりだろうが、全く説明になっていない。

>>970
禿同。
>>968
SDSかます時点で、大概のタンパク質は活性なくなるでしょ。
ちゃんとSDS除去のステップ経ないで、酵素の死活うんぬんはナシでしょ。
>>968のカキコから推測するに、
等電点電気泳動でPIが一緒なら活性アリとしているかの様ですが、
PI、分子量が同じでも、タンパク質の立体構造がくずれていたら、
酵素の活性はなくなります。

>>970.971
本当に説明へたですいません（；；

>>971
流す時、サンプルにはSDSは加えますが、メルカプトを加えたり、加熱などのはしません。
タンパクの立体構造を崩さず、流しています。

分取後のSDS除去作業ですが、バッファーで薄めては濃縮の作業を繰り返すことで
SDSが除去されると思っていますが、正しいでしょうか？

>>972
正しくない。

SDSはタンパク質に張り付いて投石なんかでは完全には覗けない。
NP-40で処理したら覗けるという話。
そもそもSDS入れといて本当に構造が壊れていないのか？

活性のあるタンパク質を電気泳動なんかで精製しようとしないで…

>>972 =966
あんた、タンパク質を扱わない方が良いよ。
973さんの最後の一行でＦＡ。

目的産物がパーオキシダーゼという酵素なんだから、酵素活性を測って比活性を求めることが本来するべきことでしょう。
（バーオキシダーゼの活性測定について、知らずに書いているんだが。）
どうして等電点電気泳動が登場してくるんだ？

っていうか、比活性、回収率、精製度、といったタンパク質精製の時に使うタームを知っているか？　

試薬加えるときにいろいろな量を
加えなくちゃいけないから不便なんだよね。
マイクロピペットのダイヤルいちいち回したり、
チップを換えたり…
何か合理的な方法を知っている方、教えてください。

Multi-channel が３本くらいあればELISAもらくちん

Multi-channel が１本でも十分らくちんでしょう＞ELISA

>>976
既製のｹﾞﾙ買えば〜？
ｶﾈないなら面倒でも手を動かせや。


（´-`）.｡oO（こういう手抜きを目指す香具師に限ってなぜこうなるのか？
　　　　　　　という「原理」を知らないｳﾞｧｶだったりするんだよなぁ。。。


手抜きは原理を覚えてからだ。
ちなみに、ダイヤルをほとんど回さずにやる方法は間違いなく存在するが
それは自分で考えろや。

>979
0.1マイクロごとに目盛りを固定したピペットマンを多数用意。