RNAiってどうよ

少し話題になっているよね。実際にちゃんと機能しているのだろうか？この関係の実験している方などからの情報お願いします。

RNAiって何ですか？

RNA interference

antisense RNAを導入すると、sense鎖にコードされてる
タンパク質ができなくなる。

メカニズムについては現在研究中。sense鎖にhybridize
したdouble strand RNAが分解されてその分解産物が
さらに…。
面倒なので何か適当な論文でも読んでくれ。

２＞
逝ってよし。

4>
じゃあ、おまえAAA ATPaseってわかるか？

>>3

アホ一匹みっけ！！
この時代にRNAiとantisense RNAを混同している奴がいる！
無形文化財クラスの馬鹿だなあ！

まあまあ。外来の二本鎖RNAで内在性のsense RNAが分解されるのがRNAiね。

>>6
いや、べつに混同してる訳じゃなくて、
説明が下手なだけだろ。
antisenseのきこうの一つがRNAiなわけだし。

外来とはかぎりませんよ
内在のRNAiだってあるんだから

むしろ、今は内在のほうが興味深い。

>>6
>説明が下手なだけだろ。
antisenseのきこうの一つがRNAiなわけだし。

全然違うんじゃないの？
RNAiってdicerがdsRNAに結合して、21-22bpのdsRNAに分解し
それがleader役になってtargetRNAに結合して、この複合体に
さらに、ENDのRNaseが結合して分解するんだよ。
antisense RNAとは違うよ！

>>11
君はもう少し、antisenseについても
勉強したほうがいい

誰も試していないんだな。
さすが2ちゃんねる。

antisense RNAがsense RNAと２本鎖を形成することで翻訳を阻害する
とは言われているけど、証拠を示した論文て見たことないなぁ。結果的
にantisenseも同じメカニズム使って翻訳阻害していんじゃないの？学
会で数年前にそんな話を聞いたこともあるし・・・。

RNAiのiはinternetのi

>14
そんなことを書いてあるreviewを読んだことがあるが、結局そちらも
証拠はないように思う。

>>12
君はもう少し、antisenseについても
勉強したほうがいい

じゃ、お前少し解説して見ろよ！
antisense RNAで
RNAi複合体ができるなんて聞いたことないぞ！
もしあるならば論文キボーヌ

DNAiってどうよ？

>>17

12はなにも知らないのに、知ったかぶりをしているだけだ。
相手にするな。

あの定期的に立つRNAiスレか。
わたしがこの伝説を聞いてから3つめだが、
実際いくつぐらいあったのだろうか。

ホメオボックスが細胞外に分泌される話はどうなった？
FGFが細胞内因子って話はどうなった？
カリウムチャネルが核内に局在って話はどうなった？

QPコーワiってどうよ？

RNiって線虫では盛んに使われています。だってベクターをえさの中に混ぜるだけでいいから
RNiの機構は２年前くらいにCellのminireviewで取り上げられてます。

RNAiの発見って、ノーベル賞ものなの？

実験に使用している短鎖の合成ＲＮＡってどこに注文しています？
自分で合成？

なぜ短鎖RNAが必要なの？
折り返しの配列を入れたベクターを使うでしょ。

ところで、RNAi見つけたFireって若いの？

>>26
c.elegansなら折り返しでいいんだけどmammaliaではだめなの。

>>25
俺は自分で合成している。

これについてまったくの素人なんですが、
去年の分生に現れた外人さん（なんていう名前だっけ？）、
十二年ぶり来日のあの人がRNAiの第一人者？
どのような系で導入するの？
たとえば、生体に短鎖RNAを導入した場合、
遺伝病のサイレンシングを起こすことできるの？

>c.elegansなら折り返しでいいんだけどmammaliaではだめなの。

動物細胞ではIFN kinaseが活性化されバルクの転写がブロックされ
使えないんだよ！だからオリゴ２１bp dsRNA

>>27 そんなに若くない。と言ってジジイでもなかったような

>>30 C.elegansも動物なんだが・・・

以前の論文では、mammlianではRNAiは完全には抑えない（1/10程度）
と有りましたが、実際に試した方いかがでしょうか？

RNAi、humanのculture cellでも良く効くぞ！
こいつに比べればantisenseやRibozymeなど問題外だ。
でもPKRには気をつけろよ！
とりあえず21merのRNAを2本合成して細胞にぶちこんでみろ＞おまえら。

PKR を RNAi しちゃたらどうよ？

結局、ターゲットの遺伝子によって効きが違うとかね。

>32
線虫などでも完全に押さえているわけではなく、多少の漏れはある。

つまんねえ、やめろ。

>>35
それがないからRNAiはantisenseやribozymeよりイカしてるんだよ。
標的遺伝子にほとんど左右されないというのは強力だぞ！

>>38
しょせん目くそ鼻くそだよ。
knock-outや、mutantの原因遺伝子の単離にはかなわない。

サイレンシングの手法よりも、
内生のRNAiのターゲットとか、メカニズムの方が１００倍おもしろい

>>39
五十歩百歩には同意。
というか遺伝子によって効果に違いが少ないという話は初耳です。
pubmedIDおしえてください。>>38
でも興味の方向はひとそれぞれだね。
俺もRNAiを利用した内在性の遺伝子制御機構がおもしろいとは思うけど。

少なくとも線虫では完全に日常的ツールになっているんだけどなあ。
KOをやる前にRNAiを試してみるのは常識だし、
mutantをとらずにRNAiだけで解析している論文は山のようにある。
下手すりゃ半分くらいそうじゃないかってくらい。

要は「ナントカとはさみは使いよう」でしょう。
ここでは哺乳類の培養細胞の話をしているんだと思うけど、
「機構の研究の方がずっと面白い」なんて、もったいないこと言わずに、
もっと気軽に日常の実験にうまく取り入れていくことを
みんなでガンガンやっていった方がいいと思うよ。

思っているよりもずっと使えたりするかもよ。

だね。
とりあえずやってみたらいいよ。
手軽さが売りのRNAiなんだから。

>>40
とりあえず自分の比較実験の結果を述べたまで｡いろいろやってみたよ。
詳しいことはいえないが…まあうまくまとまったら論文にするよ｡

>>41
君、なかなかいいこというな！

みんな、日曜の朝からご苦労様。
たしかに、戦中では日常的ツールですね。
他の生物種ではどうなんですか？

ES細胞では長いのをいれると、都合良く短く切れて効くらしい。

>>ES細胞では長いのをいれると、都合良く短く切れて効くらしい。

動物細胞では、NCBのデータは否定されたよ。
だからoligomerを使う方法になったんだ

>>46
コメントありがとう。
MCBとPNASにも載ってたので、応用できるのかと
勘違いしました。（活字は怖い）
Oligomerの場合、トランスフェクションはどうするの
でしょうか？まさかエレガンスみたいに食べ込んだり
はしてくれないでしょう・・・・

直接Mediumに入れるのかと思っていたが、siRNA用の
トランスフェクション試薬ってのもあるらしい。

>>47

普通のlipofectaminでよろしい。
oligofectaminちゅう特別な奴も売り出されているが、
結果は変わらんかった。
どれくらいノックアウトされるかというと、これはtarget proteinの
turn overによるんだ。
cell cycle geneを潰しているが、これまで６個潰してほとんど成功した。
Westernでほとんど検出不可能なくらいなくなる。

よっしゃ、早速やってみよ！
と思ったが、RNAの合成って外注できます？

すんません。わしゃ、アメリカ在住で日本の事情に疎いので
ようわかりません。
これは　RNAだけではなく末端をTTのDNAにしてRNaseのアタックを
防御するようにしてあるので、特注となると思います。

RNA−DNAのキメラ合成、日本でもやってるよ。探してみぃ

日本バイオサービスでやってるよ。

２１merぐらいがいいのなら、少し面倒だが、相補部分を２１merにして
それらの間にスペーサーでもかますコンストラクトを作るというのは
どうでしょう。こうして、正常sense鎖と、コンストラクト由来の
antisenseを合成して、RNaseAで処理後、精製。
やっぱり面倒だ・・・・

たしかに面倒だね。
あと3'の突出が効率に関係するはず。
やっぱ外注が楽では？

>>55 3'が突出していた方がいいの？

PMID: 11157775
>>56ハエだけど。
38さんの場合どうでした？よろしかったら。

Mammalianの系での成功談もお願い。
効率ってどのくらい？ハエの場合インジェクションで
phenotypeが出ると聞きました。

HPLC精製した方がいい？

Morpholinoって誰かうまくいってる人いますか？

おれはマウスにできたとある腫瘍にうってみてうまくいったぞ。いま論文サブミットちゅうだが。。。

>>61
Morpholinoですか？vivoで撃って効くのなら最強だ！

ぶちかませ。
日本のライフサイエンスをせかいにしらしめるのだ。

>>63
恐る恐る聞きますが、Morpholinoって日本の発明ですか？
（ああ、非国民と呼ばないで）

morpholinoについては
ttp://www.gene-tools.com/
を見るべし。
んで、実際に使った人はいるの？

マウスの腫瘍ってけっこう量要るよね。
お金持ち

>51
アメリカでの業者名と値段を教えていただけませんか？
いくつか見つけたけど実績がある所に注文したいので。

PNASにヘアピン構造のRNAを発現させても抑制出来るって
論文出てた。これなら俺にもできる？

>68
そうみたいだね。でも遺伝子のどこを狙えばよいのかは
やってみないとわからんらしいね。さあオリゴをじゃん
じゃん発注じゃ！

ダーマコンって会社が専門にやってるってのを
同僚に教えてもらいました。（当方在外ポス毒っす）。
彼女は、ここで注文してから、oligofectamineを使って培養細胞に
入れてたけど、試した例では全部western blotで全然見えなくなってたです。
興味ある人はのぞいてみてはいかがですか。
http://www.dharmacon.com/index.html

んで質問なんですが、細胞は分裂増殖してる必要があるのでしょうか？
同僚の結果では、５０％confluentの時にかけてからタンパクの量をwestern blotまたは
immunocytochemistryでアッセイしていたんですが、神経みたいなpost-mitoticなターゲットにも
効くのかどうか知りたいんです。

あげ

mammalianできくの？

結局、内性のNAT(natural antisense transduction)って機能的役割をもってるの？
まだわかんないんだっけ？

一応リンク

神経系にRNAi機構は存在しないの？
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1015690094/l50
書き込み不要

siRNAのターゲットどこにしたらいいんでしょか？
mRNAの二次構造予測にかけてみたんですが、あまり関係なさそう・・・
どこをどう狙えばうまくいくのか？
初めはみんな開始コドンから50nt〜100ntって言ってたのに
最近の論文はみなこれ無視してるし．それでもうまくいってるし．

RNAiって酵母でもできるんですか？教えてください

癌細胞で、c-mycをRNAiで抑制できますか？

>>76
わたしはしらない。
でもcerevisiaeならノックアウトもらった方が速いんじゃないの。
ちがう？

>>59
HPLC精製でもカートリッジカラム精製でも
結果はほとんど変わらなかった。
安くて収量が多いほうがよければカートリッジカラムでいいし、
心配だったらHPLC精製にしたら。
>75
5種類の遺伝子について、
スタートから100塩基くらいのところで作ってみたけどすべてうまくいった。
>77
インターネットで検索かけてみたらどうでしょう。
見つけたけど教えない。

ちなみにバイオサービスに注文した。
健闘を祈る。

morpholinoいくらなんでも値段が高すぎる。
独占禁止法違反！！
誰か安く合成してください。

ライセンスが絡んでいる。

>82 morpholinoの合成法にライセンスが絡んでるということ？
ライセンスが絡まないような合成法をどこかで開発してくれなきゃダメって事か。

>70 なぜ分裂する細胞でないと効かないと考えたの？
現在のRNAiモデルからすると分裂中の細胞である必要はないと思うよ．
ただ神経系の細胞ではRNAiは効きにくいというのをよく聴くなぁ．
Dicerの発現が弱いとか、RNA editingに関する酵素が多く発現
してるから（dsRNA/siRNAが修飾されて塩基不対合を起こして二本鎖
としてRNAiに関わる酵素に認識されなくなってしまうのでは・・）
などなどいろんな説が出されてるみたいだけどね．

みなさん、詳しいですねぇ、、、。
あまりに初歩的な質問ですいません。
出来ましたらレスお願いします。
Dicerは dsRNA の切断後、23merRNAをくわえこんでいるのでしょうか？
また、植物とか下等生物で virus に対する防御で使われるって
どっかの review で読みましたが、外来・内在に関わらずヘアピンRNAはターゲットになりますか？

＞Dicerは dsRNA の切断後、23merRNAをくわえこんでいるのでしょうか？

nature Vol.409 295の話からすっと、Dicerは最終的にRNase（未同定)にsiRNAを渡すって
考えられるけど．ホントのとこはまだどーなってっかわかってねーんじゃない？
未だにどの酵素がmRNAを最終的に分断してるかは不明のはず．
核酸・タンパク質のコンプレックス（RISCとかsiRNPって名前つけられてるヤツ）
がその主役だって事はわかってんだけど、その構成因子がわかってねーんだよなぁ．

さらに俺が最近不思議に思ってんのはmRNAは、siRNAと対応するどの部分で
切断されてんだ？って事．あるペーパーではちょーどsiRNAの真ん中らへんで
切断されるって書かれてた．
が・・・
ドロソフィラやC.elegansのRNAiでは細胞内で生じたsiRNAをtemplateとして
RdRP(RNA dependent RNA pol)がさらにdsRNAをつくるって現在考えられてて
この新しいdsRNAをまたdicerが切断してさらにsiRNAを生み出すってモデルが提唱されてる．
transitive RNAiの説明にもなるって事で結構信用されてるモデルがあるんだけど、
このモデルによると切断されるのはmRNAのなかでもsiRNAに対応する
［両端］だよな．どーなってんだ・・・？？？

＞外来・内在に関わらずヘアピンRNAはターゲットになりますか？
どーいう事？？
ヘアピンRNAのdsRNA部分はRNAiを引き起こすトリガーになるか？って事？
それともヘアピンRNAをターゲットとしたRNAiは起こるのかって事？

＞70

ヒトdicer遺伝子に対するRT-PCRの結果では、脳のcrude homogenate
にはdicer遺伝子が検出できなかった・・・というような論文を見たぞ．
ただ、ヒトdicerの文献は、もともと別の遺伝子として命名されてるから注意．
あとでダイサーってわかったんだけど．

ambion から出てるRNAiのキットを使ったことある人！
使い心地はどうですか？

　　　　　　　　　＿＿＿＿＿＿
　　　　　　　／::::::::::::::::::::::::::::::::::::＼
　　　　　／::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::＼
　　　　/::::::::::/|:::::::::/ﾉ::::::::／ヽ人:::::::::::ヽ
　　　/::::::::::/　|:::／/∧::::ﾉ　　　　ヽ、:::::::ヽ
　　 |:::::::::::/ι |/　 |ﾉ　|/　　　∪　　ヽ:::::::::|
　　|::::::::::/　━━━━　　━━━━ 　|:::::::|
　　|:::::::/ 　　　＝＝　　　　　＝＝　　　 |:::::|
　　|:::::/　l￣￣￣￣|====|￣￣￣￣ l　|::::|
　　|　=ﾛ|　-=・=- 　/　　ヽ|　-=・=-　|ﾛ=|::|
　　|/　　l　　　　　/　 　　｀ヽ　 　　　l　　 |
　／　　　ー── （●＿●）───　　　＼
　|　　　　　　　　　　　l l　　　　　　　　　 　　|　　　　　　 ／￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
　|　 　∪ 　　　|--￣｀´￣--|__　　　　∪ . ｜ 　　　　／　>>70,>>84
　|　　　　 　 　　|二二二二-|　　　　　　　 　|　　　＜　　　　細胞が分裂云々ってのは、
　＼　　　　　　丿　　　　　　ヽ　　　　　　　／ 　　　　＼　　トランスフェクション効率に関係していると思われ。
　　 ＼＿　　　　 _-￣￣￣-_　　　　 ＿／　　　　　　　 ＼＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
　　　　　　￣￣￣＼＿＿／￣￣￣

ambionのキットはいくらぐらいするんですかねー？
日本で扱っている会社ってありますか？

mammalianの培養細胞にRNAiを行った場合、その効果は4日後が最大になるとのお話ですが、効果の持続の方はどうなんでしょうか

タンパク質のturn overによって違うと思うけど。
自分で確かめてみたら？

siRNA vector使ったことあるひと！
使い心地どう？

RNAiって、RNAを分解するだけで、標的遺伝子の転写も抑制してるってことあるんですか。

>>89
このコピペよく見るけど。Ｏさんですか？

>>94
植物のPTGS?

>>96
co-suppressionか？

epigenetics

T7 polymerase を使って安価でできる

1 名前：名無しゲノムのクローンさん 投稿日：02/05/30 15:35
ＲＮＡｉについて語りませか？
理論上はどんな遺伝子でも発現をストップできる！！！？

2 名前：名無しゲノムのクローンさん 投稿日：02/05/30 16:00
ほ乳類の場合は、DNA-RNAのハイブリッドじゃないと効きにくいみたいだし、
効率も良くないみたいだよねぇ。
どうしてだ？

3 名前：名無しさん 投稿日：02/05/30 16:00
その理論というのを言ってくれ

T7 RNA polymeraseで簡単に合成出来るってば！
検索してみ。すぐ出るから
漏れは今日プライマー申し込んだ
美味くできるといいね＜漏れ

>>101
> T7 RNA polymeraseで簡単に合成出来るってば！

線虫では昔からそうやっている。今でもそれが最も一般的な方法。
polymeraseはstratageneのがおすすめ。

>>101
つーか、系は何？

ﾎﾆｭｰｻｲﾎﾞｰ

　　　　　　　　　　 ／￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
　　　　　　　　　　 　|　ﾏﾝﾃﾝ　ｸﾀﾞｻｲ
　　　　　　　　　　　 ＼＿　＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
　　　　　　　　　　　　　　 ∨
　　　　　　　　　　　　　 〃 ﾊﾊヽ
　　　　　　　　　　　 ＿ “ ｰ “　　＿＿＿＿
　　　　　　　　　　／::::⊂　　⊂）:::::::::::::::::::::／
　　　　　　　　 ／:::::::::::（＿（＿つ:::::::::::::／
　　　　　　　／:::l⌒l::::::::::::::::::::::::::::::::::／
　　

morpholinoの特異性って、大丈夫なの？

imifumeinositumonn.

以前、ニワトリでもRNAiが聞くといううわさを聞いたのですが、
真偽の程をご存知の方はいらっしゃいますか？
エレクトロポーレーション法で
特定領域だけに二本鎖RNAを導入するらしいのですが、
これができたらマウスのCre-loxPよりはるかに簡単な方法で
特定領域での遺伝子発現の抑制ができるんじゃないかと思うのですが。
詳細を知る方からの情報、お待ちしております。

結局誰もまだ試してないの？
それとも上手く逝かないの？

大学で研究してるとこあるよ

＞１１０
どこ？

どこ？

>101
それって、大量合成できるってキットのことですか？

ところで、ベクターで２本鎖RNAを作らせて、RNAiに成功したってニュースを
５月ごろ見たけど、ベクターベースでやっている人いる？

U６は効果あるよ。
でもtransfectionだから、効率が悪いのが問題！
70bpのoligoを２つ頼めばいいだけ。

出始めのときiRNAっていっててAppleの製品ｶﾄｵﾓｰﾀﾖ

>114
論文にも出ていたU6 promotorのやつは効果があるのか・・・

プラスミド入れるだけだから安上がりだよね。
ウイルスベクターかなんかにして導入効率をあげているのかな？

age

RNAiは神経系だめなんでしょたぶん。
じゃあMorpholinosはどうなんでしょう？
フナコシのおっさんに聞いたら、ゴニョゴニョ言って誤魔化してたけど・・・。

ScienceではU6じゃなくてH1のプロモーターを使ってたけど
どっちがいいんだろ？

う〜ん。

ゼノパスでできますか？

RNAiの特許ってどこに行けば確認できるのかしら？

多比良せんせーの新作期待あげ

RNAiの特許がどこに行けば確認できるかわかりませんが、
RNAiの原理に特許があるのでは？

ttp://www.hgmp.mrc.ac.uk/Biology/descriptions/Celegans.html
WO 99/32619

とにかく、
最近、フナコシからでた、AmbionのRNAi合成キットはどうなん？
ってことを聞きたい！

とりあえずAmbionとDharmaconはOKらしい

ｷｱｹﾞｿもsiRNAだしたね。
「うちはやらない」いっとったのに・・・。

RNAiイケルという話だが、
実際はmajorなcell lineつかってるのがほとんど。
もともとtransfection効率がいいわけで、
そんな細胞なら上手くいくのはわかる。
といっても、transfection効率９割くらいの細胞株でも、
RNAiでの蛋白レベルの抑制効果(Western）は半分程度の場合もあるし・・

ということで、聞きたい。
そこの経験豊富なbiologist!

�@導入効率の悪いprimary culture cellでRNAiやろうとするのは、
　ムシのいい話なんだろうか？
�A神経細胞に限らず、非分裂細胞でやるのは苦しい話だろうか？

発現を抑えられなかった場合のトラブルシューティングってある程度確立されてるんですか？

>130
とにかくいろんな配列に対して試してみる

RNAｉで今一番できる人は誰かな？

金かかるよね。
完全に抑制できないもんだから、4つ余分に設計して注文しちまった。

すいません、ずっと不思議に思ってるんですが、mammmalの系では、PKRの活性化を避けるために
siRNAを使うんですよね。（合ってますよね）
Degradative PCRのモデルに当てはめると、RdRPによって、siRNAからでも長いdsRNAが
生成されちゃうと思うんですが、それってPKRの活性化の原因にはならないんでしょうか。
すいません。アフォのＭ１の質問です。

mammalでした。。スペルミス

>>134
一回の伸長では長くのびないとか？

これってのちにメカニズムが分かって、これで抑制した気になってた論文はカスって
ことになったら大混乱とかいうことはないの？

抑制してるのは確認してるっしょ。

１３７はどこまで論文読んで言ってるの？

かなり読みましたよ。
このスレのはじめから。

ﾌﾟｯ

136さんに頂いた回答が、今一般に言われてることなんでしょうか。
30nt以上に増える物は少ないっていう解釈でよかったですか？
mammalでは、Amplificationというより、siRNAの数が少なくなるのを
防いでるって感じなんですかねぇ。

うちは何にも考えずに業者委託。＄７０なり。

>143さん
純粋に僕の好奇心です。実際効いてるなら問題は無いと思うんですけど、
ふとそう考えてしまって。
この辺については、あまりこれといった説明はなされてないんですかねぇ。

ageます。

Dharmaconって最近良く聞くけど高いね。

Science 2002 Aug 1
A MicroRNA in a Multiple-Turnover RNAi Enzyme Complex.

Hutvagner G, Zamore PD.

In animals, the double-stranded RNA-specific endonuclease
Dicer produces two classes of functionally distinct, tiny
RNAs: microRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs).
miRNAs regulate mRNA translation, whereas siRNAs direct RNA
destruction via the RNA interference (RNAi) pathway.
Here we show that, in human cell extracts, the miRNA let-7
naturally enters the RNAi pathway, suggesting that only the
degree of complementarity between a miRNA and its RNA target
determines its function. Human let-7 is a component of the miRNP,
which we show is an RNAi enzyme complex. Each let-7-containing
complex directs multiple rounds of RNA cleavage, explaining
the remarkable efficiency of the RNAi pathway in human cells.

ターンオバしてたのね。だからふえなくてもいいってことなの？
まんまるでは

良スレage

RNAiなんて使えねーよ！トランスフォーメーションもなー！
原理がはっきりしねーのは認めねぇ！
文句ありますでしょうか？
逝ってきます…

↑逝ってきてね。すぐに。
こんどRNA頼むけど、どこが効くかわからない。
なにか法則とかあるの？
情報きぼーん！！

8月15日に靖国に逝くと効きます。

今からRNAiのメカニズムやってるラボに
留学するとしたらどこがいいかな？
やっぱZamore？
それとも、もう実はほとんど解明されかけていて
今からやるには手遅とか？

一般論として、今流行っているものに飛びつくのは遅すぎです。
RNAiもしかり。気づくのが2年遅い。
RNAiはとっとと諦めてこれから流行りそうなものを探してください。
出来たら自力で流行を作ってください。

>154さん
やっぱり今からじゃ遅すぎますか．
すごく興味深い現象なのでどうかな？
と思いましたが，
他を探した方が良さそうですね．
レスどうもでした．

>>154
禿同。

結局いまのところDicerが無いとやっぱりsiRNAをトランスフェクションし
ても駄目ってこと？

ターゲット配列ってどうやって選べば(･∀･)ｲｲ!!んですか？

JBIOSに載ってるのはだめぽ？

>>158Metから75塩基以上離れたトコのAAを見つけて、
そっから19塩基。この中のCG比が約50％ぐらいがいい。
CとかGとかが3つ以上連続すっと立体的に不利とか。
で、その配列が特異的であることを確認。アカンかったら
また次のAAからやり直しって感じらしい･･･。
mRNAは9割以上落ちるみたいよ。

RNaseの活性をはかるのってどうしたらいいんですか？

RNA切らせてみる

細胞内にあるRNase活性は？

究極の総合リンク集

http://home9.highway.ne.jp/cym10262/

＞１６０
ありがとうございます。
その情報のソースとかってあったら教えていただきたいのですが

>165
日本バイオサービスだと思われ

>157
遅レスなのでsageるが、mammalの場合、RdRPによる増幅は無いのだからDICERは
別にいらないような気もする。RISCで用いられているのは別の酵素のようだし。

線虫の場合もRISCの系だけはうまく回るはずで、その場合mammalと同程度は維持される
のではないかなぁと思われ（ただし、全身への移行によって薄まるのが速かったりして…
この場合SID-1（これだけでは無いかもしれないが）のKOを使ってmammalと比較しないと
ダメかも）

植物の場合は、siRNA自体はRNA silencingの結果っぽい（siRNAでRNA silencingが
起こるかどうかはまだ不明←ってことは多分おきない）。RdRPによる増幅に
primerが（おそらく）いらないことを考えても、siRNAではなくlongなdsRNAを
ぶちこむべき。っとするとDICERはいるでしょうなぁ

>167
確認なんですが，植物細胞にsiRNAを導入しても
RNAiは起きないのでしょうか？

>>167
siRNAというより、dsRNAをハンニバルやヘルズゲートベクターを用いて
アグロやウイルスで導入した結果、それが分解されてsiRNAになり、
RNAiを起こすというのが植物におけるRNAiでなかったっけ？
そういう日本語の総説を読みました。

ところで、標的遺伝子のサイレンシングの有無の確認は、
やはりノザンでsiRNAを確認するのが一般的なのでしょうか。
サイレンシング用のコンストラクトを作るときに用いたインサート部分から
外れたところでプライマーを組んで、RT-PCRを行って標的遺伝子の
バンドの消失を確認する事で代用はできないのでしょうか。

動物細胞ではsiRNAがRNAiを導くのは確かですが、
植物細胞にsiRNAを入れることでRNAiがおきるかどうかはわかっていない
ようです。現時点で「不明」ということは将来どうなるかはわかりませんが
（特に異常な研究スピードでまわっている分野ですし）、ある程度
チャレンジした人も当然いるはずの現状で報告されていないということは
「多分起きない」んだと思います＞168、169

植物のRdRPのprimerにはsiRNAがいらないっぽいので増幅にsiRNAは
関係なさそうですが、リードする役目とかはどうなんでしょうかねぇ？
植物におけるRNAi（RNA silencing）について詳しい方は
いらっしゃいませんか？

>>167
169ですが、植物ではsiRNAそのものを導入する方法は、
寡聞にして聞いたことがありません（もともとそういう分野でないので）。
アグロバクテリウム（RNAi）やウイルス（VIGS)による
サイレンシングのメカニズムは、169で述べたとおりです。
siRNAを植物細胞に導入するのは、動物や線虫と違って
植物細胞独特の構造（細胞壁やバキュオル）のせいもあって
そもそも難しいのではないでしょうか。
（表に出てきてないにしろ）植物ではどのようにsiRNAを
導入しているのですか？

1：スタッフ詳細をクリック
2：メールアドレスを登録すると貴方専用の広告タグを発行します
3：そのタグをHPや各種掲示板などに張り、クリックや紹介がある度に報酬が得られます。(HPがなくてもOK)
4：毎月1回、報酬をお客さま指定口座へお振込いたします。
［報酬について］
クリック報酬 1クリックされる度に10円の報酬(１日１０００クリックだけで１万円。各種掲示板を利用すれば簡単に可能）
バナー紹介料 リンクスタッフ登録の度に1000円の報酬
キャンペーン 今なら登録するだけで1000円プレゼント
間接報酬 紹介者が得た報酬の25%を加算いたします
プレミアム 優秀サイトには、報酬に応じてボーナス有り> 参加サイトが少ない今が、掲載のチャンス！
> 宣伝方法は、問いませんので是非参加下さい（2ｃｈでの宣伝も可）
http://accessplus.jp/staff/in.cgi?id=2168

質問した後にちょっと調べてみたのですが，
植物にsiRNAを導入してRNAiを起こしている報告がありました．
Klahre et al. (2002) PNAS 99, 11981
植物でもsiRNAは効果があるみたいですね．
siRNAの導入にはパーティクルガンを使ってます．

＞171
植物細胞にsiRNAを導入するとしたら
上記論文のようにパーティクルガンを使うか，
もしくは培養細胞だったらプロトプラスト化して
エレクトロポレーションなどで入れるか
ぐらいしか無いような気がします．

現象としては面白いがmethodとしては・・・

ということで下がってますか？このスレ

最近植物でもウイルスやアグロバクテリウムを用いたRNAiで
遺伝子の機能解析をした論文が増えてきたね。
植物では、今RNAi祭りの最中。

なるほど。
植物では祭りだけど研究人口が小さいから下がるのか・・・

植物系でIFの高い、
PNAS、P.Journal、P.Cellに最近出まくっています。
サイエンスやネイチャーにもちょくちょく植物でのサイレンシングが
でているかな。CNSを注意して読んでいれば、植物でのRNAiを
みかける機会もあるのではないか。

ではなぜこのスレがさがるのでしょうか？

じゃあage

植物やってる人は暇な時間あるんだから
ここで有意義な話をしたらいいとおもふ

禿同

漏れも暇

180 ：名無しゲノムのクローンさん ：02/09/28 03:01
植物やってる人は暇な時間あるんだから

暇な時間ありませんよ。

こんなレベルの低い所でまじめに議論する人もいないと思いますが

そう？

そうかね？

そうです、わたすが・・・

変なおじさんです！

「なんだチミは。」
「なんだチミはってか？」

が抜けてる>>185-186

ナイスアシスト

結局、遺伝子破壊の容易でない生物で用いられる代用ってことよ。

発現系を用いた場合siRNAを発現させるプロモーターは何がいいのですか？

ドン＝キング

>>189
そんなこたあない。
あんた、人生ずいぶん損してるよ。

pSUPERってどうよ?

>>192
sageで書くおまいもな

pSUPERつくってみたぞ．
やっぱベクターにするとでかいからか、トランスフェクション効率悪い．

そゆときはstable取るんだよ。>195
loxPかなんかつけて切り出せるようにするとさらにGood。

stableは、細胞あたりのプラスミド数が減って完全に効かない可能性もある
と思うけど、どう？Over expressionのstableでも発現あんまり高くないと思
うけど。

まーおまえらみたいなカスどもはメソッド確立してからやりな犀ってこった

カスじゃないやつはどうしたらいいの？ぶさいく君（藁

200ゲト

199よりはマシな顔だと思われ

>>194>>198>>199>>201
先生！このつっこみの笑いどころがわかりません！

あのー。
魚でRNAiはできますの？

とりあえずやってみたらどうでしょう。
そもそも漏れは魚でトランスフェクションしたことないんでわからんス。

RNAi試したら逆にウエスタンのバンドが増えました　鬱

つまり、お前みたいな奴は手を出すなってこった。

大発見かもよ。

＞２０７
ようわかっとるな

細胞周期の研究にはsiRNAは非常に旨く機能するぞ

とりあえず分性のワークショップでも聞けや

リンクはれや

ゼブラでRNAiやってるやついるけど。
奴はそんなにえれーのか？

ゼブラはモルフォリノ？

そうだけど？

RNAi=らちがなかなかあかない・・いつものことさ（俺達DQNs!）

保全age

pSUPERほんまにきくんかい？
普通のRNAiよりも？
トランスフェクション高率はしょうがないとして。
おせーてー、おせーてー、おねがーい。

>217
transientとstableで違いを問われても困るがな。
あと、系の組み方、標的遺伝子によってどっちが良いかは異なる。
もうちょっと勉強しなされ。

ｐＳＵＰＥＲは安い。これは大きな利点だな。
標的遺伝子は見事に消えたけど、ノンスペまで消えてしまった。なんじゃこりゃ。
ウェスタンそのものはちゃんとうまくいっているんだが。

＞２１８、２１９
レス、感謝しまふ。

２１８様
いえ、transientとstableの違いはよく存じてます。
が。。。確かに比較は難しいですね。
双方が得意とする実験系が違いますよね。

２１９様
確かに、安いし、無限に増やせますね。
標的遺伝子完全に消えたんですか？
どういう系で実験したのでしょうか？
コトランスフェクションですか？
ノンスペというのは、WBのノンスペバンドですか？
ハウスキーピングとか、近縁分子などはいかがでしょうか？
質問ばっかりで申し訳ないです。

あ、そういえば、pSUPERはどこで売ってます？
私はambionのpSilencerしか見つけられませんでした。

TﾛT://www.jbios.co.jp/RNAitop.htm

＞２２２
あ〜りがと〜〜！

>>220
完全に消えました・・・マウスでは致死的な遺伝子なので細胞が死ぬと思っていたのですが
puroの中ですくすく育っています。レトロを使ってます。
何度ウエスタンやっても、ノンスペと思っていたバンドも消えてます。やはり何らかの修飾された
蛋白なのでしょう。それはそれでおもしろいかも、と思っています。

＞２２４
ご丁寧にレスさんきゅー！

ふ〜む。。。完全に消えるのは魅力的ですね。
最初の（オリゴのほうの）RNAiだと、３割まで減ればいい方なのでは？
すばらしい。。。
もちろん、ターゲットと配列にもよるのだろうけど。
なるほど、レトロでTF効率を高めて、
puroでstableにしてるわけですね。。。
しかし、レトロはコンストが大変そうだな〜。

>>225
普通のオリゴは安いから、とにかく出来るだけ多くの配列のものをつくって
色々試して見ると良いと思う。
普通は３パターンといわれているけど、それ以上でもいいのではないか？
元祖のRNAを入れるほうは、金がないと苦しいけどね。

>226
了解っす！
確かに、何種類もチャックできるのはいいですね〜。
ただ。。。プラスミドの場合は、TF効率が低いので、
endogenousの遺伝子発現でチェックするのはしんどいですよね。
２２４さんのようなレトロのコンストをたくさん作るのは
大変そうだし。
ターゲットのcDNAをコトランフェクションしてチェックするのはどうでしょう？
意味ないでしょうか？

>>227
コトランスフェクションでうまくいくかはしらない。でも、レトロに挑戦するほうがいいよ。
誰でも出来るから。一度システムをつくってしまうと後は簡単。
ラボの人たちにも感謝されるよ。

レトロ使うんならちゃんと安全管理してね。
誰かがパクられて実験やりにくくなったりするのは勘弁なのぢゃ。

>>229
ちゃんとしたベクターを使えば安心。
臨床にも使われるくらいだし。

ヒトに感染するから臨床に使われるわけで、だからこそ安全管理には
気を使うべし、といいたいのでは?

プラナリアにRNAiするにはやっぱりpBlueScriptに構築したインバーテッドリピートを大腸菌に入れて
IPTGで発現させた菌体を食わせればいいの？

pSUPERとpSilencerってどっちがいいの？

どっちも

似たようなものだろ。
ＭＣＳの酵素の種類で決めたら？

>234,235
レスさんきゅ！
えっと、プロモータが違うのが気になりました。
U6とH1だったかな。。。確かこんな名前。

>>236
どっちでもいいんじゃないの？

pSHAGどうよ？

いいよ

>>239
どれくらい消えたっすか？

化学と生物掲載age

蛋白質核酸酵素掲載上げ

植物を材料に使ったRNAiでなんかいい論文ある？

>243
PTGS?

アゲ ものにアクリルアミド

243はダメ研究者

>>240
９割

自分で検索できないヤシがRNAiなんて百年はy（以下略

>>247
やっぱ、リコンビナントの発現ベクターと、pSHUGの量比が難しいんです。
どっかの論文には1：30だとか書いてあったけど。

すみませぬ。。。
自分で調べられないのでお聞きしますが、
pSHUGって、どんなベクターですか？
pSUPERとは違うんですか？
「めんどくせ！」って思った方は、
参考にすると良いアドなり教えていただきませんか？

>>250
コールドスプリングラボに聞いてみな
（　´_ゝ`）

>>251
ナイス

うまく効くpSUPER作ったんだけど、
ある細胞では、siRNAは効くのにpSUPERだと
うまく働かない・・。
この細胞ではDicerが発現してないor発現量少ないと思われる・・。

で？対策は？

で、対策は？

>>253

HeLaが一番よいようにいわれているね。

>253
まじでっか？！
どの細胞なら大丈夫なのだしょうか？
NIH3T3とかは？

293Tだろ

T-antigenが入っていることになんか意味があるのですか？
SV40-oriのあるプラスミドがわんさか増えることですか？

今更RNAiやってもなあ・・・
ツールと割り切るなら良いけど、
RNAiメインだとよほどいい結果（原理解明・画期的応用）でないとBBRC・FEBS止まり。

プラスミドのRNAiって、どの細胞に適してるんかねー。
効かない細胞と、効く細胞あるみたいだけど。
情報交換しませう。

>>260
しかしツールと呼ぶほどメソッドが確立していない罠
メーカーがキットを販売し始めて初めてツール

キット出てるじゃんよ。
AmbionとIMGENEX。後者は最悪だけどね。

>>261
ヒーラがいいってのは聞いたよ。あとはU2-OS　H1299　C33A。
誰か293Tでやった人いないっすか？

ageageageageageageageage

仕込み一年 失敗二年 はいあぼーん

>>253 です。
対策として考えてるのはヘアピン型のsiRNAを
発現するんではなく、（細胞内でのアニーリングを期待して）
センス鎖とアンチセンス鎖のsiRNAを別々のポリヌクレオチド鎖として
発現するベクター。これならdicer必要ないでしょう。
すでにこの手のベクターは報告されてはいるものの
他のpSUPERなどのベクターに関する論文と比べて、暫定的に結論すると
抑制効率はpSUPER等より落ちるような気が・・・。
（実験で厳密に比較した訳ではないので、根拠はないですが。）

もうひとつ。
ベクター型よりsiRNAの方が圧倒的にトランスフェクション効率が高いです。
逆に言うと、siRNAを導入する場合よりベクター型の方が圧倒的に
導入効率が下がる場合があるので、ウェスタンする時などは注意が
必要かもしれません。やはりstableとらないならベクター型RNAiは
不利な場合が多いかもしれませんね。

>>267

なぜだろう？ベクター、それもレトロならかなり強く導入されるはずなんだけどな。

＞２６７
確かに、TF効率はベクターの方がかなり低いでしょうね。
（効率と言うのは、「入った細胞の数」ですよね？）
ただ、TFされた細胞あたりの阻害効果はどうなんでしょう？
たとえば、発現ベクターに入れたルシフェラーゼと、
siRNAまたはvector型をコトランスフェクションした場合など。

それと、細胞内でアニーリングさせるタイプのベクターは売っていますか？
（プロモーターがオリゴの両端にあるってこと？）

とにかくpSUPERはstable取れるのが強みだ。
手間はかかるが成功すればBackgroundの少ないデータが再現性良く得られるし、
多重トランスフェクションにも使える。
一方、siRNAはTry and errorにかかる負担が少なく、技術的にも簡便なので
時間と労力の節約になる。

siRNAとpSUPERはそもそも期待する効果が違うと思うのだが、そのへんはどう思うよ。>all
#pSUPERをトランジェントに使うなという意味ではないです。念のため。

>>269
援護ありがとうございます。
そうです。>>267でいうところのトランスフェクション効率とは
全細胞のうち、siRNAが導入される細胞の数（割合）を指しています。

>>269　ただ、TFされた細胞あたりの阻害効果はどうなんでしょう？
私自身これがもっとも知りたいとこなんですけど、手応えとしてはやはり
その抑制効率にクリティカルなのはベクター型であろうとsiRNAであろうとあまり
関係なく、要はどこをターゲットとしているかが一番の問題。
という認識をもっています。（あくまで感覚的な手応えです。）

>>267　やはりstableとらないならベクター型RNAiは不利な場合が多いかもしれませんね。
これに反対意見。（というより例外の指摘？）
ベクター型なら細胞内にベクターが存在する限りsiRNAが転写される、つまり
siRNAが細胞内で供給され続ける事がある程度期待されますが、この点からすると
トランスフェクションしてからの持続時間が単なる合成siRTNAよりもいいかも
しれませんね。

>>270 siRNAとpSUPERはそもそも期待する効果が違うと思うのだが、そのへんはどう思うよ。>all
議論を深めたいとこですね。ここで言う「効果」とはどういう意味ですか？

この重要なスレをあげねば！

>>263
>AmbionとIMGENEX。後者は最悪だけどね。

http://www.imgenex.com/products_genesuppressor.html

A. GeneSuppressor Construction kit (Catalog No. IMG-700)
のほうは NeoR gene nonfunctional のくせにサイズも大きく面倒そうですが、
B. GeneSuppressor Neo Construction kit (Catalog No. IMG-800)
は Neo/Kan vector で 3.4 kb とあり便利そうです。
Ambion のは pBlueScript や pUC の MCS に promoter が挟まっただけみたい
だし、ベクター側をすげ替えたら G418 を入れて飼ってすくすく育つでしょうか。
耐性マーカーとコトラのばあい、各クローンについてヘアピンの転写量をノザンで
チェックしなきゃなりませんか。

http://www.respace.net/resnet/H009

http://health.nikkei.co.jp/news/top/topCh.cfm?id=20021118e3mi01a818
既出？

AUGコドンの位置とtarget sequenceの位置との関係は深いんですか・
AUGコドン直上や直下ではまずいんでしょうか。
Coding中程に設定出来れば一番なんでしょうが
ファミリー多い分子ではなかなか難しく。

今日Helaににトラフェクしてみたっぺよ！！
早く結果でねーかな！！

ｍRNAのあまり前のほうをターゲットにしてもきかないらしいんだけど
なんで？

RNAiの効果の検定って、エンドの抗体ないとできないよね？
mRNAの発現調べても意味ないんかねー。

mRNAも減ります。

(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)
(´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`) (´Д`)

＞２８０
けど、蛋白みたいに結構減るもんなの？
mRNAであんまり減ってなくても、
蛋白では結構減ってる事ってありそうだけど。

君はRNAiの原理を勉強したほうがいいよ。

今日、ｐＳＵＰＥＲの作者の口演聞いてきた。
レトロより、そうじゃないやつのほうが効果が高そうなんだと。

＞２８３
え？けど、なんかの論文のデータもそうなってたと思うけど。。。
それに、理屈も合うのでは？
mRNAはまさに分解されているものだけど、
（分解の最中のものも含まれる）
タンパクは、その後にできてくるので、
必然的にmRNAよりも少なくなると思うけど。
妄想かな？

＞２８４
そうじゃないやつって、例えばなんでしょう？
普通のベクタータイプってこと？

>>285
そうです。普通のマンマリアン発現ベクターです。

ピーシャグ
ｷﾀ━(ﾟ∀ﾟ)━( ﾟ∀)━( 　ﾟ)━(　　)━(　　)━(ﾟ 　)━(∀ﾟ )━(ﾟ∀ﾟ)━!!!!!

pSHAG
http://sizeof-web.hp.infoseek.co.jp/favorite102.html

だめだ。。。ｐＳＵＰＥＲ全然消えません。

>289
！
当方、ちょうどｺﾝｽﾄﾗｸﾄこさえたとこだよ。
どういうｼﾞｹｰﾝしたのか詳細求む！！

>>290
レトロのｐＳＵＰＥＲでpuroセレクションしてるんだけど、全く消えません。
今まで8個くらいの遺伝子を試しましたが、消えません。
やっぱりレトロはだめなのかな？

＞２９１
ちゃんと自殺型のベクター使ってる？

>>292
なにそれ？

ホヤではモルフォリノ　ガンガンです

＞２９４
うらやましいが、限られたヒトにしか。。。

＞２９１
なんてこった！細胞種は？

>>295
U2OS
HeLaでも試してみます。

ぼくはU２OSでｷﾀ━(ﾟ∀ﾟ)━!!!!!でした

S化オリゴとかPNAってどうなったんでしょうか

モルフォリノにとってかわられた？

300

みなさん、RNAiの効きはウェスタンでチェックしてまつか？
抗体ないものはどうしたらいいでつか？

>300
抗体作るか、タグつきstable先に取れ。
つーか、検出もできんタンパクをどうやって研究してんのよ(w

>301
抗体作るにも時間がかかるし、当然良い抗体ができる保証もない。
タグ付きコンスト作って、それでチェックしても、
ほんとにエンドのものが消えてる保証はないので困っているのでは？
エンドを検出できないタンパクなんてたくさんあるでしょ。

>>300
なにかフェノタイプの変化で見るのが良いと思う。
その蛋白の下流にあるなにかをチェックして、それに予想されるような変化があれば
思い切って抗体をつくるのがよい

>302
検出できないタンパクやってんなら何らかの方法でモノを押さえるのが
先決じゃないかと、そう言いたいわけですよ。
普通はRNAiだのなんだの言う前にそっちが先じゃないのかと。
確かにタグつけて消えてもエンドが消えてる保証はないが、消えないようなら
エンドにも効いてない可能性は高いしね。
ちなみにtransientでも減少傾向のチェックくらいはできます。
300の文面を見る限り、それすらやってないと見受けられます。

303の言う通り表現型で見れるのならそれでもいいが、経路がわかっているもの
でさえそれが本当にそのモノによるものなのか検証する必要はあるはず。
活性が見れるのならそれでも良いが、論文にするならRNAiのデータ一本では
弱いと思うのでやっぱり抗体はあった方が良いんじゃないかな。
例えば手持ちの抗体で落とせるタンパクに結合するとかわかっているなら
それで拾って活性で追う手もあるね。

>301
あなたの場合は、タグ付きでやってますか？
それともエンドの抗体？

フェノタイプや活性でみるのも確かに良い手ですね。
ただ、やはり間接的ですよね。
RNAiが「効いてそうかどうかの判定」には良いけど、
最終的には、抗体つくって消えてるのを見せるのが理想か。。。
もちろん、抗体作る価値のあることが分かってからだと思うけど。

>305
うちはタグとエンドと両方使ってます。
まあ、市販してる奴なんで手間かけずにうまく行ったケースです。

Phenotypeだけで見てると経路のどこに効いてるのか押さえなきゃならんので、
結局手間が増える例は多いんじゃないかなと思います。
逆に最初から抗体使ってタンパク側から追って来たものを検証する意味では
やらなきゃならないですけどね。
抗体あると細胞内局在見たりするのが楽なんで、予算さえ許せば持ってて損はないですよね。

タグで見て、ていうのは、タグ付きコンストラクトとの transient のコトラで
よいのでしょうか。
それとも >>301 さんの言うようにまず stable を取らないとだめ？
かなり弱めのプロモーターを持つ発現ベクターに組みなおすとか、コトラの量比を
検討するとかの必要があるのでしょうか。
下記のレスはそういうこと？うまく行った例があれば知りたいです。

249 ：名無しゲノムのクローンさん ：02/11/02 13:06
>>247
やっぱ、リコンビナントの発現ベクターと、pSHUGの量比が難しいんです。
どっかの論文には1：30だとか書いてあったけど。

>307
transientでも消える、または減る場合もあります。
stableは、それで減少傾向見た上で取る手もアリでしょう。

301, 307
レスありがとうございます。
ターゲット配列のスクリーニング程度には tarnsient でも十分使用できそうでしょうか。
タグ付きのものの発現が少な目のあたりでやってみます。

でもRNAiを論文にするのは難しそうなのれす。
操作自体はくそ簡単で独自性だせないのれす。
stableとるのはとてもインチキくさいのれす。
わたしはもう撤退したいと思っているのれす。
でもボスは特許・ベンチャーとうるさいれす。
もっとクリエイティブな仕事がしたいのれす。
でも研究費の申請内容がRNAiばかりなのれす。

★電話料金を請求しない優良なサイトのみをご紹介しています★
◆http://yahooo.s2.x-beat.com/linkvp/linkvp.html◆

>310
体羅研？？？

>310
あー、かすみ遊戯れすか?　それともランス4.1?(w

うちのボスもウェスたんﾊｧﾊｧばっかでちっとも独創性なかったんですが、
上手く立ちまわればソレだけでScienceに載ることもあります。
RNAiも使いよう、要は妄想~h~h発想ですヨ。

今までｐSUPERやってみたけど、結局細胞によるところが大きいと思う。
たとえばある遺伝子があって、その遺伝子のAという配列とBという配列のｐSUPER
があったとしても、
AならHeLaでうまくいき、U2OSならだめ
BならU2OSでうまくいき、HeLaならだめ
というふうに細胞依存性がつよい。

対策としては、金が無いのなら多くの細胞（２９３や皮下ファイブロブラストなど）
を用意しておいて、全ての細胞でやってみる。
金があるのなら、一つの遺伝子に対して１０〜１５個の配列を作って
全てためしてみる。

というしかないな。
致死的な遺伝子の場合は、完全にNullになることはありえない。その遺伝子の
下流のフェノタイプを調べたいのなら、残ったわずかの蛋白がどの程度作用するのか、
というのも重要だと思う。

人は石垣！

下流のフェノタイプを調べたいのに
減ったかどうかフェノタイプで探せと言われたりする

生化でもsiRNAがらみのポスターやセッションは関心が集まったようですが、
分子生物ではどんな感じでしょうか？

>317
http://wwwsoc.nii.ac.jp/mbsj/
自分で見れ。

トランスジェニックでヘアピン型のコンストラクトを導入したはずが、ゲノムには入ってなくて、それにも関わらずRNAiのかかってるマウスの話を聞かされてなんとも思わんのか世話人は。

>319
c elegansの系で既に示唆されてることじゃないのか?
もっと論文読め。
つーか、世話人って誰よ(w

>317
B-bridgeのランチョンセミナーが良かったね。
効果的なRNAiデザインがあるそう。
但し、肝心な部分はすべて秘密だったけど。

>321
siRNAﾃﾞｻﾞｲﾝ、来年にwebで無料公開らしいですね。

ambionの設計はだめぽ。

>>322
もうちょっと、詳しくおねがいできますか？

>>322
>>323
より効果的なRNAiデザインの為に
彼らが見出した法則（criteria）を
来年３月にWeb上で使えるようにするって言ってたけど、
「無料」とは言ってなかったような…。

Web上で公開と言えば無料のような気もするが
ベンチャー企業が無料で公開するとも思えないし、
英語に堪能な方であのセミナーに参加してた神の降臨ｷﾎﾞﾝﾇ。

RNAiが実際に機能しているかどうかをチェックするのに
siRNAを探しているんですが、じぇんじぇん見つかりません。
mammal系でのsiRNAの存在って、まだ確認されてないんでしょーか

>325
ﾊｧ?

>>324

minimum only. GC-content and length of siRNA oligos or other obvious
ones.

厨房の質問に答えてください。
・RNAiのステーブルはインチキくさいのはんぜですか？　>310
・RNAiが将来薬剤として注目されているとかどこかで読んだのですが、
　siRNAを飲み込んだら発現とまるの？それとも標的組織にエレクトロポレーション？
(((( ；ﾟДﾟ)))ｶﾞｸｶﾞｸﾌﾞﾙﾌﾞﾙ

>324
B橋の営業さんが。。。うちとしては有料にしたいのだけど
製造元が無料を主張している。と言っていたような罠？
結局はずしてしまったら保証問題になるのが厭なのでは・・・。

ソフトほしい？

>328
わたしゃ310ではないが。
薬剤として注目されていると書かないと製薬会社から研究費が出ないと思われ(w
そして本当に開発の目処が立っていたらこんなところでバラせないよ。
守秘がらみで合成オリゴすら外に発注できない世界なんだから。

たしかにたしかに

329は罠の使い方を間違ってる罠

＞３２８　RNAiのステーブルはインチキくさい

ネガコンベクターだけ導入しても細胞クローン間で
遺伝子の発現量とか違いそうな気がする。

siRNA発現ベクター導入して複数クローン取ったとする。
ターゲット発現量が変わらないのと減ったのがあれば減ったの採用したいよね？

細胞の増殖などに影響する遺伝子をターゲットにすると、
どうしても薬剤耐性以外の選択がかかりそう。

>>333
そうなんだよ。俺も苦労している。
薬剤で選択直後にウェスタンしたら、目的蛋白が消えていたので喜んでたら
1週間後には元に戻っていた。
細胞の増殖に関わったり、致死的な遺伝子だとＲＮＡｉがよく効いているクローンは
どうしても不利なわけで、結局そうでないクローンのみが生き残こると思っている。

そう考えると、ｐＳＵＰＥＲの良いところは、オリゴ合成だけで廉価にＲＮＡｉができる
ということだけか？
致死的でない遺伝子の場合はステイブルになるのだろうが、永遠にとはいえないと思う。

conditional に polymerase などを発現させることで
inducible system を作れないかと考えるわけだが

むしろ、他の重要な遺伝子も一緒に減ってないか調べるのが大変。
実際、減ってたことあったし。

>332
ｺﾞﾒｿ。。。

oligoのdesign softは、ambionのとOligoengineのを比べると、どちらがbetter?

「オレのラボではこのソフト！」ってのを情報交換しませう。

設計方法ならambiom最強！

方法じゃなくて、効くのを設計できるのはどっちなの？

アルゴリズムが公開されていないんだから、わからんでしょ。

pSHAGって、pSUPERとおんなじだよね。要するに。

田非裸先生のラボやベンチャーはRNAiに関してレベル高いの？
なんか分生はムリムリ発表してるような気がした・・といってみるテスト

age

配列だけで設計できないできないと思う罠・・・
ゆえにambionだめぽ。

>346
>324

B-Bridgeのセミナーのでーたがほんとなら、RNAi効果はターゲット配列依存性だそうだ。
400本のsiRNAをためしたDharmaconはすごい。

ちなみに、セミナーでは来年の春にCriteriaの一部(2〜3コ)を含んだデモ版をWebで公開するといっていたが､
スピーカーの話では合計29個のCriteriaがあるそうなので、結局効く配列の選択にはお金がいると言う事だろうね｡

Dhamaconケツケチせんと、はよ公開してほしいね。

つーか、400ッ本っていくらかけてんだよ、siRNAに

結構、一塩基ずれただけでも、効果に差が出ることもあるよ。
でも、田胃羅先生の話だと、リボザイムよりはヒット率は高いらすぃ。

ＲＮＡの遺伝子制御がトップ＝今年の１０大研究−米科学誌

米科学誌サイエンスは２０日号で、２００２年の研究成果のベスト１０を発表し、
遺伝物質の低分子ＲＮＡ（リボ核酸）が遺伝子の多くの働きを制御していることの
発見をトップに挙げた。この発見により、がん細胞が遺伝子の誤った働きによって
できる原因や幹細胞が分化する謎の解明が進むと期待されるという。
（時事通信）
[12月20日6時5分更新]

AmbionのpSilencer1.0って。。
古いカタログだとMCSにBamHIが書いてあるが、、
U6 promoterの配列中にBamHIサイトがあります。注意せよ。
つーか、単純な作りだよね、pSilencer1.0。誰にでも作れる。

2.0-U6, 3.0-H1 は確かサブクローニングサイトの前側が BamHI を使うことになっていますよね。
3種類揃えるとは限らないだろうけど、同じサイトで組めるようになっていたらよかったのに。

>334
結局他の細胞がコンタミしてたってこと？
致死でなければ、増殖が遅くても取れるんじゃないのステーブル。
また、致死になるような遺伝子の場合でも、RNAiの効果の弱いクローンが取れ
れば、表現系の解析はできるんじゃないの？

コントロールのことで質問なんですが、ステーブル作った人、どんなコントロ
ールを作りましたか？他の蛋白質の発現も下げていないことを証明するのは、
難しいですよね。実際論文に投稿した人、なんかそのあたりでクレームついた
りしました？

>>354
コンタミというか、puroでセレクションした細胞だからすべての細胞にＲＮＡｉは効いているはず。
でも、クローンによって効果が大きいものから少ないものまであり、しばらく飼っているうちに
効果が少ないクローンが大勢を占めるのではないか、と思っている。

細胞が一個一個別れるように薄く播いて、薬剤で選択。その結果できてくる
コロニーは一つの細胞からできている（コンタミしてるものもあるかも）と
考えられると思うんだけど。ステーブルクローンって取ったことある？
ベクターにピューロマイシン耐性が入ってるなら、ピューロマイシンの量増
やせば、プラスミドが沢山入ったクローンがとれるんじゃないの？
大学院生だったら、先生か先輩に聞いたほうがいいよ。まあ、どうでもいいけ
ど。

> 356
いや、遺伝子がゲノムに挿入されてある程度の期間は外来遺伝子の転写が行われていたのにも関わらず、継代を重ねると転写量が減少する株が存在すると言うのは安定発現株作製をしたことある人なら分かるはず。だから安定発現株のスクリーニングは「数」が必要。
減弱した転写を薬剤でreactivation させる方法もあるけど、この薬剤が何かしでかすかもしれないしね。

>>357

そのとおりです。ところで、reactivationなんてはじめて聞いたけどどうやってやるの？

http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9159154&dopt=Abstract

>>359
素晴らしい。実は同じようなことをやってみたことがあるんですが、うまくいっていませんでした。
どうもありがとう。

＞３５９
エピゲネ効果は制御不能。細胞ががん化しやすい。

２プロモーターシステムはプロモーター干渉もやっかい。
それにsiRNA高発現株がRNAi効果高いわけでもないという罠。

ヘアピン発現ベクターつかってる人はちゃんとドイツの
論文熟読した方がいいよ。pSilencerとか信頼できん。

>>350
リボ財務ごときと比べられてもねえ…
利き方が段違いだよ。比較にもならん。

KOつくれよ

どっかのスレにも書いてあったな・・KO最強って。

バイオインフォスレだろｗ

>>363
致死的遺伝子ならつくれない

Technical Knock-out の系は何がお勧めでしょうか？
スレとあんま関係ないけどさ。

>>347
B-bridgeの話ではsiRNAの発現抑制効率に関するファクターとして
想定できうるクライテリアが合計29個あるとは言ってましたが、
そのうち、実際に400本のサンプルから出たデータを統計的に解析すると
有意であると考えられたクライテリアは「７つ」だと言ってたと思いますよ？

>>366
RNAiでも同じじゃん！

>>369
いや、たぶんembryonic rethal（つづりあってる？）
のことをいってるのでしょう。

>>370
そうか・・・ｽﾏｿ

>>351
ｲｲ話やね

>>370
間違ってるぞ

綴りが？

>>374
Yes.

RNAiブームは今年も続くのかなあ？

ラフな格好で店に入ってくる研究者のアソコに
一発ケリを入れるキャバ嬢(RNAi)

Nはどこよ？w

なでしこ（店名）

ラストオーサーを手に入れるために
仲間を裏切ったあいつに一矢報いた2002年（RNAi）

ラストオーサーを手に入れるため
仲間に毒をもったあいつにいちぢく浣腸（RNAi）

◆◇◆◇◆最新情報◆◇◆◇◆
http://yahooo.s2.x-beat.com/linkvp/linkvp.html

一年前から最新情報

ライバルをけ落とすため何でもアリの
陰湿な攻撃を続けるポスドク（RNAi）

ガイシュツスマソ
ニュー速＋(プラスの方です)で
【医療】全ての型のインフルエンザウイルスに効く物質の合成に成功、ワクチン開発に道―静岡県立大など

ってスレ立ってます。お手数ですが出張説明キボンヌ。
まじノ−ベル賞ものなんすかこれ?

出張ありがとうございました−−−−−−−逃

>>376
続いてるみたいだYO

その年のうちに >>351 のように扱われる以上、選んだ側にしても来年以降寂れる手法などとは思ってないのでは。

これが気になって・・・ヘアピン系はだめってこと？

> ヘアピン発現ベクターつかってる人はちゃんとドイツの
> 論文熟読した方がいいよ。pSilencerとか信頼できん。

ドイツの論文てのがわからない。Tuschl T [AU] でしょうか？

あと↑の方の　＆＃8722;　て何て表示されてるんでしょう。

>>391
逝ってよし！だよ

来週、年度末評価であぼーんされて一文無しになるポスドク（RNAi）

こっちもPCRスレみたくなりそうだな

あっちのスレにパンダ料理とか書いた身で言うのも何だけれど、こちらはネタでスレッドを埋めないで欲しい。
あっちは厨房スレッドだし、途中でマジレスもしてる訳で（下げてるけど）・・・

生物板では珍しく固定ハンドルの、マーキュリーストア ◆Cd0K8qiH8I さんの再登場を願って。

再登場の折には、>>292 あたりの自殺型ベクターというものについてもご説明いただければ・・・
ヒントは出しても答えは教えないという主義の方でしょうか？

灯台院生のほうが博学だよ。

>>361
タンパク質を発現させて機能を見るには使われているよね。
siRNAでは問題あるかもしれないが(特に内在性のknock down するなら)。
siRNAの転写量とknock down 効率の相関についてはわからん。
Promoter干渉の問題はおっしゃるとおり。
でも(どこまで信頼できるか知らないが)論文は出てるよね。

400

それでは灯台院生さんにも期待。

何者なの？見かけないけど＞灯台院生

新領域のヒマしてる院生でないの？＞灯台院生

この間ニュース速報で脱いでたけど？灯台院生

メスなの？

マジで真中瞳に似てたよ！ﾊｧﾊｧ

ところでベクター型を使って論文になったのってあるの？
もちろんRNAiできますよっての以外で

おまえらtoolとしてのRNAiばっかり語ってるな。
せっかくこんな面白い制御機構が最近まで発見されずに
残ってたんだから、もっとバイオロジカルなこと語れば良いのに。

>>408
是非語って下さい。
そう言う話、聞きたいです。

ロシア対日本！明日インドネシアで対戦！（RNAi）

>410　
破滅に向かうスレッドで待っています。
>408　
タンパクをコードせず miRNA というものとして働く遺伝子があると聞きました。
これらは生体内では polII によって転写されるんでしょうか？
原著論文とかぜんぜん探してません。お勧めのがあったら教えてください。

let7

あー、なんかRNAiに匹敵するような現象未発見でのこってないかねー

DNAi

pSUPER全然駄目。
これって、ほとんど詐欺状態なのでは？
何でも良いから「俺はうまくいった」という人いたら教えて。

うちはうまくいってるよ。>pSUPER
まだ論文になってないので詳細は明かせないが。

配列変えて試してみたかい?
まあ、RNAi関連は上手く行く遺伝子と行かない遺伝子があるんで、
ダメなものはどう頑張ってもダメだと作者が言ってた気がするが(w

>414
糖鎖iだな。
で、pSUGERとか作るわけよ。

>417
読みは「ｽｹﾞｰ」でよろ。

>417　(・∀・)イイ!!
ペプチドの折畳みや修飾のquality control機構へ、ある選択分子をむりやり送り込むような手法ほんとにできないですかね。
vicious chaperonみたいなの。

>416
どのくらいでヒットがでまつか？

>>415
教えてと言う前に、
まず、自分のうまくいかなかった実験条件を詳しくいって下さい。

>>514
配列のGC含量とかも考えた？

siRNAの一部はRNAプライマーとして働きRNAdependent RNA polyでdsRNAが出来て
それが Dicerでまた切断されてRNAiの作用をもつってなこと聞いた気がするんだ
けどまじでつか？

常識です

chain reactionですね。

>>412
船中屋さんですか？なにでやってます？食べさせてる？漬けてる？

>>422
オリゴエンジンのソフトでやってるよ。配列は5ペアぐらい試したかな？
細胞はＨｅＬaやらU2OSやら。
少なくともステイブルにはならないな。

>427
ならその「遺伝子」が適してなかったってことではないかと。
トランジェントには見えたのかな?

>>426
let-7くらい戦中やじゃなくてもだれでもしってるだろ。

>427
五ペアもやってダメだったの？！

（＾＾）

>>430
>>428
そう。やっぱりだめなのかな？

◆◇◆◇◆最新情報◆◇◆◇◆
http://yahooo.s2.x-beat.com/linkvp/linkvp.html

>432
もう少し、詳しく聞いてもいいでつか？
実験系は、トランジェント？ステイブル？

トランジェントではみえたけど、ステイブルにすると見えなくなったとか？

>>434
pSUPERのレトロです。ウィルスをかけた後、時間を追って細胞を採取し、ｐｕｒｏマイシンで選択後の細胞と
あわせてウェスタン。かすかにシグナルが弱いような気もしますが、とてもきいているとは思えないレベルです。

>>429
いや、rdeXなんて名前だったから。ほ乳類にもあるんですか？

さっさとやめなさい。RNAiなんて。

さっさとやめなさい。RNAiなんて。

>>425
423ですが、Chain reaction が起こった場合ってターゲットの中に他の
メッセンジャーとの相同性が高い配列があったら余計なものまでsuppress
しちゃいますかね？

Chain reaction がおこるのに
なんでRNAi効果はあまり持続しないのかなあ・・・

>>440
場合によるでしょ
確か植物で、RNAdigestionがおきるにはmiRNAはかなり相同性がないと
だめだってこの前Scienceにのってたよ。
PTGSはそう厳密ではないみたいだけど、場合によるだろ

>>441
だからChain Reactionがおきるのも一部の場合だし、
それ以前に内生的なものと無理やりコンストラクト突っ込んだ場合はちがうだろ

要するにRNAiといってる
現象の多くは保証がないということか・・・
PTGSなんてどのレベルでもおこりうるからなあ・・

キリ番ゲター参上！

>>443
まあexoな実験系なんてそんなもんだろ。
endoなものはちゃんとcontrolされてるとおもうけどね

endoでも、条件がいい加減だと生理的条件を反映しないことも多い。
同じ培養細胞で同じ実験しても、いい加減な奴のデータは怪しい。

RNAiベクターが動くmammalの細胞として HeLa, U2OS などが上がっていますが、
逆に動かなかった細胞はどうですか？
U6 promoter と 293 の組合せに一票投じたいのですが。

deicerとcotransfectionしたら良い

>448 ref.ありましたらよろしくお願いします・・・
ものは2000aaぐらいでしたけ？誰かくれるんでしょうか。

.448
そんなこと、みんなやってるの？

なぜmicroRNAの作用が
　　RNA-dependant DNA methylationとか
　　RNA cleavarageとか
　　translationの妨害
とか、いくつかのpathwayに別れてるかわからん。
ひとつでいいじゃねえか。

RNAi is a magic.

RNAiを介したHIVの抑制実験って結構やられてるんだけどなんで
レトロウイルスに対してRNAiが有効な手段となるんですかね？

＞４５１
ようするにそういう経路はいろんな刺激で影響受けやすいって事だな・・
培養細胞のクローニングとかやってると何見てるんだかわからなくなるよホント

エピゲネは混沌の世界だからなあ・・・

>>442
なるほど、そうですね。ありがとうございます。

microRNAのknock-outって作れるの？
knock-outっていうかloss-of-functionのmutantをreversed geneticsとかで
単離できるの？
今の所見つかってるのは線虫の２つだけだろ？
なんか、少なすぎない？

（＾＾）

↑はsiRNAの作用機序とどこか通じるものがありませんか？

山崎渉とsiRNAの作用機序が・・・Nature級の発見ですヨ。

ところで、vector型RNAiの成功話、聞かせておくれ。

少し落ち着いた方がいいのかなあ

RNAi現象は本当だと思うが、
ちまたに溢れる論文・発表は眉唾も多いのかも？

>>460
A system for stable Expression of short interfering RNAs in Mammalian Cells

Small interfering RNA and gene silencing in transgenic mice and rats

こんなんありますが・・・・でもねえ、U6プロモーターってどうよ。H1に一票

なあお前ら、なんでどこのスレでも人とかマウスとかラットとか、
ほ乳類使ってる前提で書き込んでんだ？
ああ？ゴルァ！

はやりですから。
それに、ハエや線虫はテクニックとしては確立してるから。
植物はしらないけど。

基本的にpolIII転写される系を使うべし。

>465
哺乳動物細胞用ベクター（言われたそばからすみません…）のことでしょうか。
U6もH1もpolIII type3 promoterだと見た気がするのですが、違うpromoterでsiRNAベクターに使われることもあるんでしょうか。

>460
pSilencer（U6の方）、HeLaでとりあえず下がった。
Ambionさまのいうとおり適当にデザインして、4クロンのうち一個当たり。
タグ付きコトラ1:30で下げたものは、detectできるものはendoも下げている。
そこで、タグ付きコトラで下げたのにendoで効かない確定例があればぜひ知りたい。
いくつか試しているうち、endoの抗体がないか検出が難しいものがあるので・・・

>467
１：３０でタグ付きはどのくらい落ちたの？
っていうか、そんなにすくなくて、タグタンパクWBで見れた？
エンドも結構下がりましたか？

>>463お、仲間。多数派は気にとめないもんだ。

昆虫やってたときも普通にmammalのプロモーター使ってたからなあ・・・。

>468
すみません 1:20。
でも出ている論文では1:20〜1:30あたりが使われているようなので、1:30でも可能だと思う。
CMV promoter のベクターで、1:20でもかなり発現している。
時間は72〜96h。コトラでは見た目２桁ぐらいは抑えている。
endoに対しては半分以下という程度だけれど、トランスフェクション効率の問題もあると思う。
HeLaだとRoche FuGeneあたりでなんとか高効率になる。

レスありがとう>471
私も同様に、抗体のないものを、コトラでチェックして、
それでオッケーなら、エンドを確認せずに、
使用できればと考えています。
（ただし、フェノタイプが分かっているので、
それでエンドの効き具合を判定できると思っています）
ベクター型の場合、普通のトランスフェクションでは、
効率に限界あるので難しいのでは？
ステイブルにするかウィルスを使うかしないと。。
（しかし、これらの問題点はこのスレで何度も指摘されてるけど）
もしくは、入った細胞だけ判別、選択できれば良いと思うのですが。

>>471
HeLaってFugene6でホントに効率いいか！？
何割くらい？

細胞染色なら、10:1ぐらいのfluorescent proteinとかとコトラしようと思っています。
セルソーターでも使えるかな？
stable selectionも一応やっておこうとは思います。
controlはscramble配列のが要求されるでしょうか？

>>473
20-30%くらいじゃない？

>475
２０ー３０％なら、siRNAで半分に減るのはなぜ？！

20〜30%というのは、マーカー遺伝子をトランスフェクションして強発現した細胞をカウントした
ような場合での数字では。
普通の発現ベクターでも、少なめの発現レベルの細胞まで数えるともっと入っていると思う。
（EGFPを発現させてFACSにかけた場合など）

RNAiベクターでも、細胞ごとに遺伝子導入効率が異なり、suppessionの効率もそれに応じて
異なっていたりするんだろうか。

>477
siRNAベクターは少ない量でも、結構ききそうに思うんだが妄想だろうか？

なんか上の方にも出ていた、siRNAの細胞内での増幅とかいうやつ？
polIIIのプロモーターで作られ続けるわけでもあるし。

pSUPERってふえにくくねー？

pSUPERのコンストでシークエンスできないのあるんだけど、みなさんどうしてる？たぶん、DNAの立体構造のせいだと思うんだけど。

ヘアピン構造とるんだから難読で当たり前。
PCRの条件を変えるなどすれば読める。
PCR後もDNAがハイブリダイズしないように工夫すべし。

自分も今組んでいる最中。
T7 promo. primer でantisense鎖から読んでいるけれど、
HindIII site（組むのに使った）を越えたしばらく後から
急激に波形が消えるやつがある。
何クローンか読んで読めているのもあってそちらをscale upに
持っていっており、今のところ致命的ではない。
19mer overlapが反応に悪さしそうな気は確かにするのだが。

>>481、>>483
漏れだけじゃなかったのね。ほっ。
マニュアル駄目院生の漏れは、原因が分からずうろたえていました。。。
Ｔ３で読んだ方が、少しましでしたね。

高次構造が想定される場合は順当には高温泳動で読むのだが、それでどうだ。
昔はSequenase使ってたからそもそも反応が行ってないことが多かったが、
PCR使うなら割とイケるのではないか。
もちろん、もっと高温域にプライマーを設定すればさらに良くなるのだろう。
#今の人はRI使わんから高温泳動言ってもわからんかなあ。

しかしそういうプラスミドは菌内でリコンビネーション起こして
おかしくならんのだろうか。
使ってる人はちょっと注意した方が良くない?

ズバリ分かりません ＞高温泳動
キャピラリーシークエンサーでも設定できますか？

げ、俺もシークエンスできない＝インサートがうまくいってないと思って捨てちゃったよ。

>485
リコンビネーションは気になっていました。
具体的に、どのような事態が起こると考えられますか？

loop部分ごっそり抜けたりするんだろうか。

ひょっとしたら、PCRもかからないのかな？＞ループになったプラスミド

ループてのは、この手のベクター型siRNAにおいて
(sense 19nt)-(loop 9nt)-(antisense 19nt)という部分があって、
(loop 9nt)の部分で折り返して(sense 19nt)と(antisense 19nt)が
相補鎖としてアニールすることです。

>485
リコンビネーションって、どこと何が組変わるのですか？

そんなこと、ここでは教えらんないよ(ﾎﾟｯ

センス鎖とアンチセンス鎖が入れ替わって逆になりまつ。

すまん。pSUPERで T7 から読めるのはsense鎖（？）だ。
H1プロモーターの反対側から読んでくれるのが T3 で、確かにこちらから読む方がよさそう。
どこかで調べた T3+ という配列のプライマーで、denaturation 98℃とかで読んでみようと思っている。

そう。読めない配列があっても、
何故かたまに読めてるクローンがある。
あれは一体なんなんだ

>>496
謎。運が良いと読める。
インサートの確認は、制限酵素で切って、
電気泳動でﾘﾆｱﾗｲｽﾞされるか見るのがてっとりばやいと思う。

Pol?｡ってプロモーターサイトの真下から転写が始まるんですよね？
したらサーキュラーのベクター切って制限酵素サイトにinsertいれる
ときは片側だけブラントにしてから入れるんですか？じゃないと制限
酵素サイトも一部も転写されそうなんですが？

詳しい人にぜひそのあたりを聞きたい。

pSUPER, pSilencerなどのベクターでは、BamHIなどの配列中のGに転写開始位置が
合わせてあり、その後CCCCなる配列に続いて標的の配列が始まる、という感じに
なっているのかと思っていたのだが。

それともCCCCの後が転写開始点なんだろうか。

>498, 499
今頃そんなことに気づいたのか？
pSUPER, pSilencerなんて信用できないといってるじゃん。
末端が合わないshRNAなんて効くとは思えん。
polIIIの勉強し直してベクターは自作しなさい！！

シクシク(；Ａ⊂)理系目指したけど・・・
やっぱ無理かな…話がさっぱりだ…
生物と化学と数学は90取っても無理か？

>>397 あたりで再登場を期待していた者です。ありがとうございます。
Tuschl の review に引いてあったものとかを見てみたのですが、やっぱり polIII よくわかりません。
しかし、結局迷いながらもベクター型で説明書の真似をして組んでみたら、効くやつがいくつかできてしまって。
オリゴで探したときは見つからなかったのに。
同じ配列がオリゴで効くか試そうとしているところです。

>499
たしかマニュアルにはCCCCの後が転写開始点になってたと思うんだけど。。。

>500
信用できないって。。。
効いてるヒトもいるのに？
末端が合わないと効かないってどういうことでしょうか？

>502
オリゴで探したときと、ベクター型で探したときの配列は違うってことでしょうか？
ちなみに、使用したベクターはpSilencerでつか？

pol?｡プロモーターはshRNAの最後にTTTTのオーバーハングつけるってことは
ターゲットはAAAAで始まる部分にするほうがいいってこと？それとも何かし
らの酵素でオーバーハングは切り落とされるのかや？？
ちなみにターゲットにはAAAAがないんだがこれはもうやってられないってこと。

pSilencerで1:20〜1:30でコトラするときトータルDNA量は
24ウェルプレートでどのくらいいれればいいの？

トランスフェクション試薬のインストラクションに普通に従ってやっています。
ベクター型なので、もちろんオリゴフェクタミンとかではない。

pSilencer新しいの出たね。

オリゴのSiRNAをトランスフェクションするのに何使ってる？
Fugeneが一般的かと思うんだけど、Lipofectamine 2000がいいと
最近やたら宣伝してるんだけど。

ターゲット選択のとき、ｍＲＮＡの２次構造についてどう思いますか？

まだRNAiなんてやってるのか貴様ら？

>510
お前がそう思うなら、やらなければいいだけなので、
いちいちつまんねー事言わないように。

↑ｸｽｸｽｯ

>>510
氏ね

sequenceの話だけどさ、dGTP BIG Dye ver.3かってみたんだけどさ、
310や3100じゃお勧めできないなんて書いてあるじゃねえか。
むかつく。
もうゲル作る気はしないんだけど、だれかキャピラリーで流したことあるやついる？
読めないの？

たまに読めるよ。

310で読んでます。
たまに読めません。
温度上げてみるか。

たまに読めるとかたまに読めないとか、なんだそれ（ｗ
お前ら失敗覚悟でやってんの？
読めないときってどうなるの？
次のサンプルに悪影響及ぼしたりする？

>>517
キャピラリーの話？
シークエンシングキット（BigDye ver.2 など）
機種（ABI310 など）
を書くとよい。

>>518
話の流れからしてdGTP BigDye ver3をキャピラリーで読む話だってわからないのか？

>519
脊髄くんはスルーしる。

>>517
514 の続きだったんだね。失礼。
310 でお勧めできないとかいうのは GC compression についてでないの？
だったら配列を手動で見て行かないといけない程度の問題だと思うけれど。
後のサンプルに悪影響って具体的に心当りあるの？

自分は BigDye ver2 で 2 temp cycle にしてそこそこ読めているけど
（キャピラリー）、この手の配列での dGTP ver3 の使用感はぜひ知りたい。

★あなたのお悩み解決致します！！
●浮気素行調査
彼氏、彼女、妻、夫の浮気を調査致します！！
●盗聴器盗撮機発見
あなたの部屋に誰かが仕掛けているかも！！
●行方調査
行方不明になっている家族の消息を調査致します！！
●電話番号から住所割り出し
一般電話、携帯から住所を割り出し致します！！
●ストーカー対策
社会問題ともなっているストーカーを撃退致します！！
その他人生相談からどんなお悩みでも解決いたします！！
　２４時間受付　　０９０−８５０５−３０８６
ＵＲＬ　　http://www.h5.dion.ne.jp/~grobal/
メール　　[email protected]
　　　グローバル探偵事務局　

213

http://www.funakoshi.co.jp/h_news/0302/030210_GTSi.php
フナコシのこれ使った人居ます？

オレはないけど、ambionでもあるよね。

やっぱり Dicer で切ったものがいいだろうね。予想はあくまでも予想だもんなー。
pSilencer だと Ambion のソフトでつくっても1/3ー1/5だね。効率悪いかもね。もっといい人いますか？

>>524
フナコシニュースのトップのやつね。
買いましたよ。結果は追って報告します。

>>526
Ambionのソフトって何ですか？
ウェブサイトの事？

配列を入れると RNAi に向きそうなところを教えてくれて、設計できるサイトがあるでしょう。Ambion のサイトを見てくださいね。

www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html

これですよ。使われた方の結果はどうよ？私は1/3-1/5 だなー。まーまーと言えばまーまー。不満といえば不満。

>>524

酵素だけ買ったんですか？

Recombinant でつくっちゃおうかと思うのだけれど、ちょっとでかいなー。

私もフナコシ買いました　随時報告します

ambionのソフトって、ほとんど基準なく選んでる事ない？
なんか、AA+19を片っ端から選んでるように思うんだけど。
ヒット数も１００以上出てこない？
使い方間違ってるのかなあ。。。

Dicerで切ったものをpSilencerにクローニングできればいいんだけどね。

>>527です。
>>528,529
ああ、やはりそこの事でしたか。
RNAiに向きそうなところとかではなく単にGC含量が35-55%になるような部分で
AAを探してくれるだけですよね？
それじゃランダムとあまり変わりないんじゃないかなぁ。
RNA polymerase IIIのtermination signalになり得る部分すら排除してくれないし。
なんか配列によっては見落としもあるっぽいし。

あと、GTSのDicerのキットなんですが、Full lengthのdsRNAからDicerで切断したRNAを使うってことは
他の遺伝子の発現まで抑えてしまう危険性が大きいと思うのですが、みなさんどう思います？

まだまだ僕も勉強不足なので新しい文献等の報告よろしくです＞みなさま

533さんへ

本当のところはやってみないと分からないなーというのが正直な感想ですねー。

タンデムに U6 をつなごうかと思っているのですが、やってみられたか手折られますか？ループだと RNA 合成が悪くなるように思うのですが。PCR でさえ増えにくいことがありますよね。

http://www.sinc.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html

ここはどうでしょう?

B-橋、営業のねーちゃん可愛いらしいよ。

↓↓↓↓↓★ピンクエンジェル★↓↓↓↓↓
http://www.pink-angel.jp/betu/linkvp/linkvp.html

> タンデムに U6 をつなごうかと

一つのベクターの中に、ってことでしょうか。

537
そうですよー。ループだと合成量が少ないのでは？と思うのですが。

なんかなおさらシークエンス読みにくそう

>>538
ループ型のほうが効率いいって話ありませんでしたっけ？
RNA polymerase III使ってるわけだし、合成量に関してはループだろうがタンデムだろうがさほど関係なさそうに思うけど。
ただ、タンデムの場合はプロモーターが２つある分合成量が上がるんじゃないかな。
問題は細胞内でうまくdsになってくれるのかどうかって事じゃないすかね。

>>539
タンデム型の方が遙かにシークエンス読みやすいと思うけど？

>>540

転写中に２本鎖構造をとって転写されにくくなるんじゃないかなー。正確に比べたわけではないですが。それがタンデムにつないであれば転写したあとしか２本鎖作らないから合成効率はよいでしょう？

知識のなさを露呈しますが、哺乳類の転写機構って40塩基ほど転写された時点で産物が高次構造をとり得るものなんでしょうか

542：
６０base ほどということですよね？２０base が完全に相補的ですよね。だから構造をとるでしょう？実際にsequencing が難しいから構造をとっていると思いますが。

いや、産物が構造をとってるからシークエンスが難しいわけではありません。

やっぱり、ベクター型って、相当あやしくない？
コトラしたら、トランスフェクション効率自体が激減
（もしくは、細胞が死んで）して、
見かけ上、発現量が減ってるように思うんだけど。。。

>>545
おれもつくづくそう思ってた、だから論文のとかも信用できない。
コントロールのやつも飽和してるし、きっとけっこうづれてるはずかと。

>>546
ああ。。。やっぱりですか。
なんで、みんな疑問に思わないのかな？
論文の見るといかにもうまくいってるように見えるからかな。
オレが思うに、コトラでチェックするにしても、
「遺伝子Aベクターと、遺伝子Bベクターと、Aに対するsiRNAベクター」
の組み合わせでトランスフェクションして、
Bが変化せずに、Aのみが減る事を示さないと意味ないのではないだろうか。
そうすれば、トランスフェクション効率や細胞死のサイドエフェクトの
可能性を除外できると思う。
この方法でチェックしたヒトいる？

何か関係ないたんぱく質の発現をチェックすればいいのではないでしょうか？
不安を上げればきりがない、でもそれでは解決につながらない。ココまで投資してやめるやめないは自由だけれど、金と時間がもったいないでしょう？
Gene Silencing の研究をして研究者がSilencingを起こしたら変でしょう？実験で証明するしかないのだから。

>>548
同じような疑問を持っている人は多いよ。
でも、今現在はそれで論文が出せるのだから、とにかくデータを出そうと必死になってる状態だろ。
後に否定されても、それは自分の責任ではないからね。

＜血液型A型の一般的な特徴＞（見せかけのもっともらしさ（偽善）に騙されるな！！）
●とにかく気が小さい(神経質、臆病、二言目には「世間」(「世間」と言っても、同じＡ型を中心とした一部の人間の動向に過ぎないのだが・・・）、了見が狭い）
●他人に異常に干渉し、しかも好戦的でファイト満々（キモイ、自己中心、硬直的でデリカシーがない）
●妙に気位が高く、自分が馬鹿にされると怒るくせに平気で他人を馬鹿にしようとする
（ただし、相手を表面的・形式的にしか判断できず(早合点・誤解の名人)、実際にはた
いてい、内面的・実質的に負けている）
●本音は、ものすごく幼稚で倫理意識が異常に低い（人にばれさえしなければＯＫ！）
●権力、強者（警察、暴走族…ｅｔｃ）に弱く、弱者には威張り散らす（強い者にはへつらい、弱い者に対してはいじめる）
●あら探しだけは名人級でウザイ（例え10の長所があってもほめることをせず、たった１つの短所を見つけてはけなす）
●基本的に悲観主義でマイナス思考に支配されているため性格がうっとうしい（根暗）
●単独では何もできない（群れでしか行動できないヘタレ）
●少数派の異質、異文化を排斥する(差別主義者、狭量）
●集団によるいじめのパイオニア＆天才(陰湿＆陰険）
●悪口、陰口が大好き（Ａ型が３人寄れば他人の悪口、裏表が激しい）
●他人からどう見られているか、人の目を異常に気にする（「〜みたい」とよく言う、
世間体命）
●自分の感情をうまく表現できず、コミュニケーション能力に乏しい（同じことを何度
も言ってキモイ）
●表面上協調・意気投合しているようでも、腹は各自バラバラで融通が利かず、頑固(本当は個性・アク強い）
●人を信じられず、疑い深い（自分自身裏表が激しいため、他人に対してもそう思う）
●自ら好んでストイックな生活をしストレスを溜めておきながら、他人に猛烈に嫉妬
する（不合理な馬鹿）　　
●後で自分の誤りに気づいても、強引に筋を通し素直に謝れない（切腹するしかない！）●自分に甘く他人に厳しい（自分のことは棚に上げてまず他人を責める。包容力がなく冷酷）
●男は、女々しいあるいは女の腐ったみたいな考えのやつが多い(例：「俺のほうが男
前やのに、なんでや！（あの野郎の足を引っ張ってやる！！）」）

>>548
なにいってんだ？
お疲れか？

silencing用のプラスミド量が多いほどコトラした遺伝子の発現が多い。
mockでもそうなる。
なぜでしょう。どなたか良い考察ありませんか？

>552
mockでそうなるのならRNAiは関係なくて単に系にミスがあるか手技上の不手際では?

みんな、>>545みたいになってるの？

うまくいってるひともいっぱいいるよ。うちも含めて。
確かに誰もがうまく行く、どんな系でも使える、って万能の系ではないが、
それはどんな系にも多かれ少なかれあること。
きちんと使えてることもあるんだから、なんでもかんでも信用しないのは
ちょっとどうかなと思ったり思わなかったり(どっちだよ)。

>>555（おお、ぞろめ）
いや、そうでなくって、
５４７が言ってるようなチェックをしてるかってこと。
見かけ上うまくいってるだけかも知れないでしょ。

素人です！ＲＮＡ干渉の技術は、エイズの特効薬開発につながるというコラムを
読んだんですが、特効薬って、根治薬って意味ですか？それとも、ウイルスの
増殖を抑える薬（根治ではない）ですか？はかせのみなさん、おしえてくださいな！！

今度RNAiやってみようと思ってるのですが、なんであんなにsiRNAって
高いんですか？気軽に出来ません。

エイズの特効薬にはつながりませんです、ハイ。
１こmutationはいればサイナラ〜ですから

エイズ研究、ウイルスってむずかしいな・・・

RNAiにはどのくらいの予算が必要でしょうか？

５０マン

高すぎ。ボスの許可おりないよー。

RNAiの旬はもう終わった
機構解析まで行けばいいが・・

冷静に考えると
よくプラスミドベクター作っただけで
トップジャーナル載ったなあと思う。

なんか灯台の先生が、ベンチャー作ったけど、商業ベースにのるかな？
うまくいけば億万長者

平たいせんせいかな？

誰か、５４５みたいなチェックしてない？
ベクター型って、ホントに大丈夫なの？
ベクターだけで、転写が異常に落ちるんだけど。

↑
プラスミドの精製度が悪いんじゃない？
LPS入ってない？

うちは複数の発現ベクターコトラして問題なく
特異的RNAi効果を確認してるぞ！！
るしふぇらーぜ・じーえふぴー・らっくぜっと・その他諸々

オマイラ実験へたすぎ!!もっと修行しろ

ちなみに上の方でマーキュリーという人がプラスミドベクターについて
いってることは大いに参考にすべし！！

　　　　　　　　　　　　　∩
　　　 　 　 ∧＿∧ 　　| |　　　／￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
　　　　 　 （　 ´Д｀）／/　　＜　先生！こんなのを発見シマスタ！
　　　　　 ／ 　 　 　 /　　　　｜
　　　　 / /|　　　　/　　　　　　＼ 　http://saitama.gasuki.com/kaorin/
　 ＿＿| | .|　　　　| 　　　　　　　 ＼
　 ＼　 ￣￣￣￣￣￣￣＼ 　　　　＼＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
　　||＼　　　　　　　　　　 　 ＼
　　||＼||￣￣￣￣￣￣￣||￣
　　||　 ||￣￣￣￣￣￣￣||
　　 　 .||　 　 　 　 　 　 　 ||

>>569
自作ベクターなの？　
マーキュリーさんを参考にしたということは、ヘアピン型じゃないんだね。
pSUPER買っちゃった後にここ読んだ…まぁやるだけやってみよう。

>>568
LPSってなーに？

＞５７２
APSのこと

>>568
レスさんきゅ〜！！！

プラスミドは全部キアゲンのmidiだから問題ないと思う。
実験も丁寧にやってるよ。

いづれにしれもうまく言ってるって聞いて、ちょっとホッとしたよ。
けど、ヘアピン型でないの？
ちなみに、プロモータはH１？U6？

あ！あと細胞種はなにかな？

ごめん、もうひとつ！
たとえば、
「GFP発現ベクターだけ」と、
「GFP発現ベクター＋siRNA空ベクターのコトラ」の
GFPの発現量を比較した事ある？

ag

are

すいません、　pSHAG vectorにheapin-roopを入れようとしているんですが
はいってくれません。
70bpのfragmentをどのようにanealしてどれくらいの量をligateしていますか？

http://www.pink-angel.jp/betu/index.html
★いらっしゃいませ！！ようこそココへ★

　　　　　　　　　　　　　∩
　　　 　 　 ∧＿∧ 　　| |　　　／￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
　　　　 　 （　 ´Д｀）／/　　＜　先生！こんなのを発見シマスタ！
　　　　　 ／ 　 　 　 /　　　　｜
　　　　 / /|　　　　/　　　　　　＼ 　http://saitama.gasuki.com/tochigi/
　 ＿＿| | .|　　　　| 　　　　　　　 ＼
　 ＼　 ￣￣￣￣￣￣￣＼ 　　　　＼＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
　　||＼　　　　　　　　　　 　 ＼
　　||＼||￣￣￣￣￣￣￣||￣
　　||　 ||￣￣￣￣￣￣￣||
　　 　 .||　 　 　 　 　 　 　 ||

age

>>549
heta?

<583
スレつぶしがW

★男はココを見るべし★女と金と？？？★
↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓
http://www.pink-angel.jp/betu/linkvp2/linkvp.html

初心者で教えて欲しいのですが、内因性のを標的にする場合は
オリゴとベクターどっちでやるのがいいのでしょうか？

トランスフェクション効率はほとんどの場合オリゴの方がよいはず。
配列選定にはベクター型が安価なので便利。

ベクター型の場合、pEGFPなどのマーカーとコトランスフェクション（マーカーの比率を1/40とかに）して効率を見ている。
オリゴの場合、それ自体を蛍光標識にするオプションがある。

蛍光標識はRNAi活性に影響しないのですか?

>587
上の方で、ベクターのみで非特異的な抑制があるとかかれてますが、、、

アダルト激安DVD一枚900円！
http://www.net-de-dvd.com/
特売品は、なんと一枚600円！
http://www.net-de-dvd.com/
アダルト激安DVD一枚900円！
http://www.net-de-dvd.com/
特売品は、なんと一枚600円！
http://www.net-de-dvd.com/
アダルト激安DVD一枚900円！
http://www.net-de-dvd.com/
特売品は、なんと一枚600円！
http://www.net-de-dvd.com/

>>589
あるよ。
非特異的阻害。

ベクター型ならアンチセンスの方がいい

ベクタータイプが使えるのはstableを得るときだけ？

>592
禿堂

非特異的阻害はなんで起こるの？ベクターの種類によらない？

U6は起こりやすいと聞いた事があるけど、
H1も同じような気がする。

age

hage

siRNAのシーケンスをわざと別のターゲットにつなげてsiRNAを導入すると
偽ターゲットはRNAiされるのだろうかね・・・。あまりいみないけどな

６００ゲト

>596
ホントにあるの？非特異的阻害。

>601
596の系はどうかしらんが、うちではついでに適当な抗体で見たら
そっちも下がってて途方にくれたことがある。

>602
その後解消されたのですか？

ターゲットによってベクター型とsynthetic siRNAとを使い分ける必要があるらしい。

>>602
単にトランスフェクションで細胞がヘタレただけでは。。。。
コントロールを取って、特異的阻害か非特異的阻害か
見る必要はあるはず。

だいたい、合成RNAに比べれば、大腸菌で手製で増やしている分、
どうしても細胞にはベクター型は余計なeffectはあると思う。

PCRで増やしてみましたという猛者がいたら聞いてみたいが
リニアでしかも大して長くもないdsDNAがどれくらい
トランスフェクションして安定かと言われるとよくわからん。


うちは一応ベクター型でワークしてるよ。
タンパクレベルで抑制を見るのに条件設定がめんどくさいのと
やっぱりシークエンスでのトラブルが多い、まあこれは
致命的な点ではないが、数作るだけにめんどくさい。

ベクター型で実験しているヒトは、
とんでもないドンデン返しに見舞う羊羹

>>606
そんなことないけど

http://www.pink-angel.jp/betu/linkvp2/linkvp.html
★☆★☆★☆★☆★☆★☆★☆★☆★☆★☆★

>605
ちゃんとコントロールとったけど、
明らかに非特異的な阻害がありました。
６０２とは別人ですけど。
６０６の羊羹に同意。

>>605
どんなコントロールとってますか？

初めてやる場合には結局オリゴとベクターどっちがいいのですか？

多様化するＰＣビジネスの中で、確実に急成長している堅実ビジネスです。
私自身、様々なネットビジネスを試してきましたが、
今回初めて自信を持ってご紹介できます。
資金は後にも先にもたったの1000円のみ！
参考までに他では、1万円〜２万円が相場です。
ばらつきはありますが、平均日商8000円位になっています。
現在、土日を除く毎日が給料日です。毎日数時間、頑張って掲示板に
書き込むだけで、口座に毎日入金されるようになります。

同時に所持金を二倍にする方法、借金を多数つくり
合法的に堂々と踏み倒す方法、一度に複数のHな女の
個人情報を入手する方法、目当ての女の本音を知る方法
など２００以上の裏情報も入手できます。

興味のある方、ヒマな方は名前ランにあるピットをクリックして
件名に情報希望を入力し送信してください。

または、[email protected]に情報希望と入力し
送信してください。

この時点ではまったくお金はかかりません。
ぜひヒマつぶしのつもりでメールください。
今日いただいたメール　１１　通です。

留学中の先生から教えてもらったけど、アメリカでEGFP入りのsiRNAベクターを
クロンテックがテスト配布してるらしい。日本で手に入らないかな。

>>610
empty vector / 違うターゲット用にデザインしたベクター
だよ＞ネガティブ コントロール

RNAレベルだけど、ちゃんとネガはネガで下がらず、予期の結果だった。


でも、このスレのせいか知らないが、非特異的な阻害を
言っている奴を最近見た。（他のラボだけど）


理屈はベクター型でも通っている気がするんだけどね。

細胞種によって、RNase活性(Dicer活性も含め）が違っていて必ずしも
細胞内でパンフ通りにプロセシングされないのかもしれない。

あるいは、small RNAの合成量が多くなり過ぎてside effectが出るのか？

>605
オレの場合、empty vectorでも発現が減りました。
プロモーターが悪さしてる？

>>615
プロモーターが悪さしているかどうかは、わかりませんが
漏れの想像では、ベクター型のemptyは
MCS配列によっては、細胞に導入した場合、比較的長いRNAを
合成してしまい、特に免疫系のセルラインでは
インターフェロン系に干渉するんじゃないのかと言う事です。

哺乳類RNAi自体、この系の存在には注意しなきゃいかんような。

と、書いてみたものの、empty vectorから転写される
RNAってssRNAだよな。。。

まあ、MCSで回文構造作ってるかも知れんけど。

GFPに対するターゲット配列が入ったものでも、
同様に非特異的な阻害が起こりました。
なんでだろう。。。
期待してたのに、ショック大きいです。
難しいステップがあるわけではないだけに、
なぜ、うまくいってるヒトがいるのかわからない。

で、結局のところ、ベクター型やってるヒトは、
何を見てるかわからないという結論でしょうか？

>>619

哺乳類での系のRNAi自体、何を見てるかわからないかも。。。

この話を最初に聞いた時、がいしゅつだけど
インターフェロン系はどうなん？？？

とすぐに思ったからなあ。

GAPDH siRNA発現ベクターをステーブル導入したらどうなるか、やった事ある人、教えてくれ！

テストカキコ。

>>621
怪獣ゼットンが生まれました

>>621
ｲﾝﾀｰﾅﾙｺﾝﾄﾛｰﾙが撮れなくなりました

>624
アクチンでとれば？

>>599
Experimental Cell Research 285, 2003, Pages 39-49

ちょっと考えて思いつく研究はほとんどやられている・・

やっぱり、ベクター型やってるヒトは、
何を見てるかわからないという結論でしょうか？

>627
なんでそうなる。
バカかあんた。

奇亞減もsiRNAを売り出したみたい。品質いいの？

RNAiのネガコン、スクランブルsiRNAの配列は、どうやって選べばよいのか？
5'-CACACACACACACACACACAC-3'はダメなのか？
Blastで何もヒットしないぞ！

>628
反論できない低能シネ

確かに上の方でvector型に異を唱える意見が多数あるな。

流れ的には６２７の結論で良いように思うがどうだろう？

〉630
dsに兄ールする時、荒い面とずれちゃうよ。

大人の出逢いから　ピュアな出逢いまで・・・。
素敵な　お相手が貴方を待っています！
もちろん　女性は完全無料です！
http://www.sweet.st

（＾＾）

結論としてしまうにはどちらも根拠にかける気がする。

http://yahooo.s2.x-beat.com/linkvp/linkvp.html

ここおすすめ
http://zoetakami.fc2web.com/

これは安いアダルトDVD一枚９００円！！
http://www.net-de-dvd.com/
これは安いアダルトDVD一枚９００円！！
http://www.net-de-dvd.com/
これは安いアダルトDVD一枚９００円！！
http://www.net-de-dvd.com/
これは安いアダルトDVD一枚９００円！！
http://www.net-de-dvd.com/
これは安いアダルトDVD一枚９００円！！
http://www.net-de-dvd.com/
これは安いアダルトDVD一枚９００円！！
http://www.net-de-dvd.com/

だが、実際にベクター型が論文で使用されているのもたしか。

　　 ∧＿∧
　　（　　＾＾ ）＜ ぬるぽ（＾＾）

そうね。
実際acceptされた論文がある以上、安易な結論を出すのは科学者として軽率かと。

　 ∋8ノノハ.∩
　　 川o・-・）ノ　＜先生！こんなのがありました！
＿_/ / 　 　/ 　　
＼(_ﾉ￣￣￣＼
||ヽ||￣￣￣￣||
　...||￣￣￣￣||
ttp://saitama.gasuki.com/wara/

で、実際、ベクター型動いてるの？みなさん？

>645
うちでは動いている。
ダメだという奴もいる。
他所の話は知らん。
論文読んでみて、ダメっぽいのもあるだろうがきちんとイケてるのもある。
このスレ見る限りでもイケてるひととイケてないひとがいるようだが、
遺伝子によっては全くダメだと作者も言ってるのでそんなのはダメだという
理由になるとは思わない。

質問も答えもさんざんｶﾞｲｼｭﾂだとおもうが、どうか。

動かない理由調べたら新発見かも

まあとっくに誰かが解析してると思うが・・

>646
だけど、ベクター型はノンスペに抑えると言う意見、最近多いよ。
どっかの業者も、U6プロモーターがノンスペに転写を抑えるっていってたし。

http://homepage.mac.com/hitomi18/

>>646
pSilencer、pSUPER、どっちですか？他のですか？
漏れはpSilencer2.1Uだっけか？ハイグロの。U6プロモーター。
で一発やってみたんですが、どうにも目的は減らない。
なのにウェスタンしてみるとノンスペが減ってる。ｲﾔｰﾝ。

あと２，３箇所で作ってみてだめならDicerで切る自作タイプにしようかな・・・。

siRNAをトランスフェクトする試薬ってプラスミドベクター用の
トランスフェクト試薬でかまわないのですか？

今、ベクター型でうまくいってると錯覚してるヤシラは、
即、ノンスペチェックすべき。
siRNAベクター有無でね。

652のいうことはもっともなようで変

遺伝子導入で細胞増殖への影響をみるとする
見事Rasのドミネガで空ベクターより増殖下がった！！

しかし空ベクターだけでも無処理に比べて若干増殖が下がってしまう！

こんな場合お前はこの発現ベクターは実験に使えないと言うのか？
当然バックグラウンドと考えるよなあ？え〜おい！！
そんなセンスもないなら実験やめれ

>653
言いたい事はわかる。
ある程度はあってる。
だが、お前は知らないだけ。
空ベクターだけで、劇的にノンスペの抑制がかかることを。
オレは昔から発現系の実験をしてるが、
こんなに、劇的なノンスペの効果を見た事がない。
生きがいいのは分かるが、ヒトの有意義なアドバイスにたいして、
誰でもわかってることで粋がるのは見るに耐えない。ハズカシイ。
ちなみに６５２とは別人。

>653
まあ、そういわず、やってみてよ。
私は、どっちの結果でもいいと思い松。
みんながスッキリするならそれで。
そんなに手までもないし。
できれば、このスレで報告お願いし松。

http://www.k-514.com/

ところでsiRNAでノンスペ下げた例ってありましたっけ。
いや、別に上げたでも死んだでも良いんだけど(w

オリゴでは聞いた事ありません。

RNAiやってまつか〜！！！

U6プロモータの問題でなく
空ベクターのMCS後の
塩基配列デザインが悪い気がする。

つまり空のつもりが無意味で長ったらしい
RNAを転写させており
細胞種によっては毒性を与えているのではないか。

というのも、空ベクターの導入DNA量が上がると
随分細胞のイキが悪くなる気がしてたまらん。

insertを挿入した奴は一応目的の奴は減って
コントロールのHousekeepingは下がっていない。漏れの場合は。

コントロールのハウスキーピングなんて取る必要あるのか？
目的の奴が下がってればいいじゃん？
トータル蛋白であわせりゃ十分なんじゃない？

>661
いや、それじゃどうにもマズそうだって流れで今の議論に発展してるわけよ。

俺も660に同意で、ベクターのデザインの問題のような気がする。

http://homepage.mac.com/ayaya16/

660の意見にさんせい。
確かにあのベクターは不親切だと思う。

ただ、オレはインサート有りでもノンスペ下がったけどね、凄く。

茅ヶ崎ちゃんねる
http://jbbs.shitaraba.com/travel/1213/

実際のところ、どんな転写産物がどれだけ出てるのかきちんと検証しないと
何が原因かよくわからんという気が。
モノの性質上、かなりマイナーな転写があってもstableには効いて来る
可能性が高いわけで、そういう不確定要素を考えるとsiRNAを素直に使う方が
コントロールしやすいと思われる。
ベクターの精製度とか、そういうのにもかなり依存しそうだな。

俺はどっちかというとベクター派なのだが、まだ改善の余地があるという点で
660に一票。

読んでて面白いけど、専門用語（RNAiってそもそも何？）が
よーわからん。誰かこの無知な生物好きな高校生に教えれ。
簡単でもいいっす、ある程度わかれば自分で資料探すなり。

>667
ぐぐれ。
全てはそれからだ。

とりあえずここでも見れ。
http://www.nippongene.jp/pages/products/sirna/review/
http://www.qiagen.com/catalog/auto/cget.asp?p=RNAi_background&l=jp

vector型のstable取ってる人いますか？

現在、stable作成中。なんとかなりそうだと（推測）。transientはベクターでもうまくいった。ただし成功例は同じ遺伝子に対し4箇所作製し1〜2。

メーカー情報は重要だけど彼らは研究が目的ではないので論点がズレる。分子生物学会で実際の使用者情報が最も有用。結局国内では皆さん試行錯誤状態。ベクターが有用であることは否定できない。実名は出せないが筑波のグループのベクターが最有力となると思う。

現在トランスジェニックマウスも作製検討中。大阪では既に作製しているが、イマイチ是非が判断しにくい。

みなさん空ベクターで、のんすぺの影響
出るって言ってるけど、
まったくの no transfectionと比較してですか？

transfectionは、それだけで細胞内の一部のシグナルを
活性化させるので、そのせいという事はないのかな？

入場無料

http://ime.nu/www.net-de-dvd.com/

>674
いえ、私の場合、タンパクAとsiRNA-A vectorをコトラしても、
タンパクAとsiRNA-B vectorをコトラしても、
劇的にAが減少しました。
っていうか、ほとんど発現しなくなりました。
もちろんインサート無しのベクターでも同じです。

>673
去年の分生でやってましたね。そーいえば

そうだね。

やっぱベクター型危なそう。やーめた！

RNAiそのものをやめるのが勝ち組

ていうか、RNAi一本で話をまとめようとするからマズいのでは。
別の系で立てた仮説を補強する意味で使えばどっちのやり方も
有効なデータを提供するものと思われる。
道具は使いよう、ってことで。

>681
結局はそういうことだよね

>680 RNAiそのものをやめるのが勝ち組
結論はまだ早いと思う。
少なくともそれまではアンチセンスしか選択肢なかったこと考えれば。
アンチセンスよりはましのような気がするし。
もしRNAiを完全に×とするならアンチセンスの研究はどうなんだろ？
あっ、一応ドミネガも選択肢か。ドミネガも怖いよね。
loss of functionは有用だし、RNAi、アンチセンス、ドミネガのなかではRNAiが最有力かと思うのだが。

>>297ぼくはU２OSでｷﾀ━(ﾟ∀ﾟ)━!!!!!でした

なんでRNAiでよくU2os細胞使っているの？

>683
全く同意。
ただ、やっぱりベクター型RNAiは危険かな。
ステイブル取るならアンチセンスの方がいいと思う。

>ステイブル取るならアンチセンスの方がいいと思う。

いや、アンチセンスでstableなんて実際ほとんど取れないのは業界の常識。
plantで花の色をアンチセンスで変えたという実験が印象的だったので
１０年前大流行だったけど、現実に、アンチセンスの発現が
transientだとOKでも、stableだと、ほとんどの場合、offになってしまう
ので、取れないことが多い。fibronectinをアンチセンスでノックオフした
stable transformantが癌化したというCellのpaperは撤回された。
その細胞ではアンチセンスのRNAが発現していないと言うことがわかったので。

オリゴのもまだまだ問題多いよね。
所詮はトランジエントだから、期待したほどＳｉＲＮＡの効果が少なかったりする。
ところが、特に期待していないときに思った以上にターゲットが消えたり。

やっぱり最後はベクター型だと思うよ。でもまだ未完成のようだね。

>686
恐れ入りました。
トランジェントならアンチセンスも結構いけるということですね。

ガイシュツだけど、U6とかH1プロモーターって結構悪さしそうですね。

ベクター型は重要だが必要以上に拘るのもイマイチかと。
stableでないといけない系ではベクター型は必須だが、transientでも良い系ならベクター型でない方がよいだろう。
手間・暇少ない分フレキシブルに実験できる。
新しさ故、必要以上にベクター型に拘りすぎている気がするのだが。
ベクター型を使用するにしてもオリゴ型でうまくいった同じ配列で実験するのが良いと思う。
同じ配列でベクター型、オリゴ型比較した報告って誰か知ってます？

でも、まだオリゴ高いもんね？
みんな、いくらで購入していますか？

>>690
アメリカなんで1ペア250ドルほどです。
日本は高いんですよね。こういうところで論文に差が出るのでしょうね。

まだ配列がパブリッシュされていなかったら一気に4ペア注文してます。
そうするとたいてい１つはあたっている。

>>691

どこのCompany,
うち、ボストンだけど４５０ドル払っている。

やっぱりRNAは合成の方がいいの？
某Amb社キットではin vitro合成した方が化学合成RNAより効果が強いと記載してあった。
合成よりも値段も安いし。
欠点は手動かさないといけないので、、、
合成の方が金はかかるが手動かさないので便利。

>693
合成方法よりできあがったものがどんな純度を持ってるかが問題ではないかと。
結果的に何か効果を増幅する薬品や安定化・不安定化するタンパクが入りこむから
効果が高いとかいうことなら、それを純品に混ぜればいいわけで。
多少degったり合成ミスが混じった方が効果が高いとかいうことなら、
そのうちそういうデータが出てくるかもしれないね。

ttp://www.symposia.com/Meetings/ViewMeetings.cfm?MeetingID=701

RNAiはもうやめたら？

>695
なんで？ごめん、わかならい。

日本にRNAiとかエピゲネで国際的に通用するPIっているのか？

TABATAとか、国際的に有名。
実験が下手で狙った場所にマイクロインジェクションができなくて
漏れてしまって、虫をソーキングするだけでRNAiが起こることを
みつけたそうです。

http://life.fam.cx/

>>692
Ｑｉａｇｅｎだよ。
いちどホームページにいってみな。

>>697
エピゲネ。。。

オリゴエンジン、あたらしいpSUPERだしてたね
で、明日はsiＲＮＡ設計ツールのバージョンアップだそうな。
ﾌﾗｯｼｭのなかなか良いツールだが、検索結果のコピペできるようにしてほしいなぁ。

スクリーンショットでしのげ

U6プロモーターとかH1プロモーターが入ってるベクターって買える？

　 ∋8ノノハ.∩ 　　http//togoshi.ginza.st/sinagawa/
　　 川o・-・）ノ　＜先生！こんなのがありました！
http://www.togoshi.ginza.st/hankaku/hankaku04.html
http://togoshi.ginza.st/zenkaku/index.html
http://www.togoshi.ginza.st/hankaku/hankaku01.html
http://togoshi.ginza.st/hankaku/hankaku10.html
http://www.togoshi.ginza.st/hankaku/hankaku07.html
http://togoshi.ginza.st/hankaku/hankaku08.html
http://www.togoshi.ginza.st/hankaku/hankaku05.html
http://togoshi.ginza.st/hankaku/hankaku03.html
http://www.togoshi.ginza.st/hankaku/hankaku06.html
http://togoshi.ginza.st/hankaku/hankaku02.html
http://www.togoshi.ginza.st/hankaku/hankaku09.html

　 ∋8ノノハ.∩ 　　http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php3?pGMPID=0601007
　　 川o・-・）ノ　＜先生！こんなのがありました！

1度やってみたかったんだよね、このネタ。(w

http://www.oligoengine.com/
オリゴエンジン社は21日をまだむかえてないのか。。。
どこの会社だ？時差か？ちくしょー期待させてじらしやがってぇ。

━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅（＾＾）]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

age

>706
最初、何のことかわからなかった。
704への返事になってるんだね。

”週間ボイス”っていいよ
ニュースの英字記事内容と訳文を月８０円で毎週日曜日に
購読できて、そのニュース音声も聞くことができる。
まぐまぐから配信されるから安心だよ。
申込は以下のアドレスからできるよ。
HPにはサンプルがあるから試してみて

ＨＰから↓
http://flexy.infoseek.ne.jp

まぐまぐから↓
http://premium.mag2.com/
週間ボイスで探してみて

きあげんでreagentやオリゴを頼もうと思ってるんだけど、評判はイイので
すか？

http://homepage.mac.com/hiroyuki43/

>>713
キャンペーンでsiRNAはちょっと安い。

>>706
ありがとう！！たすかったぜい。
でも11満もするのか。

>>715
きあげんキャンペーンなんてやってるの？
クラブ会員になると安くなるようだけど。

北\すもRNA合成やっているよ。
これはカタログにはのっていないようなのだが。
そこそこやすくなるみたいだから、といあわせてみるとよい。

>>717
それ。6月末までの期間限定キャンペーン価格。

rnaiだけで論文だせますか？

そういう時期はもう過ぎ去ったと思っている。
いやまあ、letterとかなら話は別だが。

RNAiの根本原理や生体中での意義を明らかにすればCNS狙えるよ！

ちなみにレトロウイルスでのRNAiはあまりうまくいかないね
ウイルスタイターが異常に低いし効果も薄い
ツールとしては失格だと思いまふ

>>722
現在、自分でレトロ型のヘアピン型siRNAベクターを作っているんだけど、あまり効果が薄いというのはうまく発現してくれてないということなの？
今作っているのは高効率で感染させることができるものを使って作っているんだけど、それでも無理そう？
アドバイスおねがいします。

本当の完全無料サイトはココだよ！　
２５５の動画が完全無料で見放題だよ！
今すぐ抜けるよ！ http://www.gonbay2002.com

◎よろしかったら見て下さい◎
http://endou.kir.jp/betu/linkvp2/linkvp.html

>723
論文参考にMLV自己不活性型を作製
エンベロープはeco
U6プロモーター使用
プラスミド型で間違いなくRNAiおこす配列を組み込み

感染後薬剤選択でタイターアッセイ&RNAi効果の検定
タイターかなり低い & RNAi効果弱い

レンチ&VSV-Gなら勝機もあるか（既報ではあるが・・・）?

単に俺のベクターがヘタレの可能性も高い
俺は撤退する
成功を祈る

http://homepage.mac.com/hiroyuki43/hankaku/hankaku08.html

発現型RNAi危険

　　　 　∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　(　　＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣〕
　　＝ ◎――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉

どれでも良いんでレス、よろしく。
１）Dharmacon HPみたけど無料・配列検索、Ambionより良さそう。Ambionの検索結果は見にくくて不親切（個人的にはAmbion好きなんだが）。
実際Dharmacon使用者います？
２）導入効率低い細胞でのRNAiで例えばMACS select4みたいなんで濃縮かけて使用できるかな？
できれば、CD4なんかで濃縮かけてmicroarrayと組み合わせ実験したいんだけど。
そういえばRNAiとmicroarrayのセット実験って報告少ないけど、実施しているヒトいませんかね？
３）Dr.tairaのtRNAプロモーターって興味あるんだけど。今んとこtRNA使っているのあそこだけ？
欠点とかもっといいプロモーターってあるの？
４）今最もお勧めのRNAi用トランスフェクションキットってどこ？
細胞によっても違うのは当然だけど、3-4複数検討するとしたらどこがいいだろうか？
５）雑談だけど・・・もしあるcDNAの3'に自己のヘアピン型RNAi(dsRNA)貼り付けたら、どうなるんだろう・・・
実用性はともかくとして、何か遊べるツールやネタにならんかな？

>>722
わたすはレトロでうまくいってますが何か？

>731
素晴らしい。

うまくいってるように見えているだけだ罠

いつでも激安

安心して24時間お買い物ができる！
セルビデオ店が近くにないお客様も気軽にお買い物を楽しめます。
http://www.net-de-dvd.com/
安心確実

お支払は安心の代金引換です
振り込んだのに商品が届かない等
の心配は無用！
http://www.net-de-dvd.com/

siRNA ノーベル賞 有力か！？

>735
もう一息でないかな。
応用の実用化がもっと進めば。。。

ウニ幼生の骨片を記せ。また、これは脊椎動物の骨を形成する胚葉と同じか、異なるか？さらにウニの骨片と脊椎動物の骨の同じ点と異なる点を説明せよ。・・・を教えて下さい。

>730(2)
今おれがやってるからまっていてくれ。

アイドルのツルツル割れ目が見れるサイト発見(*´Д`)
コラだけどハァハァ・・・
http://plaza16.mbn.or.jp/~satchel/turuturu/

>730(2)
この前の生化学会でポスター見かけたような気がした罠？

http://homepage.mac.com/yuuka20/

★クリックで救える○○○○があるらしい？？★
http://yahooo.s2.x-beat.com/linkvp/linkvp.html

>738
そう言わずヒント、コツ、経験などを。
例えばトランスフェクション、CD4濃縮の影響とかマイクロアレイで致命的に影響しないの？
結果がバラつきそうで少し不安。

あまいら、RNAiは相変わらずH1かU6?
tRNAとか使ってるヤツ、おる？

>>744
もうすぐ宝が市販するるときいた＞tRNAたいぷ
それ使えば楽だろうな。

>>745　サンクス。
うそ、ホント？
そんなの聞いたこと無い。
Dr.tahiraが噛んでるの？
明日にでも確認しよ。

tRNAたいぷってメリットあるんかい？

>>747
文献もあると思うが、とりあえず昨年の分生でも。
要約すると、
　H1 & U6⇒　核内でRNA発現（一部が漏れて？細胞質で機能）
　tRNA　　⇒　積極的に細胞質へRNA輸送
dsRNAは細胞質で標的RNA分解。

わかりやすいまとめサンクース。
tRNAのほうが効きやすいってことね。
プロモーター自体が違うってことかな？
文献読んでみます。
H１とかU6だとノンスペに抑えられるらしいから、
そういう効果もなくなるのだろうか。。。？

文献って
Kawasaki H, Taira K.
Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells.
Nucleic Acids Res. 2003
これ？？？

>>750
yes、他の筆者で他にもあるかもしれんが。
日本のラボはTuschlらの論文で急にバタバタ。
Dr. KTはもともとアンチセンスでの発現抑制に長けていたのと、
特に独自のpol IIIプロモータでのRNA発現系、構築していたのがラッキー

訂正
アンチセンス　→　リボザイム
リボザイムなんて実用性はアンチセンス以下で使えん、、、
と思っていたのに。

お詫びに
　↓
ttp://www.taitec.ne.jp/magazine/taira/taira.html

ご丁寧にありがとう。
tRNA型に注目しまっす！

ヒトってすごいよな。
知られる前から使ってるっつーの！
↓
http://headlines.yahoo.co.jp/hl?a=20030609-00001020-mai-soci

>>754
俺の勘違いか？
ニュースの文面、マイクロRNAとRNAiが混同されているような・・・
ま、ネーちゃん読むとするか。

ついでに、知られる前から使ってるっつーの！ ・・・当然のこと。
自然科学の多くはもともと自然が使っているものを知ることでしかない、からね。

tRNA型の発現ベクターって耐裸先生が作ったベンチャーから
売り出されるんじゃなかったっけ？
RNAi実験プロとコールっていう本に
いろんな種類の発現ベクターを売り出すようなこと書いてあったよ。

>>754
確か、ベンチャーの話は単純じゃなかったような気が。
まず発現ベクターだけを単品販売ではなく、契約の元での実験でなかった？
あとライセンス料が高かったように思うんだが。
間違いならｽﾏｿ

>>748
自分はH1 & U6でも結構効果が出ているが、これは本当に核から漏れた一部のヤシらの仕業なのだろか？

Genes Dev. 2003 Jun 1;17(11):1340-5. みると、核内にもdsRNA分解酵素が有りそな感じ。Dicerは細胞質だけって本当？
H1 & U6からのdsRNAも核内のdsRNA分解酵素でsiRNA化&核外輸送ってことでOKれすか？

ところで、細胞内で発現させたsiRNAのノザンってみえる？　単に俺のウデがヘタレなのか....

>>758
難しそうなんで俺はsiRNAのノザンやったことないが、やれるみたい。
学会ポスタで発表してたので、直接演者に聞いたら問題ないとのこと。

>>756
DR TAHIRAのベンチャーが考えたのをドラゴンで合成して
宝ブランドで世界中で売ると聞いたのですけど。
あちこちのメーカーが獲得競争やったともきいた。
すごいぞ宝バイオ。転職したいぞ宝バイオ。
うちのチーフはうわさが好きだから間違ってたらゴメソ。

◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆裏情報総合取引場◆◆◆◆◆◆◆◆
◆裏情報交換⇒⇒ttp://www.kawachi.zaq.ne.jp/dpdan803/◆
◆騙された経験⇒ttp://www.kawachi.zaq.ne.jp/dpdan803/◆
◆各種番号調査⇒ttp://www.kawachi.zaq.ne.jp/dpdan803/◆
◆ＦＬＡＳＨ⇒⇒⇒ttp://www.kawachi.zaq.ne.jp/dpdan803/◆
◆各種掲示板⇒⇒ttp://www.kawachi.zaq.ne.jp/dpdan803/◆
◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/hankaku02.html

>>760
宝すごいね。ホンと転職したいわｗ
O157、SARSの儲けを抜くかな。このベクターで。

>760
扱うのは宝だけ？

ｺﾞﾒｿ、良く分からん。何か発現ベクタとRNAiオリゴ合成が混同してないかな？
745の情報通り、宝はtRNAプロモター発現ベクタ扱うのか確か（確認済）。
DrタイラのベンチャーはRNAi関係でビジネス（確認済）。
ただし発現ベクタ販売は定かなのか？
760の宝話はベクタでなくて合成オリゴのことかな？

tRNA系の発現ベクタ、宝とくろんてくがうるってうわさ聞いた。
あと、Drタイラのベンチャーは、ライブラリがウリらしい。

他にRNAi関係の企業ってありませんでしたっけ？

既出だがまず筆頭にはDharmaｺﾝ、かなりハイレベル。
次にAnbiｵﾝ、ベクタは先駆けだし、元々RNA専門メーカーだしお気に入りだがRNAiはDharmaｺﾝの方かな。
　webで無料部位検索できるのは助かったし、文献情報豊富なのも好きなんだけどね。
あとついでにQIAｹﾞﾝ、メリットは？
ProﾒｶﾞはPCRベースでRNAi用DNA断片調製できるのはユニークだけど実用性はどうかな？

離婚美男とダイサーはどうでつか？

http://www.oligoengine.com/
おお、いつの間にか設計ソフトが新しくなってる。

だるまこん、「絶対効果あるsiRNAを設計･合成精製してお届けします」
というが、その配列情報つけてもらうと4本で50万円オーバー・・・。
(同一ターゲットに対するsiRNA4種を混ぜて効果を増幅する)

当たるか外れるか判らない配列を自分で設計するより、
だるまこんのデータに沿って作れば絶対当たる(らしい)。
それなら安いのかなぁ・・・。
迷い中。

>765
販売は2社からでる噂アリ。
どぉする〜フナムシ〜。

だるまこんの配列予測ってどうなの？
やったひといる？

ちょっと教えて欲しいのですがsiRNAのtransfection法ってどれが一番
いいんでしょうか？前にLipofectoamineでやったらうまくいかなかったので
別のやり方にしようかと思ってるのですが。

>773
siRNAとDNAでトランスフェクション効率が大幅に変わらないと仮定するなら
最後は細胞種によるんじゃないかなあ。
リポでも条件次第で効率一桁変わることもあるわけだし。

例えばDNAなら40%入るMethodで効果が見えないとしたら、
それはsiRNAの設計が悪かったと見るだろう。
例えばリポでどうやっても2%しか入らない細胞なら、
リポでやれとは言われないだろう。

>772
びみょ〜

きあげんはオンラインデザインできるの？うまくいかんけど。

>619
配列をコピペして検索すれば沢山候補が出てくる。

GENES&DEVELOPMENT
pDECAP
これ最強

>778
5'CAPと3'polyAをなくしたpol II転写・・・ドツボにハマりそう。

>778
ほんとに最強なの？怪しくない？
>779
その心を教えて下さい。

>774
invitrogenのoligofectamineでうまくいってます

利権のグループだよね（ttp://www.genesdev.org/cgi/content/full/17/11/1340）。
アイデアは面白いし、実践したことも素晴らしいと思う。おそらく、標的遺伝子を発現抑制する可能性は高いと思う。
ただ汎用性においては、１）系が複雑、２）開発途上の2点の理由により時期尚早と感じる。
得てして懲りすぎた系は壷り易い。

具体的に言うと
（１）機構が運任せ。
pol IIからの長い転写産物⇒5'CAP、3'polyA⇒細胞質⇒IFN応答、よって5'CAP、3'polyA除去⇒核⇒Dicer⇒siRNA⇒細胞質
・・・単に発現抑制するだけが目的ならU6やH1などのpol IIIからのsiRNA (shRNA)で核に発現させるだけで十分だし、核内でのDicer分解が必須でない分シンプル。
更には内在機構により能動輸送されるtRNA系の方が良いかも（推測）。
（２）特異性？　
これが一番問題。vitroでのDicer処理同様、どの部分がsiRNAとして機能するかが不明。最悪、特異性を保証できないかも。
文献でも懸念し、基礎実験していたが全ての遺伝子に保証できるか？
同様の問題ですべての長鎖RNAiがすべての細胞・組織でうまくDicerで処理されてIFN反応を惹起しないかが不明。
最初から短鎖を発現する方がリスクは少ない。
（３）すべてのプロモータに有効か？　
今回のCMVは予備実験に過ぎない。CMV系を使用するのなら上記理由でpol IIIの方が可能性大（推測）。
彼らの目的の一つはイントロにもあるように部位特異的な遺伝子破壊。本当に他の部位特異的pol II プロモータで実施可能か？
その場合でも現在 pol IIIでCre-Lox、もしくはtet誘導系を応用した開発研究に比較しメリットあるか？

以上を考えると、もし入手できたとしても現時点で第3者が独立に使用するにはリスク大。やはり開発者である利権グループの伸展を期待するか、せめて協同研究かと思う。

全てを書き記せないし、反論も多いと思うので、是非他のヒトの意見・推測も聞きたいね。

>779
非常に参考になりました。
私が思うメリットは、
１）設計の必要がないのでとっつきやすい。
２）RNAiカクテルなので、強力であるかもしれない。
という点です。
安く確実に潰すにはこの方法は優れていると思います。
が、やはり特異性が一番の問題かもしれません。
メカニズムも素人目にはこじつけっぽく感じるし。。。

おすすめ
http://pleasant.free-city.net/

多少特異性低くても効く方がいい！
U6やH1はなんか変。

実際どのくらい特異性が低くなるのだろう。。。
アンチセンスも特異性低いのかな〜

俺も完全に否定してないけよ。でも、論文読む限りそんなに強く押す理由が無く、理論的に考えるとメリットが疑問。
786が言うU6やH1が変な噂は聞いたことあるが、pDECAPでも同じこと（もしくはそれ以上）起こる可能性があるように思う。in vitroの発現抑制（論文データ）もあんまり強くないような気が。
RNAiカクテルが効きやすいというのなら複数のsiRNA co-transfectionした方が人為的コントロールできる。
784の言う設計不要というのは多分誤りじゃない、むしろどこで切断されるか不明の長い領域（500bp）で特異性を期待できる部位を検索するのはもっと大変かも。
ま、理論的に批判ばかりしても意味ないし、実施例増えてくることは期待してる。

pDECAPの特異性の問題はDicer分解法と同じだよね。
長いRNA、Dicerで分解した後のRNAi特異性調べた文献（実体験）あるのかしら？

実体験者降臨キボ〜ン

癒されますね
http://pleasant.free-city.net/

降臨希望あげ

HelaやK562のような浮遊系にうまくRNAiをtransfectionするのには
どこのKitがいいですか？Ambion?Invitrogen?それとも
だるまこん？だるまこんはOptimizeされてないような気がするし・・・
どなたかご教授を！！

えれぽ　はどうなの？

えれぽがあればなんでもできる

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

陰vitrogen最強！

pDECAP最高！

>798
利権？？？

800ゲット

↓ 探し回りました
http://pleasant.free-city.net/

核外輸送シグナルだけど、ポリAなしでも、他の要素で輸送される
っていうレポがあるんだけど、どうなんだろう？
実際、どれくらいの確率でうまく行くもんなの？
まさに運任せ・・・？

やっぱin vitroでDicerかけた21mer poolでしょ。

効いたの？＞８０３

経口のRNAi薬ってつくれるのか？

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

☆覗いてみてください☆（閲覧無料）
http://endou.kir.jp/yuminet/link.html

C.Eleganceでは経口でもオッケーじゃなかった？

楽しみ
http://pocket.muvc.net/

injection
soaking
feeding

>>808
確かそうだ。ねーちゃーめでぃすんか何かにのってた。
所でちょいと質問なんだけど、浮遊系細胞のほうが付着系細胞より
transfectionがうまくいかない理由は何？細胞培養久しぶりに
やるんで、操作が楽な浮遊系を選ぼうと思ったら、transfectionしにくいって
聞いたもんで・・

>>811
そういうものだ

きいたんか？＞８０３

ベクター型は最近はうまくいっているのでしょうか？

やっとマウス個体でもRNAiが起きる事が実証されましたね。
ヘアピン型を使った系でGFP減光マウスが得られたが、肝心の
siRNAの検出ができていない、と去年の分生で報告されてましたが。

ウ〜ン。。。それって何かヤバくないです？
上の方でベクター型は危険だのってありますが。。。
大丈夫なのでしょうか？

>816
815のマウス個体でのRNAiと去年の分生の話は別の話だと思われ。
去年の分生の内容は確かに？だった。
815の話は　↓　のことじゃ無いかな？

Nat Struct Biol. 2003 Feb;10(2):91-2.
Germline transmission of RNAi in mice.

ま、この論文も少し怪しげだけど・・・

最近「ベクター型はおかしい！」って思ったヒト手上げて！

まぁ、とりあえず、分子機構とか経路はわかんないけど
gene silencing できちゃうから使っちゃおうって感じ
だからなぁ。生物間でも機構が違うっぽいし。

本当の完全無料サイトはココだよ！　
２６０の動画が完全無料で見放題だよ！
今すぐ抜けるよ！ http://www.gonbay2002.com

８００円〜！?なんでこんなに安いんだ！？

http://www.dvd-yuis.com/

>>818
あなたはどうなの？

非特異的な抑制がみられますた

transit RNAi とかいうやつが報告されてたよね、C.eleganceで。
DICERで生じた断片が二次的にmRNAを抑制するとかいうやつ。
一応、HELAcellでは、そういう影響を含めて、他のgeneには影響を
与えないって言う報告が出てたけど。（あ、transfection の場合ね）

☆頑張ってまーす！！☆女の子が作ったサイトです☆
http://endou.kir.jp/betu/linkvp2/linkvp.html

>>823
具体的には？

ベクターだけで発現なくなりまちた。

HeLaは他の細胞に比べてやたらとRNAiが起きやすい。なぜだ？

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/2ch.html

>>828
何を使ってtransfectionしたの？

>>830
発現ベクターで、レンチとアデノでつ。導入効率はどの細胞も同じでつ。

【クレジットカードのショッピング枠を現金化！】

クレジットカードで買い物をすると、商品代金の８０〜９０％のキャッシュバック！！
１０万円の買い物をすれば８〜９万円の現金がお手元に！！

■■朝日カード■■
http://www2.pekori.to/~ryu/asahi/

>>830
831タンとは別人でつが、
わいは普通のベクター型でダメでつ。

実は私もHeLaにtransfectionするのに半分遊びでlipofectamineで
やってみたら出来るときと出来ないときがある。う〜む奥深いな
進まないのは困るのでDMRIE-C買って今週末やろうと思ってるけど。
もうひとつ同時にK562にもやってみまつ。

ベクターだけで発現下がったヒトつのれ！

>>835
標的タンパクがベクターだけでさがったんでつか？
そんなことあるの？

http://homepage.mac.com/maki170001/

>836
ありまつ。
すっごく下がりますた。
もちろんターゲットに対する配列ないでつ。

>838
プロモーターの後ろにTTTTTとかのストップ配列は
はいっていたんでつか？

８００円〜！?なんでこんなに安いんだ！？

http://www.dvd-yuis.com/

☆貴方のハートをキャッチします☆
http://endou.kir.jp/yuminet/link.html

>>838
ターゲットタンパクは何よ？

＞８３９
空のベクターには入ってないでつ。
でもGFPのsiRNAベクターでも、すっかり発現がなくなりますた。
もっち、ターゲットはGFPではないでつ。

＞８４２
ごめんなさいでつ。
ここではちょっと。

>>843
たしかに、失礼しました。
じゃぁストレスとかに影響うけやすいものでつか？

>844
いえ、隠す程のものではないでつが。。。

一般的な遺伝子でつ。
ただ、私の実験の問題かもしれませんし。
とはいえ、ここまで発現が消えるとビックラしまつ。
ちなみに、共発現でつ。

ベクター型ってやばくない？
↓
Bridge AJ, Pebernard S, Ducraux A, Nicoulaz AL, Iggo R.
Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells.
Nat Genet. 2003 Jul;34(3):263-4.

>846
読んでみないと分からないけど、恐い。siは、interferon responseが無いのが売りなはずなのに、、、、。
ベクターだけで、蛋白の発現が減少することは、あるのかな？

論文はベクターの場合、短いインサートDNAからでもinterferon responseが起こり得ることを示唆。
このスレで書かれているのはヴェクターだけでinterferon responseこと。
論点が異なってない？

PKR KO細胞を使った実験で、普通に使われている発現ベクターにもbackbone部分にcrypticなdsDNAの発現があって、IFN responseが起こっちゃって発現が落ちちゃってるってデータあるよ。つまり、「何を今さら」ってこと。

確かに、一回だけですが実験のデータを見てみると、どのタイムコースでも、配列の有無に関わらず蛋白量が1割程度減少している気がしますが、誤差の範囲だとずっと思っていました。今後、注意深くみてみたいです。（でも、めんどくさくて定量しないこの頃）
特異的な発現抑制は、ターゲット以外の遺伝子を共発現することで確認するのがよいと、（今のところ）考えています。簡便なので。

『短いインサートDNAからでもinterferon responseが起こり得ることを示唆』する報告があるということは、コントロールはベクターではダメなんですね。
やはり、スクランブルでないといけない！と確信できました。ありがとうございます。いや、先生はベクターでいいといっていただけに、、、役立ちました。

>>851
スクランブルってなに？
あと、インターフェロンおきたら何が問題なの？

>>８５２
IFN（I型）のレスポンスで、JAK-STAT系が活性化されると,
Mx1やPKRなどのがinnate imunity 関連のタンパクが発現する。
特に、PKRはdsRNAの存在により、その下流のeIF-2αのリン酸化
活性を獲得する。そうすっと、人食い的にタンパク質合成が抑制されるってわけね。
RNAiを動かしまくっている人には釈迦に説法だったかな？

>>853
ご教授ありがとうございます。
自分は悪沈をコントロールとして人食い的な抑制は見れていないのですが
それじゃだめ？

>854
なんかずれてない？

Is HES1 coded by the same gene as h-ES1?????

>>856

どういう意味？

スクランブルは、ターゲット配列をランダムにシャッフルした配列です。
スクランブル配列を組み込んだベクターは、shRNA(short hairpin RNA)が細胞内で合成されるためより正確なコントロールなのではないかと思っています。

ヘアピンのスクランブルなんて作れるんかいな？

★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　　 ★☆

☆★体験しました？『　超過激＆かわいいイエローキャブのライブチャット登場　』 ★☆　

☆★　生ライブ中、あなたの命令で若い娘たちがヌレヌレモード＆イクイクモード　 ★☆
☆★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　　 ★☆
☆★ ・・・当然モザイクありません・・・・・アメリカ西海岸発 ・・・・・・・・ ★☆
☆★　寂しがりやの日本人留学生の若い娘たちがお待ちしております！・・・・・・ ★☆
☆★　・・もちろん、オナニー&バイブ好きの若い娘ばかり・・・・・・・・・・ ・ ★☆
☆★　・・・　あなたのチャットをお待ちしております！！・・・・・・ ・・ ・ ・★☆
☆★　・・・・・　日本人留学生のハレンチな「性」を覗いてみてくださいmase・・★☆
☆★・・・・・・・・チャット・セフレをお探しのあなた！今すぐ！ Let's Live!! ・★☆
☆★　・１０分間無料で体験できるほか７日間会費無料でございます・・・・・・・ ★☆
☆★　　　　　　　　　　　　http://www.gals-cafe.com　　　　　　　　　　　 ★☆
☆★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　★　　☆　　　 ★☆

>>855
?

>>859
作れるか？
と聞かれれば・・・作ることは可能。
実際、人工設計したランダムなshRNAライブラリーも存在するのだから。
簡単に作製するとしたら・・・
１）まずpol IIIプロモーターとランダムな19nt オリゴからなるdsDNA作製。
（合成でもPCRでもなんでもいいが、とりあえず入手できればOK）
２）片側がループになったdsDNAをligation。
　dsDNAにTTTTTなどを入れておく。
　blunt endだと1/2がセンス鎖にTTTTTが結合
　向きを固定するならbluntでないように細工
３）１と２の結合産物を熱変性でssDNA
４）両末端付近でPCR増幅

でいけると思う、理論的には（どっかでやってたの聞いたので、実際可能かと思うよ）。
回文だからPCRもクロウするだろうし、ループが長すぎないようにしないといけないけど。

最近だと100mer以上合成できるから、全合成も可能かな？
100mer以上の合成でランダム配列だとかなり偏りが出来ると思うけど、
この場合は多少偏っても問題ないだろう。

>862
すまん。
たぶん丁寧に説明してくれてると思うのだが、
オレの頭がついていけない。
そのライブラリーを使ってる論文ウpしてくれないだろうか？
リボザイムのは見た事ある（体羅氏）

>864
嫌味ではなく、分からんと思うわ。
俺も文面だけでは理解する自信ねぇ（w
論文では無いんだな（俺の知らない論文ある可能性高いけど。
864も書いている体羅氏関連ベンチャーのお話だったと思うが・・・
資料無い、ｽﾏﾝ。

もしかしてこれで分かるかな？
　AA詳しかったらもっと分かりやすくできるのだが・・・

5'-T7 promoter---random N19--- (synthetic DNA)
↓ PCR
5'=T7 promoter===random N19=== + =TTT=loop DNA==}
↓ ligation
5'=T7 promoter===random N19====TTT=loop DNA==}
↓ denature
5'-T7 promoter---random N19---TTT-loop DNA---・・・・・・・・--retomorp 7T-- 3'
↓ PCR
5'=T7 promoter===random N19====TTT=loop DNA== (parindrome)

う〜ん、ちょっと違ったかな？
ま、こんな程度のシステム適当に応用すれば可能かと思うのだが。
最近　案微温や風呂妻鹿なんかからPCRベースのsiRNAキット販売してるからこの辺応用してもランダムできるかも、
と無責任に推測。

スクランブルは、単に配列をシャッフルした形でベクターに組み混んでいる
だけですから、難しいものではないものです。合成でもメジャーなものなら
売られているのではないかな。
864さんのいうリボザイムのライブラリーをRNAiでもやろうとしていると
いう話は聞いたことがある。

iResearch
ダダ

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/hankaku09.html

＞８６６
いや、そうでなくて、
ヘアピンのスクランブルの話でしょ？
スクランブルをループでつないでも、
アニールしない。

>869
866ではないですけど、ヘアピンの両方の配列をスクランブルに
するのではなく、片方の配列で考えてスクランブルにして、
それに対する相補鎖をつくれば設計できます。
って書いても図示しないとわかりにくいかな？

それならわかりまつ。
でも８６５氏のはむつかしいでつ。

世界最強RNAi企業誕生

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/hankaku09.html

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/hankaku09.html

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

loopは、どの配列がいいのでしょうか？
microRNA由来の配列の方がいいのでしょうか？

リンパ球でやってるやついないかぁ？？

>>877
T良の論文みてね。NARだったかな？

>878
primaryはtransfection効率低いからな、、、
vectorでstableってのも容易ではないし、、、
RNAi以前にtransientでのoverexpressionさえルーティンでないから
難しいだろ。

＞880
そっかぁ。まだやり始めたばかりだから色々条件ふってみるよ。

　__∧＿∧_
　|（　　＾＾ ）|　＜寝るぽ（＾＾）
　|＼⌒⌒⌒＼
　＼ |⌒⌒⌒~|　　　　　　　　　山崎渉
　　 ~￣￣￣￣

Bridge AJ, Pebernard S, Ducraux A, Nicoulaz AL, Iggo R.
Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells.
Nat Genet. 2003 Jul;34(3):263-4.

この論文によればどの発現ベクターにも
インターフェロン応答があるってことだよな。
普通の過剰発現でもインターフェロン応答が起こっているってこと？！

http://www.39001.com/cgi-bin/cpc/gateway.cgi?id=ookazujp

＞884
846、既出だが・・・

いや、むしろ、どのベクターでも起こるのに驚いた。

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

888

自分のでインターフェロンおきてるか
手軽に調べることできませんか？

>>889
RT-PCR

人気サイト
http://pocket.muvc.net/

誰かおせ〜て
(1)Target cDNAがえらい長いとうまくいかないってことある？
(自分のは8k)何ケ所か混ぜればいいのかな？
(2)エンドやコトラを落とす落とさないは議論になってるけど、
ステーブルに出てる細胞のって落ちにくくない？
↑以上２点でドツボにはまってる(ちなみにpSilencer)
(3)PCRめそっどやってるひといる？Am美音からでてるけど。
あと別個にぱでぃそんてひとの催吐もあるが、経験者は？

>>892
　それが
　人にものを聞く
　態度か？

893の言うことももっともだが、それ以前に892はもっとわかりやすく書け。
百歩譲って謎解きしようとしても、何を教えたらいいのかわからん。

＞さすがヤクザ（８９３）。
硬派だねぇw

大変失礼致しました。
お詫び致します。
自粛します。

>892
(1)　mTOR（8ｋぐらい？）をsiRNAで落としてるのこないだ確か見たよ。
複数箇所の効く配列を同時に入れてsynergisticに働くかは、自分ので今試そうとしている。
(2)　外来遺伝子をstableに入れた細胞で、その発現を落とすってこと？
入れる前の細胞か、switching systemならoffの状態の細胞を使うのでは？
(3)　Silencer Expression Cassette てののことかな。
（http://www.ambion.com/catalog/ProdGrp.html?fkApp=25&fkProdGrp=287）
ループを発現させるという点ではこのスレの上のほうの話題と同じ問題を抱えているんだろうか。
これの修飾っての何？

ベクターだけでなんでInterferon Resが起こるんだろう？？

情報ありがとうございます。
(2)その通りでして、この状態で見たいんです。
(何故かこういう細胞だけ持っている、ちなみにエンドにはほとんど出てない)
(3)それそれそれです。MMMってなんですかね。私も疑問。

>>898
>>849を嫁

「dsDNAの発現」
意味分からない。
DNAの発現って？？？

dsRNAのtypoだろ

なるほど。
でもバックボーンから起こる転写は凄く少なそうだけど。
interferon resを起こす程、発現してるとは思えないけどなあ。
（もちろん、論文読んでないから詳細は知らない）
過剰発現された耐性遺伝子が悪さしてるならともかく。。。

>901 903
論文でも要するに明確な原因は不明。
分子メカで実際の細胞内イベントを100％説明するのに現時点で無理がある可能性大。
多かれ少なかれ発現ベクターがinterferon res起こすこと考えると、転写以外にも細胞内に外来性ds DNAが大量に導入されることに問題あるのかも。
論文でも結論は至適条件を見つけて最小限のDNAを導入しましょうとなっていたと思う。
例えばメチル化するとどうなんだろうか？
transientではinterferon res起きても、stableでは既に外来性ではない性質を持ってるからinterferon res起こるか？
などなどの研究は今まさにやられているはずだから、もう少し待てば結論でるかもね。

>899
このキットってプロトコル、webから入手できないのかな？
他の同社キットは入手できるの多いけど・・・
プロトコル見れば分かるんだけど・・・
MMM　⇒　精製のための修飾（Magnetか？）、DNA末端安定化（分解耐性）、もしくはtransfection関連か？

「プラスミドの精製純度が悪いだけ」に１２００プラスミド

みんなキットつかってるだろ？
信用できんよ。分析屋から見ればキットでとったDNAは糞

>906
セシウム超遠心で取れと？

それもいいな。
ゲルろ過というてもあるぞ
molecular cloningやcurrent protocolに丁寧に書いてある

分析屋が不満持つのも分かるが、ただし純度とinterferon resは？
純度は導入効率に影響することは事実だけどね。

既出かもしれませんが、ちょっと疑問に思ったので教えてください。
細菌（大腸菌）から精製した外来dsDNAの刺激でType-1 IFN (IFN-alha/beta)が
応答するのは、Toll-like receptor (TLR)-9を介してNF-kappaB系などに刺激が
入るからなのでしょうか？
もしそうであれば、dsRNAの場合はTLR-3からシグナルが入ることになるし。
（TLR Familyの発現は培養細胞の種類によって違うので、endotoxinに対する感
受性が細胞によって異なるように、これらの核酸に対する応答も細胞によって
違うのかもしれませんが）
単純な疑問なのですが、どなたか詳しい方、御教示お願いします。

>910
勘違い。
TLRの作用も完全に無いとは言えない、また確かにTLR4などがIFN応答するのも事実。
しかし、ここで問題となっている反応は主として、細胞内に無理やり押し込められた
細胞内での外来2本鎖核酸の刺激によるもの。
典型的な例としてはdsRNAなどによるPKR活性化。
要するに細胞がウイルスなどに感染したと勘違いして遺伝子発現を抑えようとするのだね。

硬↑
　｜ウン鉄
　｜ウン岩
　｜ウン石
　｜ウンゴ
　｜ウンコ
　｜ウンチ
　｜ウンチョ
　｜ウンニョ
　｜ウン汁
　｜ウン水
柔↓

らしいです。
これを言っていたのは僕の中学二年の時の担任でした。
わざわざ授業（社会科）を中断してまで力説してくれました。
その先生はちょっと頭のネジの外れた人で、自らを”神”と呼んでいました。
文化祭のときに展示と演劇両方やる！と言い出し挙句の果てにコンドーム入れ
を配るような破天荒な教師でした。（テーマがAIDSだったので合ってる事は合ってる）
クラスの皆は何かあると連帯責任で放課後机の上に正座させられたりしました。
今となってはいい思い出です・・・

というかウンコの硬度て。まあ硬ければ硬いほど産みの苦しみも大きいけどな。
しかしまぁ、
「どうしたの？」
「いやちょっとウンニョしてきただけ」
という風に会話の表現の幅が広がるのはいいね。
実際使うかどうかというのは抜きにして。

>912
おもしろくない

>911
そうか？細胞内でTLRは機能せず、
膜状に出て初めて機能するというデータがあるのか？
910の言ってる事は勘違いとは思わんが。

>914
TLRって細胞外受容体だよね、一応。
確かに受容体も細胞内でリガンドと結合して機能・・・って可能性無いとは言わないけど。
TLRも細胞内でHspなんかと相互作用してるらしいし。
ただし、RNAiのケースでは一般的にTLRを考えてるヒト少ないのも事実。
多くはdsRNA activated Protein Kinase (PKR)のような細胞内因子で説明されている（それで十分かは不明だが）。
もし証明できれば論文になるよw

ただRNAiでよく使われているHEKなどの細胞にTLR発現してたっけか？

>>914
膜のトポロジーって分かってるか、おまえ。

>916　
それで細胞内のTlRは機能を持たずdsRNAを認識できないと？
完全な答えになってない。

間違った。l→Lね。

落ちついて冷静に！
まず910の質問はそこまで深い意味では無いのでは？
と思ったので、まずは×、でいいよね？
910はそれ以上の質問だったら別の可能性も示唆するけど。。。
917は推測かい？
それとも何か示唆する情報ありかい？
例えばTLRの細胞内での機能などについて。
特にそれがPKRではなくtransfectionされた2本鎖核酸などに強く反応する主たる経路の可能性についても。

追伸
ここはTLRではなくRNAiのスレなので、RNAiによるIFN応答介在性非特異的反応を目的に議論しましょう。

そんなデータがあったらこんなとこで書かないだろ。

911さん、大人の対応ですね。
細胞内って言うから曖昧になって、>>914とか>>917みたいなことを言うヤツが出てくるんでは？
RNAiで問題になっているのは「細胞質」のdsRNAで、TLRは細胞内って言ったってERやゴルジに乗っちゃってるんだから。
TLRが細胞質側でdsRNAを認識してるなんて話がホントなら、NatureでもCellでもお好きにどうぞって程のネタなんだから、>>917みたいなこと捨て台詞でも言ってると恥ずかしいよ。

917のサポートではないけど、910のアイデアは面白いかも。
素人（？）発想には意外なヒントの可能性ある。
脂質につつまれたDNAなどが細胞内のTLRを刺激し、TLR下流に存在するPKR活性化に結びつく・・・
という可能性は否定できないかも、というのは面白いかな？
誰も現時点で発現（RNAi）ベクターの非特異反応をうまく説明できていないのも事実。
まぁ、そう言っても世の中この程度の発想誰かが気付いているから、
事実なら半年以内に論文になるだろ（藁
Dr.アキラとか好きそうなネタだし。

↓ここに詳しくのっていたよ（＾＾
http://osusume.zero-yen.com/%7E/news05.htm

>924
ﾜﾛﾀ、絶妙のタイミング。
無関係ｼﾞｬﾝ、ﾎﾞｹｪ（お約束）

910です。
みなさん、良質な議論を展開してくださってありがとうございました。
当方、細胞（質）内寄生性の病原細菌が、感染した食細胞を刺激して初期免疫応答
を惹き起こすメカニズムを研究しています。
培養細胞の感染系にRNAiによるgene supressionも利用しようと思ったのですが、
こちらのスレでIFN responseという現象があることを知りました。
上述の初期免疫応答には、IFN-alpha/betaも含まれているのですが、解析の対象
となるサイトカインの発現に同様なシグナル系を介して影響してしまうのでは、
ちょっと問題があるので、現在のところ、どういうメカニズムが考えられている
のか知りたく質問させていただきました。

細胞質内外に関しては、私も多少考慮したのですが、
（１）transfectionなどによって外来DNA/RNAが取り込まれるメカニズムが
　　　エンドサイトーシスなのかダイレクトな膜融合なのかで、TLRと会合
　　　しうる機会があるかどうか決まる
（２）transfection試薬で処理しても、脂質/糖質と複合体を形成しなかった
　　　フリーな核酸も多少は存在し、それらも一緒にtransfectionの系に添加
　　　される
などの細かい理由から、TLRの可能性もあると思ったのですけど、実は専門家の
間ではとっくに否定されてる、あるいはナンセンスな話なのかな？　っと疑問に
思ったわけです。

RNAiは研究上有力なツールだと認識していますので、自分でももう少し文献を
あたって、この系にもRNAiが適用可能か検討してみようと思います。
みなさん、本当に感謝です。

>>923　（素人ついでに）
細胞質に限っていえば、TLR同様LPSを認識しうるNODのFamilyが関与している
可能性とか、どうなんでしょう（根拠のない発想ばかりで申し訳ないですが）。

なるほど、TLRは専門なんですね（失礼！）。
素人（？）と言ったのはRNAiに関してなので・・・

実は私も少し免疫かじってるのですが、最近少しご無沙汰なのでNODは詳しくは？？？
LPSのようなバイオポリマー認識するといってもNODに核酸認識能あるんだっけか？
いずれにしてもPKRだけで十分かは分かってないと思う（？）し、細胞が感染防ぐメカは複雑なinnate immunityシステムになってる可能性も否定できないかもね。

ちなみにここで問題になってるのはベクタータイプなので、そちらの実験にはオリゴで十分でないの？
それだったらIFN応答あんまり問題にならないかもよ。

ちょっと話にわって入って悪いですけど、
もっとテクニカルな話もしてほしいでつ。
例えばdsDNAでトランスフェクションしたときに起こるIFresが
どういうサイドエフェクトを引き起こすので、
こういう実験系ではマズイとか、
IFresを起こさないようにする工夫とか。。。
御存じの方お願いしまつ。

>>922
>TLRは細胞内って言ったってERやゴルジに乗っちゃってるんだから。
１００％ERやゴルジに乗ってると言い切れる？cytomlasmにフリーのTLRがあれば？
だから>>917で完全な答えじゃない。って書いたんだよ。
まあ、あくまで妄想の範囲内ではあるが。

>929
それはまた・・・
無益な言い争いは避けたいのだけど、ちょっと強引だって。
929は他を煽ることになる可能性が高いなぁ〜
だって1回膜貫通受容体がcytomlasmでフリーの状態で機能してる例なんて報告無いと思うが。
ホントなら正にどの雑誌にも投稿できるネタになるんだけど・・・
シャペロンってのはERやゴルジに乗った状態で機能するんだっけ（勘違い？？？）。
むしろ可能性ではそっちの方が（ry

>928
テクニカルな話題では無いようなw

IFresについてはログ読みましょう、少し前なので。
大体、大まか論文にも書いてあるし、それが分かってなければ議論できないのだが？
むしろ論文に書けない詳細は誰にも不明ってことだ（正確なメカとかな）。

作用メカが完全に理解できていない以上、実験上での注意・工夫などできないのだけど・・・
ベクター実験に関して敢えて言えば、前述の文献通り、至適条件見つけて導入DNA量を最小にすることぐらいしか誰も答えれれん、
と思うが。
むしろ、敢えて実施する理由なければベクターを使わず、オリゴもしくはPCR産物でのsiRNAをするべきだろな。
現時点でベクター使用の理由はstable以外殆ど無い（安価な点も）。
transientではベクター使用しない方が無難。

>>923
このような現象に疑問を持ちメチル化したプラスミド使ってみたらNF-
ｋB活性化が抑制された。でも本当にCpGのメチル化非メチル化を細胞質
か膜型タンパク質かわからんけど直接の相互作用の証明が僕のレベルでは無理だと感じたので棚上げになってしまった。いわゆるPAMPsとTLRみたいなタンパク質のLRRとの直接作用しているという証明はいまだないのでしょうか？ちょっと板違いですまん。

ﾂﾞｪﾉﾌｧﾝｸﾂｮｿ共同研究を大学に公募したそうじゃないか！？

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/hankaku08.html

あげ

>926
ペプチドグリカンの構成成分であるMDPがNODを介してRip2-NFkBを活性化する。プラスミドにペプチドグリカンはどのぐらいコンタミしているのだろうか？
>932
大腸菌から精製したプラスミドはTLR9のagonisitとして作用するから、931の言うようにtransientでベクター型は使用しない方が無難と思う。

みんなsiRNAに標識してる（FITCとか）？

法則に例外が存在するだけでも「法則」としては失格となる。
それにもかかわらず、メンデルが発見されたとされる「遺伝の法則」は例外だらけである。
したがって、「遺伝の法則」は実際には存在していない「幻の法則」である。

ソース
http://www1.kcn.ne.jp/~mituto/mat.htm
http://www1.kcn.ne.jp/~mituto

　　　 　∧＿∧　 ∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ　（　 ・３・） (　　＾＾ ） ＜これからも僕たちを応援して下さいね（＾＾）。
　　＝〔~∪￣￣￣∪￣￣〕
　　＝ ◎――――――◎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎渉&ぼるじょあ

てゆーか

で、結局の所はRNAiって何なのよ？

Hes1 is a target of microRNA-23 during retinoic-acid-induced neuronal differentiation of NT2 cells.

http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

致死遺伝子でなければKOした方が早いかもね。

KO1年かかるよ

最低で一年って感じ？
でも、RNAiってサイドエフェクトあるでしょ？
完全に特異的に抑える事は難しいし。
信頼性のあるデータ出すなら結局KOがいいかと。

体験しましたか？『超過激＆かわいいイエローキャブのライヴチャット登場』
生ライヴ中、あなたの命令で若い娘たちがヌレヌレモード＆イクイクモード　
当然モザイクはありません・・・アメリカ西海岸発・・・・・☆
１０分間無料で体験できるほか７日間会費無料・
http://www.gals-cafe.com

>>933
はずれた

>948
うちはあたりましたがなにか？

>>949
なにやるの？

KOならサイドイフェクトがないとでもいいたげな。

一番の問題はな、KOは細胞（in vitro）で実験できんことだ。
細胞でも簡単にKOホモできるのならRNAiなんて殆どメリットないのだが。

>952
MEFとれ

>953
そう言う香具師もいると思ったが（藁
１）時間がかかる（細胞なら数日）
２）細胞タイプが限定
３）lethalityの問題（発生段階かなり初期での）
４）特殊な設備・技術が必要
などで将来的には細胞（in vitro）はRNAiに期待。

や、「細胞で実験できん」とあったので。(w

致死遺伝子の場合は確かに普通の手ではどうしようもないが、
それもCre-lox系を使うなりTet-On/Off系を使うなり、
工夫次第で解決できると思われるよ。

金と手間と技術が必要で外れたらダメージデカいのが
KOの最大のデメリットだが、当たれば他で手に入らない材料が
得られる分、旨味もデカい。
うまく用途で使い分けたいものだ。

>KOならサイドイフェクトがないとでもいいたげな

実験上のサイドエフェトの話ね。
ノックアウト作った事ないから確信はないけど、
一応単一遺伝子を潰していて、
それ以外のゲノムには傷が入ってないんだよね？

RNAiの場合は、おそらく他の遺伝子も抑制しているように思うのだが。
トランスフェクションによる効果も無視できないだろうし。
特異性高いって言っても、完全に特異的にするのは無理じゃないか？

Cre-lox、Tet-On/Off系って
最初期待されたほど汎用性あるんかいな？
実際、使ってる香具師なんて極一部。

むしろTet-On/OffとRNAiの組み合わせに期待してるのだが。

>957
どう組み合わせる?
もし差し支えなければ聞かせてくれ。

http://homepage.mac.com/hiroyuki45/

>956
確かに、KOは単一遺伝子のみを破壊してるから（ほんと？）、
RNAiのように非特異的な阻害を心配する必要はない罠

ルーズのはき方が街を歩いている女子校生並にマッチしています。
顔は少しふけ気味ではありますがなぜかセーラー服がよく似合います。
こういうなんちゃって女子校生もたまにはいいでしょ？
オマンコの具合はよさそうだし・・・
無料ムービーはこちらから
http://www.pinkschool.com/

みんなぐちょぐちょだよ♪
今だけ会費全額無料なので入会してね♪
http://e-rebirth.com/af/in.cgi?id=30

>958 どう組み合わせる?
いやいや、具体的じゃなくて単なる期待。
でも実際にやってるのは間違いないらしいよ。
オレも強調して質問したのだがpol IIIプロモーターにもtet使えるって。
あと上にもあったと思うが、理研のDECAPってベクター知ってる。
pol IIIで無くてもいいらしいから、できるのかも？

って程度の内容だけど、まず1年以内に論文でるんじゃない、
誰でも考えることだから。

>963
要はTetONでRNAiのStable取ってinducibleな系作るってことで?
それならいけるかな。
うちでも似たようなの作ってるし。
#まだpaperになってないので書けない。すまん。

　　　 (⌒V⌒)
　　　│ ＾ ＾ │＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
　　⊂|　　　　|つ
　　　（＿）（＿）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山崎パン

tetシステムって使えるの？
IPTGよりも？

IPTGなつかすい

やっぱり、みんなオンオフのシステム欲しい？

http://homepage.mac.com/hiro139/

女の子も勉強になるよ！
http://homepage3.nifty.com/manko/

http://homepage.mac.com/yamazaki8

ちょっこっとRNAｉについて雑誌で読みました
World food & bio News , may 2003
ハエではdsRNAを発現させた大腸菌付ｴｻを食べさせるとのことですが
当方植物系なのでよくわかりません。
ハエのどのような部分で発現するんでしょうか？
菌が細胞に取り込まれる？わけないですよね？

現役女子高生ですが、相当遊んでいるのでしょう。
性感帯はかなり敏感でアヘアヘ状態です。少し淫乱系なのか、快楽に対してかなり貪欲です。
ビラビラなども肥大気味で性生活を垣間見ることができます。
騎乗位で挿入されながらクリトリスを剥き出しにするシーンは個人的に気に入りました。
結合部のアップシーンが豊富で非常に楽しめる作品です。
援交女オンリー
今すぐ無料ムービーをゲット！！
http://members.j-girlmovie.com/main.html

いくつか有料情報を買ってみましたが、
どれも同じような内容で、素人の私にすぐにできるものは
ほとんどありませんでした。

その中でも一つだけとても使える技があったので紹介します。
間単にできると書いてあったので、はじめてみたのですが、
私自身とてもびっくりしました。
気軽にできると思いますので試してみてください。
やり方は簡単です。
�@下記のURLでＩＤを取得。(完全無料)
住所・電話番号など個人情報は必要ありません！フリーメールで登録可能です
�A宣伝広告のＵＲＬが送られてくるのでそれを２ちゃんに貼る。
�Bあとは待つだけで勝手にいろいろな人がクリック数してくれたり登録してくれた

りでどんどん儲かります。
そのURLは
http://www./index.cgi?id=1061228008
http://www./addclickport.cgi?pid=1061228008（コピペで飛んでください）


これ続けてたら絶対儲かるはずです。
私もまだ少しですが儲けています。
登録し終わったら、私と同じようにいろんな掲示板に張り付けたるだけでお金にな

ります

>972
feeding method
C.elegans

laevisで誰か導入した人いないの？
発生系で試したいんだけど。
教えて下さい。

最近カキコ少ないね。
ところで、このところ、IFNレス関係の報告多くない？
一時期このスレでも話題になったけど。
どーなんだろ。

例えばどんなの？

age

ttp://www.jij.co.jp/news/bio/art-20030826190421-OAGBJYTLWY.nwc

>978
Nat Cell Biol.2003/Vol 5/Number 9/pp 834　とか。

このスレのどこかで誰かが警告してた事が
いよいよ真実味を帯びてきたわけね。

>>981
あの論文は今まで言われていたことを一気にまとめたという感じだね。
これでIFNがからんだRNAi論文はクズ同然だろうし、他の論文もRNAiだけの
事象じゃ相手にされなくなるかも。