**一番切れない制限酵素**
1 ：名無しゲノムのクローンさん：
安いものほど良く切れる！
高い奴ほど全く切れない！
しかも、買った当初からチューブのそこに「辛うじてある？」程度の量しかない！
今まで使った制限酵素の中で一番切れないのを上げてみよう！
高い奴ほど全く切れない！
しかも、買った当初からチューブのそこに「辛うじてある？」程度の量しかない！
今まで使った制限酵素の中で一番切れないのを上げてみよう！
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2 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 07:50
SfiI
3 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 09:05
メジャーなのに性根悪いのはKpnIだな。東洋紡のはやたらスメアになる。
見捨ててNEB使ってた。
見捨ててNEB使ってた。
4 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 19:21
PmeI
5 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 19:54
>メジャーなのに性根悪いのはKpnIだな.
そりゃ、plasmidのprepの残留塩だよ。
70% EtOHでよく洗えば切れるようになる。
そりゃ、plasmidのprepの残留塩だよ。
70% EtOHでよく洗えば切れるようになる。
6 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 20:25
新人が入ってきて２ヶ月ほどから切れが悪くなる。
7 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 21:20
>>6
100点満点
100点満点
8 ：3：01/10/15 21:23
9 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/15 21:33
ProK
10 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/16 00:48
NdeI
11 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/16 01:10
どのメーカが良い？
とーよーぼー？neb？
とーよーぼー？neb？
12 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/16 06:19
TOYOBOは悪い
NEBはそれに比べて良い気がする。
Promegaの酵素は外れた事が（今の所）ない。
タカラは標準的な気がする。
うちのラボはタカラが多いからかも知れないけれど。
NEBはそれに比べて良い気がする。
Promegaの酵素は外れた事が（今の所）ない。
タカラは標準的な気がする。
うちのラボはタカラが多いからかも知れないけれど。
13 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/16 22:26
>>6
禿しく同意
禿しく同意
14 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/16 23:07
KpnI,SfiI,MboIは長持ちしない。
15 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/16 23:23
＞KpnI
ホント？
一年前の使ったけど切れたよ、、ちなみにタカラ
ホント？
一年前の使ったけど切れたよ、、ちなみにタカラ
16 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/18 00:33
昨日KpnI使った。
このスレ見た後だからちょっとひんやりした。そして切れなかった……
Lバッファー使用の癖に、スター活性があるなんて嫌いだぁ！！
このスレ見た後だからちょっとひんやりした。そして切れなかった……
Lバッファー使用の癖に、スター活性があるなんて嫌いだぁ！！
17 ：名無しゲノムのクローンさん ：01/10/29 22:13
KpnI(NEB)に一票。
18 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/29 22:26
通はKpnI site切る時は、Asp718を使う。
これ最強。問題無くなる。良く切れる。
でも5'凸だから気を付けてね。
これ最強。問題無くなる。良く切れる。
でも5'凸だから気を付けてね。
19 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/30 19:34
>>18
って、何で？
って、何で？
20 ：名無しゲノムのクローンさん：01/10/30 19:45
NdeIも残留塩や大腸菌残骸由来低分子に弱いみたいだね
ってNEBのカタログにかいてあるね。
キットをつかって精製すれば、よく切れるようになるよ！
ってNEBのカタログにかいてあるね。
キットをつかって精製すれば、よく切れるようになるよ！
21 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/01 23:36
うちもNEBのKpnIだけれど切れないなぁ。
たからにしてみるか。
たからにしてみるか。
22 ：ば：01/11/01 23:50
EcoR69(シックスナイン）
23 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/02 13:05
SalI
24 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/02 13:20
おれもKpnIじゃなくてAsp718を使う。本当に最強。
高塩濃度で使えるから、mini prep後でも塩の影響を受けにくいだけでなく
double digestionもしやすい。
使いにくい酵素AccI
SalIも切れるのでうっとうしい。
MscI Dam Methylaseによくひっかかる。
どう？
高塩濃度で使えるから、mini prep後でも塩の影響を受けにくいだけでなく
double digestionもしやすい。
使いにくい酵素AccI
SalIも切れるのでうっとうしい。
MscI Dam Methylaseによくひっかかる。
どう？
25 ：ﾌｫﾙｱ!!：01/11/02 15:54
Kil893IIに決まってるだろが。
26 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/02 16:10
ﾌｫﾙｱ!!さんへ
本当にそれつかわんとあかんかったの？
ストらてじーの敗北ちゃうかー。
本当にそれつかわんとあかんかったの？
ストらてじーの敗北ちゃうかー。
27 ：名無しゲノムのクローンさん ：01/11/02 19:03
SaIIは切れるじゃろう、>>23
28 ：ﾌｫﾙｱ!!：01/11/02 19:36
29 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/02 20:22
>27
SalIは認識サイトの周りの配列によっては切れにくくなるよん 塩を足すと活性が上がります。
SalIは認識サイトの周りの配列によっては切れにくくなるよん 塩を足すと活性が上がります。
30 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/03 00:59
>>28
面白くないよ。
面白くないよ。
31 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/03 01:25
>>29
スター活性高まりそうだな。平気？
スター活性高まりそうだな。平気？
32 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/03 01:29
Kpn?氓ﾉ一票。
この酵素とこの酵素の切れ目はくっつくっての教えて下さい。
この酵素とこの酵素の切れ目はくっつくっての教えて下さい。
33 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/03 12:46
昔のTakaraのカタログには書いてあったけど。
34 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/03 13:03
NEBのカタログがこの手の酵素についての情報ではいちばんでしょう。
酵素数も多いし勉強になるよ。
酵素数も多いし勉強になるよ。
35 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/10 12:54
コンストラクション続行中age
36 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/10 15:12
ZipFX。
ベリー、キレテナーイ！
ベリー、キレテナーイ！
37 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/10 16:43
Nde I なんか切れ残りが多い控訴だのう。
メジャーな控訴の中では、Xho Iかのう。
意外に目地れーしょんがきついのは、Xba Iかのう。
メジャーな控訴の中では、Xho Iかのう。
意外に目地れーしょんがきついのは、Xba Iかのう。
38 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/10 20:50
スロンビン。これが切れにくい。
39 ：実験医学：01/11/10 22:03
Acc65I
NdeIの哀訴才ぞまー
NdeIの哀訴才ぞまー
40 ：実験医学：01/11/10 22:07
２００U(6000円）相当使って４時間で１０μgのうち半分しか斬れん
3000円返せ！NEBよ
3000円返せ！NEBよ
41 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/11 03:26
>40 で、
なにが。
なにが。
42 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/11 04:10
（ふかわりょう風に）
お前のDNA、なんかすっぱいな！ >>40
お前のDNA、なんかすっぱいな！ >>40
43 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/15 01:00
各社のバッファー組成が微妙で、ダブルダイジェスチョンの時悩む。
BSA淹れるのはどうよ？
BSA淹れるのはどうよ？
44 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/15 15:26
↑
面倒くさがらずにフェノール抽出・エタ珍して次切れよ
面倒くさがらずにフェノール抽出・エタ珍して次切れよ
45 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/15 21:27
折角のプラスミドをロスってしまうし。
46 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/15 21:39
自分でバッファー作れよ。
47 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/15 23:46
XmnIに一票
48 ：ななし：01/11/16 00:09
ScaI。切れにくい。
BamHI へたってスター活性が出やすい。よく切れるが。
あと、高温で切る酵素はあまり使いたくないな。
BamHI へたってスター活性が出やすい。よく切れるが。
あと、高温で切る酵素はあまり使いたくないな。
49 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/16 01:06
ClaIでちっともプラスミドが切れません。
インサートをPCRしたときはきちんと切れたのにー
もちろん、ネタですが。
インサートをPCRしたときはきちんと切れたのにー
もちろん、ネタですが。
50 ：ななし：01/11/16 01:11
ネタだねぇ。初心者がよく落ちるワナ。
51 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/16 01:26
うちのBamHI、全然切れなくなっちゃった… なんでだろ…
EcoRIと一緒にしとくとインサートが見えるので切れてるような気がするんだけど、
で、EcoRI bufferとBamHIだとやっぱ切れない… 昔は切れたのに… なんでだろ…
水でQiaPrepから流しだしたプラスミドでも切れないし… 捨てるしかないか…
#同室研究者の「緑コロニーばっか」発言と状況が一致
EcoRIと一緒にしとくとインサートが見えるので切れてるような気がするんだけど、
で、EcoRI bufferとBamHIだとやっぱ切れない… 昔は切れたのに… なんでだろ…
水でQiaPrepから流しだしたプラスミドでも切れないし… 捨てるしかないか…
#同室研究者の「緑コロニーばっか」発言と状況が一致
52 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/16 03:01
BamHI siteがもともと無いんだろ。
53 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/16 17:12
頼むGよ、酵素を水で薄めて返却するのは止めてくれ。
あんたもういい年なんだから、過剰量主義は卒業してくれ。
うちのラボは酵素が出荷時よりも増えて、しかも凍る。
それもあんたが使った後に限ってだ。みんな酵素が切れなくて困ってるんだよ。
お願いだから目を覚ましてくれ。1マイクログラムのDNAきるのに50unit
の酵素は入れすぎだってば。
あんたもういい年なんだから、過剰量主義は卒業してくれ。
うちのラボは酵素が出荷時よりも増えて、しかも凍る。
それもあんたが使った後に限ってだ。みんな酵素が切れなくて困ってるんだよ。
お願いだから目を覚ましてくれ。1マイクログラムのDNAきるのに50unit
の酵素は入れすぎだってば。
54 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/16 18:37
↑酵素は切れないけど、俺は切れるね。
55 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/16 18:40
>54
怒りっぽい人は嫌い カルシュウムとってる？
怒りっぽい人は嫌い カルシュウムとってる？
56 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/16 18:44
>>53
on iceでずっとフタ開けっ放しにして結露したのでは？
on iceでずっとフタ開けっ放しにして結露したのでは？
58 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/21 21:11
SalI
59 ：名無しゲノムのクローンさん：01/11/22 00:42
60 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/04 00:39
EcoRIのスター活性ってどれくらいなんだろぅ。
61 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/04 09:15
一番切れそうにないもの、手を付けちった後輩理系DQN女との縁
一番切れそうになるもの、バカ教授とのディスカッション
一番切れそうになるもの、バカ教授とのディスカッション
62 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/04 11:48
バカは自分と心得よ。
63 ：名無しゲノムのクローンさん：01/12/08 00:49
制限酵素は、時々こっちの心を読んでいるのではないかと思うくらい、日和見で切れる。
焦っているときに限って切れない。
焦っているときに限って切れない。
64 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/02 16:35
はじめまして
ゲノム研究をしたことがありません
大変興味があります
制限酵素って何ですか
わかりやすく教えてください。お願いします。
ゲノム研究をしたことがありません
大変興味があります
制限酵素って何ですか
わかりやすく教えてください。お願いします。
65 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/02 17:41
制限酵素とは、簡単にいうと塩基配列の特定の配列を認識して切断する酵素です。
例えば Eco RI なら GAATTC とか。
それぞれの酵素で認識する配列が違うから、DNA の好きなとこを切ったりできるよ。
あと、同じ切り口でくっつけたりするのも可能なんで（リガーゼとかで）好きに配列をいじれるよん。
例えば Eco RI なら GAATTC とか。
それぞれの酵素で認識する配列が違うから、DNA の好きなとこを切ったりできるよ。
あと、同じ切り口でくっつけたりするのも可能なんで（リガーゼとかで）好きに配列をいじれるよん。
66 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/03 11:25
ちいさなDNAや制限酵素をどのように触ってどのように配置するとか
知りたくなったのですが
知りたくなったのですが
67 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/04 11:43
＞６６
実際に扱うときは、いずれも溶液の形で扱います。
濃度が分かっていれば、精密なピペットではかることで任意の量を取り扱えます。
実際に扱うときは、いずれも溶液の形で扱います。
濃度が分かっていれば、精密なピペットではかることで任意の量を取り扱えます。
68 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/04 17:43
Xba1のDamメチレーションにひっかかった事があります。
>>32
こんぱーちぶるはNEBのカタログに出ているはずです。かなり詳しく。
私はBamH1/Bgl2とSal1/Xho1の２パターンくらいしか使いませんが。
>>32
こんぱーちぶるはNEBのカタログに出ているはずです。かなり詳しく。
私はBamH1/Bgl2とSal1/Xho1の２パターンくらいしか使いませんが。
69 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/04 17:55
ユニット当たり値段の高い酵素が切れにくかったりすると、
腹立ちますよね。
まだ名前が挙がってないようですが、もとNEBの子会社だった
FERMENTAS（たしか和光から入手可能）が安価。
Acc65I（KpnIサイトを５’突出で切ります）もそこの酵素です。
（NEBは転売してるのだ）
腹立ちますよね。
まだ名前が挙がってないようですが、もとNEBの子会社だった
FERMENTAS（たしか和光から入手可能）が安価。
Acc65I（KpnIサイトを５’突出で切ります）もそこの酵素です。
（NEBは転売してるのだ）
70 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/04 23:16
高い方が切れない。
これ常識
これ常識
71 ： ：02/01/05 23:14
ドイツではFERMENTAS/MBIがメジャーです。でも、独自のアイソシゾマーが多いので、混乱するぞー。
XhoIはライゲーション効率が悪いなあ。あとSal Iも時々。
NEBのSal Iは切れが良くないのでTAKARAのを使っていたなあ。
XhoIはライゲーション効率が悪いなあ。あとSal Iも時々。
NEBのSal Iは切れが良くないのでTAKARAのを使っていたなあ。
72 ：胴圍：02/01/05 23:24
たからのさるわんはさいきょう
73 ：アイソシゾマー当て：02/01/05 23:38
>>72 な～、そう思うやろ！
問題：以下のFERMENTASのアイソシゾマーとプロトタイプとなった酵素を対応させよ。
FERMENTASの酵素：BcuI, Bsp68I, Bsu15I, Cfr42I,Eco32I, Eco52I, Eco91I, Eco130I, Eco147I, Mph1103I,PaeI,PdiI
プロトタイプ：AvaIII, BstEII, ClaI, EcoRV, NaeI, NruI, SacII, SpeI, SphI,StuI, StyI, XmaI
全然わからへんぞ～、ｺﾞﾙｧ！
問題：以下のFERMENTASのアイソシゾマーとプロトタイプとなった酵素を対応させよ。
FERMENTASの酵素：BcuI, Bsp68I, Bsu15I, Cfr42I,Eco32I, Eco52I, Eco91I, Eco130I, Eco147I, Mph1103I,PaeI,PdiI
プロトタイプ：AvaIII, BstEII, ClaI, EcoRV, NaeI, NruI, SacII, SpeI, SphI,StuI, StyI, XmaI
全然わからへんぞ～、ｺﾞﾙｧ！
74 ：15時間待っている男：02/01/06 00:55
XL1-Blue 増えるまで暇なんで。
BcuI...SpeI
Bsp68I...NruI
Cfr42I...SacII
Eco32I...EcoRV
Eco91I...BstEII
Eco130I...Styl
Eco147I...StuII
PaeI...SphI
PdiI...NaeI
あと、わかる人、よろしく。
BcuI...SpeI
Bsp68I...NruI
Cfr42I...SacII
Eco32I...EcoRV
Eco91I...BstEII
Eco130I...Styl
Eco147I...StuII
PaeI...SphI
PdiI...NaeI
あと、わかる人、よろしく。
75 ： ：02/01/06 01:20
Competent Cell作り？だったらXL2-Blueの方が効率良いと思うが。
あんたエライ！そこまでの正答率１００％！そちらのラボでは、日本では多分珍しいFERMENTAS使ってるん？
あんたエライ！そこまでの正答率１００％！そちらのラボでは、日本では多分珍しいFERMENTAS使ってるん？
76 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/06 04:44
ちょっと質問。
メチル化DNAの影響を受けないPstIのIsoschizomerってありませんか？
メチル化DNAの影響を受けないPstIのIsoschizomerってありませんか？
77 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/06 07:31
ニッポンジーンの制限酵素を使っている人いる？
TakaraやToyoboに比べるとあまりにマイナーなので
注文するのをためらってしまうのだが・・・
TakaraやToyoboに比べるとあまりにマイナーなので
注文するのをためらってしまうのだが・・・
78 ： ：02/01/06 07:33
Age Iを前のラボで使っていた。当時は確かあそこからしか入手できなかった。
他の酵素も時々使っていたが、特に問題なかった。
他の酵素も時々使っていたが、特に問題なかった。
79 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/06 13:09
ファーメンタスって何？
80 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/06 17:54
>>79
元NEBの子会社で、今は独立したバイオ会社。
リトアニアに本社があります。製品はまあまあ
安定しており、制限酵素以外にも使える酵素
など多数あります。日本でも一部代理店が輸入してる
はずです。（和光とか）
カタログがこれ意外にもよいです。これだけでも
入手されては。
ちなみに当方は当企業とは全く関係のない、
海外研究者です。
元NEBの子会社で、今は独立したバイオ会社。
リトアニアに本社があります。製品はまあまあ
安定しており、制限酵素以外にも使える酵素
など多数あります。日本でも一部代理店が輸入してる
はずです。（和光とか）
カタログがこれ意外にもよいです。これだけでも
入手されては。
ちなみに当方は当企業とは全く関係のない、
海外研究者です。
81 ：79：02/01/07 12:37
<<80
レスありがとうござい～。
分子生物学に興味を深く持った（一生をかけて狂牛病の撲滅をやりたいと思って）
ものの、僕はまだ大学にも入ってない素人です。
バイオテクノロジーにはどれくらい種類があり（分子生物学とかプロテオミクスとか）
研究費がドレくらいかかり
研究はどれくらい盛んなのか、どこで盛んなのか教えてください
それで、そのカタログはどうやって得られますか？研究手順やらも教えてくれたら
うれしいです。
レスありがとうござい～。
分子生物学に興味を深く持った（一生をかけて狂牛病の撲滅をやりたいと思って）
ものの、僕はまだ大学にも入ってない素人です。
バイオテクノロジーにはどれくらい種類があり（分子生物学とかプロテオミクスとか）
研究費がドレくらいかかり
研究はどれくらい盛んなのか、どこで盛んなのか教えてください
それで、そのカタログはどうやって得られますか？研究手順やらも教えてくれたら
うれしいです。
82 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/07 17:06
>>81
とりあえず、君は一生大学に入らないほうが良い
とりあえず、君は一生大学に入らないほうが良い
83 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/07 17:18
84 ：79：02/01/07 19:10
ごめんなさい、むかしのくせがでた。
いぎりすですか、どうも
いぎりすですか、どうも
85 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/07 23:46
ゲノムライブラリー作ろうとしてるんですけどNruIって切れ具合どうですか？
86 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/08 00:16
うちの大学の教授は朝から切れまくり。
だけか切れないようにできないか？
だけか切れないようにできないか？
87 ： ：02/01/08 00:19
メチラーゼでその教授を処理しろ。
Nru Iは、自分の経験ではあまり切れが良くなかったような。
Nru Iは、自分の経験ではあまり切れが良くなかったような。
88 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/08 00:23
Bal I は扱いにくい印象ですが、どうですか。
Kpn Iって、そんな難しいですか？
TaKaRaでもNEBでも、切れなかったこと皆無ですが。
Kpn Iって、そんな難しいですか？
TaKaRaでもNEBでも、切れなかったこと皆無ですが。
89 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/08 00:30
Bal IはNEBのイソシゾマーを使っていたが、プラスミド切る分には問題はなかったなあ。
Kpn Iも普通の切り張りで特に問題を経験したことはないな～。
Kpn Iも普通の切り張りで特に問題を経験したことはないな～。
90 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/08 02:38
91 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/08 04:40
多分NEBのSfaN I当たりではないかと思われ。
92 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/08 13:53
TOYOBOのMnl1は500Unitsで134,000yenだ。
93 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/08 21:06
>>92 NEBやFERMENTASのMnl Iを使えば？
1Unit当たり300円弱だから、まだ上がある。
1Unit当たり300円弱だから、まだ上がある。
94 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/09 02:15
>>77ニッポンジーンも随分早くから制限酵素に手をつけてたような・・・？
95 ：79：02/01/09 10:27
断片的な記憶で育ったから大学で何やってるかわからなかった。神学でもしてるかと思った。
僕がアフガン情勢をいじった気がしてならないんだけど。あの情報戦しょぼかったね。
秘密事項を守る自信はありますと言ったら面接大丈夫かな
社会的、組織的に重大なことにきづいた精神病の病み上がりなんだけど
人並みの付き合いができたら大学までは大丈夫ですか？
僕がアフガン情勢をいじった気がしてならないんだけど。あの情報戦しょぼかったね。
秘密事項を守る自信はありますと言ったら面接大丈夫かな
社会的、組織的に重大なことにきづいた精神病の病み上がりなんだけど
人並みの付き合いができたら大学までは大丈夫ですか？
96 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/09 11:15
うわ～。こわいよ～。
真正の電波だよ～
真正の電波だよ～
97 ：79：02/01/09 16:05
すまん、ほっといて続けて
98 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/21 01:02
優良スレあげ。
99 ：M2 ◆8fbZZkx. ：02/01/21 04:15
漏れはPst1あんまり好きじゃないなり。。
至適塩濃度高いし、良く切れるんだけどね。
なんか変な失敗おおい。
白コロニーでインサートナシとか（涙
ライゲーション効率も悪いような気がする。
カタログでも見てみるか。。。
みなさんも個人的に嫌いな制限酵素ないですか？
至適塩濃度高いし、良く切れるんだけどね。
なんか変な失敗おおい。
白コロニーでインサートナシとか（涙
ライゲーション効率も悪いような気がする。
カタログでも見てみるか。。。
みなさんも個人的に嫌いな制限酵素ないですか？
100 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/21 05:19
きらいな酵素といえばBclI。
認識サイトがあっても使えない・・・
ホントは使えないわけじゃないけど。
これに気付かずはまった教官も・・・
認識サイトがあっても使えない・・・
ホントは使えないわけじゃないけど。
これに気付かずはまった教官も・・・
101 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/21 06:24
>>100 damかdcmと重なっているんだっけ？ホストにJM110とか使うしかないな。
102 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/21 11:09
今まで使った一番高い制限酵素と言ったら？？
103 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/23 19:03
プライマーの端っこに制限酵素サイトくっつけて、PCR産物を制限酵素処理して直接クローニングするときに、
切れなくてはまる制限酵素ってあったりしない？
NEBのカタログの一番最後に付いている表(Cleavage Close to the End of DNA fragmentsというタイトル)
を参考にして外側に余分な配列を3-5merくらいは持たせるようにしているけど、あれってみんなうまくいくの？
切れなくてはまる制限酵素ってあったりしない？
NEBのカタログの一番最後に付いている表(Cleavage Close to the End of DNA fragmentsというタイトル)
を参考にして外側に余分な配列を3-5merくらいは持たせるようにしているけど、あれってみんなうまくいくの？
104 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/23 19:53
>103
それって結構常識では？
私は、PCRで増やした後にどうしても切れにくい制限酵素のときは、一度TAクローニングでpGEM T-Easyにサブクロしてから、そのplasmidを切ってます。
それって結構常識では？
私は、PCRで増やした後にどうしても切れにくい制限酵素のときは、一度TAクローニングでpGEM T-Easyにサブクロしてから、そのplasmidを切ってます。
105 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/23 21:02
いや、だから酵素の種類による癖を知りたかったんだけど。
プラスミド相手だと切れやすいけど、PCR産物の末端だと切れにくい酵素とか知られてないかと。
私もベクターに入んないときは素直にTOPO TA cloning kit使っちゃってます。
駄目だと分かってたらはじめからTA cloningしちゃいたいという、ただそれだけ。
プラスミド相手だと切れやすいけど、PCR産物の末端だと切れにくい酵素とか知られてないかと。
私もベクターに入んないときは素直にTOPO TA cloning kit使っちゃってます。
駄目だと分かってたらはじめからTA cloningしちゃいたいという、ただそれだけ。
106 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/24 00:39
>103
Nde I で卒研のころはまったなぁ。
EcoR Iでうまくいったんで何も考えずNde Iサイト入れたら、
ちっともつながんない。 先輩に相談したら常識だったと...
最近はさらに外側へ別のサイトつなげて８塩基くらい余分になるようにしてる。
Nde I で卒研のころはまったなぁ。
EcoR Iでうまくいったんで何も考えずNde Iサイト入れたら、
ちっともつながんない。 先輩に相談したら常識だったと...
最近はさらに外側へ別のサイトつなげて８塩基くらい余分になるようにしてる。
107 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/24 14:23
つーことは8mer余分につければ切れるってことですか？
NdeIは絶対駄目だと思って諦めてた。
NdeIは絶対駄目だと思って諦めてた。
108 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/25 01:42
>>107
配列にもよるだろうけどNde Iなら8塩基くらいつければ、効率悪いけど切れてるみたい。
何%くらい切れてるか正確に確認したことないけどね。
あと、たしかNot I は10塩基くらい必要だったはず。
私もNEBのカタログだか何かで、認識サイト外側にどの程度の余裕があれば切れるかを
知りました。でも、一部の制限酵素についてしか載っていなかったような気がしますが、
最近も同じですか？研究室に行ったら久しぶりに見てみます。
配列にもよるだろうけどNde Iなら8塩基くらいつければ、効率悪いけど切れてるみたい。
何%くらい切れてるか正確に確認したことないけどね。
あと、たしかNot I は10塩基くらい必要だったはず。
私もNEBのカタログだか何かで、認識サイト外側にどの程度の余裕があれば切れるかを
知りました。でも、一部の制限酵素についてしか載っていなかったような気がしますが、
最近も同じですか？研究室に行ったら久しぶりに見てみます。
追伸：
検索したらNot Iは2塩基程度でいけるような事、書いてありました。
記憶ちがいだったみたい。適当かいてごめん。
ttp://www.google.co.jp/search?sourceid=navclient&q=Cleavage+Close+End+DNA+fragments
検索したらNot Iは2塩基程度でいけるような事、書いてありました。
記憶ちがいだったみたい。適当かいてごめん。
ttp://www.google.co.jp/search?sourceid=navclient&q=Cleavage+Close+End+DNA+fragments
110 ：M2 ◆8fbZZkx. ：02/01/28 01:34
私は殆どの場合、足場は2merだけですよ。全然問題ありません。
で、足場に付ける塩基って何にしてます？
私はだいたいGG。
学部生時代に習ったのでずーっとこうしているんですが、なんか意味有るんでしょうか？
で、足場に付ける塩基って何にしてます？
私はだいたいGG。
学部生時代に習ったのでずーっとこうしているんですが、なんか意味有るんでしょうか？
111 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/28 01:38
水素結合が強くてほどけにくいからじゃないの
112 ：M2 ◆8fbZZkx. ：02/01/28 01:49
あー、DQNぶりを発揮してしまった。。
付加した制限酵素部位より5'側はtemplateに結合しないやん、とか勝手に勘違いしておりました。
やっぱ5'側もG or Cの方が良いのですね。。
PCRの基礎から学び直しに逝ってきます（鬱
付加した制限酵素部位より5'側はtemplateに結合しないやん、とか勝手に勘違いしておりました。
やっぱ5'側もG or Cの方が良いのですね。。
PCRの基礎から学び直しに逝ってきます（鬱
113 ：名無しゲノムのクローンさん：02/01/28 02:04
>私は殆どの場合、足場は2merだけですよ。全然問題ありません。
しつこいようだけど、Nde Iは絶対駄目でしょ？俺は7merつけても駄目だったよ。
NEBの巻末には7merあれば2hrで75%切れることになってるけどね。
ちなみに6mer以下だと全然駄目らしい。
あと、NEBの巻末を見ると、2merだときつそうな酵素も結構ある。
>>108で出てきたNot Iは、やっぱり2merじゃ全然切れないことになっている。
もっとも、この数値はあくまでもオリゴヌクレオチドを相手にした場合であって、
制限酵素サイトの片側が実質無限大のPCR産物ではもっと緩い条件でもOKなのかもしれない。
>で、足場に付ける塩基って何にしてます？
あんまりちゃんと考えてないけど、やっぱりなんとなくGCリッチにすることが多いよね。
もしくはNEBの巻末に出てる奴をそのまんま使ってみたり。
あとはプライマーが変な構造をとらないようにとか、プライマーのCG含量が偏らないようにとか。
しつこいようだけど、Nde Iは絶対駄目でしょ？俺は7merつけても駄目だったよ。
NEBの巻末には7merあれば2hrで75%切れることになってるけどね。
ちなみに6mer以下だと全然駄目らしい。
あと、NEBの巻末を見ると、2merだときつそうな酵素も結構ある。
>>108で出てきたNot Iは、やっぱり2merじゃ全然切れないことになっている。
もっとも、この数値はあくまでもオリゴヌクレオチドを相手にした場合であって、
制限酵素サイトの片側が実質無限大のPCR産物ではもっと緩い条件でもOKなのかもしれない。
>で、足場に付ける塩基って何にしてます？
あんまりちゃんと考えてないけど、やっぱりなんとなくGCリッチにすることが多いよね。
もしくはNEBの巻末に出てる奴をそのまんま使ってみたり。
あとはプライマーが変な構造をとらないようにとか、プライマーのCG含量が偏らないようにとか。
NEBのカタログに書いてあるのならばそうなんでしょう。
実はわたしはNde1は一回しか使ったことないんです。
が、外側にもう一つ制限酵素サイトを付けてあったので問題は起きませんでした。
ちなみに、6塩基認識の酵素＋GGなので合計8merです。
実はわたしはNde1は一回しか使ったことないんです。
が、外側にもう一つ制限酵素サイトを付けてあったので問題は起きませんでした。
ちなみに、6塩基認識の酵素＋GGなので合計8merです。
115 ： ：02/02/01 23:15
切れにくい酵素とかの知識がないヤツが使った方がよく切れる気がする。
116 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/01 23:35
Double digestionにはまっています。
うちのラボは宝だけじゃなくていろんなメーカーの酵素を購入してるのですが、
会社によって塩濃度とか結構違いますよね。
で、同じ会社どうしのものなら比較しやすいのですが、
違う会社の酵素を使って Double digestionするときってどうしていますか？
うちのラボは宝だけじゃなくていろんなメーカーの酵素を購入してるのですが、
会社によって塩濃度とか結構違いますよね。
で、同じ会社どうしのものなら比較しやすいのですが、
違う会社の酵素を使って Double digestionするときってどうしていますか？
117 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/01 23:38
NarIは切れにくいよ
118 ：名無しゲノムのクローンさん ：02/02/02 01:47
119 ：NEB狂：02/02/02 10:20
NEBのカタログにDouble Digestionの適正表がありましたよ。
ちなみに、日本語だと第一化学薬品のカタログにNEBのAppendixみたいなのが載っています。
BamHI、XbaIなんかは会社によって至適塩濃度がちがいますよね。
私は各社のBufferの組成とにらめっこして自分で考えるのも手。
でも、ハマってて何度もやりなおす位なら低塩濃度→高塩濃度の２段階で切った方がよっぽど早いと思われ。
ちなみに、日本語だと第一化学薬品のカタログにNEBのAppendixみたいなのが載っています。
BamHI、XbaIなんかは会社によって至適塩濃度がちがいますよね。
私は各社のBufferの組成とにらめっこして自分で考えるのも手。
でも、ハマってて何度もやりなおす位なら低塩濃度→高塩濃度の２段階で切った方がよっぽど早いと思われ。
120 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/02 15:37
迷ったら、両方のバッファを１:１で混ぜてみるってのはダメ？
121 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/02 15:56
>>108
NEBのデータのページ
circuit.neb.com/neb/tech/tech_resource/restriction/properties/cleave_oligo.html
circuit.neb.com/neb/tech/tech_resource/restriction/properties/cleave_vector.html
いつも、Ndeの前に7塩基（EcoRIサイト＋１）つけているけど問題なくNdeIで切れているよ
NEBのデータのページ
circuit.neb.com/neb/tech/tech_resource/restriction/properties/cleave_oligo.html
circuit.neb.com/neb/tech/tech_resource/restriction/properties/cleave_vector.html
いつも、Ndeの前に7塩基（EcoRIサイト＋１）つけているけど問題なくNdeIで切れているよ
122 ：( ﾟДﾟ)＜ﾎﾞｸﾒｰﾂ ◆iboKUMEQ ：02/02/02 15:59
( ﾟДﾟ)＜ﾏｼﾞで研究したいなら
( ﾟДﾟ)＜日本なんかにくすぶってちゃﾀﾞﾒだろう
( ﾟДﾟ)＜上の方の学生さん
( ﾟДﾟ)＜日本なんかにくすぶってちゃﾀﾞﾒだろう
( ﾟДﾟ)＜上の方の学生さん
123 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/06 06:19
やっぱり一番はDqnIだな。
認識配列はａｔａｔａｔａｔってところで。
おあとがよろしいようで。
認識配列はａｔａｔａｔａｔってところで。
おあとがよろしいようで。
124 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/07 12:04
NEBのKpnI買っちゃったよ・・ 切れまくりだよ・・ サイト入ってないのに・・(w
www.biowire.com/bw_jsp/product_review_list_top.jsp?tid=2207&ru=7179
今なら日本でレビューサイト作れば先行できる？アマゾンに作ってもらうとか？
ところで、BsaIとEco31Iどっちが切れなさそうですかね？
#Fermentasのカタログ届きました。いいですね、これ
www.biowire.com/bw_jsp/product_review_list_top.jsp?tid=2207&ru=7179
今なら日本でレビューサイト作れば先行できる？アマゾンに作ってもらうとか？
ところで、BsaIとEco31Iどっちが切れなさそうですかね？
#Fermentasのカタログ届きました。いいですね、これ
125 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/10 03:58
Nde1使ってるけどライゲーション効率が低い以外の問題起きたことないな
Nde1は不安定だから古いの使うとぜんぜんだめだけど
(37度での半減期15分)
PCRではプライマー長めに設計してるので問題なくいくし
Nde1は不安定だから古いの使うとぜんぜんだめだけど
(37度での半減期15分)
PCRではプライマー長めに設計してるので問題なくいくし
126 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/13 01:53
127 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/13 19:10
>>103
Nde1とBam1で余分な配列なしでダイレクトにpETに入った経験あります！
かなりてんぱってて、pT7と同時にだめもとでpET23aにライゲしたら１発で入った！
でも、それって理論上はおかしいんですよね？？？
入ったからいいんだけど。。。
あせる気持ちがフラグメントに伝わったのかなぁ～ってことにしてみてる。
Nde1とBam1で余分な配列なしでダイレクトにpETに入った経験あります！
かなりてんぱってて、pT7と同時にだめもとでpET23aにライゲしたら１発で入った！
でも、それって理論上はおかしいんですよね？？？
入ったからいいんだけど。。。
あせる気持ちがフラグメントに伝わったのかなぁ～ってことにしてみてる。
128 ：名無しゲノムのクローンさん：02/02/20 22:03
BamHIなんか大嫌い。
129 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/06 23:40
SrfIってStratagene以外に売ってるとこありますか？
130 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/07 01:37
良すれage
131 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/23 02:57
ScaI逝ってよし
132 ：名無しゲノムのクローンさん：02/03/23 13:49
SfiI嫌い。
133 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/07 12:51
salI Bpu1102I でコンストラクション。入らない。
鬱だ･･････なぜ一ヶ月もはまっているのだろう。
鬱だ･･････なぜ一ヶ月もはまっているのだろう。
134 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/09 02:52
プライマーを疑うべし。
漏れは２ヶ月くらいやってだめだったが、新しく同じ配列でプライマー頼んだら一発で入った事がある。
ちなみに、PCRは古いプライマーでもごっそり増える。
漏れは２ヶ月くらいやってだめだったが、新しく同じ配列でプライマー頼んだら一発で入った事がある。
ちなみに、PCRは古いプライマーでもごっそり増える。
135 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/26 02:26
BspMI
136 ：133：02/04/26 21:29
一ヶ月はまりコンストラクションは､同じことを繰り返したらなぜか抜けられた。
やっぱりTAKARAのがFAST LINK よりライゲーション効率はいいかね？
やっぱりTAKARAのがFAST LINK よりライゲーション効率はいいかね？
137 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/26 23:06
一番よく切れるのはうちの教授だ！
138 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/27 00:08
そんなことに一か月もはまっててゆるされるんだ
平和だなあ
平和だなあ
139 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/27 05:10
>135 pUCでも切ってるの？
140 ：名無しゲノムのクローンさん：02/04/28 02:30
141 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/02 00:15
TOYOBOのMnl1使ったことある人！
あのお値段と切れっぷりに関する情報求む。
あのお値段と切れっぷりに関する情報求む。
142 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/08 01:27
とーてもお歳の先生が昔は制限酵素は自分でとったものだとかゆってた。
自分で精製したことある人？？
自分で精製したことある人？？
143 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/12 16:09
Mnl1よくきれたよ。
保証します。
保証します。
144 ：熊大大学院生2年目：02/05/23 06:59
おまえら、Takaraの話があまり出てこないが、使ってなさそうだな。
評判でも悪いのでしょうか？
やっぱりNEBがよい？
評判でも悪いのでしょうか？
やっぱりNEBがよい？
145 ：熊大大学院生2年目：02/05/28 04:37
つ～か Sfi I のどこが切れが悪いんだよ。ガツガツ切れるがな。
おまえらちゃんと50度で切ってんのかと小一時間問い詰めたい。
おまえらちゃんと50度で切ってんのかと小一時間問い詰めたい。
146 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/28 09:39
当初切れにくいと思っていたTakaraの「KpnI」、「Bgl2」。
実は切れまくりでした・・・。
実は切れまくりでした・・・。
147 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/30 20:18
やっぱ２ちゃんはこの程度か・・・とほほ。
メーカーとかエンザイムの種類の問題じゃないだろ。
メーカーとかエンザイムの種類の問題じゃないだろ。
148 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/30 20:35
>>147
本気でいってんの？
本気でいってんの？
150 ：名無しゲノムのクローンさん：02/05/31 18:29
>>144
凍謡貿より鷹いからじゃないの？
凍謡貿より鷹いからじゃないの？
152 ：熊大大学院生2年目：02/06/01 00:39
まぁ、おれんところのGene Technology Centreでは
NEB使ってるみたいね。
おれんとこの講座ではTakaraだけど。
NEB使ってるみたいね。
おれんとこの講座ではTakaraだけど。
153 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/01 04:03
半額や30%オフのキャンペーンやってるメーカーから買う。
これうちのラボの鉄則ね。toyobo、rocheが多い。
takaraはあまりキャンペーンチラシ見ないな。。
これうちのラボの鉄則ね。toyobo、rocheが多い。
takaraはあまりキャンペーンチラシ見ないな。。
154 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/01 07:01
メーカーとかエンザイムにしか目がいかない初心者ばかりだな。
こいつら何十個もコロニー拾ってミニプレップやってんだろうな。ご苦労さん。
まずは、いい指導者を見つけるのが先決だ。
そもそもサブクローニングなんてバックグラウンドで90％決まるだろ。
こいつら何十個もコロニー拾ってミニプレップやってんだろうな。ご苦労さん。
まずは、いい指導者を見つけるのが先決だ。
そもそもサブクローニングなんてバックグラウンドで90％決まるだろ。
155 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/01 07:55
何のばっくぐらうんど？
156 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/01 11:23
>155
ベクター側の処理とかそういう意味じゃないのかな？
ベクター側の処理とかそういう意味じゃないのかな？
157 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/02 02:12
>>154
まったくもって意味不明
まったくもって意味不明
158 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/02 04:28
159 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/02 05:08
>>158
ヤバい人のマジレスに一票
ヤバい人のマジレスに一票
160 ：ﾃﾞﾑﾊﾟの予感。。。。：02/06/02 05:29
( ( ( (((((((((>>154)))))))) ) ) ) )
161 ：だめだこりゃ。：02/06/02 12:47
ホントに初心者ばっかりなんですね。
162 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/02 13:11
163 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/02 14:47
164 ：ﾃﾞﾑﾊﾟ増大中。。。。：02/06/02 15:43
( ( ( ( ( ( ( ( ((((((((>>154))))))) ) ) ) ) ) ) ) ) )
165 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/03 23:42
NEB 大好きあげあげ。
166 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/04 00:28
だいたい一巡したようですね。
では、いちばん「切ない」のはどれでしょう？
では、いちばん「切ない」のはどれでしょう？
167 ：?@：02/06/04 17:39
>>166
全くレスがつかないお前
全くレスがつかないお前
168 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/04 19:03
>>167
そんなこと逝っちゃかわいそう･ﾟ･(ﾉД`)･ﾟ･｡
そんなこと逝っちゃかわいそう･ﾟ･(ﾉД`)･ﾟ･｡
169 ：熊大大学院生2年目：02/06/04 22:42
一般的に「値段の高い酵素ほど切れにくい」
という法則があると思いますが、
その観点から言って
安いのに切れにくい制限酵素ってなんでしょう？
という法則があると思いますが、
その観点から言って
安いのに切れにくい制限酵素ってなんでしょう？
170 ： ：02/06/05 01:04
>169
そのハンドルやめて・・・
俺もお仲間だからなんだかちょっと恥ずかしい・・・
そのハンドルやめて・・・
俺もお仲間だからなんだかちょっと恥ずかしい・・・
171 ：JSサイト発信！！：02/06/05 05:49
172 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/08 12:24
pUC18をBamHIでCIPバッファー(3)で切ったらラダーになりました。
3中では50%活性だっていうから多めに入れたのに・・ 1ng返せ！
3中では50%活性だっていうから多めに入れたのに・・ 1ng返せ！
173 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/08 12:54
切ないね…
174 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/09 02:32
>>172
酵素はどれだけ入れたのだ？
グリセロール濃度が高くなってしまって、スター活性が出てきているのでは？
理由がなんにせよ、あんたDQNだよ。
腕磨け。もっと勉強しろ。先輩のゆうことよく聞け。風呂入ったか？歯磨けよ！じゃあな！！
酵素はどれだけ入れたのだ？
グリセロール濃度が高くなってしまって、スター活性が出てきているのでは？
理由がなんにせよ、あんたDQNだよ。
腕磨け。もっと勉強しろ。先輩のゆうことよく聞け。風呂入ったか？歯磨けよ！じゃあな！！
175 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/09 09:15
HaeII 失活との強壮
176 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/09 10:11
>174
そんな誰でも知ってることを偉そうに書き込めるお前がDQN
もっと面白い書き込みができるようにがんばれよ。
そんな誰でも知ってることを偉そうに書き込めるお前がDQN
もっと面白い書き込みができるようにがんばれよ。
177 ：DQ172：02/06/09 12:13
>>174 うちは先輩いないのよ。有機化学系研究室でひっそりと生化立ち上げ中。
確かに10μlに3μlの酵素入れたからねえ・・ でも、こんなにあちこち切れた
スター活性て見たことなかたから勉強になた。1μlで十分だたね。
あと、NEBにはdouble digestion一覧にCIPとの相性も載せてくれるよう希望。
確かに10μlに3μlの酵素入れたからねえ・・ でも、こんなにあちこち切れた
スター活性て見たことなかたから勉強になた。1μlで十分だたね。
あと、NEBにはdouble digestion一覧にCIPとの相性も載せてくれるよう希望。
178 ：なんだか、：02/06/11 09:24
イラストレイテッドを愛読しているような輩ばかりだな。
プロはいないのかよ！！！
プロはいないのかよ！！！
179 ：komakoma：02/06/20 22:21
マルチクローニングサイトの中で
隣接した２ヶ所の制限酵素認識部位で切りたいのですが、
うまく切れません。注意することってありますか？
どなたか教えてください。
隣接した２ヶ所の制限酵素認識部位で切りたいのですが、
うまく切れません。注意することってありますか？
どなたか教えてください。
180 ：熊大大学院生2年目：02/06/20 22:40
>>179
具体的にどのenzymeを使うのか、
何bpくらいそのふたつのsiteが離れているのか
くらい書かないと答えようがないよ。
一般的なことはNEBのカタログに書いてあるよ。
enzymeによっては端がある程度bpがないと切れないのがあるから、
切れないのがあれば、
「まず、切れない方から切って、
次に端に関係なく切れる方で切る」
のが王道だよ。
具体的にどのenzymeを使うのか、
何bpくらいそのふたつのsiteが離れているのか
くらい書かないと答えようがないよ。
一般的なことはNEBのカタログに書いてあるよ。
enzymeによっては端がある程度bpがないと切れないのがあるから、
切れないのがあれば、
「まず、切れない方から切って、
次に端に関係なく切れる方で切る」
のが王道だよ。
181 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/20 23:34
182 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/20 23:43
構築はアウトソーシング。これ最強。
183 ：熊大大学院生2年目：02/06/21 00:57
>>181
まぁまぁ、そういわんと。
10ulで反応させるなら最大1ulの酵素量にしましょう。（ふつ～0.25から0.5)
CIAPとの相性ってよく意味がわからんだたーけど、
そうか笑うところだったのか（汗
まぁまぁ、そういわんと。
10ulで反応させるなら最大1ulの酵素量にしましょう。（ふつ～0.25から0.5)
CIAPとの相性ってよく意味がわからんだたーけど、
そうか笑うところだったのか（汗
184 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/21 01:04
>>177
おまえある意味神だよ。
おまえある意味神だよ。
185 ：ぺー：02/06/30 04:29
ＮＥＢ最高！ＴＯＹ●ＢＯきらい。ぜんぜん切れねー！！
186 ：名無しゲノムのクローンさん：02/06/30 04:31
LOTの番号言ってとっかえてもらえよ
問題ないよ普通どこでも
問題ないよ普通どこでも
187 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/16 06:15
NEB の NdeI はホントに良く切れる。足場が GGGG の 4 bp でも切れる。いつもこれでやってる。
宝のは切れにくいらしいけど、使ったことない。
宝のは切れにくいらしいけど、使ったことない。
188 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/28 19:49
このスレにはユニットを理解してない奴がいるな。
せめてカタログをよく読んでね。
あと切れない酵素は、新しい人間（学生・スタッフ問わず）が入ってきた
頃よく量産されます。
せめてカタログをよく読んでね。
あと切れない酵素は、新しい人間（学生・スタッフ問わず）が入ってきた
頃よく量産されます。
189 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/28 20:19
熊大大学院生2年目
↑
実験始める前にユニットを理解しましょうね。
↑
実験始める前にユニットを理解しましょうね。
190 ：熊大大学院生2年目：02/07/28 20:27
191 ：名無しゲノムのクローンさん：02/07/28 22:23
TAKARAのNdeI良く切れるよ～
熱に弱いから丁寧に扱わなきゃいけないのは
どこのでも一緒だが
熱に弱いから丁寧に扱わなきゃいけないのは
どこのでも一緒だが
192 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/17 03:42
貴重な情報スレのため。保全。
193 ：ぺー：02/08/23 23:18
切れないのは精製がよくないからですね。
194 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/24 02:23
制限酵素なんて物によってはえらい年代物が残っていたりするが、その中で
ApaIは切れが悪くなるようだ。以前7年前の（宝酒造のラベルをつまめる頃の
もの）の切れが悪くて気が付いた。といっても現在も５年前のを使っているが。
ApaIは切れが悪くなるようだ。以前7年前の（宝酒造のラベルをつまめる頃の
もの）の切れが悪くて気が付いた。といっても現在も５年前のを使っているが。
195 ：名無しゲノムのクローンさん：02/08/31 22:09
優良スレあげ。
196 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 08:45
NEBのBamHI buffer、ぜんぜん足りね～よ もっと入れといてくれよ
自分で作ったやつ使ったらぜんぜん切れね～よ(泣)
自分で作ったやつ使ったらぜんぜん切れね～よ(泣)
197 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 09:40
はにゃ？ なんで自分で作ったやつだとだめ？？ 濃度間違えてない？
198 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 22:19
TOYOBOのNar1は良く切れる。
切れてもつながん無いのってあるらしいが、情報もとむ。
切れてもつながん無いのってあるらしいが、情報もとむ。
199 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 22:51
ＸｂａとＸｈｏ！！！
こいつらは制限酵素か、ほんまに？？
こいつらの働き自体制限しとるって話や！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！
こいつらは制限酵素か、ほんまに？？
こいつらの働き自体制限しとるって話や！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！
200 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/04 22:53
１９９さん、具体的にどうぞ。
201 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 14:52
>>199
GATCAAAAT
GATCAAAAT
202 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 16:12
SEXA1って酵素に興味がある。
203 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 16:17
>196
TAKARAとかは捨てるほどたくさん10xbufferがついてくるぞ。
いっぺん頼んでみな。（代理店にbuffer set付と伝えておくこと）
TAKARAとかは捨てるほどたくさん10xbufferがついてくるぞ。
いっぺん頼んでみな。（代理店にbuffer set付と伝えておくこと）
204 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/20 23:01
NcoIをうんこと呼んでますがなにか？
205 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 14:39
くそー♪BamHIにまた日和られたぁ～
現在切れまくりぃ～ ひょっとしてミニプレ用の70%EtOHが死んでたのか？
現在切れまくりぃ～ ひょっとしてミニプレ用の70%EtOHが死んでたのか？
206 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 14:50
207 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/21 15:30
>204
Xho I は”クソ”と呼んでいる
Xho I は”クソ”と呼んでいる
208 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 01:40
高い物、安い物、多少の差は当然有る。が、最も重要なファクターは手元に届くまでの輸送条件！
もってくるのが早い等の信頼できる業者を選びましょう。
もってくるのが早い等の信頼できる業者を選びましょう。
209 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 02:14
XhoI好きだけどなぁ。。。。。。。。。。
210 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 02:25
EcoR王
211 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 03:41
いま分かった。
王＝ワン、ね。
王＝ワン、ね。
212 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 15:05
おせーよ！
GST融合タンパク質用のpGEX3XはBamHIで全然切れましぇん。
多分ベクターの方（構造など）に問題があるんだろうけど。
注意すべし。
多分ベクターの方（構造など）に問題があるんだろうけど。
注意すべし。
214 ：コギャルとＨ：02/09/28 20:13
215 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/28 22:22
>>213
マジっすか！？
マジっすか！？
切れないときは酵素多めにぶちこぬ！
217 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/29 01:25
それは蟻ですか？
218 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/29 04:30
モハメドです当然
219 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/29 21:31
うそ
220 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/29 23:42
おれもこのまえreaction vol. 100ulにして
XbaI 8ulつっこんだらソッコー切れたよ。
4ulでは半分しかきれなかったよ
XbaI 8ulつっこんだらソッコー切れたよ。
4ulでは半分しかきれなかったよ
221 ：名無しゲノムのクローンさん：02/09/30 03:44
それって違うとこも切れてない？
222 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 00:39
きれてな～い！！
223 ：クソ院生：02/10/01 00:55
PCR primerに制限酵素サイトつくって、
digestion→精製→ligationやるものの、
transformationの効率って悪いので（全然生えてこないときがよくある）、
TA cloningやってるんだけど、
他の人はどーよ？
digestion→精製→ligationやるものの、
transformationの効率って悪いので（全然生えてこないときがよくある）、
TA cloningやってるんだけど、
他の人はどーよ？
224 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 01:25
225 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/01 02:42
一番切れない制限酵素
↓
業者が室温で持ってきやがったNdeI
↓
業者が室温で持ってきやがったNdeI
226 ：すごく遅い人：02/10/16 11:18
227 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 21:57
225、ｲｲ!!
228 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/16 22:27
>>226
dimerとかtetramerとかで正の協同性を示すそう言う酵素けっこうあるよ。NsiIとかSfiIとかもそうじゃなかったかな。反応中に認識配列に相当するds-oligoを入れとくと良く切れるんで、そういう専用bufferが付いてたりする。
dimerとかtetramerとかで正の協同性を示すそう言う酵素けっこうあるよ。NsiIとかSfiIとかもそうじゃなかったかな。反応中に認識配列に相当するds-oligoを入れとくと良く切れるんで、そういう専用bufferが付いてたりする。
229 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/17 12:55
TEのもちこみ多いと
EDTAでMgキレートされたり
pH狂ったりして切れないこともある
EDTAでMgキレートされたり
pH狂ったりして切れないこともある
230 ：名無しゲノムのクローンさん：02/10/19 12:20
学部でもしってることだよ
231 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/03 11:49
>>225
ｲｲ！！
ｲｲ！！
232 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/03 18:12
★一重で目が細いか小さい★目頭がほとんど無い★ヨリ目かツリ目★
★眉毛がかなり薄い★目と眉毛の間が広い★ハの字眉★肌が茶色い★
★男なのにあまりヒゲが生えない★歯が大きい、または出っ歯★
★スネ毛など体毛が薄いかほとんど生えない
★彫りが極端に浅く、起伏に乏しい★ずんぐりとした瓜実型体型★
★絶壁頭★名前に哲の字がある
以上のうち４つ以上該当すれば朝鮮
★眉毛がかなり薄い★目と眉毛の間が広い★ハの字眉★肌が茶色い★
★男なのにあまりヒゲが生えない★歯が大きい、または出っ歯★
★スネ毛など体毛が薄いかほとんど生えない
★彫りが極端に浅く、起伏に乏しい★ずんぐりとした瓜実型体型★
★絶壁頭★名前に哲の字がある
以上のうち４つ以上該当すれば朝鮮
233 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/03 22:10
Not1め！！いつになったら本気だしてくれるんだ！！
234 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/06 18:10
KasIは全くと言っていいほど切れない。
酵素入れ忘れたのかと思ったくらい。
O/N digestionしても泳動パターンが、酵素未処理の
サンプルと変わらない。恐ろしい酵素だった。
ちなみにメーカーはNEB
酵素入れ忘れたのかと思ったくらい。
O/N digestionしても泳動パターンが、酵素未処理の
サンプルと変わらない。恐ろしい酵素だった。
ちなみにメーカーはNEB
235 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/07 02:25
NotIって本気出しまくりじゃん？
すんげえきれるよ。
plate lysateで取ったキッタネエファージDNAもNotIが一番きれが良かった。
HindIIIでも切れ残るのに。
まあキット使えば何でも切れるんだがな
236 ：名無しゲノムのクローンさん：02/11/07 03:27
>>233
おまいさ、端っこ切ってたりしないよな？
おまいさ、端っこ切ってたりしないよな？
237 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/13 22:51
BalIよりｲｿｼｿﾞﾏｰの方が切れがいいのか。。勉強になった。買ってみよ。
238 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/14 22:25
コンストラクション再開age。
239 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/15 01:16
Promega の AgeI てちゃんと切れる？
ライセンスの関係で他で売れないかしらんが、あのでかいキャップが
並ぶのいやだ。
ライセンスの関係で他で売れないかしらんが、あのでかいキャップが
並ぶのいやだ。
240 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/15 11:08
プロメガバッファーはダブルダイジェスチョンにはいいけれどね……
あのすぐに制限酵素名が消えるチューブはどうかと思う（´Д｀）ｙ-’
あのすぐに制限酵素名が消えるチューブはどうかと思う（´Д｀）ｙ-’
241 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 13:31
SpeI
242 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 14:32
NotI
243 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 15:34
KirenaiI
244 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 17:09
大晦日に実験・・・。切れそう。
245 ：名無しゲノムのクローンさん：02/12/31 23:35
KpnI 切れねえ。。。
また誰かシッカツさせやがったな。
また誰かシッカツさせやがったな。
246 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 02:57
至適塩濃度が低い制限酵素が切れないとか言（以下略
247 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 03:02
(ﾟдﾟ) <ﾊﾞｶｼﾞｬﾅｲﾉ >246
ﾟ( )－
/ >
ﾟ( )－
/ >
248 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/02 12:52
249 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 06:52
小知識が憑き始めたばかりのガキのカキコだろうな
250 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 09:28
251 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 09:40
横ﾚｽですまんが・・・。漏れにはわからん。教えて。
252 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 10:11
253 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 10:19
254 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 10:20
第一段階
至適塩濃度が低い制限酵素が切れないとか言（ってる初心者の精製したDNAは大盛り塩ダク）
第二段階
至適塩濃度が低い制限酵素が切れないとか言（うレス自体超既出だしもう見てらんない）
>249 など、>245 に対してなのか >246 のことなのかすら分からない。
それで自分が偉くなれた気がしたのかと。
至適塩濃度が低い制限酵素が切れないとか言（ってる初心者の精製したDNAは大盛り塩ダク）
第二段階
至適塩濃度が低い制限酵素が切れないとか言（うレス自体超既出だしもう見てらんない）
>249 など、>245 に対してなのか >246 のことなのかすら分からない。
それで自分が偉くなれた気がしたのかと。
255 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 10:23
>>253 あげてない上に、（以下略）や「という罠」は間違った使用例も多数あるはずなのでお勧めできない
256 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 10:26
257 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 10:34
>254
苦笑・・・。なんだ。日本語読めないお馬鹿さんだったのね。
わりいわりい。
も一辺245を読んでみな。245がぼやいてるのは、KpnI（失活しやすいのは
常識）を、また誰かが失活させやがって、ってことだろ。
それに対して至適塩濃度が低い云々なんて、えらくずれたレスだとは
思わないかい？思わないんだろうねえ。
249は明らかにKpnIときたら塩濃度と脊髄反射してる246に対する
ものだろ。それも読めなかった？
もう一辺言ってあげよう。245がぼやいてるのは、KpnI（失活しやすいのは
常識）を、また誰かが失活させやがって、ってことだろ。
どこをどうつついたら、塩濃度なんてレスが出てくるのかと小一時間（以下略
(これで良いですか！253師匠！)
苦笑・・・。なんだ。日本語読めないお馬鹿さんだったのね。
わりいわりい。
も一辺245を読んでみな。245がぼやいてるのは、KpnI（失活しやすいのは
常識）を、また誰かが失活させやがって、ってことだろ。
それに対して至適塩濃度が低い云々なんて、えらくずれたレスだとは
思わないかい？思わないんだろうねえ。
249は明らかにKpnIときたら塩濃度と脊髄反射してる246に対する
ものだろ。それも読めなかった？
もう一辺言ってあげよう。245がぼやいてるのは、KpnI（失活しやすいのは
常識）を、また誰かが失活させやがって、ってことだろ。
どこをどうつついたら、塩濃度なんてレスが出てくるのかと小一時間（以下略
(これで良いですか！253師匠！)
258 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 10:50
解説ご苦労
259 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 10:54
まあ、塩濃度厨（黙ったようだね）はほっとくとしても、
KpnIは性悪な酵素だよな。ある意味厨酵素かも。
素直なときは実にいい子にしてるんだが、すぐへそを曲げるし飽きっぽい。
最初の方にAcc65I最強というレスがあったが、確かにそうなんだけど
Acc65I高いし、いい子にしてるときのKpnIは、それはそれはよく
働くからなあ。
うちではAcc65IでなくKpnIを使ってるが、ストック一本は常備する
ようにしてるよ。あと、無理に使い切らない。やばいなと感じたら
すぐ捨てる。激安だからね。それで一応うまく回ってるよ。
KpnIは性悪な酵素だよな。ある意味厨酵素かも。
素直なときは実にいい子にしてるんだが、すぐへそを曲げるし飽きっぽい。
最初の方にAcc65I最強というレスがあったが、確かにそうなんだけど
Acc65I高いし、いい子にしてるときのKpnIは、それはそれはよく
働くからなあ。
うちではAcc65IでなくKpnIを使ってるが、ストック一本は常備する
ようにしてるよ。あと、無理に使い切らない。やばいなと感じたら
すぐ捨てる。激安だからね。それで一応うまく回ってるよ。
260 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 13:33
ラボの規模や使う頻度によるのかもしれないけれど、制限酵素ってそんなに失活するもんなの？
ストックを置いておくのは賛成するが。
コンストラクションで頻用するものは、開けてあるのを一本、ストックを一本、誰かがストックを注文し忘れた時のために一本。
Takaraの５本組みを買う場合もあるが。
何かのコレクターみたいだ。
ストックを置いておくのは賛成するが。
コンストラクションで頻用するものは、開けてあるのを一本、ストックを一本、誰かがストックを注文し忘れた時のために一本。
Takaraの５本組みを買う場合もあるが。
何かのコレクターみたいだ。
261 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/04 14:39
NaeIとScaIが漏れの中での切れないワン、ツー。
全く名前通り。ネタじゃないけど。
こいつらは絶対使わないように構築を考える。
もう二度と使うものか。
>260
五月六月はよく失活するなあ。KpnI、BamHI、NdeIなどは
うちでも要注意酵素。扱いが荒いとすぐダメになるよね。
全く名前通り。ネタじゃないけど。
こいつらは絶対使わないように構築を考える。
もう二度と使うものか。
>260
五月六月はよく失活するなあ。KpnI、BamHI、NdeIなどは
うちでも要注意酵素。扱いが荒いとすぐダメになるよね。
262 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/06 03:29
厨の多い生物板だが、これくらい片方が一方的にやりこめられるのは
久しぶりに見た。
楽しませていただきやした。>247以降
久しぶりに見た。
楽しませていただきやした。>247以降
263 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/07 01:19
カタログに最適バッファー以外だと活性50％とか書いてあるけど
あれは何を示唆していますか？使うなってこと？それとも何か
意味あるの？試したことないから分かりません。
あれは何を示唆していますか？使うなってこと？それとも何か
意味あるの？試したことないから分かりません。
264 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/10 01:49
DNA濃度が高すぎて切れんとかあるのだろうか？
以前BamHIで切れん切れんと悩んだ揚句にDNA濃度を1/10に希釈したらアッサリ
切れた事があるのだが・・
以前BamHIで切れん切れんと悩んだ揚句にDNA濃度を1/10に希釈したらアッサリ
切れた事があるのだが・・
（＾＾）
266 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/14 08:17
267 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/14 12:23
268 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/16 02:17
（＾＾）
270 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/06 01:25
>>264
XbaIは、他の制限酵素と同じ反応条件だと、全然切れない。
DNA濃度を他の酵素のときの半分にしないと切れない。
制限サイトマップを作るために、いろんな酵素で切る時、
XbaIだけ反応液の組成を変えなければいけないので、ちょっと面倒。
XbaIは、他の制限酵素と同じ反応条件だと、全然切れない。
DNA濃度を他の酵素のときの半分にしないと切れない。
制限サイトマップを作るために、いろんな酵素で切る時、
XbaIだけ反応液の組成を変えなければいけないので、ちょっと面倒。
271 ：名無しゲノムのクローンさん：03/02/06 02:43
（＾＾）
（＾＾）
274 ：名無しゲノムのクローンさん：03/03/20 17:25
（＾＾）
∧＿∧
（ ＾＾ ）＜ ぬるぽ（＾＾）
（ ＾＾ ）＜ ぬるぽ（＾＾）
277 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/06 04:35
NdeI失活するの速すぎ・・ つうか、何時間ぐらい生きててくれてるんだろうか？
ガンガン入れてもかなり切れ残るのです。。
ちなみにへたったNdeI(NEB)使ったらプラスミドがバラバラにされました。
ガンガン入れてもかなり切れ残るのです。。
ちなみにへたったNdeI(NEB)使ったらプラスミドがバラバラにされました。
川o・-・）ノ ＜先生！こんなのがありました！
http://www.japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz03.html
http://japan.pinkserver.com/kaorin/mona/index.html
http://www.japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz02.html
http://japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz08.html
http://www.japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz09.html
http://japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz05.html
http://www.japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz06.html
http://japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz01.html
http://www.japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz10.html
http://japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz07.html
http://www.japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz04.html
http://www.japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz03.html
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http://www.japan.pinkserver.com/kaorin/moe/jaz10.html
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279 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/07 22:03
このスレを見ると、いかにいい加減なことがまかり通ってるかよく分かる。
Kpn Iが失活しやすいとか、BamH Iが、失活しやすいとか。
あるいは何々は切れにくいとか。
あり得ないね。そんな目にあったことないよ。
全く、いい加減なこと言わんといてほしいわ。
Kpn Iが失活しやすいとか、BamH Iが、失活しやすいとか。
あるいは何々は切れにくいとか。
あり得ないね。そんな目にあったことないよ。
全く、いい加減なこと言わんといてほしいわ。
一瞬スレタイが**一番切ない制限酵素**に見えた。制限酵素に切られて逝ってきます。
281 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/08 00:37
切ないの? どうした？ 好きな女に振られたのか？
∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ ( ＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
＝〔~∪￣￣〕
＝ ◎――◎ 山崎渉
ﾋﾟｭ.ｰ ( ＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
＝〔~∪￣￣〕
＝ ◎――◎ 山崎渉
283 ：名無しゲノムのクローンさん：03/05/29 03:05
NdeIは低分子の不純物（塩以外?)のコンタミに弱い、ってNEBのカタログに
かいてあるっしょ
かいてあるっしょ
__∧＿∧_
|（ ＾＾ ）| ＜寝るぽ（＾＾）
|＼⌒⌒⌒＼
＼ |⌒⌒⌒~| 山崎渉
~￣￣￣￣
285 ：ゲノム：03/07/23 22:59
ＳｅｘＡＩの切れ味教えて。これ使ってみたいのだけど。
286 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/24 01:22
NdeIって「ンデワン」と呼んでるんだが
287 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/24 02:44
今年も５～６月がすぎましたが、皆さんのラボでは、
やはり切れにくくなる酵素続出だったのでしょうか？
ちなみにうちでは、SacIやKpnI処理が上手くいくまでに
GW以降、約一ヶ月を要しました。
（残留塩の方が問題だったようで、キットで精製させたら
すぐ切れた）
やはり切れにくくなる酵素続出だったのでしょうか？
ちなみにうちでは、SacIやKpnI処理が上手くいくまでに
GW以降、約一ヶ月を要しました。
（残留塩の方が問題だったようで、キットで精製させたら
すぐ切れた）
288 ：なまえをいれてください：03/07/24 15:31
ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。
289 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/24 23:50
ＳｐｅＩとＳｆｉＩかなぁ。
ＫｐｎＩとよぼで切れなかったこと無いなぁ。
ＢｉｏランドのＭａｘｉプレプDNase残っちゃうねぇ（反応終ると
全部無くなってる）。
ＫｐｎＩとよぼで切れなかったこと無いなぁ。
ＢｉｏランドのＭａｘｉプレプDNase残っちゃうねぇ（反応終ると
全部無くなってる）。
290 ：名無しゲノムのクローンさん：03/07/30 08:36
あのね，PCRのprimerにClaI siteを入れておいて
PCR産物をpBSにcloningしたあとClaIで切ったら
全然切れないの（cloningに使ったのは ClaIより
さらに5’側につけておいた別のsiteね）．
おかしいなーと思っていたらClaI siteのあとに
Cがついてたの．で，なんだー俺って馬鹿ー
と思ってprimer作り直してもう１回やったら
やっぱりClaIで全然切れないの．おっかしいなー
と思っていたら ClaI siteの前にGがついてたの．
俺ってやっぱ大馬鹿？
というわけで切れない酵素はClaIとScaIに決定．
PCR産物をpBSにcloningしたあとClaIで切ったら
全然切れないの（cloningに使ったのは ClaIより
さらに5’側につけておいた別のsiteね）．
おかしいなーと思っていたらClaI siteのあとに
Cがついてたの．で，なんだー俺って馬鹿ー
と思ってprimer作り直してもう１回やったら
やっぱりClaIで全然切れないの．おっかしいなー
と思っていたら ClaI siteの前にGがついてたの．
俺ってやっぱ大馬鹿？
というわけで切れない酵素はClaIとScaIに決定．
291 ：ぼるじょあ ◆yBEncckFOU ：03/08/02 03:00
∧＿∧ ∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ （ ・３・） ( ＾＾ ） ＜これからも僕たちを応援して下さいね（＾＾）。
＝〔~∪￣￣￣∪￣￣〕
＝ ◎――――――◎ 山崎渉&ぼるじょあ
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＝〔~∪￣￣￣∪￣￣〕
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(⌒V⌒)
│ ＾ ＾ │＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
⊂| |つ
（＿）（＿） 山崎パン
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⊂| |つ
（＿）（＿） 山崎パン
293 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/20 22:20
良スレ。上げましょ。
294 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/21 01:33
>>285 分子生物学会のテクノロジーセミナー「制限酵素の達人」入門で、SexAIはpreferenceが激しい酵素の代表例に挙げられてました。
295 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/21 01:35
>>290 私もあります。ORFだけを増幅しようとしたときに終止コドンUAGの直後にClaI付けてはまりました。気が付くのに１週間かかりました。
296 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/21 12:04
末端部分の切れやすさは酵素に依存するのよ。さらに末端から何塩基対
あるかによってもちがう。調べてみ。
ちなみにEcoRI、BamHIは無敵。
あるかによってもちがう。調べてみ。
ちなみにEcoRI、BamHIは無敵。
297 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/21 12:06
と思ったらすでに議論されていたのね。一滴増す。
298 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/21 12:52
BamHIは無敵じゃないだろ
299 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/21 12:55
すみません。うろ覚えで>>294にウソを書いてしまいました。SexAIはDcmでブロックされる酵素の例でした。
300 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/21 12:57
>>296 しかも論点がずれてるぞ
301 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/22 02:54
お ま え ら ぼ ろ く そ だ な
302 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/23 11:05
EcoRI, BamHI, XbaIのみですべての実験をやる。
今まで失敗いしたためしなし。
今まで失敗いしたためしなし。
303 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/23 12:31
37度で切れる高熱化BamHIってできないもんなのかな？
売れるだろうに。
売れるだろうに。
304 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/23 13:02
NEBのは37℃を推奨してるよ。て言うか、TaKaRaだって昔は37℃だった。
http://www.neb.com/neb/products/res_enzymes/136.html
http://www.neb.com/neb/products/res_enzymes/136.html
305 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/23 14:46
バムＨ椀って37度じゃないのか？
306 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/23 15:10
■使用上の注意
37℃反応でも同等の酵素活性を示すが、30℃と比較して酵素反応中の安定性が少し低い。
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0044
37℃反応でも同等の酵素活性を示すが、30℃と比較して酵素反応中の安定性が少し低い。
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0044
307 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/26 08:13
NEBだと37度でやれと書いてあるな。
308 ：名無しゲノムのクローンさん：03/12/26 13:52
失活させるのに80℃にしないといけない酵素 by NEBユーザー
あぼーん
310 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/07 03:08
６塩基認識の制限酵素サイトって、なじぇ点対称(TCTAGA）なんですか？
311 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/15 08:37
２量体で切るから、とか
312 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/15 10:23
二本鎖だからだろ
313 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/15 11:48
４塩基認識もそうだが、
一次元の配列情報に「点」対称と言ってるのもなんだが、
結合（認識）の特異性を上げる手段として、２量体で結合するからでしょ。
一次元の配列情報に「点」対称と言ってるのもなんだが、
結合（認識）の特異性を上げる手段として、２量体で結合するからでしょ。
314 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/15 11:51
まあそうだな。
315 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/15 12:02
Mnqのことお前らなんて言ってる？
俺的にはムンク
俺的にはムンク
316 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/15 13:06
マンキュー
317 ：名無しゲノムのクローンさん：04/02/15 13:35
俺はｵﾏﾝｺｩかな
318 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 07:53
takara のXho1使ったら、ごっついスメア、、、。
ライゲーション用のベクターとして１時間×２回やったんだが。
間でエタ沈はやったんだが。
どっかよそのでいいのないですか？？
ライゲーション用のベクターとして１時間×２回やったんだが。
間でエタ沈はやったんだが。
どっかよそのでいいのないですか？？
319 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 13:55
Xho I はいつも他人の使い残しチューブでやっております。
Gibro, NEB, Roche, Strata 等々、古いチューブでも問題になったことは無いです。
Takaraは一度も使ったこと有りませんが。
Gibro, NEB, Roche, Strata 等々、古いチューブでも問題になったことは無いです。
Takaraは一度も使ったこと有りませんが。
320 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 14:04
ミスタイプしちゃった。
Gibro ぢゃなくて Gibco。
Invtrogenに吸収される前のチューブがまだある。
Gibro ぢゃなくて Gibco。
Invtrogenに吸収される前のチューブがまだある。
321 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 14:15
318です。私もこんなこと初めてで、、、
もう１回やってみるyo.
もう１回やってみるyo.
322 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 16:18
自分の好みの配列で切れる酵素を作る方法がいつか出来ると思わない？
色々な酵素の構造が解明されるとできそう。
それ最初に作ったらノーベル賞だよ。
色々な酵素の構造が解明されるとできそう。
それ最初に作ったらノーベル賞だよ。
323 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 16:19
たとえば
ATTGCGTGCAAGTGACT
↑
という酵素を作ってくれ！とオーダーすれば送られてくる、みたいな。
ATTGCGTGCAAGTGACT
↑
という酵素を作ってくれ！とオーダーすれば送られてくる、みたいな。
324 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 16:27
そんなんでノーベル賞とれるかよ．．．
325 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 16:31
うーん、機械的にDNAをいじれる方が早いかも。
326 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 16:35
327 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/20 16:50
>322
それは昔から多くの人が考えていて実際に作ろうとしているひともいるんだけど、かなり難しいらしいよ。
いろんなことに応用できそうだから、ノーベル賞ってのもあるかもね。
それは昔から多くの人が考えていて実際に作ろうとしているひともいるんだけど、かなり難しいらしいよ。
いろんなことに応用できそうだから、ノーベル賞ってのもあるかもね。
328 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/26 16:23
ノーベル賞以前に金持ちにはなれそうだが。
非対称を特異的に認識かぁ・・
非対称を特異的に認識かぁ・・
329 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/26 16:48
330 ：名無しゲノムのクローンさん：04/05/26 17:18
やっぱりリボザイムかなあ。
331 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/01 10:21
2重鎖をざっくりやっちゃうリボザイムってあったっけ？
332 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/06 06:44
何で学部生をたたくの？酵素失活させちゃったにしても。
そりゃ注意してやらなきゃいけないけど、何か研究室暗そうだね
そりゃ注意してやらなきゃいけないけど、何か研究室暗そうだね
333 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/06 07:30
334 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/06 08:05
厳しくしたほうが本人のためだとおもうな。
明るく楽しい職場(ラボ)なんて
その先の人生どぶにすててるようなもんだ
文系就職するならともかく。
明るく楽しい職場(ラボ)なんて
その先の人生どぶにすててるようなもんだ
文系就職するならともかく。
335 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/06 09:56
殺伐としたラボきぼんぬ
336 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 13:16
質問です。
最初5＞でmini prep後に切断できない時ってよくあるのでしょうか・・。
昨日、ライゲーション後に、１０個斬って、１０個ともだめだった。
鬱だ、、
最初5＞でmini prep後に切断できない時ってよくあるのでしょうか・・。
昨日、ライゲーション後に、１０個斬って、１０個ともだめだった。
鬱だ、、
337 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 19:23
338 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 20:51
>>336
質問の意味が分からない。
質問の意味が分からない。
339 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 21:49
>>336です。詳しく書きます。
ベクターをHpa1でcut+Bap処理。しかし、最終産物を泳動すると少しスメア状態。
インサートはPCR産物をtakara BKLで処理。
これらをライゲーションして、トランスフォーメーションすると、
インサートどころか、切れるハズの酵素で全くきれないコロニーばかり。しかも、未処理ベクターを一緒に流すとどうやら違うものである事が分かりました。
という事です。
上の>>5で残留塩の持ち込みの話がでていたものですから。
後、考えられるのは、Hpa1処理後に何か問題があって、変なベクター
ができたのか？？Hpa1後にエタ沈はしているのですが。
フェノクロまでした方がいいのでしょうか？？
ベクターをHpa1でcut+Bap処理。しかし、最終産物を泳動すると少しスメア状態。
インサートはPCR産物をtakara BKLで処理。
これらをライゲーションして、トランスフォーメーションすると、
インサートどころか、切れるハズの酵素で全くきれないコロニーばかり。しかも、未処理ベクターを一緒に流すとどうやら違うものである事が分かりました。
という事です。
上の>>5で残留塩の持ち込みの話がでていたものですから。
後、考えられるのは、Hpa1処理後に何か問題があって、変なベクター
ができたのか？？Hpa1後にエタ沈はしているのですが。
フェノクロまでした方がいいのでしょうか？？
340 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 22:04
＞ フェノクロまでした方がいいのでしょうか？？
当然だろ！ BAP持込みまくりのサンプルでligationしたって、マトモな産物が出来るはずなかろう。
当然だろ！ BAP持込みまくりのサンプルでligationしたって、マトモな産物が出来るはずなかろう。
341 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 22:06
>>339
いや、お前の場合は残留塩は関係ない。と思う。
ポイントは＞最終産物を泳動すると少しスメア状態
つまり、末端が少し削れたベクターが大腸菌に導入されそれが大腸菌本来の
ligaseで結合したものと考えられる。だから制限酵素のサイトも壊れてて
酵素で切れなかったと、、
と、思うがどうか？
いや、お前の場合は残留塩は関係ない。と思う。
ポイントは＞最終産物を泳動すると少しスメア状態
つまり、末端が少し削れたベクターが大腸菌に導入されそれが大腸菌本来の
ligaseで結合したものと考えられる。だから制限酵素のサイトも壊れてて
酵素で切れなかったと、、
と、思うがどうか？
342 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 22:11
343 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 22:26
HpaIは結構star activityが出る酵素なので、不必要に過剰量の酵素や不
必要に長時間の消化は避けるべし。スメアになる元だ。HpaI消化とBAP処
理の間にフェノクロ処理は不要、と言うかオレは同時にやってる。スメア
がligationされれば、>>341が言うようにAmp耐性の小さなプラスミドにな
る。ただし大腸菌のligaseによるわけじゃなくて、ligation reaction中
に起こることだけどね。
必要に長時間の消化は避けるべし。スメアになる元だ。HpaI消化とBAP処
理の間にフェノクロ処理は不要、と言うかオレは同時にやってる。スメア
がligationされれば、>>341が言うようにAmp耐性の小さなプラスミドにな
る。ただし大腸菌のligaseによるわけじゃなくて、ligation reaction中
に起こることだけどね。
344 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 22:43
>>339
プライマーはリン酸化してますか？
プライマーはリン酸化してますか？
345 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 22:45
すばやい返答有難うございます。
同時に処理とは、制限酵素反応液にBapを入れるのでしょうか。
入れるとしたら、どういう組成にされてますか。
Hpa1が高グリセロールでstar activityがでるとあるので、
Bapも結構グリセロール入ってるみたいですし。
よければ御教授願いますでしょうか。
同時に処理とは、制限酵素反応液にBapを入れるのでしょうか。
入れるとしたら、どういう組成にされてますか。
Hpa1が高グリセロールでstar activityがでるとあるので、
Bapも結構グリセロール入ってるみたいですし。
よければ御教授願いますでしょうか。
346 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 22:48
347 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 23:05
>>345 あのー、BAP入れすぎてやしませんか？BAPから持込みのglycerolが問題になるとは思えないのですが。バッファーの組成は制限
酵素のものに合せます、というか、制限酵素の反応液をセットアップし
たら消化を始めて、30分くらいしたらBAPを加えてさらに30分消化を続
けたものをフェノクロｘ３回・エタ沈で使っています。フェノクロ３回
はやり過ぎのような気もしますが、これで頻度がぐっと違います。２回
ではBAPの持込みが無視できないのかなと思っています。
酵素のものに合せます、というか、制限酵素の反応液をセットアップし
たら消化を始めて、30分くらいしたらBAPを加えてさらに30分消化を続
けたものをフェノクロｘ３回・エタ沈で使っています。フェノクロ３回
はやり過ぎのような気もしますが、これで頻度がぐっと違います。２回
ではBAPの持込みが無視できないのかなと思っています。
348 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 23:24
今回使用しているHpa1は、平滑末端で脱リン酸化の効率が悪い
と添付文書に有り、スタートの酵素量と途中で入れるBapの具体的な量を教えていただけたらと思います。
自分としたら、
スタート：total 30ul
DNA+D2W 24ul
buffer 3ul
Hpa1 3ul
途中でBap 2ul
こんな感じでしょうか？？
と添付文書に有り、スタートの酵素量と途中で入れるBapの具体的な量を教えていただけたらと思います。
自分としたら、
スタート：total 30ul
DNA+D2W 24ul
buffer 3ul
Hpa1 3ul
途中でBap 2ul
こんな感じでしょうか？？
349 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/07 23:41
30ulに酵素のstock soln 5ulではスメアになるのも道理
まず、酵素の量を1/3にしてみよう。
まず、酵素の量を1/3にしてみよう。
350 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/08 00:34
酵素のunitの定義知ってる？DNAが数μgだとしたらHpaI入れすぎ。
平滑末端で脱リン酸化の効率が悪いのはそのとおりだが、BAPも入れすぎ。Molecular Cloningを参照せよ。
平滑末端で脱リン酸化の効率が悪いのはそのとおりだが、BAPも入れすぎ。Molecular Cloningを参照せよ。
351 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/08 04:30
ブランとエンドライゲーションはめっちゃ濃いベクターと
めっちゃ濃いインサートを使えば（100～1000ng/ulくらい）
制限酵素処理や脱リン酸化なんてそんな気にするほどの
問題じゃないと思うのだがどうですか？
俺はSma1ではまったけど切れ残りがある状態でも
15個に2,3個は向きまで当たりがあります.
その時のベクターのすめあはDNAをキレイにしたら
なくなりました.CIAPでも大丈夫でした.
めっちゃ濃いインサートを使えば（100～1000ng/ulくらい）
制限酵素処理や脱リン酸化なんてそんな気にするほどの
問題じゃないと思うのだがどうですか？
俺はSma1ではまったけど切れ残りがある状態でも
15個に2,3個は向きまで当たりがあります.
その時のベクターのすめあはDNAをキレイにしたら
なくなりました.CIAPでも大丈夫でした.
352 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/08 11:26
PCR産物はどうやって精製してる？
ベクターもゲル精製したら？
PCR産物は平滑末端になってるんだよね？
ベクターもゲル精製したら？
PCR産物は平滑末端になってるんだよね？
353 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/08 13:58
354 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/08 13:59
355 ：351：04/06/08 17:06
>>353
キアゲン．るーちんでコンストラクトするので
ラージスケールをキアゲンでとってきた．
ミニプレ由来のものは制限酵素処理中（オーバーナイト）に
スめりました．俺のケースも君のケースも恐らく汚い
DNAに由来してるのでは？バムとかエコとかだったら
気にしなくていいのに・・・
キアゲン．るーちんでコンストラクトするので
ラージスケールをキアゲンでとってきた．
ミニプレ由来のものは制限酵素処理中（オーバーナイト）に
スめりました．俺のケースも君のケースも恐らく汚い
DNAに由来してるのでは？バムとかエコとかだったら
気にしなくていいのに・・・
356 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/11 14:24
>>336です。一応、目的のプラスミドは得ることができました。皆さんの助言ありがとうございました。しかし、できたコロニー１4個ついて目的のインサートが入っていたのはその１個でした。
他は、7個がわけのわからない切断できないプラスミド、６個がベクターでした。
効率悪すぎのような気がしますが、、、。
他は、7個がわけのわからない切断できないプラスミド、６個がベクターでした。
効率悪すぎのような気がしますが、、、。
357 ：名無しゲノムのクローンさん：04/06/11 16:04
お前も人が悪いな。ネタで遊ぶなんて
358 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/16 07:12
KpnIにはTriton-Xを入れると切れるようになるのがある。
どこの会社のやつか忘れた。
マニュアル見てください。
どこの会社のやつか忘れた。
マニュアル見てください。
359 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/16 07:52
>>358
みんなNEBのKpnIの話しかしてないですよ。＜切れない、切れすぎてバラバラ殺人
みんなNEBのKpnIの話しかしてないですよ。＜切れない、切れすぎてバラバラ殺人
360 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/17 19:05
HindIII
361 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/17 21:46
えーHindⅢ切れるよー問題なく。
buffer間違えてない？
buffer間違えてない？
362 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/18 19:04
sfi1って切れないって本当ですか？
363 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/18 19:04
sfi1が切れないって本当ですか？
364 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/18 20:25
本当です
本当です
本当です
365 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/18 21:11
そーか？
結構きれるぞ。
切れない人の体験談を聞かせてくれ？
オーバーナイトでやってるの？
結構きれるぞ。
切れない人の体験談を聞かせてくれ？
オーバーナイトでやってるの？
366 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/18 21:32
どこのメーカ？
367 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/18 21:41
toyoboだよ。
二時間で十分だろ。
二時間で十分だろ。
368 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/18 22:00
SfiIはtetramerとしてactiveなので、SfiI siteが同時に２ヶ所結合しないと切れないのだ。だからSfiI site濃度（SfiI site数/mg DNA）の低いgenomic DNAなどは切れにくい。vectorを切るときなどはあまり問題にならないだろうけどね。
369 ：367：04/07/18 22:13
漏れはベクターとかインサートだからだ。
なるほど。
近くにsfiⅠサイトがあれば切れやすいのか。
クローンテックのキットとかだとよく使うけど、
あんまりgenomicでは使わないよねーー。
なるほど。
近くにsfiⅠサイトがあれば切れやすいのか。
クローンテックのキットとかだとよく使うけど、
あんまりgenomicでは使わないよねーー。
370 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/18 22:16
そのために、わざわざSfiI siteのds oligoを入れた反応bufferもあるよね。
371 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/18 22:19
基本的にSfiⅠはライゲーションで使うだろ。
そもそも活性自体は強い酵素だと思う。
16時間後や高温処理後も活性あるし。
オーバーナイトは必要ないね。
そもそも活性自体は強い酵素だと思う。
16時間後や高温処理後も活性あるし。
オーバーナイトは必要ないね。
372 ：名無しゲノムのクローンさん：04/07/18 22:31
漏れはovernight するけどな。
やっぱり時間がたつにつれて
切断できるsfi1サイトが少なくなってくるからな。
やっぱり時間がたつにつれて
切断できるsfi1サイトが少なくなってくるからな。
373 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/02 01:51
「制限酵素の名前がIDにでるまで頑張るスレ」をたてようと思ったら
この板ってID無いんだ
この板ってID無いんだ
374 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/04 11:11
50度でo/nするとbufferがすべて蓋に移るという罠。
サーマルサイクラー使ってみたりしてます。アホくさいけど。
あと、私はplasmidを切ったんだけれど、インサートが3kとかあるのを
切ろうとしたら切れませんでした・・・欝。
サーマルサイクラー使ってみたりしてます。アホくさいけど。
あと、私はplasmidを切ったんだけれど、インサートが3kとかあるのを
切ろうとしたら切れませんでした・・・欝。
375 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/05 06:24
376 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/07 16:55
うちの教授はcompletely digested per day
弁当についている醤油小袋みたいに”こちら側のどちらからでも切れます”
弁当についている醤油小袋みたいに”こちら側のどちらからでも切れます”
377 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/07 16:58
3kって普通じゃない？
378 ：375：04/09/08 05:53
379 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/08 12:51
380 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/09 02:06
NEBのsfi1はむちゃくちゃ切れるけどな。
おまいらちゃんとメチレーションはチェックしてるか？
おまいらちゃんとメチレーションはチェックしてるか？
381 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/10 11:02
NEB USA最高。どんな酵素も１本58$。
あまりににお手ごろ価格なんでマイ酵素セット持ってます。
ただあんまりあてにならんなと思ったのは、至適じゃないバッファでの活性かな。
25%と書いてあってもほとんど切れないときとかあるし。
あまりににお手ごろ価格なんでマイ酵素セット持ってます。
ただあんまりあてにならんなと思ったのは、至適じゃないバッファでの活性かな。
25%と書いてあってもほとんど切れないときとかあるし。
382 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/11 21:20:17
えこあーるわんわん
383 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/20 11:32:56
Fermentasってリトアニアの会社って聞いたんですけど
本当ですか？？？ リトアニアから空輸してるんですかね。
粘りが無くてさっぱりしてそれなりに切れるから好きなんですけど
本当ですか？？？ リトアニアから空輸してるんですかね。
粘りが無くてさっぱりしてそれなりに切れるから好きなんですけど
384 ：名無しゲノムのクローンさん：04/09/22 10:56:02
あたしも Fermentas 大好き。
キャンペーンの時にまとめ買い。
別段切れなかったことないし。ｳﾏｰ。
キャンペーンの時にまとめ買い。
別段切れなかったことないし。ｳﾏｰ。
385 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/04 09:53:17
BclIが全然切れません・・・
プライマーの設計ミスぽ？？？
プライマーの設計ミスぽ？？？
386 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/05 03:51:26
387 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/05 11:50:40
smaⅠて切れますか？メチル化されていると切れないとタカラのカタログには書いてありました。
しかし認識配列はｃｃｃｇｇｇで・・・・・
しかし認識配列はｃｃｃｇｇｇで・・・・・
388 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/05 16:27:49
389 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/05 19:57:06
390 ：名無しゲノムのクローンさん：04/10/08 11:57:59
>>388
それはCAPSというんだよ
それはCAPSというんだよ
391 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/28 23:22:35
BcgIってどう？
392 ：名無しゲノムのクローンさん：04/11/29 00:40:21
NdeI
393 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/03 13:51:40
394 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/05 18:46:37
S-adenosylmethionine (通称 SAM）って何？するものなの？
395 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/06 02:44:46
>>393詳しく
396 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/14 15:17:00
Afl II ってどうでつか？
最近はまってるんですが。。。
最近はまってるんですが。。。
397 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/14 16:51:07
takaraので切れたよ。
以前制限酵素siteのないベクターを送られて酵素を疑ったが、
別のひとから貰ったベクターでは切れた。
以前制限酵素siteのないベクターを送られて酵素を疑ったが、
別のひとから貰ったベクターでは切れた。
398 ：77：04/12/18 16:16:12
SfiⅠで切れなくて困ってたのですが、
このサイトをみつけてちょっとためになりました。
O/Nでやってみます。
このサイトをみつけてちょっとためになりました。
O/Nでやってみます。
399 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/18 16:22:31
400 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/19 00:17:19
>>398
SfiIが切れないというのが信じられないが、何故切れない？
俺はNEBのを使っているけど、反応時間１時間で問題なく切れる。
別に酵素量を多く使っている訳でもない。
切れないと言う人は、ちゃんと50℃で反応させているのか？
また、Dam, Dcmメチレーションされるsiteでないことを確認して切っているのか？
SfiIが切れないというのが信じられないが、何故切れない？
俺はNEBのを使っているけど、反応時間１時間で問題なく切れる。
別に酵素量を多く使っている訳でもない。
切れないと言う人は、ちゃんと50℃で反応させているのか？
また、Dam, Dcmメチレーションされるsiteでないことを確認して切っているのか？
401 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/19 08:20:52
Nae I は萎える。
402 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/22 16:24:45
ＥｃｏＲＩとかＨｉｎｄＩＩＩみたいなよく切れる酵素って、どれくらいの時間インキュベートしてる？
10分もあればほとんど切れている気がするけど、やっぱり不安だったりする
10分もあればほとんど切れている気がするけど、やっぱり不安だったりする
403 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/23 15:46:03
404 ：私大もせめて業績重視で採用しろよな。：04/12/23 15:47:06
http://www.mainichi-msn.co.jp/keizai/seisaku/news/20041223k0000m020107000c.html
復活折衝：財源５００億円めぐる調整終了
０５年度一般会計予算の財務省原案に対する谷垣禎一財務相と各閣僚
の復活折衝が２２日、同省で行われた。財源５００億円をめぐる調整
はこれで終了し、政府は２４日午前の閣議で０５年度予算の政府案を
決定する。【須佐美玲子、千代崎聖史】
また文部科学省が要求していた私学助成については、大学分の私立大学
等経常費補助が前年度比０．９％（３０億円）増の３２９２億５０００
万円（要求額３３８７億５０００万円）、高校以下分の私立高校等経常
費助成費等補助は同０．５％（５億円）増の１０３３億５０００万円
（要求額１１０８億５０００万円）で決着した。大学分のうち、今年
４月からスタートした法科大学院支援経費は同６０％増の４０億円が
認められた。
中山成彬文科相は「子どもが減る中で厳しいと思っていたが、一方で
国立との格差の是正という意味もある。教育の重要性をよく認識して
くれた」と述べた。
復活折衝：財源５００億円めぐる調整終了
０５年度一般会計予算の財務省原案に対する谷垣禎一財務相と各閣僚
の復活折衝が２２日、同省で行われた。財源５００億円をめぐる調整
はこれで終了し、政府は２４日午前の閣議で０５年度予算の政府案を
決定する。【須佐美玲子、千代崎聖史】
また文部科学省が要求していた私学助成については、大学分の私立大学
等経常費補助が前年度比０．９％（３０億円）増の３２９２億５０００
万円（要求額３３８７億５０００万円）、高校以下分の私立高校等経常
費助成費等補助は同０．５％（５億円）増の１０３３億５０００万円
（要求額１１０８億５０００万円）で決着した。大学分のうち、今年
４月からスタートした法科大学院支援経費は同６０％増の４０億円が
認められた。
中山成彬文科相は「子どもが減る中で厳しいと思っていたが、一方で
国立との格差の是正という意味もある。教育の重要性をよく認識して
くれた」と述べた。
405 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/23 20:43:50
>403
みたいなやつは使えないポスドクか貧乏ラボのやつ
間違いない
みたいなやつは使えないポスドクか貧乏ラボのやつ
間違いない
406 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/23 22:46:00
>>405
厳密に実験ができないアフォですか？
厳密に実験ができないアフォですか？
407 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/23 22:53:07
でも、多量に入れると早く切れるわけではないでしょ？
408 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 00:58:58
>>407
早く切れるよ。
早く切れるよ。
409 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 01:25:43
410 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 01:34:16
>>403は正しい。煽ってる奴は馬鹿だろ。
何事も論理的に考えられないと自然科学を研究するのは厳しいんじゃない？
最近は馬鹿でも出来る分子生物がのさばってるから勘違いしてる奴も多いんだけどさ。
文系エセ科学者には背後に潜む真理を暴くことなんて到底不可能だね。
何事も論理的に考えられないと自然科学を研究するのは厳しいんじゃない？
最近は馬鹿でも出来る分子生物がのさばってるから勘違いしてる奴も多いんだけどさ。
文系エセ科学者には背後に潜む真理を暴くことなんて到底不可能だね。
411 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 02:39:04
高校生でつ。
質問なんですが
制限酵素ってどうやって作ってるんですかね？
まさか、微生物を増やしていちいち遠心かけて
抽出してるとか？
質問なんですが
制限酵素ってどうやって作ってるんですかね？
まさか、微生物を増やしていちいち遠心かけて
抽出してるとか？
412 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 05:23:26
413 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 06:25:34
414 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 08:18:13
↑
煽ってる馬鹿な奴
煽ってる馬鹿な奴
415 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 13:55:35
416 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 13:58:00
>>409
テクニシャンはいい加減な実験するなよw
テクニシャンはいい加減な実験するなよw
417 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 14:04:29
>>415
もったいないオバケがでるぞ
もったいないオバケがでるぞ
418 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 15:57:25
EcoR Iだと、反応液の1割も酵素を入れるとスター活性でまくり。
419 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 16:44:28
なにやら必死になってるやつがいるなw
細かいとこばかり追求して大局観が無くしょーもない雑誌にしか論文載らないタイプのやつw
細かいとこばかり追求して大局観が無くしょーもない雑誌にしか論文載らないタイプのやつw
420 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 22:08:43
↑
煽ってる馬鹿な奴
煽ってる馬鹿な奴
421 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/24 22:32:20
>>419
こういうヤツってユニットの定義も知らねーんだろうなぁ
こういうヤツってユニットの定義も知らねーんだろうなぁ
422 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 00:25:07
大局観っていうか、商業誌のご意見伺いが達者なだけでしょｗ
423 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 00:31:06
細かいとこを追求できて大局観があるのが成功するのに必要。
大局観があっても細かいとこを追求できなければ成功できるわけがない。
大局観があっても細かいとこを追求できなければ成功できるわけがない。
424 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 00:33:36
太極拳
425 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 00:52:30
>>423
そういう時には捏(ry
そういう時には捏(ry
426 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 01:03:03
おまえ等ホントにつられれやすいなｹﾞﾗ
427 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 01:05:41
そもそも大局観があればいちいち制限酵素の量なんか細かく計算しないよﾌﾟ
428 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 01:11:09
↑釣れますか？
429 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 01:18:30
計算できないからって、、w
430 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 01:24:40
いやはや、ぐたぐたですな。
煽るのはいいけど、一行レスだけは勘弁して欲しい。
何故これこれは良くないか。
これはシカジカの理由からこうすべきとか
もうちっと建設的な意見交換したらどうかと思うんだけど。
煽るのはいいけど、一行レスだけは勘弁して欲しい。
何故これこれは良くないか。
これはシカジカの理由からこうすべきとか
もうちっと建設的な意見交換したらどうかと思うんだけど。
431 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 09:17:44
大局観があっても細かいとこを追求できない方を
我々ネーチャー編集部はお待ちしております。
我々ネーチャー編集部はお待ちしております。
432 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/25 12:12:27
>>430
まともなdiscussionもできない人なんだろ。
いい加減な実験しかしてないようだしな。
おそらく研究者じゃないんじゃない（うちの技術員でさえ
できることができないようだし）？
まぁ使うだけ使われて消えていくような人達でしょう。
建設的な意見交換はできる人達でやっていけばいいのでは。
まともなdiscussionもできない人なんだろ。
いい加減な実験しかしてないようだしな。
おそらく研究者じゃないんじゃない（うちの技術員でさえ
できることができないようだし）？
まぁ使うだけ使われて消えていくような人達でしょう。
建設的な意見交換はできる人達でやっていけばいいのでは。
433 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/26 14:02:57
クリスマスに自作自演お疲れ！
434 ：マーキュリーストア ◆Cd0K8qiH8I ：04/12/29 10:55:34
Nae Iは犯罪的に切れない。
売るなよって思ったことが何度もあります。
Promegaのturbo Nae Iはだいぶんマシ
bufferだけの問題らしい。
売るなよって思ったことが何度もあります。
Promegaのturbo Nae Iはだいぶんマシ
bufferだけの問題らしい。
435 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/30 14:36:46
そもそも切れない制限酵素を使う実験系をたてるのが悪い
ligationなんかPCRでできるし
fusion PCRおすすめよ
ligationなんかPCRでできるし
fusion PCRおすすめよ
436 ：名無しゲノムのクローンさん：04/12/30 22:38:47
437 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/15 13:19:24
SalI-XhoIでligationができません。なんどやってもできませんがどうしたらいいのでしょうか？
438 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/15 13:22:52
外注しろ
439 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/15 14:49:25
440 ：439：05/01/15 14:51:37
ゴメソ、SalIとXhoIをligationしたいって話だった？
問題あったことはないから、何か他の原因があるんじゃ？
問題あったことはないから、何か他の原因があるんじゃ？
441 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/15 14:55:29
442 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/16 03:49:39
酵素が死んでくると、死んだ酵素とダイマーを作った酵素が不活性で
よけい活性が急減する印象がある
よけい活性が急減する印象がある
443 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/17 22:42:13
>>437
もしかして、それはvector側のSal1サイトとXho1サイトが
bluescriptみたいに、隣り合ってるか、ごく近くに
あるんじゃないの？
リニアDNAの端っこのSal1は切れにくいです。Xho1はどうだったかな？
そう言う場合は、Sal1サイトにすでにインサートが入っているプラスミド
を使って、１Xho1だけで斬る、２後追いでSal1を追加するとよろしい。
もしかして、それはvector側のSal1サイトとXho1サイトが
bluescriptみたいに、隣り合ってるか、ごく近くに
あるんじゃないの？
リニアDNAの端っこのSal1は切れにくいです。Xho1はどうだったかな？
そう言う場合は、Sal1サイトにすでにインサートが入っているプラスミド
を使って、１Xho1だけで斬る、２後追いでSal1を追加するとよろしい。
リニアDNAの端っこのSal1は切れにくい
というのは、先にXho1で切れたvectorと言う意味ね。
というのは、先にXho1で切れたvectorと言う意味ね。
445 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 03:43:10
446 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 04:30:47
ともかくフェノールが一番信用できる！
447 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 21:58:14
Xho1 クソ1
Nco1 ウンコ1
Nco1 ウンコ1
448 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/18 23:42:34
>>445
ゲルから切り出せば無問題
ゲルから切り出せば無問題
449 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 00:00:08
ManI マン１
450 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 00:46:41
NdeI
451 ：名無しゲノムのクローンさん：05/01/19 04:03:48
452 ：名無しゲノムのクローンさん ：05/03/11 16:36:11
Xho1はたしかに糞。切れない。
453 ：卵の名無しさん：2005/04/28(木) 15:34:21
あげ
454 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 04:59:39
>>451
qiaやqbioのカラムじゃ精製不足なこともある訳？
qiaやqbioのカラムじゃ精製不足なこともある訳？
455 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/04/29(金) 07:42:57
大蟻
456 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/07/05(火) 05:39:47
NheIで切れない
457 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/03(水) 09:35:37
旧ベーリンジャーのは好き
だけどちょっと高め
だけどちょっと高め
458 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/03(水) 13:23:07
459 ：& ◆13JBLgYGQE ：2005/08/06(土) 22:16:54
ATG入っているNcoIって性質どうですかね？
使っている人感想おながいします。
使っている人感想おながいします。
460 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/06(土) 22:48:16
XbaIが切れないと思ったらDam siteだった･･･orz
461 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/07(日) 14:56:49
実験がうまくいかないのを制限酵素、あげくの果てにはメーカーのせいにする。
それよりも問題なのは研究室内の管理・・・
ものすごく古い酵素や、なんやら謎の酵素がコンタミしてる酵素が放置されてたりする。
ちゃんとした新品使えば、XhoI、NdeI、SalI、NcoI、NheI、XbaIは切れるよ。
ただしメチル化や必要な末端塩基数はNEBカタログでちゃんと調べて問題がなければ、だけどね。
それよりも問題なのは研究室内の管理・・・
ものすごく古い酵素や、なんやら謎の酵素がコンタミしてる酵素が放置されてたりする。
ちゃんとした新品使えば、XhoI、NdeI、SalI、NcoI、NheI、XbaIは切れるよ。
ただしメチル化や必要な末端塩基数はNEBカタログでちゃんと調べて問題がなければ、だけどね。
462 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/07(日) 17:53:43
前日に遠心フラッシュしておいたはずの酵素のフタがベットリ orz
ひっくりかえすなよな
ひっくりかえすなよな
463 ：E：2005/08/08(月) 02:15:21
464 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/08(月) 03:10:05
>461
素手で共用酵素を扱う輩がいると困る。
素手で共用酵素を扱う輩がいると困る。
465 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/08(月) 09:26:36
制限酵素使うときにいちいち手袋しないとダメなの？
466 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/08(月) 13:04:56
おれは素手でも手袋でもなく、ピペット万で扱うよ。
467 ：QQ：2005/08/10(水) 12:45:28
使ったことある酵素を列挙してみよう！
XhoI, NdeI, NcoI, EcoRI, BamHI (5個）
XhoI, NdeI, NcoI, EcoRI, BamHI (5個）
468 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/10(水) 12:58:09
> XhoI, NdeI, NcoI, EcoRI, BamHI (5個）
なんて読んでる？
なんて読んでる？
469 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/10(水) 12:59:18
クソー ワン
ンデ ワン
ンコ ワン
エコアー ワン
バンエッチ ワン
ンデ ワン
ンコ ワン
エコアー ワン
バンエッチ ワン
470 ：QQ：2005/08/11(木) 13:43:23
クゾーワン
エヌディーイーワン
エヌシーオーワン
イーコアールワン
バムエッチワン
です。
エヌディーイーワン
エヌシーオーワン
イーコアールワン
バムエッチワン
です。
471 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/11(木) 23:44:21
統一した呼び方を作ってほしいな。
472 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/20(土) 02:13:10
最初だけはゾーワンかな。
あとはそのまんま読んでる
あとはそのまんま読んでる
473 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/20(土) 02:13:53
ｽﾏｿあげてもた
474 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/20(土) 04:46:36
ぞーわん
ぬでわん
ぬこわん
えこあーるわん
ばむえいちわん
でもって切れないのは
なえわん
これまじで萎える
ぬでわん
ぬこわん
えこあーるわん
ばむえいちわん
でもって切れないのは
なえわん
これまじで萎える
475 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/28(日) 12:07:23
まったく大腸菌にtransfectionできないんです。
やっぱり原因はﾗｲｹﾞｰｼｮﾝ？
やっぱり原因はﾗｲｹﾞｰｼｮﾝ？
476 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/28(日) 14:50:22
×transfection
○transformation
○transformation
477 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/28(日) 15:49:34
今１番求められているものは
すぐにキレないボス毒と
アタマの切れるボス毒だ
すぐにキレないボス毒と
アタマの切れるボス毒だ
478 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/28(日) 15:52:20
>ぬこわん
ぬこじるうどんですか？
ぬこじるうどんですか？
479 ： ：2005/08/30(火) 13:38:16
>>476
でもさ、GFPvectorをtransformationすると大腸菌が黄色に。これはどういうこと？
でもさ、GFPvectorをtransformationすると大腸菌が黄色に。これはどういうこと？
480 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/30(火) 23:33:00
は？ ＧＦＰがうっすら発現して大腸菌が蛍光を発してるんだろ、もちろん。
481 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/31(水) 01:33:24
KpnI 切れるけど、ヘタりが早いのが難点。
partial digestionになることしばしば。
高濃度品買った方が良いのかも………＞漏れ
partial digestionになることしばしば。
高濃度品買った方が良いのかも………＞漏れ
482 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/31(水) 12:38:37
315 ：名無しゲノムのクローンさん ：04/02/15 12:02
Mnqのことお前らなんて言ってる？
俺的にはムンク
316 ：名無しゲノムのクローンさん ：04/02/15 13:06
マンキュー
317 ：名無しゲノムのクローンさん ：04/02/15 13:35
俺はｵﾏﾝｺｩかな
Mnqのことお前らなんて言ってる？
俺的にはムンク
316 ：名無しゲノムのクローンさん ：04/02/15 13:06
マンキュー
317 ：名無しゲノムのクローンさん ：04/02/15 13:35
俺はｵﾏﾝｺｩかな
483 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/08/31(水) 14:22:58
>>479
transfection（導入）
これはプラスミドベクターを大腸菌内に導入する、という意味。
transformation（形質転換）
ベクターを組み込まれた大腸菌の形質が変わること。
本来とは違う遺伝子を発現し、蛋白を作るようになる（GFP,GST など）。
transfection は実験者が主語で transformation は大腸菌が主語。
transfection（導入）
これはプラスミドベクターを大腸菌内に導入する、という意味。
transformation（形質転換）
ベクターを組み込まれた大腸菌の形質が変わること。
本来とは違う遺伝子を発現し、蛋白を作るようになる（GFP,GST など）。
transfection は実験者が主語で transformation は大腸菌が主語。
484 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/01(木) 11:20:47
>transfection は実験者が主語
I transfect xx to yy.
>transformation は大腸菌が主語
E. coli transforms xx to yy.
んなバカな～
I transfect xx to yy.
>transformation は大腸菌が主語
E. coli transforms xx to yy.
んなバカな～
485 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/01(木) 22:12:09
>>483
てか、自分勝手な定義つくるんじゃねえよ！ あんたの脳内だけの定義だ、そりゃ。
てか、自分勝手な定義つくるんじゃねえよ！ あんたの脳内だけの定義だ、そりゃ。
486 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/01(木) 23:41:44
そんな文句言ってる間に正しい答え教えてあげればいいのに。
trasformationは問題ない。主語とかそういう議論はのぞく。
transfectionは主にほ乳類の細胞にplasmidを導入すること。
ウイルスが感染することをinfectionといいますが、transfectionとinfectionとの
合成語です。ただ、現在はほ乳類細胞以外にも使われているようです。
trasformationは問題ない。主語とかそういう議論はのぞく。
transfectionは主にほ乳類の細胞にplasmidを導入すること。
ウイルスが感染することをinfectionといいますが、transfectionとinfectionとの
合成語です。ただ、現在はほ乳類細胞以外にも使われているようです。
487 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/03(土) 12:24:46
transformation＞微生物
transfection＞培養細胞
ということでよろしいか？
transfection＞培養細胞
ということでよろしいか？
488 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/03(土) 13:06:38
489 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/03(土) 13:29:58
なるほど。
490 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/03(土) 13:43:57
transfection って日本語訳は何？
transformation は「形質転換」だよね。
transformation は「形質転換」だよね。
491 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/03(土) 13:45:48
トランスフェクション
492 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/03(土) 13:49:24
なるほど。
493 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/06(火) 11:21:04
BamHI 切れすぎました。スター活性でした。やり直します。
494 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/06(火) 11:39:52
KpnⅠは、ケーパンワン？
495 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/06(火) 23:09:59
ウチのラボじゃふつーにけーぴーえぬわんって呼んでる
あと、ぬでわんじゃなくのでわんって呼ぶ
あと、ぬでわんじゃなくのでわんって呼ぶ
496 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/09(金) 09:07:29
すいません、困ってるんで教えてください。
NotIとSphIで切ってるんですが、バッファーが違うので、その都度
きあげんキットで精製してます。泳動で確かめても、もちろん問題なし。
きれいに切れてる。しかし、セルフライゲーション多すぎ！ようするに
切れてないのが混ざってる、ってこと？
NotIとSphIで切ってるんですが、バッファーが違うので、その都度
きあげんキットで精製してます。泳動で確かめても、もちろん問題なし。
きれいに切れてる。しかし、セルフライゲーション多すぎ！ようするに
切れてないのが混ざってる、ってこと？
497 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/09(金) 09:30:11
マルチクローニングサイトの話だとすると、２つ目の酵素で切れているか
どうかはどうやって見分けてるの？
どうかはどうやって見分けてるの？
498 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/09(金) 09:35:52
ハッッッ、見分けてないです、、、
では問題は、２つ目の酵素ですかね。
では問題は、２つ目の酵素ですかね。
499 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/09(金) 09:41:54
このスレでも話が出てたと思うけど、酵素によってはendに近いと切れない
ことがあるので、２つのサイトが近すぎるときは要注意。NEBのカタログの
巻末に情報が出てる。
ことがあるので、２つのサイトが近すぎるときは要注意。NEBのカタログの
巻末に情報が出てる。
500 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/09(金) 12:17:43
ありがとうございます！たしかめてみますです！
501 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/10(土) 00:24:58
>>496
NotIとSphIならHigh bufferで一緒に切れる。
NotIとSphIならHigh bufferで一緒に切れる。
502 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/09/10(土) 01:42:56
BSAとTritonを忘れずにね
503 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/01(土) 22:13:23
Bcl I
504 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/19(水) 05:07:01
>>503
メチル化されてると切れないよ～
メチル化されてると切れないよ～
505 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/20(木) 21:54:02 BE:617803979-
>>504
知ってるよ。ＰＣＲ産物でも切れない
知ってるよ。ＰＣＲ産物でも切れない
506 ：919：2005/10/21(金) 12:07:48
λDNAをHindⅢで消化したとき、125bpくらいのバンドがありますよね？そのソースをどなたか教えて頂けませんか?
507 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/22(土) 00:45:15
形質導入 とらんすふぇくしょん
ファージ使うやつ。
ファージ使うやつ。
508 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/22(土) 02:55:17
女切れの酵素は無い・・・ んんだな・・・
安くても、高くても、切れない・・・。
安くても、高くても、切れない・・・。
509 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/23(日) 04:38:56
ＳｍａⅠやＳａｃⅡみたいに認識部位にＣＧが入ってる酵素は
ＣＧメチラーゼのせいで動物細胞のゲノムを切ることはできないの？
実際に切れてないんだけど、条件によっては切れたりする？
ＣＧメチラーゼのせいで動物細胞のゲノムを切ることはできないの？
実際に切れてないんだけど、条件によっては切れたりする？
510 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/10/26(水) 04:46:18
HindIIIとEcoRIで☆活性でまくった。
どうしてかな。前回同じ条件でやったときはなんともなかったのに。
☆活性って再現性乏しいのは俺だけ？
どうしてかな。前回同じ条件でやったときはなんともなかったのに。
☆活性って再現性乏しいのは俺だけ？
511 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/27(日) 19:38:41
NdeIまじ切れね～。末端に５bpちゃんと取ってるんだけど。足りないのか？
てかそのおかげで今だセルフライゲーションの嵐。奴を最も効率的に扱うにはどうすれば？
てかそのおかげで今だセルフライゲーションの嵐。奴を最も効率的に扱うにはどうすれば？
512 ：名無しゲノムのクローンさん：2005/11/29(火) 03:49:23
・必要な足場の塩基数をNEBのカタログで確認して
足りなかったら設計し直す
・O/Nで処理
・Double Digestionなら分けて処理
・DNAの量が多過ぎないか確認
・高濃度版
・平滑で入れてから移し替え
足りなかったら設計し直す
・O/Nで処理
・Double Digestionなら分けて処理
・DNAの量が多過ぎないか確認
・高濃度版
・平滑で入れてから移し替え
513 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/01/18(水) 12:47:25
514 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/02/10(金) 21:48:26
もう制限酵素なんてバッファとおんなじ
値が付かんってやつ
値が付かんってやつ
515 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/02/28(火) 01:05:22
516 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/02/28(火) 01:14:01
培養細胞（たとえば癌細胞）だってトランスフォーメーションするし、
微生物だって培養細胞だし。
微生物だって培養細胞だし。
517 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/02/28(火) 01:35:20
昔、英語のカタログみてたらある欧米メーカーA社の酵素番号が日本の
メーカーT社の酵素番号とほとんど符合していました。
このことを別の日本メーカーの研究所のひとに話したら、自分のところだけで
作っているメーカーは絶対にないだろうと言っていた。少なくとも２割は
他メーカーからの購入したものだそうです。実際この会社の某酵素は
かなりのメーカーに樽買いしてもらってるとのことでした。
もちろん自分のところの酵素も他社から買っているものが結構あるとの
ことでした。
メーカーT社の酵素番号とほとんど符合していました。
このことを別の日本メーカーの研究所のひとに話したら、自分のところだけで
作っているメーカーは絶対にないだろうと言っていた。少なくとも２割は
他メーカーからの購入したものだそうです。実際この会社の某酵素は
かなりのメーカーに樽買いしてもらってるとのことでした。
もちろん自分のところの酵素も他社から買っているものが結構あるとの
ことでした。
518 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/02/28(火) 01:47:45
樽で売ってるものなんでつか？ｗ
519 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/02/28(火) 02:21:36
15mlのブルーキャップに入ってたのを見たことはある。
520 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/02/28(火) 11:05:37
＞５１８
「樽買い」は業界用語だよ。バルクが一般的かな？中味が同じでも、
「どこのメーカーが良い」とか真面目に品評してる人がいるから、
メーカー営業は内心笑って聞いてるよ。
「樽買い」は業界用語だよ。バルクが一般的かな？中味が同じでも、
「どこのメーカーが良い」とか真面目に品評してる人がいるから、
メーカー営業は内心笑って聞いてるよ。
521 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/03/26(日) 19:27:52
522 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/03/29(水) 00:31:33
>>520
制限酵素も一般の試薬も似たようなものらしい。
どこか原料ソースがあって、それが各社が買って小分けしてるのが多いんだって。
「○○の△△がいい」なんていうのはもしかしたらばかげているかもしれないね。
話し脱線してすまそ
制限酵素も一般の試薬も似たようなものらしい。
どこか原料ソースがあって、それが各社が買って小分けしてるのが多いんだって。
「○○の△△がいい」なんていうのはもしかしたらばかげているかもしれないね。
話し脱線してすまそ
523 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/22(土) 04:30:23
DraIってどう？
524 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/22(土) 10:39:51
制限酵素ぢゃないけどKODplusでPCRやって増えないときはどうすればいいの？
exTaqのコントロールはめちゃ増えます。
exTaqのコントロールはめちゃ増えます。
525 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/22(土) 22:14:51
アニーリングTを下げるとか。
526 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/22(土) 22:57:21
使わないようにする
527 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/25(火) 13:22:03
ロッシュの酵素いいね
528 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/25(火) 23:38:10
>>524
マグネシウム濃度を振ってみる
マグネシウム濃度を振ってみる
529 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/26(水) 18:53:53
530 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/26(水) 23:33:56
>524
ExTaqで増えるのならいいじゃん
ExTaqで増えるのならいいじゃん
531 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/27(木) 09:05:32
きっとmutation入れたくないんだろ
532 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/28(金) 10:25:03
>>524
KODplusってご機嫌があるみたいなので、もう一回やるというのもありかと。
KODplusってご機嫌があるみたいなので、もう一回やるというのもありかと。
533 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/28(金) 10:44:54
ホットスタートのために入れている抗KOD抗体が悪さ？
534 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/04/28(金) 23:43:49
primestar
535 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/05/05(金) 08:45:01
>524
PCR産物がGC richならDMSO10%いれると、増幅いいけど。
PCR産物がGC richならDMSO10%いれると、増幅いいけど。
536 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/05/23(火) 23:12:41
>>523
おしい！１ハンうｐだけ！！
おしい！１ハンうｐだけ！！
537 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/06/07(水) 11:20:55
ロッシュの制限酵素半額やってるけど使えんの？
教えてください。
教えてください。
538 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/06/07(水) 15:01:16
ロッシュのはどれも信頼性高いよ。よく切れる。
539 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/06/07(水) 16:08:51
ロシュ ＝ ベーリンガー
つい最近ロシュの営業さんから聞いた。。。。
つい最近ロシュの営業さんから聞いた。。。。
540 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/06/07(水) 16:12:00
ロッシュ
541 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/06/30(金) 17:15:44
TakaraのStuIとXhoIで切るとき、バッファーを何を使ったらよろしいでしょうか？
542 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/06/30(金) 17:21:16
バッファーって何日ぐらいモツ？？
543 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/07/01(土) 00:54:59
>>541
なぜ聞く？
なぜ聞く？
544 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/07/30(日) 13:30:43
いまベクター構築中で、PvuIがいい位置で使えそうなんだけど
NEBのカタログにPvuIサイトはdamメチル化あるからligaseでつなげにくいって書いてある。
誰か経験のある人いますか？
ここで聞くのがいいのかわからんのだが、プライマー頼んでから失敗したくないのでお願いします。
NEBのカタログにPvuIサイトはdamメチル化あるからligaseでつなげにくいって書いてある。
誰か経験のある人いますか？
ここで聞くのがいいのかわからんのだが、プライマー頼んでから失敗したくないのでお願いします。
545 ：544：2006/08/12(土) 21:11:05
誰も答えてくれないので自己レス。
16℃オーバーナイトでつなげてみたけど、T4 ligase 10U使ってもコロニー出なかった。
（セルフも出ない）
エレポで再挑戦してtransformantゲットしました。
PvuI末端はケミカルコンピだとかなり効率よくないと厳しいライゲーション効率のようです。
報告以上。
16℃オーバーナイトでつなげてみたけど、T4 ligase 10U使ってもコロニー出なかった。
（セルフも出ない）
エレポで再挑戦してtransformantゲットしました。
PvuI末端はケミカルコンピだとかなり効率よくないと厳しいライゲーション効率のようです。
報告以上。
546 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/08/13(日) 00:53:19
ご苦労様。 なんかの時に参考にするわ。
547 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/08/13(日) 02:08:24
ライゲーション効率の低さを
エレポの形質転換効率の高さで補ったということか。
エレポの形質転換効率の高さで補ったということか。
あ、ちなみに、PvuIはTOYOBOですた。
酵素そのものはよく切れますた。
酵素そのものはよく切れますた。
549 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/09/29(金) 16:19:25
Xho1が切れません…（１０×Hバッファー、３７℃、２．５時間
古い酵素らしくて、いつからあるのか教授に聞いたら知らん。と返されました。
古いと切れないものなんですか？って聞いたらそんなことないよって言われました
使用期限や半減期みたいなのがあれば教えて下さい
古い酵素らしくて、いつからあるのか教授に聞いたら知らん。と返されました。
古いと切れないものなんですか？って聞いたらそんなことないよって言われました
使用期限や半減期みたいなのがあれば教えて下さい
550 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/10/03(火) 12:24:06
>549
どこの教授だか知らんが、ラボを替えたほうがいい。
タンパクなんだからそのうち失活する。特に温度管理が甘かったり、使用者がDQNの場合は早く死ぬ。
使用期限どうのこうのはともかく、確実に切断することがわかっているラムダDNAとかあれば、
それをコントロールとして切ってみる。切れなければ教授にデータを見せて買ってもらえ。
どこの教授だか知らんが、ラボを替えたほうがいい。
タンパクなんだからそのうち失活する。特に温度管理が甘かったり、使用者がDQNの場合は早く死ぬ。
使用期限どうのこうのはともかく、確実に切断することがわかっているラムダDNAとかあれば、
それをコントロールとして切ってみる。切れなければ教授にデータを見せて買ってもらえ。
551 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/10/12(木) 13:58:13
わかりました。
なんとか掛け合ってみます。
詳しい説明有り難うございました。
なんとか掛け合ってみます。
詳しい説明有り難うございました。
552 ：名無しゲノムのクローンさん：2006/10/12(木) 16:37:49
わかりました。
なんとか掛け合ってみます。
詳しい説明有り難うございました。
なんとか掛け合ってみます。
詳しい説明有り難うございました。
553 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/02/17(土) 20:37:35
とりあえずage
554 ：名無しゲノムのクローンさん：2007/07/14(土) 13:26:38
age
555 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/13(日) 23:58:53
高いので無駄な使用は避けてください
科研が通らないとさらにたいへんで寿司
科研が通らないとさらにたいへんで寿司
556 ：名無しゲノムのクローンさん：2008/01/31(木) 02:43:42
どなたかNEBのHpyCH4IIIを使ったことのある方はいらっしゃいませんか？
AhdIを使ってTベクターを自作しようと思ったのですが手元にあるベクター
に既にAhdIのサイトがあるのでHpyCH4IIIのサイトを２つ入れたプライマー
を注文して作成しようかと思っています。どなたか情報がありましたら
教えてください。宜しくお願い致します。
AhdIを使ってTベクターを自作しようと思ったのですが手元にあるベクター
に既にAhdIのサイトがあるのでHpyCH4IIIのサイトを２つ入れたプライマー
を注文して作成しようかと思っています。どなたか情報がありましたら
教えてください。宜しくお願い致します。
557 ：名無しゲノムのクローンさん：2009/07/28(火) 23:23:47
肺活量が人の2倍の俺の人工呼吸もなかなか切れない
558 ：名無しゲノムのクローンさん：2009/09/03(木) 21:19:31
>>557
じつにつまらん
じつにつまらん
559 ：名無しゲノムのクローンさん：2009/09/03(木) 22:31:35
GGATCC
GAATTC
GAATTC
560 ：名無しゲノムのクローンさん：2009/10/23(金) 14:43:53
561 ：名無しゲノムのクローンさん：2009/10/25(日) 00:00:14
562 ：名無しゲノムのクローンさん：2009/11/07(土) 22:44:41
制限酵素は生きているのにDNAが切れないときってどうしたらいいの？
やっぱりDNA自体が立体構造作ってるから、高温で構造を破壊？
やっぱりDNA自体が立体構造作ってるから、高温で構造を破壊？
563 ：名無しゲノムのクローンさん：2009/11/07(土) 22:57:08
まずdamメチラーゼ、dcmメチラーゼの認識配列とかぶってないか、そしてその酵素がメチル化感受性かどうかを調べろ。話はそれからだ。
564 ：名無しゲノムのクローンさん：2009/11/08(日) 00:01:26
まて、もしかするとGenomic DNAの話かもしれないぞ。
565 ：名無しゲノムのクローンさん：2010/01/18(月) 16:01:10
Fermentasの5-15分で切れるという酵素使っている方いますか？
使い勝手について教えてください。
今かなり安くなっているのでちょっと心が揺れているんですが
使い勝手について教えてください。
今かなり安くなっているのでちょっと心が揺れているんですが
566 ：名無しゲノムのクローンさん：2010/01/18(月) 16:58:41
３年以上前に買って－２０℃に置いておいた制限酵素が切れません
EcoRI,SalI,BamH1,Sma1でそういうことがありますか？
EcoRI,SalI,BamH1,Sma1でそういうことがありますか？
567 ：名無しゲノムのクローンさん：2010/01/19(火) 16:26:53
568 ：名無しゲノムのクローンさん：2010/02/21(日) 17:51:32
うちの酵素も前世紀の遺物だが大概切れるな。
東洋紡の緑色のタグつきのやつ。
ただ、KpnIが以前使ってた新しいのに比べて切れにくい。
最近のはpreparationが改善してるんじゃないか。
>>566
BamHIはtakaraのKバッファかNEBの特製バッファだからな。東洋紡のHバッファ推奨はウソだ。
SmaIは25℃反応だからな。37度だと反応開始時だけしか切れなくなる。
EcoRIだのSalIがスター活性出るのはあれとして全然切れないのは酵素死んでるんじゃないか。
一本あたりの量が多いから何度も室温に放置したりすると死にそうだ。
東洋紡の緑色のタグつきのやつ。
ただ、KpnIが以前使ってた新しいのに比べて切れにくい。
最近のはpreparationが改善してるんじゃないか。
>>566
BamHIはtakaraのKバッファかNEBの特製バッファだからな。東洋紡のHバッファ推奨はウソだ。
SmaIは25℃反応だからな。37度だと反応開始時だけしか切れなくなる。
EcoRIだのSalIがスター活性出るのはあれとして全然切れないのは酵素死んでるんじゃないか。
一本あたりの量が多いから何度も室温に放置したりすると死にそうだ。
569 ：名無しゲノムのクローンさん：2010/04/22(木) 02:27:54
>>568 NEBの
570 ：名無しゲノムのクローンさん：2010/04/22(木) 02:29:08
571 ：名無しゲノムのクローンさん：
俺をメチラーゼの罠から救ってくれた
スレが落ちそうではないかｗ
スレが落ちそうではないかｗ