ウエスたん…ﾊｧﾊｧ(;*´Д`)
351 ：名無しゲノムのクローンさん：
>347
340だが。
stepの作り方が知りたいのかね。それともgradient?
stepは、
まず濃いめAAのlower gel mixに5-15%くらいのGlycerolを入れて、
組み立てたゲル版に注ぐ。すぐに通常のseparation gel mixを
注ぐ。適当に混ざって境目がなだらかになる。後は普通に。
Tipsとしては、TEMEDをかなり控え目にすること。すぐ固まると
むらが出来る。重合開始を遅くして、重いlowerが水平になる
時間を稼ぐ。目安としては通常の半分-1/4くらいで試してみては？
あと、どちらかのgel mixにBPBを少しだけ足してうっすら色を
付けておく。成功したかどうかが目で確認できるように。
ゲル溶液はゲル版の真ん中から注ぐこと。端を使うとうまくできないよ。
Glycerolの濃度はゲルの厚さやなにやらで適当な量が変わってくるから、
試行錯誤だな。
Gradientのplotocolがほしければrequestしてくれ。
340だが。
stepの作り方が知りたいのかね。それともgradient?
stepは、
まず濃いめAAのlower gel mixに5-15%くらいのGlycerolを入れて、
組み立てたゲル版に注ぐ。すぐに通常のseparation gel mixを
注ぐ。適当に混ざって境目がなだらかになる。後は普通に。
Tipsとしては、TEMEDをかなり控え目にすること。すぐ固まると
むらが出来る。重合開始を遅くして、重いlowerが水平になる
時間を稼ぐ。目安としては通常の半分-1/4くらいで試してみては？
あと、どちらかのgel mixにBPBを少しだけ足してうっすら色を
付けておく。成功したかどうかが目で確認できるように。
ゲル溶液はゲル版の真ん中から注ぐこと。端を使うとうまくできないよ。
Glycerolの濃度はゲルの厚さやなにやらで適当な量が変わってくるから、
試行錯誤だな。
Gradientのplotocolがほしければrequestしてくれ。
|
|
|
352 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/06 00:20
protocolでおながいしまつ。
353 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/06 00:43
とりあえずすぐ使う立場ではないですが、説明をどうもありがとう
ございます。
BPBをゲルに混ぜても泳動に支障がないことは知っていたのですが、
ペリスタポンプとか複雑な装置を組み立てずにできそうですね。
mix の温度や脱気などには何か特別に注意するのでしょうか。
また step gel という名前自体知らなかったのですが、正式に
通じる名称なんでしょうか。
ございます。
BPBをゲルに混ぜても泳動に支障がないことは知っていたのですが、
ペリスタポンプとか複雑な装置を組み立てずにできそうですね。
mix の温度や脱気などには何か特別に注意するのでしょうか。
また step gel という名前自体知らなかったのですが、正式に
通じる名称なんでしょうか。
354 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/06 01:19
改行が多すぎると怒られたので三つに分けます。
>352,353
mixの温度や脱気は気にする必要ないよ。普通に。
BPBは入れすぎると泳動を乱すから、控え目にね。
stepが通じるかどうか・・・。うーん。正確には、この手のゲルは
step gradient gelと言うんだが、漏れの周りならアメ人にもstepで通じる。
けど、通じないとこもあるかもね。
>352,353
mixの温度や脱気は気にする必要ないよ。普通に。
BPBは入れすぎると泳動を乱すから、控え目にね。
stepが通じるかどうか・・・。うーん。正確には、この手のゲルは
step gradient gelと言うんだが、漏れの周りならアメ人にもstepで通じる。
けど、通じないとこもあるかもね。
355 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/06 01:20
さて、普通のgradient gelだけど、これもperistaとか複雑な装置は
使わなくて出来るよ。
まず、lowerとupperのgel mixを用意する。lowerには例によって
20%のglycerolを加えておく。どちらかにBPBで薄く色をつける。
どちらにつけるかは大した問題ではない。
次に、ゲル一枚分のlowerとupperを、正確に量り取り、TEMEDを加えて
混ぜる。例によってTEMEDは控え目に。
適当な大きさのシリンジに、18Gか21Gくらいの針をつけ、upper、lower
の順でそっと吸い上げる。界面を乱さないように、そっと。
全部吸い上げたら、そのままシリンジを引いて、中に気泡を入れる。
気泡が界面をかき混ぜて、きれいなgradientが出来る。気泡は10個
弱かな。適当に好みで調整。このとき、引き込む気泡の数を覚えて
おいて一定にすると、再現性の良いゲルが出来る。
使わなくて出来るよ。
まず、lowerとupperのgel mixを用意する。lowerには例によって
20%のglycerolを加えておく。どちらかにBPBで薄く色をつける。
どちらにつけるかは大した問題ではない。
次に、ゲル一枚分のlowerとupperを、正確に量り取り、TEMEDを加えて
混ぜる。例によってTEMEDは控え目に。
適当な大きさのシリンジに、18Gか21Gくらいの針をつけ、upper、lower
の順でそっと吸い上げる。界面を乱さないように、そっと。
全部吸い上げたら、そのままシリンジを引いて、中に気泡を入れる。
気泡が界面をかき混ぜて、きれいなgradientが出来る。気泡は10個
弱かな。適当に好みで調整。このとき、引き込む気泡の数を覚えて
おいて一定にすると、再現性の良いゲルが出来る。
356 ：名無しゲノムのクローンさん：03/01/06 01:21
さらに、シリンジを45度に傾けて一回転し、なじませる。
そのまま、そっとゲル板の中央から流し込む。シリンジを垂直に
保つこと。注射針をガラスプレートに沿わせると良い。
あとはアルコールを重層して、待つのみ。複数枚作るなら繰り返す。
peristaとgradient makerを使わないので完全なlinearではないけど、
使用上大した問題ではない。実にきれいに流れるよ。ゲルを染色する
場合は、固定前に5分ほど純水でゲルを洗ってglycerolを抜いておくと
よい。ウエスタンならそのまま何の問題もなく転写できる。
Tipsはstepの時と同じ。TEMEDの量は重要。重合開始に10分くらいは
かかるように減らしておく。但し、30分もすれば完全に固まって
ほしいものだね。
ふう。つかれた。こんなもんでどうでしょ。
そのまま、そっとゲル板の中央から流し込む。シリンジを垂直に
保つこと。注射針をガラスプレートに沿わせると良い。
あとはアルコールを重層して、待つのみ。複数枚作るなら繰り返す。
peristaとgradient makerを使わないので完全なlinearではないけど、
使用上大した問題ではない。実にきれいに流れるよ。ゲルを染色する
場合は、固定前に5分ほど純水でゲルを洗ってglycerolを抜いておくと
よい。ウエスタンならそのまま何の問題もなく転写できる。
Tipsはstepの時と同じ。TEMEDの量は重要。重合開始に10分くらいは
かかるように減らしておく。但し、30分もすれば完全に固まって
ほしいものだね。
ふう。つかれた。こんなもんでどうでしょ。